Cromatografia Liquida

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  • Cromatografia Liquida - CLAE

  • O que Cromatografia ?Definio:

    A cromatografia uma tcnica de separao na qual os componentes a serem separados de uma mistura migram entre duas fases sendo uma fase mvel e a outra estacionria.A natureza qumica e fsica dos componentes da mistura definem o grau de afinidade entre as duas fases, acontecendo o fenmeno de migrao diferencial .

  • O que Cromatografia a Lquido HPLC?Definio:Na tcnica de cromatografia a lquido a fase mvel um lquido e a fase estacionria um slido .O processo cromatogrfico acontece na fase lquida , sendo que os componentes da amostras devem estar dissolvidos.

  • Instrumentao para HPLC

  • CLAE -HPLCFase mvel(amostra)Fase estacionria(Componentes retidos)Migraes diferenciaisAnalitomov AnalitoestK = Analitoest / Analitomov= coeficiente de partio

  • INSTRUMENTAOpumpinjectorcolumnovendetectorOne pump used to control 4 reservoirs; mixing is donebefore pump.MIXERdata processorFase mvel

  • Instrumentao para HPLCCOLUNA

  • Componentes de um Cromatgrafo a Lquido HPLCUm cromatgrafo a lquido composto de 3 partes principais :Injetor : o dispositivo que tem a funo de introduzir a amostra na fase mvel ;Coluna cromatografia : o dispositivo que tem a funo de separar os componentes da amostra ;Detector : o dispositivo que tem a funo de detectar os componentes eludos da coluna cromatogrficas

  • Componentes auxiliares de um HPLCBomba :

    o dispositivo que bombeia e controla o fluxo e a presso da fase mvel ( solvente ); composta de um ou mais pisto acoplados a um sistema de vlvulas.Fornece uma alta presso.

  • BOMBA Fluxo deve ser constante (0,01-10 mL/min)

    Opes: Simples, gradiente binrio, quaternrio

    Mede a presso sobre o sistema

    Manuteno preventiva (selos, pistes, check valves, etc.)

  • Componentes auxiliares de um HPLCVlvula de purga: o dispositivo que permite a troca rpida de solvente desviando o fluxo de solvente para o dreno.Misturador: o dispositivo que homogeneza a mistura de solventes quando operando com gradiente de eluio .

  • Fase estacionria

  • Colunas CromatogrficasFases estacionrias :Slica- C8 Slica- C18 Slica- C18 ( ODS)Slica- NH2Slica- DiolSlicaTroca InicaResinas DVB-ST Sulfonadas CaResinas DVB-ST porosas

    Pr-Coluna: o uma pequena coluna instalada a montante da coluna analtica .Tem como objetivo reter slidos e em muitos casos reter materiais que por reaes qumicas podem precipitar sobre a fase estacionria.

  • SLICA (suporte + usado):

    Resistncia mecnica Variedade de forma, tamanho de partculas e poros

    - Instabilidade frente a fases mveis cidas ou bsicas - Superfcie no homogneaCOLUNAS CROMATOGRFICAS

  • SLICA GRUPOS SILANISLIVRESGEMINALVICINAISinfluenciam no grau de acidez da slica

  • Fase Estacionria

    A fase estacionria mais utilizada composta de partculas microporosas de slica. So permeveis ao solvente e possuem uma rea superficial de varias centenas de metros por gramas.No deve ser utilizada em sistemas com pH acima de 8,0.

  • MODIFICAO SUPERFICIAL- QUIMICAMENTE LIGADAS

    - HBRIDAS

    - RECOBERTAS COM POLMEROS ORGNICOS

  • Fases Quimicamente LigadasC18 (ODS) forteC8amostraamostraamostraC4mdiafraca

  • RECOBRIMENTO COM POLMEROS RESISTNCIA MECNICA DA MATRIZ INORGNICA

    - SELETIVIDADE E INRCIA QUMICA DOS POLMEROS ORGNICOS

  • - Maior recobrimento dos stios ativos do suporte- Maior seletividade (natureza e quantidade dos grupos funcionais nas cadeias dos polmeros, espessura dos filmes, rea superficial e estrutura de poros do suporte) Poli(etileno) Poli(butadieno) Poli(estireno) Poli(dimetilsiloxano) Poli(metiloctilsiloxano) Poli(metiloctadecilsiloxano) Politeres Polissacardeos Poliaminas Polinucleotdeos Poliamidas ProtenasSlicaZircniaTitniaAlumina

  • PRINCPIOS DE SEPARAOINTERAO DO SOLUTO NAS 2 FASES (EQUILBRIO)INTERAES DE VAN DER VALLS

    LIGAES DE HIDROGNIO

    INTERAES DIPOLO-DIPOLO

    ATRAO ELETROSTTICA

  • Fases estacionriasInteraesC8PHC2van der Waalsvan der Waalsvan der Waals

  • Fase Estacionria

  • Fase Estacionria

  • Processo de EluioDefinio:Pode ser descrita como deslocamento do soluto na fase estacionria.Srie eluotrpica Ordena os solventes de acordo com suas habilidades relativas de deslocar soluto de um dado adsorvente.

  • Fora eluente: uma medida da energia de adsoro do solvente

    Cromatografia com fase normal: Utiliza uma fase estacionria polar e um solvente menos polar.Cromatografia com fase reversa: Utiliza uma fase estacionria apolar ou fracamente polar e um solvente polar.

  • DETECTORES - ClassificaoUNIVERSAIS:Geram sinal para qualquersubstncia eluda.SELETIVOS:Detectam apenas substnciascom determinada propriedadefsico-qumica.Dispositivos que geram um sinal eltrico proporcional quantidade eluda de um analito

  • DETECTORESUVFLUORESCNCIAMSELETROQUMICOIRPOLARMETRO

  • mais comum, usado na CLAE. Porque muitos solutos absorvem a luz ultravioleta. So bons para a eluio por gradiente com solventes no-absorventes.Detectores Ultra violeta:

  • Princpio: Absoro de luz ultravioleta ou visvel pela amostra, quando nela passa radiao eletromagntica.

    Seletivo (molculas com cromforos)

    Comprimento de onda () fixo

    pode ser selecionado (190 600 nm)

    Varredura (DAD)

    Solventes tambm absorvemUltra violeta (UV-visvel):guaMeOHACNAcetonaHexanoClorofrmioTHF 190 210 200 330 200 245 215 nmSolvente

  • Princpio: Emisso de energia fluorescente de um soluto que foi excitado por radiao UV

    Seletivo (molculas que fluorescem)

    Exemplo: Aromticos policclicos e duplas ligaes conjugadas

    Mais sensvel que UV por ser emisso

    Podem ser feitas reaes de derivao pr ou ps-coluna para que o analito se torne fluorescente.

    Reagentes de derivatizao comuns: fluorescamina e cloreto de dansilaFluorescncia:

  • Detectores por ndice de Refrao:

  • Princpio: Mede a diferena no ndice de refrao da fase mvel e do eluente vindo da coluna

    No- seletivo

    Sensvel a variaes de: Temperatura Presso Fluxo Composio fase mvel

    Baixa sensibilidade e difcil de estabilizar

    Muito usado em cromatografia preparativaIndice de refrao:

  • Princpio: Determinao da massa de solutos atravs da ionizao e determinao da relao massa-carga (m/z)

    Destrutivo

    Pode ser extremamente seletivo (SIM e massas tandem MS/MS)

    Interfaces de ionizao mais comuns: ESI, ApCI

    Anlise de micro e macromolculas.

    Alta sensibilidadeEspectrometria de massas:

  • MODOS DE SEPARAONORMAL

    REVERSO

    TROCA INICA

  • MODO NORMALMECANISMO DE INTERAO:ADSOROFase estacionria: + POLAR que a fase mvel

    Fase mvel: mistura de solventes orgnicos Colunas: Slica, Ciano, fenil, amino

  • MODO REVERSOINTERAO DA PARTE NO POLAR DOSOLUTO E A FASE ESTACIONRIAHIDROFOBICIDADEFase estacionria: APOLARFase mvel: H2O, MeOH, CH3CN REA DE C SOLUTO RETENO

  • Tempo de Reteno e HidrofobicidadeOHOHC18 (ODS) forteInteraofraca

  • HidrofobicidadeSe a amostra possuiCH3CH2CH2--- : cadeia carbnica : grupo aromtico

    Se a amostra possui-COOH : grupo carboxlico-NH2 : grupo amino-OH : grupo hidrxi

    A hidrofobicidade ser forteA hidrofobicidade ser fraca

  • TROCA INICAMECANISMO DE INTERAO :ATRAO ELETROSTTICAFase estacionria: Resinas trocadoras de ons (catinicas / aninicas)

    Fase mvel: Tampo (pH, , fora inica, temperatura)Aninicas: amnio quaternrio, aminasCatinicas: cido sulfnico, cido carboxlico

  • Microsseringas para InjeoLQUIDOS Capacidades tpicas: 1 L, 5 L e 10 Lmbolocorpo (pirex)agulha (inox 316)Obs: Seringa de HPLC

  • Seqncia

    Lavagem da coluna -MeOH por 30 minutosCondicionamento da coluna com fase mvelMonitoramento da linha de baseInjeo das amostras

  • PARMETROS CROMATOGRFICOSFATOR DE RETENO (k)

    FATOR DE SEPARAO ()

    NMERO DE PRATOS (N)

  • CromatogramatRtMTEMPOSINAL

  • Efeitos do alargamento excessivo de picos:EFICINCIA Capacidade de eluio com o mnimo de disperso do analito.

  • w2 na linha de baseBANDA CROMATOGRFICA

  • Representa a capacidade de distribuio do soluto nas fasesNo leva em conta o tempo morto da colunaFATOR DE RETENO (k)tr = tempo reteno analitoto = tempo morto da coluna

  • Se: t0 = 1,5 mint1 = 3,5 mint2 = 4,2 mink1 = 1,3k2 = 1,8

  • FATOR DE SEPARAO ()AVALIA A SELETIVIDADE

  • Se:

    k1 = 1,3 k2 = 1,8

    = 1,38 k1 = 1,3k2 = 1,8 = 1 no houve separao

  • NMERO DE PRATOS (N)Mede a eficincia do sistemaDepende da coluna, da amostra e do fluxo da fase mvel

  • Resoluo funo da Seletividade ()Eficincia da coluna (N)Fator de reteno (k)

  • ResoluoRs = 0.8

  • FASE MVEL Solvente grau HPLC (alta pureza)

    Filtrao (membrana 0.45 m)

    Degaseificao do solvente (ultrassom, borbulhamento de He ou automtico)

    Purgar os solventes

  • MODOS DE ELUIOISOCRTICO:Uma nica composio de fase mvel ao longo da corrida; a composio ds FM CONSTANTE.

    GRADIENTE: - Variao da composio da fase mvel (FM) ao longo da corrida.- Amostras com ampla faixa de k (0,5 < k < 20)

  • COLETA/OBTENO (QUANTIDADE, LUGAR, ETC..)

    ESTOCAGEM E PREPARAO (ESTABILIDADE)

    EXTRAO:

    - LQUIDO-LQUIDO - LQUIDO-SLIDO - SOXHLET - FLUDO SUPER CRTICO - EXTRAO EM FASE SLIDA (EFS / SPE)PREPARAO DA AMOSTRA

  • Filtrao necessria, previamente injeo, usualmente com membranas de 0.45 mm mesh para a remoo do m