METODY INSTRUMENTALNE

W ANALIZIE CHEMICZNEJ

Zakład Chemii Medycznej PUM

Promieniowanie elektromagnetyczne:

• fala

• strumień fotonów

Fala to rozchodzące się w przestrzeni i w czasie,

spójne drganie pól elektrycznego

i magnetycznego.

2

Fotony są pozbawione masy spoczynkowej, niosą ze

sobą ściśle określoną energię, którą wyraża zależność

Plancka:

gdzie:

• E energia promieniowania

• h stała Plancka 6,625 • 10-34 Js

• liczba falowa cm-1

Zajmuje się oddziaływaniem promieniowania elektromagnetycznego

z cząsteczkami.

W cząsteczce wieloatomowej można wyróżnić następujące rodzaje

energii:

• translacji - swobodny ruch cząsteczki w przestrzeni

• rotacji - związana z obrotem cząsteczki wokół osi środka masy

• oscylacji - związana z drganiem atomów wokół położenia równowagi

• elektronową - energia kinetyczna (ruch) elektronów i potencjalna związana z przyciąganiem elektronów przez jądro i

odpychaniem przez sąsiednie elektrony.

4

W wyniku absorpcji promieniowania elektromagnetycznego przez cząsteczki

następuje wzbudzenie odpowiednich poziomów energii , czego mierzalnym

efektem jest widmo.

• pod wpływem promieniowania z zakresu mikrofal i dalekiej podczerwieni

(energia 4x10-2 – 4x10-3 KJ/mol) następuje wzbudzenie rotacyjnych poziomów

energii a efektem jest widmo rotacyjne.

• pod wpływem promieniowania IR (podczerwień 4 – 240 KJ/mol) wzbudzeniu

ulegają oscylacyjne poziomy energii – efekt widmo oscylacyjne.

• wzbudzenie elektronów jest wywołane promieniowaniem

elektromagnetycznym (400 KJ/mol) z zakresu UV – Vis (ultrafiolet i

widzialne). Efektem absorpcji tego promieniowania jest elektronowe widmo

absorpcyjne.

5

Elektronowe widmo absorpcyjne jest widmem ciągłym

6

Podstawowe założenia do praw absorpcji:

• monochromatyczność wiązki promieniowania elektromagnetycznego

• jednorodność ośrodka absorbującego

7

8

Intensywność początkowa

promieniowania (Io)

Intensywność promieniowania

monochromatycznego (I1)

po przejściu przez próbkę o grubości l

c- stężenie roztworu

α- współczynnik absorpcji 0,4343K

I prawo absorpcji (prawo Lamberta)

Wiązka promieniowania monochromatycznego po przejściu przez

jednorodny ośrodek absorpcyjny o grubości “b” ulega osłabieniu

wg równania:

I = Io e –Kb

A= log I0 / I = a b

Absorbancja jest proporcjonalna do grubości warstwy

absorbującej jeśli wiązka promieniowania elektromagnetycznego

przechodzi przez jednorodny ośrodek absorbujący.

9

A- absorbancja, gęstość optyczna,

zdolność pochłaniania promieniowania

II prawo absorpcji (prawo Lamberta - Beera)

Absorbancja wiązki promieniowania

monochromatycznego przechodzącej przez

jednorodny roztwór jest wprost proporcjonalna

do stężenia roztworu “c” i do grubości warstwy

absorbującej “b”.

A = a• b • c

10

III Prawo absorpcji (addytywności absorpcji)

Absorbancja roztworu wieloskładnikowego równa się

sumie absorbancji poszczególnych składników.

A = A1 + A2 + A3 + ...... + An

11

Odchylenia od praw adsorpcji są wywołane przez:

1. Podstawowe ograniczenia praw

• prawa absorpcji są spełniane dla roztworów rozcieńczonych

c 10 -2 mol/l

• zakłada się, że jedynym oddziaływaniem promieniowania

elektromagnetycznego z substancją rozpuszczoną jest

absorpcja promieniowania (a nie np. fluorescencja)

12

2. Czynniki chemiczne

• zmianie pH roztworu, także zmianie stężenia mogą

towarzyszyć reakcje jak: polimeryzacja, dysocjacja, asocjacja,

solwatacja, reakcje kompleksowania - tym reakcjom

towarzyszą zmiany właściwości optycznych analizowanych

roztworów.

3. Czynniki aparaturowe

• brak monochromatyczności wiązki (główna przyczyna

odchylenia od praw)

• promieniowanie rozproszone

Spektrometria w zakresie nadfioletu (ultrafiolet UV) i promieniowania

widzialnego (visible – Vis).

Absorpcja promieniowania w zakresie UV – Vis jest związana z

przejściami elektronów walencyjnych ( i π) oraz elektronów

wolnych par elektronowych (elektrony n).

14

Ilościowe oznaczanie metodą spektrofotometryczną UV – Vis należy do metod porównawczych.

Porównuje się z wzorcami i posługuje z krzywymi kalibracyjnymi.

1. Metoda porównania z pojedynczym wzorcem

Ax – absorpcja roztworu badanego cx

Aw – absorpcja roztworu wzorcowego o cw pomiar w kuwetach o tej

samej grubości b i przy tej samej długości fali

Ax = a cx b Aw = a cwb

15 w

x

w

x

c

c

A

A

2. Metoda porównania z kilkoma wzorcami czyli

metoda krzywej wzorcowej – metoda

uniwersalna

16

A

C

Ax

Cx

Analiza jakościowa

Elektronowe widmo absorpcyjne jest cechą charakterystyczną

związku chemicznego i określa jednoznacznie związek jednorodny.

• W przypadku związku organicznego widma UV – Vis w zakresie

180 –800 nm są użyteczne do ustalania pewnych zależności

strukturalnych i identyfikacji grup funkcyjnych.

• Użytecznym pojęciem jest wprowadzone przed wieloma laty określenia:

chromofor i auksochrom

17

Chromofory są to grupy absorbujące promieniowanie

elektromagnetyczne w zakresie 180 – 800 nm

grupy: karboksylowa, nitrozowa, alkenowa, azowa, tiolowa, benzenowa

Auksochromy są to grupy przesuwające absorpcję (max i Emax) w

kierunku fal dłuższych (przesunięcie batochromowe)

grupy: aminowa, hydroksylowa, sulfhydrylowa

18

Cząstki w stanie wzbudzonym mogą emitować promieniowanie

przechodząc do stanu podstawowego - zjawisko to nazywamy

luminescencją - emisja światła przez ciała zimne.

W zależności od czynników które wywołały luminescencję rozróżniamy:

fotoluminescencja – substancja jest wzbudzona promieniowaniem elektromagnetycznym UV – Vis

chemiluminescencja – wzbudzenie jest wynikiem reakcji chemicznej

bioluminescencja - wzbudzenie jest wynikiem procesów biochemicznych

elektroluminescencja – wzbudzenie następuje w polu elektrycznym.

19

Proces fotoluminescencji cząstki można przedstawić

schematycznie: X + h X* X + ciepło + h´

h´- energia oddana na sposób

promienisty

W zależności od mechanizmu

przejść elektronowych wyróżniamy:

fluorescencję

fosforescencję

20

Zastosowanie analityczne fluorescencyjnej analizy

ilościowej:

witaminy (tiamina)

hormony (adrenalina)

aminokwasy (tryptofan)

alkaloidy (chinina)

leki (antybiotyki, barbiturany)

środki spożywcze

substancje toksyczne w środowisku

tiamina

tiochrom

Absorpcja promieniowania IR wpływa na zmianę

energii oscylacyjnej cząsteczki

Zakresy długości fal odpowiadające podczerwieni:

• 0,8 – 2,5 m NIR bliska podczerwień

• 2,5 – 25 m MIR podstawowa

• 25 – 500 m FIR daleka podczerwień

22

Widmo IR jest właściwością charakterystyczną dla danego związku chemicznego.

Wykorzystuje się je do:

• identyfikacji związków (ustala się grupy funkcyjne i strukturę badanego związku).

• w analizie ilościowej (obowiązuje tu także prawo Lamberta-Beera).

• w biologii, biochemii, medycynie do badania tkanek-mięśni, włókien i krwi.

23

Jądra atomowe niektórych izotopów umieszczone w jednorodnym

polu magnetycznym mogą absorbować promieniowanie

elektromagnetyczne o częstotliwości radiowej.

Z warunku rezonansu wynika, że można:

• przy ustalonej częstotliwości radiowej zmieniać natężenie pola magnetycznego tak długo aż wystąpi rezonans

• przy stałym natężeniu pola można zmieniać częstotliwość promieniowania radiowego aż do wystąpienia rezonansu

Promieniowanie o częstotliwości radiowej uzyskuje się z krystalicznego

oscylatora o dużej stabilności.

Najczęściej bada się izotopy: 1H, 13C, 19F, 31P, 14N, 11Bi, 29Si

24

25

Tomografia MRI (magnetic resonance imaging)

• Pierwszy raz wykorzystana w 1973r. przez

Lauterbur’a,

• Obecnie to istotna metoda stosowana w

diagnostyce klinicznej.

• Magnes horyzontalny, do którego wsuwany jest

na leżąco pacjent utrzymuje stałe i jednorodne

pole magnetyczne.

• Za pomocą dodatkowych cewek uzyskuje się

warunki rezonansowe jąder tylko w wybranej

warstwie, w przekroju.

• Impuls pola zmiennego wzbudzającego rezonans trwa ułamek sekundy

• Obraz żywego organizmu przedstawia mapę gęstości protonów wody w

tkankach danej części ciała.

• Najczęściej obrazuje się nieruchome części ciała tj. mózg, rdzeń kręgowy,

kończyny.

• Obraz mózgu otrzymany metodą tomografii zmienia się w zależności od tego ile świeżej utlenowanej krwi jest dostarczone do niego w trakcie myślenia, zapamiętywania czy reakcji na bodźce.

• Uzyskuje się mapę funkcji mózgu

• Do obrazowania narządów wewnętrznych konieczne jest dodatkowe sterowanie gradientem pola w rytm oddechów tzw. nawigator oddechowy

• W badaniu serca sekwencje obrazujące są sterowane sygnałem EKG

26

ANALIZA PROTEOMICZNA PROTEin complement of the genOME (składnik białkowy kodowany przez genom)

Proteomika zmierza do poznania wszystkich białek pojawiających się w danym

organizmie w ciągu całego życia.

• Liczba białek proteomu jest znacznie większa niż liczba kodujących ją genów. Ludzki genom ma w przybliżeniu 30-50 tysięcy genów kodujących białka

• Do tej pory rozpoznano około 500 tysięcy białek, co oznacza, że na 1 gen przypada prawie 10 różnych wariantów białek

• Na taki stan mają wpływ:

• procesy molekularnego składania w trakcie translacji i powstawania informacyjnego kwasu rybonukleinowego

• procesy potranslacyjne: fosforylacja czy glikozylacja, które mają wpływ na ostateczną strukturę białka

• Pełna analiza białek- markerów białkowych zawartych w materiale biologicznym może być źródłem wielu informacji o zdrowiu pacjenta oraz wspomóc kliniczną diagnozę w monitorowaniu choroby czy prowadzeniu terapii.

Białka w surowicy ludzkiej

• Ludzka surowica zawiera wiele tysięcy białek/peptydów o stężeniu w zakresie 35-50 ∙ 10⁹

pg/ml do 0-5 pg/ml

• Poznano 22 białka stanowiące 99% surowiczego proteomu, pozostały 1% białek/peptydów

nazwano peptydomem, zawierającym białka o masie cząsteczkowej mniejszej niż 10 000 Da.

• Małe białka są trudne do identyfikacji i wykonania analizy ilościowej z powodu ich małej

ilości w surowicy oraz tendencji przyłączania się do białek transportujących, takich jak

albumina.

ANALIZA PROTEOMICZNA

W wykrywaniu markerów biologicznych stosuje się techniki pozwalające na

porównywanie złożonych mieszanin białkowych i ilościową ocenę ich

poszczególnych składników.

ANALIZA PROTEOMICZNA – elektroforeza 2D

ETAP 1

• Białka są rozdzielane w gradiencie

pH w zależności od punktu

izoelektrycznego pI, czyli wartości

pH, przy której ładunek wypadkowy

białka jest równy zero

Analiza proteomiczna wykorzystuje elektroforezę

dwukierunkową 2D i spektrometrię mas.

Ogniskowanie izoelektryczne IEF

ETAP 2

Białka są rozdzielane zgodnie z ich masą

cząsteczkową metodą SDS-PAGE

Uzyskuje się rozdziały białek o

podobnych masach cząsteczkowych

ANALIZA PROTEOMICZNA – spektrometria mas

• Technika analityczna, której

podstawą jest pomiar stosunku

masy do ładunku elektrycznego

danego jonu.

• Metoda oparta na jonizacji

cząsteczek lub atomów, a

następnie detekcji liczby jonów w

funkcji ich stosunku masy do

ładunku (m/z).

• Wyniki działania spektrometru

mas są przedstawiane w postaci

tzw. widma masowego.

Chromatografia (gr. chromatos= barwa + graphos= pisze)

technika służąca do rozdziału lub badania składu mieszanin

związków chemicznych.

Chromatografię stosuje się do :

wyodrębniania związków z mieszanin oczyszczania identyfikacji ilościowej i jakościowej preparacji związków

Wybór metody zależy od :

ilości mieszaniny identyfikacyjnej rodzaju związków stopnia skomplikowania podziału

33

Rozdział chromatograficzny polega na umieszczeniu badanej mieszaniny na ciekłej lub stałej fazie nieruchomej (stacjonarnej), a następnie na przepuszczeniu ciekłej bądź gazowej fazy ruchomej (mobilnej) przez nią lub też nad nią, czyli elucji mieszaniny z fazy nieruchomej.

Składniki mieszaniny o różnych stosunkach podziału są eluowane (migrują) z różnymi szybkościami. Te różnice w szybkości migracji prowadzą do rozdziału składników w czasie i przestrzeni.

34

Kryteria podziału metod chromatograficznych

35

I. Zastosowanie eluentu

1. chromatografia cieczowa

2. chromatografia gazowa

3. chromatografia fluidalna

IV. Stan skupienia faz

1. chromatografia gazowo-cieczowa (GLC)

2. chromatografia cieczowo-cieczowa (LLC)

3. chromatografia gazowo-stała (GSC)

4. chromatografia cieczowo-stała (LSC)

II. Natura sił fizyko-chemicznych procesu

1. chromatografia adsorpcyjna

2. chromatografia jonowymienna

3. chromatografia podziałowa

a. klasyczna

b. z odwróconymi fazami

c. par jonowych

4. chromatografia sitowo-żelowa (sączenie

molekularne)

5. chromatografia powinowactwa

6. elektroforeza kapilarna (CE)/ wysokosprawna

elektroforeza kapilarna (HPCE)

III. Geometria układu

1. chromatografia kolumnowa

2. chromatografia planarna

a. bibułowa

b. cienkowarstwowa (TLC)

V. Parametry procesu

1. wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC)

2. szybka, białkowa chromatografia cieczowa (FPLC)

Klasyfikacja adsorbentów: 1. pod względem aktywności adsorpcyjnej

- słabe (skrobia, sacharoza)

- średnie (węglan wapnia)

- silne (aktywowany kwas krzemowy, tlenek glinu)

2. ze względu na polarność

- silnie polarne (tlenek glinu, tlenek krzemu)

- słabo polarne (węglan wapnia)

- niepolarne (węgiel aktywowany)

3. ze względu na właściwości chemiczne:

- kwaśne ( SiO2)

- zasadowe ( CaO)

- obojętne ( węgiel aktywowany)

- amfoteryczne ( Al2O3)

4. ze względu na naturę chemiczną:

- organiczne (węgiel, skrobia, poliamidy)

- nieorganiczne (Al2O3, MgO, krzemiany)

- mieszane (talk + sacharoza, CaCO3+ talk)

- specyficzne (silikażel o specyficznych porach)

36

Rozpuszczalniki (solwenty) - ułożone są w szereg eluotropowy, w zależności

od zdolności adsorpcyjnych w stosunku do substancji w nich rozpuszczonych

oraz elucyjnych.

Stosowane są do rozwinięcia chromatogramu jak i do elucji (wymywania

rozdzielonych substancji).

W chromatografii rozpuszczalniki uszeregowane są wraz ze wzrostem zdolności

wymywania zaadsorbowanych związków polarnych:

• heksan ( najmniej polarny)

• tetrachlorek węgla

• benzen

• eter dietylowy

• aceton

• chloroform

• octan etylu

• etanol

• metanol

• woda

Zdolności adsorpcyjne cząsteczek zależą od :

wielkości i budowy przestrzennej

liczby i położenia wiązań podwójnych

liczby podstawników polarnych i niepolarnych

liczby i rodzaju grup funkcyjnych

Stopień adsorpcji cząsteczek adsorbatu wzrasta wraz z:

ilością wiązań podwójnych

grup funkcyjnych

liczbą podstawników tego samego rodzaju

39

Rozpuszczone w fazie ruchomej składniki mieszaniny ulegają podziałowi między

dwie fazy. O rozdziale decyduje:

Prawo podziału solutu- prawo Nernsta

K = C1 / C2

K - współczynnik w stanie równowagi zależy jedynie od temperatury i właściwości

substancji tworzących roztwory, a nie zależy od ilości substancji rozpuszczonej

C1 - stężenie solutu (substancji rozpuszczonej) w fazie stacjonarnej

C2 - stężenie solutu w fazie ruchomej

Ekstrakcja- metoda rozdziału składników mieszaniny lub oczyszczania

określonego składnika z towarzyszących zanieczyszczeń wykorzystująca

prawo podziału solutu.

40

Rozdział mieszaniny jest oparty na różnicy we współczynnikach podziału

składników mieszaniny (odmienną rozpuszczalnością) między dwie nie

mieszające się ze sobą fazy, z których jedna jest cieczą osadzoną na nośniku

(faza stacjonarna), a druga fazą ruchomą (ciecz, gaz). 41

Szybka metoda wstępnej orientacji w ilości i

względnym udziale składników mieszaniny

związków organicznych.

Podstawę podziału stanowią reakcje wymiany jonowej między jonami z roztworu, a

jonami związanymi z fazą stacjonarną, którą stanowią jonity (kationity i anionity).

Rozdział składników mieszaniny wynika z różnic w ładunku elektrycznym jonów.

Jonity (wymieniacze jonowe) są to substancje, które mają właściwości pobierania

jonów z roztworów w zamian za oddawanie do roztworów równoważnych ilości innych

jonów tego samego znaku.

Żywica jonowymienna składa się ze szkieletu (matrycy) polimeru łańcuchów

węglowodorowych w postaci sieci przestrzennej. Z matrycą są trwale powiązane jony

(grupy) aktywne, które noszą nazwę jonów utrwalonych. Jony te mogą być wymieniane

na inne znajdujące się w roztworze.

Zastosowanie chromatografii jonowymiennej:

rozdział związków jonowych, kwasów karboksylowych, zasad (aminy),

aminokwasów, peptydów, białek, pochodnych kwasów nukleinowych,

cukrów

zmiękczanie wody – usuwanie jonów wapnia i magnezu

demineralizacja wody

Obejmuje metody chromatograficzne, w których fazą nośną jest gaz.

Analizowana próbka (analit) jest przenoszona za pomocą gazu nośnego poprzez

kolumnę wypełnioną fazą nieruchomą, gdzie następuje rozdział mieszaniny na

poszczególne związki chemiczne.

Rozdzielone substancje mierzy się i rejestruje u wylotu kolumny za pomocą

odpowiedniego układu detektorowego.

W zależności od rodzaju fazy nieruchomej rozróżnia się:

chromatografię gazową podziałową (faza nieruchoma - ciecz naniesiona na

stałym nośniku)

chromatografię gazową adsorpcyjną (faza nieruchoma - adsorbent)

chromatografię gazową kapilarną - średnica kolumny 0,2-0,6 mm,

(faza nieruchoma – ciecz naniesiona bezpośrednio na ścianki kolumny)

Szybka i skuteczna metoda rozdzielania mieszanin związków lotnych.

Analiza jakościowa i ilościowa

Schemat chromatografu gazowego

Wysokociśnieniowa/wysokosprawna chromatografia cieczowa -

HPLC – High Pressure/Performance Liquid Chromatography

Faza ruchoma - ciecz wtłaczana pod wysokim ciśnieniem (20MPa-40MPa)

Faza stacjonarna - gęsto i jednorodnie upakowane złoże w kolumnie z metalu,

dobrze odpowietrzone

Wariant analityczny - węższe kolumny (4-8 mm); długość 5 – 25 cm

Wariant preparatywny - szersze kolumny (20 – 500 mm); długość 25 –100 cm

Zalety: szybki, zautomatyzowany i precyzyjny rozdział związków; łatwe

stosowanie gradientów; powtarzalność czasów retencji; ilościowe oznaczanie

związków (pole powierzchni pod pikiem)

Detekcja: spektroskopowa (UV-VIS), elektrochemiczna, spektrofluorymetryczna

Wada: rozdział małych ilości związków

Schemat chromatografu cieczowego