ESCUELA SUPERIOR POLITCNICA DEL LITORAL
FACULTAD DE INGENIERIA MECNICA Y CIENCIAS DE LA PRODUCCIN
INGENIERA EN ALIMENTOS
TEMA:Microscopio Electrnico
INTEGRANTES: Silvia Dayana Moreano Guijarro Kristhian Luis
Iniguez Gomez Daniel Alfredo Santos Palomino
PROFESORA: Msc. Mara Fernanda Morales Romo LerouxFECHA DE
ENTREGA: Lunes, 16 de Junio del 2014.
TRMINO I2014-2015INTRODUCCIN Histricamente el microscopio fue el
primero que permiti revelar los secretos de la estructura celular y
todava hoy contina siendo un instrumento muy valioso en biologa
celular.La microscopia es la tcnica de producir imgenes viables de
estructuras o detalles demasiado pequeos para ser percibidos a
simple vista. En la microscopia se evidencian los grandes aportes
que la fsica ha hecho a la biologa y como esta ha ido dando lugar a
nuevos cambios en el desarrollo de otras ciencias.El estudio
detallado de los componentes de clulas y tejidos animales o
vegetales, por el tamao que poseen, requiere el uso de instrumentos
que permitan ampliar muchas veces ms la imagen de las estructuras
que los constituyen. El instrumento que fue empleado por los
primeros bilogos para estudiar la clula y los tejidos, es el
microscopio. El nombre deriva etimolgicamente de dos races griegas:
mikrs, que significa pequeo y skopoo, que significa observar. Es
decir el microscopio es un instrumento que sirve para observar
objetos o estructuras pequeas. Existen dos tipos de microscopios,
el de luz (ptico) y el electrnico, segn el principio en que se base
la amplificacin. Para el examen microscpico de los microorganismos
se puede utilizar el microscopio ptico o el microscopio electrnico.
El desarrollo del microscopio electrnico es uno de los mayores
logros de fsica aplicada del siglo XX, y ha venido a revolucionar
el conocimiento en diversas ramas.Sin este instrumento no sera
posible estudiar la estructura interna de microorganismos como las
bacterias o la forma y tamao de los virus. Con l se consiguen
aumentos de hasta 500.000 dimetros, de manera que permite ver
estructuras aun de tamao molecular, el poder de resolucin es
muchsimo mayor al del microscopio ptico.El microscopio electrnico
funciona mediante un principio similar al del microscopio ptico.
Utiliza un flujo de electrones en lugar de un haz de luz. El haz de
electrones es enfocado por lente electromagnticos y el objeto en
estudio se interpone de manera que interacta con dicho haz y se
proyecta una imagen que se registra en una pantalla sensible a los
electrones.Es decir, la imagen de los objetos no se observa
directamente, como en el microscopio de luz, sino que la imagen se
forma en una pantalla. De la imagen se obtienen electromicrografias
las cuales son muy tiles para llevar a cabo estudios especializados
sobre los detalles estructurales del objeto que se est
analizando.Existen varios tipos de microscopia electrnica:
microscopa electrnica de transmisin, microscopa electrnica de
barrido, microscopia de fuerza atomica.Por la naturaleza de este
instrumento, solo en objetos extremadamente delgados se pueden
observar detalles estructurales internos. Por lo tanto se requiere
de tcnicas especializadas para preparar muestras por observar.A
pesar de las grandes ventajas que ofrece la microscopia electrnica,
tambin tiene sus limitaciones. Por ejemplo, las clulas no se pueden
estudiar vivas. Adems, los procedimientos de preparacin de la
muestra pueden alterar algunas de las caractersticas de las clulas.
Debido a esto los resultados de la microscopia electrnica deben ser
interpretados solo por los especialistas en este campo y con
ciertas preocupaciones.Estos tipos de microscopios se utilizan para
propsitos especiales o en el desarrollo de trabajos de
investigacin. Sin embargo, los estudiantes conocemos de sus
aplicaciones porque cada uno tiene propiedades convenientes para
demostrar estructuras morfolgicas especficas y porque adems es un
instrumento que formar parte en el desarrollo prctico y
experimental de nuestra especializacin.A partir de nuestra
investigacin se pudo conocer sobre el funcionamiento del
microscopio electrnico, se estudiaron sus componentes mecnicos, sus
sistemas pticos y de iluminacin, su amplificacin y poder de
resolucin y los tipos de microscopios tanto pticos como electrnicos
que se utilizan en la actualidad. Se pudieron establecer
diferencias entre ambos microscopios y cules son sus funciones en
el desarrollo de la investigacin microbiolgica. Se concluy que el
microscopio es un instrumento utilizado no solo en las reas de
biologa y microbiologa sino en todas las ciencias experimentales
que han logrado un gran avance tecnolgico en nuestra vida diaria y
que gracias a este se podrn seguir dando nuevos cambios y
descubrimientos en todas las reas cientficas.
CUERPO DE LA INVESTIGACIN MICROSCOPIO ELECTRNICO El microscopio
electrnico tiene una capacidad mxima de mostrar detalles de la
imagen de un objeto (poder de resolucin), cuando entre ellos existe
una distancia aproximada de 0.2 de micrmetro. Este tipo de
microscopio es incapaz de ofrecer un poder de resolucin mayor
porque existen dos factores limitantes: la longitud de onda de la
energa luminosa utilizada y la apertura numrica (A.N.) de la lente
del objetivo. La nica manera de aumentar el poder de resolucin de
un microscopio era encontrar energa radiante con longitudes de onda
menores a las que posee el espectro radiante visible.En 1930, el
fsico De Broglie, basndose en estudios tericos predijo que los
electrones, emitidos bajo ciertas circunstancias, como en el vaco,
por ejemplo, podan desplazarse y comportarse como ondas de energa.
Comprobada esta teora, entre 1932 y 1934, Knoll y Ruska, junto con
otros cientficos desarrollaron un microscopio electrnico, en el que
mediante la aplicacin de energa elctrica de alto voltaje a un
electrodo metlico, se emitan haces de electrones con longitudes de
onda que en un principio no lograron sobrepasar el poder de
resolucin del microscopio electrnico pero que, en el ao de 1938,
despus de una serie de innovaciones como el fabricar y adicionarle
un condensador que orientaba, concentraba y aceleraba la marcha del
haz de electrones emitidos, les permiti alcanzar imgenes con un
poder de resolucin cercano a los 10 nanmetros (100). La longitud de
onda de los electrones emitidos por el electrodo metlico (ctodo),
depende del voltaje aplicado, es decir, a mayor voltaje utilizado
menor ser la longitud de onda del haz de electrones.Los haces de
electrones emitidos por el ctodo se desplazan en todas las
direcciones del espacio, por lo tanto es necesario reorientarlos y
acelerar su desplazamiento. Esto se consigue con un nodo colocado
en las cercanas de la emisin que genera un alto potencial elctrico
positivo. Funcionamiento del microscopio electrnicoEl
funcionamiento del microscopio electrnico se basa en dos
caractersticas de los electrones: primera, los electrones presentan
propiedades ondulatorias, asocindose la longitud de onda en forma
inversamente proporcional a la velocidad de desplazamiento de
estos; segunda, el rayo de electrones puede ser enfocado pasndolo a
travs de un campo magntico.Cuando un haz de electrones en el vaco
incide sobre un objeto, las partculas que lo tocan pueden ser
absorbidas, transmitidas o modificadas de distinta manera sus
frecuencias.Permite evidenciar la estructura biolgica. La imagen se
basa en la dispersin de electrones, que depende del espesor y
densidad molecular del objeto y, sobre todo, del nmero atmico.
Tambin se producen electrones secundarios y fluorescencia de rayos
X. La fuente de iluminacin es un haz de electrones procedentes de
un ctodo luminiscente. Las lentes son campos magnticos. Los tomos
de las estructuras biolgicas tienen bajo nmero atmico, por lo que
dan poca imagen y, por ello, se les aaden tomos pesados (tcnica de
bombardeo metlico con Osmio, Uranio, Oro). Tambin se usa la tcnica
de coloracin negativa (embebiendo el espcimen con un material denso
como el fosfotungstato).Tiene ms poder de resolucin que el
microscopio ptico. La resolucin aumenta con la velocidad del
electrn y con el voltaje, por tanto. Consigue alcanzar hasta los
200.000 aumentos, con un poder de resolucin inferior a los 10nm.
Hay que tener en cuenta que cualquier partcula puede detener el
paso de electrones, con lo que la observacin ha de realizarse
colocando la muestra en un tubo vaco, lo que limita las muestras a
analizar. Las preparaciones deben ser ultrafinas y teidas con
sustancias especiales que dispersen bien los electrones.Los
microscopios electrnicos se clasifican, de acuerdo con la forma en
que son expuestos los detalles del espcimen, en: Microscopia
electrnica de transmisin (TEM) Microscopia electrnica de barrido, o
de exploracin electrnica (SEM)En los dos primero tipos, los
electrones libres son disparados a partir de una fuente y actan
sobre los ncleos atmicos del espcimen, mientras que en los de
emisin, el espcimen en si es la fuente de radiacin. El microscopio
electrnico de emisin no es de gran utilidad para estudios
biolgicos; los que ms se utilizan son el de transmisin y el de
rastreo.Un microscopio ptico ordinario consta de una fuente de luz,
un condensador para concentrar la luz sobre o cerca del objeto, un
soporte para el objeto, una lente objetivo para concentrar la
imagen y un ocular para proyectar la imagen formada por el objetivo
sobre el ojo, o una pelcula fotogrfica. Todo es vlido para el
microscopio electrnico, con la diferencia de que la luz esta
reemplazada por un haz de electrones, el soporte del objeto es una
tela metlica que se conoce con el nombre de rejilla y las lentes
son electroimanes y no lentes de vidrio.El microscopio electrnico
presenta tres caractersticas diferentes del microscopio ptico. En
primer lugar, como los electrones no pueden recorrer grandes
distancias a travs del aire, toda las columna del microscopio debe
encontrarse en condiciones de alto vaco; en consecuencia el objeto
siempre debe estar deshidratado y, por lo tanto, muerto. En segundo
lugar debido a que la amplificacin que resulta de una lente
electromagntica es proporcional al campo magntico, que a su vez es
proporcional a la corriente en las bobinas, la amplificacin puede
variarse de forma continua variando la corriente que atraviesa las
bobinas de las lentes. En el microscopio la amplificacin viene
fijada por la forma de la lente de vidrio; por lo tanto se
necesitan muchos objetivos para cubrir la escala de aumentos. En
tercer lugar, ninguna de las aberraciones primarias puede ser
corregida en las lentes en las lentes electromagnticas estndar,
porque las lentes magnticas son siempre convergentes.Para reducir
la aberracin esfrica y mejorar as la calidad de la imagen, las
lentes se manejan con aperturas numricas muy pequeas. Cmo se logra
las amplificaciones en un microscopio electrnico? La imagen se
forma por lo que se denomina con frecuencia como accin sustractiva
de la muestra. Esto es, los tomos del objeto dispersan algunos
electrones. La pauta de esta prdida de electrones, produce el
modelo de la imagen (de forma similar a cmo se reduce la intensidad
de la luz por la absorcin del objeto en un microscopio ptico). La
lente objetivo, ajustada de forma que la muestra se encuentre en su
punto focal, vuelve a enfocar el haz para producir una imagen. Esta
imagen sufre a continuacin un proceso de amplificacin, en varias
etapas, que se realiza por medio de tres lentes electromagnticas,
las lentes de difraccin, intermedia y de proyeccin. La lente de
proyeccin final forma la imagen sobre una pantalla fluorescente o
una placa fotogrfica.El lmite de resolucin del microscopio ptico
es, aproximadamente, de unos 200nm, el cual no es suficiente para
observar orgnulos celulares, virus y macromolculas de inters
actual. Ello es posible no obstante, mediante el empleo del
microscopio electrnico, cuyo lmite de resolucin, bajo condiciones
especiales, es menor que el dimetro de un tomo de uranio
(aproximadamente 0.5nm).Pocos aparatos presentan tan desconcertante
cantidad de botones y contadores como el microscopio electrnico;
adems pocas tcnicas requieren una mayor habilidad y atencin a los
detalles. Sin embargo, el uso del instrumento es sencillo en la
mayor parte de sus aplicaciones y la preparacin de muestras no es
complicada. Fig. 1.- Relaciones entre los tamaos de diversas
muestras y la resolucin del ojo humano, el microscopio ptico y el
microscopio electrnico.
MICROSCOPIO ELECTRNICO DE TRANSMISIN Y DE BARRIDO
Fig. 2.- Microscopio electrnico de trasmisin y de barrido.
Microscopio Electrnico de Transmisin (MET) El microscopio
electrnico ms sencillo es muy similar al microscopio ptico. Ambos
tienen lentes y condensadores para concentrar la iluminacin sobre
la muestra. Los rayos de iluminacin atraviesan la muestra y son
enfocados por las lentes del objetivo y de proyeccin para forma una
imagen aumentada sobre una pantalla fluorescente. Sin embargo el
microscopio electrnico es mucho ms complejo. El desarrollo del MET
nace de la necesidad de observar los ms diminutos detalles de las
estructuras biolgicas, lo que se logra por el altsimo poder de
resolucin que se obtiene con la longitud de onda del flujo
iluminado de electrones.El microscopio electrnico de transmisin est
constituido bsicamente por cuatro sistemas que son:1. Sistema ptico
electrnico2. Sistema de haz de electrones3. Sistema de deteccin y
amplificacin4. Sistema de exhibicinEste aparato, al igual que los
microscopios pticos, proporciona una imagen en dos dimensiones; la
alta resolucin y magnificacin que se obtiene est en funcin de la
utilizacin de cortes ultrafinos (50-1000 A de espesor), debido a
que la formacin de la imagen depende de los electrones
transmitidos.En fitopatologa, el MET se utiliza bsicamente para
conocer las interacciones entre una planta y sus patgenos, a nivel
de ultraestructura. Tambin, con tcnicas especiales, permite el
estudio de partculas de virus, bacterias, etc.En trminos generales,
la preparacin de muestras para ser observadas en el MET consta de
las siguientes fases: Seleccin adecuada de muestras Fijacin de las
muestras Pretincin Infiltracin Inclusin Seccionamiento Tincin
Montaje Recubrimiento ObservacinTambin en este caso los tiempos y
concentraciones de todos los compuestos utilizados varan de acuerdo
con la naturaleza del material que se va a observar.El sistema
central del microscopio electrnico incluyendo la pantalla
fluorescente y el equipo fotogrfico, lo constituye un tubo hueco.
El equipo elctrico que suministra la corriente necesaria se halla
generalmente situado a una cierta distancia para evitas la
interferencia de los campos magnticos dispersados. La mayora de los
microscopios estn equipados con dispositivos de seguridad que no
permiten conectar el filamento de alto voltaje hasta que no se ha
conseguido de vaco apropiado. Las lentes magnticas del microscopio
electrnico estn formadas por imanes en forma de herradura. El imn
puede ser permanente o de tipo electromagntico. Componentes del
microscopio electrnico de transmisin (TEM) Can electrnico: El tipo
ms [usado de can electrnico consiste de un filamento de alambre de
tungsteno doblado en forma de V. El electrodo de control se
denomina cilindro de Wehndt, y tiene una apertura circular de 1 a 3
mm de dimetro centrada en el pice del filamento. La superficie
cncava hace las funciones de nodo, y utilizando una superficie
convexa la imagen de la fuente electrnica puede reducirse en tamao
respecto al electrodo cncavo. La intensidad total de haz de ctodo a
nodo puede ser de 10 a 400 microamperios, pero solamente una pequea
fraccin die ste llega hasta la muestra. Condensadores: Los idos
condensadores son capaces de dar una amplia gama de intensidad
ajustando el can electrnico. Esto reduce el rea iluminada en la
muestra. Sin embargo, otras partes de la muestra tambin sufren los
efectos del haz electrnico. El primer condensador reduce la imagen
de la fuente mientras que el segundo condensador obtiene la
adecuada intensidad de iluminacin. Plataforma para la colocacin de
la muestra: La plataforma para colocar la muestra est situada en
frente del objetivo. Se introduce la muestra en la columna del
microscopio a travs de una abertura. Objetivo: El objetivo es la
lente ms importante en el microscopio electrnico. La distancia
focal de esta lente est comprendida entre 1 y 5 milmetros, siendo
1,1 mm la ms frecuente. Cuanto menor es la distancia focal, mayor
es la resolucin. Debido a que el haz de imagen tiene la mxima
apertura angular en el primer objetivo, esta lente controla la
calidad de la imagen producida. Se puede corregir la aberracin
esfrica usando un "stigmator", que es un dispositivo que permite,
introducir metal para compensar la homogeneidad inherente de la
lente, y obtener elevada resolucin. Otro accesorio importante,
permite regular la apertura del objetivo, la cual limita la
dispersin de los electrones, evitando as la degradacin de la
imagen. Esta apertura mejora el contraste siendo 20 y 40 micrmetros
(pm) los ms frecuentes. Lente intermedia: La lente intermedia puede
aumentar o disminuir la imagen. Se puede conseguir esto, aumentando
o disminuyendo la potencia de la corriente a esta lente. Lente de
proyeccin: La lente (de proyeccin corresponde al ocular del
microscopio ptico. Su funcin es la de proyectar la imagen real
sobre la pantalla fluorescente, y permite una amplia gama de
aumentos. Se puede variar la ampliacin de 100 X hasta 300.000 X
usando lentes intermedias y de proyeccin. Cmara de observacin: La
cmara de observacin y la pantalla fluorescente estn situadas en el
fondo de la columna. La imagen se enfoca sobre un punto marcado y
el enfoque fino se consigue con unos binoculares de 6 y 20 X. El
dimetro del punto de enfoque es de 100 ,pm, por 10 tanto la imagen
debe ser mayor que [este dimetro para ser resuelta. La cmara de
observacin est protegida por un vidrio grueso de plomo para evitar
la emisin de rayos X. Cmara fotogrfica: La cmara fotogrfica est
situada debajo de la pantalla fluorescente. La pantalla
fluorescente est sujetada por m lado, y al quitar el paso del haz
electrnico la imagen se centra sobre la pelcula fotogrfica. Se
pueden usar varios tipos de pelculas y placas de vidrio.
Microscopio Electrnico de Barrido (SEM) La observacin de un
espcimen en un MER se logra porque el aparato emite una cortina
delgada de electrones que lo barren haciendo resaltar con muchas
nitidez los detalles de su superficie. Debido a lo anterior, a este
tipo de microscopio electrnico se le llama tambin barrido.El
principio del microscopio electrnico de rastreo consiste, como en
el caso de la televisin, en hacer coincidir punto por punto la
superficie del objeto que se est observando con la de la pantalla
fluorescente; las imgenes dadas por los electrones secundarios, los
retrodifundidos y los absorbidos, son recogidas por captores
especiales y proyectadas en la pantalla fluorescente del aparato.Se
llaman electrones secundarios a los que son sacados de sus orbitas
por el bombardeo incidente; permiten formar una imagen completa y
no selectiva de tal o cual objeto, o bien dar una curva espectral
de anlisis.Fig. 3.- Esquema de funcionamiento de un microscopio
electrnico de barrido.
La metalizacin de la superficie de la muestra permite mejorar la
emisin de electrones, porque equilibra las tensiones de polarizacin
superficial y compensa los valores dbiles de masa atmica de algunos
componentes del objeto que se est observando; por otra parte, los
componentes de la emisin secundaria hacen variar el contraste de la
imagen. Todo lo anterior da como resultado la formacin de una
imagen en relieve, anloga a la que se observa en un microscopio
ptico estereoscpico; es decir, el microscopio electrnico de rastreo
proporciona una imagen en tres dimensiones, debido a que los
electrones no pasan a travs del objeto, lo que permite observar
muestras ms gruesas que en el microscopio electrnico de transmisin
(MET); adems, la profundidad de campo es mayor que en el de
transmisin, donde es considerablemente afectada por el grosor de la
muestra.La preparacin del material biolgico para ser observado en
el MER consiste bsicamente de los siguientes pasos: Fijacin
Postfijacin con tetraxido de osmio Deshidratacin de una serie
graduada de alcohol etlico a 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90,
95, y 100%. Secado por punto crtico en CO2 lquido Metalizacin con
oro, oro-paladio u otros metales preciosos Observacin al MER para
seleccionar los detalles de la muestra Fotografiar los detalles que
interesanLos tiempos y concentraciones de las diferentes soluciones
que se utilizan dependen de la naturaleza del material que se desea
observar.Cuando una muestra solo pretende estudiar las estructuras
externas de un organismo no son necesarios los cortes ultrafinos,
pudindose realizar la observacin de las clulas intactas o de los
componentes celulares de modo directo por MET tras una tcnica
denominada tincin negativa. Por otra parte, se puede utilizar el
microscopio electrnico de barrido (MEB). La muestra a estudiar
mediante este instrumento primero se recubre con una fina capa de
metal pesado, como el oro. El haz de electrones desviados por la
capa de metal son recogidos y proyectados sobre una pantalla para
producir una imagen. En el MEB se pueden observar muestras de
cierto tamao y la profundidad de campo es excelente. Adems, permite
obtener un amplio rango de aumentos, desde 15 hasta 100.000 veces,
pero solo se puede ver la superficie de los objetos. Todos los
microscopios electrnicos incorporan cmaras que permiten fotografiar
las muestras. Este tipo de fotografas se denominan micrografas
electrnicas.Los componentes principales del microscopio de barrido
SEM son los siguientes: Puente de energa: La fuente de energa del
microscopio electrnico de barrido depende de varios factores,
siendo los ms importantes el voltaje de aceleracin, la intensidad
de la corriente y al dimetro de haz. Para usos prcticos debe
asegurarse una alta estabilidad de la corriente. Porta muestras: La
muestra montada sobre un soporte puede moverse en tres direcciones,
ser calentada, enfriada, estirada, etc. dentro del instrumento.
Para de estudio de ciertos tipos de muestras tales como, metales,
minerales, semiconductores, se requiere calefaccin de la muestra.
La calefaccin puede conseguirse por medio de un hilo incandescente
o calentando la muestra en un crisol aplicando directamente a la
muestra una corriente elctrica.Caractersticas de SEM Las
caractersticas ms importantes de SEM son: poder de resolucin,
profundidad del campo y contraste. Poder de resolucin El poder de
resolucin en el microscopio electrnico de barrido (SEM) depende de
varios factores, tales como la dimensin del haz de electrones, la
difusin del mismo en la muestra antes de la misin de los electrones
secundarios, y la corriente estabilizada de la lente. La dimensin
del haz puede reducirse de muchas formas. Se pueden ampliar
filamentos apuntados o usando elevado potencial de Kv. Por ejemplo
a potencia de 1 Kv, la resolucin es 140 nm., mientras que a 30 Kv,
la resolucin les 20 nm (200 A). Se puede prevenir la difusin del
haz de electrones en la muestra, aumentando la potencia de la
corriente. Finalmente, la alimentacin de corriente debe ser muy
estable, del orden de 1 parte en 100.000, para conseguir alta
resolucin. Sistema de amplificacin del microscopio de barridoEl
sistema de amplificacin recoge seales y procesa la informacin
procedente de la muestra, al mismo tiempo que el haz de electrones
barre la muestra.El generador de barrido est conectado al tubo de
rayos catdicos para que el haz de electrones en este tubo sea
barrido en la misma forma que el haz principal. Sin embargo la
potencia de la corriente suministrada a la columna principal para
de barrido puede ser atenuada mientras que el tubo de la pantalla
es barrido sobre una rea constante. Como consecuencia de ello,
cualquier reduccin en el rea de muestra barrida da lugar a un
aumento de la imagen. Este aumento viene determinado por la relacin
del rea de la pantalla del tubo respecto al rea de la muestra
barrida.Aplicaciones Microscopia electrnica de barridoSe utiliza en
todas las ramas de la ciencia que tienen por estudio la morfologa
de la muestra, siempre que sean resistentes a un alto vaco. Estudio
de poblaciones celulares del sistema inmunitario y sanguneo. Se
tipifican nuevos patrones morfolgicos de superficie que definen
distintos casos de leucemia. Aplicacin a los procesos de
biomineralizacin, tejidos duros, pues no es necesaria la
descalcificacin. Aplicacin para el estudio microvascular de
diferentes rganos y sistemas. Puede incorporar sistemas de deteccin
de energa dispersa de rayos X y electrones retrodispersos que se
combinan con tcnicas complementarias para hacer posible la
determinacin de diferentes elementos qumicos y su distribucin.
Permite visualizar estructuras artificiales teidas con elementos de
elevado nmero atmico, lo que permite localizar las actividades de
las enzimas y el anlisis de antgenos y receptores de superficie
celular mediante tcnicas inmunocitoqumicas y de oro coloidal.TIPOS
DE MICROSCOPIOS OPTICOSFig.4.- Microscopio ptico (MO) de campo
claro, de campo oscuro y de contraste de fase.
Microscopio SimpleEs aquel que solo utiliza un lente de aumento
al contrario del Microscopio ptico estndar, que posee varias lentes
de aumento. Es el microscopio ms bsico. El ejemplo ms clsico es la
lupa.El microscopio ptico estndar utiliza dos sistemas de lentes
alineados. El objeto por observar se coloca entre el foco y la
superficie de la lente, lo que determina la formacin de una imagen
virtual, derecha y mayor cuanto mayor sea el poder diptrico del
lente y cuanto ms alejado est el punto prximo de la visin ntida del
sujeto.El microscopio simple aventaja al microscopio compuesto solo
en la luminosidad, pues sta es ms amplia y por ello se notan menos
los inconvenientes de la esfericidad y cromaticidad de que adolecen
los microscopios compuestos cuando no estn equipados con lentes de
superior calidad.
El holands Anton van Leeuwenhoek construy microscopios muy
eficaces basados en una sola lente. Esos microscopios no padecan
las aberraciones que limitaban tanto la eficacia de los primeros
microscopios compuestos, como los empleados por Robert Hooke, y
producan una ampliacin de hasta 300 veces; gracias a ellos
Leeuwenhoek fue capaz incluso de describir por primera vez las
Bacterias.Microscopio de campo oscuroSe denomina as porque la
imagen que se forma est constituida por una serie de estructuras
brillantes sobre un fondo oscuro. El microscopio de campo oscuro se
utiliza para examinar microorganimos vivos que no son visibles con
el microscopio ptico comn, que no pueden teirse con los mtodos
estndares o que resultan tan distorsionados por la tincin que sus
caractersticas no pueden identificarse. En lugar del condensador
normal el microscopio de campo oscuro tiene un condensador especial
que incluye un disco opaco. El disco bloquea la luz que llegara
directamente al objetivo, en el que solo ingresa la luz reflejada
por la muestra. Como no hay una luz de fondo negro, es decir el
campo oscuro. El principio ptico de este microscopio es el de
aprovechar un conjunto de rayos luminosos oblicuos que inicialmente
no entran a la lente frontal del objetivo, observndose el campo
microscopio totalmente oscuro. Para que esto ocurra se requiere en
primer lugar que la apertura numrica del condensador sea mayor que
la apertura numrica del objetivo. Esta condicin facilita que los
rayos luminosos directos provenientes de la fuente luminosa sean
impedidos de entrar a la porcin central de la lente del condensador
y solo penetren y emerjan de l, los rayos perifricos que al
refractarse se hacen oblicuos. Cuando estos rayos oblicuos
encuentran en su recorrido, alguna partcula, son desviados hacia la
lente frontal del objetivo y la imagen de la partcula se observa
brillante en medio de un fondo oscuro. El microscopio de campo
oscuro se emplea para ver clulas vivas (protozoarios, bacterias,
clulas descamadas, etc.) en las cuales no se han aplicado
sustancias fijadoras ni colorantes. Tambin se observan partculas de
un tamao inferior a los 0.2 de micrmetro; esto se debe a que los
rayos de luz oblicuos que inciden en ellas forman un halo luminoso
brillante alrededor de las mismas. Mediante el empleo de este
microscopio se distinguen con facilidad la forma y el movimiento
helicoidal que muestra la espiroqueta Treponema pallidum, una
bacteria causante de la sfilis.Microscopia de Contraste de FaseLos
microorganismos tambin pueden observarse con un microscopio de
contraste de fase, que es especialmente til porque permite la
observacin detallada de estructuras internas en los microorganismos
vivos. Adems, no es necesario fijar ni teir la muestra,
procedimientos que podran distorsionar o destruir a los
microorganismos.El principio de la microscopia de contraste de fase
se basa en la naturaleza ondulatoria de los rayos de luz y en el
hecho de esos rayos pueden estar en fase o fuera de fase. Si el
pico de la onda de los rayos de luz de una fuente coincide con el
pico de la onda de los rayos de luz de otra fuente, los rayos
interactan para producir un reforzamiento. En cambio, si el pico de
la onda de una fuente de luz coincide con la depresin de la onda de
otra fuente de luz, los rayos interactan para producir
interferencia. En un microscopio de contraste de fase un conjunto
de rayos luminosos proviene directamente de la fuente de luz. El
otro conjunto proviene de la luz que se refleja o difracta por una
estructura particular de la muestra. Cuando los dos conjuntos de
rayos de luz- rayos directos y rayos reflejados o difractados- se
unen forman una imagen de la muestra en el ocular, que contiene
reas que van desde relativamente luminosas a matices de gris hasta
el negro. En la microscopia de contraste de fase las estructuras
internas de una clula se definen con mayor claridad.Microscopio de
Fluorescencia o de Radiacin UltravioletaEl microscopio de
fluorescencia aprovecha las ventajas de la fluorescencia, es decir
la capacidad de ciertas sustancias de absorber luz de longitudes de
onda corta (ultravioleta) y emitir una luz de una longitud de onda
mayor (visible). Algunos organismos fluorescen naturalmente bajo la
luz ultravioleta; si la muestra que se debe examinar no fluoresce
de modo natural, se la tie con alguno de los colorantes
fluorescentes denominados fluorocromos. Cuando los microorganismos
teidos con un fluorocromo se examinan mediante un microscopio de
fluorescencia con una fuente de luz ultravioleta o cercana a ella
aparecen como objetos luminiscentes y brillantes contra un fondo
oscuro.El uso principal de la microscopia de fluorescencia es una
tcnica diagnstica denominada inmunofluorescencia (IF) o tcnica con
anticuerpos fluorescentes. Los anticuerpos son molculas de defensa
naturales que producen los seres humanos y varias especies de
animales en respuesta a una sustancia extraa o antgeno. Los
anticuerpos fluorescentes contra un antgeno particular se obtienen
del siguiente modo: se le inyecta a un animal un antgeno especfico,
como por ejemplo una bacteria, y el animal comienza a producir
anticuerpos especficos contra ese antgeno. Despues de un tiempo
suficiente se extraen los anticuerpos del suero del animal. A
continuacin se combinan qumicamente el fluorocromo con los
anticuerpos. Estos anticuerpos fluorescentes se agregan luego a un
portaobjetos que contiene una bacteria desconocida. Si esa bacteria
desconocida es la misma que se le inyecto al animal, los
anticuerpos fluorescentes se unen a los antgenos presentes en la
superficie de la bacteria y determina que esta parezca
fluorescente.Requerimientos para el microscopio de fluorescencia
Fuente de luz: Se necesita una intensa fuente de luz para excitar
la fluorescencia en el espectro especfico de cada fluorocromos. Hay
que tomar en cuenta que la fluorescencia es pasajera y la
iluminacin produce un efecto de fotoblanqueo en el fluorocromo;
adems, las clulas vivas pueden ser daadas por la intensa radiacin.
La luz debe ser de una longitud de onda corta. Se emplean lmparas
de mercurio a alta presin que funcionan de un modo diferente a las
lmparas de filamentos incandescentes. Tambin se utiliza luz
ultravioleta y rayos laser. Muchos modelos funcionan con
epi-iluminacin. Filtros: Son los que permiten el paso de luz de una
determinada longitud de onda, la del rango y color necesario para
excitar al fluorocromo y bloquean las longitudes no deseadas. Una
vez filtrada, la luz incide sobre el espcimen por reflexin de un
espejo dicroico (epi-iluminacin) y es nuevamente filtrada para
poder ser observada. Objetivos: Deben tener gran capacidad para
transmitir la luz y proveer una imagen de alta calidad. De igual
manera deben poseer una gran apertura numrica.La microscopa de
fluorescencia ha permitido avanzar de manera sorprendente en la
investigacin de procesos fisiolgicos celulares que mediante otros
procedimientos no hubiera sido posible realizar. La fluorescencia
permite demostrar, por la radiacin luminosa que emiten, partculas
sumamente pequeas que con otros tipos de microscopios fotnicos no
son fciles de visualizar. En este tipo de procedimiento es
indispensable obtener el registro fotogrfico de las imgenes
obtenidas. Esta tcnica, que permite detectar bacterias u otros
microorganismos patgenos, incluso dentro de clulas, tejidos u otras
muestras clnicas, posee una importancia extraordinaria porque con
ella se puede identificar un microbio en el trmino de minutos. La
inmunofluorescencia es especialmente til en el diagnstico de la
sfilis y de la rabia.Tabla 1.- Resumen de los diversos tipos de
MicroscopiosRESUMEN DE LOS DIVERSOS TIPOS DE MICROSCOPIOS
Tipo de microscopioCaractersticas distintivasImagen tpicaUsos
principales
ptico (MO)
De campo claroUtiliza luz visible como fuente de iluminacin; no
puede resolver estructuras con un tamao menor de 0,2um; la muestra
aparece contra un fondo claro. Su uso es econmico y sencillo.Para
observar diversas muestras teidas y contar microbios, no resuelve
elementos pequeos como los virus.
De campo oscuroUtiliza un condensador especial con un disco
opaco que bloquea la luz que llega directamente al objetivo; solo
ingresa en el objetivo la luz reflejada por la muestra y la muestra
aparece iluminada contra un fondo negro.Para examinar
microorganismos vivos que son invisibles en la microscopia de campo
claro, no se tien con facilidad o se distorsionan con la tincin; se
utiliza con frecuencia para detectar Treponema pallidum de la
sfilis.
De contraste de faseUtiliza un condensador que contiene un
diafragma anular. El diafragma permite que la luz directa del
condensador pase, se enfoque la luz sobre la muestra y en una placa
de difraccin en la lente objetivo. Los rayos de luz directos y
reflejados o difractados se unen para formar la imagen.
Para facilitar la observacin de las estructuras internas de
muestra viables.
De contraste por interferencia diferencialComo el contraste de
fase, emplea las diferencias en los ndices de refraccin para
producir la imagen. Utiliza dos haces de luz separados por prismas;
la muestra aparece coloreada como resultado del efecto prisma.Para
proporcionar imgenes tridimensionales.
De fluorescenciaUtiliza una fuente de luz ultravioleta o cercana
a la ultravioleta que determina que los microbios que emiten luz en
una muestra aparezcan como fluorescentes.En tcnicas con anticuerpos
fluorescentes para detectar con rapidez e identificar microbios en
muestras de tejidos o clnicas.
Confocal
Utiliza luz por lser para iluminar un plano de la muestra por
vez.Para obtener imgenes bidimensionales y tridimensionales de
clulas para aplicaciones biomdicas.
Acstico de barrido (MAB)Utiliza una onda sonora de frecuencia
especfica que atraviesa la muestra con una porcin que se refleja
cuando la golpea.Para examinar clulas vivas adherida a otra
superficie, como clulas cancerosas, placa arterial y pelculas
biolgicas dentro del material.
Electrnico
De transmisin (MET)Utiliza un haz de electrones en lugar de luz;
los electrones atraviesan la muestra; dada la longitud de onda ms
pequea de los electrones, pueden resolverse estructuras menores de
0,2 um.
Para examinar virus o la ultraestructura interna en cortes
delgados de clulas.
De barrido (MEB)Utiliza un haz de electrones en lugar de luz,
los electrones se reflejan desde la muestra; dada la longitud de
onda ms pequea de los electrones, pueden resolverse estructuras
menores de 0,2 um.
Para estudiar las caractersticas de la superficie de clulas y
virus.
De sonda de barrido
Por efecto tnel (MBT)Utiliza una sonda delgada de metal que
recorre una muestra y produce una imagen que revela las
protuberancias y las depresiones de los tomos sobre la superficie
de la muestra. El poder de resolucin es mucho mayor que el de un
microscopio electrnico.
Proporciona imgenes muy detalladas de molculas dentro de las
clulas.
De fuerza atmicaUtiliza una sonda de metal y diamante que se
aplica con una fuerza suave a lo largo de la superficie de una
muestra. Proporciona una imagen tridimensional.Proporciona imgenes
de procesos moleculares y molculas biolgicas en detalle casi
atmico.
TCNICAS DE TINCINLa investigacin de procesos fisiolgicos
celulares que mediante otros procedimientos no hubiera sido posible
realizar. La fluorescencia permite demostrar, por la radiacin
luminosa que emiten, partculas sumamente pequeas que con otros
tipos de microscopios fotnicos no son fciles de visualizarLa mayora
de las observaciones iniciales de los microorganismos se realizan
con preparados teidos. El trmino tincin significa simplemente
colorear los microorganismos con un colorante que destaque ciertas
estructuras. Sin embargo antes de teir los microorganismos, se los
debe fijar (adherir) al portaobjetos. El proceso de fijacin produce
la muerte simultnea de los microorganismos y su adherencia al
portaobjetos. Tambin preserva diversas partes de los microbios en
su estado natural con una distorsin mnima.Cuando se debe fijar una
muestra se extiende una pelcula delgada del material que contiene
los microorganismos sobre la superficie del portaobjetos. Esta
pelcula, denominada extendido, se deja secar al aire. A continuacin
en la mayor parte de los procedimientos de tincin el portaobjetos
se fija pasndolo varias veces a travs de la llama de un mechero
Bunsen con el lado del extendido hacia arriba o cubrindolo con
alcohol metlico durante 1 minuto. Se aplica el colorante se lo lava
con agua y se lo seca con papel absorbente. Si no se realiza la
fijacin el colorante podra arrastrar los microorganismos al
portaobjetos. Una vez efectuado el procedimiento descrito, los
microorganismos estn listos para la observacin microscpica.Los
colorantes son sales compuestas por un in positivo y un in
negativo, uno de los cuales estn coloreados y se conoce como
cromforo. El color de los denominados colorantes bsico est en el in
positivo; en los colorantes cidos, est en el in negativo. En un pH
de 7 bacterias presentan una carga levemente negativa. Por lo
tanto, el in positivo coloreado en un colorante bsico es atrado
hacia la clula bacteriana con carga negativa. Los colorantes
bsicos, entre los que se encuentran el violeta de genciana, el azul
de metileno, el verde de malaquita y la safranina, se utilizan con
ms frecuencia que los colorantes cidos. Estos ltimos no son atrados
por la mayor parte de los tipos de bacterias porque la superficie
bacteriana con carga negativa repele los iones negativos del
colorante, de modo que este tie el fondo en lugar de la estructura
bacteriana. Los preparados bacterianos incoloros, contra un fondo
coloreado se denominan tincin negativa, una tcnica valiosa para la
observacin de las formas generales, los tamaos y las cpsulas
celulares porque las clulas resultan muy visibles contra un fondo
oscuro que contrasta. Las distorsiones del tamao y la forma de las
clulas se disminuyen al mnimo porque no se requiere fijacin y las
clulas no captan el colorante. Son ejemplos de colorantes cidos la
eosina, la fucsina cida y la nigrosina.Para aplicar los colorantes
cidos o bsicos los microbilogos emplean tres clases de tcnicas de
tincin: simple, diferencial y especial.TINCIONES SIMPLESUna tincin
simple es una solucin acuosa o alcohlica de un colorante bsico
nico. Aunque los diferentes colorantes se unen de forma especfica a
las distintas partes de las clulas, el propsito principal de una
tincin simple es destacar el microorganismo completo para que se
vean las formas y las estructuras celulares bsicas. El colorante se
aplica al extendido fijado durante un tiempo determinado y luego se
lava; a continuacin el portaobjetos se seca y se examina. En
ocasiones se agrega una sustancia qumica a la solucin para
intensificar la coloracin; este aditivo se denomina mordiente. Una
de las funciones de un mordiente es aumentar la afinidad de una
muestra biolgica por un colorante; otra es cubrir una estructura
(como un flagelo) para darle mayor espesor y facilitar las
observaciones despus del teido. Algunas de las tinciones simples
utilizadas con frecuencia en el laboratorio son el azul de
metileno, la carbolfucsina, el violeta de genciana (cristal
violeta) y la safranina.TINCIONES DIFERENCIALESA diferencia de las
tinciones simples, las tinciones diferenciales reaccionan de modo
diferente con las distintas clases de bacterias y por lo tanto
pueden ser empleadas para establecer una distincin entre ellas. Las
tinciones diferenciales utilizadas con ms frecuencia para las
bacterias son la tincin de GRAM y la tincin de cido-alcohol
resistencia.TINCIN DE GRAMLa tincin de GRAM fue desarrollada por el
bacterilogo dans Hans Christian Gram en 1884 y es uno de los
procedimientos de tincin ms tiles porque permite clasificar las
bacterias en dos grandes grupos: grampositivas y gramnegativos.
Fig. 5.- Tcnica de Tincin GRAM.
1. Un extendido fijado con color se cubre con un colorante
violeta bsico, por lo general violeta de genciana. Como el
colorante violeta imparte su color a todas las clulas, se lo
denomina colorante primario.2. Despus de un breve lapso, se escurre
el colorante violeta, se lava el extendido y se lo cubre con yodo,
un mordiente. Cuando se lava el yodo, tanto las bacterias
grampositivas como las gramnegativas aparecen de color violeta
oscuro o prpura.3. A continuacin se lava el portaobjetos con
alcohol o con una solucin de alcohol-acetona. Esta solucin es un
agente descolorante que elimina el color violeta de las clulas de
algunas especies pero no de otras.4. Se elimina el alcohol con agua
y se tie el portaobjetos con safranina, un colorante bsico. Luego
se vuelve a lavar el extendido, se lo seca con papel absorbente y
se lo examina con el microscopio.El colorante violeta y el yodo se
combinan en el citoplasma de cada bacteria y lo colorean de violeta
oscuro o prpura. Las bacterias que conservan este color despus de
haberles agregado el alcohol para descolorarlas se clasifican como
grampositivas; las bacterias que pierden el color violeta oscuro
despus de la decoloracin se clasifican como gramnegativas.Como las
bacterias gramnegativas son incoloras despus del lavado con
alcohol, dejan de ser visibles. Por ese motivo se les aplica el
colorante bsico safranina, que las convierte en rosadas. Los
colorantes como la safranina que tienen un color que contrasta con
el colorante primario se denominan colorantes de contraste. Dado
que las bacterias grampositivas conservan el colorante violeta
original, no son afectadas por el colorante de contraste
safranina.Las diferentes clases de bacterias reaccionan de modo
distinto frente a la tincin de Gram porque las diferencias
estructurales en sus paredes determinan la retencin o el escape de
una combinacin de violeta de genciana y de yodo, denominada
complejo violeta-yodo (CV-I). Fig. 6.- Imagen de bacteria
grampositiva.
Entre otras diferencias las bacterias grampositivas tienen un
peptidoglucano (disacridos y aminocidos) en su pared celular ms
grueso que las bacterias gramnegativas. Adems, las bacterias
gramnegativas contienen una capa de lipopolisacrido (lpidos y
polisacridos) como parte de su pared celular. Cuando se los aplica
tanto a clulas grampositivas como a clulas gramnegativas el violeta
de genciana y luego el yodo ingresa con facilidad en las clulas, en
cuyo interior se combinan para formar CV-I. Este complejo es ms
grande que la molcula de violeta de genciana que ingres en las
clulas y por su tamao, no puede ser eliminado por el agregado de
alcohol de la capa de peptidoglucano intacta de las clulas
grampositivas. Estas retienen el color del colorante violeta de
genciana. En cambio en las clulas gramnegativas el alcohol altera
la capa externa del lipopolisacrido y el complejo CV-I se elimina
de la capa delgada de peptidoglucano. Como consecuencia, las clulas
gramnegativas son incoloras hasta que se agrega el colorante de
contraste safranina, despus de lo cual aparecen de color rosado.En
sntesis, las clulas grampositivas retienen el colorante y
permanecen de color violeta. Las clulas gramnegativas no retienen
el colorante; son incoloras hasta que se las tie con un colorante
de contraste rojo.TINCIN DE CIDO-ALCOHOL RESISTENCIAOtra tincin
diferencial importante es la tincin de cido alcohol resistencia,
que se fija de modo firme solo a las bacterias que poseen ceras en
las paredes de sus clulas. Los microbilogos utilizan esta tincin
para identificar todas las bacterias del gnero Mycobacterium. Esta
tincin se utiliza para identificar las cepas del gnero
Nocardia.Fig. 7.- Bacterias cido-alcohol resistentes.
En este procedimiento de tincin se aplica el colorante rojo
carbolfucsina a un extendido fijado y se caliente suavemente el
portaobjetos durante varios minutos. Luego se enfra el portaobjetos
y se lo lava con agua. A continuacin el extendido se trata con cido
alcohol, un decolorante que elimina el color rojo de las bacterias
que no son cido alcohol resistentes. Los microorganismos cido
alcohol resistentes, retienen el color rojo porque la carbolfucsina
es ms soluble en los lpidos de la pared celular que en los cido
alcohol resistentes, en las bacterias que no son cido alcohol
resistentes las paredes carecen de componentes lipdicos y la
carbolfucsina se elimina con facilidad durante la decoloracin, lo
que deja a las cdulas incoloras. Luego el extendido se colorea con
azul de metileno, que acta como colorante de contraste. Las
bacterias que no son cido alcohol resistente aparecen azules despus
de la aplicacin del colorante de contraste.TINCIONES ESPECIALESLas
tinciones especiales se utilizan para colorear y aislar partes
especficas de microorganismos como endosporas y flagelos, y para
detectar la presencia de cpsulas.Fig.8.- Tincin Negativa.
TINCIN PARA ENDOSPORAS (ESPORAS)Una endospora es una estructura
especial, resistente y latente que se forma dentro de una clula y
que protege a una bacteria de las condiciones ambientales adversas.
Aunque las endosporas son relativamente inusuales en las clulas
bacterianas, pueden ser formadas por algunas bacterias. Fig. 9.-
Tincin de endosporas.
Las endosporas no se tien con los mtodos comunes como la tincin
simple y la tincin de Gram, porque estos colorantes no atraviesan
sus paredes. La ms utilizada para este fin es la tincin de
Schaeffer-Fulton para endosporas. Se aplica el colorante primario
verde de malaquita a un extendido fijado con calor y se lo calienta
hasta la emisin de vapores durante alrededor de 5 minutos. El calor
ayuda a que el colorante atraviese la pared de la endospora. Luego
se lava el preparado con agua durante cerca de 30 segundos para
eliminar el verde de malaquita de todas las parte de la clula
excepto las endosporas. A continuacin se aplica el extendido
safranina, un colorante de contraste, para teir las porciones de
las clulas distintas de las endosporas. En un extendido preparado
de modo adecuado aparecen verdes dentro de clulas rojas o
rosadas.TINCIN PARA FLAGELOSLos flagelos bacterianos son
estructuras de locomocin demasiadas pequeas para ser vistas con un
microscopio ptico sin tincin. Hay un procedimiento tedioso y
delicado que se basa en el empleo de un mordiente y el colorante
carbolfucsina para aumentar el dimetro de los flagelos hasta que se
tornen visibles con el microscopio ptico.Fig. 10.- Tincin de
flagelos.
Tabla 2.- Resumen de diversas tinciones y usosRESUMEN DE
DIVERSAS TINCIONES Y SUS USOS
TincinUsos principales
Simple (azul de metileno, carbolfucsina, violeta de genciana,
safranina)Utilizado para destacar microorganismos a fin de
determinar las formas y las disposiciones celulares. Las clulas se
tien con una solucin acuosa o alcohlica de un colorante bsico
solo.
Diferencial
GramUtilizada para distinguir entre clases diferentes de
bacterias. Clasifica las bacterias en dos grandes grupos:
grampositivas y gramnegativas. Las bacterias grampositivas retienen
el color del colorante violeta de genciana aparecen violceas. Las
bacterias gramnegativas no retienen el colorante violeta y
permanecen incoloras hasta que se aplica la safranina como
colorante de contraste y entonces se tornan rosceas.
Coloracin de cido-alcohol resistenciaUtilizada para distinguir
especies de Mycobacterium y algunas especies de Norcadia, las
bacetrias acido-alcohol resistentes, una vez teidas con
carbolfucsina y tratadas con cido-alcohol, retienen el colorante y
aparecen de color rojo. Las bacterias que no son acido-alcohol
resistentes, cuando se las tie y se las trata de la misma manera y
despus se las tie con azul de metileno, aparecen de color azul
porque pierden el colorante carbolfucsina y entonces puede aceptar
el colorante azul de metileno.
EspecialUtilizada para colorear y aislar varias estructuras,
como capsulas, endosporas y flagelos; a veces se la utiliza como
herramienta diagnostica.
NegativaUtilizada para demostrar la presencia de capsulas. Como
estas no aceptan la mayora de los colorantes aparecen como halos no
teidos alrededor de las clulas bacterianas y se destacan contra un
fondo que contrasta.
EndosporasUtilizada para detectar la presencia de endosporas en
las bacterias. Cuando se aplica verde de malaquita sobre un
extendido de clulas bacterianas fijadas con color, el colorante
penetra en el interior de las endosporas y las tie de verde. Cuando
a continuacin se aplica safranina, tie el resto de las clulas de
rojo o rosado.
FlagelosUtilizada para demostrar la presencia de flagelos. Se
usa un mordiente para aumentar los dimetros de los flagelos hasta
que puedan visualizarse por microscopia cuando se tian con
carbolfucsina.
Conclusiones El microscopio fue el primer instrumento que
permiti revelar los secretos de la estructura celular y aun en
nuestros das contina siendo un instrumento muy valioso en biologa
celular y en muchas ramas de estudio cientfico que han dado paso a
un exitoso avance en la tecnologa y al descubrimiento de muchas
experiencias nuevas para el ser humano. El microscopio se ha
convertido en una base fundamental para las ciencias experimentales
debido a que estas necesitan el uso de instrumentos que permitan
ampliar muchas veces ms la imagen de las estructuras que los
constituyen, por ejemplo en biologa se lo utiliza para el estudio
detallado de los componentes de clulas y tejidos animales o
vegetales y por el tamao que poseen, el microscopio es el
instrumento capaz de llevar a cabo esta tarea debido a su poder de
amplificacin y resolucin. Tiene ms poder de resolucin que el
microscopio ptico. La resolucin aumenta con la velocidad del
electrn y con el voltaje, por tanto. Consigue alcanzar hasta los
200.000 aumentos, con un poder de resolucin inferior a los 10nm. El
funcionamiento del microscopio electrnico se basa en dos
caractersticas de los electrones: primera, los electrones presentan
propiedades ondulatorias, asocindose la longitud de onda en forma
inversamente proporcional a la velocidad de desplazamiento de
estos; segunda, el rayo de electrones puede ser enfocado pasndolo a
travs de un campo magntico. La imagen en el microscopio electrnico
se basa en la dispersin de electrones, que depende del espesor y
densidad molecular del objeto y, sobre todo, del nmero atmico. Los
microscopios electrnicos se clasifican, de acuerdo con la forma en
que son expuestos los detalles del espcimen, en: Microscopia
electrnica de transmisin (MET) y Microscopia electrnica de barrido,
o de exploracin electrnica (SEM). El microscopio electrnico
presenta tres caractersticas diferentes del microscopio ptico. En
primer lugar, como los electrones no pueden recorrer grandes
distancias a travs del aire, toda las columna del microscopio debe
encontrarse en condiciones de alto vaco; en consecuencia el objeto
siempre debe estar deshidratado y, por lo tanto, muerto. En segundo
lugar debido a que la amplificacin que resulta de una lente
electromagntica es proporcional al campo magntico, que a su vez es
proporcional a la corriente en las bobinas, la amplificacin puede
variarse de forma continua variando la corriente que atraviesa las
bobinas de las lentes. En el microscopio la amplificacin viene
fijada por la forma de la lente de vidrio; por lo tanto se
necesitan muchos objetivos para cubrir la escala de aumentos. En
tercer lugar, ninguna de las aberraciones primarias puede ser
corregida en las lentes en las lentes electromagnticas estndar,
porque las lentes magnticas son siempre convergentes. El
microscopio electrnico de transmisin est constituido bsicamente por
cuatro sistemas que son: sistema ptico electrnico, sistema de haz
de electrones, sistema de deteccin y amplificacin y el sistema de
exhibicin. El microscopio electrnico de barrido (MEB) est compuesto
por: un can electrnico, condensadores, plataforma para la colocacin
de la muestra, objetivo, lente intermedia, lente de proyeccin,
cmara de observacin y una cmara fotogrfica. El microscopio
electrnico de barrido (MEB) consiste, como en el caso de la
televisin, en hacer coincidir punto por punto la superficie del
objeto que se est observando con la de la pantalla fluorescente;
las imgenes dadas por los electrones secundarios, los
retrodifundidos y los absorbidos, son recogidas por captores
especiales y proyectadas en la pantalla fluorescente del aparato.
En el MEB se pueden observar muestras de cierto tamao y la
profundidad de campo es excelente. Adems, permite obtener un amplio
rango de aumentos, desde 15 hasta 100.000 veces, pero solo se puede
ver la superficie de los objetos. El poder de resolucin en el
microscopio electrnico de barrido (SEM) depende de varios factores,
tales como la dimensin del haz de electrones, la difusin del mismo
en la muestra antes de la misin de los electrones secundarios, y la
corriente estabilizada de la lente. El sistema de amplificacin
recoge seales y procesa la informacin procedente de la muestra, al
mismo tiempo que el haz de electrones barre la muestra. El
generador de barrido est conectado al tubo de rayos catdicos para
que el haz de electrones en este tubo sea barrido en la misma forma
que el haz principal. Sin embargo la potencia de la corriente
suministrada a la columna principal de barrido puede ser atenuada
mientras que el tubo de la pantalla es barrido sobre una rea
constante. Como consecuencia de ello, cualquier reduccin en el rea
de muestra barrida da lugar a un aumento de la imagen. Este aumento
viene determinado por la relacin del rea de la pantalla del tubo
respecto al rea de la muestra barrida. El microscopio simple es
aquel que solo utiliza un lente de aumento al contrario del
microscopio ptico estndar, que posee varias lentes de aumento, es
el microscopio ms bsico. El microscopio de campo oscuro se utiliza
para examinar microorganimos vivos que no son visibles con el
microscopio ptico comn, que no pueden teirse con los mtodos
estndares o que resultan tan distorsionados por la tincin que sus
caractersticas no pueden identificarse. En lugar del condensador
normal el microscopio de campo oscuro tiene un condensador especial
que incluye un disco opaco. El disco bloquea la luz que llegara
directamente al objetivo, en el que solo ingresa la luz reflejada
por la muestra, la imagen de la partcula se observa brillante en
medio de un fondo oscuro. El principio de la microscopia de
contraste de fase se basa en la naturaleza ondulatoria de los rayos
de luz y en el hecho de esos rayos pueden estar en fase o fuera de
fase. En este microscopio un conjunto de rayos luminosos proviene
directamente de la fuente de luz. El otro conjunto proviene de la
luz que se refleja o difracta por una estructura particular de la
muestra. Los microorganismos tambin pueden observarse con un
microscopio de contraste de fase, que es especialmente til porque
permite la observacin detallada de estructuras internas en los
microorganismos vivos. Adems, no es necesario fijar ni teir la
muestra, procedimientos que podran distorsionar o destruir a los
microorganismos. El microscopio de fluorescencia aprovecha las
ventajas de la fluorescencia, es decir la capacidad de ciertas
sustancias de absorber luz de longitudes de onda corta
(ultravioleta) y emitir una luz de una longitud de onda mayor
(visible). El microscopio de fluorescencia permite detectar
bacterias u otros microorganismos patgenos, incluso dentro de
clulas, tejidos u otras muestras clnicas, posee una importancia
extraordinaria porque con ella se puede identificar un microbio en
el trmino de minutos. Para aplicar los colorantes cidos o bsicos
los microbilogos emplean tres clases de tcnicas de tincin: simple,
diferencial y especial. La tincin simple es utilizada para destacar
microorganismos a fin de determinar las formas y las disposiciones
celulares. Las clulas se tien con una solucin acuosa o alcohlica de
un colorante bsico solo. Las tinciones diferenciales utilizadas con
ms frecuencia para las bacterias son la tincin de GRAM y la tincin
de cido-alcohol resistencia. La tincin GRAM es utilizada para
distinguir entre clases diferentes de bacterias. Clasifica las
bacterias en dos grandes grupos: grampositivas y gramnegativas. Las
bacterias grampositivas retienen el color del colorante violeta de
genciana aparecen violceas. Las bacterias gramnegativas no retienen
el colorante violeta y permanecen incoloras hasta que se aplica la
safranina como colorante de contraste y entonces se tornan rosceas.
La tincin de cido-alcohol resistencia es utilizada para distinguir
especies de Mycobacterium y algunas especies de Norcadia, las
bacetrias cido-alcohol resistentes, una vez teidas con
carbolfucsina y tratadas con cido-alcohol, retienen el colorante y
aparecen de color rojo. Las bacterias que no son acido-alcohol
resistentes, cuando se las tie y se las trata de la misma manera y
despus se las tie con azul de metileno, aparecen de color azul
porque pierden el colorante carbolfucsina y entonces puede aceptar
el colorante azul de metileno. Las tinciones especiales se utilizan
para colorear y aislar partes especficas de microorganismos como
endosporas y flagelos, y para detectar la presencia de cpsulas. La
tincin de endosporas es utilizada para detectar la presencia de
endosporas en las bacterias. Cuando se aplica verde de malaquita
sobre un extendido de clulas bacterianas fijadas con color, el
colorante penetra en el interior de las endosporas y las tie de
verde. Cuando a continuacin se aplica safranina, tie el resto de
las clulas de rojo o rosado. La tincin de flagelos es utilizada
para demostrar la presencia de flagelos. Se usa un mordiente para
aumentar los dimetros de los flagelos hasta que puedan visualizarse
por microscopia cuando se tian con carbolfucsina.
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