Embed Size (px)
Citation preview
JOZEF ČURLEJ
METÓDY A TECHNIKY CYTOGENETICKEJ
ANALÝZY ŽIVOČÍŠNYCH BUNIEK
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
Jozef Čurlej
Metódy a techniky cytogenetickej analýzy živočíšnych buniek
Nitra 2014
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
Názov:
Metódy a techniky cytogenetickej analýzy živočíšnych buniek
Autor:
Ing. Jozef Čurlej, PhD.
Vedecký redaktor:
prof. Ing. Peter Chrenek, DrSc.
Fakulta biotechnológie a potravinárstva, Slovenská poľnohospodárska
univerzita v Nitre
Výskumný ústav živočíšnej výroby, NPPC, Ústav genetiky a reprodukcie
hospodárskych zvierat
Recenzenti:
prof. Ing. Jozef Bulla, DrSc.
Fakulta biotechnológie a potravinárstva, Slovenská poľnohospodárska
univerzita v Nitre
Ing. Alexander Makarevič, DrSc.
Výskumný ústav živočíšnej výroby, NPPC, Ústav genetiky a reprodukcie
hospodárskych zvierat
Schválil rektor Slovenskej poľnohospodárskej univerzity v Nitre dňa 7. 5. 2014
ako vedeckú monografiu.
ISBN 978-80-552-1188-6
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
Poďakovanie
Touto cestou ďakujem vedeniu Výskumného ústavu živočíšnej výroby,
NPPC v Nitre za poskytnutie priestoru pre realizáciu experimentov
a Slovenskej poľnohospodárskej univerzity v Nitre za možnosť vydania tejto
publikácie. Základy práce boli realizované v laboratóriu genetiky VÚŽV Nitra a
boli rozšírené vďaka spolupráce so zahraničím (Karlova univerzita Praha,
Česká Republika). Moje úprimné poďakovanie patrí recenzentom za ich
odborné pripomienky a usmernenie pri spracovávaní monografie.
autor
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
OBSAH
Úvod ........................................................................................... 6
1 Delenie buniek ........................................................................... 8
1.1 Fázy bunkového cyklu ............................................................... 8
1.2 Regulačné mechanizmy bunkového cyklu ................................. 11
1.3 Replikácia DNA ......................................................................... 14
1.4 Molekulárne mechanizmy genetických mutácií ........................ 15
1.5 Faktory vonkajšieho prostredia .................................................. 15
1.5.1 Charakter zmien DNA vyvolaných chemickými a fyzikálnymi
faktormi ......................................................................................
16
1.6 Génové mutácie ......................................................................... 17
2 Organizácia genetického materiálu bunky - bunkový genóm .... 18
2.1 Chromozómy ............................................................................. 18
2.2 Karyotyp a idiogram .................................................................. 21
3 Metódy cytogenetiky ................................................................. 21
3.1 Klasické metódy karyotypingu .................................................. 21
3.2 Moderné metódy molekulárnej cytogenetiky ............................ 22
3.2.1 Fluorescenčná in situ hybridizácia ............................................. 22
3.2.1.1 Vývoj FISH metódy ................................................................... 23
3.2.1.2 Princíp FISH metódy ................................................................. 23
3.2.1.3 Sondy využívané pri metóde FISH ............................................ 27
3.2.1.4 Vzorky, ktoré sú vhodné pre FISH analýzu ............................... 28
3.2.1.5 Identifikácia pozície génov prostredníctvom FISH ................... 28
3.2.1.6 Diagnostika chromozómových zmien cestou využitia
karyotypu a FISH .......................................................................
29
3.2.1.7 Využitie FISH sond pri metóde farbenia celých chromozómov 30
3.2.1.8 Analýza interfáznych chromozómov metódou FISH ................ 32
3.2.1.9 Ďalšie možnosti využitia FISH v oblasti klinických a iných
výskumných štúdií .....................................................................
34
3.2.1.10 Výhody a obmedzenia metódy FISH ......................................... 34
3.2.1.11 Interpretácia výsledkov metódy FISH ....................................... 34
3.2.2 Komparatívna genómová hybridizácia (CGH) .......................... 36
3.2.2.1 Úvod do porovnávacej genómovej hybridizácie …………… 36
3.2.2.2 Princíp metódy CGH ................................................................. 38
3.2.2.3 Výhody a využitie CGH v klinickej cytogenetike ..................... 39
3.2.3 Porovnanie medzi FISH a CGH ................................................. 41
4 Chromozomálne aberácie ........................................................... 42
4.1 Štrukturálne zmeny chromozómov ............................................ 42
4.2 Numerické zmeny chromozómov .............................................. 44
4.2.1 Polyploidná varianta .................................................................. 45
4.2.2 Aneuploidná varianta ................................................................. 46
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
4.2.2.1 Štúdie aneuploidie ako dlhodobá tradícia .................................. 47
4.2.3 Chromozómová mozaika ........................................................... 51
4.2.4 Príčiny a dôsledky vzniku numerických chromozomálnych
zmien ..........................................................................................
51
5 Ochorenia vyvolané zmenami na úrovni chromozómov
u hospodárskych zvierat .............................................................
53
5.1 Králik.......................................................................................... 55
5.2 Ovce ........................................................................................... 56
5.3 Kozy ........................................................................................... 58
5.4 Zdravotné aspekty génových manipulácii u experimentálnych
zvierat .........................................................................................
59
6 Cytogenetické analýzy v experimentálnej oblasti ...................... 60
6.1 Preimplantačné genetické diagnózy - analýzy oocytov
a embryí .....................................................................................
60
6.1.1 Selekcia embryí pre embryo-transfer ......................................... 62
6.2 Využitie cytostatík za účelom synchronizácie bunkového
cyklu ...........................................................................................
63
6.3 Výstupy cytogenetických štúdii zameraných na oblasť
hodnotenia chromozómov ..........................................................
66
6.3.1
Detekcia integrácie hFVIII transgénu prostredníctvom FISH z
lymfocytov periférnej krvi králika .............................................
66
6.3.1.1 Identifikácia DAPI farbených králičích chromozómov ............. 66
6.3.1.2 FISH-TSA analýza ..................................................................... 66
6.3.2 Detekcia aneuploidie z lymfocytov kostnej drene transgénnych
králikov ......................................................................................
68
6.3.3 Detekcia aneuploidie z lymfocytov periférnej krvi
transgénnych králikov ................................................................
70
6.3.4 Detekcia aneuploidie - oocyty a embryá .................................... 72
Prílohy ........................................................................................ 76
Záver .......................................................................................... 84
Conclusion ................................................................................. 86
Zoznam skratiek ......................................................................... 88
Zoznam použitej literatúry ......................................................... 89
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
6
Úvod
Cytogenetika sa zaoberá štúdiom chromozomálnej štruktúry.
Predstavuje biologicko-medicínsky subjekt študujúci cytologicko-dedičné
faktory. Zaoberá sa mikroskopickou štruktúrou chromozómov vo vzťahu ku
genotypu respektíve fenotypu jedinca. Jej rutinnou súčasťou je analýza
prúžkovaných (bandovaných) chromozómov a molekulárna cytogenetika: FISH
fluorescenčná in situ hybridizácia, CGH komparatívna hybridizácia genómu.
Štúdium metafáznych chromozómov umožňuje poznanie ich štruktúry, na
základe karyotypu bunky je ďalej možné zistiť odchýlky na chromozomálnej
úrovni. Cytogenetika môže byť takto nápomocná v procese šľachtenia zvierat,
ako jeden zo selekčných faktorov, na základe numerických a štrukturálnych
chromozomálnych aberácii. Ideálne bunky pre analýzy chromozómov musia
spĺňať požiadavky rýchleho rastu a rýchleho delenia sa. Nositeľmi týchto
vlastností sú aj lymfocyty získané z kostnej drene alebo z periférnej krvi
(Moorhead et al., 1960). Flemming a Arnold (1880) prvýkrát pozorovali ľudské
chromozómy, avšak ich presný počet ostal neznámy viac ako 70 rokov.
Začiatky modernej cytogenetiky sa spájajú so zistením presného počtu
chromozómov ľudskej bunky (46) v roku 1956 Levanom. Predošlá teória 48
chromozómov ľudskej bunky bola prekonaná. Hsu (1952) prišiel s novou
technikou prípravy podložných sklíčok využívajúc hypotonický roztok, ktorý je
menej koncentrovaný ako vnútorné prostredie buniek a spôsobuje ich
nabobtnanie. Chromozómy z takto hypotonizovaných buniek sú na sklíčku
lepšie rozostúpené a teda vhodnejšie pre analýzy. Zaužívanie nových
technológii umožnilo ľahšie, presnejšie a rýchlejšie hodnotenie chromozómov a
chromozomálnych abnormalít vyvolaných non-disjunkciou, vedúcou k
aneuzómii (strata respektíve nadbytok celých chromozómov). Koncom 60-tych
rokov 20 storočia Caspersson objavil techniky bandingu- odlišujúceho farbenia
chromozómov (Caspersson et al., 1970). Táto metóda znamenala revolúciu v
cytogenetických analýzach. Každý chromozóm môže byť presne identifikovaný
na základe jemu vlastných unikátnych prúžkových (bandingových) znakov.
Metóda bandingu ďalej umožnila identifikáciu chromozómov podobného
vzhľadu a lokalizáciu miesta zlomu, či miesta translokácie. Konštruovanie
cytogenetických máp (karyotyping) významne prispelo k odhaleniu
chromozomálnych zmien. V roku 1980 zaznamenávame pokrok molekulárnej
cytogenetiky používaním fluorescenčne značených prób. Príchod molekulárnej
genetiky, objavenie spektra molekulárno-cytogenetických techník ako
fluorescenčná in situ hybridizácia (FISH), komparatívna genómová
hybridizácia (CGH) a iné prinieslo odpovede na viaceré otázky pri riešení
problémov v danej oblasti (Kearney a Horsley, 2005; Pinkel a Albertson, 2005;
Speicher a Carter, 2005). Ďalšie metódy vo výskume chromozómov viedli k
vzniku techniky chromozomálnej mikrodisekcie, čím aberácie v štruktúre
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
7
chromozómov môžu byť izolované, klonované a detailnejšie študované.
Cytogenetika teda vstúpila do molekulárnej éry zavedením in situ hybridizácie,
metódy, ktorá umožňuje lokalizovať pozície špecifických sekvencií DNA na
chromozómoch. Od prvého experimentu s využitím in situ hybridizácie v roku
1969 (Gall a Pardue, 1969), bolo vyvinutých niekoľko variant a citlivosť
metódy enormne vzrástla. V súčasnosti, väčšina in situ hybridizačných
postupov využíva fluorescenčne značené sondy, pre detekciu sekvencií DNA,
s označením FISH (fluorescenčná in situ hybridizácia). Existuje teda niekoľko
techník, využívaných v oblasti diagnostiky viacerých typov chromozomálnych
abnormalít, akými sú: interfázna FISH vyvinutá z metafáznej FISH, viacfarebná
FISH vyvinutá z jednofarebnej FISH a CGH (array komparatívna genómová
hybridizácia) vytvorená z klasickej CGH. Úspech FISH a všetkých ostatných
metód in situ hybridizácie závisí od stability dvojreťazcovej molekuly DNA.
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
8
1 Delenie buniek
1.1 Fázy bunkového cyklu
Proces delenia buniek, ktorým sa zdvojnásobuje ich počet, je potrebný
pri vývoji, raste i náhrade poškodených buniek. Delenie somatických buniek
predstavuje komplexný proces, pri ktorom z jednej materskej bunky vznikajú
dve identické dcérske bunky. Väčšina buniek v ľudskom organizme je
diferencovaná a špecializovaná na plnenie určitých funkcií. Tieto bunky sa
nedelia, nachádzajú sa v tzv. kľudovej - G0 fáze. Stabilné bunky v pokojovej
fáze (G0) majú nekondenzovanú DNA vo forme chromatínu. V tejto forme
môže bunka využívať genetické informácie zakódované v DNA pre syntézu
proteínov. Schopnosť deliť sa si zachováva skupina buniek, ktoré sa označujú
ako pluripotentné kmeňové alebo progenitorové bunky. Ich úlohou je obnova,
náhrada poškodeného tkaniva. Proliferácia buniek je prísne regulovaný proces,
na ktorom sa podieľajú rôzne proteínové komplexy (Giorgetti et al., 2013).
Samotný bunkový cyklus pozostáva zo štyroch základných fáz: G1, S, G2 a M
(Obr. 1).
Obrázok 1 Fázy bunkového cyklu
(http://ricochetscience.com/category/diseases/cancer/)
Najdlhšou z celého bunkového cyklu je G1 fáza (približne 40 % BC; 6-
12 hodín). Počas tejto prípravnej fázy sa syntetizujú komponenty, potrebné pre
samotnú replikáciu (syntézu) DNA. Pri prechode bunky z G1 do S fázy
bunkového cyklu nasleduje kontrolný bod G1/S (checkpoint), kde dochádza ku
kontrole, či je všetko v poriadku, aby bunka mohla pokračovať v delení.
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
9
Syntéza DNA prebieha v S (syntetizačnej) fáze bunkového cyklu a trvá
takmer toľko, čo G1 fáza (39 % BC; 6-8 hodín). G2 je opäť prípravná fáza,
uskutočňuje sa v nej príprava na presné rozdelenie genetického materiálu počas
mitózy do dvoch dcérskych buniek. Táto fáza je podstatne kratšia (19 % BC; 3-
4 hodiny) ako predchádzajúce fázy. Pri prechode z G2 do M fázy sa vyskytuje
ďalší kontrolný bod G2/M checkpoint. Fázy G1, S a G2 sú súčasťou interfázy
trvajúcej 6-36 hodín, ktorá oddeľuje mitotické delenie bunky. Bunkový cyklus
sa vo fázach G1 a G2 spomalí alebo zastaví, aby mohla prebehnúť kontrola
kvality DNA. Je to príležitosť na opravu genetického materiálu alebo iniciáciu
apoptózy, ktorou je poškodená bunka odstránená. Po interfáze končiacej fázou
G2, ak nie sú zistené nedostatky, bunka vstupuje do poslednej, najkratšej fázy
bunkového cyklu (Obr. 2), M fázy - mitóza (2 % BC; 0,5-2 hodiny).
Obrázok 2 Mitóza
(http://www.quia.com/jg/2497938list.html)
Začína profázou, počas ktorej sa rozrušuje jadrová membrána, centriola
sa rozdelí na dve a s mikrotubulami vytvára deliace vretienko, zaniká jadierko,
chromozómy sa skracujú, stávajú sa rozlíšiteľné - špiralizujú sa. V metafáze sú
chromozómy maximálne špiralizované a preto najlepšie rozlíšiteľné. Zoraďujú
sa do centrálnej - ekvatoriálnej roviny, nastáva pozdĺžne rozštiepenie
chromozómov na dve dcérske chromatídy, ktoré zostávajú zatiaľ spojené
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
10
centromérou (Giorgetti et al., 2013). V anafáze sa centroméra rozdelí na dve,
takto sú chromozómy úplne rozštiepené na dve chromatídy, každá chromatída
sa stáva dcérskym chromozómom. Dcérske chromozómy skracovaním
mikrotubúl deliaceho vretienka sa rozostupujú k protiľahlým pólom bunky.
V poslednej fáze mitózy telofáze zaniká deliace vretienko, chromozómy sa
dešpiralizujú - rozpletajú sa, vznikom dcérskych jadier končí karyokinéza -
delenie jadra a utvára sa nová jadrová membrána. Syntetizuje sa jadierko,
nastáva cytokinéza - rozdelenie cytoplazmy a následne zaškrtením materskej
bunky v strede sa vytvára deliaca brázda, až dochádza k rozdeleniu bunky za
vzniku dvoch dcérskych buniek. Po mitóze môžu bunky pokračovať v cykle
delenia alebo vstúpiť do pokojovej fázy G0, nepotrebné alebo poškodené bunky
sú odstránené apoptózou (Giorgetti et al., 2013).
Pohlavné bunky vznikajú počas redukčného delenia (meióza), ktoré
pozostáva z dvoch krokov (Obr. 3). Počas prvého redukčného delenia
nedochádza k rozdeleniu sesterských chromatíd, ale vždy jeden celý
chromozóm (pozostávajúci z dvoch chromatíd) z párových chromozómov
(jeden pochádza od matky a druhý od otca) je priťahovaný k protiľahlým pólom
bunky (Giorgetti et al., 2013). Takýmto spôsobom dochádza k vytvoreniu
buniek s haploidným počtom chromozómov. Počas druhého mitotického
delenia dochádza k rozdeleniu sesterských chromatíd, za vzniku 4 pohlavných
buniek s haploidným počtom chromozómov.
Obrázok 3 Meióza, redukčné delenie
(http://www.fertilab.net/ginecopedia/fertilidad/problemas_en_la_mujer/ovarios/los_ovarios_1)
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
11
1.2 Regulačné mechanizmy bunkového cyklu
Kľúčovú úlohu v regulácii bunkového delenia zohrávajú: cyklíny (A, B,
D a E), serín/treonín cyklín dependentné kinázy (CDK), Rb (retinoblastoma)
proteín ako aj inhibítory cyklín dependentných kináz (CDKI). Každá fáza
bunkového cyklu je regulovaná inými cyklínmi, ktoré vytvárajú komplex s
príslušnou cyklín dependentnou kinázou. Vznikom komplexu dochádza k
aktivácii CDK. Bunka vstupuje do G1 fázy bunkového cyklu na základe
signálov, ktoré prichádzajú z medzibunkového prostredia. Pôvodcovia týchto
signálov sú rastové faktory alebo mitogénne stimuly. Rastové faktory interagujú
s príslušnými membránovými receptormi, čo vedie k ich aktivácii. Z
aktivovaného receptora sa signál prenáša do vnútra bunky, napr. na Ras proteín,
ktorý prostredníctvom proteínovej kaskády indukuje expresiu cyklínu D1 v
skorej G1 fáze (Obr. 4).
Obrázok 4 Aktivácia bunkového cyklu
(http://journals.prous.com/journals/dof/20012611/html/df261087/images/Adjei_f1.gif)
Gény pre rastové faktory, receptory rastových faktorov, gény kódujúce
bunkové prenášače signálu a nukleárne transkripčné faktory sa považujú za
onkogény, tieto gény sú často mutované v zhubných nádoroch, ako aj v
nádorových líniách. Mutácie v týchto génoch spôsobujú, že gény nereagujú na
signály pre ich „vypnutie“ (represiu), následkom čoho dochádza k stabilnej
proliferácii buniek (Cooper, 2000). G1 fáza bunkového cyklu je regulovaná
cyklínom D1, ktorý vytvára komplex s cyklín dependentnou kinázou 4 alebo 6
(CDK4/6). Komplex D – CDK4/6 fosforyluje Rb proteín. Gén pre Rb proteín je
považovaný za tumor supresorový gén, nakoľko je priebežne fosforylovaný v
priebehu celého bunkového cyklu. V tomto proteíne sa nachádza až 15 polôh,
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
12
ktoré môžu byť fosforylované. Na konci bunkového cyklu je
hyperfosforylovaný Rb proteín, defosforylovaný enzýmom PP1 (protein
phosphatase 1). Fosforyláciou Rb proteínu dochádza k uvoľneniu väzby medzi
Rb a E2F proteínom, ktorý je transkripčným faktorom. E2F vytvára spolu s DP
proteínom heteroduplex (E2F/DP komplex) (Obr. 5), ktorý sa po aktivácii viaže
na špecifické DNA sekvencie v promótorových oblastiach génov (E2F
responsive elements), ktoré sú regulované E2F a sú dôležité počas bunkového
cyklu.
Obrázok 5 Regulácia bunkového cyklu. CDK – cyklín dependentné kinázy, pRB –
fosforylovaný Rb proteín, E2F – transkripčný faktor, DP – DP proteín (Bačová et al., 2005)
Komplex Rb/E2F/DP sa môže viazať na DNA, pôsobí ako supresor,
zabraňuje transkripcii E2F regulovaných génov. E2F transkripčný faktor
reguluje transkripciu troch skupín génov: a) gény riadiace prechod z G1 do S
fázy bunkového cyklu (gény kódujúce cyklín E, A, c - myc, pRB a p107); b)
gény pre syntézu a replikáciu DNA (gény kódujúce enzým dihydrofolát
reduktáza DHFR), Cdc6, tymidín kináza (TK), DNA polymeráza; c) gén
kódujúci p19ARF, ktorý reguluje apoptózu. Na konci G1 fázy je syntetizovaný
cyklín E, ktorý vytvára komplex s CDK2, check point kinázou. Tento komplex
umožňuje posun bunkového cyklu z G1 do S fázy. Komplex cyklín E – CDK2
taktiež fosforyluje Rb proteín, čo umožňuje aktiváciu ďalších proteínových
komponentov, ktoré sa zúčastňujú na priebehu bunkového cyklu. S fáza
bunkového cyklu je regulovaná cyklínom A, ktorý vytvára komplex s CDK2.
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
13
Tento komplex opäť fosforyluje Rb proteín, čo je dôležité pre aktiváciu
faktorov, potrebných v tejto fáze bunkového cyklu. Cyklín B je syntetizovaný
a uplatňuje sa v G2 a M fáze bunkového cyklu. Vytvára komplex s CDK1,
označovanou aj ako CDC2, za vzniku hlavnej mitotickej kinázy MPF (M -
phase Promoting Factor). Táto kináza umožňuje presun do M fázy bunkového
cyklu. Inaktiváciu MPF kinázy zabezpečuje cyklín B, čím sa ukončí mitóza.
Počas G2 fázy je CDC2 neaktívna v dôsledku väzby Wee1 a Myt1 kinázy. Po
vstupe do M fázy je táto kináza aktivovaná (Cooper, 2000). Významnú úlohu v
regulácii bunkového cyklu zohrávajú inhibítory cyklín dependentných kináz
(CDKI), ktoré sú schopné v rôznych fázach rôznymi mechanizmami inhibovať
priebeh bunkového cyklu. Dôvodom inhibície bunkového cyklu môže byť
poškodenie DNA. Na regulácii bunkového cyklu sa podieľajú dve skupiny
CDKI (Obr. 6).
Obrázok 6 Inhibítory cyklín dependentných kináz (CDKI), CDK – cyklín dependentné kinázy,
CIP/KIP – skupina inhibítorov cyklín dependentných kináz, INK4 – skupina inhibítorov cyklín
dependentných kináz (Bačová et al., 2005).
Zatiaľ čo skupina INK4 inhibítorov sa viaže na CDK, čo bráni tvorbe
komplexu medzi cyklínom a CDK, CIP/KIP skupina inhibítorov sa viaže na už
vytvorený komplex cyklín – CDK. K INK4 skupine inhibítorov patria proteíny
p15, p16, p18 a p19. Tieto inhibítory sa uplatňujú pri blokovaní G1 fázy
bunkového cyklu. Do skupiny CIP/KIP inhibítorov patria proteíny p21, p27 a
p57, ktoré blokujú S a G2 fázu bunkového cyklu, patria sem: cyklín E – CDK2,
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
14
cyklín A – CDK2 a cyklín B – CDK1. Okrem iného, CIP/KIP inhibítory sú
potrebné pri tvorbe funkčného komplexu cyklín D – CDK. Z tohto dôvodu
hladiny niektorých inhibítorov CDK stúpajú a klesajú v určitých špecifických
časových intervaloch počas bunkového cyklu. Inhibítory CDK sú aktivované
rôznymi signálnymi dráhami, napr. prostredníctvom proteínu p53, ATM/ATR
kinázovou signálnou dráhou, nádorovým rastovým faktorom beta (tumor
growth factor - β, TGF - β) (Cooper, 2000).
1.3 Replikácia DNA
Replikácia DNA je nevyhnutným krokom pri delení buniek. V priebehu
S fázy bunkového cyklu dochádza k zdvojeniu genetickej informácie, ktorá v
neskorších fázach bunkového cyklu je odovzdaná dcérskej bunke. Replikácia
DNA je semi-konzervatívny proces, čo znamená, že každý reťazec pôvodnej
DNA molekuly slúži ako šablóna (template) na vytvorenie komplementárneho
dcérskeho reťazca. Novo-syntetizovaná molekula DNA pozostáva z jedného
rodičovského a jedného dcérskeho (novo-syntetizovaného) reťazca DNA.
Replikácia DNA začína v špeciálnych oblastiach chromozómov, označovaných
ako Ori (origin). Samotnej replikácii predchádza uvoľnenie chromatínovej
štruktúry v tejto oblasti, čo umožňuje naviazanie celej proteínovej mašinérie na
DNA (Cooper, 2000). Syntéza DNA je iniciovaná vytvorením replikačnej
vidlice (Obr. 7).
Obrázok 7 Replikačná vidlica
(http://pdbj.org/eprots/index_en.cgi?PDB%3A3BEP)
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
15
Na replikácii DNA sa zúčastňuje veľké množstvo proteínov, ktoré
zabezpečujú lokálne rozpletenie DNA, stabilitu a ochranu prechodne vzniknutej
jednoreťazcovej DNA, ktorá vzniká po rozpletení DNA, DNA polymerázy
(Pol , Pol ), primáza a ligáza, ktorá spája novo-syntetizované úseky. Nakoľko
DNA polymeráza je schopná syntetizovať DNA iba v smere 5 3 , jeden z
reťazcov sa syntetizuje kontinuálne a označuje sa ako vedúci reťazec (leading
strand), kým druhý reťazec sa označuje ako zaostávajúci (lagging strand). Tento
reťazec sa syntetizuje v krátkych tzv. Okazakiho úsekoch, aby mohla byť
zachovaná syntéza v smere 5 3 . Posunom replikačnej vidlice je replikovaná
DNA opäť špiralizovaná, za pomoci histónových a nehistónových proteínov
(Cooper, 2000). Replikácia je iniciovaná súčasne na niekoľkých miestach
chromozómov a syntéza DNA prebieha oboma smermi od miesta začiatku
syntézy.
1.4 Molekulárne mechanizmy genetických mutácií
Každý organizmus je denne vystavovaný pôsobeniu rôznych
chemických, fyzikálnych a biologických faktorov, ktoré sa nachádzajú v
životnom prostredí. Tieto faktory sú schopné navodzovať rôznorodé poškodenia
genetického materiálu v somatických a zárodočných bunkách, ktoré po fixácii v
DNA môžu viesť k vzniku genetických mutácií. V takomto prípade hovoríme o
indukovaných mutáciách. Genetické zmeny môžu byť navodené aj v dôsledku
endogénneho metabolizmu alebo vplyvom chýb pri replikácii DNA. Mutácie,
ktoré vznikajú v dôsledku týchto procesov nazývame spontánne mutácie.
Akumulácia mutácií v genetickej výbave bunky, najmä v génoch, ktoré
kontrolujú bunkový cyklus, proliferáciu buniek a bunkovú smrť (proto -
onkogény) alebo v génoch zodpovedných za zachovanie integrity genómu
(tumor supresorové gény), môže mať za následok vznik nádoru (Russel a
Cummings, 2002).
1.5 Faktory vonkajšieho prostredia
Chemické a fyzikálne faktory môžu navodiť v DNA rôzne typy
poškodení, ktoré ak nie sú z DNA odstránené (opravené) môžu spôsobovať
génové mutácie, t.j. zmeny v sekvencii DNA. Pôsobením faktorov vonkajšieho
prostredia však môžu byť v bunke navodené aj rozsiahle poškodenia
genetického materiálu, ktoré majú za následok zmeny v počte a štruktúre
chromozómov (Bačová et al., 2005).
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
16
1.5.1 Charakter zmien DNA vyvolaných chemickými a fyzikálnymi faktormi
K zmenám, ktoré môžu viesť ku génovým mutáciám patrí deaminácia
báz. V dôsledku deaminácie sa pôvodná báza mení za inú (5-metylcytozín sa
mení na tymín, cytozín sa mení na uridín) alebo sa mení na zlúčeninu, ktorá má
iné párovacie schopnosti (guanín sa mení na xantín a adenín na hypoxantín).
Kým prítomnosť uridínu v DNA je účinne opravená opravnými mechanizmami
bunky, zámena 5-metylcytozín na tymín môže viesť k zmenám v regulácii
expresie génov. Deaminácia purínov má za následok zmenu v párovacích
schopnostiach týchto báz, xantín sa páruje s tymínom, kým hypoxantín s
cytozínom. Táto zámena spôsobuje zmeny v sekvencii dcérskeho reťazca pri
replikácii DNA. K takýmto zmenám môže dochádzať spontánne, napr. v
dôsledku hydrolýzy, ale aj pôsobením cudzorodých látok (xenobiotík). K
depurinácii báz, t.j. k strate purínov (adenín, guanín) môže taktiež dochádzať
spontánne, ale aj pôsobením napr. chemických látok. Vplyvom fyzikálnych
faktorov (UV svetla), ale aj viacerých chemických látok dochádza k tvorbe
medzi-reťazcových (interstrand) alebo vnútro-reťazcových (intrastrand)
krížových väzieb (crosslinks) v DNA alebo môže dochádzať k väzbe medzi
DNA a proteínmi. Tieto poškodenia sú prekážkou pre replikáciu aj transkripciu
DNA. Niektoré chemické látky sa môžu včleniť (interkalovať) do štruktúry
DNA. Túto vlastnosť majú fluorescenčné farbivá, ktoré sa využívajú na
farbenie DNA (napr. akridíny, etídium bromid a iné). Schopnosť chemických a
fyzikálnych faktorov vyvolávať rôzne typy poškodení DNA, ktoré sú prekážkou
pre replikáciu, t.j. proliferáciu buniek, sa využiva aj v liečbe onkologických
ochorení. Cieľom terapie je navodiť poškodenie v proliferujúcich bunkách, t.j.
v nádorovom tkanive, ktoré by viedlo k eliminácii týchto buniek. K najčastejšie
využívaným terapeutikám patria alkylačné antineoplastiká (napr.
cyklofosfamid, melfalan, deriváty močoviny), deriváty cis-platiny (indukcia
krížových väzieb), bleomicín (rádiomimetikum) a ionizačné žiarenie. Chemické
látky, napr. polycyklické aromatické uhľovodíky (PAH), kam patrí aj
benzpyrén, vyvolávaju tvorbu poškodení, v dôsledku naviazania objemných
molekúl chemických látok na DNA, čím spôsobujú konformačné zmeny DNA
molekuly. Alkylačné poškodenia v dôsledku pôsobenia chemických látok sú
taktiež prekážkou pre replikáciu a transkripciu DNA. Viaceré chemické aj
fyzikálne faktory indukujú v DNA oxidačné poškodenia, či už priamo alebo
nepriamo, v dôsledku oxidačného stresu. Oxidácia guanínu v polohe C8 (8-oxo
dG), sa považuje za najzávažnejšie oxidačné poškodenie, ktoré vedie k
mutáciám v DNA. Predpokladá sa, že akumulácia oxidačných poškodení v
DNA súvisí s procesom starnutia a je aj príčinou zvýšeného rizika vzniku
nádorového ochorenia. K poškodeniam, ktoré sú navodené hlavne fyzikálnymi
faktormi patria zlomy DNA a to jednoreťazcové (single strand breaks) a
dvojreťazcové zlomy (double strand breaks). Práve tvorba dvojreťazcových
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
17
zlomov patrí k najzávažnejším poškodeniam DNA, ktoré, ak nie sú opravené,
spôsobujú smrť bunky (Bačová et al., 2005).
1.6 Génové mutácie
Zmeny v sekvencii DNA v dôsledku poškodenia môžu spôsobiť rôzne
typy genetických zmien. Zámena bázy za inú sa označuje ako bodová mutácia
alebo substitúcia. Pri zámene purínu za iný purín alebo pyrimidínu za iný
pyrimidín hovoríme o tranzícii, kým pri zámene purínu za pyrimidín alebo
opačne hovoríme o transverzii. Zámena bázy nemusí viesť priamo k zmenám v
poradí aminokyselín pri translácii, vzhľadom na skutočnosť, že genetický kód
je degenerovaný, t.j. viac kodónov kóduje tú istú aminokyselinu (Obr. 8).
Obrázok 8 Bodová mutácia
(http://www.intelihealth.com/article/dna-genes-and-chromosomes)
Substitučné mutácie však môžu viesť k vytvoreniu tzv. missence
mutácie, vzniká nefunkčný proteín alebo proteín so zmenenými vlastnosťami,
prípadne nonsence mutácie, ak zámenou bázy sa vytvoril stop kodón, čo má za
následok syntézu skráteného proteínu (Russel a Cummings, 2002). K vzniku
génových mutácií môže dôjsť aj v dôsledku vsunutia alebo eliminácie jednej
alebo viacerých báz, čo spôsobí posun čítacieho reťazca, za vzniku tzv.
posunových alebo frameshift mutácií. V dôsledku posunu je syntetizovaný
proteín, ktorý má zmenené vlastnosti, má iné vlastnosti alebo je úplne
nefunkčný (Obr. 9). Vsunutie tripletu báz (celý kodón) spôsobí inzerciu novej
aminokyseliny do syntetizovaného proteínu prípadne naopak, strata kodónu =
strata aminokyseliny. Výsledkom syntézy je opäť proteín s inými vlastnosťami
ako mala pôvodná bielkovina. Mutácie v regulačných oblastiach génov môžu
viesť k zmenám v expresii génov. Gény, ktoré sú kľudové, napr. gény
regulujúce bunkový cyklus sa exprimujú (prepisujú) v diferencovaných
bunkách. Môžu indukovať amplifikáciu génu, tzv. lokálna replikácia
(„namnoženie“) génu, čo spôsobuje, že daný gén sa nachádza vo viacerých
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
18
kópiách, t.j. je nasyntetizovaný vo väčšom množstve (Russel a Cummings,
2002).
Obrázok 9 Príklady posunových (frameshift) mutácií
(http://www.intelihealth.com/article/dna-genes-and-chromosomes)
2 Organizácia genetického materiálu bunky - bunkový genóm
Termínom genóm sa označuje súbor všetkých génov jedinca, niekedy sa
genómom rozumie súbor génov v haploidnej sade chromozómov. Bunkové
štruktúry, ktoré obsahujú génovú DNA sa označujú ako genofory. Genofory s
najväčším počtom génov sú chromozómy, menší počet génov obsahujú
plazmidy, prípadne iné mimo chromozómové genofory. Genóm
prokaryotických buniek pozostáva z jedného chromozómu a plazmidov.
Genóm eukaryotických buniek pozostáva z viacerých jadrových chromozómov,
chromozómov mimojadrových (mitochondriálnych a v rastlinných bunkách aj
chloroplastových) a v niektorých prípadoch aj z plazmidov. Jadrové
chromozómy sa označujú ako jadrový genóm, súbor nejadrových genoforov
ako plazmón. Ak je bunka hostiteľom vírusu, môže sa v určitých situáciách
uplatňovať na determinácii vlastností bunky aj vírusový genóm (napr. pri
nádorovej transformácii buniek). U človeka existujú dva genómy: zložitý
nukleárny a jednoduchý mitochondriálny genóm (Cooper, 2000).
2.1 Chromozómy
Chromozómy sú najvýznamnejšie jadrové komponenty, ktoré obsahujú
genetickú informáciu bunky a odovzdávajú ju nasledujúcej generácii buniek
(Jakolev, 1976). Zohrávajú dôležitú úlohu pri zabezpečovaní presného
rozdelenia genetického materiálu do dcérskych buniek počas meiotického a
mitotického delenia materských buniek. Ich tvar a počet je u jednotlivých
organizmoch konštantný (Tab. 1). Pod mikroskopom sa javia ako tenké
štruktúry. Pozostávajú z krátkych a dlhých ramien (chromatídy) separovaných
primárnou konstrikciou nazývanou centroméra. Krátke rameno sa označuje
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
19
písmenom p a dlhé písmenom q. Centroméra je aj miestom uchytenia deliaceho
vretienka, ktoré je nevyhnutné pre správny pohyb a segregáciu chromozómov
počas bunkového delenia.
Tabuľka 1 Diploidný počet chromozómov vybraných zvierat, vrátane človeka
(Lawrence a Fowler, 2002)
Druh Latinský názov Diploidný
počet (2n)
Americký bizón Bison bison 60
Človek Homo sapiens 46
Domestikovaná kačica Anas platyrhyncha 80
Domestikovaná koza Capra hircus 60
Domestikovaná ošípaná Sus scrofa 38
Domestikovaná ovca Ovis aries 54
Domestikovaná sliepka Gallus domesticus 78
Domestikovaný byvol Bubalus bubalus 48
Domestikovaný kôň Equus caballus 64
Domestikovaný králik Oryctolagus cuniculus 44
Európske divé prasa Sus scrofa 36
Európsky domestikovaný dobytok Bos taurus 60
Holub Columbia livia 80
Kačica pižmová Cairina moschata 80
Mačka Felis catus 38
Mongolský divý kôň Equus przewalskii 66
Morča Cavia cobaya 64
Morka domáca Meleagris gallopavo 82
Myš domová Mus musculus 40
Perzský divý somár onager Equus hemionus 56
Pes Canis familiaris 78
Potkan Rattus norvegicus 42
Sob Rangifer tarandus 70
Somár Equus asinus 62
Včela medonosná Apis mellifera 32
Zebu domestikovaný dobytok Bos indicus 60
Celková dĺžka králičích chromozómov na somatickú bunku varíruje od
90 μm do 187 μm (Nichols et al., 1965). Závisí od štádia mitotického cyklu.
Napriek variabilnosti rozmerov chromozómov sú chromozómy stabilnými
komponentmi jadra (Jakolev, 1976). Typy chromozómov na základe polohy
centroméry Levan et al. (1964):
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
20
• metacentrický - centroméra v dlhom chromozóme je uprostred,
• submetacentrický - ramená chromatídy sa líšia svojou dĺžkou,
• akrocentrický - centroméra delí chromozóm na dve nerovnaké časti,
• telocentrický - centroméra je umiestnená na konci metafázneho chromozómu.
Na základe špiralizácie respektíve dešpiralizácie DNA uloženej v
chromozómoch majú chromozómy odlišný morfologický vzhľad. Počas
interfázy bunkového cyklu sa chromozómy dajú pozorovať pomocou
svetelného mikoskopu vybaveného fázovým kontrastom ako dlhé vlákna, kedy
sú dešpiralizované. Okamžite po procese špiralizácie chromozómy získavajú
tvar jednoduchých respektíve zdvojených 1-30 μm tyčiniek. Štúdium
morfologickej stavby chromozómov sa najlepšie uskutočňuje na metafáznych
chromozómoch, kedy sú chromozómy maximálne špiralizované a dobre
farbiteľné jadrovými farbivami (Parkányi et al., 2006). Chromozómy sú
zadelené do troch skupín na základe dĺžky krátkych a dlhých ramien a
umiestnenia centroméry (Obr. 10). Metacentrické chromozómy majú krátke a
dlhé ramená približne rovnakej dĺžky a centroméru umiestnenú v strede
chromozómu. Submetacentrické majú krátke a dlhé ramená odlišnej dĺžky a
centroméra je posunutá viac k jednému koncu. Akrocentrické chromozómy
majú veľmi malé krátke ramená a centroméru umiestnenú blízko jedného
konca. Často je u chromozómov prítomná sekundárna konstrikcia na krátkých
ramenách, kde sa pripájajú krátke úseky DNA nazývané satelity. Obsahujú
gény kódujúce ribozomálnu RNA. Novozélandský biely králik má 5 párov
metacentrických, trinásť párov submetacentrických, dva páry
subtelocentrických a dva páry telocentrických chromozómov.
Obrázok 10 Rozdelenie chromozómov na základe polohy centroméry
(http://on-line.ucol.ac.nz/genetics/P6%20Page%201.html)
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
21
2.2 Karyotyp a idiogram
Karyotyp tvorí systematické zoradenie chromozómov jednej bunky
(Obr. 11). Idiogram, teda priemerný karyotyp predstavuje grafické zobrazenie
karyotypu, ktoré je založené na meraní chromozómov vo viacerých bunkách
(Srb, 1975).
Obrázok 11 G- prúžkovaný humánny karyotyp
(http://www.springerimages.com/Images/LifeSciences/5-10.1186_1741-7007-6-18-0)
3 Metódy cytogenetiky
3.1 Klasické metódy karyotypingu
Caspersson et al. (1970) zadefinovali techniku, tvoriacu vzory
horizontálnych pruhov na chromozómoch (tzv. bandy), ktoré odlišujú jednotlivé
gonozómy a páry homologických chromozómov v genóme bunky (Pergament,
2008). Následne bolo vyvinutých viacero prúžkovacích (bandovacích) techník,
ktoré je možné zadeliť do dvoch hlavných kategórií: postupy, ktoré vytvárajú
špecifické prúžky po celej dĺžke chromozómu a metódy, ktoré farbia iba
špecifickú oblasť vybraných alebo všetkých chromozómov (Gersen a Keagle,
2005). Najčastejšie využívanou technikou pre vyšetrovanie metafáznych
chromozómov je tzv. G-banding, ktorý vytvára sériu svetlých a tmavých
prúžkov pozdĺž chromozómu. Svetlé G-prúžky sú signifikantnejšie
z biologického hľadiska, nakoľko reprezentujú aktívne časti chromozómov (tzv.
euchromatínové oblasti), kým tmavé G-prúžky obsahujú relatívne málo
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
22
aktívnych génov (tzv. heterochromatín). Okrem uvedenej metódy existujú aj
ďalšie, ako napríklad R-banding (opak G-bandingu), C-banding (zobrazujúci
umiestnenie a počet centromérových oblastí), T-banding (zameraný na
prúžkovanie telomér). Konvenčná cytogenetika predstavuje najčastejši spôsob
vyšetrenia metafáznych chromozómov v rámci jednej bunky - teda zostavenie
karyotypu a deteguje všetky typy prítomných zmien, ak je zasiahnutá časť
dostatočne veľká (Gersen a Keagle, 2005; Li a Pinkel, 2006). Hoci cestou
klasickej cytogenetiky analyzujeme celý genóm v rámci jednej analýzy, jej
rozlišovacia schopnosť je relatívne nízka a viacero submikroskopických zmien
zostáva neodhalených. Pre identifikáciu týchto zmien, musí byť cytogenetická
analýza doplnená citlivejšími metódami, akými sú metódy molekulárnej
cytogenetiky (Jarošová, 2007).
3.2 Moderné metódy molekulárnej cytogenetiky
Rekombinantné DNA technológie poskytli metódy pre vytvorenie a
značenie vysokošpecifických DNA sond, ktoré rozpoznávajú špecifické
sekvencie DNA v chromozómoch a s vysokou špecificitou hybridizujú priamo
k chromozómálnej vzorke. Kombinácia molekulárnej genetiky a konvenčnej
cytogenetiky vytvorila novú éru v klinickej genetike tzv. molekulárnu
cytogenetiku (Pergament, 2008). Prvý prevrat v oblasti cytogenetiky priniesla
metóda fluorescenčnej in situ hybridizácie, vďaka jej schopnosti štúdia
chromozómových aberácii aj v interfáznych jadrách, senzitivite, špecificite a
rýchlosti, ktoré jej otvorili dvere v celom rade klinických štúdií modernej
molekulárnej cytogenetiky (Mundle a Sokolova, 2004).
3.2.1 Fluorescenčná in situ hybridizácia
Fluorescenčná in situ hybridizácia (FISH) je cytogenetická technika,
ktorá slúži na detekciu prítomnosti alebo neprítomnosti a umiestnenia
špecifických sekvencií génu. Je primárnou technikou využívanou v
molekulárno-cytogenetickej charakterizácii chromozómov (Pandley a Mishra,
2007). Umožňuje vizualizovať špecifické cytogenetické abnormality (počty
numerických aberácií), ako napríklad chromozomálna delécia, amplifikácia a
translokácia. FISH sa využíva v prenatálnej diagnostike a slúži aj ako
diagnostický a prognostický marker pre rôzne sarkómy. V poslednej dobe FISH
nachádza využitie v oblasti dermatológie, pri hodnotení melanocytických lézií
(Amy et al., 2013). FISH je metóda, ktorá môže byť použitá pri detekcii malých
delécií a duplikácii, ktoré nie sú viditeľné pomocou klasickej mikroskopickej
analýzy. Rovnako, nachádza uplatnenie pri detekcii počtu chromozómov
určitého typu v jednotlivých bunkách a identifikácii zmien v štruktúre
chromozómov. FISH sa zameriava predovšetkým na analýzu určitej oblasti
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
23
konkrétneho chromozómu. Za týmto účelom sa využíva malé množstvo
špecifickej chemickej látky, ktorá indukuje svetlo po naviazaní sa na konkrétnu
oblasť chromozómu. Na detekciu svetelných signálov na chromozómoch sa
používa špeciálny mikroskop. Napríklad, ak človek je nositeľom delécie, len
jeden svetlý bod môže byť zaznamenaný namiesto dvoch (jeden na každom
chromozóme). V prípade ak došlo k duplikácii, tri svetlé body možno
identifikovať namiesto pôvodných dvoch.
3.2.1.1 Vývoj FISH metódy
V roku 1953 James Watson a Francis Crick opísali rozsiahlu sieť
vodíkových väzieb, ktoré držia pokope dve antiparalelné vlákna v
dvojreťazcovej molekule DNA (Watson a Crick, 1953). V súčasnej dobe je
známe, že adenín na jednom reťazci DNA sa viaže s tymínom na
komplementárnom reťazci DNA, cytozín sa viaže s guanínom. Vzhľadom na
viacero vodíkových väzieb vytvorených medzi týmito bázami, dvojitá špirála
predstavuje stabilnú štruktúru. Navyše, v prípade, ak vodíkové väzby, ktoré
držia špirálu pokope sa narušia vplyvom teploty alebo pôsobením chemikálií,
špirála je schopná reformácie po opätovnom vytvorení vhodných podmienok.
Táto schopnosť reformácie alebo renaturácie molekuly DNA tvorí základ pre
molekulárnu hybridizáciu. Pri molekulárnej hybridizácii, značená sekvencia
DNA alebo RNA sa využíva ako sonda pre identifikáciu alebo kvantifikáciu
komplementárnych sekvencií vo vzorke. V roku 1960 Joseph Gall a Mary Lou
Pardue zistili, že molekulárna hybridizácia môže byť využitá pre identifikáciu
pozície sekvencií DNA metódou in situ (tj v ich prirodzenej pozícii na
chromozóme). V roku 1969 bolo preukázané, že rádioaktívne kópie
ribozomálnej sekvencie DNA môžu byť použité pri detekcii komplementárnych
sekvencií DNA v jadre žabích ikier. Od tohto zistenia, viacero modifikácií
prispelo k zvýšeniu všestrannosti a citlivosti metódy do tej miery, že in situ
hybridizácia je v súčasnosti považovaná za základnú metódu cytogenetiky.
V krátkej dobe po publikácii výsledkov (Gall a Pardue, 1960), fluorescenčné
značky nahradili rádioaktívne značenie u hybridizačných sond, vzhľadom k
vyššej miere bezpečnosti, stability a jednoduchosti detekcie (Rudkin a Stollar,
1977). Najaktuálnejšia podoba FISH in situ hybridizácie sa vykonáva na
základe postupov (Trask, 2002; Speicher a Carter, 2005).
3.2.1.2 Princíp FISH metódy
DNA v bunkách pozostáva z dvoch vlákien organizovaných do štruktúry
známej ako dvojitá špirála (Double Helix) (Obr. 12). Každé z vlákien obsahuje
sekvenciu pozostávajúcu z kombinácie štyroch báz (A, T, G a C). Jednotlivé
vlákna sú schopné viazať sa medzi sebou a takýmto spôsobom udržať
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
24
kompletnú molekulu DNA. To je možné iba v prípade, ak sú vlákna korektne
spárované, teda vzájomne komplementárne (A sa môže viazať len s T a C sa
môže viazať len s G). Ak sa nájdu dve komplementárne sekvencie, naviažu sa
na seba, teda hybridizujú. Metóda FISH spočíva v schopnosti špecifickej
hybridizácie jedného vlákna DNA k inému vláknu DNA. FISH využíva krátke
vlákna DNA, označované ako sondy, ktoré sú fluorescenčne značené. Sondy sú
komplementárne k špecifickej časti chromozómu.
Obrázok 12 Vlákna DNA v tvare dvojitej špirály spájané medzi bázovými pármi
(http://www.picstopin.com/400/pictures-library-dna-double-helix/http:||faculty*ksu*edu*
sa|al-saleh|Pictures%20Library|_w|DNA%20double%20helix_jpg*jpg/)
Ak DNA je zahrievaná, dvojvláknovú DNA je možné rozdeliť na dve
samostatné vlákna, teda denaturovať. Následne sondy sú schopné hybridizovať
ku komplementárnej sekvencii DNA (Obr. 13). Ak je v oblasti
komplementárnej k sonde prítomná delécia, sonda sa nenaviaže. Ak došlo
k duplikácii v komplementárnej oblasti, viacero sond hybridizuje s týmto
miestom. Metóda FISH zahŕňa teda väzbu alebo aneláciu fluorescenčne
značenej, cieľovo špecifickej sondy nukleovej kyseliny ku komplementárnej
DNA alebo RNA sekvencii, a následnú vizualizáciu týchto sond v bunkách
hodnoteného tkaniva. Hodnotené tkanivo môže byť fixované formaldehydom,
prípadne parafínom alebo ako čerstvé mrazené tkanivo. Najskôr DNA alebo
RNA sekvencie z hodnoteného tkaniva musia denaturovať, aby sa stali
jednovláknovými. Následne vybraná FISH sonda je aplikovaná. Detekciu
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
25
sekvencie DNA v podstate možno prirovnať k “hľadaniu ihly v kope sena“, kde
„ihlou“ je určitá sekvencia molekuly DNA a “kôpkou sena“ je sada
chromozómov. Detekcia je oveľa jednoduchšia, ak je k dispozícii "výkonný
magnet", v tomto prípade fluorescenčná kópia hľadanej sekvencie DNA.
Obrázok 13 Väzba fluorescenčne značenej sondy ku komplementárnej sekvencii DNA reťazca
( .rarechromo.org/information/Other/FISH%20FTNW.pdf )
K hybridizácii dochádza, ak "magnet" nachádza "ihlu", čo si vyžaduje
prítomnosť sondy a jej cieľovej sekvencie (Obr. 14). Sekvencia sondy, často
úsek klonovanej DNA je zobrazená na červeno. Cieľová DNA chromozómov
fixovaných na sklíčku je prezentovaná modrou farbou (v pravom stĺpci).
Vodíkové väzby, ktoré spájajú dve vlákna špirály DNA prezentujú čierne čiary.
Prvým krokom v tomto systéme je vytvorenie fluorescenčnej kópie sekvencie
sondy (Obr. 14b, stredný stĺpec) alebo modifikovanej kópie sekvencie sondy,
ktorá môže byť následne fluorescenčne interpretovaná (Obr. 14b, ľavý stĺpec).
Pred každým procesom hybridizácie, cieľová sekvencia a sekvencia sondy sa
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
26
musia denaturovať pôsobením teploty alebo chemicky (Obr. 14c). Tento krok
denaturácie je nevyhnutný pre vznik nových vodíkových väzieb medzi cieľovou
sekvenciou a sondou, v priebehu následného kroku v procese hybridizácie.
Sekvencia sondy a cieľová sekvencia sú následne zmiešané dohromady (Obr.
14d) a sonda špecificky hybridizuje ku komplementárnej sekvencii na
chromozóme. V prípade, ak sonda je už fluorescenčne aktívna (prostredný
stĺpec), je možné priamo identifikovať miesto hybridizácie. V ostatných
prípadoch (ľavý stĺpec), môže byť nevyhnutné vykonanie ďalšieho kroku,
potrebného pre vizualizáciu hybridizovanej sondy.
Obrázok 14 Princípy fluorescenčnej in situ hybridizácie FISH (Speicher a Carter, 2005)
Hybridy, vytvorené medzi sondami a ich chromozomálnymi cieľovými
úsekmi je môže detegovať použitím fluorescenčného mikroskopu. Pred voľbou
správneho dizajnu FISH experimentu je potrebné zvážiť, či citlivosť a
rozlíšenie potrebné pre realizovaný experiment je v možnostiach technických
limitov fluorescenčnej mikroskopie. Svetlená citlivosť konkrétneho mikroskopu
rozhoduje o tom, či je možné detegovať aj krátke cieľové sekvencie, ktoré sú
ťažšie vizualizovateľné, než veľké cieľové sekvencie. Rozlíšenie predstavuje
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
27
schopnosť diferenciácie medzi dvoma bodmi na štruktúre chromozómu.
Svetelná mikroskopia nedokáže presne selektovať objekty, ktoré sú od seba
vzdialené menej ako 200 až 250 nm, čo predstavuje dolnú hranicu viditeľného
svetelného spektra. Na základe týchto technických obmedzení je potrebné vziať
do úvahy usporiadanie molekuly DNA v chromozóme. Metafázne chromozómy
sú tisíckrát kompaktnejšie ako v štádiu interfázy, teda najmenej desaťkrát
kompaktnejšie ako samotná DNA (jeden 3,4 nm dlhý závit špirály DNA
zodpovedá 10 bázovým párom DNA). Na základe týchto faktov, spravidla je
možné očakávať rozlíšenie v rozsahu megabáz pre pozície na metafáznych
chromozómoch a rozlíšenie v rozsahu desiatkach tisícov kilobáz pre pozície
u interfáznych chromozómov.
3.2.1.3 Sondy využívané pri metóde FISH
Výber vhodnej FISH sondy je dôležitým krokom v diagnostickom teste,
pretože FISH deteguje iba tie chromozomálne abnormality, ktoré sú špecificky
viazané na využitie konkrétnej sondy. Rôzne sondy sa používajú v závislosti od
potreby analýzy. Napríklad, veľký počet opakujúcich sa cytogenetických
abnormalít bol identifikovaný u melanómov pri využití komparatívnej
genómovej hybridizácie (CGH), kde práve tieto opakujúce sa zmeny slúžia ako
vhodní kandidáti pre využitie FISH sondy (Song et al., 2011). Po výbere
vhodnej sondy, fluorescenčné značenie sondy sa môže uskutočniť buď priamo
alebo nepriamo. Pri metóde priameho fluorescenčného značenia, fluorochróm,
ktorý je detegovaný fluorescenčným mikroskopom je priamo viazaný na DNA
sondu. Pri nepriamej metóde, haptén, ktorý nie je viditeľný pod fluorescenčným
mikroskopom je začlenený do DNA sondy. Haptén je následne
imunohistochemicky detegovaný pomocou fluoroforom značenej protilátky.
Ďalej, fluorescenčne značená sonda a cieľová sekvencia DNA alebo RNA sú
združené v procese hybridizácie, pri ktorej fluorescenčne značená sonda nasadá
na cieľové sekvencie. Posthybridizačným premývaním sa odstránia nadbytočné
nenaviazané sondy. Sklíčka sú následné pripravené na analýzu. Viacero FISH
sond sa viaže k špecifickým častiam molekuly DNA predstavujúcich konkrétne
gény, za účelom detekcie prítomných zmien menšieho rozsahu. Tieto sú známe
ako lokus špecifické sondy. Iné sondy sa viažu k oblasti centroméry alebo
teloméry (konce ramien chromozómu), využívajú sa pre určenie počtu
konkrétnych chromozómov, respektíve pre identifikáciu chromozomálnych
prestávb. Existujú aj farebne značené sondy, ktoré sa viažu na celý chromozóm.
Lokus/génovo-špecifické sondy sa využívajú pri detekcii štrukturálnych
aberácií, ako sú delécie, duplikácie, amplifikácie, prestavby a inverzie.
Centromérové sondy sa využívajú pri detekcii numerických aberácii –
aneuploidií. Telomérovo-špecifické sondy sú využívané pri identifikácii zmien
menšieho rozsahu, ktoré zahŕňajú konce chromozómov. Celochromozómové
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
28
alebo tzv. paintingové sondy pozostávajúce z unikátnych sekvencií DNA sond
hybridizujú k lokusom pozdĺž celého chromozómu, čím umožňujú identifikáciu
tzv. marker chromozómov (chromozómy so štruktúrnou aberáciou) a
kryptických translokácií (S ansbury, 2003).
3.2.1.4 Vzorky ktoré sú vhodné pre FISH analýzu
FISH sa najčastejšie vykonáva u vzoriek krvi. Okrem iného, môže byť
súčasťou prenatálnej diagnostiky na prítomnosť aneuploidie (nadbytočné - extra
kópie celých chromozómov) z plodovej vody pri amniocentéze alebo u vzorky
placenty po odbere z choriových klkov (CVS). Menej často sa používa ako
prenatálny test na prítomnosť delécie z plodovej vody, respektíve u CVS
vzoriek.
3.2.1.5 Identifikácia pozície génov prostredníctvom FISH
FISH poskytuje účinný nástroj pre identifikáciu umiestnenia klonovanej
sekvencie DNA na metafáznych chromozómoch. Obrázok 15a poukazuje na
výsledky klasického FISH experimentu, v ktorom klonovaná sekvencia DNA
hybridizovala k normálmu metafáznemu chromozómu. Červené prúžky sú
detegované v mieste hybridizácie na dvoch homologických chromozómoch,
ktoré možno identifikovať na základe ich charakteristických prúžkov.
Presnejšie, každý červený prúžok pozostáva z dvoch miest, zodpovedajúcich
dvom sesterským chromatídam mitotického chromozómu. Tieto údaje
o hybridizácii spolu s prúžkovacou technikou je možné využiť pre umiestnenie
sekvencie sondy, v rámci niekoľkých megabáz iných známych génov na
chromozóme.
Obrázok 15 Cytogenetická analýza integrovaných klonov (Cheung et al., 2001)
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
29
Z historického hľadiska, výsledky FISH a ďalších in situ hybridizačných
techník zohrávali primárnu úlohu pri mapovaní génov na ľudských
chromozómoch. Výsledky z týchto experimentov boli postupne
zhromažďované v databázach a následne využívané pri riešení projektu
mapovania ľudského genómu (HGP). V súčasnosti, keď je ľudský genóm
kompletne zmapovaný, len zriedkavo sa využíva in situ hybridizácia pre
identifikáciu umiestnenia ľudského génu na chromozóme (Druhy, u ktorých
genóm nebol osekvenovaný, FISH a súvisiace metódy in situ hybridizácie aj
naďalej prinášajú dôležité dáta pri mapovaní pozícií génov na chromozómoch).
Využitie FISH u ľudí je v súčasnej dobe smerované najmä ku klinickým
diagnostikám.
3.2.1.6 Diagnostika chromozómových zmien cestou využitia karyotypu a FISH
FISH a iné postupy in situ hybridizácie sú dôležité v klinickej
diagnostike rôznych chromozomálnych zmien, vrátane delécií, duplikácií
a translokácií. Obrázok 15b poukazuje na príklad využitia FISH spolu s
metódou klasickej karyotypizácie, pri analýze translokácie. Hybridizačná sonda
je príslušná k časti chromozómu 19, ktorá je súčasťou identifikovanej
translokácie. Z fluorescenčného obrazu sú zrejmé tri oblasti hybridizácie. Jeden
z bodov zodpovedá normálnej kópii chromozómu 19 (nl19), ďalšie dve miesta
zodpovedajú zmeneným alebo odvodeným (der) verziám chromozómov 11 a
19, ktoré sú produktom translokácie. Na základe toho je možné presnejšie
identifikovať oblasť zlomu na chromozóme 19 a určiť druhý chromozóm
podieľajúci sa na translokácii. Hybridizačná sonda na Obrázku 15b bola jednou
z tisícich klonov umelých bakteriálnych chromozómov (BAC), využitých pri
projekte HGP, ktoré boli k dispozícii. V súčasnosti je možné využívať rozsiahle
zdroje HGP klonov pre presnú identifikáciu miest chromozomálnych prestávb,
ktoré sa vyskytujú v karyotype. Konzorcium vedcov zmapovalo viac než 7000
DNA klonov z HGP v určitom pásme na ľudských chromozómoch (BAC
Research Consortium, 2001). Minimálne jeden klon je k dispozícii pre každú
časť megabázy chromozomálnej DNA (Jedinou výnimkou je chromozóm Y,
ktorý je relatívne chudobný na obsah génov). Identifikácia delécie
prostredníctvom FISH, zvyčajne pri tomto type testu sú využívané dve sondy,
prvá sonda (zelená) predstavuje kontrolnú sondu, ktorá slúži na identifikáciu
oboch kópií chromozómu. Táto sonda hybridizuje k sekvencii, ktorá nie je
zahrnutá do úseku na ktorom došlo k delécii, tým pádom signál kontrolnej
sondy je identifikovaný u oboch chromozómov. Druhá sonda (červená)
hybridizuje so sekvenciou, u ktorej je podozrenie na prítomnosť delécie (Obr.
16). Najbežnejšie je delécia prítomná iba u jedného chromozómu
z chromozomálneho páru. Z tohto dôvodu sa sonda môže viazať len k
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
30
intaktnému chromozómu. Nakoľko väzba k chromozómu s prítomnou deléciou
nevzniká, identifikovaný je iba jeden signál.
Obrázok 16 Delécia na chromozóme 22 u ľudí
(www.rarechromo.org/information/Other/FISH%20FTNW.pdf)
3.2.1.7 Využitie FISH sond pri metóde farbenia celých chromozómov
Detekcia chromozomálnych prestávb, využitím špecifických sond
k určitej oblasti chromozómu môže byť časovo náročným procesom a to najmä
v prípade, ak došlo ku komplexnej prestavbe alebo v prípade, ak oblasti, ktoré
sú súčasťou prestavby nie je možné identifikovať pomocou klasickej metódy
prúžkovania karyotypu. V takýchto prípadoch je možné v súčasnosti využiť
multifluorescenčnú FISH, prípadne metódu spektrálneho karyotypingu, pre
rýchle zmapovanie sady metafáznych chromozómov, za účelom identifikácie
potenciálnych prestávb (Speicher et al., 1996; Schrock et al., 1996).
Multifluorescenčná FISH generuje karyotyp, v ktorom každý typ chromozómu
je označený inou farbou. Každá farba predstavuje kolekciu hybridizačných
sond, ktoré sa viažu k sekvenciám viazaným k dĺžke určitého chromozómu. V
rámci multifluorescenčnej FISH sa najskôr vytvára kolekcia sekvencií DNA,
ktoré sa využijú ako sondy pre každý typ chromozómu. Na Obrázku 17a,
chromozomálne sondy sú vzájomne od seba oddelené pomocou prietokovej
cytometrie (v súčasnosti sa využívajú komerčne dostupné DNA zmesi pre
každý typ chromozómu). V ďalšom kroku sú vzorky DNA označené
kombináciou fluorochrómov, ktoré produkujú jedinečnú farbu pre každý typ
chromozómu (Cot-1 DNA odstraňuje opakujúce sa sekvencie DNA, napr.
centromerickú DNA, ktorá by sa mohla viazať k všetkým chromozómom).
Fluorescenčné hybridizačné sondy sa spájajú a hybridizujú s metafáznymi
chromozómami. Obrázok 17b poukazuje na snímky interfáznych a metafáznych
chromozómov pod mikroskopom po hybridizácii. Až po digitálnom spracovaní
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
31
obrazu je možné rozlíšiť spektrálne rozdiely medzi chromozómami, nakoľko
ľudské oko deteguje rovnaké zafarbenie u viacerých metafáznych
chromozómov. Normálny ľudský chromozóm (Obr. 17b) má rovnakú farbu po
celej svojej dĺžke, chromozóm po prestavbe vykazuje pruhovaný vzhľad.
Obrázok 17c poukazuje na chromozómy izolované z buniek nádoru, ktoré prešli
početnými chromozomálnymi prestavbami (označené šípkami).
Obrázok 17 Spektrálny karyotyping a multifluorescenčné FISH farbenie humánnych
chromozómov (Trask, 2002)
Digitálne spracovanie obrazu umožňuje identifikáciu chromozómov,
ktoré boli zapojené do procesu translokácie. Hoci farbenie chromozómov
umožňuje rýchle vyhodnotenie rozsiahlych chromozomálnych zmien u
metafáznych náterov, rozlišovacia schopnosť metódy je obmedzená. Farbenie
chromozómu umožňuje rýchlu identifikáciu chromozómov zapojených do
procesu translokácie a identifikáciu rozsiahlych delécií alebo duplikácií, no
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
32
malé delécie a duplikácie nie je možné takouto metódou zachytiť. V takýchto
prípadoch je potrebné použitie špecifických sond pre konkrétne miesta.
3.2.1.8 Analýza interfáznych chromozómov metódou FISH
Od zavedenia FISH je možné analyzovať chromozómy v štádiu
interfáza, taktiež metafázne chromozómy využívané u klasických karyotypov
(Trask, 2002). Hlavná výhoda však spočíva v tom, že bunky nemusia byť
kultivované po dobu niekoľkých dní alebo týždňov pred samotnou
chromozomálnou analýzou. Okrem toho, FISH môže byť použitá pri analýze
chromozómov vo vzorkách, ako sú nádory nepodliehajúce častému deleniu,
ktoré sú bodom záujmu viacerých klinických štúdií. Ďalšou vlastnosťou FISH
je, že umožňuje súčasne sledovať niekoľko miest, ak hybridizačné sondy boli
značené rozdielnymi fluorofórmi. Obrázok 18 poukazuje na dva príklady, ako
môže byť využitá interfázová FISH pri diagnostike chromozomálnych zmien.
Obrázok 18a prezentuje interfázne jadro jedinca so syndrómom Charcot - Marie
- Tooth (CMT) typu 1A (Lupski et al., 1991). CMT typu 1A je pomerne časté
neurologické ochorenie vyvolané duplikáciou v géne na chromozóme 17, ktorý
kóduje jeden z proteínov myelínovej pošvy, ktorá obklopuje nervové axóny. Na
Obrázku 18a, bunka pacienta hybridizovala s červene značenou sondou,
príslušnou k sekvencii zodpovedajúcej oblasti duplikácie, spolu so zelenou
sondou zodpovedajúcou sekvencii na chromozóme 17, ktorá sa nachádza mimo
oblasti duplikácie. Na základe prítomnosti dvoch zelených signálov je možné
identifikovať dve kópie chromozómu 17 v jadre. Zatiaľ, čo jeden z
chromozómov má normálnu konfiguráciu, druhý der (17) obsahuje duplikovanú
oblasť, čo je evidentné na základe prítomnosti blízkych dvoch červených
signálov. Obrázok 18 poukazuje aj na ďalšie dôležité črty interfázovej FISH.
Vzhľadom k tomu, že interfázový chromatín je približne 10 000 krát menej
kondenzovaný ako mitotický chromatín, je možné identifikovať duplikáciu
regiónov na der (17), ako diskrétnych bodov. U mitotických chromozómov
duplikáciu takýchto malých rozmerov by bolo mimoriadne obtiažné
identifikovať. Obrázok 18b prezentuje analýzu FISH, ktorá bola použitá pri
detekcii prítomnosti chromozomálnej translokácie u jedinca s chronickou
myelogénou leukémiou (Tkachuk et al., 1990). Vo väčšine prípadov tohto typu
ochorenia časť chromozómu 9 obsahujúca ABL protoonkogén sa spája s
oblasťou zlomu (BCR) na chromozóme 22 počas recipročnej translokácie.
Vytvorený chromozóm 22 - der (22), známy ako Philadelphia chromozóm
obsahuje fúzovaný BCR - ABL gén, v ktorom silný BCR promótor riadi
syntézu transkriptu ABL onkogénu, čo vedie k vzniku rakoviny. Obrázok 18b
poukazuje, ako BCR - ABL fúzie môžu byť ľahko identifikované FISH
metódou, ak sa zeleno značená hybridizačná sonda sprievodných BCR aplikuje
spoločne s červeno značenou sondou sprievodných ABL. Na uvedenej snímke
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
33
normálne kópie chromozómov 9 a 22 sú detegované ako červené (chromozóm
9) a zelené body (chromozóm 22). Na druhej strane, Philadelphia chromozóm je
viditeľný ako komplexný spojitý bod, so stredovou žltou oblasťou,
vrátane červenej a zelenej oblasti po oboch stranách (pri fluorescenčnej
mikroskopii, žltá farba indikuje tesnú blízkosť červenej a zelenej sondy, až sa
zdá, že sa vzájomne prekrývajú).
Obrázok 18 Identifikácia chromozomálnych zmien u interfáznych jadier (Trask, 2002; Gray et
al., 1986)
Zložitá štruktúra spojitého bodu je detekovateľná u interfáznych
chromozómov pomocou FISH, u chromozómov v štádiu metafázy to možné nie
je. Dvojfarebná medzifázová FISH teda poskytuje citlivú metódu pre analýzu
fúzií chromozómov. Iné metódy interfáznej FISH využívajú chromozóm-
špecifické farbenie, za účelom získania informácie o organizácii chromozómov
v jadre. Obrázok 18a poukazuje na interfázne jadro, ktoré bolo farbené
chromozóm-špecifickými farbami. Na základe obrázku sa môže zdať, že
chromozómy zaujímajú odlišné oblasti v jadre. Vhodná kombinácia
chromozóm-špecifických sond s génovo-špecifickými sondami a protilátkami
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
34
môže ponúknuť nové poznatky v oblasti jadrovej architektúry, prostredníctvom
využitia FISH metódy.
3.2.1.9 Ďalšie možnosti využitia FISH v oblasti klinických a iných výskumných
štúdií
Stále sa hľadajú nové možnosti využitia FISH. Napríklad, v súčasnosti
sa využíva porovnávacia genómová hybridizácia pri detekcii kvantitatívnych
rozdielov, ako sú rozdiely v počte kópií u chromozómov. V nedávnej minulosti
sa podarilo zvýšiť rozlišovaciu schopnosť FISH použitím elastických
chromatinových vlákien (Parra a Windle, 1993) alebo mikročipov. S takýmito
možnosťami je cytogenetika schopná štúdia celých chromozómov na
makroskopickej úrovni pre potreby štúdia DNA, z ktorej chromozómy
pozostávajú.
3.2.1.10 Výhody a obmedzenia metódy FISH
• FISH je schopná detegovať viacero menších delécií, duplikácií
a chromozomálnych prestáv, ktoré nie sú identifikovateľné prostredníctvom
štandardnej analýzy mikroskopom.
• FISH analýza zvyčajne nezobrazuje všetky zmeny chromozómu. Väčšina zo
sond je špecifických pre určitý konkrétny typ delécie alebo duplikácie, v rámci
vybraného úseku konkrétneho chromozómu.
• FISH sondy sú k dispozícii len pre najlepšie charakterizované syndrómy,
asociované s deléciou respektíve duplikáciou v štruktúre chromozómu.
• FISH metóda má obmedzenú schopnosť presne definovať, ktoré gény a miesta
zlomu sú zapojené do vzniku chromozomálnej nestability.
3.2.1.11 Interpretácia výsledkov metódy FISH
Každá fluorescenčne značená sonda, ktorá hybridizuje v jadre bunky
analyzovaného tkaniva sa prezentuje ako samostatný fluorescenčný bod. Každý
bod identifikuje jednu kópiu chromozomálneho lókusu s homologickou DNA
sekvenciou. Diploidné jadrá vykazujú dva takéto body. Ak sa vyskytuje
duplikácia v sledovanej oblasti, bude to mať za následok prítomnosť viacerých
než dvoch bodov. Naopak, v prípade, ak v sledovanej oblasti došlo k stratám,
bude to mať za následok prítomnosť jedného respektíve žiadneho bodu. V praxi
sa často využíva kombinácia viacerých sond v rámci jedného viacfarebného
FISH experimentu. Napríklad, sondy môžu byť označené rôznymi farbami, ako
sú červená, zelená, žltá a modrá, čo umožňuje analýzu niekoľkých
cytogenetických znakov v rámci jedného testu. Prekryv spektra vlnových dĺžok
dostupných fluorochrómov však obmedzuje maximálny počet sond využitých v
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
35
jednom experimente na štyri (Gerami a Zembo icz, 2011). Počet bodov v jadre
so špecifickou fluorescenčnou farbou môže byť detegovaný manuálne alebo
prostredníctvom softvéru, určeného pre automatickú analýzu. Vzhľadom k
vnútornej variabilite FISH signálov je potrebný dostatočný počet
analyzovaných buniek, pre získanie reprezentatívneho výsledku. Výsledky
FISH sú zvyčajne prezentované ako percento jadier, ktoré obsahujú viac ako
dve kópie určitého cieľového lókusu, respektíve ako percento buniek
vykazujúcich stratu, prípadne nadbytok v určitej oblasti chromozómu. Určité
percento zo stanovených buniek je potrebné považovať za chybu vo výsledku
FISH analýzy, ktoré musí byť stanovené a overené pomocou vhodnej metódy
pre každú z použitých sond. Vzhľadom k tomu, že hodnoty analýzy sú
empiricky odvodené, môžu sa vzájomne líšiť medzi rôznymi laboratóriami
(Gerami a Zembowicz, 2011).
Výsledky FISH sú často súčasťou mikroskopickej analýzy v
kombinovanej podobe. Prvá časť analýzy predstavuje výsledok karyotypu. Ak u
chromozómov nedošlo k delécii, karyotyp môže vyzerať nasledovne - 46
XX.ish 22q11.2 (TUPLE1x2) (ARSAx2) (URL 1):
46 Celkový počet chromozómov
XX Pohlavné chromozómy (XX ženské
pohlavie, XY mužské pohlavie)
ish Analýza typu: fluorescenčná in situ
hybridizácia (FISH)
22 FISH analýza bola vykonaná na
chromozóme 22
q11.2 Chromozóm má dve miesta
prerušenia, obe v pásme 22q11.2 a
materiál medzi týmito miestami
prerušenia absentuje
(TUPLE1x2) DNA segment (sonda) s názvom
TUPLE je prítomný v dvoch kópiách
(podľa očakávania)
(ARSAx2) DNA segment (sonda) s názvom
ARSA2 je prítomný v dvoch kópiách
(podľa očakávania)
Ak je prítomná delécia, karyotyp je zmenený, napríklad - 46, XX.ish del (22)
(q11.2q11.2) (TUPLE1-) (URL 1):
46
Celkový počet chromozómov
XX Pohlavné chromozómy (XX ženské
pohlavie, XY mužské pohlavie)
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
36
ish Analýza typu: fluorescenčná in situ
hybridizácia (FISH)
del Delécia, alebo absencia materiálu
(22) Delécia pochádza od chromozómu 22
(q11.2q11.2) Chromozóm má dve miesta
prerušenia, a to v pásme 22q11.2 a
materiál medzi týmito miestami
prerušenia absentuje
(TUPLE1-) Jedna kópia DNA segmentu (marker),
s označením TUPLE chýba
3.2.2 Komparatívna genómová hybridizácia (CGH)
3.2.2.1 Úvod do porovnávacej genómovej hybridizácie
Vývoj komparatívnej genómovej hybridizácie (CGH) (du Manoir et al.,
1993; Kallioniemi et al., 1992) vytvoril prvý efektívny nástroj pre zosnímanie
celého genómu, za účelom identifikácie rozdielov v počte kópií molekuly DNA
(Obr. 19). Táto technika predstavuje metódu, ktorá je založená na princípe
fluorescenčnej in situ hybridizácie a umožňuje detekciu nebalansovaných
chromozómových aberácií v celom genóme v rámci jedného kroku (Kirchhoff
et al., 1999). Pri typickej CGH analýze je celková genomická DNA izolovaná
od testovaných a referenčných populácií buniek odlišne značená a
hybridizovaná s reprezentatívnou DNA genómu, čo umožňuje naviazanie
sekvencií k rozličným častiam genómu, za účelom ich vzájomného odlíšenia.
Viac ako dva genómy môžu byť súčasne porovnávané, ak je k dispozícii
vhodné značenie. Hybridizácia vysoko repetitívnych sekvencií je zvyčajne
potlačená zaradením neznačenej Cot – 1 DNA do reakcie. Pôvodne za úćelom
reprezentácie génomu boli využívané chromozómy v štádiu metafáza,
lokalizácia rozdielov v počte kópii medzi testovanou a referenčnou genómovou
DNA bola identifikovaná v rámci jej umiestnenia na chromozómoch. V
súčasnosti, chromozómy sú z veľkej časti nahradené DNA micročipmi
obsahujúcimi prvky, ktoré sú mapované priamo na sekvencii genómu (Pinkel et
al., 1998; Pollack et al., 1999; Solinas-Toldo et al., 1997). Relatívna intenzita
hybridizácie testovacích a referenčných signálov v danom mieste je (v ideálnom
prípade) úmerná relatívnemu počtu kópií týchto sekvencií u testovaných a
referenčných genómov. Ak referenčný genóm je štandardný, potom rast a
pokles pomeru intenzity signálu priamo poukazuje na rozdiely v počte kópií
DNA v genóme testovaných buniek. Dáta sú typicky štandardizované tak, že
modálny pomer pre genóm je nastavený na vybranú štandardnú hodnotu,
typicky 1,0 na lineárnej stupnici alebo 0.0 na logaritmickej stupnici. Ďalšie
merania, ako napríklad fluorescenčná in situ hybridizácia alebo prietoková
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
37
cytometria (Mohapatra et al., 1997) môžu byť využité na určenie skutočného
počtu kópií, v súvislosti s pomernou hodnotou.
Obrázok 19 Čípová (array) komparatívna genomová hybridizácia (CGH). Genomická DNA od
dvoch populácií buniek je rozdielne značená a hybridizovaná na mikročip. Pomer intenzity
fluorescenčného signálu hodnotený v každom mieste čipu je štandardizovaný tak, že stredný
log2 pomer je 0. Vykreslenie dát na chromozóme 9 z pter na qter poukazuje, že väčšina prvkov
vykazuje pomer blízky 0. Dva prvky blízke k pter majú pomer blízky -1, čo poukazuje na
redukciu v počte kópií. Fluorescenčná in situ hybridizácia (FISH) s červeno značenou sondou
pre oblasť delécie a zelene značenou kontrolnou sondou (miesta genómu indikované červenými
a zelenými šípkami na profile pomeru) poukazuje, že bunky obsahujú dve kópie zelenej sondy a
len jednu pre červenú sondu, v súlade s CGH analýzou (Snijders et al., 2001).
Čípová CGH bola vytvorená kombináciou viacerých metód. Prvotné
pokusy využívali čipy vytvorené z rozsiahlych sekvencií genómových klonov,
ako sú umelé bakteriálne chromozómy (BAC) (Pinkel et al., 1998; Solinas-
Toldo et al., 1997). Produkcia dostatočného množstva BAC DNA
zodpovedajúcej čistoty pre produkciu čipov je náročná, z tohto dôvodu bolo
vytvorených niekoľko ďalších techník. Tieto zahŕňajú ligáciou sprostredkovanú
polymerázovú reťazovú reakciu (PCR) (Snijders et al., 2001), degenerovaný
primer PCR s využitím jednej (Hodgson et al., 2001) alebo niekoľkých sád
primerov (Fiegler et al., 2003) a cyklickú amplifikáciu (Smirnov et al., 2004). V
súčasnosti sú k dispozícii BAC čipy, ktoré poskytujú kompletné stopy genómu
(Ishkanian et al., 2004; Krzywinski et al., 2004; Li et al., 2004). Používané sú aj
čipy vyrobené z menej komplexných nukleových kyselín, ako je napríklad
cDNA (Pollack et al., 1999), vybrané PCR produkty (Dhami et al., 2005;
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
38
Mantripragada et al., 2004) a oligonukleotidy (Brennan et al., 2004; Carvalho et
al., 2004). Hoci väčšina CGH postupov využíva hybridizáciu s kompletnou
genómovou DNA, niektoré využívajú menej komplexné reprezentívne miesta
genómu, produkované PCR technikami. Výpočtová analýza sekvencie genómu
sa využíva pri návrhu čipu a jeho súčastí, komplementárnych k sekvenciám
prítomným v reprezenzatívnej vzorke (Lucito et al., 2000). V súčasnej dobe,
rôzne jednonukleotidové polymorfizmy (SNP) platforiem pre genotypizáciu,
využívajúce redukovanú komplexnosť reprezentatívneho genómu sú hodnotené
z hľadiska ich schopnosti determinácie počtu DNA kópií a zastúpenia alel v
genóme (Zhao et al., 2004; Zhou et al., 2004). Odlišné postupy čípovej CGH
poskytujú rôznu efektivitu metódy, niektoré z nich sú vhodné pre konkrétne
aplikácie. Faktory, ktoré určujú požiadavky metódy zahŕňajú veľkosť zmien v
počte kópií, ich umiestnenie v genóme, stav a zloženie vzorky, množstvo
materiálu ktoré je k dispozícii pre analýzu a spôsob využitia výsledkov analýzy.
Viacero aplikácií vyžaduje spoľahlivú detekciu zmien v počte kópií a prísnejšie
požiadavky, než iné micročipové technológie. Poznanie technických detailov je
esenciálne dôležité, rôzna implementácia "rovnakých" čipových CGH postupov
môže priniesť odlišné výsledky metódy.
3.2.2.2 Princíp metódy CGH
Komparatívna genómová hybridizácia (CGH) predstavuje jednu
z variant metódy FISH, ktorá umožňuje identifikáciu chromozómových zmien v
rámci genómu. CGH bola prvýkrát opísaná v roku 1992 (Kallioniemi et al.,
1992). Princíp CGH spočíva v odlišnom fluorescenčnom značení testovanej a
referenčnej genómovej DNA, ktoré spoločne hybridizujú k normálnym
referenčným metafáznym chromozómom. Vyhodnocuje sa vzájomný pomer
intenzity signálov medzi týmito dvoma genómami (Obr. 20) (Pinkel
a Albertson, 2005).
Obrázok 20 Karyogram zhotovený pomocou metódy CGH (Mayer et al., 2002)
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
39
Táto metóda umožňuje vykonávanie porovnávacej analýzy
chromozómových zmien v celom genóme počas jednej hybridizačnej reakcie.
Využíva sa pri vyšetrení celého genómu na prítomnosť amplifikácií, duplikácií
prípadne delécií genetického materiálu. Metóda CGH je založená na
hybridizácii odlišne značenej testovanej a referenčnej DNA k štandardným
metafáznym chromozómom. Rozdiely vo väzbe testovaných a normálnych
DNA sekvencií pozdĺž cieľových štandardných chromozómov predstavujú
oblasti amplifikácie alebo delécie DNA sekvencií medzi dvoma genómami vo
všetkých chromozómových oblastiach (Michalová, 1999). Nádorová DNA
pochádzajúca z chromozómových oblastí prítomných v bunkách, v
amplifikovanom počte sa viaže relatívne viac než normálna DNA, kým
nádorová DNA z chromozómových oblastí, ktoré sú prítomné v nižšom počte
(delécia) sa viaže v relatívne nižšej miere. Nakoľko nádorová a normálna DNA
sú značené rôznymi typmi fluórochrómov, ich vzájomný pomer môže byť
definovaný ako pomer intenzít dvoch rôznych farieb (Waldman et al., 1996).
Odchýlka od ideálneho pomeru 1:1, teda pomer nižší ako 0,75 je hodnotená ako
delécia, zatiaľ čo pomer väčší ako 1,25 je hodnotený ako amplifikácia DNA,
prítomná na určitých úsekoch chromozómov analyzovanej vzorky DNA
(Kallioniemi et al., 1994). Počítačová analýza výstupov zahŕňa kvantitatívnu
analýzu zmien fluorescenčného pomeru a vyhodnotenie v podobe CGH
profilov.
3.2.2.3 Výhody a využitie CGH v klinickej cytogenetike
Výhodou komparatívnej genómovej hybridizácie je, že pri analýze
vzoriek nádoru je potrebná len DNA z testovaného tkaniva, čím je možné
vyhnúť sa príprave metafáznych chromozómov. K ďalším výhodám patrí
potreba iba jednej hybridizačnej reakcie. Limitom CGH je neschopnosť
detekcie vyrovnaných prestávb, taktiež nieje možné určiť percento zastúpenia
buniek s hodnotenou abnormalitou. Doterajšie výsledky poukazujú, že
minimálna dĺžka sekvencie DNA, ktorej amplifikáciu či deléciu je možné
prostredníctvom CGH zachytiť, predstavuje zhruba 5 - 10 Mb (Forozan et al.,
1997; Van Gele, 1997; Van Roy, 1997; Weiss et al., 1999). Metóda CGH sa
používa pri detekcii genetických zmien najmä v nádorovej cytogenetike, svoje
uplatnenie nachádza aj vo výskume solídnych nádorov a hematologických
malignít. Komparatívna genómová hybridizácia je využívaná predovšetkým pri
identifikácii klonálnych aberácií, identifikácii nových nádorových génov
(amplifikované, respektíve duplikované oblasti môžu obsahovať nové
onkogény, oblasti delécie môžu identifikovať umiestnenie nádorových
supresorových génov). Využitie CGH je limitované relatívne nízkou
citlivosťou. Túto nevýhodu eliminuje tzv. High Resolution CGH (HRCGH),
ktorá je schopná rozlíšiť deléciu či amplifikáciu už v rozsahu 3 Mb (Kirchhoff
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
40
et al., 2001). Hlavnou výhodou CGH metódy je, že nevyžaduje predchádzajúce
znalosti o chromozómovej aberácii (Speicher a Carter, 2005) a umožňuje
aplikáciu vzorky bez ohľadu na mitotickú aktivitu buniek. Mapuje pôvod
amplifikovaných a deletovaných sekvencií DNA na normálnych
chromozómoch, čím zviditeľňuje pozíciu dôležitých génov (Kallioniemi et al.,
1994). Obmedzením tejto metódy je neschopnosť CGH detegovať balansované
translokácie, inverzie, zmeny v ploidii (Morrison, 1994). Analyzované zmeny
sa musia vyskytovať u viac ako 50 % z hodnotených buniek (Jarošová, 2007).
Nevýhody klasickej CGH, ako sú nižšia detekčná schopnosť a príprava
metafáznych chromozómov odstránila metóda aCGH (array komparatívna
genómová hybridizácia), založená na rovnakom princípe s tým rozdielom, že
metafázne chromozómy sú nahradené unikátnymi fragmentami DNA (sondy),
ktoré sú chemicky alebo synteticky fixované k pevnému povrchu (napr.
podložné sklíčko) (Obr. 21).
Obrázok 21 Molekulárny karyotyping pomocou array – CGH
(http://www.genetadi.com/tec_cimo_ac.php?lang=en)
Existuje viacero rôznych platforiem pre aCGH, čo primárne závisí od
komplexnosti fixovaných DNA sond (komplementárna DNA, oligonukleotidy,
BAC klony), pričom každá má svoje výhody a nevýhody (Morrison, 1994).
CGH a aCGH, patria medzi najpoužívanejšie molekulárno-cytogenetické
techniky. Čípová (array) CGH je jedným z cytogenetických prístupov, ktoré
môžu poskytnúť komplexné informácie o aspektoch biologického statusu,
prípadne jeho funkcii. Tieto metódy môžu zároveň poskytnúť informáciu, ktorá
je užitočnou pri klinickej diagnostike v onkológii a lekárskej genetike a
základné informácie o charakteristike štruktúry genómu. Aplikácie metódy v
lekárskej genetike nachádzajú čoraz častejšie uplatnenie. Je však nevyhnutné
vytvoriť určitú hranicu spoľahlivosti, aby falošne pozitívne signály na
prítomnosť abnormality boli obmedzené na akceptovateľnú úroveň a aberácie,
ktoré sú detegované boli správne interpretované. Z hľadiska dlhšieho časového
horizontu, kombinácia meraní počtu kópií DNA, RNA, úrovne proteínovej
expresie, atď. prináša nové poznatky v pochopení biologických procesov, štúdie
akejkoľvek malej časti funkčnej dráhy odhaľujú dôležité detaily. Z dôvodu
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
41
možnosti nesprávnej interpretácie rôznych štúdií, kvoli celkovému nedostatku
informácií, integrácia poznatkov „smerom zdola nahor a zhora nadol“ je
nevyhnutná. Vyprofilovanie technológie môže naplniť informačné databázy,
avšak získané dáta majú hodnotu iba v prípade, ak sú dostatočnej kvalitny,
starostlivo vyhodnotené a interpretované v rámci rôznych súvislosti (Pinkel a
Albertson, 2005).
3.2.3 Porovnanie medzi FISH a CGH
Pre realizáciu FISH je potrebné vedieť, k čomu uvedená metóda slúži.
Výsledok FISH je iba pozitívny alebo negatívny, vo vzťahu k analyzovanej
chromozomálnej oblasti. V tomto sa líši od metódy CGH, pri ktorej sa počet
aberácií celého genómu hodnoteného tkaniva vyhodnocuje v rámci jedného
experimentu. Ak mikroskopická analýza a FISH metóda neidentifikujú zmeny v
chromozomálnom usporiadaní, môže byť následne využitá komparatívna
genómova hybridizácia (array CGH). Táto metóda analyzuje všetky
chromozómy na prítomnosť straty prípadne nadbytku v štruktúre DNA a je
schopná identifikovať aj menšie zmeny v chromozomálnej štruktúre, ako
metóda FISH (Obr. 22).
Obr. 22 Porovnanie FISH a CGH
(http://www.intechopen.com/books/clinical-management-and-evolving-novel-therapeutic-
strategies-for-patients-with-brain-tumors/chromosomal-analysis-clinical-applicability-to-brain-
cancers)
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
42
V porovnaní s FISH, CGH metóda je nákladnejšia a časovo náročnejšia.
Vzhľadom k tomu, že bunky musia byť rozčlenené, CGH zvyčajne vyžaduje
prípravu parafínového bloku. Okrem toho, zmeny v počte kópií musia byť
prítomné minimálne u 30-50 % buniek pre reprezentatívnosť CGH analýzy,
zatiaľ čo FISH vyžaduje iba 20-30 dobre vizualizovateľných buniek,
potrebných pre zhodnotenie presného počtu fluorescenčných signálov. Metóda
FISH je napríklad uplatniteľná u veľkých nádorov, ale aj u nádorov, u ktorých
malígny podiel predstavuje len určitú časť z celkovej bunkovej populácie. FISH
sondy môžu identifikovať aj vyvážené translokácie, ktoré nie sú zistiteľné
prostredníctvom CGH metódy (Gerami a Zembowicz, 2011).
4 Chromozomálne aberácie
Za chromozomálne aberácie sa v širšom slova zmysle považujú všetky
odchýlky chromozómov štrukturálneho a numerického charakteru, zistené
bežnými cytogenetickými metódami. Ich vznik je dôsledkom mutačných
procesov na chromozomálnej úrovni. Vo všetkých populáciách sa vyskytujú
štrukturálne alebo numerické varianty štandardného karyotypu (Parkányi et al.,
2006). Kaina a Rieger (1979) poukazujú na mimoriadny význam určitých typov
inverzií a translokácií z hľadiska vzniku numerických a morfologických variant
štandardného karyotypu.
4.1 Štrukturálne zmeny chromozómov
Štrukturálne zmeny vznikajú v dôsledku chromozómových zlomov a sú
sprevádzané vznikom abnormálnych chromozomálnych kombinácii. Medzi
štrukturálne chromozomálne zmeny radíme:
Translokácia- jedná sa o prenos určitej časti, buď v rámci toho istého
chromozómu z jednej lokácie na inú, alebo prenos časti jedného chromozómu
na iný homologický respektíve nehomologický chromozóm. Pri reciprokej
translokácii sa medzi homologickými a nehomologickými chromozómami
navzájom vymenia dva segmenty. Osobitným prípadom je Robertsonova
translokácia, ktorá nastáva v prípade spojenia dvoch akrocentrických
chromozómov do jedného metacentrického alebo submetacentrického
chromozómu (Obr. 23).
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
43
Obrázok 23 Translokácia a) balansovaná; b) nebalansovaná
(http://biology.about.com/od/genetics/ss/chromosome-mutation.htm;
http://ghr.nlm.nih.gov/handbook/illustrations/unbalancedtranslocation)
Inverzia- určitá časť chromozómu sa otočí o 180º, chromozóm je celý, ale
vybraná časť má obrátené poradie jednotlivých lokusov (Obr. 24).
Obrázok 24 Inverzia
(http://ghr.nlm.nih.gov/handbook/illustrations/inversion)
Duplikácia- prítomný je nadbytočný úsek chromozómu v dôsledku zlomu
u dvoch homologických chromozómov. Odtrhnutý úsek jedného chromozómu
sa pripája k druhému a tým sa zdvojujú vlohy vyskytujúce sa v odtrhnutom
segmente.
Za účelom identifikácie štrukturálnych zmien u chromozómov boli
vytvorené tzv. prúžkovacie metódy. V súčasnosti sú známe nasledovné
prúžkovacie metódy (Čurlej, 2009):
Q- metóda farbenia- Jedna z prvých prúžkovacích metód. Prúžky sa označujú
ako “Q- bands”. Ako farbivo sa používa quinakrín.
C- metóda farbenia- Táto metóda neumožňuje individuálne odlíšenie
chromozómov. Prúžky sa označujú ako “C- bands”. Farbí sa heterochromatín v
oblasti centromér.
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
44
G- metóda farbenia- Giemsa staining” metóda. Prúžky sa označujú ako “G-
bands”. Pred samotným farbením sú chromozómy hypotonizované použitím
napr. KCl a mierne natrávené trypsínom.
R- metóda farbenia- (R znamená opačný). Pri tejto metóde sú prúžky opačného
charakteru v porovnaní s G metódou. G a R umožňujú individuálne odlíšenie
chromozómov a sú najčastejšie používané pri detekcii štrukturálnych aberácii
u chromozómov.
4.2 Numerické zmeny chromozómov
Pred samotným znovu objavením Mendelových princípov dedičnosti na
prelome 20. storočia cytogenetici opísali správanie sa chromozómov počas
mitózy a meiózy. Burnham (1962) cytogenetickou štúdiou u rastlín a White
(1954) u nižších živočíchov poukázali na odchýlky v počte chromozómov v
rámci druhu a medzi jednotlivými druhmi. Všeobecne numerické a štrukturálne
zmeny chromozómov môžeme začlenit do dvoch kategórii: vrodené a získané,
ktoré sú dôsledkom sekundárnych zmien vyvolávajúcich ochorenia ako je
rakovina. Numerické zmeny chromozómov sú zapríčinené stratou respektíve
nadbytkom celého chromozómu alebo chromozómov. Môžu sa vyskytovať u
autozómov aj u pohlavných chromozómov. Najbežnejšou autozomálnou
numerickou abnormalitou je Do nov syndróm u ľudí. Všeobecne strata
chromozómu má väčší vplyv na jedinca ako nadbytočný chromozóm, hoci aj
ten môže zapríčiniť viaceré zmeny. Numerické chromozomálne abnormality
vyvolávajú chyby v procese implantácie embrya. Ich hlavnou príčinou býva
nondisjunkcia počas gametogenézy (Obr. 25).
Obrázok 25 Non- disjunkcia: a) schéma vzniku non-disjunkcie; b) metafázna platnička,
chromozómy- človek, lymfocyty z krvi
(http://www.med.umich.edu/lrc/coursepages/m1/embryology/embryo/02prefertilization.htm)
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
45
Vo všeobecnosti existujú dva typy numerických zmien na
chromozomálnej úrovni a to polyploidia a aneuploidia. Polyploidné bunky sú
tie, u ktorých je počet chromozómov celým násobkom základného respektíve
haploidného počtu (n). Heteroploidia: Termín zaviedol Beatty (1957), týmto
pojmom označil každú odchýlku od ortoploidného počtu chromozómov,
napríklad diploidné somatické bunky a haploidné gaméty. Strata chromozómu
bunky sa označuje ako monozómia pre daný chromozóm, kým chromozóm
navyše sa označuje ako trizómia pre daný chromozóm. Väčšina buniek nesúcich
monozómiu je eliminovaná už počas utvárania.
4.2.1 Polyploidná varianta
Za polyploidný sa považuje organizmus, ktorého počty chromozómov
sú väčším celým násobkom haploidného súboru ako 2n. Polyploidia predstavuje
celý násobok tri a viacnásobne vyšší ako základný respektíve haploidný počet.
Je definovaná ako počet chromozómov, ktorý je násobne vyšší ako dva
monoploidné počty. Vznik polyploidie je vyvolaný viacerými mechanizmami
(Obr. 26).
Obrázok 26 Formovanie polyploidie
http://www.polyploidy.org/index.php/Information:How_do_polyploids_create_novel_variation
Najčastejšou príčinou polyploidie bývajú diploidné gaméty, polyspermia
a endomitóza u somatických buniek. Môže byť súčasťou normálnej fyziológie
rastlín a zvierat, vrátane niekoľkých typov ľudských buniek, celkove nevedie k
vzniku defektov vo vývoji organizmu respektíve v jeho fyziológii (Otto a
Whitton, 2000). Duplikácie celého genómu sú súčasťou evolúcie niektorých
skupín ako sú rastliny a kvasnice, môžu byť prirodzeným javom v danom
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
46
procese (Adams a Wendel, 2005). Ak polyploidia zahŕňa všetky bunky zygoty
je rovnako letálnym faktorom. Vznik triploidie má za následok zlyhanie
jedného zrecieho delenia vo vajíčku alebo spermii. Tetraploidia vzniká v
dôsledku neschopnosti úplne dokončiť prvé delenie brázdiacej zygoty. K
polyploidizácii buniek často dochádza v normálnych tkanivách sleziny, pečene,
kostnej drene a iných orgánov živočíchov a človeka (Žinkin, 1962).
Pravdepodobne polyploidné bunky plnia určitú funkciu. Ich množstvo sa
zvyšuje v procese intenzívnej regenerácie tkaniva a pri rôznych funkčných
zaťaženiach (Rjabinina a Benjuš, 1977). Normálna hladina polyploidných
buniek hemopoetického tkaniva hospodárskych zvierat sa môže zvýšiť pri
zhubnej novotvorbe krvotvorného tkaniva. Parkányi a Zelník (1982) vo svojej
práci karyologicky hodnotia spätným krížením dve plemená králika mäsového
typu (Nb a Ni) vo vzťahu ku karyotypovej a idiogramovej klasifikácii buniek
kostnej drene, vzhľadom k adaptívnemu numerickému a štrukturálnemu
chromozomálnemu polymorfizmu. Najvyššiu úroveň polyploidie zaznamenali u
reciprokých krížencov NbNi (2,8 %). Polyploidné bunky boli zistené u
všetkých štyroch genotypových skupín. Boli zastúpené tetraploidnými formami,
ktoré vznikli pravdepodobne pri mitóze. Úroveň polymorfných buniek v
kostno-dreňovom tkanive je pravdepodobne determinovaná genetickým
založením králikov (Parkányi et al., 1983).
4.2.2 Aneuploidná varianta
Aneuploidia ako pojem vyjadruje počet chromozómov, ktorý nie je
euploidný (nepravidelný počet chromozómov). Predstavuje zmenu v počte
chromozómov v chromozomálnych sadách (Weaver a Hedrick, 1995). Hlavnou
príčinou je nondisjunkcia počas mitotického resp. meiotického delenia, kedy
dochádza k nerovnomernému rozdeleniu páru chromozómov do dcérskych
buniek. Kým jedna dcérska bunka obsahuje obidva chromozómy, druhá
neobsahuje ani jeden (Bond a Chandley, 1983). Non-disjunkcia je bežná v
meióze I. Zriedkavo sa môže vyskytnúť aj v meióze II. Ak sa vyskytne počas
meiotického delenia, všetky bunky, ktoré sa z príslušnej zygoty s aneuploidným
počtom chromozómov vyvinú budú aneuploidné. Ak nastáva počas mitotického
delenia, postihnutá je iba časť somatických buniek (Parkányi et al., 2004).
K non-disjunkcii môže dôjsť v procese fertilizácie, čím dochádza k formovaniu
embrya mozaiky, u ktorého môžu byť súčasne prítomné chromozomálne
korektné, monosomické a trizomické blastoméry. Aneuploidia je častou
príčinou vzniku rôznych ochorení, sterility, vedie k tvorbe nádorov respektíve
až k úhynu jedinca. Aneuploidné počty blízke diploidnému počtu
chromozómov ako napríklad peridiploidia možno označiť za hyperdiplodné.
Napríklad trizómia, za trizómickú možno označiť diploidnú sadu chromozómov
u ktorej sa jeden reprezentatívny chromozóm vyskytuje v troch kópiách.
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
47
Príčinou trizómie býva non-disjunkcia v prvom a v druhom meiotickom
delení respektíve počas mitózy. Trizómia autozómu zvyčajne vedie k
embryonálnej smrti. Na druhej strane, chromozomálne sady s počtom
chromozómov zníženým oproti diploidnému počtu sa označujú ako
hypodiploidné (Obr. 27). V prípade monozómie jeden chromozóm z
chromozomálneho páru absentuje. Monozómia môže byť výsledkom
oneskorenia v procese delenia chromatíd. Monozómia pri autozómoch u
cicavčích embryí býva zriedkavým javom. Strata genetickej informácie
v dôsledku monozómie je menej tolerovaná ako nadbytok genetickej informácie
v dôsledku trizómie. Zmeny v karyotype druhov, ktoré vyvolávajú zmeny v
počte chromozómov sú teda označované ako aneuploidie respektíve
polyploidie.
Obrázok 27 Hypodiploidná c-metafáza samca králika, 2n<44, Giemsa farbenie (Čurlej, 2009)
4.2.2.1 Štúdie aneuploidie ako dlhodobá tradícia
Živočíchy
Prvá systematická analýza vplyvu aneuploidie na úrovni bunky
a fyziológie organizmu bola uskutočnená pred viac ako storočím u druhov
morskej ježovky Paracentrotus lividus, Echinus microtuberculatus a
Strongylocentrotus purpuratus (Boveri 1902, 1904). Boveri sa zaoberal
hodnotením vývoja vajíčok morskej ježovky oplodnených dvoma spermiami v
dôsledku čoho boli triploidné. Tie formovali štyri centrozómy (niekedy tri), na
rozdiel od dvoch počas prvej mitózy v dôsledku čoho chromozómy segregovali
na štyri póly tvoriac štvorbunkové embryo s vynechaním 2-bunkového štádia.
Výsledkom tohto delenia bola masívna aneuploida. Ďalej zistil, že embryá po
dispermickej fertilizácii vykazujú vývojové chyby a hynú. Poukázal na to, že
strata a nadbytok chromozómov vedú k abnormálnemu vývoju a k letalite.
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
48
Bridges (1921a,b) sa zaoberal hodnotením aneuploidie u ovocnej
mušky. Drosophila melanogaster nesie tri páry autozómov (II, III a IV) a pár
pohlavných chromozómov (samice XX, samce XY). Zistil, že mutant drozofily
známy ako “zmenšený” bol monozómický pre štvrtý chromozóm. Ako už
indikuje označenie mutanta, tieto mušky strácajúce jednu kópiu chromozómu
IV sú menšie, sterilné a vykazujú množstvo vývojových abnormalít. Lindsley et
al. (1972) vytvorili mutantné línie drozofílie krížením mušiek nesúcich
translokácie medzi chromozómom Y a autozómami. Tieto niesli abnormálne
fragmenty rozdielnych chromozómov (segmentálne trizómie) respektíve im
chýbali určité oblasti chromozómov (segmentálne monozómie). Hughes (1968)
vo svojej práci zaoberajúcej sa štúdiom buniek kostnej drene sýrskych škrečkov
vo veku od 4 týždňov do 16 mesiacov zaznamenal výskyt aneuploidie jedine
u starších zvierat vo veku 16 mesiacov. Tieto výsledky korešpondujú s
poznaním zvýšeného výskytu chromozomálnych porúch u jedincov vo vyššom
veku. Hodgkin et al. (1979) vytvorili prvého aneuploidného červa nesúceho tri
kópie X chromozómu. Tieto červy boli životaschopné, avšak vykazovali
morfologické abnormality, neplodnosť a spomalený rast. Následne Sigurdson et
al. (1986) vytvorili generáciu červov trizómických pre chromozóm IV s
určitými morfologickými zmenami, zároveň boli neplodné. Dyban a Baranov
(1987) pozorovali následky trizómií u myší. Jedine jedince s trizómiou 19 sa
narodili avšak v krátkom čase hynuli, všetky ostatné trizómie pôsobili letálne už
počas embryogenézy. Porovnania medzi veľkosťou chromozómu a časom
embryonálnej smrti vykázali jednoznačnú koreláciu týchto dvoch aspektov
poukazujúc na inverzné korelácie v organizme medzi veľkosťou genómu
prezentovaného troma kópiami a životaschopnosťou jedinca. Výskyt
chromozomálnych abnormalít je preukazne vyšší pri in vitro embryách v
porovnaní s in vivo embryami (Viuff et al., 2001). Iwasaki et al. (1989)
zaznamenali abnormality vo frekvencii 13,7 % u bovinných embryí v štádiu 2-,
4 buniek. Yoshiza a et al. (1999) zistili až 80 % aneuploidiu u 5-, 10-
bunkových bovinných embryí. I asaki a Nakahara (1990) zaznamenali 38 %
aneuploidiu u bovinných blastocýst. Vyššie zastúpenie chromozomálnych
aberácii u klonovaných králičích embryí zistili Shi et al. (2004) v porovnaní s in
vitro produkovanými embryami králika (83 % vs. 56 %). Viuff et al. (2000)
výskumom rôznych vývojových štádií embryí od 2 do 5 dní po in vitro
oplodnení detailnejšie objasnili početnosť numerických aberácií. Po fertilizácii
bola zrejmá vysoká frekvencia takzvanej pravej polyploidie, keď všetky bunky
embrya sú polyploidné. Pomalšie vyvíjajúce sa embryá preukazovali vyšší
pomer polyploidie. K eliminácii polyploidných embryí dochádza pred
dosiahnutím 8-bunkového štádia, v ktorom sa vyskytuje najväčšia aktivita
embryonálneho genómu u hovädzieho dobytka (Camous et al., 1986).
Genómové mutácie a spontánne chromozómové aberácie sú u vyšších
organizmoch takmer zákonité. O mixoploidii hovoríme v prípade, ak napríklad
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
49
kostná dreň respektíve iné tkanivá a orgány sú tvorené diploidnými aj
polyploidnými bunkami (Parkányi et al., 2006). Vznik mixoploidie nastáva buď
pri oplodnení alebo počas kultivácie embryí v podmienkach in vitro. Chyby
počas in vitro kultivácie embryí môžu zapríčiniť abnormálnu segregáciu
chromozómov vedúc k vzniku mixoploidie. Viuff et al. (2000) u embryí s
abnormálnymi bunkami zistili častý výskyt mixoploidie. Z jednotlivých
kategórii mixoploidných embryí bola najviac zastúpená diploidno-triploidná
mozaika (65 %), diploidno-tetraploidná bola zistená v 11 % a diploidno-
triploidno-tetraploidné mozaiky v 24 %. Presný mechanizmus vyvolávajúci
vznik mozaiky u bovinných embryí nie je známy. Relatívny pomer aneuploidie
v rôznych štúdiách varíruje v závislosti na pôvode a zdroji buniek. Aneuploidné
bunky v kostnej dreni králikov predstavujú 9,2 % a aneuploidné bunky v
kultúre krvi králika 16,6 až 17,8 % (Zartman, Fechheimer, 1967). Parkányi et
al. (2004) pri zisťovaní výskytu aneuploidie chromozómov u transgénnych a
netransgénnych králikov z krvi dospeli k výsledkom, že signifikantne vyššia
frekvencia aneuploidie bola detekovaná u transgénnych králikov (56 - 66 %) v
porovnaní s netransgénnymi (28 - 38 %). Naproti tomu u netransgénnych samíc
bolo zistené vyššie zastúpenie diploidných somatických buniek (63 %), kým u
transgénnych to bolo 38 %. Najväčší podiel na aneuploidii mali hypodiploidné
bunky, kde počet chromozómov je nižší ako 2n. Zastúpenie hyperdiploidných
buniek, kde počet chromozómov je vyšší ako 2n, bolo extrémne nízke. Výskyt
aneuploidie u králikov po SM (mikroinjekcia do samčieho prvojadra) 63 % bol
zhodný so zvieratami po DM (mikroinjekcia do samčieho a samičieho
prvojadra) 61 %. Hodgkin (2005) poukázal na to, že genomické zmeny
v určitom rozsahu umožňujú preživatelnosť.
Rastliny
Blakeslee et al. (1920) charakterizovali následky aneuplodie u durmana
Datura stramonium. Prvá spontánne aneuploidná Datura bola opísaná v
Botanickej záhrade Botanical Garden of Storrs, Connecticut, s atypickým
globusovitým ovocím a neobyčajným modelom dedičnosti (Avery, 1959).
Následne bolo identifikovaných niekoľko ďalších rastlín nesúcich odlišné
znaky, dedené atypickým spôsobom. Blakeslee et al. (1920) poukázali, že
gaméty týchto neobyčajných variant nesú 13 namiesto 12 chromozómov,
pričom tieto rozdielne duplikácie chromozómov boli zodpovedné za odlišné
fenotypy durmanov. Následne všetky možné 2n+1 rastliny boli izolované ako
spontánne vyskytujúce sa varianty respektíve boli vytvorené krížením medzi
triploidnými a diploidnými rastlinami. Podobne ako pri Drozofile, čím väčší je
extra chromozóm, tým je väčší dopad na vitalitu. Ukázalo sa, že niektoré druhy
rastlín lepšie tolerujú aneuploidiu ako zvieratá. V niektorých prípadoch,
chromozomálne nadbytky respektíve straty sú súčasťou ich vlastnej evolúcie.
Henry et al. (2005) pri viacerých vzorkách ryže a kukurice zistili, že
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
50
aneuploidné rastliny rástli signifikantne pomalšie v porovnaní s divo žijúcimi
jedincami. Do určitej miery u kukurice a ryže stupeň spomalenia rastu koreluje
s veľkosťou ich nadbytočného chromozómu.
Kvasinky
Mortimer a Ha thorne (1966) vytvorili prvé aneuploidné
Saccharomyces cerevisiae za účelom mapovania. Parry a Cox (1970) pri
pokusoch na kvasinkách zistili pomerne dobré tolerovanie prítomnej
aneuploidie. Aneuploidné kvasinkové bunky vykazujú transkripčnú odpoveď
podobnú ako bola zistená u buniek kvasinky rastúcich v rôznych stresových
podmienkach, senzitivita na vysokú teplotu a spomalenie v G1 fáze bunkového
cyklu (Gasch et al., 2000). Spomalená bunková proliferácia v G1 fáze ako
stresová reakcia môže pôsobiť na zvýšenie prežívateľnosti, keď proteinové
stechiometrie sú narušené. Niektoré štúdie na Schizosaccharomyces pombe
poukázali na negatívny vplyv celochromozomálnej a segmentálnej aneuploidie
na proliferáciu buniek (Ni a et al., 2006). Bunky kvasiniek nesúce extra
chromozóm vykazujú prítomnosť defektov, ktoré môžu byť dôsledkom
aneuploide. Stupeň prejavu závisí od množstva nadbytočnej DNA prítomnej v
bunkách kvasiniek (Torres et al., 2007).
Ľudia
Aneuploidia vznikajúca počas vývoja embrya (trizómia alebo
monozómia) býva najčastejšie identifikovanou chromozomálnou anomáliou u
ľudí a vyskytuje sa u viac ako 5 % všetkých klinicky diagnostikovaných
tehotenstiev. Takmer jedno z troch narodených detí je nositeľom aneuploídie.
Najčastejšími zmenami tejto podstaty bývajú trizómia 21, 18, 22, nadbytočný
respektíve chýbajúci pohlavný chromozóm. Približne jedna tretina potratov je
zapríčinená výskytom aneuploidie - trizómia 16, 21, 22. Dailey et al. (1996)
určili za príčinu zvýšenej frekvencie výskytu aneuploidie u humánnych embryí
vyšší vek matiek, u ktorých zaznamenali vyššiu produkciu oocytov s
chromozomálnymi abnormalitami. Lejeune et al. (1959) zistili, že podmienky
známe ako Do nov syndróm sa prejavujú vďaka prítomnosti nadbytočnej kópie
chromozómu 21. Trizómia 21 je jedinou autozomálne viazanou trizómiou u
ľudí, ktorá umožňuje prežívateľnosť nositeľa. Ďalšie dve trizómie: trizómia 13
(Patau’s syndróm) a trizómia 18 (Ed ardsov syndróm) umožňuju prežívanie až
do pôrodu no neskôr ich nositeľ zomiera (Pai et al., 2003). Všetky ostatné
autozomálne trizómie pôsobia letálne už v embryonálnom štádiu (podobne ako
všetky autozomálne monozómie). Trizómie, ktoré umožňujú prežívatelnosť
majú za následok vznik niekoľkých porúch súčasne ako napríklad pri
Do novom, Ed ardso om a Patau’s syndróme sa objavujú kardiovaskulárne
poruchy, kraniofaciálne poruchy, vývojové abnormality nervového systému a
zastavený rast (Pai et al., 2003). Štúdie za posledných 15 rokov poukázali, že
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
51
autozomálne trizómie sa objavujú skôr, ak homologické chromozómy zlyhávajú
v procese crossing overu (Lynn et al., 2004). Väčšina trizómií je vyvolaná
chybami počas meiózy I u matky. Chyby počas meiózy I sa často spájajú s
absenciou rekombinácie respektíve s nezvyčajne situovanými zmenami.
Mechanizmus vzniku aneuploidie pohlavných chromozómov u ľudí je na
rozdiel od autozomálnych aneuploidií uniformný, pričom jeho príčinou býva
strata respektíve nadbytok rodičovského chromozómu. Fenotypové prejavy
bývajú menej zreteľné v porovnaní s autozomálne determinovanými
aneuploidiami, dokonca u niektorých jedincov je zachovaná reprodukčná
schopnosť. Napriek prítomnosti abnormalít v chromozomálnej konštitúcii
jedinca, viaceré gaméty produkované týmito jedincami nesú správny počet
chromozómov, pravdepodobným mechanizmom vedúcim ku korektnosti
v počte chromozómov býva strata nadbytočného pohlavného chromozómu pred
respektíve počas procesu meiózy. To znamená, že schopnosť selekcie majú
bunky so správnym X chromozomálnym obsahom (napríklad XX voči XXX
bunkám a XY voči XXY) a bunky so zastúpením jedného Y chromozómu
(napríklad XY voči XYY).
4.2.3 Chromozómová mozaika
Ak sa non-disjunkcia vyskytne počas meiotického delenia, bunky
pochádzajúce z defektnej zygoty s aneuploidným počtom chromozómov sú
nositeľmi tejto chromozomálnej zmeny a postihnuté embryo je neskoršie
eliminované. Non-disjunkcia počas mitotického cyklu môže viesť k vzniku
chromozomálnej mozaiky prezentovanej dvoma respektíve viacerými
bunkovými klonmi s odlišným počtom chromozómov. Teda u niektorých
jedincov sú prítomné normálne aj abnormálne bunkové línie. Títo jedinci sú
označovaní ako mozaiky a vo väčšine prípadov abnormálne bunkové línie nesú
numerické chromozomálne zmeny. Štrukturálna mozaika je extrémne vzácna.
Stupeň klinického dôsledku zmeny chromozómov na jedinca závisí od percenta
abnormálnych buniek. V bežnej cytogenetickej analýze sa hodnotí minimálne
15-20 buniek podľa poradia pre vylúčenie každého klinicky signifikantného
mozaicizmu (Parkányi et al., 2006).
4.2.4 Príčiny a dôsledky vzniku numerických chromozomálnych zmien
Celkove, aneuploida má za následok vznik vývojových abnormalít
a znižuje vitalitu organizmu. Pre objasnenie príčiny straty životaschopnosti
organizmu v dôsledku straty alebo nadbytku chromozómov je potrebné
pochopiť mechanizmy týchto zmien. V prípade chromozomálnych strát existujú
dve príčiny zodpovedné za vznik ochorenia a to: redukcia aktivity proteínov v
dôsledku redukcie efektu génov, tento jav je známy ako haploinsuficiencia.
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
52
Obdobne je to v prípade nadbytku chromozómov, nevyváženie v
proteínovej stechiometrii. Torres et al. (2007) predpokladajú, že aditívne efekty
stechiometrických inbalancií proteínov vzniknuté v dôsledku aneuploidie sú
zodpovedné za vznik defektov u buniek a vývojových abnormalít organizmu.
Pri strate chromozómov dochádza k redukcii hladiny dôležitých proteínov. Vo
všeobecnosti stratu chromozómov, kedy dochádza k redukcii v génovom
zložení organizmus znáša ťažšie ako nadbytok. Neschopnosť kompenzovať
stratu génov môže vysvetľovať lepšiu toleranciu chromozomálnych nadbytkov
v porovnaní s chromozomálnymi stratami. Doposiaľ nie sú známe mechanizmy
kompenzujúce stratu proteínov v dôsledku monozómie. Aneuploidia teda
vyvoláva odchýlku v normálnej stechiometrii podjednotiek proteínového
komplexu. Tieto zmeny v intracelulárnom proteínovom zložení môžu zapríčiniť
poruchy jednotlivých bunkových procesov vedúce k vývojovým poruchám a k
zníženiu životaschopnosti organizmu. Táto teória známa ako teória rovnováhy,
vysvetľuje príčinu vzniku chýb v asociácii s aneuploidiou, v dôsledku nadbytku
chromozómu a tých, ktorých príčinou je strata chromozómu (Veitia, 2002; Papp
et al., 2003). Torres et al. (2007) sa domnievajú, že viaceré znaky a hlavne tie,
čo vznikajú pôsobením rozdielnych aneuploidií sa spolupodieľajú na
signifikantnom poklese vitality aneuploidného organizmu. Redukciu vitality
aneuploidných organizmov vyvoláva rad príčin. Nerovnováha v proteínovej
stechiometrii je pravdepodobne hlavnou príčinou vzniku chýb asociovaných s
nadbytkom chromozómov, nerovnováha proteínovej stechiometrie a redukcia
génového efektu vybraných génov sú hlavnou príčinou vzniku defektov
asociovaných s chromozomálnymi stratami. Nakoľko nadbytočné chromozómy
bývajú aktívne v aneuploidných bunkách je pravdepodobné, že transkripčné a
translačné procesy sú v dôsledku toho narúšané, čo môže viesť k redukcii
vitality organizmu (Torres et al., 2007). Kľúčovou otázkou ostáva ako bunky
reagujú na aneuploidiou vyvolaný nerovnovážny stav, či a ako sa ho pokúšajú
opraviť. Vo všeobecnosti sa aneuploidné bunky pokúšajú o znovu dosiahnutie
správnej proteínovej stechiometrie a to buď zníženou reguláciou translačných
procesov respektíve degradáciou nadbytočného proteínu. Príkladom regulácie
môže byť degradácia -tubulínu a histónov v prípade overexpresie, respektíve
straty ich väzobných partnerov (Gunjan a Verreault, 2003; Lacefield et al.,
2006). Predpokladá sa, že proteínové komplexy ktorých podjednotky plnia
rozdielne funkcie (napríklad jedna podjednotka plní katalytickú funkciu a
ďalšie slúžia ako receptory substrátu) sú kontrolované týmto mechanizmom.
Medzi proteinové komplexy spadajúce do tejto skupiny patria ribozómy,
proteáza a mikrotubuly. Predpoklad o kompenzačnom efekte sa objavuje pri
zvýšenej hladine proteínu, kedy z časti dochádza k degradácii tohto proteínu
(Torres et al., 2007). Pri pozorovaní nádorových buniek, ktoré sú často
aneuploidné, Whittesell a Lindquist (2005) zistili, že tieto bunky v dôsledku
vysokej proteázovej aktivity sú viac senzitívne na inhibítory proteázy ako
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
53
euploidné bunky. Niektoré chromozomálne chyby nevytvárajú zásadné zmeny v
genóme, avšak vyvolávajú nepravidelnosti v procese meiózy. Ak zmena nastáva
v procese fertilizácie vajíčka, následne mitózou je táto aberácia prenášaná do
všetkých buniek vyvíjajúceho sa organizmu. Ak sa aberácia objaví v čase, kedy
je organogenéza približne ukončená, zasiahnutý je len genóm niektorých
buniek, postihnuté je teda iba niektoré tkanivo. Fenotypový efekt
chromozomálnej zmeny teda závisí od času, kedy došlo jej k vzniku. Na
základe pozorovania stupňa mozaicizmu u tkanív získaných z troch
embryonálnych zárodočných vrstiev je možné stanoviť, v ktorom štádiu vývoja
došlo k vzniku danej aberácie. Beatty (1957) poukázal na to, že iba časť buniek
vnútrobunkovej masy embrya sa podieľa na formovaní plodu. Viaceré formujú
embryonálne membrány a placentu. Na základe tohto poznania, aberantné
bunkové línie sa môžu normálne vyvíjať, pričom nemajú rozhodujúcu úlohu na
embryonálny vývin. Existuje množstvo mechanizmov v procese ontogenézy
schopných potlačiť nepriaznivé pôsobenie chromozomálnych aberácií. Je
zrejmé, že aberácie, ktoré zapríčiňujú stratu veľkého množstva chromatínu
môžu viesť k vážnej chybe v procese ontogenézy. Viaceré typy spôsobujú
potiaže iba počas meiózy, následne mitóza prebieha normálne. Hoci
chromozomálne aberácie sa objavujú príležitostne a spontánne, môžu byť v
populácii v určitom čase a mieste inkorporované do genómu a to buď ako
prenosný respektíve stabilný polymorfizmus. Väčšina z nich nie je prospešná a
býva eliminovaná. Pri situáciách, kedy vyvolaná zmena pôsobí nepriaznivo na
životaschopnosť jedinca, proces eliminácie nastáva rýchlo, čím je zabránené
zastúpenie aberantnej formy v populácii. Niektoré nepriaznivo pôsobiace
zmeny majú za následok zníženú fertilitu jedinca, vyvolávajú embryonálnu
smrť respektíve potrat. Iné zapríčiňujú nepatrné modifikácie v procese
ontogenézy, čím zvyšujú riziko predčasného úhynu plodu. Viacerí vedci sa
domnievajú, že aneuploidia u cicavcov je čiastočne geneticky podmienená a
môže viesť k vzniku genetickej poruchy, respektíve mať až letálny účinok. Pri
patologických zmenách v organizme dochádza k nárastu počtu aneuploidných
buniek.
5 Ochorenia vyvolané zmenami na úrovni chromozómov
u hospodárskych zvierat
Ochorenia vyskytujúce sa v chovoch hospodárskych zvierat priamo
ovplyvňujú produkčné, reprodukčné či zdravotné parametre chovaných
jedincov. Včasnou diagnostikou, liečbou a vhodnými opatreniami je možné
uchrániť nemalé hodnoty v intenzívnych chovoch. Niektoré ochorenia
objavujúce sa v ranných štádiách života nie je možné objasniť bežnými
veterinárnymi metodami, nakoľko ich výskyt je príčinou zmien na
chromozomálnej úrovni, vznikajúcich počas embryogenézy vplyvom rôznych
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
54
faktorov. Životaschopnosť, produkčné, reprodukčné vlastnosti jedincov
nesúcich tieto zmeny bývajú značne potlačené a v mnohých prípadoch
geneticky podmienené (chromozomálne zmeny) vedú k úhynu plodu. Jedincov
nesúcich geneticky podmienené nežiaduce zmeny je nutné z hľadiska
potenciálneho prenosu chybnej genetickej informácie na potomstvo z
reprodukčného procesu vylúčiť. Chimerizmus, chromozomálna translokácia u
dobytka a X monozómia u koní sú najbežnejšie detekované chromozomálne
poruchy u týchto druhov. Niekoľko štúdii poukázalo na spojitosť
Robertsonových translokácií so zníženou fertilitou samcov a samíc rôznych
druhov (Cribiu et al, 1989). U koní je dobre známa X monozómia, zvyčajne
spôsobujúca sterilitu. Poznanie mechanizmu vzniku geneticky podmienených
ochorení je základom pochopenia ich podstaty a rizika. Chromozómy ako
nositelia genetickej informácie určujú fenotypový prejav zvieraťa. Každý
chromozóm je nositeľom veľkého počtu génov, genetické anomálie vznikajú,
ak gény chýbajú respektíve je ich prebytok, v dôsledku ich mutácie, respektíve
ich nesprávnym umiestnením na chromozóme v dôsledku translokácie.
Niektoré gény priamo ovplyvňujú vznik abnormalít, hoci výskyt takýchto
génov je skôr sporadický. Zvyčajne gény podmieňujúce tieto ochorenia sú
recesívnej povahy, čo v praxi znamená, že dva takéto defektné gény musia byť
prítomné na vyvolanie abnormality. Každé zviera teda nesie dva gény pre určitý
znak, jeden zdedený po matke a jeden po otcovi. To isté zviera prenáša iba
jeden z dvojice zdedených génov na potomstvo a je vecou náhody, ktorý z nich
to bude. Približne polovica potomstva dedí jeden gén a druhá polovica druhý.
Ak oba gény sú odlišné vzniká otázka, ktorý z nich determinuje ako bude zviera
vyzerať a aké budú jeho funkčné znaky. Fakt, že väčšina mutácii má recesívnu
povahu umožňuje, že jedinec nesúci len jednu kópiu defektného génu sa javí
ako zdravý bez akýchkoľvek symptómov a je nositeľom ochorenia. Zviera,
ktoré zdedí defektné gény od oboch rodičov je postihnuté so všetkými prejavmi
tohto ochorenia. Rodič - nositeľ ochorenia prenáša zdravý gén na polovicu
potomstva a defektný gén na druhú polovicu potomstva, teda vzniká približne
polovica normálneho potomstva a druhá polovica nositeľov ochorenia. U
žiadneho z týchto jedincov sa neprejavia symptómy ochorenia. Ak obaja
rodičia, nositelia sú pripárení, jedna štvrtina potomstva bude normálna,
polovica bude nositeľmi ochorenia a druhá štvrtina budú postihnutí jedinci. Ak
postihnutý jedinec je pripárený s normálnym zdravým jedincom, celé jeho
potomstvo bude nositeľom ochorenia. Ak postihnutý jedinec je pripárený
s jedincom - nositeľom, polovica potomstva bude postihnutá a druhá polovica
nositeľská. U všetkých typov ochorení je dôležitá schopnosť včasne rozpoznať
výskyt ochorenia na základe znalostí jednotlivých symptómov sprevádzajúcich
to ktoré ochorenie a následné potvrdenie respektíve vyvrátenie ich výskytu
vhodnou metódou (Čurlej a Chrenek, 2009).
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
55
5.1 Králik
1. Buftalmia, ochorenie vyskytujúce sa predovšetkým u plemena
Novozélandský biely, vyvolané mutáciou autozomálne recesívneho génu (Obr.
28). Klinickými príznakmi bývajú zákal, zastretie rohovky a vypuklé očné gule
(URL 2).
Obrázok 28 Buftalmia králikov, oko zdravého jedinca versus oko jedinca s ochorením
(http://www.bunny- rabbits.com/rabbits.jpg, http://www.dar.uiuc.edu)
2. Splay-leg alebo rozkročené končatiny, je autozomálne recesívne dedičné
genetické ochorenie. Mladé králiky trpiace týmto ochorením postupne strácajú
schopnosť využívať jedny alebo obe končatiny (Obr. 29).
Obrázok 29 Splay legs, rozkročené končatiny
(http://www.medirabbit.com/GE/Knochenkrankheiten/Splay/splayleg_ge.htm)
Ochorenie napáda predné respektíve zadné končatiny, ktoré sú ohnuté.
Postihnutý jedinec nie je schopný využívať tieto končatiny, čo vedie k
čiastočnej až úplnej paralýze. Zviera normálne prijíma potravu, jediným
klinickým príznakom je obtiažna chôdza a krútenie sa dookola. Sprievodné javy
sprevádzajúce toto ochorenie sú: panvová hypoplazia so stehennou luxáciou
(vykĺbením), skrútenie distálnej časti prednej končatiny, zhoršený rast bedier a
ramenných kĺbov (achondroplasia) a syringomyelia - výskyt tekutinou
vyplnených miest na chrbtovej mieche. Postihnutých jedincov je možné
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
56
dochovať do jatočnej hmotnosti avšak ich použitie v plemenitbe je nežiaduce
(URL 2).
5.2 Ovce
1. Entropion je geneticky podmienené ochorenie recesívnej povahy vyskytujúce
sa predovšetkým u oviec, pri ktorom je okraj viečka (najčastejšie spodné
viečko) obrátený, čo spôsobuje podráždenie a oder očnej rohovky s následným
zvredovatením, zastrením rohovky až slepotou (Obr. 30). Zasahuje jedno
respektíve obe oči. Zvyčajne sa objavuje u mladých jedincov v prvých týždňoch
života. Toto ochorenie sa môže vyskytnúť ako dedičné ochorenie u psov,
sporadicky v stáde oviec a kôz (Cockett et al., 2001).
Obrázok 30 Entropion - obrátený okraj viečka
(http://www.infovets.com/books/smrm/C/C202.htm;http://www.nadis.org.uk/bulletins/eye-
diseases-in-sheep.aspx)
2. Poruchy čeľuste u oviec (horný predkus, spodný predkus) sa vyskytujú
takmer u všetkých plemien oviec v dôsledku zmien na predných rezákoch.
Tieto defektné zmeny majú genetické pozadie recesívnej povahy. Typy zmien
na čeľusti: horný predkus, papagájové ústa, mandibular branchygnathism.
Horná čeľusť je dlhšia ako spodná, medzi hornými a spodnými rezákmi je
medzera pri zavretých ústach. V niektorých prípadoch ak sa táto porucha
vyskytne u jahniat, v priebehu dospievania sa môže upraviť do normálneho
stavu. Spodný predkus tzv. obrátené nožnice, prognathism. Spodná čeľusť je
dlhšia ako horná (Obr. 31). Nositeľov týchto anomálii je vhodné z chovu
vyradiť hlavne kvôli neskorším problémom pri výžive systémom kŕmenia z
kŕmnych zariadení (Cockett et al., 2001).
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
57
Obrázok 31 Spodný predkus
(http://www.flickr.com/photos/hopemcg/2776512512/)
3. Rektálne vydutie (rektálna prolapsia) je ochorenie vyskytujúce sa najmä u
oviec mäsového typu (Obr. 32). Toto ochorenie má genetické pozadie. Rovnako
ako pri predošlých ochoreniach, týchto jedincov je nutné z chovného stáda
vylúčiť (Cockett et al., 2001).
Obrázok 32 Rektálna prolapsia
(http://www.infovets.com/books/smrm/C/C900.htm)
4. Kryptorchizmus, ochorenie pri ktorom jeden, respektíve oba semenníky
ostávajú umiestené v dutine brušnej a nezostupujú, respektíve len čiastočne
zostúpia do mieška. Existujú dve formy kryptorchizmu a to: 1. unilaterálny
kryptorchizmus- jeden zo semenníkov je normálne zídený do mieška, zatiaľ čo
druhý ostáva v brušnej dutine. Nositelia sú zvyčajne schopní párenia, avšak
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
58
nakoľko ochorenie je geneticky podmienené, nositeľov je nutné z chovu
vyradiť. 2. bilaterálny kryptorchizmus- ak oba semenníky ostávajú nezostúpené
v dutine brušnej, nositelia sú sterilní. Ochorenie je recesívne, geneticky
podmienené (Cockett et al., 2001).
5. Pavučie jahňatá (Spider Lamb Syndrome, SLS), dedičná chondrodysplasia je
recesívne genetické ochorenie vyskytujúce sa u oviec vyvolávajúce deformity
kostry u mladých jahniat (Obr. 33). Syndrómy tohto ochorenia zahŕňajú
abnormálne dlhé a ohnuté končatiny, skrútenú chrbticu, nízky vzrast, plochý
hrudný kôš a dlhý krk (Cockett et al., 2001).
Obrázok 33 SLS, Pavučie jahňatá
(http://www.uwyo.edu/vetsci/undergraduates/courses/patb_4110/2009_lectures/31_genetic_dise
ase/html/class_notes.htm)
5.3 Kozy
1. Beta mannosidosia je recesívnym geneticky podmieneným ochorením
plemena Nubian, podobá sa na G-6-S v spôsobe prenosu a manifestácii tohto
ochorenia. Na rozdiel od G-6-S, beta-mannosidosia je ochorenie vedúce k
pomerne rýchlemu úhynu a teda možnosť prenosu v procese párenia je nízka na
rozdiel od G-6-S. Postihnutý jedinec je ochrnutý, nie je schopný postaviť sa na
nohy, neschopný zdvihnúť hlavu a trasie sa pri akomkoľvek pokuse o
postavenie sa. Ďalšími sprievodnými znakmi bývajú deformity kostry, prudké
mihanie očami a hluchota. Príčinou týchto ťažkostí je nedostatok enzýmu, ktorý
za normálnych okolností spoľahlivo odbúrava cukry z buniek. Tieto cukry sa
akumulujú v bunkách a ako prvé sú zasiahnuté bunky nervového systému. Na
rozdiel od G-6-S prvotné príznaky sú zreteľné už u narodeného jedinca (URL
3).
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
59
2. G-6-S, Glucosamine-6-Sulfatase Deficiency alebo Caprine
Mucopolysaccharidosis-IIID je genetické ochorenie u kôz plemena Nubian
a jeho krížencov. Príčinou ochorenia je G-6-S mutácia, má recesívnu povahu.
Daný jedinec trpí nedostatkom G-6-S enzýmu. Bolo pozorované, že G-6-S
mutácia je prítomná prevažne u línií určených na vysokú produkciu mlieka.
Postihnutí jedinci majú početné anomálie ako sú: spomalený rast a nízky
celkový vzrast, nízky objem svalovej hmoty, zavalitá hlava, hluchosť, slepota,
problémy imunitného systému, problémy srdcovej činnosti a reprodukčné
problémy. Úhyn nastáva najneskôr vo veku 3-4 rokov v dôsledku zlyhania
srdcovej činnosti (URL 4).
5.4 Zdravotné aspekty génových manipulácii u experimentálnych zvierat
V súčasnom období zaznamenávame intenzívny rozvoj biologických
vied zameraných na kontrolu a modifikácie biologických procesov. Novým
trendom v oblasti biotechnológií živočíchov sa stávajú kmeňové bunky, ktoré
sú schopné delenia a diferenciácie na bunky rôznych tkanív celého organizmu,
čo znamená, že kmeňové bunky by mohli nahradiť odumierajúce bunky
rôznych orgánov a vyliečiť viaceré degeneratívne ochorenia cez genetickú
modifikáciu. Genetické technológie umožňujú indukovať zmeny a využívať
vlastnosti organizmov v prospech ľudstva, ktorých podstatou je zásah do
genetickej výbavy organizmov. Biotechnológie ako multidisciplinárne
technológie využívajúc poznatky molekulárnej a bunkovej biológie, genetiky a
génového inžinierstva, biochémie a ďalších disciplín umožňujú produkciu
geneticky modifikovaných organizmov. Cieľavedomá zmena genómu
hospodárskych zvierat metódami transgenézy a vytvorenie geneticky
modifikovaných organizmov umožňuje realizovať nielen tvorbu špecifických
genotypov, ale aj zabezpečiť produkciu nových biologicky aktívnych látok
(Roychoudhury et al., 2008). Práve za najvhodnejšie modelové organizmy sa
považujú hospodárske zvieratá, ako napríklad hovädzí dobytok, ošípané, kozy,
ovce a králiky. Ich prednosťou je vysoká schopnosť produkcie dostatočného
množstva žiadaných účinných látok, krátky interval na získanie novej
transgénnej generácie, vysoká stabilita expresie a relatívne nízke náklady.
Transgénne králiky sa stali vhodným živočíšnym modelom pre štúdium
mechanizmov ľudských ochorení ako napríklad aterioskleróza, Parkinsonová
choroba, skleróza multiplex, hemofília a iné. Poskytujú alternatívny model pre
produkciu terapeutických proteínov v mlieku a sú vhodným modelovým
organizmom pre štúdium genómu, génovej expresie a regulácie (Stromqvist et
al., 1997). Náhodná integrácia génových konštruktov može mať za následok
narušenie funkcie regulácie endogénnych génov, v dôsledku čoho vznikajú
inzertné mutácie (Palmiter and Brinster, 1986), respektíve aneuploidia
chromozómov (Goepfert et al., 2000). Aneuploidia môže mať letálny účinok,
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
60
alebo môže viesť k nárastu genetickej poruchy. Niektoré chromozomálne
abnormality nevedú k vzniku ochorenia u nositeľov, ako napríklad translokácie
alebo inverzie, hoci môžu viesť k zvýšenej pravdepodobnosti potomstva s
chromozomálnou poruchov. Vnášanie cudzích génov môže vyvolať rôzne
poruchy vlastných génov, vnášaný génový konštrukt sa môže integrovať do
buniek necieľových orgánov (Chrenek, 2002). Embryá s takto vyvolanými
abnormalitami môžu byť eliminované už počas embryonálneho vývinu v
maternici, respektíve narodení jedinci môžu byť sterilní alebo niesť rôzne
vývojové poruchy. U zdanlivo zdravých geneticky modifikovaných
hospodárskych zvierat môžu zdravotné problémy prepuknúť počas života ako
dôsledok neprítomnosti genetickej kontroly cudzieho génu. Transgénne zvieratá
často vykazujú nekontrolovanú expresiu inzertovaného génu vedúcu k
zhoršeniu ich zdravotného stavu, k poruche úžitkovosti respektíve k úhynu.
Extra kópia génu rastového hormónu u geneticky modifikovaných oviec
vyvolávajúca rýchlejši rast, zvýšenú produkciu vlny a mlieka často viedla u
týchto zvierat k cukrovke a zvýšenej vnímavosti na parazity (Pursel et al.,
1989). U transgénnych Beltsvillských ošipaných s génom pre ľudský rastový
hormón za účelom zvýšenia ich produkcie boli zaznamenané hnačky, vývoj
mliečnej žľazy u samcov, reuma, problémy s očami, problémy s pokožkou,
strata libida, porucha estrálneho cyklu, pneunómia či dokonca úhyn (Pursel et
al., 1989). Myší WAP gén riadený WAP promótorom pri expresii u
transgénnych oviec s integrovaným génom tohto typu viedol k zvýšenej
chorobnosti týchto zvierat (Wall et al., 1996). Z vyššie uvedených dôvodov,
cytogenetické analýzy transgénnych zvierat môžu byť nápomocnými pri
eliminácii geneticky podmienených ochorení u potomkov.
6 Cytogenetické analýzy v experimentálnej oblasti
6.1 Preimplantačné genetické diagnózy - analýzy oocytov a embryí
Myšlienka PGD diagóz sa objavila už v 60. rokoch 20. storočia pri
pokusoch zisťovania pohlavia králičích embryí v štádiu blastocysty. Riziko
prenosu genetických ochorení na potomstvo je jedným z najväčších problémov
asistovanej reprodukcie. V danom smere PGD metódy v procese selekcie
embryí znižujú riziko výskytu spontánnych potratov a riziko výskytu
chromozomálnych trizómií (Gianaroli et al., 2003; Munné, 2003).
Preimplatačné genetické diagnózy prinášajú dôležité informácie o
chromozomálnej stavbe embrya. Zavedenie PGD metód v procese asistovanej
reprodukcie umožňuje včasné odhalenie rizika výskytu geneticky
podmienených ochorení, ešte pred samotným prenosom embrya do recipientky.
Adaptácia týchto metód sa významne podieľa na znižovaní rizika výskytu a
následného vývinu embryí s aneuploidným počtom chromozómov.
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
61
Preimplantačné genetické diagnózy a ďalšie techniky eliminácie
chromozomálne abnormálnych embryí zvyšujú úspešnosť techník embryo
transferu. Pre získanie komplexnejších informácii boli vyvinuté PGD metódy
detekcie aneuploidie založené na princípe FISH (fluorescenčnej in situ
hybridizácie) použiteľné aj pri interfáznych jadrách. Numerické analýzy
interfáznych chromozómov sú založené na použití špecifických fluorescenčne
značených DNA prób, kde súčasné použitie viacerých prób umožňuje
mapovanie niekoľkých chromozómov v jednom experimente. Nie menej
dôležitou súčasťou PGD analýz sú vhodne zvolené kultivačné podmienky a
kultivačné média. V súčasnosti sú dobre známe podmienky maturácie oocytov,
oplodnenia in vitro a kultivačné podmienky pre zygoty a embryá. Tie významne
vplývajú na morfológiu, počet buniek a životaschopnosť in vitro
produkovaných embryí (Abe et al., 1999). Viuff et al. (2000) poukázali, ako
odlišné kultivačné podmienky pôsobia na vývoj markerov kvality embrya
a jeho životaschopnosť v in vitro produkčnom systéme. Tieto podmienky in
vitro produkcie embryí zásadne vplývajú na chromozomálnu stavbu embrya.
Podmienky vyvinuté pre ľudské embryonálne kultúry vychádzajú zo štúdií na
myších, králičích modeloch a na škrečkoch. Vylepšenia kultivačných médií a
kultivačných podmienok vychádzajú z poznania fyziológie embrya a
podmienok vo vajcovode a v maternici. Poznanie vývoja embrya od zygoty po
štádium blastocysty v in vitro podmienkach a poznanie zloženia vajcovodných
a vnútromaternicových tekutín viedlo k vytvoreniu špecifických kultivačných
médií. Kultivačné podmienky pre ľudské embryá boli vyvinuté za účelom
zvyšovania životaschopnosti in vitro oplodnených embryí. Rozdiely vo výskyte
chromozomálnych abnormalít u embryí publikované rôznymi autormi sú
pravdepodobne zapríčinené rôznymi kultivačnými podmienkami. Napríklad,
Iwasaki a Nakahara (1990) zistili 13,7 % výskyt chromozomálnych abnormalít
u 2-bunkových bovinných embryí, kým Ka arsky et al. (1996) detekovali
výskyt chromozomálnych abnormalít v 36,3 % rovnako u bovinných embryí v
tom istom embryonálnom štádiu. Viuff et al. (2000) vo svojej štúdii
zaoberajúcej sa hodnotením chromozomálnych abnormalít prostredníctvom
FISH metódy poukazujú, že nie všetky jadrá embryí v závislosti od
analyzovaného embryonálneho štádia je možné podrobiť detekcii, kvôli stratám
počas prípravy preparátov. Uvádzajú napríklad pri 2-bunkovom štádiu
úspešnosť izolácie 1,9 jadra; pri 3-4 bunkovom štádiu 3,6 jadra; u 5-8
bunkovom štádiu 6,4 jadra; 9-10 bunkové štádiu 10,0 jadra; 17-25 bunkové
štádium 17,0 jadra; 26-35 bunkové štádium 23,1 jadra a pri štádiu 36 buniek a
vyššie 46,7 jadra.
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
62
6.1.1 Selekcia embryí pre embryo-transfer
Embryonálny vývoj začína syngamiou samčieho a samičieho prvojadra
po oplodnení. Schopnosť embrya úspešne sa vyvíjať je ovplyvnená už v
prvotných štádiách jeho existencie, čo je dané kvalitou vstupujúcich samčích a
samičích gamét. Následné chyby vznikajúce počas vývoja môžu viesť k
mortalite embrya. Fragmentácia patrí medzi najbežnejší morfologický znak pri
stanovení kvality embrya. Nie všetky fragmentácie sa ukazujú ako škodlivé pre
vývin embrya, charakter fragmentácie má však značný vplyv na vývojový
potenciál embrya. Väčšie fragmenty formované v 2- až 4- bunkovom štádiu sa
ukazujú ako škodlivé z hľadiska ochudobnenia embrya o esenciálne organely
ako sú napríklad mitochondrie (Harper et al., 1996). Prítomnosť malých
fragmentov nemá zásadný vplyv na vývojovú schopnosť embrya. Formovanie
malých fragmentov môže byť výsledkom nekompletnej cytokinézy. Výsledky v
úspešnosti implatnácie embrya sa ukázali rovnaké pri embryách bez výskytu
fragmentácie a pri embryách s nízkou úrovňou fragmentácie. Nízke schopnosti
implantácie boli zaznamenané u embryí s 10 - 50 % výskytom fragmentácie na
druhý deň ich vývoja (Slimane et al., 2002). Morfologické kritéria však nie sú
dostatočné pre selekciu kvalitných embryí, hoci embryá s dobrými
morfologickými vlastnosťami vykazujú nižšie zastúpenie chromozomálnych
aberácii v porovnaní s embryami so zastaveným delením, respektíve so zlými
morfologickými znakmi. Výsledky štúdii u preimplantačných embryí poukázali
na 30 - 60 % výskyt embryí nesúcich chromozomálne abnormality (Magli et al.,
2000). Selekcia embryí v štádiu blastocysty zlepšuje efektívnosť prenosu,
nakoľko len približne polovica všetkých zygot má schopnosť vyvíjať sa až do
štádia blastocysty. Predĺžená kultivácia do štádia blastocysty však neeliminuje
všetky embryá s výskytom chromozomálnych abnormalít (Slimane et al., 2002).
Magli et al. (2000) poukázali na to, že niektoré chromozomálne abnormálne
embryá sú schopné dosiahnuť štádium blastocyty, hoci častejšie u nich
dochádza k zablokovaniu delenia. Existuje niekoľko teórii vysvetľujúcich ako
sa môže embryo s výskytom chromozomálne abnormálnych blastomér vyvíjať
do normálneho plodu: 1) selekcia alebo apoptóza jednej bunkovej línie nemusí
pôsobiť na embryo letálne, ak chromozomálne korektné jadrá prežívajú (Everett
a West, 1998). 2) aneuploidné blastoméry sú vylúčené do trofodermu (James et
al., 1995). Aneuploidia môže byť vysvetlením približne 50 % úspechov vo
vývoji embryí do štádia blastocysty (Magli et al., 2000). Približne 40 % embryí
s normálnym morfologickým vývinom do blastocysty býva aneuploidných.
Farfalli et al. (2007) sa domnievajú, že výskyt aneuploidie v preimplantačných
štádiách nie je limitujúcim faktorom pre formovanie, expanziu blastocyty, či
pre hatching. Aneuploidia má zvyčajne za následok zablokovanie delenia
embrya (Munné et al., 1995). Chromozomálne abnormality sú detekované vo
vyšších počtoch u zastavených, respektíve pomaly sa deliacich embryí (Farfalli
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
63
et al., 2007). Častým problémom pri analýzach chromozómov u embryonálnych
buniek býva, že iba relatívne malá časť buniek poskytuje analyzovateľné
metafázy (Santaló et al., 1995). Len pri malom počte blastomér náhodne
izolovaných z embryí je možné získať metafázu vhodnú pre analýzu za
relatívne krátky čas. Dokonca pri celonočnej kultivácii izolovaných blastomér v
prítomnosti kolcemidu, len približne jedna tretina buniek dáva metafázy
použiteľné pre karyotyping, pravidlom však bývajú ešte nižšie výťažky metafáz
(Santaló et al., 1995). Napríklad u ľudských embryí pred štádiom
kompaktizácie sa bunky nachádzajú v interfáze väčšiu časť z ich približne 16
hodinového bunkového cyklu. Samotné cytogenetické štúdia embryí
neprinášajú dostatočné množstvo informácií o podstate chromozomálnych
abnormalít, nakoľko len časť embryonálnych buniek môže byť vyšetrená. FISH
metóda v tomto smere prináša riešenie daného problému použitím
fluorescenčne značených chromozómovo-špecifických prób pre analýzu
interfáznych jadier.
6.2 Využitie cytostatík za účelom synchronizácie bunkového cyklu
Správne rozdelenie replikovaných chromozómov do dcérskych buniek
počas mitózy závisí od formovania deliaceho vretienka pozostávajúceho
primárne z mikrotubúl. Mikrotubuly predstavujú dynamické štruktúry, ktorých
priestorová organizácia je rozhodujúca pre správnu funkciu deliaceho vretienka.
Fyzikálne a chemické činitele zasahujúce do organizácie mikrotubúl blokujú
proces mitózy. Najčastejším prvkom s daným účinkom je kolcichín, výťažok z
rastlín Colchicum. Je pomerne dlho známym potenciálnym inhibítorom
bunkového delenia, pôsobí na proces formovania mikrotubúl deliaceho
vretienka (Dustin, 1979; Sluder, 1991). Po rokoch používania kolchicínu a od
neho odvodeného menej toxického kolcemidu sa začali používať aj ďalšie
cytoblokátory ako: podophyllotoxin, steganacín, vinblastín a nokodazol s
podobným mechanizmom účinku na proces mitózy. Väčšina znalostí ohľadom
pôsobenia týchto látok na proces mitózy vychádza z cytologických hodnotení
fixovaných buniek z pred roku 1955. Tieto prvotné štúdie priniesli základný
pohľad na účinok kolchicínu/kolcemidu na proces formovania deliaceho
vretienka u rastlín a živočíchov, zaviedli terminológiu používanú aj v
súčasnosti na charakteristiku procesu mitózy. Použitie rôznych koncentrácií
kolcichínu a kolcemidu v zásade neovplyvňuje počet buniek vstupujúcich do
procesu mitózy (Sluder, 1979). Ak sa aplikujú v čase pred rozpadom jadrovej
membrány, vo vhodnej koncentrácii tieto látky kompletne inhibujú proces
formovania mikrotubúl deliaceho vlákna. Výsledkom je uvoľnenie
chromozómov do cytoplazmy v čase rozpadu jadrovej membrány, kde
pretrvávajú náhodne rozptýlené počas predĺženej periódy mitózy. Je
pozoruhodné, že proces kondenzácie chromozómov napriek tomu pokračuje
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
64
ďalej počas mitózy, čím chromozómy postupne kondenzujú s redukciou o 1-1,5
násobok ich zvyčajnej dĺžky (Mazia, 1961). V ďalších krokoch kondenzácie sa
sesterské chromatídy separujú po celej ich dĺžke, vrátane centromérickej
oblasti, formujúc X- tvaré chromozómy respektíve C- páry (Cooke et al., 1987).
Dovtedajšie zaužívané rozdelenie mitotického cyklu na profázu, metafázu,
anafázu a telofázu rozšíril Schrader (1944) o prometafázu. Jeho štúdia bola
prvotným impulzom pre zavedenie tohto termínu ako samostatnej fázy v
procese mitózy. Sluder (1988) zistil, že k blokácii C- mitózy dochádza
v prometafáze a nie v metafáze ako sa predpokladalo predtým. V súčasnosti je
stále zaužívaný mylný názor, že kolchicín/kolcemid blokujú cyklus mitózy v
metafáze. Pojmy ako metafázny blok, C- mitotická metafáza, blokovaný v
metafáze, kolchicínová metafáza a ďalšie obmeny nie sú úplne správne.
Nakoľko tieto “metafázne” blokované bunky sú v rozpore s oocytmi prirodzene
blokovanými v skutočnej metafáze I respektíve II meiotického cyklu s
kompletne formovaným deliacim vretienkom (Longo, 1973) respektíve so
somatickými bunkami, ktoré použitím rozličných ošetrení za účelom
permanentného bloku v procese mitózy sú s kompletne (Shoji-Kasai et al.,
1987) respektíve s približne kompletne formovanými deliacimi vretienkami
(Hirano et al., 1988). Viaceré typy živočíšnych buniek vrátane buniek čínskeho
škrečka (Stubblefield, 1964), mloka, potkana, kengury (Jensen et al., 1987),
myši (Kung et al., 1990), človeka (Chamla et al., 1980) a morskej ježovky
(Sluder, 1979) sú schopné kompletne prejsť jedným, respektíve viacerými
cyklami C- mitózy v prítomnosti cytostatík. Kolchicín/ kolcemid a cytostatiká s
podobnými účinkami neblokujú všetky živočíšne bunky v procese mitózy
permanentne. Väčšina buniek ošetrených prídavkom cytostatík pretrváva
signifikantne dlhšiu dobu (viac ako 10 násobne dlhšie) v prometafáze mitózy
ešte pred vstupom do interfázy ďalšieho bunkového cyklu v porovnaní s
bunkami bez ošetrenia (Eigsti a Dustin, 1955). Predlžovanie periódy mitózy
počas C- mitózy nie je iba výsledkom deštrukcie deliaceho vretienka použitím
kolchicínu a podobných cytostatík. Rieder a Palazzo (1992) poukázali, že
kolchicín, kolcemid a obdobné jedy oneskorujú, ale nie inhibujú mitotický
cyklus. Rôzne koncentrácie kolcemidu respektíve vinblastinu u morskej
ježovky signifikantne predlžujú mitózu (Sluder, 1988). Za predlžovanie
mitotickej periódy nie je výhradne zodpovedný iba kolcemid respektíve ďalšie
podobné látky narúšajúce formovanie mikrotubúl, trvanie prometafázy
u neošetrených kontrolných buniek sa predlžuje aj v prítomnosti zle
orientovaných chromozómov (Rieder a Alexander, 1989) a tiež v prípade
absencie normálnej bipolarity deliaceho vretienka (Hunt et al., 1992). Rieder a
Alexander (1989) poukázali na prítomnosť kontrolných mechanizmov
bunkového procesu označovaných ako „checkpoints“, ktorých funkciou je
zabezpečenie správnosti jednotlivých procesov mitózy. Hart ell a Weiner
(1989) zistili, že tieto kontrolné body sa objavujú v čase, keď bunka vstupuje do
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
65
anafázy a prechod týmto kontrolným bodom spúšťa sériu udalostí, ktoré
následne umožňujú rýchle “opustenie” mitózy, teda priblíženie sa bunky k
interfáze ďalšieho bunkového cyklu. Nedávno bolo zistené, že jadrové a
cytoplazmatické procesy spúšťajúce proces mitózy sú čiastočne regulované
postupnou syntézou a akumuláciou “cyklínu“, proteínov A a B. Tieto proteíny
predstavujú kofaktory nevyhnutné pre katalytickú aktivitu protein kinázy,
p34cdc2 (Solomon et al., 1990). Syntéza cyklínu zapája bunky do procesu
mitózy (Murray a Kirschner, 1989), nástup anafázy a následné “uvoľnenie sa”
buniek z procesu mitózy sa spája s rýchlou proteolytickou deštrukciou týchto
proteínov (Whitfield et al., 1990). U somatických buniek cyklín A dosahuje
najvyššie hodnoty práve pred rozpadom jadrovej membrány a následne počas
formovania vretienka v prometafáze dochádza k jeho degradácii. Naopak
hodnoty cyklínu B ostávajú na vysokej úrovni až po metafázno-anafáznu
tranzíciu, kedy dochádza k jeho rýchlemu poklesu. Cyklín A je degradovaný,
hodnoty cyklínu B ostávajú vysoké počas predĺženej prometafázy C-mitózy
(Kung et al., 1990; Whitfield et al., 1990). Teda prechod cez kontrolný bod
formovania deliaceho vretienka je umožnený poklesom hladín cyklínu B. Nie
všetky živočíšne bunky napokon prechádzajú cez C-mitózu a vstupujú do
ďalšieho bunkového cyklu v prítomnosti cytostatík. V niektorých prípadoch
značná časť buniek mitoticky blokovanej populácie buniek prekonáva tento
blok, zatiaľ čo ostatné odumierajú (Jordan et al., 1991). Kung et al. (1990)
zistili, že schopnosť niektorých typov buniek prežívať C-mitózu je druhovo
špecifická a spája sa so schopnosťou buniek degradovať cyklín B počas
predlženej mitotickej periódy. U aktívnych cyklujúcich buniek nástup anafázy a
teda “opustenie” mitózy signalizuje disjunkcia replikovaných chromatíd. U
niektorých typov buniek sa chromatídy každého replikovaného chromozómu
delia v centromérickej oblasti tesne pred koncom periódy C- mitózy. C- anafázy
boli pozorované u viacerých typov živočíšnych buniek pri pokusoch s použitím
tzv. “kvapkaných” chromozomálnych preparátov vrátane ľudských lymfocytov
(Gabarron et al., 1986). Vig, (1981) v štúdii zaoberajúcej sa hodnotením
postupnosti separácie centromér zistil, že ošetrenia preparátov ako
hypotonizácia, fixácia roztokom kyseliny octovej/etanolu, nakvapkanie vzorky,
expanzia vzorky na sklíčku nie sú pravdepodobnou príčinou “umelej“ separácie
chromatíd. U niektorých živočíšnych buniek disjunkcia chromatíd poukázala na
dočasnú inaktiváciu p34cdc2 cyklín B komplexu a na deštrukciu cyklínu B
riadenú Ca2+ iónmi (Shamu a Murray, 1992). Proces chromatínu vedúci k
separácii chromatíd je multifázový (napríklad rozdelenie viacerých častí a
následná separácia chromozomálnych ramien a telomér nastáva pred samotným
rozdelením centromér). Ostáva otázkou, či C-anafáza je charakteristickým
prvkom C-mitózy všetkých živočíšnych buniek. Ako bolo spomenuté, niektoré
typy buniek odumierajú v procese C-mitózy, nakoľko u nich zrejme
nedochádza k degradácii cyklínu B, čím je blokovaný nástup anafáznych
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
66
procesov vedúcich k “opusteniu” mitotického cyklu (Hunt et al., 1992). Ak
dochádza k úspešnej iniciácii anafázy, nastupuje separácia chromatíd. U buniek
neschopných opustiť C-mitózu nedochádza k separácií chromatíd. Niektoré
typy buniek sú schopné “opustiť” C-mitózu na základe ich schopnosti prekonať
kontrolný bod formovania deliaceho vretienka pri absencii vretienka, od
ktorého závisí ich schopnosť degradovať cyklín B počas C-mitózy. C-mitotické
bunky schopné prechodu cez tento kontrolný bod dosahujú interfázu.
6.3 Výstupy cytogenetických štúdii zameraných na oblasť hodnotenia
chromozómov
6.3.1 Detekcia integrácie hFVIII transgénu prostredníctvom FISH z lymfocytov
periférnej krvi králika
Cieľom tejto časti bola presná identifikácia miesta integrácie hFVIII
transgénu na králičích chromozómoch, zistenie počtu integrovaných kópii
transgénu. Do pokusu boli zaradení jedinci: samec - rodič z F2 generácie
transgénnych králikov a dvaja potomkovia (F3 generácia). Pre kontrolu boli
použití netransgénni jedinci na základe náhodného výberu. Ako zdroj buniek
pre detekciu transgénu sme zvolili izolované lymfocyty z periférnej krvi
králikov pripravené na základe metodiky Parkányi et al. (2004) bez finálneho
zafarbenia Giemsou.
6.3.1.1 Identifikácia DAPI farbených králičích chromozómov
Jednotlivé DAPI - farbené chromozómy boli rozpoznané na základe
pomeru p/q ramien a pomeru medzi celkovou dĺžkou hodnoteného
chromozómu a dĺžkou najväčšieho chromozómu 1 (Tab. 2). Teda, identifikácia
cieľových chromozómov u DAPI farbených metafáznych náterov bola
ukončená zistením pomeru ramien p/q a relatívnej dĺžky v porovnaní s
chromozómom 1, použitým ako štandard. Získané hodnoty z R-prúžkovaného
králičieho idiogramu (Hayes et al., 2002) slúžili ako štandard. DAPI farbený
králičí karyotyp so všetkými identifikovanými chromozómami (Obr. 34a).
6.3.1.2 FISH-TSA analýza
V tejto práci bola použitá metóda FISH-TSA za účelom mapovania
transgénu ľudského zrážacieho faktora VIII (hFVIII) na králičích
chromozómoch. FISH-TSA sa uskutočnila za účelom identifikácie
chromozomálnej pozície ľudského koagulačného faktora VIII (hFVIII) u F2
transgénneho samca (jedinec 1-3-8) a u dvoch potomkov (F3 generácia: ♂24s a
♀35s). Pri F2 samcovi, hybridizácia hFVIII próby viedla k označeniu
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
67
chromozómov 3p, 7p, 8q, 9p a 18q. Jedinec 24s vykázal signál na chromozóme
3 v pozícii p ramien.
Tabuľka 2 Identifikácia všetkých králičích chromozómov na základe pomeru
dĺžky ramien p/q a ich relatívnej dĺžky v porovnaní s chromozómom 1 (interný
štandard) (Krylov et al., 2008)
U králika 35s z F3 generácie boli identifikované dva cieľové
chromozómy 3p a 7p (Obr. 34b). Pre vylúčenie možnosti značenia vlastného
králičieho génu próbou, gén bol sekvenovaný a uskutočnila sa FISH-TSA
analýza. Kódujúca sekvencia bola publikovaná v Gen-Bank databáze pod
číslom EU447260. Zoskupenie nukleotidov ľudských a králičích cDNA
sekvencií vykázalo 86 % podobnosť a 21 rozdielov. Príslušná štruktúra
proteínov poukázala na 78 % identitu a 86 % pozitivitu v porovnaní s ľudskými
kópiami. Králičia cDNA próba (1310 bp) je lokalizovaná na géne umiestnenom
na konci q ramena X chromozómu (Obr. 34c). Lokalizácia ľudského FVIII
transgénu na chromozómoch u králikov F2 a F3 generácie jasne poukázala na
vertikálne prerozdelenie jednotlivých lókusov. Značka pre ľudský chromozóm
X hybridizovala jedine s vlastným králičím X chromozómom. Toto zistenie
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
68
spolu so súčasnými výsledkami mapovania génu poukazuje na silnú X
chromozóm konzerváciu medzi oboma druhmi.
Obrázok 34: a) DAPI farbený králičí karyotyp netransgénnej samice; b) Lokalizácia ľudského
FVIII transgénu na králičích chromozómoch u F2 samca a dvoch F3 potomkov; c) Lokalizácia
vlastného králičieho FVIII génu na konci q ramena X chromozómov u netransgénnej samice
(Krylov et al., 2008)
6.3.2 Detekcia aneuploidie z lymfocytov kostnej drene transgénnych králikov
V tejto časti štúdie sme sa zaoberali hodnotením chromozomálnej
aneuploidie u somatických buniek - lymfocytov kostnej drene králika s
predpokladom na zvýšený výskyt chromozomálnej aneuploidie u transgénneho
potomstva. Do pokusu sme zahrnuli 10 transgénnych jedincov F4 generácie s
integrovaným hFVIII transgénom a ako kontrolu sme použili 10
netransgénnych jedincov v rovnakom veku. Izoláciu a kultiváciu lymfocytov
kostnej drene králika sme uskutočnili podľa modifikovanej Parkányiho
metodiky (Parkányi, 1981). Vo výsledkoch sme nezaznamenali preukazné
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
69
rozdiely pri výskyte chromozomálnej aneuploidie medzi transgénnymi (61 a 70
%) a netransgénnymi králikmi (51,27 a 61,4 %) línie I a línie II (Tab. 3, 4).
Tabuľka 3 Rozdelenie c-metafáz z lymfocytov kostnej drene na základe ploidity
(samica č. 1-3-5), línia I (Curlej et al., 2007)
Tabuľka 4 Rozdelenie c-metafáz z lymfocytov kostnej drene na základe ploidity
(samica č. 1-9-7), línia II (Curlej et al., 2007)
Signifikantné rozdiely (p<0,05) boli zistené v zastúpení chromozomálne
korektných (diploidných) buniek medzi transgénnymi a netransgénnymi
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
70
jedincami línie II (Tab. 4). Aneuploidia bola zapríčinená predovšetkým
kategóriou hypodiploidných buniek (2n<44) v rozpätí (23 - 57 %) u oboch
sledovaných skupín. Percentuálne zastúpenie hyperdiploidných buniek (2n>44)
bolo nízke (3 - 30 %) u transgénnych a netransgénnych králikov. Polyploidné
bunky sa vyskytovali vo veľmi nízkom zastúpení u oboch sledovaných skupin
králikov (0 – 17 %). V priemere, transgénne králiky oboch línii boli
charakterizované 65,5 % aneuploidiou v porovnaní s netransgénnymi a ich 56,3
% priemernou hodnotou aneuploidie (Graf 1). Transgénne králiky oboch línii
vykázali nižšie priemerné zastúpenie korektných somatických buniek (29,5 %)
v porovnaní s netransgénnou kontrolou (39,1 %).
Graf 1 Grafické porovnanie priemerného zastúpenia diploidných a aneuploidných buniek v
hodnotených skupinách transgénnych a netransgénnych králikov (Čurlej, 2009)
6.3.3 Detekcia aneuploidie z lymfocytov periférnej krvi transgénnych králikov
Častou metódou zisťovania aneuploidie u živých zvierat je detekcia z
lymfocytov periférnej krvi. V tejto časti práce sme vychádzali z metodiky
publikovanej v práci Parkányi et al. (2004). Periférnu krv sme získali jej
sterilným odberom z ušnej vény králikov. Následnú analýzu sme uskutočnili u 6
transgénnych králikov s integrovaným hFVIII transgénom pochádzajúcich z F2
a F3 generácie, ako kontrolu sme použili 6 netransgénnych jedincov. Zistili sme
podobné percentuálne zastúpenie aneuploidných metafáz u transgénnych
králikoch (37,78 %) a 37,22 % u netransgénnych (Tab. 5). Podobné výsledky
boli zaznamenané v skupine diploidných buniek s 57,78 % zastúpením pri
transgénnych a 59,44 % pri netransgénnych králikoch (Obr. 35a). Na
aneuploidii sa u oboch skupín králikov podieľali predovšetkým hypodiploidné
bunky s 31,11 a 33,89 % priemerným zastúpením (Obr. 35b). Hyperdiploidné
boli nájdené len v 3,33 % zastúpení u netransgénnych a 6,67 % zastúpení u
transgénnych králikoch. Výskyt polyploidných buniek bol zistený v nízkom
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
71
percentuálnom zastúpením pri transgénnych a netransgénnych králikoch 3,33 a
4,44 % (Obr. 35c).
Tabuľka 5 Chromozomálna analýza (c-metafázy) transgénnych
a netransgénnych králikov (Čurlej, 2009)
Obrázok 35 a) Diploidná metafáza; b) Hypodiploidná metafáza; c) Polyploidná metafáza
(Čurlej, 2009)
Zistené rozdiely v zastúpení aneuploidných a diploidných buniek medzi
transgénnymi a netransgénnymi jedincami boli v oboch prípadoch nepreukazné
(Graf 2).
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
72
Graf.2 Porovnanie priemerného zastúpenia diploidných a aneuploidných buniek v hodnotených
skupinách transgénnych a netransgénnych králikov (Čurlej, 2009)
6.3.4 Detekcia aneuploidie - oocyty a embryá
Včasné odhalenie chromozomálnych zmien u vstupujúceho materského
a otcovského genetického materiálu, u vyvíjajúceho sa embrya umožňuje
predísť vzniku genetických ochorení, či zániku vyvíjajúceho sa plodu,
respektíve narodeného jedinca. V tejto časti sme hodnotili výskyt aneuploidie u
27 oocytov a 58 embryí po in vitro kultivácii (Tab. 6). Podiel blastomér úspešne
blokovaných v štádiu metafázy predstavoval 100 %, 86,1 % a 92,2 % pre 2-, 4-
a 8- bunkové embryá. Napriek tomu, že počet blastomér blokovaných v štádiu
metafázy po kultivácii s prídavkom kolcemidu bol relatívne vysoký, nie všetky
metafázne jadrá nájdené na mikroskopickom sklíčku boli detekovateľné v
dôsledku nedostatočného rozostúpenia sa izolovaných chromozómov a ich
prekrývania sa. Podiel analyzovateľných blastomér dosiahnutý v tejto štúdii
predstavoval 58,8 %, 83,9 % a 59,8 % pre 2-, 4- a 8- bunkové embryá. Pri
oocytoch bolo zistené 59,3 % zastúpenie haploidných chromozomálnych sád.
Ďalej sme zaznamenali 35 %, 53,85 % a 37,5 % zastúpenie blastomér nesúcich
korektné počty chromozómov u 2-, 4-, 8- bunkových preimplantačných
embryálnych štádií (Obr. 36a). Z aneuploidnej formy hlavné zastúpenie mala
hypodiploidia pri embryách, hypoploidia pri oocytoch (29,6 % pri oocytoch;
52,5 %; 30,8 %; 54,7 % pri 2-, 4-, 8 bunkových embryách) (Obr. 36b).
Hyperdiploidia (hyperploidia) bola pozorovaná v malom zastúpení u troch
analyzovaných skupinách (11,1 % pri oocytoch, 10 % a 3,85 % pri 2- a 4-
bunkových štádiách) (Obr. 36c). Celková hodnota aneuploide v jednotlivých
skupinách poukázala na 62,5 % výskyt v dvoj-bunkovom štádiu a 54,7 % v
štádiu ôsmych buniek. Nižšia úroveň aneuploidie bola zistená pri oocytoch v
40,7 % a 34,65 % u štvor-bunkových embryí. Blastoméry s polyploidným
počtom chromozómov boli zistené iba v nízkom počte pri 2-bunkových (2,5 %)
a pri 8-bunkových embryách (3,1 %) (Obr. 36d).
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
73
Tabuľka 6 Chromozomálna analýza (c-metafázy) králičích oocytov a in vitro preimplantačných embryí v štádiu 2-,4- a 8-
buniek (Curlej et al., 2010)
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
74
Obrázok 36 a) Diploidná metafáza (4- bunkové štádium); b) Hypodiploidná metafáza (8- bunkové štádium); c) Hyperdiploidná metafáza (8-
bunkové štádium); d) Polyploidná metafáza (2- bunkové štádium) (Čurlej, 2009)
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
75
Výskyt haploidie bol zistený pri 4- a 8- bunkových embryách v 11,5 % a
4,7 % zastúpení. Pri štatistickom porovnávaní celkovej aneuploidie χ2 testom
medzi oocytmi a jednotlivými embryonálnymi štádiami sme zistili preukazný
rozdiel (p<0,01) v skupine oocytov a 2- bunkových embryí 40,7 % vs. 62,5 %
(Graf 3).
Graf. 3 Porovnanie percentuálneho zastúpenia aneuploidných blastomér podľa vývojového
štádia (Curlej et al., 2010)
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
76
Prílohy (Vzor laboratórnych protokolov)
Protokol 1 Schéma hormonálneho ošetrenia donorky králika
(Chrenek et al., 1999)
Zootechnické kritériá:
Vek - 5 mesiacov
Hmotnosť - minimálne 3,5 kg
Svetelný režim - 12/12 hod., 14/10 hod.
Voda a krmivo - ad libitum
Ustajnenie - individuálne, klietkové
Dobrý zdravotný stav
Donorka:
1) Aplikácia PMSG a HCG
• 13:00 hod. (80 I.U. PMSG, aplikácia do svalu - intramuskulárne)
• po 72 hod. 13:00 hod. (150 I.U. HCG, aplikácia do žily - intravenózne)
Ihneď pripustiť pohlavne dospelým a prevereným samcom (min. 2x), 0 hod. PC
(post coitum)
2) Aplikácia FSH a HCG
07:00 hod 0,250mg FSH (pod kožu alebo do svalu)
19:00 hod. 0,250mg FSH (pod kožu alebo do svalu)
07:00 hod. 0,625mg FSH (pod kožu alebo do svalu)
19:00 hod. 0,625mg FSH (pod kožu alebo do svalu)
07:00 hod. 0,250mg FSH (pod kožu alebo do svalu)
po 8-10 hod.
15-17 hod. (150 I.U. HCG do žily - intravenózne)
Ihneď pripustiť pohlavne dospelým a prevereným samcom (min. 2x),
0 hod. PC (post coitum)
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
77
Metodické postupy zamerané na hodnotenie chromozomálnej aneuploidie u
králika
Protokol 2 Kultivácia lymfocytov kostnej drene
(Curlej et al., 2007)
Materiál:
TCM 199 (Gibco BRL, USA)
10 % FCS (Gibco BRL, USA)
KaryoMAX Colcemid (Gibco BRL, USA) koncentrácia roztoku 10μg/ml
0,075 M KCl (Gibco BRL, USA)
Kyselina octová (Lachema, ČR)
Metanol (Mikrochem, SR)
Giemsa (Gibco BRL, USA)
Postup:
1. Usmrtenie králika - elektrickým prúdom,
2. Vypreparovanie femuru,
3. Vyplavenie kostnej drene použitím 2 ml média TCM 199 a 10 % FCS,
4. Resuspendácia peletu a centrifugácia buniek kostnej drene počas 7 minút pri
1200 ot./min.,
5. Odstránenie supernatantu (médium s tukom),
6. Pridanie 2 ml média TCM 199 k bunkám na dne skúmavky,
7. Resuspendácia peletu a pridanie 100 μl cytostatika kolcemid o finálnej
koncentrácii 0,50 μg kolcemidu / 1 ml média,
8. Inkubácia 40 minút pri teplote +37 °C,
9. Centrifugácia 7 minút pri 1200 ot./min.,
10. Odstránenie supernatantu,
11. Pridanie 4 ml hypotonického roztoku 0,075 M KCl zohriatého na +37 °C,
pôsobenie 20 min. v termostate pri +37 °C,
12. Centrifugácia 7 minút pri 1200 ot./min.,
13. Odstránenie supernatantu,
14. Pridanie 4 ml fixátora (metanol : kyselina octová v pomere 3:1), spočiatku
0,5 ml fixátora po kvapkách a po premiešaní pridanie zvyšných 3,5 ml fixátora.,
15. Centrifugácia 7 minút pri 1200 ot./min.,
16. Odstránenie supernatantu,
17. Pridanie fixátora, centrifugáciu a odsávanie supernatantu opakujeme ešte
dvakrát v uvedenom poradí.
18. Odstránenie supernatantu a ponechanie 0,5 ml peletu buniek,
19. Aplikácia 2 až 3 kvapiek resuspendovaného peletu na vopred vyčistené a
vychladené podložné sklíčko (Obr. 37),
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
78
Obrázok 37 Aplikácia fixovanej suspenzie buniek na mikroskopické sklíčko (Čurlej, 2009)
20. Po uschnutí vzorky farbenie chromozómov 2 % roztokom Giemsa (farbivo
Giemsa + MILLI Q voda) po dobu 7. min.,
21. Oplach vzorky destilovanou vodou, uschnutie pri izbovej teplote
a vyhodnotenie za pomoci svetelného mikroskopu.
Protokol 3 Chromozómy z kultúry lymfocytov periférnej krvi
(Čurlej et al., 2007)
Materiál:
Sterilná ihla (Medoject, SR)
Sterilná striekačka 5ml (Braun, Nemecko)
Heparin (Léčiva, ČR)
PB Karyomax (Gibco BRL, USA)
KaryoMAX Colcemid (Gibco BRL, USA) koncentrácia roztoku 10μg/ml
0,075 M KCl (Gibco BRL, USA)
Kyselina octová (Lachema, ČR)
Metanol (Mikrochem, SR)
Giemsa (Gibco BRL, USA)
Postup:
1. Odber krvi v objeme (0,5ml) z ušnej vény králika dezinfikovanej
benzylalkoholom sterilnou ihlou a injekčnou striekačkou s antikoagulačným
prípravkom Heparin,
2. Pridanie 3 kvapky krvi do skúmavky s 2ml kultivačného média PB
Karyomax (Gibco BRL, USA),
3. Kultivácia vzorky v termostate cca 66-72 hodín pri teplote 37 ºC,
premiešanie vzorky 2-3 krát počas doby kultivácie,
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
79
4. Po kultivácii pridanie 120 μl cytostatika kolcemid - finálna koncentrácia 0,25
μg/ml
5. Kultivácia vzorky po dobu 1 hodiny za občasného premiešania,
6. Centrifugácia 7 minút pri 1200 ot./min.,
7. Odstránenie supernatantu,
8. Pridanie 4 ml hypotonického roztoku 0,075 M KCl zohriatého na +37 °C,
pôsobenie 20 min. v termostate pri +37 °C,
9. Centrifugácia 7 minút pri 1200 ot./min.,
10. Odstránenie supernatantu,
11. Pridanie 4 ml fixátora (metanol : kyselina octová v pomere 3:1), spočiatku
0,5 ml fixátora po kvapkách a po premiešaní pridanie zvyšných 3,5 ml fixátora.,
12. Centrifugácia 7 minút pri 1200 ot./min.,
13. Odstránenie supernatantu,
14. Pridanie fixátora, centrifugáciu a odsávanie supernatantu opakujeme ešte
dvakrát v uvedenom poradí.
15. Odstránenie supernatantu a ponechanie 0,5 ml peletu buniek,
16. Aplikácia 2 až 3 kvapiek resuspendovaného peletu na vopred vyčistené a
vychladené podložné sklíčko,
17. Po uschnutí vzorky farbenie chromozómov 2 % roztokom Giemsa (farbivo
Giemsa + MILLI Q voda) po dobu 7. min.,
18. Oplach vzorky destilovanou vodou, uschnutie pri izbovej teplote
a vyhodnotenie za pomoci svetelného mikroskopu.
Protokol 4 Získavanie oocytov a embryí
(Chrenek et al., 1999)
Materiál:
PBS (Gibco BRL, USA)
CO2 independent (Gibco BRL, USA)
10 % FCS (Gibco BRL, USA)
Postup:
1. Odber oocytov od samíc králika plemena Novozélandsky biely respektíve
Kalifornský realizujeme 18h po pripustení vazektomovaným samcom, odber
embryí v štádiu 2- buniek (Obr. 38) od samíc králika plemena Novozélandsky
biely respektíve Kalifornský realizujeme 24h po pripustení overenými
samcami,
2. Usmrtenie samice v porážkarni a odobratie vajcovodov spolu s vaječníkmi a
rohom maternice,
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
80
Obr. 38 Fázy delenia embrya v podmienkach in vitro
(http://www.fertilab.net/ginecopedia/fertilidad/problemas_en_la_mujer/ovarios/los_ovarios_1)
3. Vyplavenie oocytov respektíve embryí zohriatym PBS na 37 ºC (Obr. 39).
Obrázok 39 Vyplavovanie vajcovodov v laboratórnych podmienkach (Čurlej, 2009)
4. Premývanie v zohriatom (37 ºC) CO2 independent médiu s prídavkom 10 %
FCS, 3x,
5. Selekcia oocytov a embryí na základe morfologických kritérií
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
81
Protokol 5 Kultivácia embryí a synchronizácia bunkového cyklu
(Curlej et al., 2010)
Materiál:
k-DMEM (Gibco BRL, USA)
10 % FCS (Gibco BRL, USA)
Kultivačná miska štvorkomorová (Nunc, Dánsko)
KaryoMAX Colcemid (Gibco BRL, USA) koncentrácia roztoku 10μg/ml
Postup:
1. Prenos vyselektovaných embryí do k-DMEM kultivačného média
doplneného o 10 % FCS v 4-jamkovej kultivačnej miske,
2. Kultivácia v podmienkach CO2 inkubátora pri 5 % CO2 a 39 ºC,
3. Zablokovanie delenia buniek v štádiu metafáza pridaním cytostatika
kolcemid o výslednej koncentrácii 1 μg/ml do kultivačného k-DMEM média po
dobu pôsobenia 7, 12 respektíve 13 hod. pri 2-, 4- a 8- bunkových embryách.
* Pozn. V každom pokuse ponecháme niekoľko embryí bez ošetrenia
cytostatikom, ako kontrolu fázy mitotického cyklu, tieto slúžia ako indikátor
dĺžky pôsobenia kolcemidu na embryá.
Protokol 6 Izolácia chromozómov - embryá
(Curlej et al., 2010)
Materiál:
Pronase (Sigma, USA)
CO2 independent (Gibco BRL, USA)
1 % roztok citrátu sódneho (Mikrochem, SR)
0,25 % FBS (Gibco BRL, USA)
KaryoMAX Colcemid (Gibco BRL, USA) koncentrácia roztoku 10μg/ml
Kultivačná miska štvorkomorová (Nunc, Dánsko)
Giemsa (Gibco BRL, USA)
Postup:
1. Mitoticky blokované embryá prenesieme do 0,5 % pronázy (Sigma, USA)
zohriatej na 39 ºC v podmienkach CO2 inkubátora počas 16-20 minút za účelom
odstránenia zony pellucida a mukóznej vrstvy,
2. Blastoméry po odstránení zóny pellucida následne 3x premyjeme v
zohriatom CO2 independent médiu (37ºC) za účelom eliminácie neželaného
ďalšieho pôsobenia pronázy na obnažené embryonálne bunky,
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
82
3. Za účelom hypotonizácie použijeme 1 % roztok citrátu sódneho obohatený o
0,25 % FBS a kolcemid vo finálnej koncentrácii 1 μg/ml, v podmienkach
termostatu pri 37 ºC po dobu 15 min. pôsobenia,
4. Fixáciu blastomér realizujeme vždy čerstvo pripraveným fixačným roztokom
(metanol : kyselina octová v pomere 3:1) zohriatom na izbovú teplotu, pri
konštantnom mikroskopickom pozorovaní v 4- jamkových kultivačných
miskách, pokiaľ sa cytoplazma stane transparentnou.
* Pozn. Jedným z častých problémov je nedostatočné nariedenie cytoplazmy
počas doby fixácie (Obr. 40b).
a) b) Obrázok 40 a- fixácia blastomér s dostatočným nariedením cytoplazmy (2- bunkové štádium);
b- blastoméry s reziduálnou cytoplazmou (2- bunkové štádium) (Čurlej, 2009)
5. Fixované bunky prenesieme na čisté a odmastnené mikroskopické sklíčka do
kvapky hypotonického roztoku,
6. Finálnu fixáciu buniek uskutočníme aplikáciou kvapky fixačného roztoku
(metanol: kyselina octová, 3:1) vychladeného na 4 ºC z približne 4 cm výšky,
7. Schnutie a následné farbenie chromozómov 2 % rozokom Giemsa (Gibco
BRL, USA) cca 8 min. pri izbovej teplote.
Protokol 7 Izolácia chromozómov - oocyty
(Curlej et al., 2010)
Materiál:
0,5 % roztok hyaluronidázy (Sigma, USA)
0,5 % roztok pronázy (Sigma, USA)
1 % roztok citrátu sódneho (Mikrochem, SR)
0,25 % FBS (Gibco BRL, USA)
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
83
Kultivačná miska štvorkomorová (Nunc, Dánsko)
Giemsa (Gibco BRL, USA)
Postup:
1. Kumulárne bunky z oocytov odstránime pôsobením 0,5 % roztokom
hyaluronidázy za pomoci pipety,
2. Následne zonu pellucida odstránime pôsobením 0,5 % roztokom pronázy po
dobu 4. minút v podmienkach termostatu pri 37 ºC,
3. Za účelom hypotonizácie použijeme 1 % roztok citrátu sódneho obohatený o
0,25 % FBS v podmienkach termostatu pri 37 ºC po dobu 15 min. pôsobenia,
4. Fixáciu oocytov realizujeme vždy čerstvo pripraveným fixačným roztokom
(metanol : kyselina octová v pomere 3:1) zohriatým na izbovú teplotu, pri
konštantnom mikroskopickom pozorovaní v 4- jamkových kultivačných
miskách, pokiaľ sa cytoplazma stane transparentnou.
5. Fixované bunky prenesieme na čisté a odmastnené mikroskopické sklíčka do
kvapky hypotonického roztoku,
6. Finálnu fixáciu buniek uskutočníme aplikáciou kvapky fixačného roztoku
(metanol : kyselina octová, 3:1) vychladeného na 4 ºC z približne 4 cm výšky,
7. Schnutie a následné farbenie chromozómov 2 % rozokom Giemsa (Gibco
BRL, USA) cca 8 min. pri izbovej teplote.
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
84
Záver
Chromozómy sú najvýznamnejšie jadrové komponenty, ktoré obsahujú
genetickú informáciu bunky a odovzdávajú ju nasledujúcej generácii buniek
(Jakolev, 1976). Zohrávajú dôležitú úlohu pri zabezpečovaní presného
rozdelenia genetického materiálu do dcérskych buniek počas meiotického a
mitotického delenia materských buniek. Non-disjunkcia počas mitotického
resp. meiotického delenia je najčastejšou príčinou nerovnomerného rozdelenia
páru chromozómov do dcérskych buniek.
Za chromozomálne aberácie sa v širšom slova zmysle považujú všetky
odchýlky chromozómov štrukturálneho a numerického charakteru, zistené
bežnými cytogenetickými metódami. Ich vznik je dôsledkom mutačných
procesov na chromozomálnej úrovni. Štrukturálne zmeny vznikajú v dôsledku
chromozómových zlomov a sú sprevádzané vznikom abnormálnych
chromozomálnych kombinácii. Numerické zmeny chromozómov sú zapríčinené
stratou respektíve nadbytkom celého chromozómu alebo chromozómov. Môžu
sa vyskytovať u autozómov aj u pohlavných chromozómov. Aneuploidia ako
pojem vyjadruje počet chromozómov, ktorý nie je euploidný (nepravidelný
počet chromozómov). Predstavuje zmenu v počte chromozómov v
chromozomálnych sadách (Weaver a Hedrick, 1995). Prvá systematická
analýza vplyvu aneuploidie na úrovni bunky a fyziológie organizmu bola
uskutočnená pred viac ako storočím. Celkove, aneuploida má za následok vznik
vývojových abnormalít a znižuje vitalitu organizmu.
Nakoľko ochorenia vyskytujúce sa v chovoch hospodárskych zvierat
priamo ovplyvňujú produkčné, reprodukčné či zdravotné parametre chovaných
jedincov. Včasnou diagnostikou, liečbou a vhodnými opatreniami ako je
selekcia jedincov pri podozrení na ochorenie genetickej podstaty, je možné
uchrániť nemalé hodnoty v intenzívnych chovoch a predísť riziku prenosu
ochorenia do nasledujúcich generácii. Keďže, niektoré ochorenia objavujúce sa
v ranných štádiách života nie je možné objasniť bežnými veterinárnymi
metódami, nakoľko ich výskyt je príčinou zmien na chromozomálnej úrovni,
vznikajúcich počas embryogenézy vplyvom rôznych faktorov. V tomto smere
cytogenetika nachádza nezastupiteľné uplatnenie ako súčasť klinickej
diagnostiky. Konvenčná cytogenetika predstavuje najčastejši spôsob vyšetrenia
metafáznych chromozómov v rámci jednej bunky - teda zostavenie karyotypu a
deteguje všetky typy prítomných zmien, ak je zasiahnutá časť dostatočne veľká
(Gersen a Keagle, 2005; Li a Pinkel, 2006). Hoci cestou klasickej cytogenetiky
analyzujeme celý genóm v rámci jednej analýzy, jej rozlišovacia schopnosť je
relatívne nízka a viacero submikroskopických zmien zostáva neodhalených. Pre
identifikáciu týchto zmien, musí byť cytogenetická analýza doplnená
citlivejšími metódami, akými sú metódy molekulárnej cytogenetiky (Jarošová,
2007). Z tohto hľadiska, kombinácia molekulárnej genetiky a konvenčnej
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
85
cytogenetiky vytvorila novú éru v klinickej genetike tzv. molekulárnu
cytogenetiku (Pergament, 2008). Prvý prevrat v oblasti cytogenetiky priniesla
metóda fluorescenčnej in situ hybridizácie (FISH), vďaka jej schopnosti štúdia
chromozómových aberácii aj v interfáznych jadrách, senzitivite, špecificite a
rýchlosti, ktoré jej otvorili dvere v celom rade klinických štúdií modernej
molekulárnej cytogenetiky (Mundle a Sokolova, 2004). Jej nespornou výhodou
je schopnosť detegovať viacero menších delécií, duplikácií a chromozomálnych
prestáv, ktoré nie sú identifikovateľné prostredníctvom štandardnej analýzy
mikroskopom. Vývoj ďalšej cytogenetickej techniky - komparatívnej
genómovej hybridizácie (CGH) (du Manoir et al., 1993; Kallioniemi et al.,
1992) vytvoril efektívny nástroj pre zosnímanie celého genómu, za účelom
identifikácie rozdielov v počte kópií molekuly DNA, kde viac ako dva genómy
môžu byť súčasne porovnávané, ak je k dispozícii vhodné značenie. Ďalšou
z možností uplatnenia tejto techniky je schopnosť detekcie nebalansovaných
chromozómových aberácií v celom genóme v rámci jedného kroku (Kirchhoff
et al., 1999). Nevýhody klasickej CGH, ako sú nižšia detekčná schopnosť a
príprava metafáznych chromozómov odstránila metóda aCGH (array
komparatívna genómová hybridizácia), založená na rovnakom princípe s tým
rozdielom, že metafázne chromozómy sú nahradené unikátnymi fragmentami
DNA (sondy), ktoré sú chemicky alebo synteticky fixované k pevnému povrchu
(napr. podložné sklíčko).
V experimentálnej oblasti využitie cytogenetických štúdii u
preimplantačných embryí poukázalo na 30 - 60 % výskyt embryí nesúcich
chromozomálne abnormality (Magli et al., 2000). Z tohto hľadiska, aneuploidia
môže byť vysvetlením približne 50 % úspechov vo vývoji embryí do štádia
blastocysty (Magli et al., 2000). Detekcia chromozomálnych aberácií pri in
vitro oocytoch a in vitro preimplantačných embryí umožňuje včasne selektovať
tento genetický materiál pred samotným embryo transferom (Čurlej, 2009).
Významným trendom v súčasnom období je intenzívny rozvoj biologických
vied zameraných na kontrolu a modifikácie biologických procesov. Avšak,
náhodná integrácia génových konštruktov može mať za následok narušenie
funkcie regulácie endogénnych génov, v dôsledku čoho vznikajú inzertné
mutácie (Palmiter and Brinster, 1986), respektíve aneuploidia chromozómov
(Goepfert et al., 2000). Cytogenetické analýzy transgénnych jedincov môžu byť
účinnymi nástrojmi eliminácie geneticky podmienených ochorení u týchto
zvierat a ich potomkov.
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
86
Conclusion
Chromosomes are the most important nuclear components containing
the genetic information of the cell and transmit it to the next generation of cells
(Jakolev, 1976) . Play an important role in ensuring accurate distribution of
genetic material to daughter cells during mitotic and meiotic division of parent
cells. Nondisjunction during mitotic respectively . meiotic division is the
leading cause of uneven distribution of a pair of chromosomes into daughter
cells.
Chromosomal aberrations in a broad sense presents all variations of
chromosome structural and numerical character detected by conventional
cytogenetic methods. Their formation is the result of mutational processes at the
chromosomal level. Structural changes result from chromosome breakage and
are accompanied by the production of abnormal chromosomal combination.
Numerical chromosome changes are caused by an excess or loss of the entire
chromosome or chromosomes . May affect the autosomes and sex
chromosomes. Aneuploidy as a term is the number of chromosomes that is not
euploid (irregular number of chromosomes). Represents the change in the
number of chromosomes in chromosome sets (Weaver and Hedrick, 1995). The
first systematic analysis of the impact of aneuploidy at cellular and physiology
level of the organism was made over a century ago. Overall, aneuploidy gives
rise to developmental abnormalities and reduces the vitality of the organism.
As the disease occurring in the livestock directly affect production ,
reproduction and health parameters reared specimens . Early diagnosis,
treatment and appropriate measures such as the selection of individuals for
suspected disease of genetic nature, it is possible to save considerable value in
intensive production systems and to prevent the risk of disease transmission to
the next generation. Whereas , some emerging disease in the early stages of life
can not be clarified by conventional veterinary methods , since their occurrence
is caused by changes in the chromosomal level , arising during embryogenesis
due to various factors. In this respect, cytogenetics has found irreplaceable
application as part of a clinical diagnosis. Conventional cytogenetics are the
most common way of metaphase chromosome studies of a single cell - thus
formation of karyotype and detection of the all types of present changes, if the
affected portion is large enough (Gersen and Keagle, 2005, Li and Pinkel,
2006). Although classical cytogenetics way we analyze the entire genome in a
single analysis, the resolution is relatively low and the number of
submicroscopic changes remain undetected. To identify these changes the
cytogenetic analysis must be supplemented by more sensitive methods, such as
methods of molecular cytogenetics (Jarošová, 2007). In this regard , the
combination of molecular genetics and conventional cytogenetics created a new
era in clinical genetics - molecular cytogenetics (Pergament, 2008). The first
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
87
upheaval in cytogenetics brought fluorescence in situ hybridization (FISH),
thanks to its ability to study chromosomal aberrations in the interphase nucleus,
sensitivity, specificity and speed, which opened the doors for this technique in a
number of clinical studies of modern molecular cytogenetics (Mundle and
Sokolova, 2004). Its advantage is the ability to detect a number of small
deletions, duplications and chromosomal rebuilds that are not identifiable by
the use of standard microscope analysis. Further development of cytogenetic
techniques - comparative genomic hybridization (CGH (du Manoir et al., 1993,
Kallioniemi et al., 1992) has developed an effective tool for scanning of the
entire genome for identify differences in the number of copies of the DNA
molecule, in which more than two genomes can be compared simultaneously, if
the labelling is appropriate. Another possibility of application of this technique
is the ability to detect non-balansed chromosomal aberrations throughout the
genome in a single step (Kirchhoff et al., 1999). CGH disadvantages, such are
lower detection capability and preparation of metaphase chromosomes were
removed by the aCGH (array comparative genomic hybridization) method,
based on the same principle with the difference, that metaphase chromosomes
are replaced by unique DNA fragments (probes) which are chemically or
synthetically fixed to a solid surface (eg. a microscope slide).
In the experimental field the use of cytogenetic studies in
preimplantation embryos showed the 30 - 60 % incidence of embryos carrying
chromosomal abnormalities (Magli et al., 2000). In this regard , aneuploidy can
be the reason of about 50 % of the success in the development of embryos to
the blastocyst stage (Magli et al., 2000). Detection of chromosomal aberrations
of in vitro oocytes and in vitro preimplantation embryos allows early selection
of this genetic material prior to the embryo transfer (Čurlej, 2009). A major
trend in the current period is an intensive development of life sciences aimed at
controlling and modifying biological processes. However, the random
integration of the gene construct may result in disruption of the function of
regulation of endogenous genes and therefore creates insertion mutation
(Palmiter and Brinster, 1986), or chromosomal aneuploidy (Goepfert et al .,
2000). Cytogenetic analysis of transgenic individuals may be an effective tools
of eliminating genetic diseases in those animals and their offspring.
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
88
Zoznam skratiek
Použitá skratka Vysvetlivka
A Adenín (C5H5N5)
aCGH Array komparatívna genómová hybridizácia
BAC Umelý bakteriálny chromozóm
bp Bázový pár
C Cytozín (C4H5N3O)
CDK Cyklín dependentná kináza
cDNA Komplementárna deoxyribonukleová kyselina
CGH Komparatívna genómová hybridizácia
DAPI 4',6-‐diamidino-‐2-‐fenylindol
DNA Deoxyribonukleová kyselina
FBS Plodové hovädzie sérum
FCS Plodové teľacie sérum
FISH Fluorescenčná in situ hybridizácia
FISH-TSA FISH Tyramide signal amplification
FSH Folikulostimulačný hormón
G Guanín (C5H5N5O)
HCG Ľudský choriový gonadotropín
hFVIII Rekombinantný ľudský faktor VIII
HGP Projekt ľudského genómu
IU Medzinárodná jednotka
KCl Chlorid draselný
k-DMEM Knockout DMEM médium
RNA Ribonukleová kyselina
T Tymín (C5H6N2O2)
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
89
Zoznam použitej literatúry
ABE, H.- YAMASHITA, S. - ITOH, T. - SATOH, T. - HOSHI, H. 1999.
Ultrastructure of bovine embryos developed from in vitro-matured and -
fertilized oocytes: comparative morphological evaluation of embryos cultured
either in serum-free medium or in serumsupplemented medium. In Mol.
Reprod. Dev., vol. 53, pp. 325-335.
ADAMS, K. L. – WENDEL, J. F. 2005. Polyploidy and genome evolution in
plants. In Curr. Opin. Plant Biol., vol. 8, no. 2, pp. 135-141.
AMY, Y. - CHEN, Y. - CHEN, A. 2013. Fluorescence in situ hybridization. In
Journal of Investigative Dermatology, vol. 133, pp. 1-4.
AVERY, A. G. 1959. The Genus Datura. New York : Ronald Press. 289 p.
BAČOVÁ, Z. – GÁBELOVÁ, A. - HRUBIŠKO, M. - IMRICH, R. - VLČEK,
M. – ŠTRBÁK, V. 2005. Patologická fyziológia. Bratislava : Ústav normálnej a
patologickej fyziológie SAV. 163 p.
BEATTY, R. A. 1957. Chromosome constancy in the corneal epithelium of the
mouse. In Chromosoma, vol. 8, no. 6, pp. 585-596.
BLAKESLEE, A. F. – BELLING, J. – FARNHAM, M. E. 1920. Chromosomal
duplication and Mendelian phenomena in Datura mutants. In Science, vol. 52,
pp. 388-390.
BOND, D. J. – CHANDLEY, A. C. 1983. Aneuploidy. In American Journal of
Medical Genetics, vol. 22, no. 2, pp. 431-432.
BOVERI, T. 1902. Uber mehrpolige mitosen als mittel zur analyse des
zellkerns verhandlungen der physikalisch-medizinischen gesellschaft zu
wurzburg. In Neu Folge, vol. 35, pp. 67-90.
BOVERI, T. 1904. Ergebnisse uber die konstitution der chromatischen substanz
des zellkerns. Gustav Fischer, Jena, Germany.
BRENNAN, C. – ZHANG, Y. – LEO, C. – FENG, B. – CAUWELS, C. –
AGUIRRE, A. J. - KIM, M. – PROTOPOPOV, A. – CHIN, L. 2004. High-
resolution global profiling of genomic alterations with long oligonucleotide
microarray. In Cancer Res., vol. 64, no. 14, pp. 4744–4748.
BRIDGES, C. B. 1921a. Genetical and cytological proof of nondisjunction of
the fourth chromosome of Drosophila melanogaster. In Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, vol. 7, pp. 186-192.
BRIDGES, C. B. 1921b. Proof of non-disjunction for the fourth chromosome of
Drosophila melanogaster. In Science, vol. 53, 308 p.
BURNHAM, CH. R. 1962. Discussions in cytogenetics. In Science, vol. 15,
375 p.
CAMOUS, S. – KOPEČNÝ, V. – FLECHON, J. E. 1986. Autoradiographic
detection of the earlies stage of [3H]- uridine incorporation into the cow
embryo. In Biol. Cell, vol. 58, no. 3, pp. 195-200.
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
90
CARVALHO, B. – OUWERKERK, E. – MEIJER, G. A. – YLSTRA, B. 2004.
High resolution microarray comparative genomic hybridisation analysis using
spotted oligonucleotides. In J. Clin. Pathol., vol. 57, no. 6, pp. 644–646.
CASPERSSON, T. – ZECH, L. – JOHANSSON, C. 1970. Differential binding
of alkylating fluorochromes in human chromosomes. In Exp. Cell Res., vol.
60, no. 3, pp. 315-319.
COCKETT, N. E. – SHAY, T. L. – SMI, M. 2001. Analysis of the sheep
genome. In Physiological Genomics, vol. 7, pp. 69-78.
COOKE, C. A. – HECK, M. M. – EARNSHAW, W. C. 1987. The inner
centromere protein (INCENP) antigens: movement from inner centromere to
midbody during mitosis. In The Journal of Cell Biology, vol. 105, no. 5, pp.
2053-2067.
COOPER, G. M. 2000. The Cell. 2. vyd. Sunderland MA-USA : Sinauer
Associates Inc. 689 p. ISBN 978-0878931064.
CRIBIU, E. P. – MATEJKA, M. – DARRE, R. – DURAND, V. – BERLAND,
H. M. – BOUVET, A. 1989. Identification of chromosomes involved in
a Robertsonian translocation in cattle. In Genet. Sel. Evol., vol. 21, no. 4, pp.
555-560.
CURLEJ, J. - BULLA, J. - CHRENEK, P. 2010. Occurrence of chromosomal
aneuploidy in rabbit oocytes and embryos at different developmental stages. In
Zygote, vol. 18, no. 3, pp. 203-207.
CURLEJ, J. - PARKANYI, V. - BULLA, J. - JURCIK, R. - CHRENEK, P.
2007. The effect of hFVIII transgene on the chromosomal aneuploidy rate in
rabbits. In Folia Biologica, vol. 55, no. 3-4, pp. 161-164.
ČURLEJ, J. – CHRENEK, P. 2009. Onemocnění genetické podstaty
u vybraných hospodářských zvířat. In Chovatelský magazín, no. 1, pp.27-29.
ČURLEJ, J. – ROYCHOUDHURY, S. - OMELKA, R. – CHRENEK, P. 2007.
Level of chromosomal aneuploidy detected from peripheral blood and bone
marrow in transgenic rabbits. In Slovak J. Anim. Sci., vol. 40, no. 4, pp. 5-8.
ČURLEJ, J. 2009. Aneuploidia transgénnych králikov : doktorandská
dizertačná práca. Nitra : SPU. 95 s.
DAILEY, T. – DÁLE, B. – COHEN, J. – MUNNÉ, S. 1996. Association
between nondisjunction and maternal age in meiosis-II human oocytes. In Am.
J. Hum. Genet., vol. 59, no. 1, pp. 176-184.
DHAMI, P. – COFFEY, A. J. – ABBS, S. – VERMEESCH, J. R. –
DUMANSKI, J. P. - WOODWARD, K. J. – ANDREWS, R. M. –
LANGFORD, C. – VETRIE, D. 2005. Exon array- CGH: detection of copy
number changes at the resolution of individual exons in the human genome. In
Am. J. Hum. Genet., vol. 76, no. 5, pp. 750–762.
DU MANOIR, S. – SPEICHER, M. R. – JOOS, S. – SCHRÖCK, E. – POPP, S.
– DÖHNER, H. – KOVACS, G. - ROBERT-NICOUD, M. – LICHTER, P. –
CREMER, T. 1993. Detection of complete and partial chromosome gains and
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
91
losses by comparative genomic in situ hybridization. In Hum. Genet., vol. 90,
no. 6, pp. 590–610.
DUSTIN, P. 1979. Microtubules and mitosis. In Bull Assoc Anat (Nancy), vol.
63, no. 180, pp. 109-126.
DYBAN, A. P. – BARANOV, V. S. 1987. Cytogenetics of mammalian
embryonic development.Oxford/New York : Clarendon Press/Oxford University
Press. 362 p. ISBN 9780198545842.
EIGSTI, O. J. – DUSTIN, P. 1955. Colchicine in agriculture, medicine, biology
nad chemistry. Aimes, Iowa : Iowa State Coll. Press, 470 p.
EVERETT, C. A. – WEST, J. D. 1998. Evidence for selection against tetraploid
cells in tetraploid/diploid mouse chimaeras before the late blastocyst stage. In
Genet. Res., vol. 72, no. 3, pp. 225-228.
FARFALLI, V. I. – MAGLI, M. V. – FERRARETTI, A. P. – GIANAROLI, L.
2007. Role of aneuploidy on embryo implantation. In Gynecol. Obstet. Invest.,
vol. 64, no. 3, pp. 161-165.
FIEGLER, H. – CARR, P. – DOUGLAS, E. J. – BURFORD, D. C. – HUNT, S.
– SCOTT, C. E. – SMITH, J. – VETRIE, D. – GORMAN, P. –
TOMLINSON, I. P. – CARTER, N. P. 2003. DNA microarrays for
comparative genomic hybridization based on DOP- PCR amplification of BAC
and PAC clones. In Genes Chromosomes Cancer, vol. 36, no. 4, pp. 361–374.
FOROZAN, F. - KARHU, R. – KONONEN, J. - KALLIONIEMI, A. -
KALLIONIEMI, O. P. 1997. Genome screening by comparative genomic
hybridization. In Trends Genet., vol. 13, no. 10, pp. 405-409.
GABARRON, J. – JIMENEZ, J. – GLOVER, G. 1986. Premature centromere
division dominantly inherited in a subfertile family. In Cytogenet. Cell Genet.,
vol. 43, no. 1-2, pp. 69-71.
GALL, J. G. - PARDUE, M. L. 1969. Formation and detection of RNA-DNA
hybrid molecules in cytological preparations. In Proceedings of the National
Academy of Sciences, vol. 63, no. 2, pp. 378-383.
GASCH, A. P. – SPELLMAN, P. T. – KAO, C. M. - CARMEL-HAREL, O. –
EISEN, M. B. – STORTZ, G. – BOTSTEIN, D. – BROWN, P. O. 2000.
Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental
changes. In Mol. Biol. Cell, vol. 11, no. 12, pp. 4241-4257.
GERAMI, P. - ZEMBOWICZ, A. 2011. Update on fluorescence in situ
hybridization in melanoma: state of the art. In Arch Pathol Lab Med., vol. 135,
no. 7, pp. 830–837.
GERSEN, S. L. - KEAGLE, M. B. 2005. The principles of clinical
cytogenetics. 2. vyd. New Jersey USA : Humana Press Inc. 596 p. ISBN 1-
58829-300-9.
GIANAROLI, L. – MAGLI, M. C. – FIORENTINO, F. – BAKLI, M. –
FERRARETTI, A. P. 2003. Clinical value of preimplantation genetic diagnosis.
In Placenta, vol. 24, pp. 77-83.
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
92
GIORGETTI, L. – SERVANT, N. – HEARD, E. 2013. Changes in the
organization of the genome during the mammalian cell cycle. In Genome Biol.,
vol. 14, no. 12, 142 p.
GOEPFERT, T. M. – McCARTHY, M. – KITTRELL, F. S. – STEPHENS, C.
– ULLRICH, R. L. – BRINKLEY, B. R. – MEDINA, D. 2000. Progesterone
facilitates chromosome instability (aneuploidy) in p53 null normal mammary
epithelial cells. In FASEB J., vol. 14, no. 14, pp. 2221-2229.
GRAY, J. W. – LUCAS, J. – PETERS, D. – PINKEL, D. – TRASK, B. - VAN
DEN ENGH, G. - VAN DILLA, M. 1986. Flow karyotyping and sorting of
human chromosomes. In Cold Spring Harb Symp Quant Biol., vol. 51, pp. 141-
149.
GUNJAN, A. – VERREAULT, A. 2003. A Rad53 kinase-dependent
surveillance mechanism that regulates histone protein levels in S. cerevisiae. In
Cell, vol. 115, no. 5, pp. 537- 549.
HARPER, J. C. – DELHANTY, J. D. A. 1996. Detection of chromosomal
abnormalities in human preimplantation embryos using FISH. In Assist.
Reprod. Genet., vol. 13, pp. 137-139.
HARTWELL, L. H. – WEINERT, T. A. 1989. Checkpoint: Controls that ensure
the order of cell cycle events. In Science, vol. 246, no. 4930, pp. 629-634.
HAYES, H. – ROGEL-GAILLARD, C. – ZIJLSTRA, C. - de HAAN, N. A. –
URIEN, C. – BOURGEAUX, N. – BERTAUD, M. – BOSMA, A. A. 2002.
Establishment of an R-banded rabbit karyotype nomenclature by FISH location
of 23 chromosome-specific genes on both G- and R-banded chromosomes. In
Cytogenetic and genome research, vol. 98, no. 2-3, pp. 199-205.
HENRY, I. M. – DILKES, B. P. – YOUNG, K. – WATSON, B. – WU, H. –
COMAI, L. 2005. Aneuploidy and genetic variation in the Arabidopsis thaliana
triploid response. In Genetics, vol. 170, no. 4, pp. 1979-1988.
HIRANO, T. – HIRAOKA, Y. – YANAGIDA, M. 1988. A temperature-
senzitivr mutation of the Schizosaccharomyces pombe gene nuc2+ that
encodes a nuclearscaffold- like protein blocks spindle elongation in anaphase.
In J. Cell Biol., vol. 106, no. 4, pp. 1171-1183.
HODGKIN, J. – HORVITZ, H. R. – BRENNER, S. 1979. Nondisjunction
mutants of the nematode Caenorhabditis elegans. In Genetics, vol. 91, no. 1, pp.
67-94.
HODGKIN, J. 2005. Karyotype, ploidy, and gene dosage. In WormBook: The
Online Review of C. elegans Biology, pp. 1-9.
HODGSON, G. – HAGER, J. H. – VOLIK, S. – HARIONO, S. – WERNICK,
M. – MOORE, D. – NOWAK, N. – ALBERTSON, D. G. – PINKEL, D. –
COLLINS, C. – HANAHAN, D. - GRAY, J. W. 2001. Genome scanning with
array CGH delineates regional alterations in mouse islet carcinomas. In Nat.
Genet., vol. 29, no. 4, pp. 459–464.
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
93
HSU, T. C. 1952. Tissue culture studies on human skin. III. Some cytological
fractures of the outgrowth of ephitelial cells. In Tex. Rep. Biol. Med., vol 10, no.
2, pp. 336-352.
HUGHES, D. T. 1968. Cytogenetical polymorphism and evolution in
mammalian somatic cell populations in vivo and in vitro. In Nature, vol. 217,
no. 5128, pp. 518-523.
HUNT, T. – LUCA, F. C. – RUERMAN, J. V. 1992. The requirements for
protein synthesis and degradation, and the control of destruction of cyclins A
and B in the meiotic and mitotic cell cycles of the clam embryo. In The Journal
of Cell Biology, vol. 116, no. 3, pp. 707-724.
CHAMLA, Y. – ROUMY, M. – LASSÉGUES, M. – BATTIN, J. 1980. Altered
sensitivity to cholchicine and PHA in human cultured cells. In Hum Genet.,
vol. 53, no. 2, pp. 249-253.
CHEUNG, V. G. - NOWAK, N. - JANG, W. - KIRSCH, I. R. - ZHAO, S. -
CHEN, X. N. - FUREY, T. S. - KIM, U. J. - KUO, W. L. - OLIVIER, M. -
CONROY, J. - KASPRZYK, A. - MASSA, H. - YONESCU, R. - SAIT, S. -
THOREEN, C. - SNIJDERS, A. - LEMYRE, E. - BAILEY, J. A. - BRUZEL,
A. - BURRILL, W. D. - CLEGG, S. M. - COLLINS, S. - DHAMI, P. -
FRIEDMAN, C. - HAN, C. S. - HERRICK, S. - LEE, J. - LIGON, A. H. -
LOWRY, S. - MORLEY, M. - NARASIMHAN, S. - OSOEGAWA, K. -
PENG, Z. - PLAJZER-FRICK, I. - QUADE, B. J. - SCOTT, D. - SIROTKIN,
K. - THORPE, A. A. - GRAY, J. W. - HUDSON, J. - PINKEL, D. - RIED, T. -
ROWEN, L. - SHEN-ONG, G. L. - STRAUSBERG, R. L. - BIRNEY, E. -
CALLEN, D. F. - CHENG, J. F. - COX, D. R. - DOGGETT, N. A. -
CARTER, N. P. - EICHLER, E. E. - HAUSSLER, D. - KORENBERG, J. R. -
MORTON, C. C. - ALBERTSON, D. - SCHULER, G. - DE JONG, P. J. -
TRASK, B.J.: BAC RESOURCE CONSORTIUM. 2001. Integration of
cytogenetic landmarks into the draft sequence of the human genome. In Nature,
vol. 409, no. 4822, pp. 953-958.
CHRENEK, P. – PETROVIČOVÁ, I. – RAFAY, J. – BULLA, J. 1999.
Superovulation and recovery of zygotes suitable for double-microinjection in
three rabbit populations. In Czech J. Anim. Sci., vol. 44, no. 10, pp. 471-474.
CHRENEK, P. 2002. Genetické manipulácie s embryami. Nitra : VÚŽV, 83.p.
ISBN 80-88872-25-1.
ISHKANIAN, A. S. – MALLOFF, C. A. – WATSON, S. K. – DELEEUW, R.
J. – CHI, B. - COE, B. P. – SNIJDERS, A. – ALBERTSON, D. G. – PINKEL,
D. – MARRA, M. A. – LING, V. – MACAULAY, C. – LAM, W. L. 2004.
A tiling resolution DNA microarray with complete coverage of the human
genome. In Nat. Genet., vol. 36, no. 3, pp. 299–303.
IWASAKI, S. – NAKAHARA, T. 1990. Incidence of embryos with
chromosomal anomalies in the inner cell mass among bovine blastocysts
fertilized in vitro. In Theriogenology, vol. 34, no. 4, pp. 683-690.
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
94
IWASAKI, S. – SHIOYA, Y. – MASUDA, H. – HANADA, A. –
NAKAHARA, T. 1989. Incidence of chromosomal anomalies in early bovine
embryos derived from in vitro fertilization. In Gamete Res., vol. 22, no. 1, pp.
83-91.
JAKOLEV, A. F. 1979. Issledovanie chromosom seľskochozjajstvennych
životnych. Metodičeskije rekomendacii. Leningrad.
JAMES, R. M. – KLERKX, A. H. E. M. – KEIGHREN, M. – FLOCKHART, J.
H. – WEST, J. D. 1995. Restricted distribution of tetraploid cells in mouse
tetraploid-diploid chimaeras. In Dev. Biol., vol. 167, no. 1, pp. 213-226.
JAROŠOVÁ, M. 2007. Cytogenetika a molekulární cytogenetika v hematologii.
In Onkologická péče, vol. 2, pp. 9-12.
JENSEN, C. G. – DAVISON, E. A. – BOWSER, S. S. – RIEDER, C. L. 1987.
Primary cilia cycle in PtK1 cells: Effects of colcemid and taxol on cilia
formation and resorption. In Cell Motil. Cytoskel., vol. 7, no. 3, pp. 187-197.
JORDAN, M. A. – THROWER, P. – WILSON, L. 1991. Mechanisms of
inhibition of cell proliferation by vinca alkaloids. In Cancer Res., vol. 51, no. 8,
pp. 2212-2222.
KAINA, B. – RIEGER, R. 1979. Chromosomenmutationen,
karyotyppolymorphismus und speciation. In Biol. Zbl., vol. 98, pp. 661-697.
KALLIONIEMI, A. – KALLIONIEMI, O. P. – SUDAR, D. – RUTOVITZ, D.
– GRAY, J. W. – WALDMAN, F. – PINKEL, D. 1992. Comparative genomic
hybridization for molecular cytogenetic analysis of solid tumors. In Science,
vol. 258, no. 5083, pp. 818–821.
KALLIONIEMI, O. P. - KALLIONIEMI, A. - PIPER, J. - ISOLA, J. -
WALDMAN, F. M. - GRAY, J. W. - PINKEL, D. 1994. Optimizing
comparative genomic hybridization for analysis of DNA sequence copy
number changes in solid tumors. In Genes Chromosome Cancer, vol. 10, no. 4,
pp. 231-243.
KAWARSKY, S. J. – BASRUR, P. K. – STUBBINGS, R. B. – HANSEN, P. J.
– KING, W. A. 1996. Chromosomal abnormalities in bovine embryos and
their influence on development. In Biol. Reprod., vol. 54, no. 1, pp. 53-59.
KEARNEY, L. – HORSLEY, S. W. 2005. Molecular cytogenetics in
haematological malignancy: current technology and future prospects. In
Chromosoma, vol. 114, no. 4, pp. 286-294.
KIRCHHOFF, M. – GERDES, T. – MAAHR, J. – ROSE, H. – BENTZ, M. –
DOHNER, H. - LUNDSTEEN, C. 1999. Deletions below 10 megabasepairs
are detected in comparative genomic hybridization by standard reference
intervals. In Genes Chromosomes Cancer, vol. 25, no. 4, pp. 410–413.
KIRCHHOFF, M. – ROSE, H. – LUNDSTEEN, C. 2001. High resolution
comparative genomic hybridization in clinical cytogenetics. In J Med Genet.,
vol. 38, no. 1, pp. 740-744.
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
95
KRYLOV, V. - TLAPÁKOVÁ, T. - MÁCHA, J. - CURLEJ, J. - RYBAN, L. -
CHRENEK, P. 2008. Localization of human coagulation factor VIII (hFVIII)
in transgenic rabbit by FISH-TSA: Identification of transgene copy number
and transmission to the next generation. In Folia Biologica, vol. 54, no. 4, pp.
121-124.
KRZYWINSKI, M. – BOSDET, I. – SMAILUS, D. – CHIU, R. –
MATHEWSON, C. – WYE, N. – BARBER, S. - BROWN-JOHN, M. –
CHAN, S. – CHAND, S. – CLOUTIER, A. – GIRN, N. – LEE, D. –
MASSON, A. – MAYO, M. – OLSON, T. – PANDOH, P. – PRABHU, A. L. –
SCHOENMAKERS, E. – TSAI, M. – ALBERTSON, D. – LAM, W. - CHOY,
C. O. – OSOEGAWA, K. – ZHAO, S. - DE JONG, P. J. – SCHEIN, J. –
JONES, S. - MARRA, M. A. 2004.Aset ofBAC clones spanning the human
genome. In Nucleic Acids Res., vol. 32, no. 12, pp. 3651–3660.
KUNG, A. L. – SHERWOOD, S. W. – SCHIMKE, R. T. 1990. Cell line-
specific differences in the control of cell cycle progression in the absence of
mitosis. In Proc Natl Acad Sci U S A, vol. 87, no. 24, pp. 9553-9557.
LACEFIELD, S. – MAGENDANTZ, M. – SOLOMON, F. 2006.
Consequences of defective tubulin folding on heterodimer levels, mitosis and
spindle morphology in Saccharomyces cerevisiae. In Genetics, vol. 173, no. 2,
pp. 635-646.
LAWRENCE, T. L. J. – FOWLER, V. R. 2002. Growth of farm animal. 2. vyd.
New York USA : CABI Publishing. 349 p. ISBN 0-85199-484-9.
LEJEUNE, J. – GAUTIER, M. – TURPIN, R. 1959. Study of somatic
chromosomes from 9 mongoloid children. In C. R. Hebd. Seances Acad. Sci.,
vol. 248, no. 11, pp. 1721-1722.
LEVAN, A. – FREDGA, K. – SANDBERG, A. A. 1964. Nomenklature for
centromeric position on chromosomes. In Hereditas, vol. 52, pp. 201-220.
LEVAN, A. 1956. Chromosome studies on some human tumors and tissues of
normal origin, grown in vivo and in vitro at the Sloan-Kettering Institute. In
Cancer, vol. 9, no. 4, pp. 648-663.
LI, J. – JIANG, T. – MAO, J. H. – BALMAIN, A. – PETERSON, L. –
HARRIS, C. – RAO, P. H. – HAVLAK, P. – GIBBS, R. – CAI, W. W. 2004.
Genomic segmental polymorphisms in inbred mouse strains. In Nat. Genet.,
vol. 36, no. 9, pp. 952–954.
LI, M. - PINKEL, D. 2006. Clinical cytogenetics and molecular cytogenetics.
In J Zhejiang Univ Sci B., vol. 7, no. 2, pp. 162-163.
LIEHR, T. 2009. Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) Application Guide.
XVIII vyd. Berlin (Germany) : Springer, 452p. ISBN 978-3-540-70581-9.
LINDSLEY, D. L. – SANDLER, L. – BAKER, B. S. – CARPENTER, A. T. –
DENELL, R. E. – HALL, J. C. – JACOBS, P. A. – MIKLOS, G. L. – DAVIS,
B. K. – GETHMANN, R .C. – HARDY, R. W. – STEVEN, A. H. – MILLER,
M. – NOZAWA, H. – PARRY, D. M. - GOULD-SOMERO, M. 1972.
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
96
Segmental aneuploidy and the genetic gross structure of the Drosophila
genome. In Genetics, vol. 71, no. 1, pp. 157-184.
LONGO, F. J. 1973. Fertilization: A comparative ultrastructural review. In Biol.
Reprod., vol. 9, no. 2, pp. 149-215.
LUCITO, R. – WEST, J. – REINER, A. – ALEXANDER, J. – ESPOSITO, D.
– MISHRA, B. – POWERS, S. – NORTON, L. – WIGLER, M. 2000. Detecting
gene copy number fluctuations in tumor cells by microarray analysis of
genomic representations. In Genome Res., vol. 10, no. 11, pp. 1726–1736.
LUPSKI, J. R. - DE OCA-LUNA, R. M. – SLAUGENHAUPT, S. – PENTAO,
L. – GUZZETTA, V. – TRASK, B. J. - SAUCEDO-CARDENAS, O. -
BARKER, D. F. – KILLIAN, J. M. – GARCIA, C. A. – CHAKRAVARTI, A.
– PATEL, P. I. 1991. DNA duplication associated with Charcot-Marie-Tooth
disease type 1A. In Cell, vol. 66, no. 2, pp. 219-232.
LYNN, A. – ASHLEY, T. – HASSOLD, T. 2004. Variation in human meiotic
recombination. In Annu. Rev.Genomics Hum. Genet., vol. 5, pp. 317-349.
MAGLI, M. C. – JONES, G. M. – GRAS, L. – GIANAROLI, L. – KORMAN,
I. – TROUNSON, A. O. 2000. Chromosome mosaicism in day 3 aneuploid
embryos that develop to morphologically normal blastocysts in vitro. In
Human reproduction, vol. 15, no. 8, pp. 1781-1786.
MANTRIPRAGADA, K. K. - TAPIA-PAEZ, I. – BLENNOW, E. – NILSSON,
P. – WEDELL, A. – DUMANSKI, J. P. 2004. DNA copy-number analysis of
the 22q11 deletion-syndrome region using array-CGH with genomic and PCR-
based targets. In Int. J. Mol. Med., vol. 13, no. 2, pp. 273–279.
MAYER, J. – STARÝ, J. et al. 2002. Leukémie. V: Jarošová M. Cytogenetika,
Praha : Grada Publishing, pp. 78–89.
MAZIA, D. 1961. Mitosis: the physiology of cell division. 3 vyd. New York :
The Cell Academic Press, pp. 78-412.
MICHALOVÁ, K. 1999. Úvod do lidské cytogenetiky. Brno : Vydavatelství
IDV PZ. 183 p. ISBN 80-7013-281-7.
MOHAPATRA, G. – MOORE, D. H. – KIM, D. H. – GREWAL, L. – HYUN,
W. C. - WALDMAN, F. M. – PINKEL, D. – FEUERSTEIN, B. G. 1997.
Analyses of brain tumor cell lines confirm a simple model of relationships
among fluorescence in situ hybridization, DNA index, and comparative
genomic hybridization. In Genes Chromosomes Cancer, vol. 20, no. 4, pp. 311–
319.
MOORHEAD, P. S. – NOWELL, P. C. – MELLMAN, W. J. – BATTIPS, D.
M. – HUNGERFORD, D. A. 1960. Chromosome preparations of leukocytes
cultured from human peripheral blood. In Exp. Cell Res., vol. 20, pp. 613-616.
MORRISON, C. 2006. Fluorescent in situ hybridization and array comparative
genomic hybridization: complementary techniques for genomic hybridization.
In Arch Pathol Lab Med., vol. 130, no. 7, pp. 967–974.
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
97
MORTIMER, R. K. – HAWTHOME, D. C. 1966. Genetic mapping in
Saccharomyces. In Genetics, vol. 53, pp. 165-173.
MUNDLE, S. D. - SOKOLOVA, I. 2004. Clinical implications of advanced
molecular cytogenetics in cancer. In Expert Rev. Mol. Diagn., vol. 4, no. 1, pp.
71-78.
MUNNÉ, S. – ALIKANI, M. – TOMKIN, G. – GRIFO, J. – COHEN, J. 1995.
Embryo morphology, developmental rates, and maternal age are correlated with
chromosome abnormalities. In Fertility and Sterility, vol. 64, no. 2, pp. 382-
391.
MUNNE, S. 2003. Preimplantation genetic diagnosis and human implantation -
a review. In Placenta, vol. 24, pp. S70-S76.
MURRAY, A. W. – KIRSCHNER, M. W. 1989. Dominoes and clocks: The
union of two views of the cell cycle. In Science, vol. 246, no. 4930, pp. 614-
624.
NICHOLS, W. W. – LEVAN, A. - HANSEN-MELANDER, E. –
MELANDER, Y. 1965. The idiogram of the rabbit. In Hereditas, vol. 53, no. 1,
pp. 63-76.
NIWA, O. – TANGE, Y. – KURABAYASHI, A. 2006. Growth arrest and
chromosome instability in aneuploid yeast. In Yeast, vol. 23, no. 13, pp. 937-
950.
NOVÁKOVÁ, P. - ILENČÍKOVÁ, D. 2010. Cytogenetické a molekulárno-
cytogenetické metódy v hematoonkológii. In Onkológia (Bratisl.), vol. 5, no. 2,
pp. 59–63.
OTTO, S. P. – WHITTON, J. 2000. Polyploid incidence and evolution. In
Annu. Rev. Genet., vol. 34, pp. 401-437.
PAI, G. S. – LEWANDOWKI, R. C. – BORGAONKAR, D. S. 2003.
Handbook of chromosomal syndromes. New York : John Wiley & Sons.
ISBN-13: 9780471372172.
PALMITER, R. D. – BRINSTER, R. L. 1986. Germ-line transformation of
mice. In Ann. Rev. Genet., vol. 20, pp. 465-499.
PANDEY, A. - MISHRA, A. 2007. Cytogenetics in head and neck cancer. In
Indian J. Otolaryngol. Head Neck Surg., vol. 59, pp. 317-321.
PAPP, B. – PAL, C. – HURST, L. D. 2003. Dosage sensitivity and the
evolution of gene families in yeast. In Nature, vol. 424, no. 6945, pp. 194-197.
PARKÁNYI, V. – CHRENEK, P. – RAFAY, J. – SUVEGOVÁ, K. – JURČÍK,
R. – MAKAREVICH, A. V. – PIVKO, J. – HETÉNYI, L. – PALEYANDA, R.
K. 2006. Aneuploidia u transgénnych králikov. In Produkcia a anaýza
transgénnych králikov. Nitra : SCPV Nitra, pp. 95-124, ISBN 80-88872-54-5.
PARKÁNYI, V. – CHRENEK, P. – RAFAY, J. – SUVEGOVÁ, K. – JURČÍK,
R. – MAKAREVICH, A. V. – PIVKO, J. – HETÉNYI, L. – PALEYANDA, R.
K. 2004. Aneuploidity in the transgenic rabbit. In Folia Biologica (Praha), vol.
50, no. 6, pp. 194-199.
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
98
PARKÁNYI, V. – RAFAY, J. – JAKUBIČKA, I. 1983. Vplyv parciálnej
desangvinácie na polyploidiu buniek kostnej drene a krvný obraz králika
domáceho. Nitra : VÚŽV, 42 p.
PARKÁNYI, V. – ZELNÍK, J. 1982. Karyológia kostného a hepatálneho
tkaniva čistokrvných a hybridných králikov : záverečná správa. Nitra : VÚŽV
VI-5-1, pp. 1-6.
PARKÁNYI, V. 1981. Utilization of some methods of cytogenetic analysis in
the delection of chromosome anomalies in the species Oryctolagus cuniculus.
In Agriculture, vol. 27, no. 2, pp. 148-154.
PARRA, I. - WINDLE, B. 1993. High resolution visual mapping of stretched
DNA by fluorescent hybridization. In Nature Genetics, vol. 5, no. 1, pp. 17-21.
PARRY, E. M. – COX, B. S. 1970. The tolerance of aneuploidy in yeast. In
Genet. Res., vol. 16, no. 3, pp. 333-340.
PERGAMENT, E. 2008. Cytogenetics. In Glob. libr. women's med. ISSN:
1756-2228.
PINKEL, D. – ALBERTSON, D. 2005. Array comparative genomic
hybridization and its application in cancer. In Nature genetics supplement, vol.
37, pp. S11–S17.
PINKEL, D. – SEGRAVES, R. – SUDAR, D. – CLARK, S. – POOLE, I. –
KOWBEL, D. – COLLINS, C. – KUO, W. L. – CHEN, C. – ZHAI, Y. –
DAIRKEE, S. H. – LJUNG, B. M. – GRAY, J. W. – ALBERTSON, D. G.
1998. High resolution analysis of DNA copy number variation using
comparative genomic hybridization to microarrays. In Nat. Genet., vol. 20, no.
2, pp. 207–211.
POLLACK, J. R. – PEROU, C.M. – ALIZADEH, A. A. – EISEN, M. B. -
PERGAMENSCHIKOV, A. – WILLIAMS, C. F. – JEFFREY, S. S. –
BOTSTEIN, D. - BROWN, P. O. 1999. Genome-wide analysis of DNA copy-
number changes using cDNA microarrays. In Nat. Genet., vol. 23, no. 1, pp. 41-
46.
PURSEL, V. G. – PINKERT, C. A. – MILLER, K. F. – BOLT, D. J. –
CAMPBELL, R. G. – PALMITER, R. D. – BRINSTER, R. L. – HAMMER, R.
E. 1989. Genetic engineering of livestock. In Science, vol. 244, no. 4910, pp.
1281-1288.
RIEDER, C. L. – ALEXANDER, S. P. 1989. The attachment of chromosomes
to the mitotic spindle and the production of aneuploidy in newt lung cells. New
York : Mechanisms of Chromosome Distribution and Aneuploidy, pp. 185-194.
RIEDER, C. L. – PALAZZO, R. E. 1992. Colcemid and the mitotic cycle. In
Journal of Cell Science, vol. 102, pp. 387-392.
RJABININA, Z. A. – BENJUŠ, A. V. 1977. Poliploidija i gipertrofija kletok v
processach rosta i vosstanovlenija. In Medicina Moskva, 207 p.
ROYCHOUDHURY, S. - BULLA, J. - ČURLEJ, J. - CHRENEK, P. 2008.
Hypodiploidy as a prominent attributor to chromosomal aneuploidy in
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
99
transgenic rabbit embryos. In Czech Journal of Animal Science, vol. 53, no. 9,
pp. 388-397.
RUDKIN, G. T. - STOLLAR, B. D. 1977. High resolution of DNA-RNA
hybrids in situ by indirect immunofluorescence. In Nature, vol. 265, no. 5593,
pp. 472-473.
RUSSEL, P. J. – CUMMINGS, B. 2002. Genetics. San Francisco : San
Francisco Press. ISBN 0-8053-4553-1.
SANTALÓ, J. – VEIGA, A. – CALAFELL, J. M. – CALDERON, G. –
VIDAL, F. – BARRI, P. N. – GIMENES, C. – EGOZCUE, J. 1995. Evaluation
of cytogenetic analysis for clinical preimplantation diagnosis. In Fertil. Steril.,
vol. 64, pp. 44–50.
SHAMU, C. E. – MURRAY, A. W. 1992. Sister chromatid separation in frog
egg extracts requires DNA topoisomerase II activity during anaphase. In J. Cell
Biol., vol. 117, no. 5, pp. 921-934.
SHI, W. – DIRIM, F. – WOLF, E. – ZAKHARTCHENKO, V. – HAAF, T.
2004. Methylation reprogramming and chromosomal aneuploidy in in vivo-
fertilized and cloned rabbit preimplantation embryos. In Biol. Reprod., vol. 71,
no. 1, pp. 340-347.
SHOJI- KASAI Y. – SENSHU, M. – IWASHITA, S. – IMAHORI, K. 1987.
Thiol protease- specific inhibitor E-64 arrests human epidermoid carcinoma
A431 cells at mitotic metaphase. In Proc. Nat. Acad. Sci. USA, vol. 85, no. 1,
pp. 146-150.
SCHRADER, F. 1944. Mitosis.1. vyd. New York : Columbia Univ. Press, 110
p.
SCHRÖCK, E. - DU MANOIR, S. – VELDMAN, T. – SCHOELL, B. –
WIENBERG, J. - FERGUSON-SMITH, M. A. – NING, Y. – LEDBETTER,
D. H. - BAR-AM, I. – SOENKSEN, D. – GARINI, Y. – RIED, T. 1996.
Multicolor spectral karyotyping of human chromosomes. In Science, vol. 273,
no. 5274, pp. 494–497.
SIGURDSON, D. C. – HERMAN, R. K. – HORTON, C. A. – KARI, C. K. –
PRATT, S. E. 1986. An X-autosome fusion chromosome of Caenorhabditis
elegans. In Mol. Gen. Genet., vol. 202, no. 2, pp. 212-218.
SLIMANE, W. – HEYMAN, Y. – LAVERGNE, Y. – HUMBLOT, P. –
RENARD, J. P. 2002. Assessing chromosomal abnormalities in two-cell bovine
in vitro-fertilized embryos by using fluorescent in situ hybridization with three
different cloned probes. In Biol. Reprod., vol. 62, no. 3, pp. 628-635.
SLUDER, G. 1979. Role of spindle microtubules in the control of cell cycle
timing. In J. Cell Biol., vol. 80, no. 3, pp. 674-691.
SLUDER, G. 1988. Control mechanisms of Mitosis: The role of spindle
microtubules in the timing of mitotic events. In Zool. Sci., vol 5, pp. 653-665.
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
100
SLUDER, G. 1991. The practical use of colcichine and colcemid to reversibly
block microtubule assembly in living cells. New York : Advanced Techniques
in Chromosome Research, pp. 427-447.
SMIRNOV, D. A. – BURDICK, J. T. – MORLEY, M. – CHEUNG, V. G.
2004. Method for manufacturing whole-genome microarrays by rolling
circle amplification. In Genes Chromosomes Cancer, vol. 40, no. 1, pp. 72–77.
SNIJDERS, A. M. – NOWAK, N. – SEGRAVES, R. – BLACKWOOD, S. –
BROWN, N. - CONROY, J. – HAMILTON, G. – HINDLE, A. K. – HUEY, B.
– KIMURA, K. – LAW, S. - MYAMBO, K. – PALMER, J. – YLSTRA, B. –
YUE, J. P. – GRAY, J. W. – JAIN, A. N. - PINKEL, D. – ALBERTSON, D.
G. 2001. Assembly of microarrays for genome-wide measurement of DNA
copy number. In Nat. Genet., vol. 29, no. 3, pp. 263–264.
SOLINAS-TOLDO, S. – LAMPEL, S. – STILGENBAUER, S. –
NICKOLENKO, J. - BENNER, A. – DÖHNER, H. – CREMER, T. –
LICHTER, P. 1997. Matrix-based comparative genomic hybridization:
biochips to screen for genomic imbalances. In Genes Chromosomes Cancer,
vol. 20, no. 4, pp. 399–407.
SOLOMON, M. .J. – GLOTZER, M. – LEE, T. – PHILIPPE, M. –
KIRSCHNER, M. 1990. Cyclin activation of p34cdc2. In Cell, vol. 63, pp.
1013-1024.
SONG, J. – MOOI, W. J. - PETRONIC-ROSIC, V. – SHEA, C. R. –
STRICKER, T. – KRAUSZ, T. 2011. Nevus versus melanoma: to FISH, or not
to FISH. In Adv Anat Pathol., vol. 18, no. 3, pp. 229–234.
SPEICHER, M. R. - BALLARD, S. G. - WARD, D. C. 1996. Karyotyping
human chromosomes by combinatorial multi-fluor FISH. In Nature Genetics,
vol. 12, no. 4, pp. 368–375.
SPEICHER, M. R. - CARTER, N. P. 2005. The new cytogenetics: Blurring the
boundaries with molecular biology. In Nature Reviews Genetics, vol. 6, no. 10,
pp. 782–792.
SRB, V. 1975. Príprava a hodnotenie chromozómov v bunkách tkanivových
kultúr. In Leško J., Veber R., Hána L. Práce s tkanivovými kultúrami.
Laboratórna príručka. Bratislava : Veda, vyd. SAV, pp. 173-180.
STROMQUIST, M. – HOUDEBINE, L. M. – ANDERSSON, J. O. –
EDLUND, A. – JOHANSSON, T. – VIGLIETTA, C. – PUISSANT, C. –
HANSSON, L. 1997. Recombinant human extracellular superoxide dismutase
produced in milk of transgenic rabbits. In Transgenic Res., vol. 6, no. 4, pp.
271- 278.
STUBBLEFIELD, E. 1964. DNA synthesis and chromosomal morphology of
chinese hamster cells cultured in media containing N-deacetyl-N-
methylcolcichine (colcemid). New York : Cytogenetics of Cells in Culture,
Academic Press, pp. 223-248.
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
101
SWANSBURY, J. 2003. Methods in molecular biolgy, vol. 220: Cancer
cytogenetics: Methods and protocols. In: Raimondi SC, Mathew S. FISH,
CGH and SKY in the diagnosis of childhood acute lymphoblastic leukemia,
New Jersey : Humana Press Inc. pp. 213–233.
TKACHUK, D. C. - WESTBROOK, C. A. - ANDREEFF, M. - DONLON, T.
A. - CLEARY, M. L. - SURYANARAYAN, K. - HOMGE, M. - REDNER, A.
- GRAY, J. – PINKEL, D. 1990. Detection of BCR-ABL fusion in chronic
myelogenous leukemia by in situ hybridization. In Science, vol. 250, no. 4980,
pp. 559–562.
TORRES, E. M. – SOKOLSKY, T. – TUCKER, C. M. – CHAN, L. Y. –
BOSELLI, M. – DUNHAM, M. J. - AMON A. 2007. Effects of aneuploidy on
cellular physiology and cell division in haploid yeast. In Science, vol. 317, no.
5840, pp. 916-924.
TRASK, B. J. 2002. Human cytogenetics: 46 chromosomes, 46 years and
counting. In Nature Reviews Genetics, vol. 3, no. 10, pp. 769–778.
VAN GELE, M. - VAN ROY, N. - JAUCH, A. - LAUREYS, G. -
SCHELFHOUT, V. - DE POTTER, C. R. - BROCK, P. - UYTTEBROECK, A.
- SCIOT, R. - SCHUURING, E. - VERSTEEG, R. - SPELEMAN, F. 1997.
Sensitive and reliable detection of genomic imbalances in human in human
neuroblastomas using comparative genomic hybridization analysis. In Eur J
Cancer, vol. 33, no. 12, pp. 1979-1982.
VAN ROY, N. - JAUCH, A. - VAN GELE, M. - LAUREYS, G. - VERSTEEG,
R. – DE PAEPE, A. - CREMER, T. - SPELEMAN, F. 1997. Comparative
genomic hybridization analysis of human neuroblastomas: Detection of distal
1p deletion and further molecular genetic characterization of
neuroblastoma cell lines. In Cancer Genet Cytogenet., vol. 97, no. 2, pp. 135-
142.
VEITIA, R. A. 2002. Exploring the etiology of haploinsufficiency. In Bio-
Essays, vol. 24, no. 2, pp. 175-184.
VIG, B. K. 1981. Sequence of centromere separation: An analysis of mitotic
chromosomes from long-term cultures of Potorus cells. In Cytogenet. Cell
Genet., vol. 31, no. 3, pp. 129-136.
VIUFF, D. – GREVE, T. – AVERY, B. – HYTTEL, P. – BROCKHOFF, P. B.
– THOMSEN, P. D. 2000. Chromosome aberrations in in vitroo produced
bovine embryos at days 2-5 post insemination. In Biol. Reprod., vol. 63, no. 4,
pp. 1143-1148.
VIUFF, D. – RICKORDS, L. – OFFENBERG, H. – HYTTEL, P. – AVERY,
B. – GREVE, T. – OLSAKER, I. – WILLIAMS, J. L. – FAIR, T. -
LAURINCIK J. - THOMSEN P. D. - CALLESEN H. – VOS, P. L. A. –
HENDRIKSEN, P. J. M. – DIELEMAN, S. J. – SCHELLANDER, K. –
BESENFELDER, U. – GREVE, T. 2001. Ribosomal RNA gene expression and
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
102
chromosome aberrations in bovine oocytes and preimplantation embryos. In
Reproduction, vol. 122, no. 1, pp. 21-30.
WALDMAN, F. M. - SAUTER, G. - SUDAR, D. - THOMPSON, C. T. 1996.
Molecular Cytometry of Cancer. In Hum Pathol., vol. 27, no. 5, pp. 441-449.
WALL, R. J. - Jr. REXROAD, C. E. - POWELL, A. – SHAMAY, A. –
McKNIGHT, R. – HENNIGHAUSEN, L. 1996. Synthesis and secretion of the
mouse whey acidic protein in transgenic sheep. In Transgenic Res., vol. 5, no.
1, pp. 67-72.
WATSON, J. D. - CRICK, F. H. C. 1953. Molecular structure of nucleic acids:
A structure for deoxyribose nucleic acid. In Nature, vol. 171, pp. 737–738.
WEAVER, R. F. – HEDRICK, P. W. 1995. Basic genes. Columbus USA :
McGraw-Hill Education, 498 p, ISBN 0071156178, 9780071156172.
WEISS,M. M. - HERMSEN, M. A. J. A. - MEIJER, G. A. - VAN GRIEKEN,
N. C. T. - BAAK, J. P. A. - KUIPERS, E. J. - VAN DIEST, P. J. 1999.
Demystified... Comparative genomic hybridization. In J Clin Pathol., vol. 52,
pp. 243-251.
WHITE, R. H. 1954. Ascariasis treated with piperazine hydrate. In Lancet, vol.
14, pp. 315-316.
WHITESELL, L. – LINDQUIST, S. L. 2005. HSP90 and the chaperoning of
cancer. In Nat. Rev. Cancer, vol. 5, no. 10, pp. 761-772.
WHITFIELD, W. G. F. – GONZALES, C. – MALDONADO-CODINA, G. –
GLOVER, D. M. 1990. The A- and B- type cyclins of Drosophila are
accumulated and destroyed in temporally distinct events that define separable
phases of the G2-M transition. In EMBO J., vol. 9, no. 8, pp. 2563-2572.
YOSHIZAWA, M. – MIURA, A. – NARISAWA, I. – SASAKI, S. – ZHU, S.
2001. Chromosomal analysis in bovine embryos derived from in vitro
fertilization of immature oocytes. In J. Mamm. Ova Res., vol. 18, pp. 110-115.
ZARTMAN, D. L. – FECHHEIMER, N. S. 1967. Somatic aneuploidy and
polyploidy in inbred and linecross cattle. In J. Anim. Sci., vol. 26, no. 4, pp.
252-258.
ZHAO, X. – LI, C. – PAEZ, J. G. – CHIN, K. – JÄNNE, P. A. – CHEN, T. H.
– GIRARD, L. – MINNA, J. – CHRISTIANI, D. – LEO, C. – GRAY, J. W. –
SELLERS, W. R. - MEYERSON, M. 2004. An integrated view of copy number
and allelic alterations in the cancer genome using single nucleotide
polymorphism arrays. In Cancer Res., vol. 64, no. 9, pp. 3060–3071.
ZHOU, X. – MOK, S. C. – CHEN, Z. – LI, Y. – WONG, D. T. 2004.
Concurrent analysis of loss of heterozygosity (LOH) and copy number
abnormality (CNA) for oral premalignancy progression using the Affymetrix
10K SNP mapping array. In Hum. Genet., vol. 115, no. 4, pp. 327–330.
ŽINKIN, L. N. 1962. Archiv. anat., gisol. In I embryol., vol. 42, pp. 15-20.
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
103
URL:
1 http://rarechromo.org/information/Other/FISH%20FTNW.pdf
2 http://www.gopetsamerica.com/small-animals/diseases/rabbit_inherit.aspx
3 http://goatconnection.com/articles/publish/article_130.shtml
4 http://gallopinggoatsfarm5.tripod.com/id6.htm
Obrázky obálka:
Embryo morula
http://medillin.deviantart.com/art/Morula-81724946
Embryo štádium 2 buniek
http://candidscience.tumblr.com/image/69865764730
Hovädzí dobytok
http://www.freefoto.com/preview/07-04-8/Cattle
Chromozómy FISH
http://www.laskerfoundation.org/awards/2006_b_description_p.htm
Chromozóm grafická štúdia
http://www.abovetopsecret.com/forum/thread926178/pg17
Kozy
http://www.deviantart.com/art/Mama-goat-and-kid-goat-301936590
Králik
http://news.asiaone.com/News/Latest+News/Singapore/Story/A1Story20120116-322136.html
Mikroskop
http://leica.imillermicroscopes.com/compound-light-microscopes/clinical/281-leica-dm1000-led-2
Ošípané
http://wall.alphacoders.com/big.php?i=471017
Ovce
http://www.bestepics.com/photo/2655.aspx#.UvjPpPsR5yU
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
Jozef Čurlej
Metódy a techniky cytogenetickej analýzy živočíšnych buniek
Vydavateľ: Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre
Vydanie: prvé
Náklad: 100 ks
AH-VH: 6,66-6,83
Neprešlo redakčnou úpravou vo vydavateľstve.
ISBN 978-80-552-1188-6
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
NITRA 2014
ISBN 978-80-552-1188-6
http://dx.doi.org/10.15414/2014.9788055211886
