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Revista Científica Agropecuaria 6: 17-23 (2002) © 2002 Facultad Ciencias Agropecuarias - UNER

__________ 1Cátedra de Genética. Facultad de Ciencias Agrarias. Universidad Nacional de Rosario. Campo Experimental J. F. Villarino. CC 14 - (S2125ZAA) Zavalla. Santa Fe. Argentina.

MICROPROPAGACIÓN DE PLANTAS ELITE DE ESPÁRRAGO

Pablo D. Asprelli1, Vanina P. Cravero1, Ileana Gatti1, Enrique Luis Cointry1

RESUMEN El espárrago es una especie perenne y dioica en la cual se han desarrollado

distintos tipos de híbridos. El cultivo in vitro de meristemas y la micropropagación son métodos rápidos y eficientes para multiplicar clones de genotipos que al ser cruzados generen híbridos con características agronómicas superiores y homogéneas. El objetivo del presente trabajo fue evaluar la capacidad de regeneración in vitro de cuatro plantas estaminadas y seis pistiladas progenitoras de híbridos con altos rendimientos en dos sistemas productivos: espárrago blanco y verde. Se determinó un comportamiento diferencial in vitro de los genotipos para los porcentajes de contaminación de los meristemas sembrados (MC), desarrollo de vástago (DV) y vástagos enraizados (EN) y para el número promedio de plántulas por explanto (PP). Los meristemas de materiales manejados como blanco mostraron valores mayores de MC (43,3 %). No se manifestó interacción genotipo-manejo para MC y sí para DV y EN (G=7,51 y G=13,1). PP estuvo condicionado por el tipo de manejo y por el sexo de los materiales de los cuales se extrajeron los meristemas. El cultivo in vitro permite adecuar las condiciones de multiplicación en función de la variabilidad de los materiales y de las interacciones existentes con los sistemas de producción.

Palabras clave: Asparagus officinalis L. - híbridos selectos - progenitores - sistemas de producción - micropropagación

SUMMARY Asparagus elite plants micropropagation

Asparagus is a perennial dioecious crop in which different types of hybrids have been developed. In vitro cultures of meristems is an efficient method that offers the possibility to rapidly replicate elite hybrids parental plants. The objective of the present work was to evaluate the in vitro regeneration capability of four staminated and six pistillated parental hybrid plants with high yielding in two productive systems, the green and white asparagus production,. A differential response was observed among genotypes for percentage of contaminated meristems (MC), shoot development (DV), rooted shoots (EN) and mean number of platelets per cultured meristem (PP). Meristems from white spears showed higher contaminated meristems (43.3%) than those from green spears. Genotype x type of production (white – green) interaction was only significant for shoot development DV and rooted shoots EN (G=7.51, 13.1 respectively). Gender of parental plant and type of production conditioned PP. Genetic variability and type of production should be considered to adequate best multiplication conditions of in vitro culture in this specie.

Key words: Asparagus officinalis L. - selected hybrids - parentals - production systems - micropropagation

Pablo D. Asprelli et al.

18 Revista Científica Agropecuaria 6, 2002

Introducción El género Asparagus, perteneciente a la familia de las Liliáceas, comprende casi 100 especies originarias del sur de Europa, Asia y África (Reuther, 1992), algunas de ellas con valor ornamental y sólo una con valor hortícola: el espárrago (Asparagus officinalis L.).

El cultivo comercial de esta especie, perenne y dioica, se inicia con la siembra de semillas en almácigo, para obtener “arañas” (órgano de reserva) de un año de edad que serán transplantadas al lugar definitivo durante el reposo invernal. En el transcurso de la primavera las yemas de los órganos de reserva se desarrollan dando origen a la porción comestible o “turión”. Existen dos sistemas de cultivo: con formación de camellones (alomado) para la producción de turiones blancos y sin alomar para turiones verdes.

Durante muchos años se intentó incrementar la

uniformidad del cultivo efectuando la plantación a partir de porciones de arañas de plantas selectas obtenidas por división de las mismas. Sin embargo no se obtuvo el resultado deseado debido a la susceptibilidad al ataque de hongos y bacterias, siendo a la vez una práctica lenta cuando se requiere un gran número de plantas. Por tales motivos sólo es posible producir dos o tres plantas por año a partir de cada planta madre (Takatori, et al., 1968; Yang y Clore 1973).

Por tales motivos, las técnicas de cultivo in

vitro resultan de interés tanto por la posibilidad de incrementar la tasa de multiplicación, como para evitar la transmisión de enfermedades normalmente portadas por la araña. La utilización de estas técnicas está subordinada a la puesta a punto de los procedimientos adecuados, especialmente en lo concerniente a la regeneración y al origen de los explantos ya que el sistema de cultivo podría influir en el comportamiento de los mismos.

En lo referente a los medios de cultivo

utilizados en general, contienen auxinas y citocininas para controlar la regeneración de tallos y raíces ya que la respuesta organogénica varía en función de la suplementación de los medios basales (Ghosh y Sen, 1992). Así, el agregado de ancymidol provoca la inhibición de la síntesis de giberelinas (Coolbaugh y Hamilton, 1976), las

cuales inhiben la formación de vástagos y raíces (Brian et al., 1960; Murashige, 1964; Schraudolp y Reinert, 1959) y promueven la formación de callos (Murashige, 1964; Schraudolp y Reinert, 1959).

El presente trabajo tiene como objetivo

determinar la capacidad de regeneración in vitro de los progenitores de híbridos selectos de manera de establecer el sistema de cultivo más adecuado para obtener el material inicial y así lograr una óptima regeneración.

Materiales y métodos Como material experimental se utilizaron cuatro plantas estaminadas (357, 710, 777 y 861) y seis pistiladas (28, 163, 221, 226, 473 y 859) provenientes de ambos sistemas productivos a partir de los cuales se obtuvieron los meristemas que fueron multiplicados in vitro (Fig. 1). Esas plantas son los progenitores de siete híbridos selectos en ensayos previos derivados del Programa de Mejoramiento de Espárrago que se desarrolla en la Facultad de Ciencias Agrarias de la UNR ubicada en la localidad de Zavalla, Santa Fe.

De cada uno de los progenitores se extrajeron cinco turiones de 10 cm de longitud los cuales fueron desinfectados sumergiéndolos en una solución de etanol 70 % durante cinco minutos y en hipoclorito de sodio al 3 % de cloro activo por igual período de tiempo, efectuando posteriores lavados con agua bidestilada estéril bajo cámara de flujo laminar horizontal. De los turiones desinfectados se obtuvieron los meristemas que constituyeron los explantos iniciales.

Se sembraron 20 meristemas por genotipo y

sistema de cultivo en tubos de vidrio de base plana de 25 mm de diámetro y 12 cm de altura, conteniendo 15 ml de medio de cultivo formulado con los macroelementos, microelementos y vitaminas de Murashige y Skoog (1962) suplementado con 2,5 mg/l de cinetina + 2,5 mg/l de ácido naftalen acético + 5 mg/l de ancymidol como inhibidor de la síntesis de giberelinas (Chin, 1982). La incubación se efectuó en cámara de cultivo con una intensidad lumínica de 50 µmol m-

2 s-1 con un fotoperíodo 16 h a una temperatura de 25 ± 1 ºC. Se efectuaron tres repiques a intervalos constantes de 40 días, de acuerdo a un diseño

Micropropagación de plantas elite de espárrago


completamente aleatorizado, seccionando los vástagos a nivel de entrenudos y colocando cada

nuevo explanto en tubos con medio de cultivo fresco.

Figura 1. a- Diferentes estadíos de desarrollo de los vástagos b- Detalle del desarrollo radicular c- Plántulas en condiciones de ser transferidas a tierra d- Aclimatación de las plantas bajo invernadero

Fueron evaluadas por genotipo y por tipo de manejo las siguientes variables: porcentaje de contaminación de los meristemas desde la siembra hasta el primer repique (MC), porcentaje de desarrollo de vástago desde la siembra hasta el primer repique (DV), porcentaje de vástagos enraizados (EN) y el número promedio de plántulas por explanto (PP) producidas en un período de 4 meses. El análisis de las tres primeras variables se efectuó por medio de la prueba no paramétrica G (Sokal y Rohlf, 1967) comparándose los efectos de los sistemas de producción sobre los genotipos mediante la prueba de ji-cuadrado (Sokal y Rohlf, 1967). Para la

variable PP se realizó un análisis de variancia utilizando el programa estadístico SAS (1982) y se obtuvieron los promedios por genotipo, por sexo y por sistema de manejo.

Resultados y discusión En el Cuadro 1 se muestran los valores de los porcentajes de contaminación (MC), de desarrollo de vástago (DV) y de enraizamiento (EN). La prueba de G permitió establecer un comportamiento diferencial de los genotipos con respecto a las variables evaluadas (Cuadro 2).

a b

c d



Cuadro 1. Porcentajes de meristemas contaminados (MC), de vástagos desarrollados (DV) y de enraizamiento (EN) por genotipo y sistema de producción

MC (%) DV (%) EN (%)

Manejo Manejo Manejo

Genotipos Blanco Verde χ2 Blanco Verde χ2 Blanco Verde χ2

357 0,0 0,0 ns 14,3 18,2 ns 12,5 0,0 ns 710 53,8 60,0 ns 16,7 0,0 ns 0,0 0,0 ns 777 33,3 40,0 ns 62,5 66,7 ns 41,7 0,0 *

Esta

min

ados

861 50,0 41,7 ns 16,7 28,6 ns 12,5 0,0 ns

28 --- 36,4 --- --- 28,6 --- --- 0,0 --- 163 36,8 16,7 ns 16,7 10,0 ns 0,0 0,0 ns 221 12,5 --- --- 0,0 --- --- 0,0 --- --- 226 58,3 16,7 * 80,0 10,0 ** 16,7 22,2 ns 473 10,0 27,8 ns 22,2 7,7 ns 23,1 0,0 ns Pi

stila

dos

859 100,0 8,3 *** 0,0 9,1 ns 0,0 22,2 ns (---) No se obtuvieron meristemas; ns=no significativo; (*) significativo al 5%; (**) significativo al 1%; (***) significativo al 5 °/°°. Cuadro 2. Valores de la prueba G para los porcentajes de meristemas contaminados (MC), de vástagos desarrollados (DV) y de enraizamiento (EN)

Hipótesis Evaluada g.l MC DV EN

Igualdad entre genotipos 9 29,53 *** 17,43 * 21,61 ** entre plantas estaminadas 3 19,86 *** 8,58 * 6,79 ns entre plantas pistiladas 5 9,64 ns 6,47 ns 14,79 * entre sexos 1 0,03 ns 2,38 ns 0,02 ns Igualdad entre manejos 1 8,18 *** 2,18 ns 2,84 ns Interacción genotipo x manejo 9 27,02 *** 7,51 ns 13,13 ns

ns=no significativo; (*) significativo al 5%; (**) significativo al 1%; (***) significativo al 5 °/°°.

Para MC se determinaron diferencias altamente significativas entre los tipos de manejo (G=8,18; p<0,005) y entre genotipos estaminados (G=19,86; p<0,005) no manifestándose interacción genotipo-manejo. Los meristemas provenientes de materiales manejados como blanco tendrían mayor posibilidad de contaminarse debido a que. entre el tallo y la escama que protege al meristema, podrían quedar restos de tierra arrastrados durante la emergencia del turión, acarreando bacterias o esporas junto con el meristema a sembrar. Si bien este comportamiento solo resultó significativo para los genotipos 226 y 859, convendría intensificar las condiciones de desinfección al iniciar el cultivo in vitro con meristemas

provenientes de este tipo de manejo, de manera de reducir las pérdidas por contaminación.

Los meristemas que no sufrieron contaminación (aproximadamente el 65% del total sembrado) desarrollaron uno o más vástagos de los cuales se obtuvieron uno o más explantos para ser repicados.

Para DV y EN se encontraron interacciones

entre el genotipo y el tipo de manejo del cultivo (G=7,51 y G=13,13) por ser no significativas las hipótesis evaluadas. Para la variable DV el genotipo pistilado 226 mostró un mayor porcentaje de vástagos desarrollados cuando los meristemas se obtuvieron de turiones provenientes



de un sistema de producción de espárrago blanco (Cuadro 1) mientras que el resto de los genotipos no modificó su comportamiento al cambiar el sistema de producción.

La existencia de variabilidad genética para el

desarrollo in vitro podría ser explicada por diferencias en el contenido hormonal endógeno de cada clon, ya que los que poseen mayores tasas de desarrollo contienen niveles más altos de sustancias inhibitorias del ácido giberélico (Chin, et al., 1990) haciendo que el catabolismo y anabolismo de ácidos orgánicos, aminoácidos libres y carbohidratos sea más rápido. La

acumulación de compuestos poliméricos conlleva a la pérdida del potencial de regeneración y desarrollo (Reuther, 1990).

Para la variable PP las plantas estaminadas

provenientes de materiales blancos presentaron valores superiores, mientras que los genotipos pistilados se comportaron de forma inversa (Fig. 2), por lo que el potencial de propagación estuvo condicionado por la interacción entre el tipo de manejo y el sexo de los materiales de los cuales se extrajeron los meristemas (F=5,07; p<0,05).

Figura 2. Número promedio de plántulas desarrolladas por meristema de cada genotipo para ambos sistemas de manejo

En espárrago, la formación in vitro de raíces

mediada por auxinas está relacionada con la ruptura de la dominancia apical y es esencial para el desarrollo de la araña con raíces adventicias y de reserva ya que determinan la supervivencia de las plántulas luego de transferirlas a tierra (Doré, 1990). Si bien los meristemas de los genotipos estaminados provenientes de un sistema de producción de espárrago blanco mostraron en general un comportamiento superior para EN, esta diferencia sólo fue significativa para el genotipo 777 (Cuadro 1).

Los genotipos pistilados mostraron diferentes tendencias en función del sistema de producción. Aunque las diferencias estadísticas fueron no significativas (Cuadro 1), el progenitor 473 mostró mayor valor de EN cuando los meristemas fueron obtenidos de un sistema de producción de espárrago blanco, mientras que el progenitor 859 mostró un comportamiento inverso. El progenitor pistilado 226 no mostró tendencias diferenciales según el manejo.

Para ninguna de las variables analizadas

existieron diferencias significativas entre ambos sexos. Una constante característica en espárrago

357 710 777 861 28 163 221 226 473 8590

2

4

6

8

10

BlancoVerde

Genotipos

Valores Promedios



es que la capacidad de micropropagación no está relacionada con el sexo pero sí con el genotipo, observándose en el primer subcultivo diferencias respecto a la cantidad de explantos por material que desarrolla vástagos, la cantidad y el diámetro de los brotes, la cantidad de microcortes y de fragmentos potenciales (Thévenin y Doré, 1976) como así también diferencias en la formación de raíces inducidas por el ancymidol (Gross, 1987).

El ancymidol reduce el período de tiempo

necesario para producir plántulas. Yang y Clore (1973) lograron tener plántulas repicables en 20 semanas utilizando un medio de cultivo sin ancymidol. Chin (1982) logró reducir ese período a 8 semanas incorporando ancymidol al medio de cultivo, logrando asimismo el desarrollo de tallos y raíces más vigorosas y suprimiendo la formación de callos. En el presente trabajo, se obtuvieron vástagos en condiciones de ser repicados a las seis semanas posteriores a la siembra, por lo que la incorporación de ancymidol al medio de cultivo resultó satisfactoria.

Asimismo, mientras que a través de las técnicas

convencionales de clonación por división de la araña sólo pueden obtenerse dos o tres plantas por año (Takatori et al., 1968), esta técnica de cultivo in vitro de meristemas permitiría obtener entre 25 y 30 plantas en el mismo período de tiempo. Por este motivo, resulta un método rápido y eficiente para obtener clones de aquellos genotipos que al ser cruzados generen híbridos con características agronómicas superiores y homogéneas (Cointry et al., 1993), permitiendo adecuar las condiciones de multiplicación en función de la variabilidad observada entre los materiales y de las interacciones existentes con los sistemas de producción.

Conclusiones

Los meristemas provenientes de materiales manejados como blanco mostraron en el primer subcultivo una leve superioridad, aunque no significativa, para el desarrollo de vástagos y para el enraizamiento. Además, los genotipos respondieron de manera diferente tanto a la inducción del desarrollo de vástagos como de raíces por lo que habrá que sembrar mayor cantidad de meristemas de aquellos materiales en los que se observe un bajo número de vástagos repicables o un escaso desarrollo de raíces para así

obtener un número considerable de plántulas en condiciones óptimas para ser transferidas a tierra.

Agradecimientos Este trabajo fue financiado con fondos aportados por la Agencia Nacional de Investigaciones Ciéntificas y Tecnológicas dentro del marco del Proyecto 08-07333.

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Recibido: 20-05-02 Aceptado: 9-10-02

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