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22/04/2008
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Seminario N° 2Microbiología General
Microscopia y Tinciones
Microscopía
Conceptos básicos: NA, resolución, partes del microscopio.
Microscopios: campo claro, campo oscuro, contraste defases fluorescencia confocal interferencia electrónico defases, fluorescencia, confocal, interferencia, electrónico debarrido, de transmisión, fuerza atómica, efecto tunel.
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Preparación de extendidos.
Tinciones: simples, diferenciales, especiales.
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Límite de resolución
Antony van Leeuwenhoek
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Descripción de Van Leeuwenhoek delos “pequeños animáculos“presentes en la placa dental. (Firstedition, Delft in Holland, 12 September1683, to Francois Aston, Pag.11).Dibujó bacilos, micrococos y espirilos.
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Máxima AN (teórica)
En objetivos secos:
n = 1 y alfa = 90° entonces
Apertura numérica
AN = 1
En la práctica AN = 0.95
(ángulo 72 °)
Índice de refracciónEn objetivos de inmersión:
n = 1.51 y alfa = 90° entonces AN = 1.51
En la práctica AN = 1.45
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Apertura numérica
Apertura Numérica (AN) = n . sen (alfa)n = índice de refracción del medio entre el objeto y el objetivo
(alfa) = mitad del ángulo descripto por el cono de luz que ingresa al objetivo.
Uso de un condensador
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Uso de Aceite de inmersión
•Máximo teórico de AN = 1: α = 90°, sin α = 1, naire = 1•Práctico: AN máx. = 0.95 ángulo de apertura ~ 72°•Máximo teórico AN = 1.51: α = 90°, sin α = 1, noil = 1.51
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Poder de Resolución
Distancia mínima entre dos puntos para que estos sean vistos como dos objetos individuales
R = λ / (NA objetivo + NA condensador)
Si luz verde λ = 550 nm , NA = 1.4 (para inmersión)
Entonces R = ?
R = λ /(2 NA)
Revolver
Ocular
Cabezal
Microscopio óptico
Objetivos
MacrométricoMicrométrico C d d
Platina
Ajuste de la platina
Brazo
Base
Micrométrico
Fuente de luz
Condensador
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Distancia de trabajo
Diafragma
Microscopía de campo claro
Campo claro Contraste de fases Campo Oscuro
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Microscopía de campo oscuroLa luz reflejada sobre el espécimen entra al
objetivo. Entonces observo el espécimen sobre unf dfondo oscuro.
Permite observar microorganismo vivos (sinteñir)
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Microscopía de contraste de fasesConvierte diferencias pequeñas en el n y la densidad
celular en variaciones de intensidad de luz fácilmentedetectadasdetectadas.
Permite observar microorganismo vivos (sin teñir) yseguir eventos dinámicos en células vivas (migración,división, etc.)
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Microscopía de Interferencia Diferencial (Nomarski)
Aprovecha los efectos de interferencia entre las ondas queatraviesan la célula, para crear una imagen de laestructura celular viva, nítida y tridimensional
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Célula epitelial de mejilla humana
Campo Claro Nomarski Campo Oscuro
Microscopía de fluorescencia
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Microscopía de fluorescencia
Sensibilidad: Mediantefluorocromos permite detectarla presencia de moléculas enbaja cantidad (DNA, proteínas)
Microscopía ConfocalCapacidad de obtener la imagen en secciones (planos)controlando la profundidad del espécimen.
Elimina el background !
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Microscopía Confocal vs
Microscopía de fluorescencia
FluorescenciaPierde detalle poralta señal de emisión
Confocal
Las secciones planopor plano permitenevidenciar diferenciasen estructuras
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MICROSCOPIODE LUZ
MICROSCOPIOELECTRONICO
Microscopía electrónica
Iluminación Haz de luz Haz de electrones
Longitud de onda 2000 Å - 7500 Å 370 nm
Lentes Vidrio Electromagnéticas
Medio Atmósfera Vacío
Resolución 0,2 um = 200 nm 0,0003 um = 0,3 nm
Magnificación 10 x - 2000 x 100 x - 450000 xMagnificación 10 x 2000 x 100 x 450000 x
Focalización Mecánica Eléctrica
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Microscopio electrónico de transmisión
Microscopio electrónico de barrido
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Microscopio de Fuerza Atómica
(AFM)
Microscopio de túnel de barrido
(Tunneling)
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PreparaciónPreparación de extendidos
y tinciones
Colorantes
Benzeno
+
Cromoforo
Solvente orgánico sin color
Grupo químico que imparteColor al solvente
Cromógeno
Colorante+
AuxocromoGrupo químico que permite la iniciacióndel cromóforo permitiendo la formaciónde sales y la unión a fibras y tejidos
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Tinción Simple Se utiliza para la visualización de lamorfología, el tamaño y la disposición
Tipos de
tinciones
Tinción Diferencial
g , y p
Separa entre grupos
Visualización de
Gram
Ácido alcohol resistentes
Flagelos
Cápsulaestructuras
Cápsula
Esporas
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Preparación de pun extendido
Tinción simple (procedimiento)
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Tinción negativa (procedimiento)
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Tinción de Gram
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Tinción de GramGram
Tinción de Ziehl-Neelsen
(BAAR)
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Tinción de Esporas (Schaeffer-Fulton)
Tinción de Esporas (Dorner)
Tinción de Cápsula
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Manipulación de cultivos