Métodos Físicos de Análise - CROMATOGRAFIA · Distância de Reten ção e Fator de Reten ção na cromatografia planar Parâmetros: (a) Distância total percorrida pelo solvente

Perito Criminal – Polícia Federal – maio/2012

Métodos Físicos de Análise - CROMATOGRAFIA

Prof. Dr. Leonardo LucchettiMestre e Doutor em Ciências – Química de Produtos Naturais – NPPN/UFRJ

Depto. de Química de Produtos Naturais – Farmanguinhos – FiocruzDocente do Programa de Pós-Graduação em Vigilância Sanitária – Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde – FiocruzDocente do Curso de Mestrado Profissional em Gestão, Pesquisa e Desenvolvimento na Indústria Farmacêutica – Farmanguinhos – Fiocruz

Métodos Físicos de Análise


Conceito :

Método físico-químico de separação dos componentes de uma mistura,realizada através da distribuição desses componentes entre duas fases(estacionária e móvel) que estão em contato íntimo.

móvel

Fases

estacionária

Gás

Líquido

Fluido supercrítico

Líquido

Sólido







A distribuição, exclusão, partição ou adsorção seletiva dos componentes é um processo de equilíbrio dinâmico: as moléculas dos analitos ora estão retidas na

fase estacionária, ora estão deslocando-se com a fase móvel

Quanto mais tenazmente uma substância interage com a fase estacionária, mais alta é a percentagem de moléculas que ficam retidas, o que provoca um

retardamento em sua migração

Quanto maior interação com a fase estacionária (fe), maior será o tempo de retenção (tr)





Classificação quanto à natureza da fase móvel:

(a) Cromatografia com fase gasosa (CG) – fase móvel é um gás.

(b) Cromatografia com fase líquida (CL) – fase móvel é um líquido

(c) Cromatografia com fluido supercrítico (CS) – fase móvel é um fluidoem estado supercrítico.

Os processos de separação podem ocorrer por:

- Adsorção

- Partição

- Exclusão

- Complexação (troca de íons)

- Bioafinidade



Classificação quanto a(o) Técnica/natureza Subtipo(s)

Suporte da fase estacionária

PlanarCamada fina

Papel

Coluna CG, CLAE, CS

Natureza da fase móvelNormal Fase estacionária polar

Reversa Fase estacionária apolar

Tipo de interação

Adsorção

Partição

Exclusão

Complexação (íons)

Afinidade

Objetivo da separaçãoAnalítica

Preparativa

Pré-tratamento



(b) Cromatografia em Coluna

Placa de vidro ou de

alum ínio

Coluna cromatogr áfica empacotada c/ uma fase

estacion ária

(a) Cromatografia planar



Classifica ção quanto ao tipo de intera ção fm x fe (mecanismo de separa ção)

Tipo de interação CaracterísticasAdsorção Fase sólida contém adsorventes que promovem separação por

interação eletrostática ou dipolar

PartiçãoFase sólida contém um líquido que promove absorção ou partição

dos analitos. Mecanismo baseia-se na solubilidade dos componentes da amostra

Exclusão Fase sólida contém poros de dimensões determinadas que capturam moléculas menores e excluem maiores

Complexação (troca de íons)Fase sólida incorpora íons fixados a ela, os quais retêm contra-íons. Íons da amostra presentes na fase móvel podem deslocar

os contra-íons originais, fixando-se em seu lugar

Afinidade (imunoafinidade) Fase sólida incorpora receptores elaborados por antígeno ou anticorpo , os quais retêm analitos que tenham afinidade por ela

Afinidade (bioafinidade)Fase sólida incorpora receptores elaborados por sistemas biológicos (enzimas, lecitinas), os quais retêm analitos que

tenham afinidade por ela



Classifica ção Quanto ao Tipo de Intera ção fm x fe (mecanismo de separa ção)

Intera ção das fases Tipo de intera ção Fase estacion ária(exemplos)

Adsorção Sólido-Líquido ou Sólido-Gás

Sílica, Alumina

Partição Líquido-Líquido ou Líquido-Gás

RP18 e RP8

Exclusão Molecular Permeação em Gel Sephadex® LH-20

Complexação Troca de Íons Resinas ligadas a cátions (NH4

+) ou ânions (SO42-)

Afinidade Complexação Carbodiimida



Mecanismo de Interação: Adsorção

O analito é adsorvido na interface da fm e fe. O fenômeno de retorno

é chamado de dessorção. Os adsorventes possuem grupos

ativos que promovem as atrações eletrostáticas ou dipolo-dipolo.

Entre os adsorventes mais comuns estão a sílica e, em segundo lugar, a alumina (ácida, básica ou neutra)



Mecanismo de Interação: Adsorção

As interações ocorrem nos sítios ativos da sílica: interação dipolo-

dipolo e eletrostática. Grupos polares terão maior afinidade pelo sítios ativos da sílica e, por isso,

ficaram retidos no leito cromatográfico. A sílica poderá ser inativada pela presença de água.

Em fase reversa, os sítios ativos da sílica são ligados quimicamente

a hidrocarbonetos (ex. RP8, RP18). Neste caso, alteram-se os

mecanismos de interação (força de Van der Waals)



Mecanismo de Interação: Partição

A fe é um líquido ligado a um suporte sólido e inerte ou nas

paredes do tubo cromatográfico. O processo é

intrafacial, ocorrendo por absorção ou partição. Baseia-

se nas diferenças de solubilidade dos componentes

da amostra. A volta dos componentes à fase móvel

depende da volatilidade (gás-líquido) ou da solubilidade nesta

fase (líquido-líquido)



Mecanismo de Interação: Troca de íons

Mecanismo de Interação: Troca de íons

A fe é constituída de uma matriz onde são adicionados grupos funcionais

ionizáveis. Estão disponíveis trocadores aniônicos (retêm ânions) que têm sítios

ativos carregados positivamente e trocadores catiônicos (retêm cátions) que

têm sítios ativos carregados negativamente. A fm é uma solução iônica que deve ter a propriedade de

substituir os íons que estão ligados à fe.



Mecanismo de Interação: Exclusão molecular (filtraç ão em gel)

Exemplo: purificação de polissacarídeos e proteínas. As substâncias de mesmo tamanho dos poros do gel são retidas,

enquanto que as maiores serão eluídas. Com isso, tem-se uma separação baseada no tamanho

molecular.



Mecanismo de Interação: Exclusão molecular (filtraç ão em gel)



Mecanismo de Interação: Bioafinidade

1

2

3

4

1- A fe entra em contato com a fm contendo o analito. Somente as

substâncias com afinidade pelo ligante da fe sofrerão

interação.

2- Os demais analitos serão eluídos com a fm.

3- Altera-se as propriedades da fm (pH) para que seja

possível eluição da substância desejada.

4- A matriz é recuperada para ser usada novamente.



Propósitos da Cromatografia

Separação

Identificação

Quantificação



Análise Qualitativa

- Baseada na comparação de parâmetros de retenção- fator de retenção- tempo de retenção

- Baseada na resposta da detecção- forma da mancha/pico- cor ou ausência de cor- reações- espectros- especificidade do detector



Análise Qualitativa

Relação: concentração x área do sinal (pico)

Normalização

Padrão externo

Padrão interno



Análise QualitativaNormaliza ção

- Todo componente produz um pico

- A resposta do detector é dependente apenas da concentração

Calibra ção externa (padrão externo)

- Solução contendo padrões de todas as substâncias a serem analisadas

- Padrões em concentrações próximas à amostra

- Condições analíticas devem ser as mesmas, inclusive o volume de injeção

Padroniza ção interna

- Uma substância conhecida é adicionada em concentração definida em todos os padrões e nas amostras;

- Não co-elui com a amostra;

- É estável e detectado na concentração em que se encontra.

- Faz-se uma curva de calibração baseada na relação entre as áreas e concentrações do PI e da substância de interesse

- Contamina-se a amostra com um volume conhecido da solução estoque do padrão interno (PI)



CROMATOGRAFIA EM CAMADA FINA

(ou DELGADA)



(a) demonstração de um cromatograma em camada fina

(b) determinação do fator de retenção (Rf)



Distância de Reten ção e Fator de Reten ção na cromatografia planar

Parâmetros:

(a) Distância total percorrida pelo solvente (dm);

(b) Distância percorrida pela substância rosa ou distância de retenção (dr b);

Assim: Rf = dr b / dm

Exemplo: Se b percorrer 5 cm em um campo cromatográfico de 10 cm (dm);

Rf = 5/10 = 0,5 (isso quer dizer que b ficou retido no meio da placa, ou 50%).

dm



Adsorventes para ccf

Silica gelSilica gel-F (indicator de fluorescência)

Silicato de magnésio (Florisil)Poliamidas

AmidoAlumina



Adsorventes para ccf

Silica Gel

Polímero baseado em ligações silício-oxigênio com grupamentos hidroxila estendidos ao longo da matriz

Si-O-Si-O-Si-O-Si-O-Si-O-Si-(OH)x

Modo de separação: adsorção ou partiçãoRegra das polaridades

Ligações hidrogênio são a principal força que controla a adsorção dos grupos funcionais dos analitos





Principais solventes para composi ção de fase m óvel e ordem eluotr ópica



Revelação de cromatogramas

- olho nu (substâncias coloridas)

- câmara de revelação (lâmpada)

- 254nm

- 365nm

- reações cromogênicas

- gerais (ex. iodo, H2SO4, anisaldeído sulfúrico, NH3, etc)

- específicas (grupamentos funcionais)

- ninhidrina

- FeCl3

- orcinol sulfúrico

- etc



CROMATOGRAFIA INSTRUMENTAL

(EM COLUNA)

Cromatografia líquida de alta eficiência

(CLAE/HPLC)

Cromatografia com fase gasosa

(CG/GC ou CGAR/HRGC)



Termos t écnicos e parâmetros para cromatografia em coluna

Parâmetros:

(a) Tempo de retenção = tR = tempo que a substância leva para ser eluída, a partir da injeção

(b) Volume Morto = volume da coluna cromatográfica. Calculado com base no TR do metano (p/CG)

(c) tR = tR – tM = tempo de retenção ajustado

(d) a = fator de separação = tR2 – tR1



Volume morto = volume da fase líquida/gasosa na colunaregra simplificada : volume morto = 65% do volume da coluna vazia

e

Termos t écnicos e parâmetros para cromatografia em coluna



Parâmetros de reten ção



Seletividade = capacidade de um sistema diferenciar dois compostos(na CG é mais associada à coluna cromatogr áfica)

Desejável: α maior que 1.2



Parâmetros de eficiência: pratos te óricos

Pratos teóricos de uma coluna = representa asregiões de equilíbrio na coluna, como funçãodas interações dos analitos entre a fm e a fe.Pode ser expresso por:

n = 16 (tR / Wb)2

Pode ser obtido tb a partir da largura nametade do pico:

n = 5,545 (tR / Wh)2

Para se comparar uma coluna com a outra,usa-se a altura equivalente a um prato teórico:

h = L / n

L = comprimento da coluna

h= altura equivalente a um prato teórico

Wh

Wb

Vários fatores alteram o n, incluindo: condições de análise, tamanho da amostra, tipo de soluto e

comprimento da coluna. Em tese, quanto maior for o comprimento da coluna, maior será a eficiência, em

termos de pratos teóricos (mais regiões de equilíbrio).





Resolu ção



Resolu ção

Medida de separação de dois picos consecutivos e traduz a eficiência da coluna e da fase estacionária.

Distância entre dois sinais dividido pela média das larguras das respectivas bases:

Rs = 2 (tr2 – tr1) / Wb1 + Wb2

Deve-se, considerar, portanto, que o importante para a RESOLUÇÃO em cromatografia não é apenas a separação entre dois picos, mas também a largura

desses picos.



Resolu ção



EXERCÍCIO

Resolução x Seletividade x Eficiência:

A =

B =

C =

C

A (1-3)

B (5-6)

C (7-8)



Cromatografia com fase gasosa

(CG/GC ou CGAR/HRGC)



Método físico-químico de separação dos componentes de uma mistura através de uma fase gasosa móvel sobre um sorvente estacionário (líquido ou sólido). Foi

dividida inicialmente em gás-líquido e gás-sólido.

A partir da década de 80 surgiu a cromatografia com fase gasosa de alta resolução (CGAR) que emprega colunas capilares de alta resolução



Cromatografia com fase gasosa: tipos

Cromatografia Gás-SólidoFE: sólidos (sílica, carvão grafitinizado, polímeros porosos)Princípio de retenção: adsorção, volatilidade

Cromatografia Gás-LíquidoLíquido mantido estacionário em suporte inertePrincípio de retenção: solubilidade, volatilidade



Cromatografia com fase gasosa: vantagens e desvanta gens

� 1- Grande poder de resolução, o que possibilita a análise de amostras contendo até

dezenas (ou centenas – CGAR) de componentes;2- Alta sensibilidade: dependendo do tipo de amostra e do detector empregado, é

possível analisar amostras em concentração de picogramas (10-12). Geralmente em CGAR, injeta-se 1ml de amostra em concentração que varia de 10 a 1000 ppm;

3- Excelente técnica para análise quantitativa (desde picogramas até miligramas);4- Técnica de análise relativamente rápida.

� 1- Só pode ser empregada em substâncias voláteis e estáveis termicamente. É

possível a derivatização para se contornar este problema;2- Não é conveniente para aplicação em cromatografia preparativa;3- Não é muito eficiente como técnica analítica, uma vez que necessita de técnicas

auxiliares, como acoplamento à espectrometria de massas.



Cromatografia com fase gasosa: g ás de arraste (fase m óvel)

Características:

(a) não deve interagir com a fe;

(b) deve ser barato;

(c) compatível com o tipo de detector.

Gases mais usados:

- Nitrogênio

- Hélio

- Hidrogênio

- Argônio

- Ar sintético (usado em conjunto com o detector de ionização em chama)



Cromatografia com fase gasosa: introdu ção da amostra

- on-column- split/splitless- large volume- headspace



Cromatografia com fase gasosa: colunas e fase estac ion ária

Tipos de fases estacionárias (exemplos):

- sólida: sílica, alumina, carvão ativado

- líquida: DB-1, DB-50, OV-275.

A fase estacionária pode ser polar, de polaridade intermediária ou apolar. Podemser recheadas ou empacotadas (capilares);

As colunas podem variar de 1m (recheadas)

até 50m (capilares);

Geralmente, a temperatura de análise não passa

dos 350oC em CGAR.




*carvão ativo, silica, peneiras moleculares, polímeros porosos** porous layer open tubular / wall coated open tubular; silicones

Parâmetro Coluna empacotada Coluna capilar

Diâmetro interno (mm) 1 - 4 0,15 - 0,75

Comprimento (m) 1 - 3 10 -100

Pratos teóricos 2400 3000

Espessura da fase estacionária (µm) 5 0,5 - 2

Vazão do gás (ml/min) 20 - 60 1- 5

Volume da amostra (µl) 02 - 20 0,001- 0,5

Flexibilidade rígida flexível

Fenômeno de separação adsorção partição

Construção Camada porosa/convencional*

PLOT/WCOT**

Fase estacionária sólida líquida






Apolar: hidrocarbonetos não aromáticos, silicones (ex.: SE-30)

Polar: contém grande quantidade de grupos polares (Ex.: Carbowax) - interações tipo pontes de hidrogênio

Intermediária: grupos polares ou potencialmente polares em esqueleto apolar (ex. SE-52)

Escolha da coluna: Polaridade da fase estacionáriadiâmetro e espessura do filme � quantidade de amostras, tempo de análise, pressão (velocidade da FM), temperatura do fornoComprimento � pratos teóricos




Abreviação de algumas fases estacionárias

DEGA - adipato de dietileno glicol

DEGS - succinato de dietileno glicol

SE-30 - metil silicone

OV -11 - 35% fenil- metilsilicone

Carbowax 20 M - polietilnoglicol



Cromatografia com fase gasosa: programa ção (gradiente) de temperatura



Silicones� Polímeros estáveis e inertes� Menos polares: polidimetilsiloxanas� Substituição de metilas por outros grupos (fenil, ciano, trifluoropropil etc) gera fases estacionárias com polaridades crescentes

Poliglic óis• Polímeros de etileno glicol e epóxido, preparados com diferentes tamanhos da cadeia

polimérica• Moderadamente polares (álcoois, aldeídos, éteres etc)• Carbowax (ex 20M = 20.000.000g/mol)

Poli ésteres• Condensação de diácidos com glicóis• Fases altamente polares• Mais comuns: succinato e adipato de dietilenoglicol (DEGS e DEGA, respectivamente)



Cromatografia com fase gasosa: deriva ção (ou derivatiza ção)

A técnica não é adequada para análise de açúcares, aminoácidos e oligopeptídeos, por exemplo. Para que essas substâncias sejam analisadas por CG necessitam ser derivatizadas.

Alguns derivatizantes

1- Trimetilsilano (TMS)

2- Diazometano (H2C=N=N)

3- Anidrido acético / piridina

4- BF3 / MeOH

5- BSTFA / piridina

AÇÚCARES AÇÚCARES ACETILADOS(AcO)2O / piridina

ÁCIDOS CARBOXÍLICOS ÉSTERES METÍLICOSBSTFA/piridina

ÁLCOOIS ÉTERES METÍLICOSBF3/metanol

Exemplos:



Cromatografia com fase gasosa: detec ção

No caso de acoplamento do cromatógrafo com um espectrômetro de massas, o detector é o próprio espectrômetro. Os analitos deixam a coluna e entram na câmara de ionização, que está sob vácuo. As

substâncias são ionizadas e os íons são identificados pelo espectrômetro, gerando um fragmentograma. Existem diferentes tipos de espectrômetros, sendo que os quadrupolos são os mais usados em CG/EM.

Em CG/EM usa-se 70 eV para gerar os íons que serão analisados.




- seletividade: universais x específicos

- ruídos (problemas eletrônicos, impurezas, sujeiras nos gases/detector)

- tipo de resposta (proporcionalidade à concentração do soluto ou à taxa de entrada de solutono detector)

- quantidade mínima detectável (gera sinais 2x mais intensos que o ruído) – característicaintrínseca do detector!)

- fator de resposta: intensidade do sinal gerado por determinadas massas de soluto, quedepende do detector e da substância analisada e pode ser visualizado como a inclinação dareta que correlaciona o sinal com a massa do soluto (curva de calibração); quanto maior o fator,mais confiável a análise quantitativa

- faixa linear dinâmica = razão entre a menor e a maior massa entre as quais o fator deresposta de um detector para um soluto é constante, isto é, onde a curva de calibração é linear(mais significativos: TCD e FID)




Captura de El étrons (DCE)

Bastante seletivo, respondendo bem para halogenetos orgânicos, aldeídosconjugados, nitrilas, nitratos e organometálicos. Pode ser empregado para análise deinseticidas clorados

O nitrogênio com alto grau de pureza deve ser usado.

Termoiônico (DPN)

Seletivo para compostos contendo nitrogênio e fósforo




Condutividade térmica (TCD ou DCT)

A velocidade de perda de calor de um corpo quente para um frio é proporcional, dentre outrosfatores, à condutividade térmica do gás que separa estes dois corpos.

Quando um componente é eluído, ele sai misturado com o gás de arraste e passa pelodetector. Se a condutividade desta mistura for diferente da do gás de arraste puro, o filamentoperde calor para o bloco numa taxa diferente daquela do equilíbrio.

Detector universal e sensível à concentração de soluto no gás de arraste (H2 ou He, gases dealtíssimas condutividades térmicas – assim, a mistura com o soluto sempre terá condutividademenor e, com isso, há a geração de sinais positivos e maiores fatores de resposta).

Não é muito sensível (400pg/ml gás arraste) – barato, simples e muito aplicado a análisesque não requeiram alta sensibilidade

Resposta universal, não destrói a amostra

Fase móvel: hélio ou hidrogênio




Ioniza ção em chama (FID ou DIC)

O funcionamento se baseia na condução de eletricidade pela chama originada pelos íonsprovenientes da queima de substâncias orgânicas.

A chama de H2 forma poucos íons (mau condutor elétrico) e quase nenhuma corrente passapelos eletrodos – a chama passa a conduzir corrente elétrica quando uma substância orgânica équeimada e gera íons. Esta corrente elétrica, amplificada, gera o sinal cromatográfico.

Apenas substâncias não inflamáveis (CCl4, H2O) ou algumas poucas que não formam íonsem chamas (HCOOH) não dão sinal; de um modo geral, quanto mais ligações C-H a substânciativer, maior a resposta.

Mais sensível que o TCD: 10 a 400pg. É o mais usado.

Grande sensibilidade, resposta quase universal (não responde bem à agua)

Sensível à concentração e destrutivo.



Cromatografia com fase gasosa: detecção



Cromatografia líquida de alta eficiência

(HPLC ou CLAE)





workstation

bombas para eluição em gradiente

injetorcoluna

detector



Cromatografia l íquida de alta eficiência: peculiaridades e caracter ísticas

1- Comumente chamada de cromatografia líquida de alta performance, alta pressão, altodesempenho;

2- Capacidade de realizar separa ções e realizar análises qualitativas/quantitativas de umgrande número de substâncias, em poucos minutos , com alta resolu ção, eficiência esensibilidade ;

3- Permite a utilização de colunas com fase normal , reversa , com resinas de troca iônica ecom polímeros que possibilitam exclusão molecular ;

4- As colunas podem ser reaproveitadas;

5- Existem diversos tipos de detectores que podem ser usados em CLAE, os quais focam aspropriedades do soluto ou deste dissolvido na fase móvel;

6- O uso de bombas pneumáticas permite a aplicação de gradientes de solventes, ou seja,mudanças na composição da fase móvel ao longo da corrida cromatográfica;

7- As bombas usadas em CLAE permitem fluxo constante, o que garante maior eficiência deseparação e, consequentemente, maior resolução.

8- A amostra deve ser solúvel na fase móvel



Cromatografia l íquida de alta eficiência: principais componentes

solventes

bomba

amostra

sistema de injeção

coluna detector















Cromatografia l íquida de alta eficiência: mecanismos de intera ção

1- Adsor ção – Fase estacionária é um sólido (cromatografia líquido-sólido) – As condições de análise podem ser preestabelecidas por ccd, usando sílica gel. Ex. colunas com sílica e alumina. Solventes usados: os mesmos empregados para ccd, como hexano, clorofórmio, acetato de etila, metanol e misturas destes. Usos: ácidos graxos, álcoois, barbitúricos, corantes, esteróides.

2- Parti ção – Fase estacionária é um líquido (cromatografia líquido-líquido) – A fase estacionária não estáquimicamente ligada à superfície de um suporte. Ex. coluna empacotada com sílica, com adição de água e clorofórmio como fase móvel. A separação se dará pela partição das substâncias entre a fase aquosa e a orgânica.

3- Exclusão Molecular – Fase estacionária é uma resina ou sílica com tamanho de partícula controlada –cromatografia de exclusão. Efetua a separação de acordo com o tamanho efetivo das moléculas. As moléculas maiores movem-se rapidamente, enquanto que as menores (considerando-se o tamanho dos poros) movem-se mais lentamente com a fase móvel.

4- Troca Iônica – Fase estacionária é uma resina ligada a grupos iônicos (ânions ou cátions) –cromatografia por troca iônica. Usos: análise de ácidos carboxílicos, analgésicos, ânions inorgânicos e cátions metálicos.







Cromatografia l íquida de alta eficiência: fase estacion ária

Polar (fase “normal”):Silica, aluminaTerminações ciano, amino ou diol na fase ligada

Não-polar (“fase reversa”)Normalmente terminações C18 e C8 na fase ligadaTerminações fenil e ciano na fase ligada

Misturas de grupos funcionais podem ser usadas



Cromatografia l íquida de alta eficiência: fase estacion ária



Cromatografia l íquida de alta eficiência: mecanismo (simplificado)

• Interações não polares (não específicas) do analito com a superfície hidrofóbica adsorvente (-C18, C8, fenil etc)

• Diferença na afinidade de sorção do analito resulta em separação• Analitos mais polares ficam menos retidos• Analitos com partes hidrofóbicas maiores ficam mais retidos• Isômeros estruturais praticamente não se separam



Cromatografia l íquida de alta eficiência: efeito da composi ção da fm na seletividade

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

0 1 2 3 4 5 6 7

0

5

10

15

20

25

0 1 2 3 4 5 6 7

0

2

4

6

8

10

12

14

16

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

0

2

4

6

8

10

12

0 2 4 6 8 10 12

90% MeCN

80% MeCN

70% MeCN

60% MeCN



Cromatografia l íquida de alta eficiência: otimiza ção da polaridade da fm



Cromatografia l íquida de alta eficiência: fase m óvel

1- Ter alto grau de pureza (grau HPLC);2- Dissolver a amostra sem decompor seus componentes ou a fase estacionária;3- Ter baixa viscosidade (para não aumentar a pressão do sistema);4- Ser compatível com o tipo de detector usado;5- Ter polaridade adequada para permitir uma separação conveniente dos componentes da amostra.



Cromatografia l íquida de alta eficiência: detectores

1 – Alta sensibilidade e baixo limite de detecção2 – Resposta rápida3 – Insensibilidade às mudanças de temperatura e vazão de fase móvel4 – Resposta independente da composição da fase móvel e proporcional em relação à concentração dos analitos

Infelizmente, não existe um só tipo de detector tão versátil. Os aparelhos modernos podem trabalhar com mais de um tipo de det ector ao mesmo tempo.




1- Espectrofotometria no UV-VIS – absorbância na faixa do UV-VIS (limite = 2 x 10-10)

2- Fluorescência – excitação com luz produz uma fluorescência (limite = 10-12)

3- Índice de refra ção – mudanças no IR da fase móvel (limite = 10-7)

4- Eletroqu ímico – oxidação ou redução em potencial fixo (limite = 10-12)

5- Condutividade el étrica – condutividade elétrica em razão da presença de íons (limite = 10-8)

6- Espectrometria de massas – analisa os fragmentos obtidos após ionização; usado paraanálise qualitativa; empregado em conjunto com o UV-vis (quantitativa).










Cromatografia l íquida de alta eficiência: elui ção em gradiente



Cromatografia l íquida de alta eficiência: influências

1 – Que afetam a eficiência:• Fluxo• Comprimento da coluna• Diâmetro da partícula• Distribuição de tamanho de partícula

2 – Que afetam a reten ção:• Tipo de eluente• Composição do eluente• Tipo de fase estacionária• Natureza do analito

3 – Que afetam a seletividade:• Tipo de fase estacionária• Natureza do analito• Aditivos no eluente• Temperature• Composição do eluente (analitos ionizáveis)



COMPARAÇÃO: CG X CLAE

Fator CG CLAE

Requisitos para Amostra Amostra ou derivado volátil, termicamente estável na temperatura do sistema

Amostra solúvel na fase móvel.

Tipo de Amostra Gases, líquidos e sólidos.PM de 2 a 1200

Líquidos e sólidos, iônicos ou covalentes. PM de 32 a

4.000.000

Limite de Detecção 10-12 (DIC ou DCE) 10-9 (UV-VIS)

Pratos Teóricos / Coluna 2.000–300.000 500–25.000

Capacidade Preparativa Pobre até razoável Boa, com facilidade de coleta e automação

Capacidade Analítica Excelente. Até 200 componentes

Excelente. Até 50 componentes.



QUESTÕES DE CONCURSOS

1- A Cromatografia em Camada Delgada (CCD) consiste na separação dos componentes deuma mistura através da migração diferencial sobre uma camada delgada de adsorvente retidosobre uma superfície plana. Neste contexto, assinale a alternativa que indica o adsorventeseguramente mais utilizado em CCD nos laboratórios. (Perito Criminal – PC/ PE – 2006 –IPAD)

A) Celulose.

B) Sílica.

C) Alumina.

D) Poliamida.

E) Silicato de cálcio.

2- Julgue CERTO OU ERRADO. (Pesquisador – Inmetro – 2007 – CESPE/ UnB).

A cromatografia é um método de separação dos componentes de uma mistura. No entanto,não pode ser usado para misturas complexas, pois apresenta restrições na separação decomponentes muito semelhantes.




3- Julgue CERTO OU ERRADO. (Pesquisador – Inmetro – 2007 – CESPE/ UnB).

A classificação dos métodos apóia-se nos tipos de fases móvel e estacionária. A faseestacionária pode ser sólida ou líquida; nesse último caso, o líquido é adsorvido ou ligadoao sólido. A fase móvel, por sua vez, pode ser líquida, gasosa ou um fluido supercrítico.

4- Na cromatografia gasosa de partição, as interações que ocorrem entre as moléculas dosdiferentes componentes da mistura a analisar e a fase estacionária líquida são devidas,principalmente, a forças de atração de Van der Waals e a ligações de hidrogênio.




PERITO CRIMINAL – NÍVEL SUPERIOR – SSP/PB - 2003




PERITO CRIMINAL – NÍVEL SUPERIOR – SSP/PE - 2006




PERITO CRIMINAL – NÍVEL SUPERIOR – SSP/PE - 2006




57 - A separação entre dois picos em um cromatograma é definida pela sua resolução RS, calculada como sendo:

a) igual ao fator de separação a.b) a razão entre o valor médio das bases dos dois picos pela distância entre os pontos de altura máxima dos dois picos.c) a razão entre a distância entre os pontos de altura máxima dos dois picos pelo valor médio da largura das bases dos dois picos.d) a média das alturas dos picos, dividida pelo fator de separação a.e) a razão entre a distância entre os pontos de altura máxima dos dois picos e o fator de separação a.

PERITO – SSP/PR – ENG.QUÍMICA - 2007








48. Sobre a cromatografia, marque a opção verdadeira:

A) A cromatografia pode ser classificada de acordo com os mecanismos de separação física em cromatografia de adsorção e de partição. A de adsorção baseia-se nas diferentes solubilidades dos componentes da amostra.B) Na Cromatografia em Camada Delgada a análise qualitativa de uma substância realiza-se através de seu Rf que se determina pela relação entre a distância percorrida pela fase móvel dividida pela distância percorrida pela substância.C) A fase móvel é selecionada em função de suas polaridades; logo em ordem crescente de polaridade podemos citar: éter de petróleo, clorofórmio, acetona, metanol e água.D) O processo de separação da Cromatografia em Camada Delgada está fundamentado no fenômeno de partição

(PERITO LEGISTA, SSP-CE, 2003)




49. Sobre a cromatografia gasosa, marque a opção verdadeira:

A) A cromatografia gasosa é utilizada na separação de substâncias volatilizáveis, uma vez que se usam temperaturas convenientes no local de injeção da amostra e na coluna, possibilitando a vaporização dessas substâncias.B) A fase estacionária na cromatografia gasosa é um gás. E os gases mais usados são: nitrogênio, hélio, hidrogênio e argônio.C) O Detector de captura de elétrons utilizado na Cromatografia Gasosa é seletivo para compostos contendo fósforo e nitrogênio como os inseticidas fosforados e nitrogenados.D) O Detector por ionização em Chama tem uma baixa sensibilidade, sendo utilizados para identificação de compostos com halogênios como os inseticidas clorados.

(PERITO LEGISTA, SSP-CE, 2003)



QUESTÕES DE CONCURSOS55 - Em uma separação cromatográfica existe a fase móvel e a fase estacionária. A fase móvel é um solvente que ficaarmazenado e necessita de tratamento preliminar para seu emprego. Esse tratamento preliminar consiste em degaseificar osolvente para:1. evitar a formação de bolhas de gás quando a fase móvel é despressurizada.2. garantir a alta sensibilidade do resultado obtido por detectores ultravioleta, uma vez que o oxigênio dissolvido absorve naregião do UV entre 190 e 260 nm, alterando o resultado.3. evitar “ruído” quando são empregados eletrodos eletroquímicos.4. evitar interferências na adsorção das substâncias que estão sendo separadas na coluna.

Assinale a alternativa correta.a) As afirmativas 1, 2, 3 e 4 são verdadeiras.b) Somente as afirmativas 1 e 2 são verdadeiras.c) Somente as afirmativas 3 e 4 são verdadeiras.d) Somente as afirmativas 1, 2 e 3 são verdadeiras.e) Somente as afirmativas 1, 2 e 4 são verdadeiras.

56 - Quanto ao emprego de detectores de fluorescência em cromatografia, a fase móvel interfere na emissão defluorescência, quando apresenta características inadequadas. Assinale a alternativa que apresenta as propriedades aserem analisadas para seleção da fase móvel.a) Constante dielétrica, pH, temperatura, concentração da fase móvel, viscosidade.b) Fotodecomposição, pH, temperatura, concentração.c) Viscosidade, densidade, pH, potencial de oxi-redução.d) Constante dielétrica, viscosidade e fotodecomposição.e) Densidade e constante dielétrica.





PF – Farmácia – 2004




A análise qualitativa de uma substância por cromatografia em camada delgada, realiza-se através do seu Rf (razão entre a distância percorrida pela substância e a distância percorrida pela frente da fase móvel). Esse parâmetro está relacionado com outro parâmetro nas cromatografias líquida e gasosa que é:a) a altura do pico;b) o tempo de retenção;c) a razão entre área da substância e área do padrão interno;d) a velocidade linear do gás de arraste;e) a relação sinal/ruído.

(PERITO LEGISTA – TOXICOLOGIA – PF)




35 - Com relação à cromatografia líquida de alta pre ssão (HPLC), assinale a alternativa correta.

a) As técnicas de cromatografia em HPLC separam apenas peptídeos.b) Na HPLC, um solvente líquido, com uma mistura de moléculas a serem identificadas, é passado por uma coluna contendo resina ligada a compostos de alta afinidade.c) Na HPLC, as esferas de resina podem ser recobertas por grupos carregados para separar compostos por troca iônica.d) Em HPLC, são usados tubos de plástico ou vidro para realizar o empacotamento da resina.e) As separações de HPLC têm resolução alta e reprodutibilidade baixa.

(PERITO – FARMÁCIA E BIOQUÍMICA – SSP/PR – 2007)



QUESTÕES DE CONCURSOSA cromatografia em camada delgada é a técnica de triagem mais utilizada em todos os laboratórios de toxicologia

forense. Esta técnica permite a manipulação de variáveis importantes para detecção de compostos isolados da matriz orgânica. Entre essas variáveis podemos enunciar:

a) eluente, índice de refluxo e revelador;b) adsorvente, índice de refluxo e agente cromogênico;c) adsorvente, eluente e agente cromogênico;d) adsorvente, eluente e gás carreador;e) pressão de vapor e temperatura do eluente.

A cromatografia gasosa é uma técnica de separação que desde os anos 70 vem sendo cada vez mais utilizada na área da toxicologia forense. Entretanto, como toda técnica, ela tem limitações quanto ao seu emprego na fase de triagem. A princípio, para ser passível de análise por cromatografia gasosa, uma substância precisa:

a) se degradar nas temperaturas do injetor;b) se volatilizar nas temperaturas operacionais;c) não conter nitrogênio na estrutura química;d) não interagir com a fase estacionária;e) ser volátil e estável à temperatura ambiente.

A cromatografia líquida de alta eficiência é uma das técnicas empregadas nas análises toxicológicas. Indique a alternativa que NÃO se apresenta como vantagem na aquisição desse equipamento:

a) a boa sensibilidade;b) a versatilidade;c) a alta resolução;d) os resultados qualitativos;e) o baixo custo de aquisição do equipamento.(PERITO LEGISTA– TOXICOLOGIA – PF)

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Métodos Físicos de Análise - CROMATOGRAFIA · Distância de Reten ção e Fator de Reten ção na cromatografia planar Parâmetros: (a) Distância total percorrida pelo solvente