i

Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet

Biološki odsjek

Ivan Šamija

MIKROFTALMIJSKI TRANSKRIPCIJSKI ČIMBENIK I TIROZINAZA KAO BILJEZI ZA OTKRIVANJE

MELANOMSKIH STANICA U PERIFERNOJ KRVI BOLESNIKA S MELANOMOM

Doktorska disertacija predložena Biološkom odsjeku

Prirodoslovno-matematičkoga fakulteta Sveučilišta u Zagrebu radi stjecanja akademskog stupnja doktora prirodnih znanosti biologije

Zagreb, 2006.

ii

Ova je disertacija izrađena u Klinici za onkologiju i nuklearnu medicinu Kliničke bolnice

"Sestre milosrdnice" u Zagrebu, pod vodstvom prof. dr. sc. Josipa Lukača, u sklopu

Sveučilišnog poslijediplomskog studija pri Biološkom odsjeku Prirodoslovno-

-matematičkog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu.

iii

Zahvaljujem mome voditelju prof. dr. sc. Josipu Lukaču na pomoći i podršci u svim fazama

rada na ovoj doktorskoj disertaciji.

Zahvaljujem akademiku Zvonku Kusiću, predstojniku Klinike za onkologiju i nuklearnu

medicinu Kliničke bolnice "Sestre milosrdnice", na podršci i razumijevanju prilikom izrade

ove disertacije.

Na pomoći pri prikupljanju kliničkih podataka o ispitanicima uključenim u istraživanje

zahvaljujem dr. Jasmini Marić-Brozić, prof. dr. sc. Mirni Šitum, prof. dr. sc. Nikoli

Đakoviću, dr. Marku Jelaviću, dr. Branimiru Bukši, dr. Nevii Delalle i dr. Željani Bućan.

Na pomoći pri statističkoj obradi podataka zahvaljujem dr. Ivi Alajbeg.

Sadašnjim i bivšim djelatnicima Odjela za laboratorijsku dijagnostiku Klinike za

onkologiju i nuklearnu medicinu Kliničke bolnice "Sestre milosrdnice" zahvaljujem na

susretljivosti i pomoći pri eksperimentalnom radu.

iv

1. UVOD ................................................................................................................. 1

2. LITERATURNI PREGLED ............................................................................ 4

2.1. MELANOM ........................................................................................................................ 5 2.1.1. EPIDEMIOLOGIJA KOŽNOG MELANOMA ................................................................ 5 2.1.2. ČIMBENICI RIZIKA I ŽARIŠTA KOJA PRETHODE KOŽNOM MELANOMU......... 7 2.1.3. KLINIČKA SLIKA KOŽNOG MELANOMA ............................................................... 10 2.1.4. PATOHISTOLOŠKA SLIKA KOŽNOG MELANOMA ............................................... 10 2.1.5. PROGNOSTIČKI ČIMBENICI KOŽNOG MELANOMA ............................................ 13 2.1.6. STUPNJEVANJE KOŽNOG MELANOMA.................................................................. 15 2.1.7. DIJAGNOZA I LIJEČENJE KOŽNOG MELANOMA.................................................. 20 2.1.8. MELANOM OKA, MELANOM SLUZNICE I METASTAZE NEPOZNATOG

PRIMARNOG MELANOMA......................................................................................... 23 2.2. TUMORSKI BILJEZI U DIJAGNOSTICI MELANOMA ......................................... 25 2.2.1. TUMORSKI BILJEZI ..................................................................................................... 25 2.2.2. BILJEZI ZA IMUNOHISTOKEMIJSKU DIJAGNOSTIKU MELANOMA................ 26 2.2.3. SERUMSKI MELANOMSKI BILJEZI.......................................................................... 27 2.2.4. ODREĐIVANJE CIRKULIRAJUĆIH MELANOMSKIH STANICA........................... 29 2.2.5. ODREĐIVANJE MELANOMSKIH STANICA U LIMFNIM ČVOROVIMA,

KOŠTANOJ SRŽI I CEREBROSPINALNOM LIKVORU............................................ 32 2.2.6. ODREĐIVANJE DRUGIH TUMORSKIH STANICA METODOM RT-PCR .............. 34 2.3. MIKROFTALMIJSKI TRANSKRIPCIJSKI ČIMBENIK (MITF)........................... 38 2.3.1. MITF I WAARDENBURGOV SINDROM .................................................................... 38 2.3.2. IZOFORME PROTEINA MITF...................................................................................... 39 2.3.3. GEN MITF....................................................................................................................... 40 2.3.4. FUNKCIJA I REGULACIJA PROTEINA MITF ........................................................... 41 2.3.5. MITF U DIJAGNOSTICI MELANOMA ....................................................................... 44

3. ISPITANICI I METODE ............................................................................... 45

3.1. BOLESNICI...................................................................................................................... 46 3.2. ZDRAVI ISPITANICI ..................................................................................................... 46 3.3. OBRADA UZORAKA KRVI.......................................................................................... 47 3.4. IZOLACIJA RNA ............................................................................................................ 48 3.5. OBRNUTO PREPISIVANJE.......................................................................................... 48 3.6. UMNAŽANJE CDNA GENA ZA GLICERALDEHID-3-FOSFAT

DEHIDROGENAZU PCR-OM........................................................................................ 49 3.7. UMNAŽANJE CDNA GENA ZA TIROZINAZU PCR-OM......................................... 50 3.8. UMNAŽANJE CDNA GENA ZA MIKROFTALMIJSKI

TRANSKRIPCIJSKI ČIMBENIK (MITF) PCR-OM ................................................... 51 3.9. OLIGONUKLEOTIDNE POČETNICE ZA UMNAŽANJE PCR-OM....................... 52 3.10. ANALIZA PRODUKATA UMNAŽANJA PCR-OM .................................................... 55 3.11. ODREĐIVANJE PRAGA DETEKCIJE METODE..................................................... 56 3.11.1. UZGOJ STANICA U KULTURI..................................................................................... 56 3.11.2. PRIPREMA SERIJE RAZRJEĐENJA STANICA.......................................................... 57 3.11.3. BROJANJE LEUKOCITA .............................................................................................. 58

v

3.12. POZITIVNA KONTROLA............................................................................................. 59 3.13. PUFERI I OTOPINE ....................................................................................................... 59 3.13.1. FOSFATNI PUFER (PBS) BEZ Ca2+

I Mg2+................................................................... 59 3.13.2. 50 X TRIS-ACETAT-EDTA (TAE) PUFER................................................................... 60 3.13.3. TÜRKOVA OTOPINA.................................................................................................... 60 3.14. STATISTIČKA OBRADA PODATAKA ...................................................................... 60

4. REZULTATI ................................................................................................... 62

4.1. PRAG DETEKCIJE METODE...................................................................................... 63 4.2. STRUKTURA ISPITANIKA .......................................................................................... 64 4.3. VRIJEDNOSTI BILJEGA (GAPDH, TIROZINAZA I MITF) U

UZORCIMA KRVI ISPITANIKA ................................................................................. 68 4.4. VRIJEDNOSTI BILJEGA I STADIJ BOLESTI.......................................................... 70 4.5. VRIJEDNOSTI BILJEGA I SPOL BOLESNIKA ....................................................... 74 4.6. VRIJEDNOSTI BILJEGA I DOB BOLESNIKA ......................................................... 76 4.7. VRIJEDNOSTI BILJEGA I DEBLJINA PRIMARNOG TUMORA......................... 81 4.8. VRIJEDNOSTI BILJEGA I LOKALIZACIJA PRIMARNOG

TUMORA.......................................................................................................................... 86 4.9. VRIJEDNOSTI BILJEGA I HISTOLOŠKI TIP PRIMARNOG

TUMORA.......................................................................................................................... 91 4.10. VRIJEDNOSTI BILJEGA I ULCERACIJA PRIMARNOG TUMORA................... 96 4.11. VRIJEDNOSTI BILJEGA I STUPANJ PO CLARKU................................................ 99 4.12. VRIJEDNOSTI BILJEGA I METASTAZE REGIONALNIH LIMFNIH

ČVOROVA ..................................................................................................................... 102 4.12.1. PRISUTNOST METASTAZA REGIONALNIH LIMFNIH ČVOROVA.................... 102 4.12.2. LOKALIZACIJA METASTAZA REGIONALNIH LIMFNIH ČVOROVA ............... 104 4.12.3. BROJ REGIONALNIH LIMFNIH ČVOROVA ZAHVAĆENIH

METASTAZAMA ........................................................................................................ 105 4.13. VRIJEDNOSTI BILJEGA I UDALJENE METASTAZE......................................... 110 4.13.1. PRISUTNOST UDALJENIH METASTAZA ............................................................... 110 4.13.2. LOKALIZACIJA UDALJENIH METASTAZA........................................................... 112 4.13.3. BROJ UDALJENIH METASTAZA.............................................................................. 113 4.14. VRIJEDNOSTI BILJEGA I LOKALNI RECIDIV ................................................... 114 4.15. VRIJEDNOSTI BILJEGA I DRUGI PRIMARNI MELANOM,

RECIDIV METASTAZA REGIONALNIH LIMFNIH ČVOROVA TE LIMFATIČKE METASTAZE...................................................................................... 115

4.16. VRIJEDNOSTI BILJEGA I TERAPIJA..................................................................... 115 4.16.1. SISTEMSKA TERAPIJA.............................................................................................. 115 4.16.2. OPERACIJA.................................................................................................................. 117

5. RASPRAVA................................................................................................... 123

6. ZAKLJUČCI ................................................................................................. 138

7. CITIRANA LITERATURA......................................................................... 141

8. ŽIVOTOPIS................................................................................................... 165

vi

TEMELJNA DOKUMENTACIJSKA KARTICA Sveučilište u Zagrebu Doktorska disertacija Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek

MIKROFTALMIJSKI TRANSKRIPCIJSKI ČIMBENIK I TIROZINAZA KAO BILJEZI ZA OTKRIVANJE MELANOMSKIH STANICA U PERIFERNOJ KRVI

BOLESNIKA S MELANOMOM

IVAN ŠAMIJA

Klinika za onkologiju i nuklearnu medicinu Klinička bolnica "Sestre milosrdnice"

Vinogradska cesta 29, 10000 Zagreb, Republika Hrvatska

U ovom je istraživanju mikroftalmijski transkripcijski čimbenik (MITF) po prvi puta istražen kao biljeg za otkrivanje cirkulirajućih melanomskih stanica metodom lančane reakcije polimerazom nakon obrnutog prepisivanja (RT-PCR). Osnovni cilj istraživanja bio je istražiti može li analiza MITF-a kao dodatnog biljega uz tirozinazu poboljšati otkrivanje cirkulirajućih melanomskih stanica RT-PCR-om u bolesnika s melanomom. Ekspresija gena za tirozinazu i MITF analizirana je RT-PCR-om u uzorcima krvi 201 bolesnika s melanomom i 40 zdravih dobrovoljaca. Prag detekcije oba biljega (MITF-a i tirozinaze) bio je dovoljno nizak da omogući otkrivanje najmanje 50 melanomskih stanica u 10 mL periferne krvi. Svi uzorci krvi zdravih dobrovoljaca bili su negativni na oba biljega (MITF i tirozinazu). Analiza MITF-a, kao dodatnog biljega uz tirozinazu, omogućila je otkrivanje cirkulirajućih melanomskih stanica u većeg broja bolesnika s melanomom u odnosu na analizu samo tirozinaze (48 naprema 20 pozitivnih od ukupno 201 bolesnika). I za MITF i za tirozinazu nađen je statistički značajni trend povećanja udjela bolesnika s pozitivnom vrijednošću biljega sa porastom stadija bolesti, što upućuje na moguću prognostičku vrijednost oba biljega. (169 stranica, 31 slika, 74 tablica, 286 literaturnih navoda, jezik izvornika hrvatski) Rad je pohranjen u Nacionalnoj i sveučilišnoj knjižnici u Zagrebu, Ulica Hrvatske bratske zajednice 4 p.p. 550, 10000 Zagreb, Republika Hrvatska. Ključne riječi: cirkulirajuće tumorske stanice / lančana reakcija polimerazom nakon reverzne transkripcije / melanom / mikroftalmijski transkripcijski čimbenik / tirozinaza / tumorski biljezi Mentor: Prof. dr. sc. Josip Lukač Ocjenjivači: Prof. dr. sc. Ivan Bašić, akademik Zvonko Kusić, Prof. dr. sc. Josip Lukač Rad prihvaćen: 5. srpnja 2006.

vii

BASIC DOCUMENTATION CARD University of Zagreb Doctoral Thesis Faculty of Science Department of Biology

MICROPHTHALMIA-ASSOCIATED TRANSCRIPTION FACTOR AND TYROSINASE AS MARKERS FOR DETECTION OF MELANOMA CELLS IN

PERIPHERAL BLOOD OF PATIENTS WITH MELANOMA

IVAN ŠAMIJA

Department of Oncology and Nuclear Medicine Sisters of Mercy University Hospital

Vinogradska cesta 29, 10000 Zagreb, Croatia

In this study, microphthalmia-associated transcription factor (MITF) was investigated for the first time as a marker for detection of circulating melanoma cells by reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). Primary aim of the study was to investigate whether analysis of MITF as an additional marker to tyrosinase in melanoma patients can improve the detection of circulating melanoma cells by RT-PCR. Blood samples from 201 melanoma patients and 40 healthy volunteers were analyzed by RT-PCR for the expression of MITF and tyrosinase. The threshold for detection of both MITF and tyrosinase was set low enough to detect 50 melanoma cells in 10 mL of peripheral blood. All samples from healthy volunteers were negative for both MITF and tyrosinase. Analysis of MITF in addition to tyrosinase allowed the detection of circulating melanoma cells in a larger number of melanoma patients than the tyrosinase analysis alone (48 vs 20 positive out of 201). A trend of increase in the proportion of patients with positive values of both MITF and tyrosinase with increasing stage of disease has been shown, which indicates potential prognostic value of both markers (MITF and tyrosinase).

(169 pages, 31 figures, 74 tables, 286 references, original in Croatian) Thesis deposited in National and University Library in Zagreb, Ulica Hrvatske bratske zajednice 4 p.p. 550, 10000 Zagreb, Croatia. Keywords: circulating tumor cells / reverse transcription polymerase chain reaction / melanoma / microphthalmia-associated transcription factor / tyrosinase / tumor markers Supervisor: Prof. Josip Lukač, PhD Reviewers: Prof. Ivan Bašić, DVM, PhD; Prof. Zvonko Kusić, MD, PhD; Prof. Josip Lukač, PhD Thesis accepted: 5th July 2006

1

1. UVOD

2

Određivanje cirkulirajućih melanomskih stanica metodom lančane reakcije

polimerazom nakon obrnutog prepisivanja (reverzne transkripcije) (RT-PCR, engl. reverse

transcription - polymerase chain reaction) istražuje se u svrhu određivanja prognoze i

praćenja odgovora na terapiju u bolesnika s melanomom. Kao specifični melanomski biljeg

u tim se istraživanjima najčešće određuje ekspresija gena za tirozinazu. Međutim, kliničku

vrijednost tirozinaze kao biljega umanjuje činjenica da je u gotovo svim istraživanjima

određeni udio bolesnika s klinički potvrđenim udaljenim metastazama bio negativan na

tirozinazu (Tsao i sur., 2001; Jung i sur., 1997; Glaeser i sur., 1997; Brownbridge i sur.,

2001; Farthmann i sur., 1998; Mellado i sur., 1999; Proebstle i sur., 2000; Mellado i sur.,

1996; Battayani i sur., 1995; Kunter i sur., 1996; Quereux i sur., 2000; Smith i sur., 1991;

Schittek i sur., 1999a; Schrader i sur., 2000; Kulik i sur., 2001; Reinhold i sur., 1997;

Mellado i sur., 2002; Reynolds i sur., 2003). Nekoliko istraživanja je pokazalo da analiza

dodatnih biljega uz tirozinazu omogućuje otkrivanje cirkulirajućih melanomskih stanica

metodom RT-PCR u većeg broja melanomskih bolesnika (Curry i sur., 1998; Schittek i

sur., 1999a; Kulik i sur., 2001).

U ovome sam radu želio istražiti mikroftalmijski transkripcijski čimbenik (MITF,

engl. microphthalmia-associated transcription factor) kao dodatni biljeg uz tirozinazu za

određivanje cirkulirajućih melanomskih stanica metodom RT-PCR. MITF je u

dosadašnjim istraživanjima pokazao visoku specifičnost i osjetljivost kao biljeg za

imunohistokemijsku dijagnostiku melanoma ali dosad, po mojim saznanjima, nije

istraživan kao biljeg za određivanje cirkulirajućih melanomskih stanica metodom RT-PCR

(King i sur., 1999; Miettinen i sur., 2001; Granter i sur., 2002; O'Reilly i sur., 2001; Salti i

sur., 2000).

Osnovna polazna hipoteza ovog istraživanja bila je da analiza MITF-a kao dodatnog

biljega uz tirozinazu omogućuje otkrivanje cirkulirajućih melanomskih stanica u većeg

broja bolesnika s melanomom u odnosu na analizu samo tirozinaze.

Ciljevi rada bili su sljedeći:

1.) Odrediti prag detekcije i provjeriti specifičnost tirozinaze i MITF-a kao biljega za

određivanje cirkulirajućih melanomskih stanica metodom RT-PCR.

3

2.) Istražiti omogućuje li analiza MITF-a, kao dodatnog biljega uz tirozinazu,

otkrivanje cirkulirajućih melanomskih stanica u većeg broja bolesnika s

melanomom u odnosu na analizu samo tirozinaze.

3.) Provjeriti postoji li povezanost između distribucije vrijednosti biljega (tirozinaze i

MITF-a) i stadija bolesti.

4.) Provjeriti postoji li povezanost između distribucije vrijednosti biljega (tirozinaze i

MITF-a) i pojedinih prognostičkih čimbenika (spol, dob, debljina primarnog

tumora, lokalizacija primarnog tumora, histološki tip primarnog tumora,

ulceracija primarnog tumora, stupanj po Clarku, prisutnost metastaza regionalnih

limfnih čvorova, lokalizacija metastaza regionalnih limfnih čvorova, broj

regionalnih limfnih čvorova zahvaćenih metastazom, prisutnost udaljenih

metastaza, lokalizacija udaljenih metastaza, broj udaljenih metastaza, lokalni

recidiv, drugi primarni melanom, recidiv metastaza regionalnih limfnih čvorova

te prisutnost limfatičkih metastaza).

5.) Provjeriti postoji li povezanost između distribucije vrijednosti bijega (tirozinaze i

MITF-a) i prethodne sistemske terapije te vremena proteklog od operacije

melanoma.

U istraživanju su obrađeni uzorci periferne krvi 201 bolesnika s melanomom u

svim stadijima bolesti. RNA je izolirana iz mononuklearnih stanica izdvojenih iz periferne

krvi i obrnutim prepisivanjem (reverznom transkripcijom) prevedena u komplementarnu

DNA (cDNA, engl. complementary DNA). Nakon toga je određena ekspresija gena za

tirozinazu i MITF lančanom reakcijom polimerazom (PCR, engl. polymerase chain

reaction). Uzorci krvi 40 zdravih dobrovoljaca korišteni su kao kontrole.

Rezultati ovog istraživanja pomoći će pri uspostavljanju i standardiziranju novog

dijagnostičkog postupka, koji bi omogućio predviđanje kliničkog ponašanja melanoma i

time poboljšao zbrinjavanje melanomskih bolesnika.

4

2. LITERATURNI PREGLED

5

2.1. MELANOM

Melanom je drugi najzloćudniji tumor kože, nakon rijetkog tumora Merkelovih

stanica. Iako čini samo oko 4% svih tumora kože, melanom je najčešći uzrok smrti od

tumora kože (Swetter, 2003). Dva su osnovna razloga zašto melanom danas predstavlja

izrazito veliki zdravstveni problem. Jedan je značajni porast njegove incidencije u cijelome

svijetu u posljednjih nekoliko desetljeća. Drugi je što, usprkos intenzivnim istraživanjima,

nije potvrđen oblik liječenja koji bi značajno utjecao na preživljenje bolesnika u

uznapredovalom stadiju bolesti.

Melanom nastaje iz melanocita, pa su stoga uz kožu, kao najčešće, moguća i druga

primarna sijela melanoma na dijelovima tijela gdje su prisutni melanociti, kao što su

dijelovi oka, sluznice, moždane ovojnice i dr. (Scotto i sur., 1976).

2.1.1. EPIDEMIOLOGIJA KOŽNOG MELANOMA

Iako u ukupnoj incidenciji svih zloćudnih tumora na melanom otpada samo 2% u

cijelome svijetu (2,2% u Hrvatskoj), melanom je veliki zdravstveni problem zbog stalnog

porasta njegove stope incidencije u posljednjih nekoliko desetljeća među svim bjelačkim

populacijama (Ferlay i sur., 2004; Hrvatski zavod za javno zdravstvo). Kako je među

nebjelačkim populacijama incidencija melanoma mnogo niža (npr. u SAD-u je stopa

incidencije melanoma 20 puta niža u crnaca nego u bijelaca), za njih ne postoje pouzdani

podaci o trendovima (Ries i sur., 2005; Bellows i sur., 2001). Prosječni godišnji porast

stope incidencije kožnog melanoma u populacijama europskog podrijetla od 60-ih do 90-ih

godina dvadesetog stoljeća iznosio je otprilike 5%, i u muškaraca i u žena (Elwood i sur.,

2003). S takvim porastom incidencije melanom je među svim tumorima na drugome

mjestu, iza raka pluća. U SAD-u, gdje se pouzdani podaci o incidenciji prikupljaju od

1973. u sklopu SEER (Surveillance, Epidemiology and End Results) programa, stopa

incidencije kožnog melanoma na 100 000 stanovnika je 1973. iznosila 6,7 u muškaraca i

5,9 u žena, te je u muškaraca najvišu vrijednost od 20,4 dosegla 1996. godine, a u žena je

najvišu vrijednost od 14,3 dosegla 1997. godine (Ries i sur., 2005). Životni rizik

obolijevanja od kožnog melanoma je u SAD-u 1935. iznosio 1:1500, a 2002. 1:68. U

Hrvatskoj je stopa incidencije (na 100 000 stanovnika) 1991. godine iznosila 4,1, a 2001.

godine 10,7 (Hrvatski zavod za javno zdravstvo).

6

Velike su varijacije u stopi incidencije kožnog melanoma među različitim

populacijama. Tako je 2000. godine među svim zemljama koje raspolažu pouzdanim

podacima najniža stopa (na 100 000 stanovnika) od 0,2, i u muškaraca i u žena, bila

zabilježena u Kini, dok je najviša stopa u muškaraca iznosila 40,5 u Australiji, a u žena

34,9 na Novom Zelandu (Ferlay i sur., 2004). Razlike u incidenciji melanoma među

spolovima variraju od populacije do populacije. Stopa incidencije (na 100 000 stanovnika)

kožnog melanoma u cijelome svijetu dobno standardizirana na svjetsku populaciju je

2002. iznosila 2,6 u muškaraca, te 2,8 u žena (Ferlay i sur., 2004). U Hrvatskoj je stopa

incidencije (na 100 000 stanovnika) 2002. godine iznosila 8,8 u muškaraca i 9,1 u žena

(Hrvatski zavod za javno zdravstvo). Melanom se može javiti u bilo kojoj životnoj dobi, s

time da srednja dob dijagnosticiranja iznosi 53 godine, što je u prosjeku 10 godina manje

nego u drugih učestalih tumora, kao što su tumori dojke, pluća i prostate. Dobno specifična

stopa incidencije kožnog melanoma raste sa starošću, i u muškaraca i u žena, a taj je

porast, prema podacima SEER-a, osobito izražen u muškaraca starijih od 45 godina (Ries i

sur., 2005).

U najnovije vrijeme u nekim je populacijama (npr. u Nordijskim zemljama)

zabilježen prestanak rasta, pa čak i pad incidencije u mlađih i srednjih dobnih skupina (de

Vries i sur., 2003). To se objašnjava u prvome redu promjenama u navikama tih dobnih

skupina s obzirom na izlaganje suncu.

Zanimljivi su podaci o trendovima incidencije kožnog melanoma s obzirom na

njegovu debljinu, koja je najvažniji prognostički čimbenik kod nediseminiranog

melanoma. U većini populacija je porast incidencije tanjih melanoma, koji su prognostički

povoljniji, puno veći od porasta incidencije debljih melanoma. Tako je u SAD-u od 1986.

do 1996. zabilježen veliki rast incidencije melanoma tanjih od 1 mm, dok u istom

razdoblju incidencija melanoma debljih od 4 mm nije rasla (Jemal i sur., 2001). U srednjoj

Europi se medijan debljine dijagnosticiranih melanoma od 1986. do 1996. smanjio s 1,2

mm na 0,8 mm (Garbe i sur., 2000). Ovaj trend se može objasniti poboljšanom ranom

dijagnostikom melanoma.

Stopa smrtnosti kožnog melanoma je u pravilu oko pet puta niža od stope

incidencije. Stopa smrtnosti (na 100 000 stanovnika) kožnog melanoma u cijelome svijetu

dobno standardizirana na svjetsku populaciju je 2002. iznosila 0,8 u muškaraca te 0,6 u

žena (Ferlay i sur., 2004). U Hrvatskoj je stopa smrtnosti (na 100 000 stanovnika) 2002.

godine iznosila 2,7 u muškaraca i 1,6 u žena (Hrvatski zavod za javno zdravstvo).

Zanimljivo je da žene, s obzirom na podatke o stopama incidencije i smrtnosti, imaju višu

7

stopu preživljenja od muškaraca nakon što je melanom dijagnosticiran. Kao i u slučaju

incidencije, u novije vrijeme je u nekim populacijama zabilježen i prestanak rasta stope

smrtnosti kožnog melanoma (Severi i sur., 2000). Taj prestanak rasta stope smrtnosti

odnosi se na mlađe dobne skupine (osobe rođene 40-ih godina dvadesetog stoljeća i

kasnije) u populacijama s inače visokom stopom incidencije i smrtnosti (Australija, Novi

Zeland, SAD i Nordijske zemlje). Ovaj povoljni trend se dijelom objašnjava intenzivnim

kampanjama prevencije kožnog melanoma, koje su utjecale na promjene ponašanja u tih

skupina s obzirom na izlaganje suncu te ranijom dijagnostikom melanoma koja značajno

povećava izlječivost.

2.1.2. ČIMBENICI RIZIKA I ŽARIŠTA KOJA PRETHODE KOŽNOM

MELANOMU

Iako sama etiologija melanoma još nije potpuno razjašnjena, poznati su okolišni i

nasljedni čimbenici koji povećavaju rizik od nastanka melanoma. Poznavanje čimbenika

rizika je važno, jer samo točna procjena pojedinačnog rizika, posebno u visokorizičnih

osoba, omogućuje prikladni pristup praćenju tih osoba i pravilno savjetovanje o

izbjegavanju izloženosti suncu i o samopregledu.

Najvažniji okolišni čimbenik rizika je izloženost ultraljubičastom (UV) zračenju,

najčešće onom sunčevog podrijetla. Za razliku od karcinoma ljuskastih stanica, kod

melanoma ne postoje studije na eksperimentalnim životinjama koje bi jednoznačno

potvrdile etiološku povezanost UV-zračenja i nastanka tumora (Elwood i sur., 2003).

Međutim, brojni podaci (povećanje incidencije melanoma u SAD-u i Australiji s

približavanjem ekvatoru gdje je veća izloženost suncu (Parkin i sur., 2002); migracijske

studije koje pokazuju povećani rizik u osoba koje su ranije razdoblje života provele u

mjestima s većom izloženošću suncu (Autier i sur., 1997); veća incidencija melanoma na

dijelovima tijela koji su stalno ili povremeno izloženi suncu (Elwood i sur., 1998); i dr.)

upućuju na povezanost izloženosti UV-zračenju i nastanka melanoma.

S obzirom na rezultate nekih epidemioloških i drugih istraživanja, pretpostavlja se

da nastanak melanoma (uz moguću iznimku melanoma lentigo maligna) nije povezan s

ukupnom kumulativnom dozom primljenog UV-zračenja, kao što je slučaj u nekih drugih

kožnih tumora i karcinoma ljuskastih stanica (Elwood i sur., 1997). Smatra se da melanom

nastaje uslijed kratkotrajne povremene (intermitentne) izloženosti jakom UV-zračenju

8

(Elwood i sur., 2003; Gilchrest i sur., 1999). Za vrijeme takve izloženosti, a za razliku od

postupnog izlaganja tijekom dužeg razdoblja, ne dolazi ni do inducirane pojačane

sposobnosti popravka oštećene DNA, niti do sinteze melanina koji štiti stanice i njihovu

DNA od oštećenja uslijed UV-zračenja. Kako melanociti, u odnosu na druge kožne stanice,

imaju značajno smanjenu sposobnost ulaska u apoptozu, takva oštećenja lako mogu dovesti

do zloćudne pretvorbe melanocita i nastanka melanoma (Elwood i sur., 2003; Gilchrest i

sur., 1999).

Ovakvim se modelom nastanka melanoma može donekle objasniti i porast

incidencije melanoma u drugoj polovici dvadesetog stoljeća, kada je došlo do promjena u

navikama ljudi u smislu sve većeg tzv. rekreativnog izlaganja suncu vikendima i u vrijeme

ljetnih godišnjih odmora. Zanimljivo je da je najveća incidencija melanoma u Australiji i

na Novom Zelandu, gdje je zbog oštećenog ozonskog Zemljina omotača puno veća

izloženost osoba sunčevu UV-zračenju. Malobrojne do sada provedene studije upućuju na

to da izlaganje umjetnom UV-zračenju u solarijima također povećava rizik od nastanka

melanoma (Swerdlow i sur., 1998).

I neki nasljedni čimbenici rizika mogu se povezati s utjecajem UV-zračenja na

nastanak melanoma. Osobe svjetlije puti, tj. slabije izražene kožne pigmentacije, imaju

povećani rizik od nastanka melanoma. Tako se pokazalo da je u SAD-u incidencija

melanoma značajno viša u bijelaca nego u crnaca, Azijaca i osoba hispanskog podrijetla

(Parkin i sur., 2002). U Europi je značajno veća incidencija u Norvežana, Šveđana i

Finaca, koji su svjetlije puti, nego u Španjolaca i Talijana, koji su tamnije puti (Parkin i

sur., 2002). Rizik od nastanka melanoma povećan je i u osoba koje pri izlaganju suncu

slabo tamne i razvijaju solarni eritem i opekline (Titus-Ernstoff i sur., 2005; Evans i sur.,

1988; Elwood i sur., 2003). Te osobe, kao i osobe svjetlije puti, imaju manju količinu

melanina, pa su slabije zaštićene od oštećenja DNA prouzročenih UV-zračenjem.

Pokazalo se da je rizik za nastanak melanoma u crvenokosih osoba 3,6 puta veći, a

u plavokosih osoba 2,4 puta veći nego u crnokosih osoba (Marrett i sur., 1992).

Osobe koje boluju od xeroderma pigmentosum imaju više od 1000 puta povećan

rizik za razvoj melanoma (Kraemer i sur., 1994). Xeroderma pigmentosum nastaje uslijed

mutacije u genima važnim za popravak oštećenja molekule DNA i ti su bolesnici izgubili

sposobnost ekscizijskog popravka molekule DNA oštećene UV-zračenjem.

Puno se istraživala povezanost madeža i nastanka melanoma. Tako se pokazalo da

je rizik od nastanka melanoma razmjeran ukupnom broju madeža (Tucker i sur., 1997;

Tsao i sur., 2003). Posebno su zanimljivi atipični madeži. Iako nisu usuglašeni jednoznačni

9

klinički i patohistološki kriteriji po kojima bi se atipični madeži razlikovali od tipičnih,

neke od kliničkih osobina atipičnih madeža su promjer veći od 5 mm, nepravilni oblik,

rubovi koji nisu oštro definirani i nejednolika pigmentiranost. Nekada se za atipične

madeže koristio i termin displastični nevusi, koji u novije vrijeme izlazi iz upotrebe (NIH,

1992). Pokazalo se da atipični madeži predstavljaju čimbenik rizika neovisan o ukupnom

broju madeža (Tucker i sur., 1997). Uz to što su čimbenik rizika, atipični madeži se

smatraju pretečama melanoma. Pokazalo se da se u osoba s obiteljskom sklonošću za

melanom, taj tumor u 70% slučajeva razvija iz atipičnog madeža (Green i sur., 1985).

Svakako treba imati na umu da i u bolesnika s obiteljskom sklonošću, a u još većoj mjeri u

ostalih, melanom može nastati i de novo. S druge strane, smatra se da iz većine atipičnih

madeža nikada ne nastane melanom (Tsao i sur., 2003). Nema pouzdanih podataka o tome

imaju li madeži izloženi traumi i iritaciji povećani rizik od zloćudne pretvorbe.

Atipični madeži se mogu javiti i u sklopu obiteljskog sindroma atipičnih madeža i

melanoma (FAMM, engl. syndrome of familial atypical mole and melanoma), koji je ranije

bio poznat i kao sindrom displastičnih nevusa (NIH, 1992). Osobe sa sindromom FAMM

imaju barem jednog rođaka u prvom ili drugom koljenu s melanomom i imaju veći broj

(često više od 50) madeža po cijelome tijelu, od kojih neki imaju kliničke i patohistološke

karakteristike atipičnih madeža (NIH, 1992). Te osobe imaju značajno povećan rizik za

razvoj melanoma. Tako je u osoba sa sindromom FAMM koje imaju dva ili više članova

obitelji s melanomom, vjerojatnost da će dobiti melanom do 75. godine života gotovo

100% (Kraemer i sur., 1986). Osobe sa sindromom FAMM imaju i puno veći rizik za

razvoj većeg broja primarnih melanoma i u njih se melanom javlja u ranijoj životnoj dobi

(Marghoob i sur., 1996; Goldstein i sur., 1994).

Žarištem koje prethodi melanomu (prekursorskom lezijom) smatra se i lentigo

maligna, kožna bolest koja najčešće zahvaća kožu glave i vrata. Oko 5% lentigo maligna

lezija progredira u melanom lentigo maligna (Weinstock i sur., 1987). Lentigo maligna 10

puta povećava rizik za razvoj melanoma (Weinstock i sur., 1987). I prirođeni madeži

gigantskog tipa su potvrđeni kao žarišta koja prethode melanomu (Rhodes i sur., 1981).

Osobe koje imaju jednog člana obitelji s melanomom, imaju 2,2 puta veći rizik za

nastanak melanoma (Ford i sur., 1995). Procjenjuje se da 6 – 14% svih melanoma nastaje u

osoba s obiteljskom sklonošću (Ang i sur., 1998).

Bolesnici s melanomom imaju povećan relativni rizik za razvoj drugog primarnog

melanoma, koji iznosi prema jednoj studiji 10 u muškaraca i 8,6 u žena (Wassberg i sur.,

10

1996). Po nekim istraživanjima 1 do 8% svih bolesnika s melanomom dobiju drugi

primarni melanom (Stam-Posthuma i sur., 2001).

2.1.3. KLINIČKA SLIKA KOŽNOG MELANOMA

U muškaraca se primarni kožni melanom najčešće javlja na leđima, a u žena na

nogama, ali se u oba spola može pojaviti na bilo kojem dijelu tijela (Kruger i sur., 1992;

Swetter, 2003; Halpern i sur., 2003).

Kožni melanom se najčešće javlja u obliku pigmentirane lezije čija se boja, veličina

ili oblik tijekom mjeseci ili godina vidljivo mijenjaju (Halpern i sur., 2003). Neke od

uobičajenih karakteristika po kojima se melanom može razlikovati od dobroćudnih lezija

su asimetričnost, nepravilni rubovi, nejednolika pigmentacija i promjer veći od 6 mm. U

svrhu poticanja rane dijagnostike melanoma te karakteristike se izdvajaju kao ABCD

simptomi, gdje se A odnosi na asimetriju (engl. Asymmetry), B na nepravilne rubove

(engl. Borders), C na nejednoličnu obojenost (engl. Color), te D na promjer veći od 6

mm (engl. Diameter) (Abbasi i sur., 2004). Melanom može biti i ulceriran i krvariti, što je

najčešće loši znak uznapredovale lokalne bolesti. Međutim, valja imati na umu da i neke

dobroćudne lezije, posebno atipični nevusi, mogu imati pojedine ili više ovih karakteristika

koje upućuju na melanom, te da melanom ne mora imati sve ove odlike. Tako se, na

primjer, u manjem broju slučajeva melanom javlja kao amelanotični melanom, koji nije

pigmentiran (Koch i sur., 2000).

Melanom metastazira limfom i krvlju. Najčešće su metastaze regionalnih limfnih

čvorova i kože. Od ostalih organa melanom najčešće metastazira u kosti, pluća, jetru i

mozak, a rjeđe i u druge organe.

2.1.4. PATOHISTOLOŠKA SLIKA KOŽNOG MELANOMA

Budući da je često teško klinički razlikovati melanom od nekih drugih dobroćudnih

lezija, sve sumnjive lezije se analiziraju patohistološki nakon biopsije.

Histološki možemo razlikovati tri različite faze u progresiji melanoma (Guerry i

sur., 1993; Crowson i sur., 2003). Najraniju fazu predstavlja melanom in situ koji se u

cijelosti nalazi u epidermisu i ne prodire kroz bazalnu membranu. Sljedeća je faza

11

radijalnog (ili horizontalnog) širenja kada dolazi do prodora melanomskih stanica kroz

bazalnu membranu u najgornji papilarni sloj dermisa. U trećoj fazi vertikalnog širenja

melanom prodire dublje u dermis ili čak u potkožno masno tkivo. Važno je odrediti u kojoj

se od tih faza nalazi melanom, jer se tako može procijeniti sposobnost metastaziranja, što

pomaže pri određivanju prognoze i odabiru najprikladnijeg oblika liječenja. U fazi

melanoma in situ i fazi radijalnog širenja, melanom se redovito može izliječiti kirurškom

ekscizijom, budući da u tim fazama melanom gotovo nikada ne metastazira (Guerry i sur.,

1993). Smatra se da prijelazom u fazu vertikalnog širenja melanom zadobiva sposobnost

metastaziranja, pa je prognoza u tome slučaju lošija (Clark i sur., 1989; Crowson i sur.,

2003).

Klinički i patohistološki razlikujemo četiri osnovna tipa primarnog kožnog

melanoma (Halpern i sur., 2003; Clark i sur., 1986; Swetter, 2003). Najučestaliji je

površinsko šireći melanom (SSM, engl. superficial spreading melanoma), koji čini oko

70% svih melanoma (Swetter, 2003). Najčešće se pojavljuje na leđima, a u žena i na

nogama, no može se pojaviti na bilo kojem dijelu tijela (Swetter, 2003; Halpern i sur.,

2003). Srednja dob pri postavljanju dijagnoze je 51 godina (Chang i sur., 1998). Često

nastaje iz postojećih madeža. Većina melanoma koji nastaju progresijom iz atipičnih

madeža je ovog tipa (Clark i sur., 1978). Rast mu se odlikuje dvjema fazama: početnom

fazom radijalnog širenja, nakon koje slijedi faza vertikalnog širenja. Za ovaj tip melanoma

su karakteristični ranije opisani ABCD simptomi (Slika 1) (Halpern i sur., 2003).

Sljedeći po učestalosti je nodularni melanom (NM), koji čini 15 do 30% svih

melanoma (Swetter, 2003). S obzirom na dob pri postavljanju dijagnoze i anatomsku

lokalizaciju sličan je površinsko širećem melanomu (Halpern i sur., 2003; Chang i sur.,

1998). Međutim, raste brže i agresivniji je od površinsko širećeg melanoma, jer nema fazu

radijalnog rasta, već od početka raste vertikalno. Najčešće se javlja kao uzdignuta papula

ili kupolasti čvor tamnosmeđe do crne boje koji može biti ulceriran i krvariti (Slika 1)

(Swetter, 2003).

U 4 do 15% melanomskih bolesnika javlja se lentigo maligna melanom (LMM) (Swetter,

2003). Pojavljuje se na dijelovima tijela izloženima suncu, najčešće na licu, u osoba starije

životne dobi (srednja dob pri postavljanju dijagnoze je 67 godina) (Chang i sur., 1998).

Dobra osobina ovog histološkog tipa je dugotrajni radijalni rast, povezan s povoljnijom

prognozom. Nastaje progresijom iz dobroćudne lentigo maligna lezije (Weinstock i sur.,

1987). Najčešće se pojavljuje kao smeđa neuzdignuta lezija nepravilnih rubova s različitim

varijacijama pigmentiranosti koje mogu uključivati i područja regresije koja se klinički

12

javljaju kao hipopigmentirana područja (Slika 1) (Swetter, 2003). Karakteristični znak

progresije iz dobroćudne lentigo maligna lezije u zloćudni lentigo maligna melanom je

pojava uzdignutih čvorića unutar lezije, koji predstavljaju područja vertikalnog rasta

(Swetter, 2003).

U bijelaca je najrjeđi akralni lentiginozni melanom (ALM), koji se u njih javlja u

2 do 8% bolesnika, dok taj isti tip melanoma čini čak 29 do 72% svih melanoma u

Afrikanaca i Azijaca (Krementz i sur., 1982; Swetter, 2003). Tipično sijelo su mu tabani,

dlanovi, te ispod noktiju (Halpern i sur., 2003; Krementz i sur., 1982; Swetter, 2003).

Javlja se najčešće u šestom i sedmom desetljeću života (Chang i sur., 1998). U najvećem

broju slučajeva se pojavljuje kao nepravilna smeđa ili crna pigmentacija promjera 3 ili više

cm (Slika 1) (Krementz i sur., 1982).

Slika 1. A - površinsko šireći melanom. B - nodularni melanom. C - lentigo maligna melanom. D

- akralni lentiginozni melanom. (Preuzeto iz: Balch CM, Houghton AN, Sober AJ, Soong SJ,

urednici. Cutaneous melanoma. 4. izdanje. St Louis (MO): Quality Medical Publishing; 2003.)

Među rjeđe zastupljenim histološkim tipovima melanoma ističe se dezmoplastički

melanom. Taj tip, koji čini manje od 1% svih melanoma, prvi je puta opisan 1971. godine

(Conley i sur., 1971). Najčešća sijela su mu glava i vrat, na koja otpada 53,2% svih

dezmoplastičkih melanoma (Lens i sur., 2005). Klinički se manifestira kao tvrdi čvor koji u

46 do 93% slučajeva nije pigmentiran (Lens i sur., 2005). Upravo ta česta

13

nepigmentiranost otežava rano postavljanje točne dijagnoze, tako da se dezmoplastički

melanom najčešće operira relativno kasno što se smatra osnovnim razlogom velike

učestalosti lokalnog recidiva u bolesnika s dezmoplastičkim melanomom (Lens i sur.,

2005). Međutim, prognoza se u bolesnika s dezmoplastičkim melanomom ne razlikuje

značajno od prognoze u bolesnika s drugim histološkim tipovima melanoma iste debljine

(Quinn i sur., 1998; Lens i sur., 2005). Pri postavljanju patohistološke i kliničke dijagnoze

treba voditi računa i o nekim vrlo rijetkim tipovima melanoma koje je lako zamijeniti s

nekim drugim zloćudnim i dobroćudnim lezijama. Tako je npr. opisan zloćudni špicoidni

melanom, kojeg je teško razlikovati od dobroćudnog Spitzovog nevusa (Spatz i sur., 1999).

2.1.5. PROGNOSTIČKI ČIMBENICI KOŽNOG MELANOMA

Najvažniji prognostički čimbenik kod lokaliziranog melanoma je debljina tumora po

Breslowu (debljina lezije u milimetrima od granularnog sloja epidermisa do najdubljeg

dijela tumora), gdje veća debljina tumora predstavlja lošiju prognozu (Breslow, 1970;

Balch i sur., 2001a). Tako je u analizi 13 581 bolesnika s lokaliziranim melanomom, među

bolesnicima s neulceriranim primarnim tumorom petogodišnje preživljenje bilo 95,3% u

bolesnika s tumorom debljine ≤1 mm, 89,0% u bolesnika s tumorom debljine 1-2 mm,

78,7% u bolesnika s tumorom debljine 2-4 mm te 67,4% u bolesnika s tumorom debljine

>4 mm (Balch i sur., 2001b). Veća debljina po Breslowu povezana je s povećanim rizikom

za razvoj metastaza regionalnih limfnih čvorova, in transit-metastaza i lokalnog recidiva

(Gershenwald i sur., 2003; Balch i sur., 2001c; Lens i sur., 2002; Kretschmer i sur., 2002).

Uz debljinu tumora po Breslowu, važnost kao prognostički čimbenik ima ulceracija koja,

ako je prisutna, predstavlja lošiju prognozu (Balch i sur., 2001a; Gershenwald i sur., 2003).

Smatra se da je ulceracija znak biološki agresivnijeg oblika melanoma koji ima veću

sposobnost metastaziranja (Balch i sur., 2003; Gershenwald i sur., 2003). Kao prognostički

čimbenik i čimbenik za stupnjevanje melanoma, ulceracija se definira kao patohistološki

utvrđeno odsustvo netaknutog epidermisa iznad većeg dijela primarnog melanoma (Balch i

sur., 2003; Balch i sur., 2001b). Ostali prognostički čimbenici, kao što su anatomska

lokalizacija primarnog tumora, dob, spol, limfocitna infiltracija tumora, histološki tip

tumora, te nivo po Clarku (nivo prodora tumora u histološke slojeve kože; Tablica 2),

pokazali su se manje značajnima. Rezultati nekih studija upućuju na to da je prognoza

lošija u slučaju: lokalizacije primarnog melanoma na trupu i glavi i vratu u odnosu na

14

udove (Balch i sur., 2001a; Garbe i sur., 1995; Gershenwald i sur., 2003), starije dobi

(Balch i sur., 2001a; Gershenwald i sur., 2003), muškog spola (Balch i sur., 2001a;

Gershenwald i sur., 2003), odsutnosti limfocitne infiltracije (Clark i sur., 1989; Clemente i

sur., 1996), te histoloških tipova NM i SSM u odnosu na LMM (Garbe i sur., 1995). Nivo

prodora tumora u kožu po Clarku pokazao se statistički značajnim neovisnim

prognostičkim čimbenikom samo u melanoma debljine manje od 1 mm i u primarnih

melanoma na lokalizacijama s malom debljinom kože, kao što su uška i kapak

(Gershenwald i sur., 2003; Balch i sur., 2001a; Buzaid i sur., 1997; Buttner i sur., 1995).

U bolesnika s metastazama regionalnih limfnih čvorova najvažniji prognostički

čimbenik je broj limfnih čvorova zahvaćenih metastazama (Balch i sur., 2001a;

Gershenwald i sur., 2003). Tako je u analizi 765 bolesnika s metastazama regionalnih

limfnih čvorova i neulceriranim primarnim tumorom petogodišnje preživljenje u bolesnika

s jednim pozitivnim limfnim čvorom bilo 65%, s dva pozitivna čvora 59%, s tri pozitivna

čvora 47%, s 4 pozitivna čvora 32%, te s više od 4 pozitivna čvora 26% (Balch i sur.,

2001a). Pokazalo se da je s obzirom na povezanost s petogodišnjim preživljenjem najbolje

grupiranje u tri skupine bolesnika: s jednim, sa dva ili tri te sa više od tri regionalna limfna

čvora zahvaćena metastazom (Gershenwald i sur., 2003). Jesu li metastaze regionalnih

limfnih čvorova mikrometastaze ili makrometastaze, drugi je najznačajniji čimbenik koji

utječe na prognozu u bolesnika s metastazama regionalnih limfnih čvorova (Balch i sur.,

2001a). Ako su metastaze otkrivene patološki tek nakon biopsije limfnih čvorova stražara

ili limfadenektomije tada govorimo o mikrometastazama koje predstavljaju bolju prognozu

u odnosu na makrometastaze koje su bile klinički ili radiološki evidentne i prije nego su

patološki potvrđene (Balch i sur., 2001a; Balch i sur., 2001b). O makrometastazama

govorimo i kada je utvrđeno širenje metastaze izvan kapsule limfnog čvora koji nije bio

klinički evidentan prije kirurškog uklanjanja. Manje važni prognostički čimbenici u

bolesnika s metastazama regionalnih limfnih čvorova su dob te ulceracija i lokalizacija

primarnog tumora. Kao i u bolesnika s lokaliziranim melanomom prognoza je lošija u

slučaju: starije dobi, prisutne ulceracije te lokalizacije primarnog melanoma na trupu i

glavi i vratu u odnosu na udove (Balch i sur., 2001a).

U bolesnika s udaljenim metastazama najvažniji prognostički čimbenik je

lokalizacija udaljenih metastaza (Gershenwald i sur., 2003; Balch i sur., 2001a; Barth i

sur., 1995). Tako je u analizi 1158 bolesnika s udaljenim metastazama petogodišnje

preživljenje u slučaju udaljenih metastaza na koži, u potkožnom tkivu ili u limfnim

čvorovima bilo 18,8%, u plućima 6,7%, a u drugim visceralnim organima i mozgu 9,5%

15

(Balch i sur., 2001b). U bolesnika s metastazama u plućima jednogodišnje je preživljenje

bilo značajno bolje nego u bolesnika s metastazama u drugim visceralnim organima i

mozgu, no ta je razlika je nestala kada se gledalo preživljenje duže od jedne godine (Balch

i sur., 2001a; Balch i sur., 2001b). Manje važni prognostički čimbenici su broj udaljenih

metastaza, dužina razdoblja bez znakova bolesti prije otkrivanja udaljenih metastaza,

klinički stadij u kojem je bolesnik bio prije otkrivanja udaljenih metastaza, te razina

enzima laktat-dehidrogenaze (LDH) u serumu. U tome smislu prognoza je lošija u slučaju

većeg broja udaljenih metastaza (Balch i sur., 1983; Gershenwald i sur., 2003), kraćeg

razdoblja bez znakova bolesti (Barth i sur., 1995), stadija 3 u odnosu na stadije 1 i 2 (Barth

i sur., 1995), te povišenog LDH u serumu (Gershenwald i sur., 2003; Manola i sur., 2000;

Sirott i sur., 1993).

2.1.6. STUPNJEVANJE KOŽNOG MELANOMA

Stupnjevanje tumora se provodi kako bi se bolesnici razvrstali u skupine koje se

međusobno razlikuju po prognozi i najprikladnijem načinu liječenja te kako bi se

omogućila usporedba rezultata dobivenih u različitim ustanovama. Kod melanoma se, uz

uobičajeno TNM stupnjevanje, koje se zasniva na osobinama primarnog tumora (T),

metastazama regionalnih limfnih čvorova (N, engl. nodes) i prisutnosti udaljenih metastaza

(M), provodi i mikrostupnjevanje po Breslowu, te po Clarku.

Mikrostupnjevanjem po Breslowu melanomi se svrstavaju u pet stupnjeva s

obzirom na debljinu lezije u milimetrima od granularnog sloja epidermisa do najdubljeg

dijela tumora (Tablica 1) (Breslow i sur., 1970). Ako je lezija ulcerirana, debljina po

Breslowu se mjeri od površine ulceracije do najdubljeg dijela lezije. Kako je debljina po

Breslowu kontinuirana varijabla, ne postoje prirodne granice među stupnjevima. Pokazalo

se da su u prognostičkom smislu najprikladnije granice među stupnjevima od 1, 2 i 4 mm

(Buttner i sur., 1995; Buzaid i sur., 1997). Mikrostupnjevanjem po Clarku melanomi se

svrstavaju u skupine s obzirom na dubinu prodora tumora u anatomske slojeve kože

(Tablica 2) (Clark i sur., 1969).

16

Tablica 1. Mikrostupnjevanje melanoma po Breslowu (Breslow i sur., 1970).

STUPANJ PO

BRESLOWU

DEBLJINA TUMORA

I < 0,75 mm

II 0,75 mm do 1,5 mm

III 1,5 mm do 2,25 mm

IV 2,25 mm do 4 mm

V > 4 mm

Tablica 2. Mikrostupnjevanje melanoma po Clarku (Clark i sur., 1969).

STUPANJ PO CLARKU DUBINA PRODORA TUMORA U KOŽU

I tumor zahvaća samo epidermis (melanom in situ)

II prodor u papilarni sloj dermisa

III tumorske stanice potpuno ispunjaju papilarni sloj dermisa do granice s retikularnim slojem dermisa

IV prodor u retikularni sloj dermisa

V prodor u potkožno masno tkivo

Trenutno se smatra najsveobuhvatnijim i najboljim sustav stupnjevanja

melanoma prema AJCC (American Joint Committee on Cancer) iz 2002. godine koje su

prihvatili i UICC (Union Internationale Contre le Cancer), Svjetska zdravstvena

organizacija i EORTC (European Organization for Research and Treatment of Cancer)

(Tablica 3; Tablica 4) (Balch i sur, 2001b). Ovaj sustav se temelji na znanstveno utvrđenim

prognostičkim čimbenicima i osmišljen je tako da viši stadij predstavlja i statistički

značajno lošiju prognozu (Slika 2). Stadiji 1 i 2 predstavljaju lokaliziranu bolest, stadij 3

zahvaćenost regionalnih limfnih čvorova metastazama te stadij 4 prisutnost udaljenih

metastaza. U osoba koje imaju više primarnih melanoma stadij se određuje s obzirom na

melanom s najgorim prognostičkim karakteristikama.

Uspoređivalo se svrstavanje u stadij 3 na temelju metastaza regionalnih limfnih

čvorova otkrivenih klinički ili radiološki s jedne strane, te patohistološki nakon biopsije

limfnog čvora stražara ili potpune limfadenektomije s druge strane (Balch i sur., 2001b).

Pokazalo se da patohistološka analiza omogućuje statistički značajno bolje razvrstavanje u

prognostički različite kategorije (Balch i sur, 2001b).

17

Tablica 3. TNM stupnjevanje kožnog melanoma po AJCC (American Joint Committee on

Cancer) iz 2002. godine (Balch i sur., 2001b).

T STUPNJEVANJE DEBLJINA TUMORA ULCERACIJA

T1 ≤ 1 mm a: bez ulceracije† i Clark I ili II

b: s ulceracijom ili Clark IV ili V

T2 1-2 mm a: bez ulceracije

b: s ulceracijom

T3 2-4 mm a: bez ulceracije

b: s ulceracijom

T4 > 4 mm a: bez ulceracije

b: s ulceracijom

N STUPNJEVANJE BROJ REGIONALNIH LIMFNIH

ČVOROVA S METASTAZOM

VRSTA METASTAZA

REGIONALNIH LIMFNIH

ČVOROVA

N1 1 a: mikrometastaze*

b: makrometastaze+

N2 2-3 a: mikrometastaze

b: makrometastaze

c: in transit-metastaze ili sateliti bez metastaza regionalnih limfnih čvorova

N3 4 ili više ili in transit-metastaze ili sateliti uz metastaze regionalnih limfnih čvorova

M

STUPNJEVANJE

LOKALIZACIJA

UDALJENIH METASTAZA

SERUMSKI LDH

M1a koža, potkožno tkivo, limfni

čvorovi

uredan

M1b pluća uredan

M1c ostali visceralni organi uredan

bilo koja povišen † ulceracija se definira kao histološki utvrđeno odsustvo netaknutog epidermisa iznad većeg dijela primarnog melanoma *mikrometastaze se otkrivaju tek nakon biopsije limfnih čvorova stražara ili limfadenektomije

+ makrometastaze su klinički evidentne i prije nego se kirurški potvrde; o makrometastazama

govorimo i uvijek kada je prisutno evidentno širenje metastaze izvan kapsule limfnog čvora

LDH – laktat-dehidrogenaza

18

Tablica 4. Svrstavanje kožnog melanoma u stadije po AJCC (American Joint Committee on

Cancer) iz 2002. godine (Balch i sur., 2001b).

STADIJ PO AJCC TNM STUPNJEVANJE

0 tumor in situ

1A T1a N0 M0

1B T1b N0 M0 T2a N0 M0

2A T2b N0 M0 T3a N0 M0

2B T3b N0 M0 T4a N0 M0

2C T4b N0 M0

3A T1-4a N1a M0 T1-4a N2a M0

3B T1-4b N1a M0 T1-4b N2a M0 T1-4a N1b M0

3C T1-4a N2b M0 T1-4a ili b N2c M0 T1-4b N1b M0 T1-4b N2b M0 bilo koji T N3 M0

4 bilo koji T, bilo koji N, M≠0

U stadij 3 su svrstani i bolesnici sa satelitskim i in transit-metastazama budući da

one utječu na prognozu na jednako nepovoljan način kao i metastaze regionalnih limfnih

čvorova (Gershenwald i sur., 2003; Buzaid i sur., 1997; Balch i sur., 2001b). Tradicionalno

se satelitske metastaze definiraju kao metastaze unutar 2 cm od primarnog tumora, dok se

in transit-metastaze definiraju kao metastaze u limfnim žilama između primarnog tumora i

regionalnih limfnih čvorova (Coit i sur., 2003). Međutim, pokazalo se da ovakvo

razlikovanje satelitskih i in transit-metastaza nema opravdanje, budući da nema razlike u

prognozi između bolesnika sa satelitskim i in transit-metastazama (Singletary i sur., 1988;

Buzaid i sur., 1997; Gershenwald i sur., 2003). Smatra se da su i satelitske i in transit-

metastaze, kao i metastaze regionalnih limfnih čvorova, samo manifestacije istog procesa

limfatičke diseminacije primarnog tumora (Borgstein i sur., 1999; Buzaid i sur. 1997;

Gershenwald i sur., 2003; Balch i sur., 2003; Balch i sur., 2001b). Satelitske metastaze

19

mogu biti klinički evidentne makrosatelitske metastaze ili mikrosatelitske metastaze, koje

se definiraju kao histološki otkrivena nakupina tumorskih stanica jasno odvojena od

osnovne tumorske mase (Gershenwald i sur., 2003; Leon i sur., 1991). Mikrosatelitske i

makrosatelitske metastaze imaju sličan nepovoljni utjecaj na prognozu, pa se i jedne i

druge svrstavaju u stadij 3 (Leon i sur., 1991; Balch i sur., 2003; Gershenwald i sur.,

2003).

PREŽIVLJENJE (godine)

PO

ST

OT

AK

PR

EŽ

IVJE

LIH

stadij 1 (n = 9175)

stadij 2 (n = 5739)

stadij 3 (n = 1528)

stadij 4 (n = 1158)

Slika 2. Krivulje petnaestogodišnjeg preživljenja za različite stadije melanoma prema AJCC

(American Joint Committee on Cancer): stadiji lokalizirane bolesti (1 i 2), stadij metastaza

regionalnih limfnih čvorova (3) i stadij udaljenih metastaza (4). Broj u zagradama je broj bolesnika

iz AJCC melanomske baze podataka koji je korišten kako bi se izračunale stope preživljavanja.

Razlike među krivuljama su visoko statistički značajne (P < 0,0001). (Preuzeto iz: Balch C, Buzaid

AC, Soong SJ, i sur. Final version of the American Joint Committee on Cancer staging system for

cutaneous melanoma. J Clin Oncol 2001;19:3635-3648.).

Neki autori smatraju da je i lokalni recidiv melanoma također manifestacija

limfatičke diseminacije primarnog melanoma (Borgstein i sur., 1999; Buzaid i sur. 1997;

Gershenwald i sur., 2003). U prilog takvoj teoriji govore podaci da je prognoza slična u

bolesnika s lokalnim recidivom, satelitskim metastazama, in transit-metastazama i

20

metastazama regionalnih limfnih čvorova (Buzaid i sur., 1997). Međutim, nastanak

lokalnog recidiva se može objasniti i nekim drugim mehanizmima (Tanabe i sur., 2003;

Balch i sur., 2001c). To je jedan od razloga zašto se lokalni recidiv ne svrstava u stadij 3.

Iako nije usuglašena precizna definicija lokalnog recidiva melanoma, on se može okvirno

definirati kao rast melanoma blizu primarnog melanoma, nakon njegove potpune široke

ekscizije (Tanabe i sur., 2003). Incidencija lokalnog recidiva je veća ako je primarni tumor

ulceriran, veće debljine po Breslowu i smješten na glavi, vratu i distalnim dijelovima

udova (Balch i sur., 2001c; Karakousis i sur., 1996). Također je veća incidencija lokalnog

recidiva u bolesnika sa satelitskim metastazama ili in transit-metastazama (Karakousis i

sur., 1996; Tanabe i sur., 2003; Kelly i sur., 1983). Lokalni recidiv je povezan s izrazito

lošom prognozom i s nastankom metastaza regionalnih limfnih čvorova i udaljenih

metastaza (Balch i sur., 2001c; Tanabe i sur., 2003). Jedna je studija pokazala da je

desetogodišnje preživljenje bolesnika s lokalnim recidivom kožnog melanoma samo 5%

(Balch i sur., 2001c).

2.1.7. DIJAGNOZA I LIJEČENJE KOŽNOG MELANOMA

Daleko najučinkovitiji oblik liječenja melanoma je kirurško uklanjanje dok se

melanom još nije metastatski proširio (Thompson i sur., 2005). Upravo zbog toga je rana

dijagnostika od presudne važnosti pri zbrinjavanju bolesnika s melanomom.

U slučaju lezija klinički sumnjivih na melanom redovito se provodi patohistološka

dijagnoza nakon ekscizijske biopsije, kojom se uklanja cijela lezija (Miller i sur., 2003).

Samo u nekim slučajevima, kao što je npr. velika površina lezije, provodi se incizijska

biopsija, kojom se uzima samo dio lezije po površini, ali u cijelu dubinu lezije (Miller i

sur., 2003).

Ako se patohistološki potvrdi dijagnoza melanoma, pristupa se širokoj reeksciziji,

koje se provodi tako da se odstrani tumor do zdravog tkiva u svim trima dimenzijama

(Ross i sur., 2003a). Preporučeni rubovi zdrave kože pri ovome kirurškom zahvatu ovise o

debljini melanoma (Tablica 5) (Ross i sur., 2003a). Samo u slučaju nekih posebnih

lokalizacija primarnog melanoma, provode se drugačiji kirurški zahvati (Ross i sur.,

2003a). Tako se kod subungvalnih melanoma provodi distalna interfalangealna amputacija.

21

Tablica 5. Preporuke za rubove zdrave kože prilikom ekscizije ovisno o debljini primarnog

melanoma (Ross i sur., 2003a).

DEBLJINA MELANOMA PO BRESLOWU EKSCIZIJSKI RUBOVI

0-1 mm 1 cm

1-2 mm 1 ili 2 cm*

2-4 mm 2 cm

>4 mm najmanje 2 cm

*1 cm za mjesta s anatomskim ograničenjima, ostalo 2 cm

U obradi bolesnika s melanomom važno je patohistološki odrediti postoje li

metastaze u regionalnim limfnim čvorovima. Patohistološko određivanje metastaza u

limfnim čvorovima koje nisu klinički evidentne omogućuje preciznije stupnjevanje,

određivanje prognoze i donošenje odluke o terapiji (Balch i sur., 2001b; Balch i sur.,

2001a). Najprikladniji način određivanja metastaza melanoma u regionalnim limfnim

čvorovima je biopsija i patohistološka obrada limfnih čvorova stražara (sentinela)

(Reintgen i sur., 2003; Balch i sur., 1999; Essner i sur., 1999; Dessureault i sur., 2001;

Reintgen i sur., 1995). Iako postoje neke nesuglasice oko točne definicije, limfnim

čvorovima stražarima se najčešće smatraju prvi limfni čvorovi u koje se ulijeva limfa iz

primarnog tumora (Morton i sur., 1999; Thompson i sur., 2003). Istraživanja su pokazala

da primjena vitalne plave boje (najčešće patent blue-V ili isosulfan blue (Lymphazurin)) i

koloida s radioaktivnim izotopom 99mTc, čije se nakupljanje u limfnom čvoru

intraoperacijski detektira gama kamerom, omogućuje točnu identifikaciju limfnih čvorova

stražara u 99% slučajeva (Gershenwald i sur., 1998; Gershenwald i sur., 2003). Smatra se

da obrada limfnih čvorova stražara omogućuje točnije određivanje metastaza u odnosu na

radikalnu disekciju i patohistološku obradu svih regionalnih limfnih čvorova (Reintgen i

sur., 2003; Essner i sur., 1999; Dessureault i sur., 2001). Radikalna disekcija regionalnih

limfnih čvorova je opravdana u slučaju klinički evidentnih metastaza, patohistološki

potvrđenih metastaza u limfnim čvorovima stražarima, te u slučaju kada je nemoguće na

propisan način provesti određivanje i biopsiju limfnih čvorova stražara (Reintgen i sur.,

2003). Iako se praksa donekle razlikuje od ustanove do ustanove, biopsija i patohistološka

obrada limfnih čvorova stražara uglavnom se preporučuju u svih bolesnika s primarnim

melanomom debljim od 1 mm, budući da je u bolesnika s primarnim melanomom tanjim

od 1 mm vjerojatnost metastaza u regionalnim limfnim čvorovima vrlo mala (Reintgen i

22

sur., 2003; Lens i sur., 2002). Trenutno je u SAD-u u tijeku opsežno kliničko istraživanje,

Multicenter Selective Lymphadenectomy Trial pod vodstvom dr. Donalda Mortona, kojim

se želi odrediti terapijska vrijednost biopsije limfnih čvorova stražara u smislu utjecaja na

preživljenje i pojavu recidiva bolesti (Reintgen i sur., 2003).

Radioterapija se provodi kao palijativni oblik liječenja u bolesnika s lokalno

uznapredovalom bolesti, s metastazama u kostima i u središnjem živčanom sustavu, te u

slučaju da tumor pritišće leđnu moždinu (McKay i sur., 2003; Ainslie i sur., 2003).

Radioterapija se provodi i u bolesnika s metastazama limfnih čvorova u nekim osobitim

slučajevima kao što je na primjer širenje tumora izvan kapsule limfnog čvora (McKay i

sur., 2003; Ainslie i sur., 2003).

Kao dopuna kirurškom liječenju u bolesnika s umjerenim i visokim rizikom za

razvoj udaljenih metastaza (stadiji 2 i 3 prema AJCC) primjenjuje se i kemoterapija,

najčešće dakarbazinom (DTIC), samim ili u kombinaciji s drugim kemoterapijskim

lijekovima. Ovaj se oblik liječenja, nažalost, nije pokazao učinkovitim u većini kliničkih

studija (Agarwala i sur., 2003; Veronesi i sur., 1982). Kemoterapija se primjenjuje i u

bolesnika s udaljenim metastazama. Tako se primjenom dakarbazina postiže objektivni

odgovor od oko 20% u bolesnika s udaljenim metastazama, no ta terapija nije pokazala

statistički značajan utjecaj na preživljenje bolesnika (Serrone i sur., 2000). Uz sam

dakarbazin najviše se istražuju sljedeći polikemoterapijski protokoli: CVD (cisplatina,

vinblastin i dakarbazin) i tzv. "Dartmouth režim" (dakarbazin, biskloretilnitrozourea

(BCNU), cisplatina i tamoxifen). Ti polikemoterapijski protokoli nisu pokazali bolje

rezultate od samog dakarbazina (Attalah i sur., 2005).

U bolesnika s udaljenim metastazama biokemoterapija interleukinom-2 (IL-2) i

interferonom-α (IFN-α) u kombinaciji s kemoterapijskim lijekovima u većini studija nije

postigla značajno bolje rezultate od kemoterapije dakarbazinom (Attalah i sur., 2005).

Kao adjuvantno sredstvo, dobre rezultate, nažalost često praćene i relativno

visokom toksičnošću, u liječenju bolesnika s visokim rizikom za razvoj udaljenih

metastaza (stadiji 2B i 3 prema AJCC) pokazuje interferon-α−α−α−α−2b (IFN-α−α−α−α−2b), kao

imunoterapijski lijek (Agarwala i sur., 2003). Nekoliko je istraživanja pokazalo da

primjena visoke doze IFN-α−2b značajno smanjuje rizik od recidiva i od smrti od

melanoma u ovih bolesnika (Agarwala i sur. 2003; Kirkwood i sur., 2001).

Određenu učinkovitost pri liječenju bolesnika s udaljenim metastazama melanoma

pokazao je interleukin 2 (IL-2) kao imunoterapijski lijek (Atkins i sur., 2000;

Schwartzentruber i sur., 2003). U jednom kliničkom istraživanju u 270 bolesnika s

23

metastatskim melanomom, primjenom visoke doze IL-2 postigao se potpuni odgovor u

6%, te djelomični odgovor u 10% bolesnika (Atkins i sur., 2000).

Istražuju se i neke druge metode liječenja melanoma, među kojima obećavajuće

rezultate pokazuju neki oblici genskog liječenja i liječenja zasnovanog na vakcinaciji

protiv melanomskih antigena (Sotomayor i sur, 2002; Zarour i sur., 2003). U najnovije

vrijeme istražuje se i ciljano liječenje (engl. targeted therapy) melanoma. U tome smislu je

obećavajuće rezultate pokazao inhibitor Raf kinaze, BAY 43-9006 (sorafenib; Nexavar®)

(Danson i sur., 2005).

2.1.8. MELANOM OKA, MELANOM SLUZNICE I METASTAZE

NEPOZNATOG PRIMARNOG MELANOMA

Uz kožu kao daleko najučestalije primarno sijelo, melanom može nastati i na drugim

dijelovima tijela u kojima su prisutni melanociti. Među ne-kožnim melanomima oko 80%

čine melanomi oka (uvealni melanomi), a oko 20% melanomi sluznica (Scotto i sur.,1976).

Uvealni melanom je najučestaliji primarni tumor oka (Sahel i sur., 2001). Javlja se na svim

dijelovima uvealnog trakta: žilnici, zrakastom tijelu i šarenici. Melanom šarenice ima

značajno bolju prognozu od melanoma žilnice i zrakastog tijela (Sahel i sur., 2001). Kao i

kožni melanom, i uvealni melanom nastaje iz melanocita i smatra se da može nastati

zloćudnom pretvorbom već postojećih nevusa (Bataille i sur., 1995). Stopa incidencije

uvealnog melanoma u SAD-u iznosi 0,43 na 100 000 stanovnika i nije se značajnije

mijenjala u razdoblju od 1973. do 1997. (Singh i sur., 2003). Puno je učestaliji u bijelaca

nego u drugih rasa (Sahel i sur., 2001). Pokazalo se da su neki od čimbenika rizika za

razvoj uvealnog melanoma svijetla boja šarenice i izloženost sunčevu UV-zračenju (Singh

i sur., 2004; Saornil, 2004). Patohistološki se uvealni melanom dijeli na tri osnovna tipa:

tip vretenastih stanica A, tip vretenastih stanica B i tip epiteloidnih stanica. Tip

epiteloidnih stanica ima značajno najlošiju prognozu (Isager i sur., 2004). Uvealni

melanom metastazira samo krvlju, a ne limfom, budući da u oku nema limfnih žila (Sahel i

sur., 2001). Najčešće sijelo udaljenih metastaza uvealnog melanoma je jetra (Sahel i sur.,

2001). Budući da često nije praćen osobitim simptomima u ranijim fazama progresije,

uvealni se melanom često dijagnosticira u već uznapredovalom stadiju, kada je velika

vjerojatnost da je već metastazirao, zbog čega je prognoza za te bolesnike nepovoljna.

Jedno istraživanje je pokazalo da je petogodišnje preživljenje bolesnika nakon enukleacije

24

s uvealnim melanomom tanjim od 2,5 mm 84%, debljine od 2,5 mm do 10 mm 68% te

debljim od 10 mm 47% (Diener-West i sur., 1992). Prognoza je značajno lošija u bolesnika

u kojih je došlo do širenja tumorske mase uvealnog melanoma izvan samog oka (Affeldt i

sur., 1980; Sahel i sur., 2001). Uvealni melanomi visine veće od 10 mm i promjera većeg

od 15 mm redovito se liječe kirurški enukleacijom (Sahel i sur., 2001). Za srednje velike

melanome (visina <10mm, promjer < 15 mm) pokazalo se da brahiterapija ili radioterapija

snopovima protona ili iona helija daje jednake rezultate kao i enukleacija (Sahel i sur.,

2001; Diener-West i sur, 2001; Bell i sur., 2004). U slučaju visine tumora manje od 1,5

mm, najčešće se preporučuje samo dalje promatranje (Sahel i sur., 2001).

Melanom sluznice po nekim studijama predstavlja oko 4% svih melanoma (Scotto i

sur., 1976; Iversen i sur., 1980; Ross i sur., 2003b). Javlja se najčešće na sluznicama glave

i vrata, zatim vulve i vagine, anorektalnog područja, mokraćnog trakta i najrjeđe jednjaka

(Ross i sur., 2003b; Iversen i sur., 1980). Melanom sluznice je redovito praćen lošom

prognozom, što se najčešće objašnjava činjenicom da se ti tumori za razliku od kožnog

melanoma redovito dijagnosticiraju relativno kasno u već uznapredovanom stadiju (Ross i

sur., 2003b). U usporedbi s kožnim melanomom trenutne spoznaje o patogenezi,

prognostičkim čimbenicima, sustavima stupnjevanja i adekvatnom liječenju melanoma

sluznice su oskudne i nedostatne (Ross i sur., 2003b).

Melanom se u 4 do 12% slučajeva, ovisno o istraživanju, manifestira u obliku

metastaza regionalnih limfnih čvorova ili udaljenih metastaza, a da nije otkriven primarni

melanom (Reintgen i sur., 1983). Pretpostavlja se da se u tim slučajevima radi ili o

melanomu nastalom de novo u limfnim čvorovima, odnosno visceralnim organima ili o

metastazi primarnog kožnog melanoma koji je nestao spontanom regresijom. Prognoza i

način liječenja u slučaju metastaza nepoznatog primarnog melanoma jednaki su kao i u

slučaju kada je primarni tumor poznat (Reintgen i sur., 1983).

25

2.2. TUMORSKI BILJEZI U DIJAGNOSTICI MELANOMA 2.2.1. TUMORSKI BILJEZI

Tumorski biljezi se mogu definirati kao tvari čija prisutnost ili promjena

koncentracije upućuju na pojavu ili progresiju tumora (Petrinović i sur., 2000). Iako se

klinička primjena tumorskih biljega intenzivno istražuje u novije vrijeme, prvi je tumorski

biljeg opisan još 1847 (Bence Jones, 1847). Tada je Henry Bence Jones primijetio da su

kod bolesnika s plazmacitomom prisutni laki lanci imunoglobulina u urinu (Bence Jones,

1847). Tumorski biljezi su vrlo raznolike molekule. Oni mogu biti proizvod samog tumora

ili proizvod organizma kao reakcija na tumor (Petrinović i sur., 2000). Po kemijskom

sastavu su to najčešće proteini i glikoproteini, ali i DNA i RNA se mogu analizirati kao

tumorski biljezi. Među proteinskim tumorskim biljezima izdvajaju se enzimi. Tumorski

biljezi se mogu podijeliti na stanične ili tkivne koji se nalaze na membrani ili unutar same

tumorske stanice te na humoralne ili serumske koje tumorske stanice ili organizam

potaknut tumorom otpuštaju u izvanstaničnu tekućinu i čija se prisutnost ili koncentracija

određuju u serumu ili u nekoj drugoj tjelesnoj tekućini (Petrinović i sur., 2000).

Opravdanost kliničke primjene nekog tumorskog biljega ovisi o nekoliko

parametara. Osnovni parametri su: specifičnost, osjetljivost, pozitivna prediktivnost i

negativna prediktivnost (O'Rourke, 1993). Specifičnost je omjer broja stvarno negativnih

osoba (testiranih osoba koje nemaju bolest i testom (određivanjem tumorskog biljega) su

detektirane kao negativne) i ukupnog broja testiranih osoba koje nemaju bolest.

Osjetljivost je omjer broja stvarno pozitivnih osoba (testiranih osoba koje imaju bolest i

testom su detektirane kao pozitivne) i ukupnog broja testiranih osoba koje imaju bolest.

Pozitivna prediktivnost testa je vjerojatnost da osoba ima bolest ako je rezultat testa

pozitivan, a negativna prediktivnost testa je vjerojatnost da osoba nema bolest ako je

rezultat testa negativan. Da bi se izračunale pozitivna i negativna prediktivnost testa

potrebno je znati kolika je prevalencija bolesti u populaciji.

Tumorski biljezi imaju nekoliko primjena. Mogu se koristiti za probiranje (engl.

screening) zdrave populacije ili populacije visokorizične za razvoj tumora (O'Rourke,

1993). U tome smislu se kod melanoma najviše istražuju mutacije u genu CDKN2A (engl.

cycline-dependent kinase inhibitor 2A), ali još uvijek se ne preporučuje rutinsko

određivanje ovog biljega (Hansen i sur., 2004; Kefford i sur., 1999). Tumorski biljezi se

zatim mogu koristiti za postavljanje dijagnoze (O'Rourke, 1993). U tu svrhu se najčešće

26

primjenjuju tumorski biljezi za imunohistokemijsku dijagnostiku. I konačno, tumorski

biljezi se primjenjuju za određivanje prognoze i praćenje tijeka bolesti u bolesnika koji su

u remisiji (u svrhu ranog otkrivanja metastaza ili recidiva bolesti) ili primaju terapiju (u

svrhu praćenja odgovora na terapiju) (O'Rourke, 1993). U tu svrhu se najčešće primjenjuju

serumski tumorski biljezi i određivanje cirkulirajućih tumorskih stanica.

Razvoj novih citogenetičkih metoda (komparativne genomske hibridizacije (CGH,

engl. comparative genomic hybridization) i fluorescencijske in situ hibridizacije (FISH)),

molekularno-genetičkih metoda kao što je određivanje gubitka heterozigotnosti (LOH,

engl. loss of heterozygosity), te genomike, transkriptomike i proteomike, omogućio je i

novi pristup analizi tumorskih biljega u bolesnika s melanomom (Pollock i sur., 2003;

Kashani-Sabet, 2004). Sve te metode, uz to što nam omogućuju nove uvide u proces

nastanka i biologiju melanoma, također nam nude mogućnost analize promjena na nivou

DNA i RNA, odnosno na nivou cijelog genoma, transkriptoma i proteoma, koje nam mogu

pružiti informacije korisne pri postavljanju dijagnoze i određivanju prognoze u bolesnika s

melanomom (Pollock i sur., 2003; Kashani-Sabet, 2004).

2.2.2. BILJEZI ZA IMUNOHISTOKEMIJSKU DIJAGNOSTIKU MELANOMA

Imunohistokemija uključuje primjenu protutijela kako bi se odredila prisutnost

specifičnih antigena u stanicama u uzorku tkiva. Imunohistokemijske metode primjenjuju

se u dijagnostici melanoma kada se klasičnim patohistološkim metodama (bojanje uzoraka

hematoksilinom i eozinom) ne može sa sigurnošću utvrditi radi li se o melanomu.

Imunohistokemija se primjenjuje i za otkrivanje metastaza melanoma u regionalnim

limfnim čvorovima, što je od presudne važnosti za predviđanje daljnjeg tijeka bolesti i

određivanje terapije. U imunohistokemijskoj dijagnostici melanoma najčešće se koriste

protutijela HMB-45 specifična za protein gp100 i protutijela specifična za protein S100

(Yaziji i sur., 2003). Protein S100 eksprimiraju gotovo svi melanomi, ali i sarkomi, tumori

živčanih ovojnica, te neki karcinomi (Ruiter i sur., 1993; Yaziji i sur., 2003). U usporedbi s

proteinom S100, gp100 je kao imunohistokemijski melanomski biljeg pokazao veću

specifičnost, ali i manju osjetljivost, što znači da se njime ne mogu detektirati svi

melanomi (Ruiter i sur., 1993; Yaziji i sur., 2003).

I brojne druge molekule se istražuju kao potencijalni biljezi za imunohistokemijsku

dijagnostiku melanoma. Kao biljezi koji bi mogli pomoći u razlikovanju melanoma od

27

dobroćudnih melanocitnih lezija obećavajuće rezultate su pokazali: β3-integrini, CD44,

Ki-67, ciklin D1, p16, p53 i CD26 (Mangini i sur., 2002). U razlikovanju melanoma od

nemelanocitnih lezija obećavajuće rezultate su pokazali: adhezijska molekula

MUC18/Mel-CAM, Melan-A/MART-1, mikroftalmijski transkripcijski čimbenik (MITF,

engl. microphthalmia-associated transcription factor) i tirozinaza (Mangini i sur., 2002;

Sheffild i sur., 2002; King i sur. 1999; Yaziji i sur., 2003).

Mnoge se molekule istražuju kao prognostički imunohistokemijski biljezi u

bolesnika s melanomom (Tablica 6) (Li i sur., 2002). Za neke se od njih pokazalo da im je

ekspresija u tumorskom tkivu u korelaciji sa stupnjem progresije tumora (Li i sur., 2002).

Međutim, stvarni prognostički značaj tih biljega nije jednoznačno potvrđen, tako da se za

sada ne može opravdati njihova rutinska klinička primjena (Li i sur., 2002).

Tablica 6. Molekule istraživane kao prognostički imunohistokemijski biljezi u bolesnika s

melanomom (Li i sur. 2002.).

biljezi stanične proliferacije

Ki-67

tumor-supresorski geni p53, p16 (CDKN2A), p21, p27

onkogeni c-myc

adhezijske molekule integrini, CD44, MUC-18, ICAM-1, E-kadherin

metaloproteinaze (MMP-1, MMP-2, MMP-9, MMP-13)

tkivni inhibitori metaloproteinaza (TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3)

molekule koje sudjeluju u enzimskoj razgradnji izvanstaničnog matriksa

aktivatori plazminogena (uPA, tPA)

2.2.3. SERUMSKI MELANOMSKI BILJEZI

Mnoge se tvari istražuju kao potencijalni serumski melanomski biljezi. Većina njih,

kao npr. enzim neuron-specifična enolaza (NSE), interleukin-10 (IL-10) i topivi

receptor za interleukin-2 (sIL-2R), nisu pokazali zadovoljavajuću osjetljivost ni

specifičnost (Li i sur., 2002; Buzaid i sur., 1994; Reintgen i sur., 1992; Boyano i sur.,

2000). Jedini biljeg koji je kao neovisni prognostički čimbenik uključen u sustav

stupnjevanja melanoma po AJCC iz 2002. je povišena koncentracija enzima laktat

dehidrogenaze (LDH) u serumu (Balch i sur., 2001b). Iako je u više studija LDH

potvrđen kao neovisni prognostički čimbenik u bolesnika s melanomom, koncentracija

28

LDH u serumu može biti povišena i kod drugih zloćudnih i dobroćudnih bolesti, tako da se

LDH ne može smatrati tumorskim biljegom specifičnim za melanom (Sirott i sur., 1993;

Manola i sur., 2000; Gershenwald i sur., 2003; Waldmann i sur., 2001a). Kao potencijalni

serumski melanomski biljeg puno je istraživan protein S100, odnosno njegova podjedinica

S100-ββββ (Li i sur., 2002; Harpio i sur., 2004; Waldmann i sur., 2001a). S100 je protein koji

veže kalcij i sudjeluje u prijenosu signala u stanici (Waldmann i sur., 2001a; Harpio i sur.,

2004). Njegova koncentracija u serumu najčešće se određuje luminoimunometrijski (Li i

sur., 2002). Pokazalo se da je povišena koncentracija S100-β u serumu značajno učestalija

u melanomskih bolesnika u višem stadiju bolesti (Li i sur., 2002; Harpio i sur., 2004). Na

osnovu dosadašnjih rezultata određivanje koncentracije S100-β u serumu moglo bi imati

kliničku važnost u određivanju prognoze i predviđanju recidiva u bolesnika u

uznapredovalom stadiju bolesti te kod praćenja odgovora bolesnika na terapiju (Li i sur.,

2002; Harpio i sur., 2004). Kao serumski melanomski biljeg istražuje se i protein MIA

(engl. melanoma inhibitory activity) (Li i sur., 2002; Bosserhoff i sur., 1999; Faries i sur.,

2004; Stahlecker i sur., 2000; Bosserhoff i sur., 2001; Waldmann i sur., 2001a). Njegova

serumska koncentracija se određuje tehnikom ELISA (engl. enzyme-linked

immunosorbent assay) (Li i sur., 2002). Pokazalo se da je povišena koncentracija proteina

MIA u serumu značajno učestalija u bolesnika u višem stadiju bolesti (Bosserhoff i sur.,

1999; Li i sur., 2002; Stahlecker i sur., 2000). S obzirom na rezultate dosad objavljenih

studija, određivanje koncentracije MIA proteina u serumu moglo bi imati kliničku važnost

u predviđanju pojave udaljenih metastaza i u praćenju odgovora na terapiju (Bosserhoff i

sur., 1999; Li i sur., 2002; Faries i sur., 2004; Stahlecker i sur., 2000; Bosserhoff i sur.,

2001). Različite su studije pokazale međusobno oprečne rezultate s obzirom na

prognostičku vrijednost određivanja sijalične kiseline vezane za lipide (LASA-P, engl.

lipid-associated sialic acid) u serumu bolesnika s melanomom (Li i sur., 2002; Millotes i

sur., 1996; Reintgen i sur., 1992). Neke obećavajuće rezultate kao serumski melanomski

biljeg, pokazao je metabolit melanina, 5-S-cisteinildopa (5SCD) (Li i sur., 2002). U

novijim istraživanjima je određivanje kompleksa tumorskog antigena TA-90 i specifičnih

Ig G protutijela (TA-90 IC, engl. TA-90 immune complex) u serumu pokazalo statistički

značajnu prognostičku vrijednost (Cheung i sur., 2002; Kelley i sur., 2001; Kelley i sur.,

1998). U jednoj je studiji TA-90 IC pokazao osjetljivost od 92% i specifičnost od 86% u

predviđanju recidiva melanoma (Kelley i sur., 2001).

29

2.2.4. ODREĐIVANJE CIRKULIRAJUĆIH MELANOMSKIH STANICA

Na temelju pretpostavke o povezanosti cirkulirajućih tumorskih stanica s nastankom

udaljenih metastaza, prisutnost cirkulirajućih melanomskih stanica istražuje se kao mogući

prognostički biljeg u bolesnika s melanomom. Međutim, stvarni biološki i klinički značaj

cirkulirajućih tumorskih stanica nije potpuno razjašnjen. Pokazalo se da tek manje od 0,1%

cirkulirajućih melanomskih stanica razvije metastaze (Fidler, 1970).

Prije uvođenja metode lančane reakcije polimerazom nakon obrnutog prepisivanja

(reverzne transkripcije) (RT-PCR, engl. reverse transcription - polymerase chain reaction),

istraživači su citološkim i imunocitokemijskim postupcima pokušali odrediti prisutnost

cirkulirajućih tumorskih stanica (Johnson i sur., 1995). Međutim, ti postupci nisu pokazali

dovoljno nizak prag detekcije. Tek se primjenom metode RT-PCR dosegao prag detekcije

dovoljno nizak za određivanje malog broja cirkulirajućih tumorskih stanica (Smith i sur.,

1991). Smith i suradnici su 1991. prvi pokazali da se metodom RT-PCR, uz primjenu

glasničke RNA (mRNA) za tirozinazu kao specifičnog biljega, mogu otkriti cirkulirajuće

melanomske stanice (Smith i sur., 1991).

Tirozinaza (monofenol – monooksigenaza, EC 1.14.18.1) je enzim koji katalizira

prva dva koraka u biosintezi melanina: pretvorbu tirozina u dihidroksifenilalanin (DOPA) i

pretvorbu dihidroksifenilalanina u dopakinon (Hearing i sur., 1987). Tirozinazu

eksprimiraju samo melanociti, Schwannove stanice i melanomske stanice koje potječu od

melanocita (Kwon i sur., 1987; Battyani i sur., 1993). Budući da u krvi normalno nema

melanocita ni Schwannovih stanica, nalaz mRNA za tirozinazu u perifernoj krvi

melanomskih bolesnika upućuje na prisutnost melanomskih stanica.

Brojna istraživanja koja su uslijedila nakon što su Smith i suradnici objavili svoje

rezultate potvrdila su nizak prag detekcije i visoku specifičnost ove metode. Prag detekcije

je u većini istraživanja bio dovoljno nizak da omogući otkrivanje 1-10 melanomskih

stanica među 107 limfocita periferne krvi, odnosno 1-10 melanomskih stanica u 10 mL

periferne krvi (Brownbridge i sur., 2001; Hoon i sur., 1995; Brossart i sur., 1993; Jung i

sur., 1997; Glaeser i sur., 1997; Szenajch i sur., 1998; Farthmann i sur., 1998; Smith i sur.,

1991; Mellado i sur., 2002; Tsao i sur., 2001; Gogas i sur., 2002; Reinhold i sur., 1997;

Curry i sur., 1998; Schittek i sur., 1999b; Kulik i sur., 2001; Schrader i sur., 2000; Mellado

i sur., 1999; Curry i sur., 2001; Proebstle i sur., 2000; Mellado i sur., 1996; Battayani i sur.,

1995; Kunter i sur., 1996; Queraux i sur., 2000). U većini su istraživanja svi uzorci krvi

davatelja koji nisu imali melanom bili negativni na tirozinazu, što pokazuje visoku

30

specifičnost ove metode (Brownbridge i sur., 2001; Hoon i sur., 1995; Brossart i sur.,

1993; Jung i sur., 1997; Glaeser i sur., 1997; Szenajch i sur., 1998; Farthmann i sur., 1998;

Smith i sur., 1991; Mellado i sur., 2002; Tsao i sur., 2001; Gogas i sur., 2002; Reinhold i

sur., 1997; Curry i sur., 1998; Schittek i sur., 1999a; Kulik i sur., 2001; Schrader i sur.,

2000; Mellado i sur., 1999; Curry i sur., 2001; Proebstle i sur., 2000; Mellado i sur., 1996;

Battayani i sur., 1995; Kunter i sur., 1996; Queraux i sur., 2000). U nekim je istraživanjima

uočena povezanost između nalaza melanomskih stanica u perifernoj krvi i stadija bolesti

(Schittek i sur., 1999a; Proebstle i sur., 2000; Mellado i sur., 1996; Brownbridge i sur.,

2001; Farthmann i sur., 1998; Hoon i sur., 2000; Hoon i sur., 1995; Carillo i sur., 2002).

Što je stadij bolesti bio viši, veći je bio udio bolesnika pozitivnih na tirozinazu. Međutim, u

nekim drugim istraživanjima povezanost između nalaza melanomskih stanica u perifernoj

krvi i stadija bolesti nije uočena (Mellado i sur., 2002; Gogas i sur., 2002; Kulik i sur.,

2001; Ranieri i sur., 2005; Mellado i sur., 1999).

Istraživana je i prognostička vrijednost određivanja cirkulirajućih melanomskih

stanica. U većini su ovih istraživanja bolesnici s pozitivnim nalazom tirozinaze u perifernoj

krvi imali značajno povećan rizik od recidiva bolesti i kraće preživljenje (Mellado i sur.,

1999; Curry i sur., 2001; Proebstle i sur., 2000; Mellado i sur., 1996; Battayani i sur., 1995;

Kunter i sur., 1996; Gogas i sur., 2002; Mellado i sur., 2002). Međutim, objavljeni su i

rezultati istraživanja u kojima određivanje cirkulirajućih melanomskih stanica u bolesnika

s melanomom nije pokazalo prognostičku vrijednost (Ranieri i sur., 2005; Queraux i sur.,

2000).

Stvarnu kliničku vrijednost određivanja cirkulirajućih melanomskih stanica

umanjuje činjenica da je u gotovo svim istraživanjima određeni udio bolesnika s klinički

potvrđenim udaljenim metastazama bio negativan na tirozinazu (Tsao i sur., 2001; Jung i

sur., 1997; Glaeser i sur., 1997; Brownbridge i sur., 2001; Farthmann i sur., 1998; Mellado

i sur., 1999; Proebstle i sur., 2000; Mellado i sur., 1996; Battayani i sur., 1995; Kunter i

sur., 1996; Quereux i sur., 2000; Smith i sur., 1991; Schittek i sur., 1999a; Schrader i sur.,

2000; Kulik i sur., 2001; Reinhold i sur., 1997; Mellado i sur., 2002; Reynolds i sur., 2003)

(Tablica 7). Jedno objašnjenje takvog nalaza je da dio melanomskih stanica tijekom

tumorske progresije izgubi ekspresiju gena za tirozinazu (Schittek i sur., 1999a; Kulik i

sur., 2001). U tom bi se slučaju osjetljivost određivanja cirkulirajućih melanomskih stanica

mogla povećati analizom dodatnih biljega uz tirozinazu. Taj se pristup pokazao uspješnim

u više istraživanja, u kojima je uočen veći udio melanomskih bolesnika s pozitivnim

31

nalazom, kada je uz tirozinazu analiziran i melanomski biljeg Melan-A/MART-1 (Curry i

sur., 1998; Schittek i sur., 1999a; Kulik i sur., 2001).

Uz tirozinazu i Melan-A/MART-1, još su neke molekule (MIA (engl. melanoma

inhibitory activity), MAGE-3 i TRP-2 (engl. tyrosinase related protein-2)) pokazale visoku

specifičnost i nizak prag detekcije kada su istraživane kao biljezi za određivanje

cirkulirajućih melanomskih stanica metodom RT-PCR (Mühlbauer i sur. 1999; Schrader i

sur., 2000; Hoon i sur., 1995; Schmidt i sur., 2002).

Neke druge molekule (MUC18, p97 i gp100) koje su istraživane kao mogući biljezi

za određivanje cirkulirajućih melanomskih stanica metodom RT-PCR nisu se pokazale

dostatno specifičnima, tj. dobiven je pozitivan nalaz i u zdravih davatelja, pa se ne mogu

smatrati pouzdanim melanomskim biljezima (Hoon i sur., 1995; Curry i sur., 1998;

Schittek i sur., 1999b; Kulik i sur., 2001).

Tablica 7. Udio melanomskih bolesnika s udaljenim metastazama i pozitivnim nalazom tirozinaze

u perifernoj krvi metodom RT-PCR u različitim istraživanjima.

ISTRAŽIVANJE

POZITIVNI, broj/ukupni

broj testiranih

POZITIVNI, %

Smith i sur., 1991. 4/6 67%

Brossart i sur., 1993. 29/29 100%

Battayani i sur., 1995. 16/32 50%

Mellado i sur., 1996. 33/35 94%

Kunter i sur., 1996. 9/34 27%

Reinhold i sur., 1997. 5/13 39%

Glaser i sur., 1997. 12/44 27%

Jung i sur., 1997. 13/50 26%

Farthmann i sur., 1998. 16/36 44%

Schittek i sur., 1999. 21/58 36%

Mellado i sur., 1999. 2/13 15%

Schrader i sur., 2000. 13/80 16%

Proebstle i sur, 2000. 16/24 67%

Brownbridge i sur., 2001. 30/37 81%

Quereux i sur., 2001. 20/32 63%

Mellado i sur., 2002. 5/15 33%

Reynolds i sur., 2003. 3/11 27%

32

Drugo moguće objašnjenje negativnog nalaza tirozinaze u perifernoj krvi bolesnika

s udaljenim metastazama temelji se na modelu metastatskog procesa po kojem se tumorske

stanice otpuštaju u cirkulaciju nasumično i diskontinuirano (Reinhold i sur., 1997). Taj

model potkrjepljuju rezultati istraživanja u kojem su među uzorcima krvi istog

melanomskog bolesnika uzimanima u vremenskim razmacima po 2 sata neki bili pozitivni

a neki negativni na tirozinazu (Reinhold i sur., 1997).

Szenajch i sur. su ponudili još jedno moguće objašnjenje negativnog nalaza

tirozinaze u perifernoj krvi bolesnika s udaljenim metastazama (Szenajch i sur., 2002). Oni

smatraju da su melanomske stanice prisutne u cirkulaciji gotovo svih melanomskih

bolesnika, ali je njihov broj manji od praga detekcije metode (Szenajch i sur., 2002).

Naime, iako se metodom RT-PCR može otkriti i samo jedna melanomska stanica u uzorku

krvi od 5 mL, moguće je da u uzorku krvi ne bude prisutna niti jedna melanomska stanica

ako je njihov broj u cijelom krvotoku dovoljno malen. U prilog ovoj hipotezi govori

istraživanje koje je pokazalo da se vjerojatnost pozitivnog nalaza tirozinaze u perifernoj

krvi bolesnika s melanomom povećava razmjerno s brojem analiziranih uzoraka krvi

pojedinog bolesnika (Szenajch i sur., 2002).

U novije vrijeme su objavljeni rezultati istraživanja u bolesnika s melanomom koji

su primali adjuvantnu imunoterapiju, koji pokazuju da određivanje cirkulirajućih

melanomskih stanica metodom RT-PCR može poslužiti kao biljeg za praćenje odgovora na

terapiju (Gogas i sur., 2002; Reynolds i sur., 2003; Mellado i sur., 2002).

2.2.5. ODREĐIVANJE MELANOMSKIH STANICA U LIMFNIM ČVOROVIMA,

KOŠTANOJ SRŽI I CEREBROSPINALNOM LIKVORU

Metastatska zahvaćenost regionalnih limfnih čvorova važan je prognostički

čimbenik u bolesnika s melanomom. Pokazalo se da je u melanomskih bolesnika koji nisu

imali klinički evidentne metastaze regionalnih limfnih čvorova, patohistološki potvrđena

prisutnost metastaza u regionalnim limfnim čvorovima najznačajniji neovisni prognostički

čimbenik (Balch i sur, 2001a).

Metastaze melanoma u regionalnim limfnim čvorovima najčešće se standardno

određuju pregledavanjem histoloških prereza obojenih hematoksilinom i eozinom pod

svjetlosnim mikroskopom (HE bojanje) (Reintgen i sur., 2003). Ovim postupkom se može

naći jedna tumorska stanica među 104 zdravih stanica (Shivers i sur., 1998). Primjenom

33

imunohistokemijskih metoda može se naći jedna tumorska stanica među 105 zdravih

(Reintgen i sur., 2003). Pokazalo se da imunohistokemijska analiza omogućuje otkrivanje

metastaza regionalnih limfnih čvorova u 20% više melanomskih bolesnika nego standardna

patohistološka analiza (HE bojanje) (Reintgen i sur., 2003). Kao biljezi za

imunohistokemijsku analizu najčešće se primjenjuju S100 i gp100 (protutijela HMB-45).

I HE bojanje i imunohistokemijska analiza temelje se na obradi određenog broja

prereza, čime se pregledava samo manji dio limfnog čvora (Reintgen i sur., 2003). Moguće

je da se takvom analizom previde manje nakupine melanomskih stanica koje se ne nalaze u

pregledanim prerezima. U prilog tome govore podaci da određen dio bolesnika kojima nisu

nađene metastaze regionalnih limfnih čvorova HE bojanjem ili imunohistokemijskom

analizom, kasnije razvije udaljene metastaze, odnosno metastaze regionalnih limfnih

čvorova (Goydos i sur., 2003; Li i sur., 2000; Ulrich i sur., 2004; Reintgen i sur., 2003;

Gershenwald i sur., 1999). S ciljem da se izdvoji ta skupina bolesnika, istraživala se

metoda RT-PCR za određivanje metastaza u regionalnim limfnim čvorovima bolesnika s

melanomom. Metodom RT-PCR može se otkriti jedna melanomska stanica među 106 do

107 zdravih (Reintgen i sur., 2003). Također metoda RT-PCR teorijski omogućuje analizu

cijelog limfnog čvora.

Istraživanja su pokazala da metoda RT-PCR omogućuje otkrivanje metastaza

regionalnih limfnih čvorova u značajno većeg broja melanomskih bolesnika nego HE

bojanje i imunohistokemijska analiza (Wang i sur., 1994; Blaheta i sur., 1999; Shivers i

sur., 1998; Li i sur., 2000; Ulrich i sur., 2004; Bostick i sur., 1999; Rimoldi i sur., 2003;

Goydos i sur., 2003). Također se pokazalo da su bolesnici kojima su metastaze otkrivene

samo metodom RT-PCR, a ne i HE bojanjem ili imunohistokemijski, imali značajno kraće

preživljenje i veći rizik za recidiv od bolesnika kojima metastaze nisu otkrivene ni HE

bojanjem ili imunohistokemijski, niti metodom RT-PCR (Shivers i sur., 1998; Ulrich i sur.,

2004; Bostick i sur., 1999). Ovi rezultati upućuju na to da metoda RT-PCR omogućuje

otkrivanje klinički relevantnih metastaza koje se ne mogu otkriti HE bojanjem ni

imunohistokemijskim metodama.

Pokazalo se, međutim, da većina bolesnika kojima su metodom RT-PCR otkrivene

metastaze regionalnih limfnih čvorova ipak ne razvije recidiv, što umanjuje kliničku

vrijednost ovog postupka (Reintgen i sur., 2003; Shivers i sur., 1998; Goydos i sur., 2003;

Ulrich i sur., 2004). Jedno objašnjenje ovih rezultata je da su u bolesnika u kojih su

metastaze otkrivene metodom RT-PCR u limfnim čvorovima stražarima, jedino ti limfni

čvorovi stražari bili zahvaćeni metastazama pa je njihova biopsija zapravo dovela do

34

potpunog izlječenja (Reintgen i sur., 2003). Dio pozitivnih rezultata otkrivanja

melanomskih metastaza u regionalnim limfnim čvorovima metodom RT-PCR može se

smatrati lažno pozitivnima (Reintgen i sur., 2003; Rimoldi i sur., 2003). Pokazalo se da se

u oko 5% limfnih čvorova nalaze stanice dobroćudnih nevusa koje eksprimiraju gen za

tirozinazu, a upravo je mRNA za tirozinazu u većini ovih istraživanja korištena kao

melanomski biljeg (Reintgen i sur., 2003; Rimoldi i sur., 2003). To je jedan od razloga

zašto se istražuje primjena više različitih melanomskih biljega (tirozinaza, Melan-

A/MART-1, MAGE-3, gp100 i dr.) za otkrivanje melanomskih metastaza u regionalnim

limfnim čvorovima metodom RT-PCR (Bostick i sur., 1999; Reintgen i sur., 2003; Rimoldi

i sur., 2003; McMasters, 2001; Takeuchi i sur., 2004).

Primjena metode RT-PCR za određivanje melanomskih stanica u koštanoj srži nije

pokazala veću osjetljivost u odnosu na određivanje melanomskih stanica u perifernoj krvi,

niti je pokazala prognostički značaj (Ghossein i sur., 1998; Waldmann i sur., 1999;

Waldmann i sur., 2001b).

U jednom istraživanju je analiza tirozinaze i još dva melanomska biljega (MAGE-3

i Melan-A/MART-1) metodom RT-PCR primijenjena za određivanje melanomskih stanica

u cerebrospinalnom likvoru (Hoon i sur., 2001). Metoda RT-PCR je u tome istraživanju

omogućila otkrivanje melanomskih stanica u većeg broja bolesnika nego citološka i

imunocitokemijska analiza (Hoon i sur., 2001). U istom je istraživanju uočena i značajna

povezanost između detekcije melanomskih stanica u cerebrospinalnom likvoru metodom

RT-PCR i razvoja metastaza središnjeg živčanog sustava u sljedeća 3 mjeseca (Hoon i sur.,

2001).

2.2.6. ODREĐIVANJE DRUGIH TUMORSKIH STANICA METODOM RT-PCR

Nakon što su B. Smith i suradnici 1991. godine pokazali da se metodom RT-PCR

mogu otkriti tumorske stanice u perifernoj krvi melanomskih bolesnika, uslijedila su brojna

istraživanja koja su imala za cilj naći prikladne molekulske biljege za određivanje

tumorskih stanica metodom RT-PCR u perifernoj krvi i drugim tkivima bolesnika sa

drugim tumorima.

Rak prostate može vrlo brzo rasti i metastazirati, a može imati i takav tijek bolesti

da ne predstavlja životnu opasnost niti smanjuje kvalitetu života bolesnika (Šamija i sur.,

2002; Carroll i sur., 2001). Stoga je važno pronaći molekulske biljege koji bi uputili na

metastatski potencijal raka prostate, kako bi se mogao provesti prikladan oblik liječenja.

35

Najviše su istraživani sljedeći molekulski biljezi za otkrivanje tumorskih stanica metodom

RT-PCR u perifernoj krvi, koštanoj srži i limfnim čvorovima bolesnika s rakom prostate:

antigen specifičan za prostatu (PSA, engl. prostate-specific antigen), membranski

antigen specifičan za prostatu (PSMA, engl. prostate-specific membrane antigen) i

humani kalikrein 2 (hk2) (Schamhart i sur., 2005; Su i sur., 2000; Ghossein i sur., 2001).

U većini su istraživanja uzorci dobiveni od zdravih osoba i osoba s dobroćudnim bolestima

prostate bili negativni na ove biljege, pa se ovi biljezi smatraju specifičnima za rak prostate

(Schamhart i sur., 2005; Su i sur., 2000; Ghossein i sur., 2001). Međutim, u većini je

istraživanja i određeni udio bolesnika s klinički potvrđenim udaljenim metastazama raka

prostate bio negativan na ove biljege (Su i sur., 2000; Schamhart i sur., 2005; Ghossein i

sur., 2001). U različitim istraživanjima su dobiveni proturječni rezultati s obzirom na

prognostičku vrijednost određivanja stanica raka prostate metodom RT-PCR (Ghossein i

sur., 2001; Schamhart i sur., 2005; Su i sur., 2000). Pokazalo se da metoda RT-PCR

omogućuje otkrivanje metastaza limfnih čvorova u većeg broja bolesnika s rakom prostate

nego HE bojanje i imunohistokemijska analiza (Su i sur., 2000; Deguchi i sur., 1993;

Martinez-Pineiro i sur., 2003; Shariat i sur., 2003).

Najvažniji prognostički čimbenik u bolesnika s rakom dojke je metastatska

zahvaćenost regionalnih limfnih čvorova (Margolese i sur., 2003). Međutim, 20 – 45%

bolesnika kojima standardnom patohistološkom obradom nisu nađene metastaze

regionalnih limfnih čvorova ipak razvije relaps bolesti (Margolese i sur., 2003). Jedan od

pristupa kojim se pokušava izdvojiti ta skupina bolesnika, kako bi im se ponudio

najprikladniji oblik liječenja, je određivanje stanica raka dojke u cirkulaciji, koštanoj srži i

limfnim čvorovima metodom RT-PCR. Više molekula se istraživalo kao moguće biljege za

određivanje stanica raka dojke metodom RT-PCR: citokeratin 19 (CK19), citokeratin 20

(CK20), karcinoembrionalni antigen (CEA, engl. carcinoembrionic antigen),

mamaglobin, maspin, mucin 1 (muc1) i dr. (Baker i sur., 2003; Gilbey i sur., 2004;

Ziegelschmid i sur., 2005). Istraživalo se i istovremeno određivanje više različitih biljega

(Baker i sur., 2003; Gilbey i sur., 2004; Ziegelschmid i sur., 2005). Nedostatak ovih biljega

je što su u pojedinim istraživanjima dobivene pozitivne vrijednosti i u osoba koje nisu

imale rak dojke (Baker i sur., 2003; Gilbey i sur., 2004; Ziegelschmid i sur., 2005). S

obzirom na dosad objavljene rezultate istraživanja, kao obećavajući biljeg izdvaja se

mamaglobin (Baker i sur., 2003; Ziegelschmid i sur., 2005). Pokazalo se da metoda RT-

-PCR omogućuje otkrivanje metastaza limfnih čvorova u većeg broja bolesnika s rakom

dojke nego HE bojanje i imunohistokemijska analiza (Baker i sur., 2003).

36

U tumora probavnog sustava određivanje tumorskih stanica u perifernoj krvi,

koštanoj srži i limfnim čvorovima, kao mogući rani znak metastatskog širenja bolesti,

može pomoći u donošenju odluke o radikalnom kirurškom zahvatu i adjuvantnim oblicima

liječenja. Kao biljezi za otkrivanje tumorskih stanica metodom RT-PCR u perifernoj krvi,

koštanoj srži te limfnim čvorovima bolesnika sa rakom želuca, rakom gušterače i

kolorektalnim karcinomom najviše su istraživani CEA, CK19, CK20 te u novije vrijeme

gvanilil ciklaza C (GCC) (Vogel i sur., 2001; Molnar i sur., 2003; Feezor i sur., 2002).

Međutim, u nekim su istraživanjima dobivene pozitivne vrijednosti ovih biljega i u osoba

koje nisu imale tumore probavnog sustava (Vogel i sur., 2001; Molnar i sur., 2003).

Kao specifični biljeg za određivanje cirkulirajućih tumorskih stanica u bolesnika s

rakom jetre najviše je istraživan alfa-fetoprotein (AFP) (Paterlini i sur., 1998; Liu i sur,

2002; Sheen i sur., 2004). Iako su u nekim istraživanjima dobivene pozitivne vrijednosti

alfa-fetoproteina i u osoba koje nisu imale rak jetre, ovaj biljeg je pokazao prognostičku

vrijednost (Kienle i sur., 2000; Jeng i sur., 2004; Sheen i sur., 2004; Cillio i sur., 2004).

Alfa-fetoprotein je istraživan i kao biljeg za otkrivanje tumorskih stanica u koštanoj srži

bolesnika s rakom jetre (Kienle i sur., 2000). Specifičnim biljezima za otkrivanje

cirkulirajućih tumorskih stanica u bolesnika s rakom jetre pokazali su se i MAGE-1 i

MAGE-3 (Mou i sur., 2002).

U bolesnika s rakom bubrega kao biljezi za određivanje tumorskih stanica u

perifernoj krvi metodom RT-PCR najviše su istraživani kadherin-6 i izoforma enzima

ugljične anhidraze MN/CA9 (Shimazui i sur., 2003; Li i sur., 2005; McKiernan i sur.,

1999; Uemura i sur., 2003).

Za određivanje tumorskih stanica u perifernoj krvi bolesnika s rakom pluća

metodom RT-PCR visoku specifičnost i nizak prag detekcije pokazali su sljedeći biljezi:

CEA, preproGRP (engl. preprogastrin-releasing peptide), SP-D (engl. surfactant protein

D) i receptor za neuromedin B (Castaldo i sur., 1997; Kurusu i sur., 1999; Yamashita i

sur., 2002; Lacroix i sur., 2001; Saito i sur., 2003; Qi i sur., 2002; Bessho i sur., 2000).

PreproGRP se pokazao specifičnim biljegom i za određivanje tumorskih stanica u

iskašljaju i koštanoj srži bolesnika s rakom pluća (Lacroix i sur., 2001; Saito i sur., 2003).

CEA je, uz specifičnost i nizak prag detekcije, pokazao i prognostičku vrijednost kao

biljeg za određivanje tumorskih stanica u perifernoj krvi bolesnika s rakom pluća metodom

RT-PCR (Yamashita i sur., 2002).

U 90% slučajeva Ewingovog sarkoma dolazi do kromosomske translokacije

kojom nastaje fuzijski gen sastavljen od 5' dijela gena EWS (Ewingov sarkom) i 3' dijela

37

onkogena FLI-1(engl. Friend leukaemia virus integration site 1) (Delattre i sur., 1994).

Primjenom metode RT-PCR za umnažanje mRNA transkripta tog fuzijskog gena mogu se

otkriti tumorske stanice u perifernoj krvi i koštanoj srži bolesnika s Ewingovim sarkomom

(Pfleiderer i sur., 1995). Pokazalo se da je prisutnost tumorskih stanica u perifernoj krvi i

koštanoj srži bolesnika s Ewingovim sarkomom određena ovom metodom povezana sa

lošijom prognozom (Schleiermacher i sur., 2003).

Tirozin-hidroksilaza određena metodom RT-PCR pokazala se specifičnim

biljegom za određivanje tumorskih stanica u krvi i koštanoj srži bolesnika s

neuroblastomom (Miyajima i sur., 1995; Burchill i sur., 2001). Potvrđena je i

prognostička vrijednost određivanja cirkulirajućih stanica neuroblastoma analizom ovog

biljega (Burchill i sur., 2001).

U bolesnika s rakom štitnjače kao biljeg za određivanje cirkulirajućih tumorskih

stanica metodom RT-PCR najviše je istraživan tireoglobulin (Ringel, 2004; Bojunga i

sur., 2002). Međutim, u nekim su istraživanjima dobiveni pozitivni nalazi tireoglobulina i u

zdravih osoba, tako da se tireoglobulin ne može smatrati dostatno specifičnim biljegom za

karcinom štitnjače (Ringel, 2004; Bojunga i sur., 2002).

38

2.3. MIKROFTALMIJSKI TRANSKRIPCIJSKI ČIMBENIK (MITF)

2.3.1. MITF I WAARDENBURGOV SINDROM

Mikroftalmijski transkripcijski čimbenik (MITF, engl. microphthalmia-associated

transcription factor) je transkripcijski čimbenik otkriven kao protein koji je u ljudi kodiran

na genskom lokusu povezanom s Waardenburgovim sindromom (Hodgkinson i sur., 1993;

Tachibana i sur., 1994). Waardenburgov sindrom je nasljedni auditorno-pigmentarni

sindrom koji se nasljeđuje kao autosomno dominantno svojstvo (Liu i sur., 1995). Klinički

se Waardenburgov sindrom dijeli na četiri tipa. Waardenburgov sindrom tipa 1 i

Waardenburgov sindrom tipa 3 povezani su s mutacijama u genu pax3 (Tassabehji i sur.,

1992). Waardenburgov sindrom tipa 4 ili Waardenburg-Shah-ov sindrom povezan je s

mutacijama u tri gena, genu Sox10, genu za endotelin 3, te genu za njegov receptor,

endotelinski receptor B (Widlund i sur., 2003).

Postoje brojni dokazi o povezanosti Wardenburgova sindroma tipa 2 s promjenama

u jednom alelu gena mitf (Tassebehji i sur., 1994; Tachibana, 1997). Pokazalo se da

mutacija u jednom alelu gena mitf ne utječe na aktivnost proteina kodiranog na zdravoj

kopiji gena mitf (Tachibana, 1997). Stoga se smatra da je dominantno nasljeđivanje

Waardenburgovog sindroma tipa 2 posljedica haploinsuficijencije, mehanizma kojim

protein MITF kodiran na zdravom alelu gena mitf ne može u stanici doseći koncentraciju

koja je nužna za njegovu normalnu funkciju (Tachibana, 1997). Simptomi

Waardenburgova sindroma tipa 2 su bijele mrlje na koži, promjene u pigmentaciji šarenice

i gubitak sluha povezan s gubitkom melanocita u stria vascularis pužnice (Liu i sur.,

1995). Svi ovi simptomi mogu se objasniti gubitkom melanocita. Mutacije u genu mitf

povezane su i s Tietzovim sindromom, vrlo rijetkim nasljednim auditorno-pigmentarnim

sindromom (Amiel i sur., 1998). Simptomi karakteristični za Tietzov sindrom slični su

onima u Waardenburgovog sindroma tipa 2 (poremećaji pigmentacije i sluha), samo se

javljaju u težem obliku (Amiel i sur., 1998).

Miševi s mutacijama na lokusu microphthalmia (mi) koji je odgovoran za sintezu

Mitf-a, mišjeg homolog MITF-a, imaju sljedeće poremećaje: gubitak pigmentacije,

smanjenu veličinu očiju (mikroftalmija), smanjen broj mastocita, osteoporozu kao

posljedicu poremećene funkcije osteoklasta te gubitak sluha (Moore, 1995). Ti poremećaji

upućuju na ulogu koju Mitf ima u razvoju i funkciji melanocita, mastocita, stanica

retinalnog pigmentnog epitela te osteoklasta.

39

2.3.2. IZOFORME PROTEINA MITF

Gen mitf nalazi se na trećem ljudskom kromosomu u kromosomskoj regiji 3p12.3-

3p14.1 (Tachibana i sur., 1994) i odgovoran je za sintezu najmanje šest izoformi proteina

MITF: MITF-M, MITF-A, MITF-H, MITF-B, MITF-C i MITF-D (Amae i sur., 1998; Fuse

i sur., 1999; Udono i sur., 2000; Takeda i sur., 2002) (Slika 3). Protein MITF posjeduje

bazičnu strukturu uzvojnica-omča-uzvojnica-leucinski zatvarač (bHLH-LZ, engl. basic

helix-loop-helix leucine-zipper), koja omogućuje vezanje na DNA i stvaranje dimera

(Hodgkinson i sur., 1993; Tachibana i sur., 1994). MITF pokazuje sličnost u

aminokiselinskom sastavu s još nekim transkripcijskim čimbenicima koji posjeduju istu

bHLH-LZ strukturu, kao što su TFE3, TFEB i TFEC (Hemesath i sur., 1994.; Yasumoto i

sur., 1998; Rehli i sur., 1999). MITF se može vezati na DNA kao homodimer ili kao

heterodimer s transkripcijskim čimbenicima TFE3, TFEB i TFEC (Hemesath i sur., 1994).

Sve izoforme proteina MITF imaju zajednički C-terminalni kraj s domenom

odgovornom za transkripcijsku aktivaciju i bHLH-LZ strukturom, a međusobno se

razlikuju u N-terminalnom kraju (Shibahara i sur., 2000; Shibahara i sur., 2001) (Slika 3).

Najkraća izoforma je MITF-M, koja ima 419 aminokiselina i razlikuje se od drugih

izoformi jedinstvenom N-terminalnom domenom M, slijeda aminokiselina

MLEMLEYNHY i umetkom od šest aminokiselina (ACIFPT) blizu bazičnog dijela

proteina (Yasumoto i sur., 1998). Pokazalo se da se sintetizira i protein MITF-M bez tog

umetka od šest aminokiselina (Yasumoto i sur., 1998). MITF-M je specifično eksprimiran

u melanocitima koji potječu iz neuralnog grebena i u stanicama melanoma (Amae i sur,

1998; Fuse i sur., 1999; Wachtenheim i Novotna, 1999; Selzer i sur., 2002). Pokazalo se da

je za takvu specifičnu ekspresiju izoforme MITF-M odgovoran promotor specifičan za

melanocite, s kojeg se prepisuje MITF-M (Fuse i sur., 1996).

Izoforme MITF-A, MITF-H, MITF-B i MITF-C imaju zajedničku B1b domenu od

83 aminokiseline te svaka svoju jedinstvenu N-terminalnu domenu (A, H, B1a i C)

(Shibahara i sur., 2000; Yasumoto i sur., 1998) (Slika 3). Domena A sastoji se od 35

aminokiselina, domena H od 19, domena B1a od 10 te domena C od 34 aminokiseline

(Shibahara i sur., 2000.; Udono i sur., 2000). Izoforme MITF-A i MITF-H eksprimirane su

u različitim tipovima stanica, uključujući i melanocite i melanomske stanice, a razina

njihove ekspresije varira ovisno o tipu stanica (Amae i sur, 1998; Fuse i sur., 1999;

Wachtenheim i Novotna, 1999). Izoforma MITF-C eksprimirana je u različitim tipovima

stanica, ali ne i u melanocitima i melanomskim stanicama (Fuse i sur., 1999). Najduža

40

izoforma MITF-A najzastupljenija je od svih izoformi u stanicama retinalnog pigmentnog

epitela (Amae i sur., 1998). Pokazalo se da postoji i šesta izoforma proteina MITF,

nazvana MITF-D (Takeda i sur., 2002). Izoforma MITF-D eksprimirana je u stanicama

retinalnog pigmentnog epitela, makrofagima, osteoklastima i mastocitima, što su sve

stanice koje su pogođene mutacijama u mišjem genu za Mitf (Takeda i sur., 2002). U

ostalim vrstama stanica koje su istražene, uključujući i melanocite i melanomske stanice,

nije nađena ekspresija izoforme MITF-D (Takeda i sur., 2002).

Slika 3. Shematski prikaz MITF-M, MITF-A, MITF-C, MITF-H i MITF-B izoformi proteina

MITF. Označene su: aktivacijska regija (AR), bazična uzvojnica-omča-uzvojnica leucinski

zatvarač (bHLH-LZ, od engl. basic helix-loop-helix leucine-zipper) regija, regija bogata serinom

(S), te N-terminalne regije specifične za svaku izoformu (M, A, C, H, B1a i B1b). Egzoni gena

mitf označeni su brojevima ispod odgovarajućeg dijela proteina MITF.

2.3.3. GEN MITF

Gen mitf sastoji se od najmanje pet prvih egzona (1M, 1A, 1H, 1B i 1C)

odgovornih za sintezu N-terminalne domene specifične za svaku izoformu te od osam

egzona zajedničkih svim izoformama (Udono i sur., 2000). 3' dio egzona B (B1b) je ujedno

41

i drugi egzon kod izoformi MITF-A, MITF-H i MITF-C (Udono i sur., 2000) (Slika 3).

Tako su izoforme MITF-M i MITF-B kodirane s devet egzona, dok su izoforme MITF-A,

MITF-H i MITF-C kodirane s deset egzona. Svaka izoforma se prepisuje s vlastitog

promotora, što upućuje na funkcijsku raznolikost ovih izoformi u različitim tkivima

(Udono i sur., 2000). Do sada je određen slijed aminokiselina homologa ljudskog proteina

MITF u miševa (Hodgkinson i sur., 1993), štakora (Opdecamp i sur., 1998), kokoši

(Mochii i sur., 1998a), hrčaka (Hodgkinson i sur., 1998), prepelica (Mochii i sur., 1998b) i

zebrice (Danio rerio) (Lister i sur., 1999). Svi oni pokazuju visok stupanj homologije s

ljudskim proteinom MITF.

2.3.4. FUNKCIJA I REGULACIJA PROTEINA MITF

MITF-M kao transkripcijski čimbenik potiče ekspresiju gena za tirozinazu i za

TRP-1 (engl. tyrosinase related protein 1), enzime koji imaju ključnu ulogu u sintezi

pigmenta melanina i specifično su eksprimirani u melanocitima, vezujući se za sljedove

CATGTG u promotorskim regijama tih gena (Bentley i sur., 1994; Yasumoto i sur., 1995).

Ne zna se sa sigurnošću je li MITF-M važan za transkripciju gena za dopakrom-

-tautomerazu (Dct/TRP2, engl. dopachrome-tautomerase / tyrosinase related protein 2),

treći od enzima koji sudjeluju u biosintezi melanina (Shibahara i sur., 2000). Pokazalo se

da potaknuta ekspresija gena za MITF-M u fibroblastima NIH/3T3 u kojima se on

normalno ne eksprimira pretvara te stanice u stanice koje eksprimiraju gene za tirozinazu i

TRP-1 (Tachibana i sur., 1996). U jednom je pokusu u embrije zebrice (Danio rerio) koji

nisu imali nacre, funkcionalni homolog gena mitf, u stanice unesen divlji tip gena nacre,

što je bilo dovoljno da potakne razvoj pigmentnih stanica (Lister i sur., 1999). Ti rezultati

upućuju na važnu ulogu koju MITF-M ima u diferencijaciji i normalnoj funkciji

melanocita. Pokazalo se da MITF-M nije potreban za diferencijaciju stanica retinalnog

pigmentnog epitela (Yajima i sur., 1999). Važnu ulogu u diferencijaciji tih stanica

najvjerojatnije ima MITF-A (Amae i sur., 1998). Geni za enzime koji sudjeluju u sintezi

melanina (tirozinazu, TRP-1 i Dct/TRP-2) uz melanocite se eksprimiraju i u stanicama

retinalnog pigmentnog epitela, gdje njihovu transkripciju najvjerojatnije potiče MITF-A

(Yasumoto i sur., 1998).

Pokazalo se da MITF potiče transkripciju gena za bcl2, važan inhibitor apoptoze

(Widlund i sur., 2003). To djelovanje proteina MITF najvjerojatnije ima važnu ulogu u

42

smanjenju broja melanocita u osoba s Waardenburgovim sindromom 2. Naime, kod osoba

s Waardenburgovim sindromom 2 mutacija u genu mitf dovodi do smanjenja funkcije

proteina MITF, koji više nije jednako djelotvoran u poticanju transkripcije gena bcl2, pa se

i sintetizira manje proteina bcl2, zbog čega veći broj melanocita umire apoptozom.

Aktivnost i stabilnost proteina MITF regulirane su fosforilacijom (Slika 4).

Vezanjem čimbenika rasta Steel na specifični receptor c-Kit pokreće se put prijenosa

signala u stanici koji dovodi do brze fosforilacije proteina MITF-M na Ser 73 putem

mitogenom aktiviranih protein kinaza (MAPK) (Hamesath i sur., 1998) (Slika 4). Ta

fosforilacija na Ser 73 potiče aktivnost proteina MITF-M, između ostalog i omogućujući

vezanje transkripcijskog koaktivatora p300/CBP (engl. CREB-binding protein) na MITF-

-M (Price i sur., 1998). Signalni put Steel/c-Kit dovodi i do fosforilacije proteina MITF-M

na Ser 409 putem serin-treonin-kinaze p90 Rsk (Wu i sur., 2000) (Slika 4). Te dvije

fosforilacije proteina MITF-M dovode do njegove kratkotrajne aktivacije i razgradnje

putem ubikvitinacije (Wu i sur., 2000). MITF-M se može fosforilirati i na Ser 298 putem

glikogen-sintaze-kinaze 3β (GSK3β), što pojačava transkripcijsku aktivnost proteina

MITF-M (Takeda i sur., 2000a) (Slika 4). Važnost ove fosforilacije na Ser 298 potvrđuju

podaci da je kod bolesnika s Waardenburgovim sindromom 2 nađena točkasta mutacija

gena mitf, koja ima za posljedicu zamjenu Ser 298 prolinom u proteinu MITF (Takeda i

sur., 2000a). Sva navedena fosforilacijska mjesta su zajednička svim izoformama proteina

MITF (Shibahara i sur., 2001).

Pokazalo se da signalni put Wnt potiče transkripciju gena za MITF-M (Takeda i

sur., 2000b). Wnt je skupina cisteinom bogatih glikoproteina koji se izlučuju i imaju važnu

ulogu u embrionalnom razvoju i diferencijaciji. Pokazalo se da su molekule Wnt posebno

važne za diferencijaciju stanica koje potječu iz neuralnog grebena, među koje pripadaju i

melanociti (Dorsky i sur., 1998).

Vezanje molekula Wnt na specifične receptore u staničnoj membrani iz porodice

Frizzled receptora sa sedam transmembranskih α uzvojnica aktivira slijed signala koji

dovodi do unutarstaničnog nakupljanja β katenina koji se veže na transkripcijski faktor

LEF-1/TCF (engl. lymphoid enhancer factor 1/ T cell factor) i tako ga aktivira

(Seidensticker i Behrens, 2000) (Slika 4). U promotorskoj regiji gena za MITF-M nađeno

je vezno mjesto za LEF-1/LCF (Takeda i sur., 2000b).

43

Slika 4. Shematski prikaz regulacije ekspresije gena mitf i aktivnosti proteina MITF. MAPK

(mitogenom aktivirane protein-kinaze), p90Rsk i GSK3β su protein-kinaze koje fosforiliraju

protein MITF redom na Ser 73, Ser 409 i Ser 298 i tako reguliraju njegovu aktivnost. CREB (engl.

cAMP response element binding protein), PAX10, SOX10 i LEF1 su transkripcijski čimbenici koji

potiču transkripciju gena mitf. Wnt, Steel i αMSH (α melanocitni stimulirajući hormon) su

čimbenici rasta koji aktiviraju putove prijenosa signala u stanici koji dovode do aktivacije

navedenih protein-kinaza i transkripcijskih čimbenika. c-Kit je receptor za čimbenik rasta Steel,

Frizzled je receptor za Wnt, a MC1r je receptor za αMSH.

Pokazalo se da se aktivnost promotora MITF-M može pojačati vezanjem sljedećih

proteina na cis-djelujuće regulatorne sljedove: CREB (engl. cAMP response element

binding protein) (Bertolotto i sur., 1998; Tachibana, 2000), PAX3 (Watanabe i sur., 1998;

Tachibana, 1999) i SOX10 (Lee i sur., 2000; Verastegui i sur., 2000; Shibahara i sur.,

2001) (Slika 4). PAX3 je protein čije mutacije dovode do Wardenburgova sindroma tipa 1

i 3 (Tassabehji i sur., 1992), dok je SOX10 protein čije mutacije dovode do

Wardenburgova sindroma tipa 4. CREB je protein koji se funkcijski aktivira fosforilacijom

putem cikličkog adenozin-monofosfata (cAMP) koji se stvara kao odgovor na aktivaciju

signalnog puta α−melanocitnog stimulirajućeg hormona (αMSH) (Bertolotto i sur., 1998;

Tachibana, 2000). αMSH je peptidni hormon koji se veže na receptor MC1r (engl.

melanocortin 1 receptor) (Slika 4). MC1r pripada porodici receptora sa sedam

44

transmembranskih α−uzvojnica koji putem G-proteina aktiviraju adenil-ciklazu koja

sintetizira cAMP. Među brojnim učincima koje iskazuje cAMP je i aktivacija

transkripcijskog čimbenika CREB (Widlund i sur., 2003).

2.3.5. MITF U DIJAGNOSTICI MELANOMA

Rutinski primjenjivani biljezi za imunohistokemijsku dijagnostiku melanoma, S100

i gp100, pokazuju relativno nisku specifičnost (S100), odnosno osjetljivost (gp100). Stoga

su posebnu pažnju pobudili rezultati istraživanja u kojem su svi uzorci tkiva primarnog

melanoma i melanomskih metastaza, uključujući i one uzorke koji su bili negativni na

gp100 i S100, pozitivno reagirali s protutijelima specifičnim za MITF (King i sur. 1999). U

tome istraživanju su pozitivni na MITF bili i uzorci zdrave kože i dobroćudnih

melanocitnih lezija. Međutim, ni jedan istraženi uzorak tumora nemelanocitnog podrijetla

nije bio pozitivan na MITF. To je posebno važno, budući da se najdjelotvorniji oblik

liječenja bitno razlikuje radi li se o primarnom melanomu, odnosno metastazi melanoma ili

o nekoj drugoj vrsti tumora koje je u pojedinim slučajevima vrlo teško razlikovati od

melanoma. Kasnija su istraživanja pokazala nižu osjetljivost (88% i 81%) proteina MITF

kao biljega za imunohistokemijsku dijagnostiku melanoma (Miettinen i sur. 2001; Granter

i sur., 2002). MITF je posebno istraživan kao biljeg za imunohistokemijsku dijagnostiku

dezmoplastičkog melanoma, rijetkog histološkog tipa melanoma kojeg je često teško

razlikovati od nekih drugih tumora ili dobroćudnih lezija. Samo je jedan od trideset

istraženih histoloških uzoraka dezmoplastičkog melanoma bio pozitivan na MITF

(Miettinen i sur., 2001).

MITF se pokazao i dobrim imunohistokemijskim biljegom za otkrivanje

melanomskih metastaza u limfnim čvorovima stražarima (sentinelima) (O'Reilly i sur.,

2001). Primjenom specifičnih protutijela dokazana je ekspresija proteina MITF i u

uzorcima tkiva i staničnim linijama drugih tumora melanocitnog podrijetla: melanomu oka,

melanocitomima središnjeg živčanog sustava i sarkomu svijetlih stanica (O'Reilly i sur.,

2001., Li i sur 2003). U jednom je istraživanju ekspresija proteina MITF istraživana kao

prognostički čimbenik u bolesnika s melanomom srednje debljine (1-4 mm) (Salti i sur.,

2000). U tome se istraživanju pokazalo da je ekspresija proteina MITF određena

imunohistokemijskom metodom bila povezana sa statistički značajno duljim ukupnim

preživljenjem i razdobljem bez znakova bolesti.

45

3. ISPITANICI I METODE

46

3.1. BOLESNICI

U istraživanje je uključen 201 bolesnik s patohistološki potvrđenom dijagnozom

melanoma. Sve bolesnike se liječilo i pratilo u Klinici za onkologiju i nuklearnu medicinu

te Klinici za kožne i spolne bolesti Kliničke bolnice Sestre milosrdnice u Zagrebu. Svi

bolesnici su dali informirani pristanak u skladu s Helsinškom deklaracijom Svjetske

medicinske asocijacije (engl. World Medical Association Declaration of Helsinki) prije

nego su uključeni u istraživanje (World Medical Association, 2002). Uzorci krvi za

analizu uzimali su se svim bolesnicima jednokratno, dok su boravili na Klinici radi

liječenja ili kontrolnog pregleda. U istraživanje nisu uključeni bolesnici koji su osim

melanoma imali i drugi primarni zloćudni tumor, te bolesnici koji su u vrijeme uzimanja

uzorka krvi primali sistemsku terapiju. Svi podaci o bolesnicima odnose se na stanje u

vrijeme uzimanja uzorka krvi. Klinički stadij bolesti je svim bolesnicima određen u

vrijeme uzimanja uzorka krvi, prema uputama American Joint Committee on Cancer

(AJCC) iz 2002. godine (Balch i sur, 2001b).

Srednja dob bolesnika uključenih u istraživanje iznosila je 51,6 godina, a

standardna devijacija dobi 15,1 godinu. Najmlađi bolesnik imao je 14, a najstariji 87

godina. U istraživanje je uključeno 110 bolesnica (54,7%) i 91 bolesnik (45,3%), što daje

omjer bolesnika ženskog spola naprema bolesnicima muškog spola od 1,2:1.

3.2. ZDRAVI ISPITANICI

Kontrolnu skupinu činilo je 40 zdravih dobrovoljaca srednje dobi 48,1 godina

(standardna devijacija 14,4 godine). Najmlađi zdravi dobrovoljac imao je 19, a najstariji

71 godinu. Među zdravim dobrovoljcima bila je 21 osoba ženskog spola (52,5%) i 19

osoba muškog spola (47,5%), tako da je omjer ženskog naprema muškom spolu bio 1,1:1.

Svi zdravi dobrovoljci dali su informirani pristanak u skladu s Helsinškom

deklaracijom Svjetske medicinske asocijacije prije nego su uključeni u istraživanje (World

Medical Association, 2002).

47

3.3. OBRADA UZORAKA KRVI

Svakom ispitaniku izvađeno je 10 mL periferne venske krvi u epruvetu s

etilendiamintetraoctenom kiselinom (EDTA, engl. ethylenediaminetetraacetic acid) kao

antikoagulansom. Obradu uzoraka krvi započeo sam unutar dva sata nakon vađenja. Iz krvi

sam izdvojio mononuklearne stanice metodom razdvajanja u gradijentu fikola (Boyum,

1968a; Boyum 1968b). Na taj način se melanomske stanice izdvajaju zajedno s

mononuklearnim stanicama jer im je gustoća slična.

Krv sam podijelio u dvije epruvete, u svaku po 5 mL krvi. Zatim sam krv razrijedio

jednakim volumenom (5 mL) fiziološke otopine (0,9% NaCl u vodi za injekcije) (Hrvatski

zavod za transfuzijsku medicinu, Zagreb). U nove epruvete sam dodao 3 mL

Lymphoprepa™ gustoće 1,077 g/cm3 (Axis-Shield PoC AS, Oslo, Norveška) i na

Lymphoprep™ pažljivo nadslojio razrijeđenu krv. Slijedilo je centrifugiranje u trajanju od

15 minuta pri centrifugalnoj sili od 500 g (1800 okreta u minuti (RPM, engl. rotation per

minute)) pri sobnoj temperaturi u centrifugi Hettich Universal 32 (Hettich, Tuttlingen,

Njemačka). Nakon centrifugiranja mononuklearne stanice se nalaze u epruveti u jednom

bijelom sloju između sloja plazme s trombocitima na vrhu i sloja Lymphoprepa™ ispod.

Eritrociti i granulociti se nalaze na dnu epruvete ispod sloja Lymphoprepa™. Sloj

mononuklearnih stanica prebacio sam pipetom u novu epruvetu, nakon čega je uslijedilo

ispiranje u fosfatnom puferu (PBS, engl. phosphate buffered saline) bez Ca2+ i Mg2+. U

epruvetu u koju sam prebacio sloj mononuklearnih stanica dodao sam do vrha PBS bez

Ca2+ i Mg2+ te centrifugirao 15 minuta pri 600 g (2000 RPM) pri sobnoj temperaturi u

centrifugi Hettich Universal 32 (Hettich, Tuttlingen, Njemačka). Nadtalog sam odlio, a

talog prebacio u polipropilensku epruvetu od 2 mL. Talog sam zatim još jednom isprao

PBS-om bez Ca2+ i Mg2+ tako što sam do vrha epruvete dodao PBS bez Ca2+ i Mg2+ te

centrifugirao 15 minuta pri 960 g (3000 RPM) pri 4°C u centrifugi Eppendorf 5417R

(Eppendorf, Hamburg, Njemačka). Nakon centrifugiranja nadtalog sam odlio, a talog

upotrijebio za izolaciju RNA, koja je uslijedila odmah nakon izolacije mononuklearnih

stanica.

48

3.4. IZOLACIJA RNA

RNA sam izolirao iz mononuklearnih stanica izdvojenih iz periferne krvi. Metoda

izolacije RNA koju sam primijenio temelji se na ekstrakciji gvanidin-tiocijanatom,

fenolom i kloroformom (Chomczynski i Sacchi, 1987).

Na talog mononuklearnih stanica dodao sam 500 µL TriPure izolacijskog reagensa

(Roche, Indianapolis, IN, SAD), koji je po kemijskom sastavu otopina fenola i gvanidin-

-tiocijanata. Zatim je uslijedila inkubacija u trajanju od 5 minuta pri sobnoj temperaturi,

kako bi se omogućila potpuna razgradnja nukleoproteinskih kompleksa. Nakon toga sam

dodao 100 µL kloroforma (Kemika, Zagreb) i epruvetu snažno tresao 15 sekundi te

inkubirao 10 minuta pri sobnoj temperaturi. Slijedilo je centrifugiranje u trajanju od 15

minuta pri 4˚C i centrifugalnoj sili od 12 000 g (10 600 RPM) u centrifugi Eppendorf

5417R. Nakon centrifugiranja stvorila su se tri sloja u epruveti. Na dnu se nalazi crvena

organska (fenol-kloroform) faza, iznad nje se nalazi bijela međufaza i na vrhu bezbojna

vodena faza u kojoj se nalazi RNA. Gornju vodenu fazu pažljivo sam prebacio u novu

polipropilensku epruvetu, pazeći pri tome da ne pokupim nimalo od međufaze. Vodenoj

fazi sam dodao 300 µL 2-propanola (Kemika, Zagreb) i 0,5 µL glikogena koncentracije 20

mg/mL (Roche, Mannheim, Njemačka). Glikogen se dodaje kako bi se pospješilo taloženje

RNA. Smjesu sam promiješao okretanjem epruvete, te inkubirao 10 minuta pri sobnoj

temperaturi. Slijedilo je centrifugiranje u trajanju od 10 minuta pri 4˚C i 12 000 g (10 600

RPM) u centrifugi Eppendorf 5417R. Nakon centrifugiranja vidljiv je mali bijeli talog

RNA. Nadtalog sam uklonio, a na talog dodao 1 mL 75% etanola (Merck, Darmstadt,

Njemačka) te centrifugirao 5 minuta pri 4˚C i 7 000 g (8 100 RPM) u centrifugi Eppendorf

5417R. Nakon centrifugiranja uklonio sam nadtalog, a talog RNA otopio u deioniziranoj

vodi. Otopljenoj RNA dodao sam 1/100 volumena inhibitora RNaza koncentracije 40

U/µL (Roche, Mannheim, Njemačka). Tako izoliranu RNA sam pohranio pri -70˚C.

3.5. OBRNUTO PREPISIVANJE

Izoliranu RNA sam obrnutim prepisivanjem (reverznom transkripcijom) preveo u

komplementarnu DNA (cDNA, engl. complementary DNA). U polipropilensku epruvetu

od 0,2 mL dodao sam: 5 µL izolirane RNA otopljene u deioniziranoj vodi, 1 µL Oligo

d(T)18 početnice (New England Biolabs, Beverly, MA, SAD) radne koncentracije 0,5

49

µg/µL i 10,37 µL deionizirane vode. Radnu koncentraciju oligo d(T)18 početnice od 0,5

µg/µL priredio sam tako da sam 170 µg (5,0 A260 jedinica) liofiliziranog praha otopio u

340 µL deionizirane vode. Smjesu sam inkubirao 4 minute pri 70˚C u uređaju Mastercycler

personal (Eppendorf, Hamburg, Njemačka), kako bi se denaturirala RNA. Nakon toga sam

u istu epruvetu dodao još: 2 µL 10xRT pufera (New England Biolabs, Beverly, MA, SAD),

1 µL dNTP miksa (otopine koja sadrži svaki od četiri deoksinukleotida u koncentraciji: 10

mmol/L dATP, 10 mmol/L dCTP, 10 mmol/L dGTP, 10 mmol/L TTP) (Sigma, St Louis,

MO, SAD), 0,5 µL inhibitora RNaza koncentracije 40 U/µL (Roche, Mannheim,

Njemačka), te na kraju 0,13 µL M-MuLV reverzne transkriptaze koncentracije 200 U/mL

(New England Biolabs, Beverly, MA, SAD). Konačne koncentracije u 20 µL smjese su

bile: 1x RT pufer (50 mmol/L Tris-HCl, 30 mmol/L KCl, 8 mmol/L MgCl2, 10 mmol/L

DTT; pH 8,3 pri 25˚C), 0,5 mmol/L dATP, 0,5 mmol/L dCTP, 0,5 mmol/L dGTP, 0,5

mmol/L TTP, 1 U/µL inhibitora RNaza, 1,25 U/µL M-MuLV reverzne transkriptaze i 25

mg/L Oligo d(T)18 početnice. Smjesu sam inkubirao u uređaju Mastercycler personal

(Eppendorf, Hamburg, Njemačka) 60 minuta pri 42˚C, a zatim 5 minuta pri 94˚C.

Dobivenu cDNA sam pohranio pri -20˚C.

3.6. UMNAŽANJE cDNA GENA ZA GLICERALDEHID-3-FOSFAT

DEHIDROGENAZU PCR-om

Kako bih provjerio uspješnost izolacije RNA i obrnutog prepisivanja u cDNA te

kvalitetu izolirane RNA, proveo sam lančanu reakciju polimerazom (PCR, engl.

polymerase chain reaction) sa početnicama specifičnim za cDNA gena za enzim

gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenazu (GAPDH). Gen za GAPDH se prepisuje u gotovo

svim ljudskim stanicama i tkivima (Janssens i sur., 2004).

U polipropilensku epruvetu od 0,2 mL dodao sam: 2,5 µL 10 x Taq pufera s Mg2+

(Eppendorf, Hamburg, Njemačka), 0,5 µL dNTP miksa (otopina koja sadrži svaki od četiri

deoksinukleotida u koncentraciji: 10 mmol/L dATP, 10 mmol/L dCTP, 10 mmol/L dGTP,

10 mmol/L TTP) (Sigma, St Louis, MO, SAD), 0,5 µL otopine kodirajuće (engl. sense)

početnice koncentracije 10 pmol/µL, 0,5 µL otopine nekodirajuće (engl. antisense)

početnice koncentracije 10 pmol/µL, 19 µL deionizirane vode, 0,1 µL Taq DNA

50

polimeraze koncentracije 5 U/µL (Eppendorf, Hamburg, Njemačka). U tako pripremljenu

reakcijsku smjesu na kraju sam dodao 2 µL cDNA dobivene obrnutim prepisivanjem.

Konačne koncentracije u 25 µL smjese bile su: 1 x Taq pufer s Mg2+ (50 mmol/L

KCl, 1,5 mmol/L MgCl2, 10 mmol/L Tris-HCl; pH 8,3 pri 25˚C), 0.2 mmol/L dATP, 0,2

mmol/L dCTP, 0,2 mmol/L dGTP, 0,2 mmol/L TTP, 0,2 µmol/L kodirajuće početnice, 0,2

µmol/L nekodirajuće početnice i 0,02 U/µL Taq DNA polimeraze.

Umnažanje PCR-om proveo sam u 30 ciklusa koji su se sastojali svaki od 30

sekundi denaturacije DNA pri 96˚C, 30 sekundi sparivanja početnica pri 60˚C, te 45

sekundi umnažanja DNA produljivanjem početnica pri 72˚C. Prvom ciklusu prethodile su

3 minute preddenaturacije DNA pri 96˚C, a nakon posljednjeg ciklusa slijedilo je dodatno

produljivanje u trajanju od 7 minuta pri 72˚C. Umnažanje PCR-om proveo sam u uređaju

Mastercycler personal (Eppendorf, Hamburg, Njemačka). Uzorke sam neposredno nakon

umnažanja pohranio pri 4˚C.

3.7. UMNAŽANJE cDNA GENA ZA TIROZINAZU PCR-om

Za analizu ekspresije gena za tirozinazu proveo sam lančanu reakciju polimerazom u

dva stupnja umnažanja (engl. nested PCR). Sastav reakcijske smjese je i za prvi i za drugi

stupanj umnažanja bio jednak kao i kod umnažanja cDNA gena za GAPDH. U prvom

stupnju umnažanja u reakcijsku smjesu dodao sam 2 µL cDNA, dok sam u drugom stupnju

umnažanja u reakcijsku smjesu dodao 2 µL produkta prvog stupnja umnažanja.

I prvi i drugi stupanj umnažanja PCR-om proveo sam u 35 ciklusa, a svaki se

sastojao od 1 minute denaturacije DNA pri 95˚C, 1 minute sparivanja početnica pri 55˚C,

te 45 sekundi umnažanja DNA produljivanjem početnica pri 72˚C. Prvom ciklusu je

prethodilo 5 minuta preddenaturacije DNA pri 95˚C, a nakon posljednjeg ciklusa slijedilo

je dodatno produljivanje u trajanju od 10 minuta pri 72˚C. Umnažanje PCR-om proveo

sam u uređaju Mastercycler personal (Eppendorf, Hamburg, Njemačka). Uzorke sam

neposredno nakon prvog i nakon drugog stupnja umnažanja pohranio pri 4˚C.

U svakoj PCR reakciji su uz uzorke melanomskih bolesnika analizirane i pozitivna i

negativna kontrola. Negativna kontrola je bila cDNA dobivena obrnutim prepisivanjem

RNA izolirane iz uzorka krvi zdravog dobrovoljca, dok je pozitivna kontrola bila cDNA

dobivena obrnutim prepisivanjem RNA izolirane iz melanomskih stanica u kulturi.

51

3.8. UMNAŽANJE cDNA GENA ZA MIKROFTALMIJSKI

TRANSKRIPCIJSKI ČIMBENIK (MITF) PCR-om

Za analizu ekspresije gena za MITF proveo sam lančanu reakciju polimerazom u

dva stupnja umnažanja (engl. nested PCR). Sastav reakcijske smjese bio je jednak u prvom

i u drugom stupnju umnažanja.

U polipropilensku epruvetu od 0,2 mL dodao sam: 2,5 µL 10 x Pfx pufera

(Invitrogen, Carlsbad, CA, SAD), 2,5 µL 10 x PCRx Enhancer solution (Invitrogen,

Carlsbad, CA, SAD), 0,75 µL dNTP miksa (otopina koja sadrži svaki od četiri

deoksinukleotida u koncentraciji: 10 mmol/L dATP, 10 mmol/L dCTP, 10 mmol/L dGTP,

10 mmol/L TTP) (Sigma, St Louis, MO, SAD), 0,5 µL otopine MgSO4 koncentracije 50

mmol/L (Invitrogen, Carlsbad, CA, SAD), 0,75 µL otopine kodirajuće početnice

koncentracije 10 pmol/µL, 0,75 µL otopine nekodirajuće početnice koncentracije 10

pmol/µL, 15 µL deionizirane vode, 0,25 µL Platinum® Pfx DNA polimeraze koncentracije

2,5 U/µL (Invitrogen, Carlsbad, CA, SAD). U prvom stupnju umnažanja u reakcijsku

smjesu dodao sam 2 µL cDNA, dok sam u drugom stupnju umnažanja u reakcijsku smjesu

dodao 2 µL produkta prvog stupnja umnažanja.

Konačne koncentracije u 25 µL smjese bile su: 1x Pfx pufer, 1 x PCRx Enhancer

solution, 0,3 mmol/L dATP, 0,3 mmol/L dCTP, 0,3 mmol/L dGTP, 0,3 mmol/L TTP, 1

mmol/L Mg SO4, 0,3 µmol/L kodirajuće početnice, 0,3 µmol/L nekodirajuće početnice,

0,025 U/µL Platinum® Pfx DNA polimeraze.

I prvi i drugi stupanj umnažanja PCR-om proveo sam u 35 ciklusa koji su se

sastojali svaki od 15 sekundi denaturacije DNA pri 94˚C, 30 sekundi sparivanja početnica

pri 60˚C, te 50 sekundi umnažanja DNA produljivanjem početnica pri 68˚C. Prvom ciklusu

prethodile su 2 minute preddenaturacije DNA pri 94˚C, a nakon posljednjeg ciklusa

slijedilo je dodatno produljivanje u trajanju od 7 minuta pri 68˚C. Umnažanje PCR-om

proveo sam u uređaju Mastercycler personal (Eppendorf, Hamburg, Njemačka). Uzorke

sam neposredno nakon prvog i nakon drugog stupnja umnažanja pohranio pri 4˚C.

U svakoj PCR reakciji su uz uzorke melanomskih bolesnika analizirane i pozitivna i

negativna kontrola. Negativna kontrola je bila cDNA dobivena obrnutim prepisivanjem

RNA izolirane iz uzorka krvi zdravog dobrovoljca, dok je pozitivna kontrola bila cDNA

dobivena obrnutim prepisivanjem RNA izolirane iz melanomskih stanica u kulturi.

52

3.9. OLIGONUKLEOTIDNE POČETNICE ZA UMNAŽANJE PCR-om

Za umnažanje cDNA gena za GAPDH koristio sam par početnica opisan u literaturi

(Tablica 8) (Battayani i sur., 1995). Sljedovi nukleinskih kiselina su bili: 5'-AAC GGA

TTT GGT CGT ATT GGG C-3' za kodirajuću te 5'-AGG GAT GAT GTT CTG GAG

AGC C-3' za nekodirajuću početnicu. Uz taj par početnica PCR-om se umnaža odsječak

veličine 623 para baza (pb).

I za umnažanje cDNA gena za tirozinazu koristio sam parove početnica opisane u

literaturi (Tablica 8) (Smith i sur., 1991). Sljedovi nukleinskih kiselina su bili: 5'-TTG

GCA GAT TGT CTG TAG CC-3' za vanjsku kodirajuću, 5'-AGG CAT TGT GCA TGC

TGC TT-3' za vanjsku nekodirajuću, 5’-GTC TTT ATG CAA TGG AAC GC-3’ za

unutarnju kodirajuću te 5’-GCT ATC CCA GTA AGT GGA CT-3’ za unutarnju

nekodirajuću početnicu. Uz vanjski par početnica u prvom stupnju umnažanja PCR-om

umnaža se odsječak veličine 284 para baza, dok se uz unutarnji par početnica u drugom

stupnju umnažanja PCR-om umnaža odsječak veličine 207 pb.

Za umnažanje cDNA gena za MITF dizajnirao sam početnice poznavajući slijed

nukleotida ljudskog gena za MITF (Tablica 8; Slika 5) (Tassabehji i sur., 1994). Početnice

sam dizajnirao tako da se vežu na granicu egzona nastalu izrezivanjem introna tijekom

prekrajanja RNA. Na taj se način osigurava umnažanje samo cDNA, a ne i potencijalno

kontaminirajuće genomske DNA. Pri dizajnu početnica vodio sam računa da početnice

omogućuju umnažanje samo cDNA za izoformu MITF-M, a ne i za druge izoforme

proteina MITF, budući da se samo izoforma MITF-M specifično eksprimira u

melanomskim stanicama (Vachtenheim i sur., 1999; Shibahara i sur., 2001; Selzer i sur.,

2002). Sljedovi nukleinskih kiselina bili su: 5’-AGG GAG GGA TAG TCT ACC GTC

TCT C-3’ za vanjsku kodirajuću, 5’-GCA GGG AGG ATT CGC TAA CAA GTG T-3’ za

vanjsku nekodirajuću, 5’-TAT CAG GTG CAG ACC CAC CTC-3’ za unutarnju

kodirajuću te 5’-CAG GCA ACG TAT TTG CCA TT -3’ za unutarnju nekodirajuću

početnicu. Uz vanjski par početnica u prvom stupnju umnažanja PCR-om umnaža se

odsječak veličine 1328 pb, dok se uz unutarnji par početnica u drugom stupnju umnažanja

PCR-om umnaža odsječak veličine 421 pb.

Sve početnice su kupljene od tvrtke Invitrogen (Invitrogen, Carlsbad, CA, SAD) kao

liofilizirani prah, koji sam otopio u deioniziranoj vodi tako da se dobije otopina

koncentracije 40 pmol/µL. Od te otopine koncentracije 40 pmol/µL priredio sam otopinu

53

radne koncentracije 10 pmol/µL tako što sam početnu otopinu tri puta razrijedio

deioniziranom vodom.

1 gggataccttgtttatagtaccttctctttgccagtccatcttcaaattggaattataga

MITF 1 61 aagtagagggagggatagtctaccgtctctcactggattggtgccacctaaaacattgtt

MITF 3 egzon 1M │ egzon 2 121 ATGCTGGAAATGCTAGAATATAATCACTATCAGGTGCAGACCCACCTCGAAAACCCCACC

M L E M L E Y N H Y Q V Q T H L E N P T

181 AAGTACCACATACAGCAAGCCCAACGGCAGCAGGTAAAGCAGTACCTTTCTACCACTTTA

K Y H I Q Q A Q R Q Q V K Q Y L S T T L

241 GCAAATAAACATGCCAACCAAGTCCTGAGCTTGCCATGTCCAAACCAGCCTGGCGATCAT

A N K H A N Q V L S L P C P N Q P G D H

301 GTCATGCCACCGGTGCCGGGGAGCAGCGCACCCAACAGCCCCATGGCTATGCTTACGCTT

V M P P V P G S S A P N S P M A M L T L

egzon 2 │ egzon 3 361 AACTCCAACTGTGAAAAAGAGGGATTTTATAAGTTTGAAGAGCAAAACAGGGCAGAGAGC

N S N C E K E G F Y K F E E Q N R A E S

egzon 3 │ egzon 4 421 GAGTGCCCAGGCATGAACACACATTCACGAGCGTCCTGTATGCAGATGGATGATGTAATC

E C P G M N T H S R A S C M Q M D D V I

481 GATGACATCATTAGCCTAGAATCAAGTTATAATGAGGAAATCTTGGGCTTGATGGATCCT

D D I I S L E S S Y N E E I L G L M D P

MITF 4 egzon 4 │ egzon 5 541 GCTTTGCAAATGGCAAATACGTTGCCTGTCTCGGGAAACTTGATTGATCTTTATGGAAAC

A L Q M A N T L P V S G N L I D L Y G N

601 CAAGGTCTGCCCCCACCAGGCCTCACCATCAGCAACTCCTGTCCAGCCAACCTTCCCAAC

Q G L P P P G L T I S N S C P A N L P N

egzon 5 │ egzon 6 661 ATAAAAAGGGAGCTCACAGCGTGTATTTTTCCCACAGAGTCTGAAGCAAGAGCACTGGCC

I K R E L T A C I F P T E S E A R A L A

egzon 6 │ egzon 7 721 AAAGAGAGGCAGAAAAAGGACAATCACAACCTGATTGAACGAAGAAGAAGATTTAACATA

K E R Q K K D N H N L I E R R R R F N I

egzon 7 │ egzon 8 781 AATGACCGCATTAAAGAACTAGGTACTTTGATTCCCAAGTCAAATGATCCAGACATGCGC

N D R I K E L G T L I P K S N D P D M R

841 TGGAACAAGGGAACCATCTTAAAAGCATCCGTGGACTATATCCGAAAGTTGCAACGAGAA

W N K G T I L K A S V D Y I R K L Q R E

54

901 CAGCAACGCGCAAAAGAACTTGAAAACCGACAGAAGAAACTGGAGCACGCCAACCGGCAT

Q Q R A K E L E N R Q K K L E H A N R H

egzon 8 │ egzon 9 961 TTGTTGCTCAGAATACAGGAACTTGAAATGCAGGCTCGAGCTCATGGACTTTCCCTTATT

L L L R I Q E L E M Q A R A H G L S L I

1021 CCATCCACGGGTCTCTGCTCTCCAGATTTGGTGAATCGGATCATCAAGCAAGAACCCGTT

P S T G L C S P D L V N R I I K Q E P V

1081 CTTGAGAACTGCAGCCAAGACCTCCTTCAGCATCATGCAGACCTAACCTGTACAACAACT

L E N C S Q D L L Q H H A D L T C T T T

1141 CTCGATCTCACGGATGGCACCATCACCTTCAACAACAACCTCGGAACTGGGACTGAGGCC

L D L T D G T I T F N N N L G T G T E A

1201 AACCAAGCCTATAGTGTCCCCACAAAAATGGGATCCAAACTGGAAGACATCCTGATGGAC

N Q A Y S V P T K M G S K L E D I L M D

1261 GACACCCTTTCTCCCGTCGGTGTCACTGATCCACTCCTTTCCTCAGTGTCCCCCGGAGCT

D T L S P V G V T D P L L S S V S P G A

1321 TCCAAAACAAGCAGCCGGAGGAGCAGTATGAGCATGGAAGAGACGGAGCACACTTGTtag

S K T S S R R S S M S M E E T E H T C

MITF 2 1381 cgaatcctccctgcactgcattcgcacaaactgcttcctttcttgattcgtagatttaat

1441 aacttacctgaaggggttttcttgataattttcctttaatatgaaattttttttcatgct

1501 ttatcaatagcccaggatatattttatttttagaattttgtgaaacagacttgtatattc

1561 tattttacaactacaaatgcctccaaagtattgtacaaataagtgtgcagtatctgtgaa

1621 ctgaattcaccacagactttagctttctgagcaagaggattttgcgtcagagaaatgtct

1681 gtccatttttattcaggggaaacttgatttgagatttttatgcctgtgacttccttggaa

1741 atcaaatgtaaagtttaattgaaagaatgtaaagcaaccccccaaaaa

Slika 5. Početnice za umnažanje cDNA gena za MITF. Na slici je naveden potpun slijed nukleotida

mRNA za izoformu MITF-M ljudskog proteina MITF, slijed aminokiselina odgovarajućeg

proteina, te granice egzona. Same početnice i sljedovi nukleotida na koje se početnice vežu

označeni su crvenom bojom.

55

Tablica 8. Sljedovi početnica korištenih za određivanje ekspresije ciljnih gena metodom RT-PCR.

Ciljni gen Početnica Slijed Veličina umnoženog odsječka (pb)

GAPDH1 (kodirajuća)

5’-AAC GGA TTT GGT CGT ATT GGG C-3’

GAPDH

GAPDH2 (nekodirajuća)

5’-AGG GAT GAT GTT CGT GAG AGC C-3’

623

HTYR1 (vanjska kodirajuća)

5’-TTG GCA GAT TGT CTG TAG CC-3’

HTYR2 (vanjska nekodirajuća)

5’-AGG CAT TGT GCA TGC TGC TT-3’

284

HTYR3 (unutarnja kodirajuća)

5’-GTC TTT ATG CAA TGG AAC GC-3’

tirozinaza

HTYR4 (unutarnja nekodirajuća)

5’-GCT ATC CCA GTA AGT GGA CT-3’

207

MITF1 (vanjska kodirajuća)

5’-AGG GAG GGA TAG TCT ACC GTC TCT C-3’

MITF2 (vanjska nekodirajuća)

5’-GCA GGG AGG ATT CGC TAA CAA GTG T-3’

1328

MITF3 (unutarnja kodirajuća)

5’-TAT CAG GTG CAG ACC CAC CTC -3’

MITF

MITF4 unutarnja nekodirajuća)

5’-CAG GCA ACG TAT TTG CCA TT -3’

421

* GAPDH – gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza; MITF – mikroftalmijski transkripcijski čimbenik (engl. microphthalmia-associated transcription factor)

3.10. ANALIZA PRODUKATA UMNAŽANJA PCR-om

Sve produkte umnažanja PCR-om analizirao sam elektroforezom u 2%-tnom gelu

agaroze obojanom etidij-bromidom.

Jedan gram agaroze (Agarose, Type I-A: Low EEO; Sigma, St Louis, MO, SAD)

otopio sam u 50 mL Tris-acetat-EDTA (TAE) pufera. Dodao sam 2,5 µL otopine etidij-

bromida koncentracije 10 mg/mL (Invitrogen, Carlsbad, CA, SAD), tako da konačna

koncentracija etidij-bromida u gelu bude 0,5 µg/mL. Etidij-bromid omogućuje

56

vizualizaciju vrpci DNA u gelu zbog svojstva da se ugrađuje između baza dvolančane

DNA i samo nakon što se ugradi u molekulu DNA fluorescira narančasto-crvenom

svjetlošću nakon što se obasja UV svjetlošću (Smith, 1998). Gel s dodatkom etidij-bromida

izlio sam u kalup. Na kalup sam prethodno postavio "češalj" kako bi se u gelu formirale

jažice. Nakon što se gel polimerizirao, "češalj" sam izvadio i gel zajedno s kalupom prenio

u kadicu za elektroforezu GNA-100 (Amersham Biosciences, Uppsala, Švedska). U kadicu

za elektroforezu sam zatim dodao TAE pufer tako da prekrije gel.

Pet µL uzorka (produkta umnažanja PCR-om) pomiješao sam sa 1 µL pufera za

nanošenje na gel (Sigma, St Louis, MO, SAD) te pažljivo nanio u jažicu na gelu. Pufer za

nanošenje na gel sadrži boje bromfenol plavilo i ksilencijanol, koje putuju u električnom

polju i tako omogućuju izravno praćenje elektroforeze te saharozu koja povećava gustoću

olakšavajući tako nanošenje uzorka u jažicu na gelu (Smith, 1998). U krajnje jažice gela

nanio sam biljeg molekulske težine DNA broj VIII ili IX (Roche, Manheim, Njemačka),

kako bih mogao odrediti veličinu fragmenata DNA u uzorku. Biljeg broj VIII sadrži

fragmente DNA veličine: 1114, 900, 692, 501, 489, 404, 320, 242, 190, 147, 124, 110, 67,

37, 34, 26 i 19 pb, dok biljeg broj IX sadrži fragmente DNA veličine: 1353, 1078, 872,

603, 310, 281, 271, 234, 194, 118 i 72 pb.

Elektroforeza se odvijala 40 minuta pri konstantnom naponu od 90 V pri sobnoj

temperaturi. Nakon elektroforeze promatrao sam gel u transiluminatoru Hoefer MacroVue

UV-20 (Hoefer, San Francisco, CA, SAD) pri UV svjetlu valne duljine 302 nm.

Uzorak sam smatrao pozitivnim ako je bila prisutna vrpca (engl. band) odgovarajuće

veličine (207 pb za tirozinazu, 623 pb za GAPDH te 421 pb za MITF).

3.11. ODREĐIVANJE PRAGA DETEKCIJE METODE

Prag detekcije melanomskih stanica metodom RT-PCR uz analizu tirozinaze i

MITF-a kao biljega odredio sam dodavanjem serijski razrijeđenih melanomskih stanica u

uzorke periferne krvi zdravih dobrovoljaca.

3.11.1. UZGOJ STANICA U KULTURI

Uspostavljenu staničnu liniju melanomskih stanica HBL dobio sam od Dr. Sanje

Kapitanović s Instituta Ruđer Bošković, Zagreb. Pokazalo se da HBL linija melanomskih

57

stanica eksprimira gene za tirozinazu i MITF (Noppen i sur., 1997; Vachtenheim i sur.,

1999). Stanice sam uzgajao u BD Falcon™ plastičnim posudama za uzgoj stanica

površine 25 cm2 (BD Biosciences, Bedford, MA, SAD) u tekućem mediju Dulbecco's

modified Eagle's medium (DMEM) (Imunološki zavod d.d., Zagreb, Hrvatska) uz dodatak

10% fetalnog goveđeg seruma (FBS, engl. fetal bovine serum; Invitrogen, Carlsbad, CA,

SAD). Stanice sam uzgajao u inkubatoru Heraeus® HERAcell® (Kendro Laboratory

Products, Langenselbold, Njemačka) pri 37ºC i 5% CO2 u vlažnoj atmosferi.

Kada su stanice dosegle 80-90% konfluentnosti (80-90% površine prekriveno

stanicama) presađivao sam ih na sljedeći način. Sterilnom pipetom sam uklonio medij.

Nakon toga sam stanice dva puta isprao fosfatnim puferom (PBS) bez Ca2+ i Mg2+, tako

što sam dodao 5 mL PBS-a bez Ca2+ i Mg2+ u posudu sa stanicama, posudu sa stanicama

lagano okrenuo nekoliko puta te uklonio tekućinu. Zatim sam dodao 2 mL 0,25%-tnog

sterilnog tripsina (Imunološki zavod d.d., Zagreb, Hrvatska) tako da prekrije stanice,

nakon čega sam stanice inkubirao 10 minuta u inkubatoru pri 37ºC. Nakon inkubacije

stanice su se odvojile od podloge. Tada sam stanicama dodao 5 mL DMEM medija,

medijem sam isprao dno posude za uzgoj stanica kako bi se sve stanice odvojile od

podloge te sam stanice suspendirane u mediju prebacio u epruvetu. Čim se doda medij,

proteinaze iz medija zaustavljaju aktivnost tripsina. Suspenziju stanica sam centrifugirao 5

minuta pri 500 g (1800 RPM) i sobnoj temperaturi u centrifugi Hettich Universal 32

(Hettich, Tuttlingen, Njemačka). Nadtalog sam odlio, a talog stanica resuspendirao u 5 mL

DMEM medija. Po 1 mL suspenzije stanica u mediju prebacio sam u nove posude za

uzgoj stanica i dodao još 5 mL DMEM medija u svaku posudu za uzgoj stanica.

3.11.2. PRIPREMA SERIJE RAZRJEĐENJA STANICA

Kada su stanice dosegle 80% konfluentnosti, odvojio sam ih od podloge na sljedeći

način. Sterilnom pipetom sam uklonio medij. Nakon toga sam stanice dva puta isprao

PBS-om bez Ca2+ i Mg2+, tako što sam dodao 5 mL PBS-a bez Ca2+ i Mg2+ u posudu sa

stanicama, posudu sa stanicama lagano okrenuo nekoliko puta te uklonio tekućinu. Zatim

sam dodao 2 mL 0,25%-tnog sterilnog tripsina (Imunološki zavod d.d., Zagreb, Hrvatska)

tako da prekrije stanice, nakon čega sam stanice inkubirao 10 minuta u inkubatoru pri

37ºC. Nakon inkubacije stanice su se odvojile od podloge. Tada sam stanicama dodao 5

mL DMEM medija, medijem sam isprao dno posude za uzgoj stanica kako bi se sve

58

stanice odvojile od podloge te sam stanice suspendirane u mediju prebacio u epruvetu.

Suspenziju stanica sam centrifugirao 5 minuta pri 500 g (1800 RPM) i sobnoj temperaturi

u centrifugi Hettich Universal 32 (Hettich, Tuttlingen, Njemačka). Nakon centrifugiranja

nadtalog sam odlio, a talog stanica resuspendirao u 5 mL PBS-a bez Ca2+ i Mg2+.

Nakon toga sam odredio brojčanu koncentraciju stanica tako što sam kap suspenzije

stanica u PBS-u bez Ca2+ i Mg2+ spustio na Neubauerovu komoricu za brojenje krvnih

stanica uz rub pokrovnog stakla tako da tekućina potpuno ispuni površinu ispod

pokrovnog stakla. Zatim sam izbrojio stanice u 4 vanjska kvadrata komorice pod

svjetlosnim mikroskopom te sam brojčanu koncentraciju stanica izračunao po formuli:

broj stanica/L = izbrojene stanice x 50 x 106

Nakon što sam odredio koncentraciju stanica, priredio sam serijska razrjeđenja od

105, 104, 103, 102, 50, 10 i 1 stanice, svako u 1 mL PBS-a bez Ca2+ i Mg2+. Svako serijsko

razrjeđenje dodao sam u uzorak 9 mL krvi zdravog dobrovoljca i promiješao. Uzorke krvi

u koje sam dodao serijski razrjeđene melanomske stanice obradio sam na jednak način kao

i uzorke krvi melanomskih bolesnika.

Cijeli postupak određivanja praga detekcije metode ponovio sam tri puta, koristeći

svaki puta ponovo uzgojene melanomske stanice.

3.11.3. BROJANJE LEUKOCITA

U svakom uzorku krvi, prije nego sam dodao serijski razrijeđene melanomske

stanice, odredio sam brojčanu koncentraciju leukocita. To mi je omogućilo da prag

detekcije izrazim kao broj melanomskih stanica u odnosu na volumen krvi i u odnosu na

broj leukocita periferne krvi. Leukocite sam brojao na sljedeći način.

U melanžer za leukocite prvo sam navukao krv do oznake 0,5, a zatim Türkovu

otopinu do oznake 11. Krv sam na taj način razrijedio 20 puta. Türkova otopina je

razrijeđena otopina octene kiseline koja uzrokuje hemolizu eritrocita i boje Gentian violet

koja boji jezgre svih stanica. Na taj se način oboje svi leukociti, budući da su u fiziološkim

uvjetima oni jedine stanice s jezgrom u krvi. Otopinu u melanžeru sam miješao najmanje

tri minute. Zatim sam kap otopine iz melanžera spustio na Neubauerovu komoricu za

brojenje krvnih stanica uz rub pokrovnog stakla tako da tekućina potpuno ispuni površinu

ispod pokrovnog stakla.

59

Leukocite sam brojao u četiri vanjska kvadrata komorice pod svjetlosnim

mikroskopom. Brojčanu koncentraciju leukocita izračunao sam po sljedećoj formuli:

broj leukocita/L = izbrojeni leukociti x 50 x 106

3.12. POZITIVNA KONTROLA

Kao pozitivnu kontrolu umnažanja PCR-om koristio sam cDNA dobivenu

obrnutim prepisivanjem RNA izolirane iz melanomskih stanica u kulturi. RNA sam

izolirao iz melanomskih stanica HBL uzgojenih u kulturi na sljedeći način. Kada su

stanice dosegle 80% konfluentnosti, sterilnom pipetom sam uklonio medij. Nakon toga

sam stanice dva puta isprao PBS-om bez Ca2+ i Mg2+, tako što sam dodao 5 mL PBS-a bez

Ca2+ i Mg2+ u posudu sa stanicama, posudu sa stanicama lagano okrenuo nekoliko puta, te

uklonio tekućinu. Zatim sam dodao 2 mL izolacijskog reagensa TriPure (Roche,

Indianapolis, IN, SAD), te nastali lizat stanica prebacio u polipropilenske epruvete od 2

mL, 500 µL lizata u svaku. Dalje sam izolirao RNA na jednak način kao i iz

mononuklearnih stanica izdvojenih iz periferne krvi.

3.13. PUFERI I OTOPINE 3.13.1. FOSFATNI PUFER (PBS) BEZ Ca2+ i Mg2+

1. Otopi se sljedeće sastojke u 800 mL destilirane vode:

• 4,0 g NaCl

• 0,1 g KCl

• 0,72 g Na2HPO4

• 0,12 g KH2PO4

2. Podesi se pH na 7,4 dodavanjem HCl.

3. Doda se destilirana voda da ukupni volumen bude 0,5 L.

4. Sterilizira se autoklaviranjem.

60

3.13.2. 50 X TRIS-ACETAT-EDTA (TAE) PUFER

1. Otopi se 121 g Tris (hidroksimetil)-aminometana u 250 mL destilirane

vode.

2. Doda se 50 mL 0,5 mol/L otopine Na2EDTA (pH=8,0).

3. Doda se 28,6 mL ledene octene kiseline.

4. Doda se destilirana voda da ukupni volumen bude 0,5 L.

5. Ovako pripremljeni 50 X TAE pufer se prije upotrebe razrijedi destiliranom

vodom da bude 1 X.

3.13.3. TÜRKOVA OTOPINA

Pomiješa se:

• 30 mL ledene octene kiseline,

• 8 mL vodene otopine boje Gentian Violet koncentracije 2 g/L,

• destilirane vode tako da ukupni volumen bude 1 L.

3.14. STATISTIČKA OBRADA PODATAKA

Statistička značajnost povezanosti distribucije vrijednosti biljega (MITF-a i

tirozinaze) i drugih binarnih ili nominalnih kategorijskih varijabli (spol, lokalizacija

primarnog tumora, histološki tip primarnog tumora, ulceracija primarnog tumora,

prisutnost metastaza regionalnih limfnih čvorova, lokalizacija metastaza regionalnih

limfnih čvorova, broj regionalnih limfnih čvorova zahvaćenih metastazom, prisutnost

udaljenih metastaza, lokalizacija udaljenih metastaza, broj udaljenih metastaza, lokalni

recidiv, prethodna sistemska terapija) određena je primjenom Hi-kvadrat (χ2) testa,

odnosno Fisherovog egzaktnog testa u slučaju 2x2 tablica ako je očekivana frekvencija u

nekoj ćeliji bila manja od 5. Navedene su χ2 vrijednosti uz Yatesovu korekciju i bez

Yatesove korekcije. Statistička značajnost povezanosti distribucije vrijednosti biljega

(MITF-a i tirozinaze) i ordinalnih kategorijskih varijabli (stadij bolesti i stupanj po Clarku)

određena je primjenom Hi-kvadrat testa za trend. Statistička značajnost povezanosti

distribucije vrijednosti biljega (MITF-a i tirozinaze) i numeričkih varijabli (dob, debljina

primarnog tumora, vrijeme proteklo od operacije melanoma) određena je primjenom Mann

61

Whitney U testa. Statistička značajnost povezanosti distribucije vrijednosti tirozinaze i

vrijednosti MITF-a određena je McNemarovim testom, budući da se radi o zavisnim

uzorcima.

Kao granična razina statističke značajnosti uzimana je vrijednost od 5% (P=0,05).

Statistička obrada podataka provedena je pomoću računalnog programa STATISTICA,

verzija 5.5 (StatSoft Inc., Tulsa, OK, SAD).

62

4. REZULTATI

63

4.1. PRAG DETEKCIJE METODE

Prag detekcije melanomskih stanica metodom RT-PCR uz analizu tirozinaze i

MITF-a kao biljega odredio sam dodavanjem serijski razrijeđenih melanomskih stanica u

uzorke periferne krvi zdravih dobrovoljaca.

Nakon umnažanja PCR-om s početnicama specifičnim za cDNA gena za tirozinazu,

detektirao sam najmanje 50 melanomskih stanica u 10 mL periferne krvi zdravog

dobrovoljca, odnosno jednu melanomsku stanicu među 0,82 x 106 leukocita periferne krvi

(Slika 6).

Nakon umnažanja PCR-om s početnicama specifičnim za cDNA gena za MITF,

također sam detektirao najmanje 50 melanomskih stanica u 10 mL periferne krvi zdravog

dobrovoljca, odnosno jednu melanomsku stanicu među 0,82 x 106 leukocita periferne krvi

(Slika 7).

Slika 6. Prag detekcije melanomskih stanica analizom ekspresije tirozinaze metodom RT-PCR.

Serijski razrijeđene melanomske stanice uzgojene u kulturi dodane su u 10 mL periferne krvi

zdravog dobrovoljca, zatim je izolirana RNA te provedeno umnažanje RT-PCR-om. Produkti

umnažanja RT-PCR-om analizirani su elektroforezom u 2%-tnom gelu agaroze obojanom etidij-

bromidom te promatrani i fotografirani pod UV-svjetlom. Staza 1: biljeg molekulske težine DNA

br. IX (72 – 1357 pb); staze 2-8: različit broj melanomskih stanica (105, 104, 103, 102, 50, 10 i 1)

dodanih u uzorak krvi zdravog dobrovoljca.

64

Slika 7. Prag detekcije melanomskih stanica analizom ekspresije MITF-a metodom RT-PCR.

Serijski razrijeđene melanomske stanice uzgojene u kulturi dodane su u 10 mL periferne krvi

zdravog dobrovoljca, zatim je izolirana RNA te provedeno umnažanje RT-PCR-om. Produkti

umnažanja RT-PCR-om analizirani su elektroforezom u 2%-tnom gelu agaroze obojanom etidij-

bromidom te promatrani i fotografirani pod UV-svjetlom. Staze 1 i 8: biljeg molekulske težine

DNA br. VIII (19 – 1110 pb); staze 2-7: različit broj melanomskih stanica (105, 104, 103, 102, 50 i

10) dodanih u uzorak krvi zdravog dobrovoljca.

4.2. STRUKTURA ISPITANIKA

U istraživanje je uključen 201 bolesnik s patohistološki potvrđenom dijagnozom

melanoma. Svi navedeni podaci o bolesnicima odnose se na stanje u vrijeme uzimanja

uzorka krvi za analizu (Tablica 9, Tablica 10, Tablica 11).

Tablica 9. Raspodjela melanomskih bolesnika uključenih u istraživanje s obzirom na neke

demografske, kliničke i patohistološke varijable.

VARIJABLA BROJ

BOLESNIKA POSTOTAK

SVIH BOLESNIKA

spol

ženski 110 54,7%

muški 91 45,3%

65

stadij bolesti po AJCC1

1 77 38,3%

2 66 32,8%

3 36 17,9%

4 14 7,0%

nepoznat 8 4,0%

lokalizacija primarnog tumora

glava i vrat 27 13,4%

trup 80 39,8%

gornji udovi 37 18,4%

donji udovi 46 22,9%

oko 4 2,0%

nepoznat primarni tumor 7 3,5%

debljina tumora

< 1 mm 42 20,9%

1,01 – 2 mm 30 14,9%

2,01 – 4 mm 39 19,4%

> 4 mm 29 14,4%

nema podataka 61 30,3%

histološki tip

SSM2 50 24,9%

NM3 56 27,9%

LMM4 5 2,5%

ALM5 1 0,5%

melanoma choroideae 4 2,0%

ostalo6 3 1,5%

nepoznat primarni tumor 7 3,5%

nema podatka 75 37,3%

ulceracija

prisutna 28 13,9%

nije prisutna 13 6,5%

nema podataka 160 79,6%

66

stupanj po Clarku

1 1 0,5%

2 33 16,4%

3 71 35,3%

4 69 34,3%

5 13 6,5%

nema podataka 14 7,0%

limfocitna infiltracija

prisutna 47 23,4%

nema podataka 154 76,6%

sistemska terapija7

kemoterapija8 22 10,9%

imunoterapija9 7 3,5%

kemoterapija i imunoterapija10 7 3,5%

primao sistemsku terapiju (ukupno) 36 17,9%

nije primao sistemsku terapiju 165 82,1%

metastaze regionalnih limfnih

čvorova11

prisutne 43 21,4%

nisu prisutne 158 78,6%

udaljene metastaze11

prisutne 14 7,0%

nisu prisutne 187 93,0% 1 American Joint Committee on Cancer (Balch i sur., 2001b); 2 površinsko šireći melanom (engl., superficial spreading melanoma); 3 nodularni melanom; 4 lentigo maligna melanom; 5 akralni lentiginozni melanom; 6 jedan melanom in situ, jedan špicoidni melanom, jedan dezmoplastički melanom; 7 podaci se odnose na svaku terapiju koju je bolesnik primio bilo kada prije uzimanja uzorka krvi za analizu; 8 dakarbazin (DTIC) ili DTIC i DBDT (dakarbazin, biskloretilnitrozourea (BCNU), cisplatina i tamoxifen); 9 interferon-α; 10 DTIC i interferon-α; 11 podaci se odnose na metastaze koje su potvrđene bilo kada prije uzimanja uzorka krvi za analizu

67

Tablica 10. Parametri distribucije nekih varijabli u skupini melanomskih bolesnika uključenih u

istraživanje.

VARIJABLA SREDNJA VRIJEDNOST

STANDARDNA DEVIJACIJA

MEDIJAN RASPON

dob (godine) 51,6 15,1 52 14-87

debljina primarnog tumora (mm)1

2,8 2,3 2,0 0,4-12,0

vrijeme proteklo od prve operacije (mjeseci)

26,8 35,5 16,1 0,2-225,2

vrijeme proteklo od posljednje operacije (mjeseci)

24,4 36,4 12,5 0,2-225,0

broj regionalnih limfnih čvorova zahvaćenih metastazom2

3,0 3,6 1,0 1-17

1 vrijednosti se odnose samo na skupinu bolesnika za koje postoje podaci o točnoj debljini tumora (njih 123); 2 vrijednosti se odnose samo na skupinu bolesnika koji su imali metastaze regionalnih limfnih čvorova (njih 43)

Tablica 11. Raspodjela bolesnika s metastazama regionalnih limfnih čvorova (njih 43) s obzirom

na njihovu lokalizaciju i broj.

VARIJABLA BROJ

BOLESNIKA % SVIH

BOLESNIKA % BOLESNIKA S METASTAZAMA

RLČ1

lokalizacija metastaza rlč1

glava, vrat i supraklavikularno

18 9,0% 41,9%

aksila 13 6,5% 30,2%

ingvinum 12 6,0% 27,9%

broj rlč1 zahvaćenih metastazom

1 22 10,9% 51,1%

2 ili 3 10 5,0% 23,3%

više od 3 10 5,0% 23,3%

nema podataka 1 0,5% 2,3% 1 regionalnih limfnih čvorova

Do dana uzimanja uzorka krvi za analizu 12 (6,0%) bolesnika je razvilo lokalni

recidiv, 5 (2,5%) ih je razvilo recidiv metastaza regionalnih limfnih čvorova, a u 4 (2%) je

dijagnosticiran drugi primarni melanom. Petero bolesnika (2,5%) je imalo satelitske

metastaze dijagnosticirane do dana uzimanja uzorka krvi za analizu.

68

U skupini bolesnika s udaljenim metastazama (ukupno 14), šest ih je imalo

udaljene metastaze ne koži, dvoje u limfnim čvorovima, dvoje na jetri, jedan na plućima,

jedan na koži i jetri, te jedan na jetri, kostima i koži.

Kontrolnu skupinu činilo je 40 zdravih dobrovoljaca srednje dobi 48,1 godine

(standardna devijacija 14,4 godine). Najmlađi zdravi dobrovoljac imao je 19, a najstariji

71 godinu. Među zdravim dobrovoljcima bila je 21 osoba ženskog spola (52,5%) i 19

osoba muškog spola (47,5%). S obzirom na distribuciju ispitanika po dobi i spolu

kontrolna skupina nije značajno odudarala od skupine bolesnika s melanomom.

4.3. VRIJEDNOSTI BILJEGA (GAPDH, TIROZINAZA I MITF) U

UZORCIMA KRVI ISPITANIKA

Prije određivanja ekspresije gena za tirozinazu i MITF odredio sam ekspresiju gena

za GAPDH metodom RT-PCR u uzorcima krvi svih ispitanika. Ekspresiju gena za

GAPDH detektirao sam u svih 201 bolesnika s melanomom i 40 zdravih ispitanika, čime

sam potvrdio uspješnost izolacije RNA i obrnutog prepisivanja u cDNA, te kvalitetu

izolirane RNA.

Kao biljeg prisutnosti cirkulirajućih melanomskih stanica, u uzorcima krvi

ispitanika odredio sam ekspresiju gena za tirozinazu i MITF metodom RT-PCR.

Vrijednost tirozinaze je bila pozitivna u uzorcima krvi 20 od ukupno 201 bolesnika s

melanomom (10,0%) (Slika 8, Slika 10). Vrijednost MITF-a je bila pozitivna u uzorcima

krvi 32 od 201 bolesnika s melanomom (15,9%) (Slika 9, Slika 10). U uzorcima krvi 4 od

201 bolesnika s melanomom (1,9%) vrijednosti oba biljega (tirozinaze i MITF-a) su bile

pozitivne. Vrijednost određivanja oba biljega (tirozinaze i MITF-a) je definirana kao

pozitivna ako je vrijednost barem jednog od biljega (tirozinaze ili MITF-a) bila pozitivna,

te negativna ako su vrijednosti oba biljega bile negativne. Tako definirana vrijednost

određivanja oba biljega bila je pozitivna u 48 od ukupno 201 bolesnika s melanomom

(23,9%) (Slika 10). Vrijednost tirozinaze ni vrijednost MITF-a nije bila pozitivna niti u

jednom od uzoraka krvi 40 zdravih ispitanika (Slika 8, Slika 9).

Povezanost distribucije vrijednosti tirozinaze i vrijednosti MITF-a nije se pokazala

statistički značajnom u skupini svih 201 bolesnika (McNemarov test: χ2=2,75; stupnjevi

slobode=1; p=0,10).

69

Slika 8. Primjeri ekspresije gena za tirozinazu u uzorcima krvi ispitanika određene metodom RT-

-PCR. Produkti umnažanja RT-PCR-om analizirani su elektroforezom u 2%-tnom gelu agaroze

obojanom etidij-bromidom te promatrani i fotografirani pod UV-svjetlom. Staza 1: biljeg

molekulske težine DNA br. IX (72–1357 pb); staza 2: negativna kontrola (zdravi dobrovoljac);

staze 3 i 4: negativni uzorci (dva bolesnika s melanomom); staze 5 i 6: pozitivni uzorci (dva

bolesnika s melanomom); staza 7: pozitivna kontrola (melanomske stanice uzgojene u kulturi).

Slika 9. Primjeri ekspresije gena za MITF u uzorcima krvi ispitanika određene metodom RT-PCR.

Produkti umnažanja RT-PCR-om analizirani su elektroforezom u 2%-tnom gelu agaroze obojanom

etidij-bromidom te promatrani i fotografirani pod UV-svjetlom. Staza 1: biljeg molekulske težine

DNA br. IX (72 – 1357 pb); staza 2: negativna kontrola (zdravi dobrovoljac); staze 3 i 4: negativni

uzorci (dva bolesnika s melanomom); staze 5 i 6: pozitivni uzorci (dva bolesnika s melanomom);

staza 7: pozitivna kontrola (melanomske stanice uzgojene u kulturi).

70

ODREĐIVANI BILJEZI

PO

ST

OT

AK

PO

ZIT

IVN

IH B

OL

ES

NIK

A

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

TIROZINAZA MITF TIROZINAZA I MITF

10,0%15,9%

23,9%

Slika 10. Postotak pozitivnih bolesnika u skupini 201 bolesnika s melanomom s obzirom na biljeg

koji je određivan. Kada su određivani tirozinaza i MITF bolesnik je proglašen pozitivnim ako je

vrijednost barem jednog od biljega bila pozitivna.

4.4. VRIJEDNOSTI BILJEGA I STADIJ BOLESTI

Stadij bolesti je svim bolesnicima određen u vrijeme uzimanja uzorka krvi za

analizu prema uputama American Joint Committee on Cancer (AJCC) iz 2002. godine

(Balch i sur. 2001b). Stadij se mogao odrediti u 193 od ukupno 201 bolesnika. U skupini

193 bolesnika s podacima o stadiju pokazao se trend povećanja udjela bolesnika s

pozitivnom vrijednošću tirozinaze sa porastom stadija bolesti (Hi-kvadrat test za trend:

χ2=4,91; stupnjevi slobode=1; p=0,03) (Tablica 12, Slika 11). U skupini 193 bolesnika s

podacima o stadiju pokazao se i trend povećanja udjela bolesnika s pozitivnom vrijednošću

MITF-a sa porastom stadija bolesti (Hi-kvadrat test za trend: χ2=4,55; stupnjevi

slobode=1; p=0,03) (Tablica 13, Slika 12). U skupini 193 bolesnika s podacima o stadiju

također se pokazao trend povećanja udjela bolesnika s pozitivnom vrijednošću određivanja

oba biljega (definiranom kao pozitivnom ako je barem jedan biljeg (tirozinaza ili MITF)

pozitivan) sa porastom stadija bolesti (Hi-kvadrat test za trend: χ2=7,57; stupnjevi

slobode=1; p=0,01) (Tablica 14, Slika 13).

71

Tablica 12. Distribucija bolesnika s obzirom na vrijednost tirozinaze u različitim stadijima bolesti

po American Joint Committee on Cancer u skupini 193 melanomska bolesnika s podacima o

stadiju.

stadij po AJCC1 pozitivni na tirozinazu /broj (%)/

negativni na tirozinazu /broj (%)/

ukupno

/broj/

1 4 (5,2%) 73 (94,8%) 77

2 5 (7,6%) 61 (92,4%) 66

3 5 (13,9%) 31 (86,1%) 36

4 3 (21,4%) 11 (78,6%) 14

ukupno 17 (8,8%) 176 (91,2%) 193

1 American Joint Committee on Cancer

* nađen je statistički značajni trend povećanja udjela bolesnika s pozitivnom vrijednošću tirozinaze sa porastom stadija bolesti (p=0,03)

Tablica 13. Distribucija bolesnika s obzirom na vrijednost MITF-a u različitim stadijima bolesti po

American Joint Committee on Cancer u skupini 193 melanomska bolesnika s podacima o stadiju.

stadij po AJCC1 pozitivni na MITF /broj (%)/

negativni na MITF /broj (%)/

ukupno

/broj/

1 8 (10,4%) 69 (89,6%) 77

2 11 (16,7%) 55 (83,3%) 66

3 6 (16,7%) 30 (83,3%) 36

4 5 (35,7%) 9 (64,3%) 14

ukupno 30 (15,5%) 163 (84,5%) 193

1 American Joint Committee on Cancer

* nađen je statistički značajni trend povećanja udjela bolesnika s pozitivnom vrijednošću MITF-a sa porastom stadija bolesti (p=0,03)

72

Tablica 14. Distribucija bolesnika s obzirom na vrijednost oba biljega (tirozinaze i MITF-a)1 u

različitim stadijima bolesti po American Joint Committee on Cancer u skupini 193 melanomska

bolesnika s podacima o stadiju.

stadij po AJCC2 pozitivni /broj (%)/ negativni /broj (%)/

ukupno

/broj/

1 12 (15,6%) 65 (84,4%) 77

2 15 (22,7%) 51 (77,3%) 66

3 10 (27,8%) 26 (72,2%) 36

4 7 (50,0%) 7 (50,0%) 14

ukupno 44 (22,8%) 149 (77,2%) 193 1 vrijednost je pozitivna ako je barem jedan biljeg (tirozinaza ili MITF) pozitivan; 2 American Joint Committee on Cancer

* nađen je statistički značajni trend povećanja udjela bolesnika s pozitivnom vrijednošću oba biljega sa porastom stadija bolesti (p=0,01)

STADIJ BOLESTI

PO

ST

OT

AK

BO

LE

SN

IKA

P

OZ

ITIV

NIH

NA

TIR

OZ

INA

ZU

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

1 2 3 4

5,2% 7,6% 13,9%21,4%

p=0,027 (Hi-kvadrat test za trend)

Slika 11. Postotak bolesnika s pozitivnom vrijednošću tirozinaze u različitim stadijima bolesti po

American Joint Committee on Cancer u skupini 193 melanomska bolesnika s podacima o stadiju.

73

STADIJ BOLESTI

PO

ST

OT

AK

BO

LE

SN

IKA

PO

ZIT

IVN

IH N

A M

ITF

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

1 2 3 4

10,4%16,7%

35,7%

16,7%

p=0,033 (Hi-kvadrat test za trend)

Slika 12. Postotak bolesnika s pozitivnom vrijednošću MITF-a u različitim stadijima bolesti po

American Joint Committee on Cancer u skupini 193 melanomska bolesnika s podacima o stadiju.

STADIJ BOLESTI

PO

ST

OT

AK

PO

ZIT

IVN

IH B

OL

ES

NIK

A

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

1 2 3 4

15,6%22,7%

50,0%

27,8%

p=0,006 (Hi-kvadrat test za trend)

Slika 13. Postotak bolesnika s pozitivnom vrijednošću oba biljega (tirozinaze i MITF-a) u

različitim stadijima bolesti po American Joint Committee on Cancer u skupini 193 melanomska

bolesnika s podacima o stadiju. Vrijednost je definirana kao pozitivna ako je barem jedan biljeg

(tirozinaza ili MITF) pozitivan, a negativna ako su oba biljega negativna.

74

4.5. VRIJEDNOSTI BILJEGA I SPOL BOLESNIKA

U skupini svih 201 bolesnika udio bolesnika s pozitivnom vrijednosti tirozinaze nije

se statistički značajno razlikovao između skupina bolesnika ženskog i muškog spola (Hi-

kvadrat test: χ2 uz Yatesovu korekciju=2,09; stupnjevi slobode=1; p=0,15; χ2 bez Yatesove

korekcije=1,46; stupnjevi slobode=1; p=0,23) (Tablica 15). U skupini svih 201 bolesnika

ni udio bolesnika s pozitivnom vrijednosti MITF-a nije se statistički značajno razlikovao

između skupina bolesnika ženskog i muškog spola (Hi-kvadrat test: χ2 uz Yatesovu

korekciju<0,0001; stupnjevi slobode=1; p=0,996; χ2 bez Yatesove korekcije=0,04;

stupnjevi slobode=1; p=0,84) (Tablica 16). Vrijednost određivanja oba biljega (tirozinaze i

MITF-a) definirana je kao pozitivna ako je barem jedan od biljega (tirozinaza ili MITF)

pozitivan, te negativna ako su oba biljega negativna. Ni udio bolesnika s pozitivnom

vrijednosti određivanja oba biljega nije se statistički značajno razlikovao između skupina

bolesnika ženskog i muškog spola u skupini svih 201 bolesnika (Hi-kvadrat test: χ2 uz

Yatesovu korekciju=0,55; stupnjevi slobode=1; p=0,46; χ2 bez Yatesove korekcije=0,58;

stupnjevi slobode=1; p=0,45) (Tablica 17).

Tablica 15. Distribucija bolesnika s obzirom na vrijednost tirozinaze i spol u skupini 201 bolesnika

s melanomom.

pozitivni na tirozinazu /broj (%)/

negativni na tirozinazu /broj (%)/

ukupno /broj/

žene 14 (12,7%) 96 (87,3%) 110

muškarci 6 (6,6%) 85 (93,4%) 91

ukupno 20 (10,0%) 181 (90,0%) 201

* nije nađena statistički značajna povezanost između distribucije vrijednosti tirozinaze i spola (p=0,15)

Tablica 16. Distribucija bolesnika s obzirom na vrijednost MITF-a i spol u skupini 201 bolesnika s

melanomom.

pozitivni na MITF /broj (%)/

negativni na MITF /broj (%)/

ukupno /broj/

žene 17 (15,5%) 93 (84,5%) 110

muškarci 15 (16,5%) 76 (83,5%) 91

ukupno 32 (15,9%) 169 (84,1%) 201

* nije nađena statistički značajna povezanost između distribucije vrijednosti MITF-a i spola (p=0,996)

75

Tablica 17. Distribucija bolesnika s obzirom na vrijednost oba biljega (tirozinaze i MITF-a)1 i spol

u skupini 201 bolesnika s melanomom.

pozitivni /broj (%)/ negativni /broj (%)/ ukupno /broj/

žene 29 (26,4%) 81 (73,6%) 110

muškarci 19 (20,9%) 72 (79,1%) 91

ukupno 48 (23,9%) 153 (76,1%) 201 1 vrijednost je pozitivna ako je barem jedan biljeg (tirozinaza ili MITF) pozitivan

* nije nađena statistički značajna povezanost između distribucije vrijednosti oba biljega i spola (p=0,46)

Budući da je spol značajan prognostički čimbenik samo u bolesnika s lokaliziranim

melanomom (stadiji 1 i 2 po AJCC), posebno sam istražio razlikuje li se distribucija

vrijednosti biljega (udio bolesnika s pozitivnom i negativnom vrijednosti biljega) između

skupina bolesnika ženskog i muškog spola u navedenoj skupini bolesnika. U skupini 143

bolesnika s lokaliziranom bolešću (stadiji 1 i 2 po AJCC) udio bolesnika s pozitivnom

vrijednosti tirozinaze pokazao se statistički značajno većim u skupini bolesnika ženskog

spola (Fisherov egzaktni test: p=0,03) (Tablica 18). U skupini 143 bolesnika s

lokaliziranom bolešću udio bolesnika s pozitivnom vrijednosti MITF-a nije se statistički

značajno razlikovao između skupina bolesnika ženskog i muškog spola (Hi-kvadrat test: χ2

uz Yatesovu korekciju=0,62; stupnjevi slobode=1; p=0,43) (Tablica 19). U skupini 143

bolesnika s lokaliziranom bolešću udio bolesnika s pozitivnom vrijednosti određivanja oba

biljega (definiranom kao pozitivnom ako je barem jedan biljeg (tirozinaza ili MITF)

pozitivan) pokazao se statistički značajno većim u skupini bolesnika ženskog spola (Hi-

kvadrat test: χ2 uz Yatesovu korekciju=3,98; stupnjevi slobode=1; p=0,046) (Tablica 20).

Tablica 18. Distribucija bolesnika s obzirom na vrijednost tirozinaze i spol u skupini 143 bolesnika

s lokaliziranim melanomom (stadiji 1 i 2 po American Joint Committee on Cancer).

pozitivni na tirozinazu /broj (%)/

negativni na tirozinazu /broj (%)/

ukupno /broj/

žene 9 (10,0%) 81 (90,0%) 90

muškarci 0 (0,0%) 53 (100,0%) 53

ukupno 9 (6,3%) 134 (93,7%) 143

* pozitivna vrijednost tirozinaze bila je statistički značajno učestalija u bolesnika ženskog spola (p=0,03)

76

Tablica 19. Distribucija bolesnika s obzirom na vrijednost MITF-a i spol u skupini 143 bolesnika s

lokaliziranim melanomom (stadiji 1 i 2 po American Joint Committee on Cancer).

pozitivni na MITF /broj (%)/

negativni na MITF /broj (%)/

ukupno /broj/

žene 14 (15,6%) 76 (84,4%) 90

muškarci 5 (9,4%) 48 (90,6%) 53

ukupno 19 (13,3%) 124 (86,7%) 143

* nije nađena statistički značajna povezanost između distribucije vrijednosti MITF-a i spola (p=0,43)

Tablica 20. Distribucija bolesnika s obzirom na vrijednost oba biljega (tirozinaze i MITF-a)1 i spol

u skupini 143 bolesnika s lokaliziranim melanomom (stadiji 1 i 2 po American Joint Committee on

Cancer).

pozitivni /broj (%)/ negativni /broj (%)/ ukupno /broj/

žene 22 (24,4%) 68 (75,6%) 90

muškarci 5 (9,4%) 48 (90,6%) 53

ukupno 27 (18,9%) 116 (81,1%) 143 1 vrijednost je pozitivna ako je barem jedan biljeg (tirozinaza ili MITF) pozitivan

* pozitivna vrijednost oba biljega bila je statistički značajno učestalija u bolesnika ženskog spola (p=0,046)

4.6. VRIJEDNOSTI BILJEGA I DOB BOLESNIKA

Vrijednosti dobi bolesnika odnosile su se na dob u trenutku uzimanja uzorka krvi za

analizu. U skupini svih 201 bolesnika nije bilo statistički značajne razlike u dobi između

skupine bolesnika s pozitivnom vrijednošću tirozinaze i onih s negativnom vrijednošću

tirozinaze (Mann Whitney U test: z=0,52; p=0,60) (Tablica 21, Slika 14). U skupini svih

201 bolesnika nije bilo statistički značajne razlike u dobi ni između skupine bolesnika s

pozitivnom vrijednošću MITF-a i onih s negativnom vrijednošću MITF-a (Mann Whitney

U test: z= –0,50; p=0,61) (Tablica 21, Slika 15). Također nije bilo statistički značajne

razlike u dobi ni između skupine bolesnika s pozitivnom i onih s negativnom vrijednošću

određivanja oba biljega (definiranom kao pozitivnom ako je barem jedan biljeg (tirozinaza

ili MITF) pozitivan) u skupini svih 201 bolesnika (Mann Whitney U test: z=0,32; p=0,76)

(Tablica 21, Slika 16).

77

Tablica 21. Parametri distribucije dobi bolesnika u različitim skupinama bolesnika s obzirom na

vrijednost biljega (tirozinaze i MITF-a) u skupini 201 bolesnika s melanomom.

PARAMETRI DISTRIBUCIJE DOBI (GODINE) VRIJEDNOST BILJEGA

(BROJ BOLESNIKA) srednja vrijednost

standardna devijacija

medijan raspon

pozitivni na tirozinazu (20) 50,5 15,2 49,5 28-80

negativni na tirozinazu (181) 51,7 15,1 52,0 14-87

pozitivni na MITF (32) 52,0 17,2 55,0 14-80

negativni na MITF (169) 51,6 14,7 51,0 17-87

pozitivni na oba biljega1 (48)

50,6 16,5 51,0 14-80

negativni na oba biljega2 (153) 51,9 14,6 52,0 17-87

1 vrijednost je pozitivna ako je barem jedan biljeg (tirozinaza ili MITF) pozitivan; 2 vrijednost je negativna ako su oba biljega (tirozinaza i MITF) negativni

RASPON

25.-75. CENTIL

MEDIJAN

VRIJEDNOST TIROZINAZE

DO

B (

go

din

e)

0

20

40

60

80

100

NEGATIVNA POZITIVNA

MEDIJAN

p=0,604 (Mann Whitney U test)

Slika 14. Distribucije dobi bolesnika u različitim skupinama bolesnika s obzirom na vrijednost

tirozinaze u skupini 201 bolesnika s melanomom.

78

RASPON

25. - 75. CENTIL

MEDIJAN

VRIJEDNOST MITF-a

DO

B (

go

din

e)

0

20

40

60

80

100

NEGATIVNA POZITIVNA

p=0,614 (Mann Whitney U test)

Slika 15. Distribucije dobi bolesnika u različitim skupinama bolesnika s obzirom na vrijednost

MITF-a u skupini 201 bolesnika s melanomom.

RASPON

25. - 75. CENTIL

MEDIJAN

VRIJEDNOST BILJEGA

DO

B (

go

din

e)

0

20

40

60

80

100

NEGATIVNA POZITIVNA

p=0,755 (Mann Whitney U test)

Slika 16. Distribucije dobi bolesnika u različitim skupinama bolesnika s obzirom na vrijednost oba

biljega (tirozinaze i MITF-a) u skupini 201 bolesnika s melanomom. Vrijednost je definirana kao

pozitivna ako je barem jedan biljeg (tirozinaza ili MITF) pozitivan, a negativna ako su oba biljega

negativna.

79

Budući da je dob značajan prognostički čimbenik samo u bolesnika s lokaliziranim

melanomom i s metastazama regionalnih limfnih čvorova (stadiji 1, 2 i 3 po AJCC),

posebno sam istražio razlikuju li se po dobi bolesnici s pozitivnom od onih s negativnom

vrijednosti biljega u toj skupini bolesnika. U skupini 179 bolesnika u stadijima 1, 2 i 3 po

AJCC nije bilo statistički značajne razlike u dobi između skupine bolesnika s pozitivnom

vrijednošću tirozinaze i onih s negativnom vrijednošću tirozinaze (Mann Whitney U test:

z=1,70; p=0,09) (Tablica 22, Slika 17). U skupini 179 bolesnika u stadijima 1, 2 i 3 po

AJCC nije bilo statistički značajne razlike u dobi ni između skupine bolesnika s

pozitivnom vrijednošću MITF-a i onih s negativnom vrijednošću MITF-a (Mann Whitney

U test: z=0,53; p=0,60) (Tablica 22, Slika 18). Također nije bilo statistički značajne razlike

u dobi ni između skupine bolesnika s pozitivnom i onih s negativnom vrijednošću

određivanja oba biljega (definiranom kao pozitivnom ako je barem jedan biljeg (tirozinaza

ili MITF) pozitivan) u skupini 179 bolesnika u stadijima 1, 2 i 3 po AJCC (Mann Whitney

U test: z=1,48; p=0,14) (Tablica 22, Slika 19).

Tablica 22. Parametri distribucije dobi bolesnika u različitim skupinama bolesnika s obzirom na

vrijednost biljega (tirozinaze i MITF-a) u skupini 179 bolesnika u stadijima 1, 2 i 3 po American

Joint Committee on Cancer.

PARAMETRI DISTRIBUCIJE DOBI (GODINE) VRIJEDNOST BILJEGA (BROJ

BOLESNIKA) srednja vrijednost

standardna devijacija

medijan raspon

pozitivni na tirozinazu (14) 45,1 13,1 43,5 28-72

negativni na tirozinazu (165) 51,6 14,9 52,0 14-87

pozitivni na MITF (25) 48,5 17,2 52,0 14-75

negativni na MITF (154) 51,5 14,4 50,5 17-87

pozitivni na oba biljega1 (37)

47,3 16,1 48,0 14-75

negativni na oba biljega2 (142) 52,1 14,3 51,5 17-87

1 vrijednost je pozitivna ako je barem jedan biljeg (tirozinaza ili MITF) pozitivan; 2 vrijednost je negativna ako su oba biljega (tirozinaza i MITF) negativni

80

RASPON

25. - 75. CENTIL

MEDIJAN

VRIJEDNOST TIROZINAZE

DO

B (

go

din

e)

0

20

40

60

80

100

NEGATIVNA POZITIVNA

p=0,088 (Mann Whitney u test)

Slika 17. Distribucije dobi bolesnika u različitim skupinama bolesnika s obzirom na vrijednost

tirozinaze u skupini 179 bolesnika u stadijima 1, 2 i 3 po American Joint Committee on Cancer.

RASPON

25. - 75. CENTIL

MEDIJAN

VRIJEDNOST MITF-a

DO

B (

go

din

e)

0

20

40

60

80

100

NEGATIVNA POZITIVNA

p=0,597 (Mann Whitney U test)

Slika 18. Distribucije dobi bolesnika u različitim skupinama bolesnika s obzirom na vrijednost

MITF-a u skupini 179 bolesnika u stadijima 1, 2 i 3 po American Joint Committee on Cancer.

81

RASPON

25. - 75. CENTIL

MEDIJAN

VRIJEDNOST BILJEGA

DO

B (

go

din

e)

0

20

40

60

80

100

NEGATIVNA POZITIVNA

p=0,139 (Mann Whitney U test)

Slika 19. Distribucije dobi bolesnika u različitim skupinama bolesnika s obzirom na vrijednost oba

biljega (tirozinaze i MITF-a) u skupini 179 bolesnika u stadijima 1, 2 i 3 po American Joint

Committee on Cancer. Vrijednost je definirana kao pozitivna ako je barem jedan biljeg (tirozinaza

ili MITF) pozitivan, a negativna ako su oba biljega negativna.

4.7. VRIJEDNOSTI BILJEGA I DEBLJINA PRIMARNOG TUMORA

Debljina primarnog tumora određena je metodom po Breslowu kao debljina lezije u

milimetrima od granularnog sloja epidermisa do najdubljeg dijela tumora. Podaci o debljini

primarnog tumora bili su poznati za 123 od ukupno 201 bolesnika. U skupini 123

bolesnika s podacima o debljini primarnog tumora nije bilo statistički značajne razlike u

debljini primarnog tumora između skupine bolesnika s pozitivnom vrijednošću tirozinaze i

onih s negativnom vrijednošću tirozinaze (Mann Whitney U test: z=0,15; p=0,88) (Tablica

23, Slika 20). U skupini 123 bolesnika s podacima o debljini primarnog tumora debljina

primarnog tumora se pokazala statistički značajno većom u skupini bolesnika s pozitivnom

vrijednošću MITF-a u odnosu na skupinu bolesnika s negativnom vrijednošću MITF-a

(Mann Whitney U test: z= –2,28; p=0,02) (Tablica 23, Slika 21). Nije bilo statistički

značajne razlike u debljini primarnog tumora između skupine bolesnika s pozitivnom i

onih s negativnom vrijednošću određivanja oba biljega (definiranom kao pozitivnom ako je

barem jedan biljeg (tirozinaza ili MITF) pozitivan) u skupini 123 bolesnika s podacima o

82

debljini primarnog tumora (Mann Whitney U test: z= –1,58; p=0,11) (Tablica 23, Slika

22).

Tablica 23. Parametri distribucije debljine primarnog tumora u različitim skupinama bolesnika s

obzirom na vrijednost biljega (tirozinaze i MITF-a) u skupini 123 bolesnika s podacima o debljini

primarnog tumora.

PARAMETRI DISTRIBUCIJE DEBLJINE PRIMARNOG TUMORA (mm) VRIJEDNOST BILJEGA

(BROJ BOLESNIKA) srednja vrijednost

standardna devijacija

medijan raspon

pozitivni na tirozinazu (11) 2,46 2,40 2,00 0,35-12,00

negativni na tirozinazu (112) 2,85 1,57 2,15 0,80-5,20

pozitivni na MITF (20) 3,58 2,21 2,45 0,66-8,00

negativni na MITF (103) 2,67 2,33 1,93 0,35-12,00

pozitivni na oba biljega1 (30)

3,12 2,06 2,35 0,66-8,00

negativni na oba biljega2 (93) 2,72 2,42 1,93 0,35-12,00

1 vrijednost je pozitivna ako je barem jedan biljeg (tirozinaza ili MITF) pozitivan; 2 vrijednost je negativna ako su oba biljega (tirozinaza i MITF) negativni

RASPON

25. - 75. CENTIL

MEDIJAN

VRIJEDNOST TIROZINAZE

DE

BL

JIN

A T

UM

OR

A (

mm

)

0

2

4

6

8

10

12

14

NEGATIVNA POZITIVNA

p=0,884 (Mann Whitney U test)

Slika 20. Distribucije debljine primarnog tumora u različitim skupinama bolesnika s obzirom na

vrijednost tirozinaze u skupini 123 bolesnika s podacima o debljini primarnog tumora.

83

RASPON

25. - 75. CENTIL

MEDIJAN

VRIJEDNOST MITF-a

DE

BL

JIN

A T

IMO

RA

(m

m)

0

2

4

6

8

10

12

14

NEGATIVNA POZITIVNA

p=0,023 (Mann Whitney U test)

Slika 21. Distribucije debljine primarnog tumora u različitim skupinama bolesnika s obzirom na

vrijednost MITF-a u skupini 123 bolesnika s podacima o debljini primarnog tumora.

RASPON

25. - 75. CENTIL

MEDIJAN

VRIJEDNOST BILJEGA

DE

BL

JIN

A T

UM

OR

A (

mm

)

0

2

4

6

8

10

12

14

NEGATIVNA POZITIVNA

p=0,113 (Mann Whitney U test)

Slika 22. Distribucije debljine primarnog tumora u različitim skupinama bolesnika s obzirom na

vrijednost oba biljega (tirozinaze i MITF-a) u skupini 123 bolesnika s podacima o debljini

primarnog tumora. Vrijednost je definirana kao pozitivna ako je barem jedan biljeg (tirozinaza ili

MITF) pozitivan, a negativna ako su oba biljega negativna.

84

Budući da je debljina primarnog tumora značajan prognostički čimbenik samo u

bolesnika s lokaliziranim melanomom (stadiji 1 i 2 po AJCC), posebno sam istražio

razlikuju li se po debljini primarnog tumora bolesnici s pozitivnom od onih s negativnom

vrijednosti biljega u toj skupini bolesnika. U skupini 97 bolesnika u stadijima 1 i 2 po

AJCC s podacima o debljini primarnog tumora nije bilo statistički značajne razlike u

debljini primarnog tumora između skupine bolesnika s pozitivnom vrijednošću tirozinaze i

onih s negativnom vrijednošću tirozinaze (Mann Whitney U test: z=0,75; p=0,45) (Tablica

24, Slika 23). U skupini 97 bolesnika u stadijima 1 i 2 po AJCC s podacima o debljini

primarnog tumora nije bilo statistički značajne razlike u debljini primarnog tumora ni

između skupine bolesnika s pozitivnom vrijednošću MITF-a i onih s negativnom

vrijednošću MITF-a (Mann Whitney U test: z= –1,55; p=0,12) (Tablica 24, Slika 24).

Također nije bilo statistički značajne razlike u debljini primarnog tumora ni između

skupine bolesnika s pozitivnom i onih s negativnom vrijednošću određivanja oba biljega

(definiranom kao pozitivnom ako je barem jedan biljeg (tirozinaza ili MITF) pozitivan) u

skupini 97 bolesnika u stadijima 1 i 2 po AJCC s podacima o debljini primarnog tumora

(Mann Whitney U test: z=–0,82; p=0,41) (Tablica 24, Slika 25).

Tablica 24. Parametri distribucije debljine primarnog tumora u različitim skupinama bolesnika s

obzirom na vrijednost biljega (tirozinaze i MITF-a) u skupini 97 bolesnika u stadijima 1 i 2 po

American Joint Committee on Cancer s podacima o debljini primarnog tumora.

PARAMETRI DISTRIBUCIJE DEBLJINE PRIMARNOG TUMORA (mm) VRIJEDNOST BILJEGA (BROJ

BOLESNIKA) srednja vrijednost

standardna devijacija

medijan raspon

pozitivni na tirozinazu (6) 1,56 0,90 1,30 0,80-3,00

negativni na tirozinazu (91) 2,34 2,02 1,80 0,35-10,00

pozitivni na MITF (11) 2,64 1,54 2,00 0,66-5,50

negativni na MITF (86) 2,25 2,03 1,70 0,35-10,00

pozitivni na oba biljega1 (17)

2,26 1,42 2,00 0,66-5,50

negativni na oba biljega2 (80) 2,30 2,09 1,70 0,35-10,00

1 vrijednost je pozitivna ako je barem jedan biljeg (tirozinaza ili MITF) pozitivan; 2 vrijednost je negativna ako su oba biljega (tirozinaza i MITF) negativni

85

RASPON

25. - 75. CENTIL

MEDIJAN

VRIJEDNOST TIROZINAZE

DE

BL

JIN

A T

UM

OR

A (

mm

)

0

2

4

6

8

10

NEGATIVNA POZITIVNA

p=0,454 (Mann Whitney U test)

Slika 23. Distribucije debljine primarnog tumora u različitim skupinama bolesnika s obzirom na

vrijednost tirozinaze u skupini 97 bolesnika u stadijima 1 i 2 po American Joint Committee on

Cancer s podacima o debljini primarnog tumora.

RASPON

25. - 75. CENTIL

MEDIJAN

VRIJEDNOST MITF-a

DE

BL

JIN

A T

UM

OR

A (

mm

)

0

2

4

6

8

10

NEGATIVNA POZITIVNA

p=0,121 (Mann Whitney U test)

Slika 24. Distribucije debljine primarnog tumora u različitim skupinama bolesnika s obzirom na

vrijednost MITF-a u skupini 97 bolesnika u stadijima 1 i 2 po American Joint Committee on

Cancer s podacima o debljini primarnog tumora.

86

RASPON

25. - 75. CENTIL

MEDIJAN

VRIJEDNOST BILJEGA

DE

BL

JIN

A Z

UM

OR

A (

mm

)

0

2

4

6

8

10

NEGATIVNA POZITIVNA

p=0,414 (Mann Whitney U test)

Slika 25. Distribucije debljine primarnog tumora u različitim skupinama bolesnika s obzirom na

vrijednost oba biljega (tirozinaze i MITF-a) u skupini 97 bolesnika u stadijima 1 i 2 po American

Joint Committee on Cancer s podacima o debljini primarnog tumora. Vrijednost je definirana kao

pozitivna ako je barem jedan biljeg (tirozinaza ili MITF) pozitivan, a negativna ako su oba biljega

negativna.

4.8. VRIJEDNOSTI BILJEGA I LOKALIZACIJA PRIMARNOG TUMORA

Među četvero bolesnika koliko ih je imalo primarni melanom oka, jedan (25,0%) je

bio pozitivan samo na tirozinazu, jedan (25,0%) samo na MITF, a dvoje (50,0%) ih je bilo

negativno na oba biljega.

Među sedmero bolesnika koliko ih je imalo nepoznat primarni melanom, dvoje

(28,6%) ih je bilo pozitivno samo na tirozinazu, a 5 (71,4%) ih je bilo negativno na oba

biljega.

U skupini 190 bolesnika s primarnim kožnim melanomom distribucija vrijednosti

MITF-a (udio bolesnika s pozitivnom i negativnom vrijednosti MITF-a) nije se statistički

značajno razlikovala između različitih skupina bolesnika s obzirom na lokalizaciju

primarnog tumora (Hi-kvadrat test: χ2 =4,25; stupnjevi slobode=3; p=0,24) (Tablica 26). U

skupini 190 bolesnika s primarnim kožnim melanomom ni distribucija vrijednosti

određivanja oba biljega (definirane kao pozitivne ako je barem jedan biljeg (tirozinaza ili

87

MITF) pozitivan) nije se statistički značajno razlikovala između različitih skupina

bolesnika s obzirom na lokalizaciju primarnog tumora (Hi-kvadrat test: χ2 =3,73; stupnjevi

slobode=3; p=0,29) (Tablica 27).

Budući da je u tablici koja pokazuje povezanost vrijednosti tirozinaze i lokalizacije

primarnog tumora u skupini bolesnika s primarnim kožnim melanomom (Tablica 25)

očekivana frekvencija u više od 20% ćelija bila manja od 5, istražio sam razlikuje li se

distribucija vrijednosti tirozinaze (udio bolesnika s pozitivnom i negativnom vrijednosti

tirozinaze) između skupina bolesnika s različitom lokalizacijom primarnog tumora nakon

objedinjavanja skupina s obzirom na lokalizaciju primarnog tumora. U skupini 190

bolesnika s primarnim kožnim melanomom distribucija vrijednosti tirozinaze nije se

statistički značajno razlikovala između skupina bolesnika s različitom lokalizacijom

primarnog tumora nakon objedinjavanja skupina s obzirom na lokalizaciju primarnog

tumora.

Tablica 25. Distribucija bolesnika s obzirom na vrijednost tirozinaze i lokalizaciju primarnog

tumora u skupini 190 bolesnika s primarnim kožnim melanomom.

lokalizacija primarnog tumora

pozitivni na tirozinazu /broj (%)/

negativni na tirozinazu /broj (%)/

ukupno

/broj/

glava i vrat 4 (14,8%) 23 (85,2%) 27

trup 7 (8,8%) 73 (91,2%) 80

gornji udovi 4 (10,8%) 33 (89,2%) 37

donji udovi 2 (4,3%) 44 (95,7%) 46

ukupno 17 (8,9%) 173 (91,1%) 190

* nije nađena statistički značajna povezanost između distribucije vrijednosti tirozinaze i lokalizacije primarnog tumora

88

Tablica 26. Distribucija bolesnika s obzirom na vrijednost MITF-a i lokalizaciju primarnog tumora

u skupini 190 bolesnika s primarnim kožnim melanomom.

lokalizacija primarnog tumora

pozitivni na MITF /broj (%)/

negativni na MITF /broj (%)/

ukupno

/broj/

glava i vrat 4 (14,8%) 23 (85,2%) 27

trup 12 (15,0%) 68 (85,0%) 80

gornji udovi 10 (27,0%) 27 (73,0%) 37

donji udovi 5 (10,9%) 41 (89,1%) 46

ukupno 31 (16,3%) 159 (83,7%) 190

* nije nađena statistički značajna povezanost između distribucije vrijednosti MITF-a i

lokalizacije primarnog tumora (p=0,24)

Tablica 27. Distribucija bolesnika s obzirom na vrijednost oba biljega (tirozinaze i MITF-a)1 i

lokalizaciju primarnog tumora u skupini 190 bolesnika s primarnim kožnim melanomom.

lokalizacija primarnog tumora

pozitivni /broj (%)/ negativni /broj (%)/ ukupno

/broj/

glava i vrat 7 (25,9%) 20 (74,1%) 27

trup 18 (22,5%) 62 (77,5%) 80

gornji udovi 12 (32,4%) 25 (67,6%) 37

donji udovi 7 (15,2%) 39 (84,8%) 46

ukupno 44 (23,2%) 146 (76,8%) 190 1 vrijednost je pozitivna ako je barem jedan biljeg (tirozinaza ili MITF) pozitivan

* nije nađena statistički značajna povezanost između distribucije vrijednosti oba biljega i lokalizacije primarnog tumora (p=0,29)

Budući da je lokalizacija primarnog tumora značajan prognostički čimbenik samo u

bolesnika s lokaliziranim melanomom i s metastazama regionalnih limfnih čvorova (stadiji

1, 2 i 3 po AJCC), posebno sam istražio razlikuje li se distribucija vrijednosti biljega (udio

bolesnika s pozitivnom i negativnom vrijednosti biljega) između skupina bolesnika s

različitom lokalizacijom primarnog tumora u toj skupini bolesnika. Distribucija vrijednosti

određivanja oba biljega (definirane kao pozitivne ako je barem jedan biljeg (tirozinaza ili

MITF) pozitivan) nije se statistički značajno razlikovala između različitih skupina

bolesnika s obzirom na lokalizaciju primarnog tumora u skupini 174 bolesnika s primarnim

89

kožnim melanomom u stadijima 1, 2 i 3 po AJCC (Hi-kvadrat test: χ2 =3,11; stupnjevi

slobode=3; p=0,38) (Tablica 30).

U tablicama koje pokazuju povezanost vrijednosti tirozinaze odnosno MITF-a i

lokalizacije primarnog tumora u skupini bolesnika s primarnim kožnim melanomom u

stadijima 1, 2 i 3 po AJCC (Tablica 28, Tablica 29) očekivana frekvencija je u više od 20%

ćelija bila manja od 5. Stoga sam istražio razlikuje li se distribucija vrijednosti tirozinaze

odnosno MITF-a (udio bolesnika s pozitivnom i negativnom vrijednosti tirozinaze odnosno

MITF-a) između skupina bolesnika s različitom lokalizacijom primarnog tumora nakon

objedinjavanja skupina s obzirom na lokalizaciju primarnog tumora u navedenoj skupini

bolesnika. Nakon objedinjavanja skupina s obzirom na lokalizaciju primarnog tumora

distribucija vrijednosti tirozinaze odnosno MITF-a nije se statistički značajno razlikovala

između skupina bolesnika s različitom lokalizacijom primarnog tumora u skupini 174

bolesnika s primarnim kožnim melanomom u stadijima 1, 2 i 3 po AJCC.

Tablica 28. Distribucija bolesnika s obzirom na vrijednost tirozinaze i lokalizaciju primarnog

tumora u skupini 174 bolesnika s primarnim kožnim melanomom u stadijima 1, 2 i 3 po American

Joint Committee on Cancer.

lokalizacija primarnog tumora

pozitivni na tirozinazu /broj (%)/

negativni na tirozinazu /broj (%)/

ukupno

/broj/

glava i vrat 3 (12,5%) 21 (87,5%) 24

trup 5 (6,8%) 68 (93,2%) 73

gornji udovi 3 (9,1%) 30 (90,9%) 33

donji udovi 2 (4,5%) 42 (95,5%) 44

ukupno 13 (7,5%) 161 (92,5%) 174

* nije nađena statistički značajna povezanost između distribucije vrijednosti tirozinaze i lokalizacije primarnog tumora

90

Tablica 29. Distribucija bolesnika s obzirom na vrijednost MITF-a i lokalizaciju primarnog tumora

u skupini 174 bolesnika s primarnim kožnim melanomom u stadijima 1, 2 i 3 po American Joint

Committee on Cancer.

lokalizacija primarnog tumora

pozitivni na MITF /broj (%)/

negativni na MITF /broj (%)/

ukupno

/broj/

glava i vrat 3 (12,5%) 21 (87,5%) 24

trup 9 (12,3%) 64 (87,7%) 73

gornji udovi 8 (24,2%) 25 (75,8%) 33

donji udovi 5 (11,4%) 39 (88,6%) 44

ukupno 25 (14,4%) 149 (85,6%) 174

* nije nađena statistički značajna povezanost između distribucije vrijednosti MITF-a i lokalizacije primarnog tumora

Tablica 30. Distribucija bolesnika s obzirom na vrijednost oba biljega (tirozinaze i MITF-a)1 i

lokalizaciju primarnog tumora u skupini 174 bolesnika s primarnim kožnim melanomom u

stadijima 1, 2 i 3 po American Joint Committee on Cancer.

lokalizacija primarnog tumora

pozitivni /broj (%)/ negativni /broj (%)/ ukupno

/broj/

glava i vrat 6 (25,0%) 18 (75,0%) 24

trup 13 (17,8%) 60 (82,2%) 73

gornji udovi 10 (30,3%) 23 (69,7%) 33

donji udovi 7 (15,9%) 37 (84,1%) 44

ukupno 36 (20,7%) 138 (79,3%) 174 1 vrijednost je pozitivna ako je barem jedan biljeg (tirozinaza ili MITF) pozitivan

* nije nađena statistički značajna povezanost između distribucije vrijednosti oba biljega i lokalizacije primarnog tumora (p=0,38)

91

4.9. VRIJEDNOSTI BILJEGA I HISTOLOŠKI TIP PRIMARNOG

TUMORA

Podaci o histološkom tipu primarnog tumora postojali su za 115 od ukupno 190

bolesnika s primarnim kožnim melanomom. U tablicama koje pokazuju povezanost

vrijednosti biljega i histološkog tipa u skupini 115 bolesnika s podacima o histološkom

tipu primarnog kožnog melanoma (Tablica 31, Tablica 32, Tablica 33) očekivana

frekvencija je u više od 20% ćelija bila manja od 5. Stoga sam istražio razlikuje li se

distribucija vrijednosti biljega (udio bolesnika s pozitivnom i negativnom vrijednosti

biljega) između skupine bolesnika s nodularnim melanomom (NM) i onih s površinsko

širećim melanomom (SSM) u skupini 115 bolesnika s podacima o histološkom tipu

primarnog kožnog melanoma. Nodularni melanom (NM) ili površinsko šireći melanom

(SSM) imalo je 106 (92,2%) od ukupno 115 bolesnika s podacima o histološkom tipu

primarnog kožnog melanoma. U navedenoj skupini bolesnika udio bolesnika s pozitivnom

vrijednosti tirozinaze nije se statistički značajno razlikovao između skupine bolesnika s

nodularnim melanomom (NM) i onih s površinsko širećim melanomom (SSM) (Fisherov

egzaktni test: p=1,0000). U navedenoj skupini bolesnika ni udio bolesnika s pozitivnom

vrijednosti MITF-a nije se statistički značajno razlikovao između skupine bolesnika s

nodularnim melanomom (NM) i onih s površinsko širećim melanomom (SSM) (Hi-kvadrat

test: χ2 uz Yatesovu korekciju=0,04; stupnjevi slobode=1; p=0,84; χ2 bez Yatesove

korekcije=0,20; stupnjevi slobode=1; p=0,66). U navedenoj skupini bolesnika također se ni

udio bolesnika s pozitivnom vrijednosti određivanja oba biljega (definiranom kao

pozitivnom ako je barem jedan biljeg (tirozinaza ili MITF) pozitivan) nije statistički

značajno razlikovao između skupine bolesnika s nodularnim melanomom (NM) i onih s

površinsko širećim melanomom (SSM) (Hi-kvadrat test: χ2 uz Yatesovu korekciju=0,12;

stupnjevi slobode=1; p=0,73; χ2 bez Yatesove korekcije=0,33; stupnjevi slobode=1;

p=0,57).

92

Tablica 31. Distribucija bolesnika s obzirom na vrijednost tirozinaze i histološki tip primarnog

tumora u skupini 115 bolesnika s podacima o histološkom tipu primarnog kožnog melanoma.

histološki tip primarnog tumora

pozitivni na tirozinazu /broj (%)/

negativni na tirozinazu /broj (%)/

ukupno

/broj/

SSM1 3 (6,0%) 47 (94,0%) 50

NM2 4 (7,1%) 52 (92,9%) 56

LMM3 0 (0,0%) 5 (100,0%) 5

ALM4 0 (0,0%) 1 (100,0%) 1

ostalo5 0 (0,0%) 3 (100,0%) 3

ukupno 7 (6,1%) 108 (93,9%) 115

1 površinsko šireći melanom (engl., superficial spreading melanoma); 2 nodularni melanom; 3 lentigo maligna melanom; 4 akralni lentiginozni melanom; 5 jedan melanom in situ, jedan špicoidni melanom, jedan dezmoplastički melanom

* nije nađena statistički značajna povezanost između distribucije vrijednosti tirozinaze i histološkog tipa primarnog tumora

Tablica 32. Distribucija bolesnika s obzirom na vrijednost MITF-a i histološki tip primarnog

tumora u skupini 115 bolesnika s podacima o histološkom tipu primarnog kožnog melanoma.

histološki tip primarnog tumora

pozitivni na MITF /broj (%)/

negativni na MITF /broj (%)/

ukupno

/broj/

SSM1 9 (18,0%) 41 (82,0%) 50

NM2 12 (21,4%) 44 (78,6%) 56

LMM3 1 (20,0%) 4 (80,0%) 5

ALM4 0 (0,0%) 1 (100,0%) 1

ostalo5 0 (0,0%) 3 (100,0%) 3

ukupno 22 (19,1%) 93 (80,9%) 115

1 površinsko šireći melanom (engl., superficial spreading melanoma); 2 nodularni melanom; 3 lentigo maligna melanom; 4 akralni lentiginozni melanom; 5 jedan melanom in situ, jedan špicoidni melanom, jedan dezmoplastički melanom

* nije nađena statistički značajna povezanost između distribucije vrijednosti MITF-a i histološkog tipa primarnog tumora

93

Tablica 33. Distribucija bolesnika s obzirom na vrijednost oba biljega (tirozinaze i MITF-a)1 i

histološki tip primarnog tumora u skupini 115 bolesnika s podacima o histološkom tipu primarnog

kožnog melanoma.

histološki tip primarnog tumora pozitivni /broj (%)/ negativni /broj (%)/

ukupno

/broj/

SSM2 11 (22,0%) 39 (78,0%) 50

NM3 15 (26,8%) 41 (73,2%) 56

LMM4 1 (20,0%) 4 (80,0%) 5

ALM5 0 (0,0%) 1 (100,0%) 1

ostalo6 0 (0,0%) 3 (100,0%) 3

ukupno 27 (23,5%) 88 (76,5%) 115

1 vrijednost je pozitivna ako je barem jedan biljeg (tirozinaza ili MITF) pozitivan; 2 površinsko šireći melanom (engl., superficial spreading melanoma); 3 nodularni melanom; 4 lentigo maligna melanom; 5 akralni lentiginozni melanom; 6 jedan melanom in situ, jedan špicoidni melanom, jedan dezmoplastički melanom

* nije nađena statistički značajna povezanost između distribucije vrijednosti oba biljega i histološkog tipa primarnog tumora

Budući da je histološki tip primarnog tumora značajan prognostički čimbenik samo u

bolesnika s lokaliziranim bolešću (stadiji 1 i 2 po AJCC), posebno sam istražio razlikuje li

se distribucija vrijednosti biljega (udio bolesnika s pozitivnom i negativnom vrijednosti

biljega) između skupina bolesnika s različitim histološkim tipom primarnog tumora u toj

skupini bolesnika.

U tablicama koje pokazuju povezanost vrijednosti biljega i histološkog tipa u skupini

86 bolesnika s lokaliziranom bolešću (stadiji 1 i 2 po AJCC) za koje postoje podaci o

histološkom tipu primarnog kožnog melanoma (Tablica 34, Tablica 35, Tablica 36)

očekivana frekvencija je u više od 20% ćelija bila manja od 5. Stoga sam istražio razlikuje

li se distribucija vrijednosti biljega između skupine bolesnika s nodularnim melanomom

(NM) i onih s površinsko širećim melanomom (SSM) u skupini 86 bolesnika s

lokaliziranom bolešću (stadiji 1 i 2 po AJCC) za koje postoje podaci o histološkom tipu

primarnog kožnog melanoma. Nodularni melanom (NM) ili površinsko šireći melanom

(SSM) imalo je 79 (91,9%) od ukupno 86 bolesnika s lokaliziranom bolešću (stadiji 1 i 2

po AJCC) za koje postoje podaci o histološkom tipu primarnog kožnog melanoma. U

navedenoj skupini bolesnika udio bolesnika s pozitivnom vrijednosti tirozinaze nije se

94

statistički značajno razlikovao između skupine bolesnika s nodularnim melanomom (NM) i

onih s površinsko širećim melanomom (SSM) (Fisherov egzaktni test: p=0,24). U

navedenoj skupini bolesnika ni udio bolesnika s pozitivnom vrijednosti MITF-a nije se

statistički značajno razlikovao između skupine bolesnika s nodularnim melanomom (NM) i

onih s površinsko širećim melanomom (SSM) (Hi-kvadrat test: χ2 uz Yatesovu

korekciju=0,01; stupnjevi slobode=1; p=0,94; χ2 bez Yatesove korekcije=0,06; stupnjevi

slobode=1; p=0,81). U navedenoj skupini bolesnika također se ni udio bolesnika s

pozitivnom vrijednosti određivanja oba biljega (definiranom kao pozitivnom ako je barem

jedan biljeg (tirozinaza ili MITF) pozitivan) nije statistički značajno razlikovao između

skupine bolesnika s nodularnim melanomom (NM) i onih s površinsko širećim

melanomom (SSM) (Hi-kvadrat test: χ2 uz Yatesovu korekciju=0,001; stupnjevi

slobode=1; p=0,97; χ2 bez Yatesove korekcije=0,11; stupnjevi slobode=1; p=0,74).

Tablica 34. Distribucija bolesnika s obzirom na vrijednost tirozinaze i histološki tip primarnog

tumora u skupini 86 bolesnika s lokaliziranom bolešću (stadiji 1 i 2 po American Joint Committee

on Cancer) za koje postoje podaci o histološkom tipu primarnog kožnog melanoma.

histološki tip primarnog tumora

pozitivni na tirozinazu /broj (%)/

negativni na tirozinazu /broj (%)/

ukupno

/broj/

SSM1 3 (7,1%) 39 (92,9%) 42

NM2 0 (0,0%) 37 (100,0%) 37

LMM3 0 (0,0%) 5 (100,0%) 5

ALM4 0 (0,0%) 1 (100,0%) 1

ostalo5 0 (0,0%) 1 (100,0%) 1

ukupno 3 (3,5%) 83 (96,5%) 86

1 površinsko šireći melanom (engl., superficial spreading melanoma); 2 nodularni melanom; 3 lentigo maligna melanom; 4 akralni lentiginozni melanom; 5 jedan melanom in situ, jedan špicoidni melanom, jedan dezmoplastički melanom

* nije nađena statistički značajna povezanost između distribucije vrijednosti tirozinaze i histološkog tipa primarnog tumora

95

Tablica 35. Distribucija bolesnika s obzirom na vrijednost MITF-a i histološki tip primarnog

tumora u skupini 86 bolesnika s lokaliziranom bolešću (stadiji 1 i 2 po American Joint Committee

on Cancer) za koje postoje podaci o histološkom tipu primarnog kožnog melanoma.

histološki tip primarnog tumora

pozitivni na MITF /broj (%)/

negativni na MITF /broj (%)/

ukupno

/broj/

SSM1 6 (14,3%) 36 (85,7%) 42

NM2 6 (16,2%) 31 (83,8%) 37

LMM3 1 (20,0%) 4 (80,0%) 5

ALM4 0 (0,0%) 1 (100,0%) 1

ostalo5 0 (0,0%) 1 (100,0%) 1

ukupno 13 (15,1%) 73 (84,9%) 86

1 površinsko šireći melanom (engl., superficial spreading melanoma); 2 nodularni melanom; 3 lentigo maligna melanom; 4 akralni lentiginozni melanom; 5 jedan melanom in situ, jedan špicoidni melanom, jedan dezmoplastički melanom

* nije nađena statistički značajna povezanost između distribucije vrijednosti MITF-a i histološkog tipa primarnog tumora

Tablica 36. Distribucija bolesnika s obzirom na vrijednost oba biljega (tirozinaze i MITF-a)1 i

histološki tip primarnog tumora u skupini 86 bolesnika s lokaliziranom bolešću (stadiji 1 i 2 po

American Joint Committee on Cancer) za koje postoje podaci o histološkom tipu primarnog

kožnog melanoma.

histološki tip primarnog tumora

pozitivni /broj (%)/ negativni /broj (%)/ ukupno

/broj/

SSM2 8 (19,1%) 34 (80,9%) 42

NM3 6 (16,2%) 31 (83,8%) 37

LMM4 1 (20,0%) 4 (80,0%) 5

ALM5 0 (0,0%) 1 (100,0%) 1

ostalo6 0 (0,0%) 1 (100,0%) 1

ukupno 15 (17,4%) 71 (82,6%) 86

1 vrijednost je pozitivna ako je barem jedan biljeg (tirozinaza ili MITF) pozitivan; 2 površinsko šireći melanom (engl., superficial spreading melanoma); 3 nodularni melanom; 4 lentigo maligna melanom; 5 akralni lentiginozni melanom; 6 jedan melanom in situ, jedan špicoidni melanom, jedan dezmoplastički melanom

* nije nađena statistički značajna povezanost između distribucije vrijednosti oba biljega i histološkog tipa primarnog tumora

96

4.10. VRIJEDNOSTI BILJEGA I ULCERACIJA PRIMARNOG TUMORA

Podaci o ulceraciji primarnog tumora postojali su za 41 od ukupno 201 bolesnika. U

skupini 41 bolesnika s podacima o ulceraciji udio bolesnika s pozitivnom vrijednosti

tirozinaze nije se statistički značajno razlikovao između skupine bolesnika s ulceriranim i

onih s neulceriranim melanomom (Fisherov egzaktni test: p=0,54) (Tablica 37). U skupini

41 bolesnika s podacima o ulceraciji ni udio bolesnika s pozitivnom vrijednosti MITF-a

nije se statistički značajno razlikovao između skupine bolesnika s ulceriranim i onih s

neulceriranim melanomom (Fisherov egzaktni test: p=0,39) (Tablica 38). Udio bolesnika s

pozitivnom vrijednosti određivanja oba biljega (definiranom kao pozitivnom ako je barem

jedan biljeg (tirozinaza ili MITF) pozitivan) također se nije statistički značajno razlikovao

između skupine bolesnika s ulceriranim i onih s neulceriranim melanomom u skupini 41

bolesnika s podacima o ulceraciji (Fisherov egzaktni test: p=0,13) (Tablica 39).

Tablica 37. Distribucija bolesnika s obzirom na vrijednost tirozinaze i ulceraciju u skupini 41

melanomskog bolesnika s podacima o ulceraciji.

pozitivni na tirozinazu /broj (%)/

negativni na tirozinazu /broj (%)/

ukupno

/broj/

ulceracija prisutna 0 (0,0%) 13 (100,0%) 13

ulceracija nije prisutna

3 (10,7%) 25 (89,3%) 28

ukupno 3 (7,3%) 38 (92,7%) 41

* nije nađena statistički značajna povezanost između distribucije vrijednosti tirozinaze i ulceracije (p=0,53)

Tablica 38. Distribucija bolesnika s obzirom na vrijednost MITF-a i ulceraciju u skupini 41

melanomskog bolesnika s podacima o ulceraciji.

pozitivni na MITF /broj (%)/

negativni na MITF /broj (%)/

ukupno

/broj/

ulceracija prisutna 1 (7,7%) 12 (92,3%) 13

ulceracija nije prisutna

6 (21,4%) 22 (78,6%) 28

ukupno 7 (17,1%) 34 (82,9%) 41

* nije nađena statistički značajna povezanost između distribucije vrijednosti MITF-a i ulceracije (p=0,39)

97

Tablica 39. Distribucija bolesnika s obzirom na vrijednost oba biljega (tirozinaze i MITF-a)1 i

ulceraciju u skupini 41 melanomskog bolesnika s podacima o ulceraciji.

pozitivni /broj (%)/ negativni /broj (%)/ ukupno

/broj/

ulceracija prisutna 1 (7,7%) 12 (92,3%) 13

ulceracija nije prisutna

9 (32,1%) 19 (67,9%) 28

ukupno 10 (24,4%) 31 (75,6%) 41 1 vrijednost je pozitivna ako je barem jedan biljeg (tirozinaza ili MITF) pozitivan

* nije nađena statistički značajna povezanost između distribucije vrijednosti oba biljega i ulceracije (p=0,13)

Budući da je ulceracija značajan prognostički čimbenik samo u bolesnika s

lokaliziranim melanomom i s metastazama regionalnih limfnih čvorova (stadiji 1, 2 i 3 po

AJCC), posebno sam istražio razlikuje li se distribucija vrijednosti biljega (udio bolesnika

s pozitivnom i negativnom vrijednosti biljega) između skupine bolesnika s ulceriranim i

onih s neulceriranim melanomom u toj skupini bolesnika. U skupini 37 bolesnika u

stadijima 1, 2 i 3 po AJCC s podacima o ulceraciji udio bolesnika s pozitivnom vrijednosti

tirozinaze nije se statistički značajno razlikovao između skupine bolesnika s ulceriranim i

onih s neulceriranim melanomom (Fisherov egzaktni test: p=0,54) (Tablica 40). U skupini

37 bolesnika u stadijima 1, 2 i 3 po AJCC s podacima o ulceraciji ni udio bolesnika s

pozitivnom vrijednosti MITF-a nije se statistički značajno razlikovao između skupine

bolesnika s ulceriranim i onih s neulceriranim melanomom (Fisherov egzaktni test: p=0,38)

(Tablica 41). Udio bolesnika s pozitivnom vrijednosti određivanja oba biljega (definiranom

kao pozitivnom ako je barem jedan biljeg (tirozinaza ili MITF) pozitivan) također se nije

statistički značajno razlikovao između skupine bolesnika s ulceriranim i onih s

neulceriranim melanomom u skupini 37 bolesnika u stadijima 1, 2 i 3 po AJCC s podacima

o ulceraciji (Fisherov egzaktni test: p=0,07) (Tablica 42).

98

Tablica 40. Distribucija bolesnika s obzirom na vrijednost tirozinaze i ulceraciju u skupini 37

melanomskih bolesnika u stadiju 1, 2 i 3 po American Joint Committee on Cancer s podacima o

ulceraciji.

pozitivni na tirozinazu /broj (%)/

negativni na tirozinazu /broj (%)/

ukupno

/broj/

ulceracija prisutna 0 (0,0%) 13 (100,0%) 13

ulceracija nije prisutna

3 (12,5%) 21 (87,5%) 24

ukupno 3 (8,1%) 34 (91,9%) 37

* nije nađena statistički značajna povezanost između distribucije vrijednosti tirozinaze i ulceracije (p=0,54)

Tablica 41. Distribucija bolesnika s obzirom na vrijednost MITF-a i ulceraciju u skupini 37

melanomskih bolesnika u stadiju 1, 2 i 3 po American Joint Committee on Cancer s podacima o

ulceraciji.

pozitivni na MITF /broj (%)/

negativni na MITF /broj (%)/

ukupno

/broj/

ulceracija prisutna 1 (7,7%) 12 (92,3%) 13

ulceracija nije prisutna

6 (25,0%) 18 (75,0%) 24

ukupno 7 (18,9%) 30 (81,1%) 37

* nije nađena statistički značajna povezanost između distribucije vrijednosti MITF-a i ulceracije (p=0,38) Tablica 42. Distribucija bolesnika s obzirom na vrijednost oba biljega (tirozinaze i MITF-a)1 i

ulceraciju u skupini 37 melanomskih bolesnika u stadiju 1, 2 i 3 po American Joint Committee on

Cancer s podacima o ulceraciji.

pozitivni /broj (%)/ negativni /broj (%)/ ukupno

/broj/

ulceracija prisutna 1 (7,7%) 12 (92,3%) 13

ulceracija nije prisutna

9 (37,5%) 15 (62,5%) 24

ukupno 10 (27,0%) 27 (73,0%) 37 1 vrijednost je pozitivna ako je barem jedan biljeg (tirozinaza ili MITF) pozitivan

* nije nađena statistički značajna povezanost između distribucije vrijednosti oba biljega i ulceracije (p=0,07)

99

4.11. VRIJEDNOSTI BILJEGA I STUPANJ PO CLARKU

Podaci o stupnju po Clarku primarnog tumora postojali su za 186 od ukupno 201

bolesnika. U skupini 186 bolesnika s podacima o stupnju po Clarku nije se pokazao trend

promjene (porasta ili smanjenja) udjela bolesnika s pozitivnom vrijednosti tirozinaze sa

porastom stupnja po Clarku (Hi-kvadrat test za trend: χ2=1,05; stupnjevi slobode=1;

p=0,31) (Tablica 43). Međutim, pokazalo se da je udio bolesnika s pozitivnom vrijednosti

tirozinaze statistički značajno veći u skupini bolesnika s stupnjem po Clarku 5, nego u

skupini bolesnika s stupnjem po Clarku manjim od 5 (Fisherov egzaktni test: p=0,02). U

skupini 186 bolesnika s podacima o stupnju po Clarku nije se pokazao ni trend promjene

udjela bolesnika s pozitivnom vrijednosti MITF-a sa porastom stupnja po Clarku (Hi-

kvadrat test za trend: χ2=3,65; stupnjevi slobode=1; p=0,06) (Tablica 44). Međutim,

pokazalo se da je udio bolesnika s pozitivnom vrijednosti MITF-a statističko značajno veći

u skupini bolesnika sa stupnjem po Clarku većim od 2 nego u skupini bolesnika sa

stupnjem po Clarku 1 i 2 (Hi-kvadrat test: χ2 uz Yatesovu korekciju=4,22; stupnjevi

slobode=1; p=0,04; χ2 bez Yatesove korekcije=5,35; stupnjevi slobode=1; p=0,02). U

skupini 186 bolesnika s podacima o stupnju po Clarku također se nije pokazao ni trend

promjene udjela bolesnika s pozitivnom vrijednosti određivanja oba biljega (definiranom

kao pozitivnom ako je barem jedan biljeg (tirozinaza ili MITF) pozitivan) sa porastom

stupnja po Clarku (Hi-kvadrat test za trend: χ2=2,87; stupnjevi slobode=1; p=0,09)

(Tablica 45).

Tablica 43. Distribucija bolesnika s obzirom na vrijednost tirozinaze i stupanj po Clarku u skupini

186 melanomskih bolesnika s podacima o stupnju po Clarku.

stupanj po Clarku pozitivni na tirozinazu /broj (%)/

negativni na tirozinazu /broj (%)/

ukupno

/broj/

1 i 2 3 (8,8%) 31 (91,2%) 34

3 6 (8,6%) 64 (91,4%) 70

4 4 (5,8%) 65 (94,2%) 69

5 4 (30,8%) 9 (69,2%) 13

ukupno 17 (9,1%) 169 (90,9%) 186

* nije nađen trend promjene udjela bolesnika s pozitivnom vrijednosti tirozinaze sa porastom stupnja po Clarku (p=0,31)

100

Tablica 44. Distribucija bolesnika s obzirom na vrijednost MITF-a i stupanj po Clarku u skupini

186 melanomskih bolesnika s podacima o stupnju po Clarku.

stupanj po Clarku pozitivni na MITF /broj (%)/

negativni na MITF /broj (%)/

ukupno

/broj/

1 i 2 1 (2,9%) 33 (97,1%) 34

3 12 (17,1%) 58 (82,9%) 70

4 15 (21,7%) 54 (78,3%) 69

5 2 (15,4%) 11 (84,6%) 13

ukupno 30 (16,1%) 156 (83,9%) 186

* nije nađen trend promjene udjela bolesnika s pozitivnom vrijednosti MITF-a sa porastom stupnja po Clarku (p=0,06)

Tablica 45. Distribucija bolesnika s obzirom na vrijednost oba biljega (tirozinaze i MITF-a)1 i

stupanj po Clarku u skupini 186 melanomskih bolesnika s podacima o stupnju po Clarku.

stupanj po Clarku pozitivni /broj (%)/ negativni /broj (%)/ ukupno

/broj/

1 i 2 4 (11,8%) 30 (88,2%) 34

3 16 (22,9%) 54 (77,1%) 70

4 18 (26,1%) 51 (73,9%) 69

5 4 (30,8%) 9 (69,2%) 13

ukupno 42 (22,6%) 144 (77,4%) 186 1 vrijednost je pozitivna ako je barem jedan biljeg (tirozinaza ili MITF) pozitivan

* nije nađen trend promjene udjela bolesnika s pozitivnom vrijednosti oba biljega sa porastom stupnja po Clarku (p=0,09)

Budući da je stupanj po Clarku primarnog tumora značajan prognostički čimbenik

samo u bolesnika s lokaliziranom bolešću (stadiji 1 i 2 po AJCC), posebno sam istražio

postoji li trend promjene udjela bolesnika s pozitivnom vrijednosti biljega sa porastom

stupnja po Clarku u navedenoj skupini bolesnika. U tablici koja pokazuje povezanost

vrijednosti tirozinaze i stupnja po Clarku u skupini 141 bolesnika s lokaliziranom bolešću

(stadiji 1 i 2 po AJCC) za koje postoje podaci o stupnju po Clarku (Tablica 46), očekivana

frekvencija je u više od 20% ćelija bila manja od 5. Stoga se nije mogla provesti pouzdana

statistička analiza promjena udjela bolesnika s pozitivnom vrijednosti tirozinaze s

porastom stupnja po Clarku u navedenoj skupini bolesnika. U skupini 141 bolesnika s

lokaliziranom bolešću (stadiji 1 i 2 po AJCC) za koje postoje podaci o stupnju po Clarku

nije se pokazao trend promjene udjela bolesnika s pozitivnom vrijednosti MITF-a sa

101

porastom stupnja po Clarku (Hi-kvadrat test za trend: χ2=0,25; stupnjevi slobode=1;

p=0,38) (Tablica 47). U skupini 141 bolesnika s lokaliziranom bolešću (stadiji 1 i 2 po

AJCC) za koje postoje podaci o stupnju po Clarku nije se pokazao ni trend promjene udjela

bolesnika s pozitivnom vrijednosti određivanja oba biljega (definiranom kao pozitivnom

ako je barem jedan biljeg (tirozinaza ili MITF) pozitivan) sa porastom stupnja po Clarku

(Hi-kvadrat test za trend: χ2=0,66; stupnjevi slobode=1; p=0,58) (Tablica 48).

Tablica 46. Distribucija bolesnika s obzirom na vrijednost tirozinaze i stupanj po Clarku u skupini

141 bolesnika s lokaliziranom bolešću (stadiji 1 i 2 po American Joint Committee on Cancer) za

koje postoje podaci o stupnju po Clarku primarnog tumora.

stupanj po Clarku pozitivni na tirozinazu /broj (%)/

negativni na tirozinazu /broj (%)/

ukupno

/broj/

1 i 2 2 (6,3%) 30 (93,7%) 32

3 4 (6,7%) 56 (93,3%) 60

4 1 (2,5%) 39 (97,5%) 40

5 2 (22,2%) 7 (77,8%) 9

ukupno 9 (6,4%) 132 (93,6%) 141

Tablica 47. Distribucija bolesnika s obzirom na vrijednost MITF-a i stupanj po Clarku u skupini

141 bolesnika s lokaliziranom bolešću (stadiji 1 i 2 po American Joint Committee on Cancer) za

koje postoje podaci o stupnju po Clarku primarnog tumora.

stupanj po Clarku pozitivni na MITF /broj (%)/

negativni na MITF /broj (%)/

ukupno

/broj/

1 i 2 1 (3,1%) 31 (96,9%) 32

3 11 (18,3%) 49 (81,7%) 60

4 6 (15,0%) 34 (85,0%) 40

5 0 (0,0%) 9 (100,0%) 9

ukupno 18 (12,8%) 123 (87,2%) 141

* nije nađen trend promjene udjela bolesnika s pozitivnom vrijednosti MITF-a sa porastom stupnja po Clarku (p=0,38)

102

Tablica 48. Distribucija bolesnika s obzirom na vrijednost oba biljega (tirozinaze i MITF-a)1 i

stupanj po Clarku u skupini 141 bolesnika s lokaliziranom bolešću (stadiji 1 i 2 po American Joint

Committee on Cancer) za koje postoje podaci o stupnju po Clarku primarnog tumora.

stupanj po Clarku pozitivni /broj (%)/ negativni /broj (%)/ ukupno

/broj/

1 i 2 3 (9,4%) 29 (90,6%) 32

3 14 (23,3%) 46 (76,7%) 60

4 7 (17,5%) 33 (82,5%) 40

5 2 (22,2%) 7 (77,8%) 9

ukupno 26 (22,6%) 115 (81,6%) 141 1 vrijednost je pozitivna ako je barem jedan biljeg (tirozinaza ili MITF) pozitivan

* nije nađen trend promjene udjela bolesnika s pozitivnom vrijednosti oba biljega sa porastom stupnja po Clarku (p=0,58)

4.12. VRIJEDNOSTI BILJEGA I METASTAZE REGIONALNIH

LIMFNIH ČVOROVA

4.12.1. PRISUTNOST METASTAZA REGIONALNIH LIMFNIH ČVOROVA

U skupinu bolesnika s metastazama regionalnih limfnih čvorova svrstani su svi

bolesnici kojima su metastaze regionalnih limfnih čvorova potvrđene bilo kada prije

uzimanja uzorka krvi za analizu. U skupini svih 201 bolesnika udio bolesnika s pozitivnom

vrijednosti tirozinaze nije se statistički značajno razlikovao između skupine bolesnika s

metastazama regionalnih limfnih čvorova i onih bez metastaza regionalnih limfnih čvorova

(Fisherov egzaktni test: p=0,15) (Tablica 49). U skupini svih 201 bolesnika ni udio

bolesnika s pozitivnom vrijednosti MITF-a se nije statistički značajno razlikovao između

skupine bolesnika s metastazama regionalnih limfnih čvorova i onih bez metastaza

regionalnih limfnih čvorova (Hi-kvadrat test: χ2 uz Yatesovu korekciju=0,61; stupnjevi

slobode=1; p=0,44; χ2 bez Yatesove korekcije=1,03; stupnjevi slobode=1; p=0,31)

(Tablica 50). Udio bolesnika s pozitivnom vrijednosti određivanja oba biljega (definiranom

kao pozitivnom ako je barem jedan biljeg (tirozinaza ili MITF) pozitivan) također se nije

statistički značajno razlikovala između skupine bolesnika s metastazama regionalnih

limfnih čvorova i onih bez metastaza regionalnih limfnih čvorova u skupini svih 201

103

bolesnika (Hi-kvadrat test: χ2 uz Yatesovu korekciju=1,96; stupnjevi slobode=1; p=0,16;

χ2 bez Yatesove korekcije=2,57; stupnjevi slobode=1; p=0,11) (Tablica 51).

Tablica 49. Distribucija bolesnika s obzirom na vrijednost tirozinaze i prisutnost metastaza

regionalnih limfnih čvorova u skupini 201 bolesnika s melanomom.

metastaze regionalnih limfnih

čvorova

pozitivni na tirozinazu /broj (%)/

negativni na tirozinazu /broj (%)/

ukupno

/broj/

prisutne 7 (16,3%) 36 (83,7%) 43

nisu prisutne 13 (8,2%) 145 (91,8%) 158

ukupno 20 (10,0%) 181 (90,0%) 201

* nije nađena statistički značajna povezanost između distribucije vrijednosti tirozinaze i prisutnosti metastaza regionalnih limfnih čvorova (p=0,15)

Tablica 50. Distribucija bolesnika s obzirom na vrijednost MITF-a i prisutnost metastaza

regionalnih limfnih čvorova u skupini 201 bolesnika s melanomom.

metastaze regionalnih limfnih

čvorova

pozitivni na MITF /broj (%)/

negativni na MITF /broj (%)/

ukupno

/broj/

prisutne 9 (20,9%) 34 (79,1%) 43

nisu prisutne 23 (14,6%) 135 (85,4%) 158

ukupno 32 (15,9%) 169 (84,1%) 201

* nije nađena statistički značajna povezanost između distribucije vrijednosti MITF-a i prisutnosti metastaza regionalnih limfnih čvorova (p=0,44)

Tablica 51. Distribucija bolesnika s obzirom na vrijednost oba biljega (tirozinaze i MITF-a)1 i

prisutnost metastaza regionalnih limfnih čvorova u skupini 201 bolesnika s melanomom.

metastaze regionalnih limfnih

čvorova pozitivni /broj (%)/ negativni /broj (%)/

ukupno

/broj/

prisutne 14 (32,6%) 29 (67,4%) 43

nisu prisutne 33 (20,9%) 125 (79,1%) 158

ukupno 47 (23,4%) 154 (76,6%) 201 1 vrijednost je pozitivna ako je barem jedan biljeg (tirozinaza ili MITF) pozitivan

* nije nađena statistički značajna povezanost između distribucije vrijednosti oba biljega i prisutnosti metastaza regionalnih limfnih čvorova (p=0,16)

104

4.12.2. LOKALIZACIJA METASTAZA REGIONALNIH LIMFNIH ČVOROVA

U tablicama koje pokazuju povezanost vrijednosti biljega i lokalizacije metastaza

regionalnih limfnih čvorova (Tablica 52, Tablica 53, Tablica 54) očekivana frekvencija je

u više od 20% ćelija bila manja od 5. Stoga sam istražio razlikuje li se distribucija

vrijednosti biljega (udio bolesnika s pozitivnom i negativnom vrijednosti biljega) između

skupina bolesnika s različitom lokalizacijom metastaza regionalnih limfnih čvorova nakon

objedinjavanja skupina s obzirom na lokalizaciju metastaza regionalnih limfnih čvorova. U

skupini 43 bolesnika s metastazama regionalnih limfnih čvorova statistički se značajno

razlikovala jedino distribucija vrijednosti određivanja oba biljega (definirane kao pozitivne

ako je barem jedan biljeg (tirozinaza ili MITF) pozitivan) između skupine bolesnika s

metastazama regionalnih limfnih čvorova u aksili i skupine s drugom lokalizacijom

metastaza regionalnih limfnih čvorova (glava, vrat, supraklavikularno i ingvinum)

(Fisherov egzaktni test: p=0,01). U tome je slučaju udio bolesnika s pozitivnom vrijednosti

određivanja oba biljega bio veći u osoba s metastazama regionalnih limfnih čvorova u

aksili.

Tablica 52. Distribucija bolesnika s obzirom na vrijednost tirozinaze i lokalizaciju metastaza

regionalnih limfnih čvorova u skupini 43 bolesnika s metastazama regionalnih limfnih čvorova.

lokalizacija metastaza

regionalnih limfnih čvorova

pozitivni na tirozinazu /broj (%)/

negativni na tirozinazu /broj (%)/

ukupno

/broj/

glava, vrat i supraklavikularno

2 (11,1%) 16 (88,9%) 18

aksila 4 (30,8%) 9 (69,2%) 13

ingvinum 1 (8,3%) 11 (91,7%) 12

ukupno 7 (16,3%) 36 (83,7%) 43

* nije nađena statistički značajna povezanost između distribucije vrijednosti tirozinaze i lokalizacije metastaza regionalnih limfnih čvorova

105

Tablica 53. Distribucija bolesnika s obzirom na vrijednost MITF-a i lokalizaciju metastaza

regionalnih limfnih čvorova u skupini 43 bolesnika s metastazama regionalnih limfnih čvorova.

lokalizacija metastaza

regionalnih limfnih čvorova

pozitivni na MITF /broj (%)/

negativni na MITF /broj (%)/

ukupno

/broj/

glava, vrat i supraklavikularno

3 (16,7%) 15 (83,3%) 18

aksila 5 (38,5%) 8 (61,5%) 13

ingvinum 1 (8,3%) 11 (91,7%) 12

ukupno 9 (20,9%) 34 (79,1%) 43

* nije nađena statistički značajna povezanost između distribucije vrijednosti MITF-a i prisutnosti metastaza regionalnih limfnih čvorova

Tablica 54. Distribucija bolesnika s obzirom na vrijednost oba biljega (tirozinaze i MITF-a)1 i

lokalizaciju metastaza regionalnih limfnih čvorova u skupini 43 bolesnika s metastazama

regionalnih limfnih čvorova.

lokalizacija metastaza

regionalnih limfnih čvorova

pozitivni /broj (%)/ negativni /broj (%)/ ukupno

/broj/

glava, vrat i supraklavikularno

4 (22,2%) 14 (77,8%) 18

aksila 8 (61,5%) 5 (38,5%) 13

ingvinum 2 (16,7%) 10 (83,3%) 12

ukupno 14 (32,6%) 29 (67,4%) 43 1 vrijednost je pozitivna ako je barem jedan biljeg (tirozinaza ili MITF) pozitivan

* pozitivna vrijednost oba biljega bila je statistički značajno učestalija u bolesnika s metastazama regionalnih limfnih čvorova u aksili nego u bolesnika s drugim lokalizacijama metastaza regionalnih limfnih čvorova (p=0,01)

4.12.3. BROJ REGIONALNIH LIMFNIH ČVOROVA ZAHVAĆENIH

METASTAZAMA

Podaci o broju regionalnih limfnih čvorova zahvaćenih metastazama postojali su za

42 od 43 bolesnika s metastazama regionalnih limfnih čvorova. U tablicama koje pokazuju

povezanost vrijednosti biljega i broja regionalnih limfnih čvorova zahvaćenih metastazama

u skupini 42 bolesnika s podacima o broju regionalnih limfnih čvorova zahvaćenih

106

metastazama (Tablica 55, Tablica 56, Tablica 57), očekivana frekvencija je u više od 20%

ćelija bila manja od 5. Stoga sam istražio razlikuje li se distribucija vrijednosti biljega

(udio bolesnika s pozitivnom i negativnom vrijednosti biljega) između skupina s različitim

brojem regionalnih limfnih čvorova zahvaćenih metastazama nakon objedinjavanja

skupina s obzirom na broj regionalnih limfnih čvorova zahvaćenih metastazama. U skupini

42 bolesnika s podacima o broju regionalnih limfnih čvorova zahvaćenih metastazama

pokazalo se da je udio bolesnika s pozitivnom vrijednosti tirozinaze statističko značajno

veći u skupini bolesnika s više od jednim regionalnim limfnim čvorom zahvaćenim

metastazama nego u skupini bolesnika s jednim regionalnim limfnim čvorom zahvaćenim

metastazama (Fisherov egzaktni test: p=0,04). U skupini 42 bolesnika s podacima o broju

regionalnih limfnih čvorova zahvaćenih metastazama distribucija vrijednosti MITF-a nije

se statistički značajno razlikovala između skupina bolesnika s različitim brojem

regionalnih limfnih čvorova zahvaćenih metastazama nakon objedinjavanja skupina s

obzirom na broj regionalnih limfnih čvorova zahvaćenih metastazama. U skupini 42

bolesnika s podacima o broju regionalnih limfnih čvorova zahvaćenih metastazama udio

bolesnika s pozitivnom vrijednosti određivanja oba biljega (definiranom kao pozitivnom

ako je barem jedan biljeg (tirozinaza ili MITF) pozitivan) pokazao se statističko značajno

većim u skupini bolesnika s više od jednim regionalnim limfnim čvorom zahvaćenim

metastazama nego u skupini bolesnika s jednim regionalnim limfnim čvorom zahvaćenim

metastazama (Hi-kvadrat test: χ2 uz Yatesovu korekciju=6,31; stupnjevi slobode=1;

p=0,01; χ2 bez Yatesove korekcije=8,07; stupnjevi slobode=1; p=0,01).

Tablica 55. Distribucija bolesnika s obzirom na vrijednost tirozinaze i broj regionalnih limfnih

čvorova zahvaćenih metastazama u skupini 42 bolesnika s podatkom o broju regionalnih limfnih

čvorova zahvaćenih metastazama.

broj rlč1 zahvaćenih

metastazama

pozitivni na tirozinazu /broj (%)/

negativni na tirozinazu /broj (%)/

ukupno

/broj/

1 1 (4,5%) 21 (95,5%) 22

2–3 4 (40,0%) 6 (60,0%) 10

>3 2 (20,0%) 8 (80,0%) 10

ukupno 7 (16,7%) 35 (83,3%) 42 1 regionalnih limfnih čvorova

* pozitivna vrijednost tirozinaze bila je statistički značajno učestalija u bolesnika s više od jednim regionalnim limfnim čvorom zahvaćenim metastazama nego u bolesnika s jednim regionalnim limfnim čvorom zahvaćenim metastazama (p=0,04)

107

Tablica 56. Distribucija bolesnika s obzirom na vrijednost MITF-a i broj regionalnih limfnih čvorova zahvaćenih metastazama u skupini 42 bolesnika s podatkom o broju regionalnih limfnih čvorova zahvaćenih metastazama.

broj rlč1 zahvaćenih

metastazama

pozitivni na MITF /broj (%)/

negativni na MITF /broj (%)/

ukupno

/broj/

1 3 (13,6%) 19 (86,4%) 22

2–3 2 (20,0%) 8 (80,0%) 10

>3 4 (40,0%) 6 (60,0%) 10

ukupno 9 (21,4%) 33 (78,6%) 42 1 regionalnih limfnih čvorova

* nije nađena statistički značajna povezanost između distribucije vrijednosti MITF-a i broja regionalnih limfnih čvorova zahvaćenih metastazama

Tablica 57. Distribucija bolesnika s obzirom na vrijednost oba biljega (tirozinaze i MITF-a)1 i broj

regionalnih limfnih čvorova zahvaćenih metastazama u skupini 42 bolesnika s podatkom o broju

regionalnih limfnih čvorova zahvaćenih metastazama.

broj rlč2 zahvaćenih

metastazama pozitivni /broj (%)/ negativni /broj (%)/

ukupno

/broj/

1 3 (13,6%) 19 (86,4%) 22

2–3 6 (60,0%) 4 (40,0%) 10

>3 5 (50,0%) 5 (50,0%) 10

ukupno 14 (33,3%) 28 (66,7%) 42 1 vrijednost je pozitivna ako je barem jedan biljeg (tirozinaza ili MITF) pozitivan; 2 regionalnih limfnih čvorova

* pozitivna vrijednost oba biljega bila je statistički značajno učestalija u bolesnika s više od jednim regionalnim limfnim čvorom zahvaćenim metastazama nego u bolesnika s jednim regionalnim limfnim čvorom zahvaćenim metastazama (p=0,01)

Budući da je broj regionalnih limfnih čvorova zahvaćenih metastazom značajan

prognostički čimbenik samo u skupini bolesnika u stadiju 3 po AJCC, posebno sam istražio

razlikuje li se distribucija vrijednosti biljega (udio bolesnika s pozitivnom i negativnom

vrijednosti biljega) između skupina bolesnika s različitim brojem regionalnih limfnih

čvorova zahvaćenih metastazama u navedenoj skupini bolesnika. U tablicama koje

108

pokazuju povezanost vrijednosti biljega i broja regionalnih limfnih čvorova zahvaćenih

metastazama u skupini 33 bolesnika u stadiju 3 po AJCC s podacima o broju regionalnih

limfnih čvorova zahvaćenih metastazama (Tablica 58, Tablica 59, Tablica 60), očekivana

frekvencija je u više od 20% ćelija bila manja od 5. Stoga sam istražio razlikuje li se

distribucija vrijednosti biljega između skupina bolesnika s različitim brojem regionalnih

limfnih čvorova zahvaćenih metastazama nakon objedinjavanja skupina s obzirom na broj

regionalnih limfnih čvorova zahvaćenih metastazama u skupini 33 bolesnika u stadiju 3 po

AJCC s podacima o broju regionalnih limfnih čvorova zahvaćenih metastazama. U

navedenoj skupini bolesnika udio bolesnika s pozitivnom vrijednosti tirozinaze pokazao se

statistički značajno većim u skupini bolesnika s više od jednim regionalnim limfnim

čvorom zahvaćenim metastazama u odnosu na skupinu bolesnika s jednim regionalnim

limfnim čvorom zahvaćenim metastazama (Fisherov egzaktni test: p=0,01). U navedenoj

skupini bolesnika udio bolesnika s pozitivnom vrijednosti MITF-a pokazao se statistički

značajno većim u skupini bolesnika s više od tri regionalna limfna čvora zahvaćena

metastazama u odnosu na skupinu bolesnika s tri ili manje od tri regionalna limfna čvora

zahvaćena metastazama (Fisherov egzaktni test: p=0,03). U navedenoj skupini bolesnika

udio bolesnika s pozitivnom vrijednosti određivanja oba biljega (definiranom kao

pozitivnom ako je barem jedan biljeg (tirozinaza ili MITF) pozitivan) pokazao se

statističko značajno većim u skupini bolesnika s više od jednim regionalnim limfnim

čvorom zahvaćenim metastazama u odnosu na skupinu bolesnika s jednim regionalnim

limfnim čvorom zahvaćenim metastazama (Fisherov egzaktni test: p=0,0015). Udio

bolesnika s pozitivnom vrijednosti određivanja oba biljega (definiranom kao pozitivnom

ako je barem jedan biljeg (tirozinaza ili MITF) pozitivan) pokazao se također statistički

značajno većim u skupini bolesnika s više od tri regionalna limfna čvora zahvaćena

metastazama u odnosu na skupinu bolesnika s tri ili manje od tri regionalna limfna čvora

zahvaćena metastazama u navedenoj skupini bolesnika (Fisherov egzaktni test: p=0,03).

109

Tablica 58. Distribucija bolesnika s obzirom na vrijednost tirozinaze i broj regionalnih limfnih

čvorova zahvaćenih metastazama u skupini 33 bolesnika u stadiju 3 po American Joint Committee

on Cancer s podacima o broju regionalnih limfnih čvorova zahvaćenih metastazama.

broj rlč1 zahvaćenih

metastazama

pozitivni na tirozinazu /broj (%)/

negativni na tirozinazu /broj (%)/

ukupno

/broj/

1 0 (0,0%) 19 (100,0%) 19

2–3 3 (37,5%) 5 (62,5%) 8

>3 2 (20,0%) 4 (80,0%) 6

ukupno 5 (15,2%) 28 (84,8%) 33 1 regionalnih limfnih čvorova

* pozitivna vrijednost tirozinaze bila je statistički značajno učestalija u bolesnika s više od jednim regionalnim limfnim čvorom zahvaćenim metastazama nego u bolesnika s jednim regionalnim limfnim čvorom zahvaćenim metastazama (p=0,01)

Tablica 59. Distribucija bolesnika s obzirom na vrijednost MITF-a i broj regionalnih limfnih

čvorova zahvaćenih metastazama u skupini 33 bolesnika u stadiju 3 po American Joint Committee

on Cancer s podacima o broju regionalnih limfnih čvorova zahvaćenih metastazama.

broj rlč1 zahvaćenih

metastazama

pozitivni na MITF /broj (%)/

negativni na MITF /broj (%)/

ukupno

/broj/

1 1 (5,3%) 18 (94,7%) 19

2–3 1 (12,5%) 7 (87,5%) 8

>3 3 (50,0%) 3 (50,0%) 6

ukupno 5 (15,2%) 28 (84,8%) 33 1 regionalnih limfnih čvorova

* pozitivna vrijednost MITF-a bila je statistički značajno učestalija u bolesnika s više od tri regionalna limfna čvora zahvaćena metastazama nego u bolesnika s tri ili manje regionalnih limfnih čvorova zahvaćenih metastazama (p=0,03)

110

Tablica 60. Distribucija bolesnika s obzirom na vrijednost oba biljega (tirozinaze i MITF-a)1 i broj

regionalnih limfnih čvorova zahvaćenih metastazama u skupini 33 bolesnika u stadiju 3 po

American Joint Committee on Cancer s podacima o broju regionalnih limfnih čvorova zahvaćenih

metastazama.

broj rlč2 zahvaćenih

metastazama pozitivni /broj (%)/ negativni /broj (%)/

ukupno

/broj/

1 1 (5,3%) 18 (94,7%) 19

2–3 4 (50,0%) 4 (50,0%) 8

>3 4 (66,7%) 2 (33,3%) 6

ukupno 9 (27,3%) 24 (72,7%) 33 1 vrijednost je pozitivna ako je barem jedan biljeg (tirozinaza ili MITF) pozitivan; 2 regionalnih limfnih čvorova

* pozitivna vrijednost oba biljega bila je statistički značajno učestalija u bolesnika s više od jednim regionalnim limfnim čvorom zahvaćenim metastazama nego u bolesnika s jednim regionalnim limfnim čvorom zahvaćenim metastazama (p=0,0015) te u bolesnika s više od tri regionalna limfna čvora zahvaćena metastazama nego u bolesnika s tri ili manje regionalnih limfnih čvorova zahvaćenih metastazama (p=0,03)

4.13. VRIJEDNOSTI BILJEGA I UDALJENE METASTAZE 4.13.1. PRISUTNOST UDALJENIH METASTAZA

U skupinu bolesnika s udaljenim metastazama svrstani su svi bolesnici kojima su

udaljene metastaze potvrđene bilo kada prije uzimanja uzorka krvi za analizu. U skupini

svih 201 bolesnika udio bolesnika s pozitivnom vrijednosti tirozinaze nije se statistički

značajno razlikovao između skupine bolesnika s udaljenim metastazama i onih bez

udaljenih metastaza (Fisherov egzaktni test: p=0,15) (Tablica 61). U skupini svih 201

bolesnika ni udio bolesnika s pozitivnom vrijednosti MITF-a nije se statistički značajno

razlikovao između skupine bolesnika s udaljenim metastazama i onih bez udaljenih

metastaza (Fisherov egzaktni test: p=0,05) (Tablica 62). U skupini svih 201 bolesnika udio

bolesnika s pozitivnom vrijednosti određivanja oba biljega (definiranom kao pozitivnom

ako je barem jedan biljeg (tirozinaza ili MITF) pozitivan) pokazao se statistički značajno

većim u skupini bolesnika s udaljenim metastazama u odnosu na bolesnike bez udaljenih

metastaza (Fisherov egzaktni test: p=0,02) (Tablica 63).

111

Tablica 61. Distribucija bolesnika s obzirom na vrijednost tirozinaze i prisutnost udaljenih

metastaza u skupini 201 bolesnika s melanomom.

udaljene metastaze pozitivni na tirozinazu /broj (%)/

negativni na tirozinazu /broj (%)/

ukupno

/broj/

prisutne 3 (21,4%) 11 (78,6%) 14

nisu prisutne 17 (9,1%) 170 (90,9%) 187

ukupno 20 (10,0%) 181 (90,0%) 201

* nije nađena statistički značajna povezanost između distribucije vrijednosti tirozinaze i prisutnosti udaljenih metastaza (p=0,15)

Tablica 62. Distribucija bolesnika s obzirom na vrijednost MITF-a i prisutnost udaljenih metastaza

u skupini 201 bolesnika s melanomom.

udaljene metastaze pozitivni na MITF /broj (%)/

negativni na MITF /broj (%)/

ukupno

/broj/

prisutne 5 (35,7%) 9 (64,3%) 14

nisu prisutne 27 (14,4%) 160 (85,6%) 187

ukupno 32 (15,9%) 169 (84,1%) 201

* nije nađena statistički značajna povezanost između distribucije vrijednosti MITF-a i prisutnosti udaljenih metastaza (p=0,05)

Tablica 63. Distribucija bolesnika s obzirom na vrijednost oba biljega (tirozinaze i MITF-a)1 i

prisutnost udaljenih metastaza u skupini 201 bolesnika s melanomom.

udaljene metastaze pozitivni /broj (%)/ negativni /broj (%)/ ukupno

/broj/

prisutne 7 (50,0%) 7 (50,0%) 14

nisu prisutne 40 (21,4%) 147 (78,6%) 187

ukupno 47 (23,4%) 154 (76,6%) 201 1 vrijednost je pozitivna ako je barem jedan biljeg (tirozinaza ili MITF) pozitivan

* pozitivna vrijednost oba biljega bila je statistički značajno učestalija u bolesnika s prisutnim udaljenim metastazama (p=0,02)

112

4.13.2. LOKALIZACIJA UDALJENIH METASTAZA

U skupini 14 bolesnika s udaljenim metastazama udio bolesnika s pozitivnom

vrijednosti tirozinaze nije se statistički značajno razlikovao između skupine bolesnika s

udaljenim metastazama na koži i u limfnim čvorovima i onih s udaljenim metastazama u

visceralnim organima (Fisherov egzaktni test: p=0,54) (Tablica 64). U skupini 14

bolesnika s udaljenim metastazama ni udio bolesnika s pozitivnom vrijednosti MITF-a nije

se statistički značajno razlikovao između skupine bolesnika s udaljenim metastazama na

koži i u limfnim čvorovima i onih s udaljenim metastazama u visceralnim organima

(Fisherov egzaktni test: p=0,30) (Tablica 65). Ni udio bolesnika s pozitivnom vrijednosti

određivanja oba biljega (definiranom kao pozitivnom ako je barem jedan biljeg (tirozinaza

ili MITF) pozitivan) također se nije statistički značajno razlikovao između skupine

bolesnika s udaljenim metastazama na koži i u limfnim čvorovima i onih s udaljenim

metastazama u visceralnim organima u skupini 14 bolesnika s udaljenim metastazama

(Fisherov egzaktni test: p=0,59) (Tablica 66).

Tablica 64. Distribucija bolesnika s obzirom na vrijednost tirozinaze i lokalizaciju udaljenih

metastaza u skupini 14 bolesnika s udaljenim metastazama.

lokalizacija udaljenih metastaza

pozitivni na tirozinazu /broj (%)/

negativni na tirozinazu /broj (%)/

ukupno

/broj/

koža i limfni čvorovi 1 (12,5%) 7 (87,5%) 8

visceralni organi 2 (33,3%) 4 (66,7%) 6

ukupno 3 (21,4%) 11 (78,6%) 14

* nije nađena statistički značajna povezanost između distribucije vrijednosti tirozinaze i lokalizacije udaljenih metastaza (p=0,54)

Tablica 65. Distribucija bolesnika s obzirom na vrijednost MITF-a i lokalizaciju udaljenih

metastaza u skupini 14 bolesnika s udaljenim metastazama.

lokalizacija udaljenih metastaza

pozitivni na MITF /broj (%)/

negativni na MITF /broj (%)/

ukupno

/broj/

koža i limfni čvorovi 4 (50,0%) 4 (50,0%) 8

visceralni organi 1 (16,7%) 5 (83,3%) 6

ukupno 5 (35,7%) 9 (64,3%) 14

* nije nađena statistički značajna povezanost između distribucije vrijednosti MITF-a i lokalizacije udaljenih metastaza (p=0,30)

113

Tablica 66. Distribucija bolesnika s obzirom na vrijednost oba biljega (tirozinaze i MITF-a)1 i

lokalizaciju udaljenih metastaza u skupini 14 bolesnika s udaljenim metastazama.

lokalizacija udaljenih metastaza

pozitivni /broj (%)/ negativni /broj (%)/ ukupno

/broj/

koža i limfni čvorovi 5 (62,5%) 3 (37,5%) 8

visceralni organi 2 (33,3%) 4 (66,7%) 6

ukupno 7 (50,0%) 7 (50,0%) 14 1 vrijednost je pozitivna ako je barem jedan biljeg (tirozinaza ili MITF) pozitivan

* nije nađena statistički značajna povezanost između distribucije vrijednosti oba biljega i lokalizacije udaljenih metastaza (p=0,59)

4.13.3. BROJ UDALJENIH METASTAZA

U skupini 14 bolesnika s udaljenim metastazama udio bolesnika s pozitivnom

vrijednosti tirozinaze pokazao se statistički značajno većim u skupini bolesnika s dvije ili

više udaljenih metastaza u odnosu na skupinu bolesnika s jednom udaljenom metastazom

(Fisherov egzaktni test: p=0,03) (Tablica 67). U skupini 14 bolesnika s udaljenim

metastazama udio bolesnika s pozitivnom vrijednosti MITF-a nije se statistički značajno

razlikovao između skupine bolesnika s jednom udaljenom metastazom i onih sa dvije ili

više udaljenih metastaza (Fisherov egzaktni test: p=1,0000) (Tablica 68). Ni udio bolesnika

s pozitivnom vrijednosti određivanja oba biljega (definiranom kao pozitivnom ako je

barem jedan biljeg (tirozinaza ili MITF) pozitivan) nije se statistički značajno razlikovao

između skupine bolesnika s jednom udaljenom metastazom i onih sa dvije ili više udaljenih

metastaza u skupini 14 bolesnika s udaljenim metastazama (Fisherov egzaktni test: p=0,46)

(Tablica 69).

Tablica 67. Distribucija bolesnika s obzirom na vrijednost tirozinaze i broj udaljenih metastaza u

skupini 14 bolesnika s udaljenim metastazama.

broj udaljenih metastaza

pozitivni na tirozinazu /broj (%)/

negativni na tirozinazu /broj (%)/

ukupno

/broj/

1 1 (8,3%) 11 (91,7%) 12

≥ 2 2 (100,0%) 0 (0,0%) 2

ukupno 3 (21,4%) 11 (78,6%) 14

* pozitivna vrijednost tirozinaze bila je statistički značajno učestalija u bolesnika s dvije ili više udaljenih metastaza nego u bolesnika s jednom udaljenom metastazom (p=0,03)

114

Tablica 68. Distribucija bolesnika s obzirom na vrijednost MITF-a i broj udaljenih metastaza u

skupini 14 bolesnika s udaljenim metastazama.

broj udaljenih metastaza

pozitivni na MITF /broj (%)/

negativni na MITF /broj (%)/

ukupno

/broj/

1 4 (33,3%) 8 (66,7%) 12

≥ 2 1 (50,0%) 1 (50,0%) 2

ukupno 5 (35,7%) 9 (64,3%) 14

* nije nađena statistički značajna povezanost između distribucije vrijednosti MITF-a i broja udaljenih metastaza (p=1,0000)

Tablica 69. Distribucija bolesnika s obzirom na vrijednost oba biljega (tirozinaze i MITF-a)1 i broj

udaljenih metastaza u skupini 14 bolesnika s udaljenim metastazama.

broj udaljenih metastaza

pozitivni /broj (%)/ negativni /broj (%)/ ukupno

/broj/

1 5 (41,7%) 7 (58,3%) 12

≥ 2 2 (100,0%) 0 (0,0%) 2

ukupno 7 (50,0%) 7 (50,0%) 14 1 vrijednost je pozitivna ako je barem jedan biljeg (tirozinaza ili MITF) pozitivan

* nije nađena statistički značajna povezanost između distribucije vrijednosti oba biljega i broja udaljenih metastaza (p=0,46)

4.14. VRIJEDNOSTI BILJEGA I LOKALNI RECIDIV

Među 12 bolesnika koliko ih je do dana uzimanja uzorka krvi za analizu razvilo

lokalni recidiv, dvoje (16,7%) ih je bilo pozitivno samo na tirozinazu, 3 (25,0%) samo na

MITF, jedan (8,3%) na tirozinazu i na MITF, a 6 (50,0%) ih je bilo negativno na oba

biljega. U skupini svih 201 bolesnika udio bolesnika s pozitivnom vrijednosti tirozinaze

nije se statistički značajno razlikovao između skupine bolesnika koji su do dana uzimanja

uzorka krvi za analizu razvili lokalni recidiv i onih koji nisu (Fisherov egzaktni test:

p=0,10). Ni udio bolesnika s pozitivnom vrijednosti MITF-a nije se statistički značajno

razlikovao između skupine bolesnika koji su do dana uzimanja uzorka krvi za analizu

razvili lokalni recidiv i onih koji nisu u skupini svih 201 bolesnika (Fisherov egzaktni test:

p=0,10). Udio bolesnika s pozitivnom vrijednost određivanja oba biljega (definiranom kao

pozitivnom ako je barem jedan biljeg (tirozinaza ili MITF) pozitivan) pokazao se statistički

115

značajno većim u skupini bolesnika koji su do dana uzimanja uzorka krvi za analizu razvili

lokalni recidiv u odnosu na one koji nisu u skupini svih 201 bolesnika (Fisherov egzaktni

test: p=0,04).

4.15. VRIJEDNOSTI BILJEGA I DRUGI PRIMARNI MELANOM,

RECIDIV METASTAZA REGIONALNIH LIMFNIH ČVOROVA TE

LIMFATIČKE METASTAZE

Među četvero bolesnika u koliko ih je do dana uzimanja uzorka krvi za analizu

dijagnosticiran drugi primarni melanom, jedan (25,0%) je bio pozitivan na tirozinazu i na

MITF, dok ih je 3 (75,0%) bilo negativno na oba biljega.

Među petero bolesnika koliko ih je do dana uzimanja uzorka krvi za analizu razvilo

recidiv metastaza regionalnih limfnih čvorova, jedan (20,0%) je bio pozitivan samo na

MITF, jedan (20,0%) na tirozinazu i na MITF, a 3 (60,0%) ih je bilo negativno na oba

biljega.

Među petero bolesnika koliko ih je imalo limfatičke metastaze (satelitske metastaze)

dijagnosticirane do dana uzimanja uzorka krvi za analizu, dvoje (40,0%) ih je bilo

pozitivnih samo na MITF, dok ih je 3 (60,0%) bilo negativno na oba biljega.

4.16. VRIJEDNOSTI BILJEGA I TERAPIJA 4.16.1. SISTEMSKA TERAPIJA

U skupinu bolesnika koji su primali sistemsku terapiju svrstani su svi bolesnici koji

su primali kemoterapiju i/ili imunoterapiju bilo kada prije uzimanja uzorka krvi za analizu.

U skupini svih 201 bolesnika udio bolesnika s pozitivnom vrijednosti tirozinaze nije se

statistički značajno razlikovao između skupine bolesnika koji su primali sistemsku terapiju

i onih koji nisu (Fisherov egzaktni test: p=1,0000) (Tablica 70). U skupini svih 201

bolesnika ni udio bolesnika s pozitivnom vrijednosti MITF-a nije se statistički značajno

razlikovao između skupine bolesnika koji su primali sistemsku terapiju i onih koji nisu

(Hi-kvadrat test: χ2 uz Yatesovu korekciju=0,01; stupnjevi slobode=1; p=0,91) (Tablica

71). Ni udio bolesnika s pozitivnom vrijednosti određivanja oba biljega (definiranom kao

pozitivnom ako je barem jedan biljeg (tirozinaza ili MITF) pozitivan) također se nije

116

statistički značajno razlikovao između skupine bolesnika koji su primali sistemsku terapiju

i onih koji nisu u skupini svih 201 bolesnika (Hi-kvadrat test: χ2 uz Yatesovu

korekciju=0,159; stupnjevi slobode=1; p=0,69) (Tablica 72).

Tablica 70. Distribucija bolesnika s obzirom na vrijednost tirozinaze i sistemsku terapiju u skupini

201 bolesnika s melanomom.

pozitivni na tirozinazu /broj (%)/

negativni na tirozinazu /broj (%)/

ukupno

/broj/

primali sistemsku terapiju1 3 (8,3%) 33 (91,7%) 36

nisu primali sistemsku terapiju 17 (10,3%) 148 (89,7%) 165

ukupno 20 (10,0%) 181 (90,0%) 201 1kemoterapiju i/ili imunoterapiju bilo kada prije uzimanja uzorka krvi za analizu

* nije nađena statistički značajna povezanost između distribucije vrijednosti tirozinaze i primanja prethodne sistemske terapije (p=1,0000)

Tablica 71. Distribucija bolesnika s obzirom na vrijednost MITF-a i sistemsku terapiju u skupini

201 bolesnika s melanomom.

pozitivni na MITF /broj (%)/

negativni na MITF /broj (%)/

ukupno /broj/

primali sistemsku terapiju1 6 (16,7%) 30 (83,3%) 36

nisu primali sistemsku terapiju 26 (15,8%) 139 (84,2%) 165

ukupno 32 (15,9%) 169 (84,1%) 201 1kemoterapiju i/ili imunoterapiju bilo kada prije uzimanja uzorka krvi za analizu

* nije nađena statistički značajna povezanost između distribucije vrijednosti MITF-a i primanja prethodne sistemske terapije (p=0,91)

117

Tablica 72. Distribucija bolesnika s obzirom na vrijednost oba biljega (tirozinaze i MITF-a)1 i

sistemsku terapiju u skupini 201 bolesnika s melanomom.

pozitivni /broj (%)/ negativni /broj (%)/ ukupno /broj/

primali sistemsku terapiju2 8 (22,2%) 28 (77,8%) 36

nisu primali sistemsku terapiju 40 (24,2%) 125 (75,8%) 165

ukupno 48 (23,9%) 153 (76,1%) 201 1 vrijednost je pozitivna ako je barem jedan biljeg (tirozinaza ili MITF) pozitivan; 2kemoterapiju i/ili imunoterapiju bilo kada prije uzimanja uzorka krvi za analizu

* nije nađena statistički značajna povezanost između distribucije vrijednosti oba biljega i primanja prethodne sistemske terapije (p=0,69)

4.16.2. OPERACIJA

Vrijeme proteklo od prve operacije računalo se kao vrijeme proteklo od prve

operacije melanoma (operacije primarnog melanoma, odnosno operacije metastaza u

bolesnika s nepoznatim primarnim melanomom) do uzimanja uzorka krvi za analizu. U

skupini svih 201 bolesnika nije bilo statistički značajne razlike u vremenu proteklom od

prve operacije između skupine bolesnika s pozitivnom vrijednošću tirozinaze i onih s

negativnom vrijednošću tirozinaze (Mann Whitney U test: z=0,31; p=0,75) (Tablica 73,

Slika 26). U skupini svih 201 bolesnika nije bilo statistički značajne razlike u vremenu

proteklom od prve operacije ni između skupine bolesnika s pozitivnom vrijednošću MITF-

-a i onih s negativnom vrijednošću MITF-a (Mann Whitney U test: z=–0,46; p=0,65)

(Tablica 73, Slika 27). U skupini svih 201 bolesnika također nije bilo statistički značajne

razlike u vremenu proteklom od prve operacije ni između skupine bolesnika s pozitivnom i

onih s negativnom vrijednošću određivanja oba biljega (definiranom kao pozitivnom ako je

barem jedan biljeg (tirozinaza ili MITF) pozitivan) (Mann Whitney U test: z=0,37; p=0,71)

(Tablica 73, Slika 28).

118

Tablica 73. Parametri distribucije vremena proteklog od prve operacije melanoma u različitim

skupinama bolesnika s obzirom na vrijednost biljega (tirozinaze i MITF-a) u skupini 201 bolesnika

s melanomom.

PARAMETRI DISTRIBUCIJE VREMENA PROTEKLOG OD PRVE OPERACIJE

(MJESECI) VRIJEDNOST BILJEGA (BROJ BOLESNIKA)

srednja vrijednost

standardna devijacija

medijan raspon

pozitivni na tirozinazu (20) 26,6 43,2 12,1 –1,0-187,6

negativni na tirozinazu (181) 26,6 34,6 16,6 –0,5-225,2

pozitivni na MITF (32) 27,4 31,6 16,3 0,3-134,0

negativni na MITF (169) 26,5 30,2 16,1 –1,0-225,2

pozitivni na oba biljega1 (48)

22,7 27,7 13,8 –1,0-134,0

negativni na oba biljega2 (153) 27,8 37,4 16,8 –0,5-225,2

1 vrijednost je pozitivna ako je barem jedan biljeg (tirozinaza ili MITF) pozitivan; 2 vrijednost je negativna ako su oba biljega (tirozinaza i MITF) negativni

RASPON

25. - 75. CENTIL

MEDIJAN

VRIJEDNOST TIROZINAZE

VR

IJE

ME

PR

OT

EK

LO

OD

PR

VE

OP

ER

AC

IJE

(m

jese

ci)

-20

20

60

100

140

180

220

260

NEGATIVNA POZITIVNA

p=0,754 (Mann Whitney U test)

Slika 26. Distribucije vremena proteklog od prve operacije melanoma u različitim skupinama

bolesnika s obzirom na vrijednost tirozinaze u skupini 201 bolesnika s melanomom.

119

RASPON

25. - 75. CENTIL

MEDIJAN

VRIJEDNOST MITF-a

VR

IJE

ME

PR

OT

EK

LO

OD

PR

VE

OP

ER

AC

IJE

(m

jese

ci)

-20

20

60

100

140

180

220

260

NEGATIVNA POZITIVNA

p=0,647 (Mann Whitney U test)

Slika 27. Distribucije vremena proteklog od prve operacije melanoma u različitim skupinama

bolesnika s obzirom na vrijednost MITF-a u skupini 201 bolesnika s melanomom.

RASPON

25. - 75. CENTIL

MEDIJAN

VRIJEDNOST BILJEGA

VR

IJE

ME

PR

OT

EK

LO

OD

PR

VE

OP

ER

AC

IJE

(m

jese

ci)

-20

20

60

100

140

180

220

260

NEGATIVNA POZITIVNA

p=0,710 (Mann Whitney U test)

Slika 28. Distribucije vremena proteklog od prve operacije melanoma u različitim skupinama

bolesnika s obzirom na vrijednost oba biljega (tirozinaze i MITF-a) u skupini 201 bolesnika s

melanomom. Vrijednost je definirana kao pozitivna ako je barem jedan biljeg (tirozinaza ili MITF)

pozitivan, a negativna ako su oba biljega negativna.

120

Vrijeme proteklo od posljednje operacije računalo se kao vrijeme proteklo od

posljednje operacije melanoma (primarnog melanoma, metastaza ili recidiva) prije

uzimanja uzorka krvi za analizu do uzimanja uzorka krvi za analizu. U skupini svih 201

bolesnika nije bilo statistički značajne razlike u vremenu proteklom od posljednje operacije

između skupine bolesnika s pozitivnom vrijednošću tirozinaze i onih s negativnom

vrijednošću tirozinaze (Mann Whitney U test: z=1,29; p=0,20) (Tablica 74, Slika 29). U

skupini svih 201 bolesnika nije bilo statistički značajne razlike u vremenu proteklom od

posljednje operacije ni između skupine bolesnika s pozitivnom vrijednošću MITF-a i onih

s negativnom vrijednošću MITF-a (Mann Whitney U test: z=0,10; p=0,92) (Tablica 74,

Slika 30). U skupini svih 201 bolesnika također nije bilo statistički značajne razlike u

vremenu proteklom od posljednje operacije ni između skupine bolesnika s pozitivnom i

onih s negativnom vrijednošću određivanja oba biljega (definiranom kao pozitivnom ako je

barem jedan biljeg (tirozinaza ili MITF) pozitivan) (Mann Whitney U test: z=1,30; p=0,19)

(Tablica 74, Slika 31).

Tablica 74. Parametri distribucije vremena proteklog od posljednje operacije melanoma u

različitim skupinama bolesnika s obzirom na vrijednost biljega (tirozinaze i MITF-a) u skupini 201

bolesnika s melanomom.

PARAMETRI DISTRIBUCIJE VREMENA PROTEKLOG OD POSLJEDNJE

OPERACIJE (MJESECI) VRIJEDNOST BILJEGA (BROJ BOLESNIKA)

srednja vrijednost

standardna devijacija

medijan raspon

pozitivni na tirozinazu (20) 21,1 43,9 6,2 –0,7-187,6

negativni na tirozinazu (181) 24,3 35,4 12,9 –0,5-225,0

pozitivni na MITF (32) 21,2 29,9 10,0 –0,3-134,0

negativni na MITF (169) 24,5 37,3 12,3 –0,7-225,0

pozitivni na oba biljega1 (48)

17,1 26,0 8,9 –0,7-134,0

negativni na oba biljega2 (153) 26,1 38,6 13,2 –0,5-225,0

1 vrijednost je pozitivna ako je barem jedan biljeg (tirozinaza ili MITF) pozitivan; 2 vrijednost je negativna ako su oba biljega (tirozinaza i MITF) negativni

121

RASPON

25. - 75. CENTIL

MEDIJAN

VRIJEDNOST TIROZINAZE

VR

IJE

ME

PR

OT

EK

LO

OD

PO

SL

JED

NJE

O

PE

RA

CIJ

E (

mje

seci

)

-20

20

60

100

140

180

220

260

NEGATIVNA POZITIVNA

p=0,197 (Mann Whitney U test)

Slika 29. Distribucije vremena proteklog od posljednje operacije melanoma u različitim skupinama

bolesnika s obzirom na vrijednost tirozinaze u skupini 201 bolesnika s melanomom.

RASPON

25. - 75. CENTIL

MEDIJAN

VRIJEDNOST MITF-a

VR

IJE

ME

PR

OT

EK

LO

OD

PO

SL

JED

NJE

O

PE

RA

CIJ

E (

mje

seci

)

-20

20

60

100

140

180

220

260

NEGATIVNA POZITIVNA

p=0,918 (Mann Whitney U test)

Slika 30. Distribucije vremena proteklog od posljednje operacije melanoma u različitim skupinama

bolesnika s obzirom na vrijednost MITF-a u skupini 201 bolesnika s melanomom.

122

RASPON

25. - 75. CENTIL

MEDIJAN

VRIJEDNOST BILJEGA

VR

IJE

ME

PR

OT

EK

LO

OD

PO

SL

JED

NJE

O

PE

RA

CIJ

E (

mje

seci

)

-20

20

60

100

140

180

220

260

NEGATIVNA POZITIVNA

p=0,194 (Mann Whitney U test)

Slika 31. Distribucije vremena proteklog od posljednje operacije melanoma u različitim skupinama

bolesnika s obzirom na vrijednost oba biljega (tirozinaze i MITF-a) u skupini 201 bolesnika s

melanomom. Vrijednost je definirana kao pozitivna ako je barem jedan biljeg (tirozinaza ili MITF)

pozitivan, a negativna ako su oba biljega negativna.

123

5. RASPRAVA

124

U ovom istraživanju je po prvi put istražen MITF kao biljeg za otkrivanje

cirkulirajućih melanomskih stanica metodom RT-PCR. MITF je analiziran kao dodatni

biljeg uz tirozinazu, najčešće primjenjivani biljeg za otkrivanje cirkulirajućih melanomskih

stanica metodom RT-PCR.

Ni vrijednost tirozinaze niti vrijednost MITF-a nisu bile pozitivne niti u jednom od

uzoraka krvi 40 zdravih dobrovoljaca. Ovi rezultati su u skladu s rezultatima prethodnih

istraživanja, koja su sva pokazala vrlo visoku specifičnost tirozinaze kao biljega za

otkrivanje cirkulirajućih melanomskih stanica metodom RT-PCR (Brownbridge i sur.,

2001; Hoon i sur., 1995; Brossart i sur., 1993; Jung i sur., 1997; Glaeser i sur., 1997;

Szenajch i sur., 1998; Farthmann i sur., 1998; Smith i sur., 1991; Mellado i sur., 2002;

Tsao i sur., 2001; Gogas i sur., 2002; Reinhold i sur., 1997; Curry i sur., 1998; Schittek i

sur., 1999a; Kulik i sur., 2001; Schrader i sur., 2000; Mellado i sur., 1999; Curry i sur.,

2001; Proebstle i sur., 2000; Mellado i sur., 1996; Battayani i sur., 1995; Kunter i sur.,

1996; Queraux i sur., 2001). Vrijednost tirozinaze je bila pozitivna samo u dvije od 512

negativnih kontrola (zdravih dobrovoljaca ili bolesnika s drugim tumorima koji nisu imali

melanom) u 23 različita istraživanja obrađena u metaanalizi koju su proveli Tsao i

suradnici (Tsao i sur., 2001).

Specifičnost MITF-a kao biljega za otkrivanje cirkulirajućih melanomskih stanica

nije istraživana u drugim istraživanjima. Od drugih molekula koje su uz tirozinazu

istraživane kao biljezi za otkrivanje cirkulirajućih melanomskih stanica metodom RT-PCR

visoku specifičnost su pokazale MIA, Melan-A/MART-1, MAGE-3 i TRP-2, dok su za

MUC18, p97 i gp100 dobivene pozitivne vrijednosti i u zdravih dobrovoljaca (Mühlbauer i

sur. 1999; Hoon i sur., 1995; Kulik i sur., 2001; Curry i sur., 1998; Schmidt i sur., 2002;

Schrader i sur., 2000; Brownbridge i sur., 2001; Schittek i sur., 1999b).

Prag detekcije oba biljega (tirozinaze i MITF-a) bio je dovoljno nizak da omogući

otkrivanje najmanje 50 melanomskih stanica u 10 mL periferne krvi, odnosno jedne

melanomske stanice među 0,82 x 106 leukocita periferne krvi. U većini drugih istraživanja

prag detekcije tirozinaze bio je dovoljno nizak da omogući otkrivanje od 1 do 10

melanomskih stanica u 10 mL periferne krvi (Brownbridge i sur., 2001; Hoon i sur., 1995;

Brossart i sur., 1993; Jung i sur., 1997; Glaeser i sur., 1997; Szenajch i sur., 1998;

Farthmann i sur., 1998; Smith i sur., 1991; Mellado i sur., 2002; Tsao i sur., 2001; Gogas i

sur., 2002; Reinhold i sur., 1997; Curry i sur., 1998; Schittek i sur., 1999b; Kulik i sur.,

2001; Schrader i sur., 2000; Mellado i sur., 1999; Curry i sur., 2001; Proebstle i sur., 2000;

Mellado i sur., 1996; Battayani i sur., 1995; Kunter i sur., 1996; Queraux i sur., 2001).

125

Prag detekcije MITF-a kao biljega za otkrivanje cirkulirajućih melanomskih stanica

nije istraživan u drugim istraživanjima. Prag detekcije biljega Melan-A/MART-1 bio je,

kao i u slučaju tirozinaze, u većini istraživanja dovoljno nizak da omogući otkrivanje od 1

do 10 melanomskih stanica u 10 mL periferne krvi (Kulik i sur., 2001; Curry i sur., 1998;

Schittek i sur., 1999b). Mühlbauer i suradnici su određivanjem biljega MIA uspjeli otkriti

najmanje 10 melanomskih stanica u 1 mL periferne krvi (Mühlbauer i sur., 1999). Schrader

i suradnici su otkrili najmanje 1 melanomsku stanicu među 105 leukocita periferne krvi

određivanjem biljega Melan-A/MART-1, MAGE-3, odnosno TRP-2, dok su određivanjem

tirozinaze otkrili najmanje 1 melanomsku stanicu među 106 leukocita periferne krvi

(Schrader i sur., 2000).

Nešto viši prag detekcije u ovom istraživanju može biti posljedica stanične linije

koju sam koristio pri njegovom određivanju. Pokazano je da različite linije melanomskih

stanica imaju različite razine ekspresije pojedinih melanomskih antigena uključujući i

tirozinazu (Kulik i sur., 2001; Glaeser i sur., 1997). Kulik i suradnici su ispitali 13

različitih linija melanomskih stanica i pokazali da ih među njima samo 9 eksprimira gen za

tirozinazu, 6 za MUC-1, 3 za p97, 3 za MAGE-3 i 9 za MART-1 (Kulik i sur., 2001).

Glaeser i suradnici su odredili prag detekcije tirozinaze koristeći 5 različitih linija

melanomskih stanica (Glaeser i sur., 1997). Sa staničnim linijama Sk-Mel-23 i Sk-Mel-28

uspjeli su otkriti najmanje jednu, sa staničnom linijom Sk-Mel-25 najmanje 103, a sa

staničnom linijom WM-1314 najmanje 104 melanomskih stanica u 10 mL periferne krvi.

Pokazano je da prag detekcije cirkulirajućih melanomskih stanica značajno ovisi i o

metodi obrade uzoraka krvi. U ovom sam istraživanju primijenio izdvajanje

mononuklearnih stanica metodom razdvajanja u gradijentu fikola gustoće 1,077 g/mL, zato

jer je u ranijim istraživanjima pokazano da takav postupak omogućuje postizanje nižeg

praga detekcije cirkulirajućih melanomskih stanica nego druge metode obrade uzoraka krvi

(Schittek i sur., 1999b; Jung i sur., 1997). Schittek i suradnici su usporedili četiri različite

metode obrade uzoraka krvi koje su primjenjivane u ranijim istraživanjima otkrivanja

cirkulirajućih melanomskih stanica metodom RT-PCR (Schittek i sur., 1999b). Nakon

izravne izolacije RNA iz pune krvi uspjeli su otkriti najmanje 300 melanomskih stanica

dodanih u krv. Kada su izolirali RNA iz krvi nakon lize eritrocita otkrili su najmanje 50

melanomskih stanica dodanih u krv, ali samo u jednom od 5 obrađenih uzoraka krvi.

Najniži prag detekcije postigli su izolacijom RNA iz mononuklearnih stanice izdvojenih

metodom razdvajanja u gradijentu fikola gustoće 1,077 g/mL. Tom metodom su u 60%

obrađenih uzoraka otkrili najmanje dvije melanomske stanice dodane u krv, dok su u svim

126

obrađenim uzorcima krvi uspjeli otkriti 40 melanomskih stanica dodanih u krv. Izolacijom

RNA iz mononuklearnih stanice izoliranih metodom razdvajanja u gradijentu fikola

gustoće 1,090 g/mL postigli su viši prag detekcije nego kada su koristili fikol gustoće

1,077 g/mL. Jung i suradnici su također pokazali da se izdvajanjem mononuklearnih

stanica u gradijentu fikola prije izolacije RNA postiže niži prag detekcije melanomskih

stanica nego izolacijom RNA iz pune krvi (Jung i sur., 1997).

Produkte umnažanja PCR-om analizirao sam elektroforezom u 2%-tnom gelu

agaroze obojanom etidij-bromidom i izravnim promatranjem gela pri UV-svjetlu. Jednak

postupak je korišten i u većini drugih istraživanja (Schittek i sur., 1999a; Schittek i sur.,

1999b; Queraux i sur., 2001; Mellado i sur., 2002; Farthmann i sur., 1998; Gogas i sur.,

2002; Mellado i sur., 1996; Proebstle i sur., 2000; Kulik i sur., 2001; Jung i sur., 1997;

Glaeser i sur., 1997; Smith i sur., 1991; Curry i sur., 1998). U manjem broju istraživanja

korišten je osjetljiviji postupak hibridizacije po Southernu nakon elektroforeze u gelu

agaroze (Brownbridge i sur., 2001; Reinhold i sur., 1997; Battayani i sur., 1995; Hoon i

sur., 1995; Mühlbauer i sur. 1999). Međutim, rezultati istraživanja u kojima je

primjenjivana hibridizacija po Southernu i onih u kojima je primjenjivano bojanje etidij-

bromidom nisu se značajno razlikovali s obzirom na prag detekcije i postotak pozitivnih

uzoraka.

U ovom istraživanju vrijednost tirozinaze je bila pozitivna u 4 od 77 (5,2%)

bolesnika u stadiju 1, 5 od 66 (7,6%) bolesnika u stadiju 2, 5 od 36 (13,9%) bolesnika u

stadiju 3 te u 3 od 14 (21,4%) bolesnika u stadiju 4 po AJCC. U većini drugih istraživanja

udio bolesnika s pozitivnom vrijednosti tirozinaze bio je veći. Tsao i suradnici su u

metaanalizi obradili 23 različita istraživanja na ukupno 1799 bolesnika s melanomom i

dobili sljedeće prosječne vrijednosti postotka bolesnika s pozitivnom vrijednosti tirozinaze:

18% (95%-tni interval pouzdanosti: 3-22%) za bolesnike u stadiju 1, 28% (95%-tni

interval pouzdanosti: 23-34%) za bolesnike u stadiju 2, 30% (95%-tni interval pouzdanosti:

26-34%) za bolesnike u stadiju 3, te 45% (95%-tni interval pouzdanosti: 41-50%) za

bolesnike u stadiju 4 po AJCC (Tsao i sur., 2001). Međutim, objavljeni su i rezultati

istraživanja u kojima je udio bolesnika s pozitivnom vrijednosti tirozinaze bio sličan

onome dobivenom u ovom istraživanju. Tako u istraživanju Tessiera i suradnika niti jedan

od 42 (0%) bolesnika u stadiju 1 nije imao pozitivnu vrijednost tirozinaze (Tessier i sur.,

1997). U istraživanju Reinholda i suradnika niti jedan od 26 (0%) bolesnika u stadijima 1 i

2 te niti jedan od 16 (0%) bolesnika u stadiju 3 nisu imali pozitivnu vrijednost tirozinaze

127

(Reinhold i sur., 1997). U istraživanju Glaeser i suradnika pozitivnu vrijednost tirozinaze

je imao jedan od 43 (2,3%) bolesnika u stadijima 1 i 2, niti jedan od 15 (0%) bolesnika u

stadiju 3 te 12 od 44 (27,3%) bolesnika u stadiju 4 (Glaeser i sur., 1997). U skupini

bolesnika u stadiju 3 pozitivnu vrijednost tirozinaze je imalo dvoje od 13 (15%) bolesnika

u istraživanju koje su proveli Mellado i suradnici te 7 od 41 (17%) bolesnika u istraživanju

koje su proveli Farthmann i suradnici (Mellado i sur., 1999; Farthmann i sur., 1998). U

skupini bolesnika u stadiju 4 pozitivnu vrijednost tirozinaze je imalo 13 od 50 (26%)

bolesnika u istraživanju koje su proveli Jung i suradnici te 13 od 80 (16,3%) bolesnika u

istraživanju koje su proveli Schrader i suradnici (Schrader i sur., 2000; Jung i sur., 1997). S

obzirom da se u svim navedenim istraživanjima prag detekcije, specifičnost i

eksperimentalni postupak nisu značajno razlikovali od istih u istraživanjima u kojima je

udio bolesnika s pozitivnom vrijednošću tirozinaze bio veći, pretpostavljamo da je nešto

niža vrijednost udjela bolesnika s pozitivnom vrijednosti tirozinaze u ovom istraživanju

posljedica populacije ispitanih bolesnika, a ne samog postupka.

U kontekstu kliničke primjene posebno su zanimljivi rezultati koji se odnose na

vrijednosti tirozinaze u bolesnika s klinički potvrđenim udaljenim metastazama. U ovom

istraživanju, kao i u većini drugih istraživanja, vrijednost tirozinaze je bila negativna u

značajnom udjelu bolesnika s klinički potvrđenim udaljenim metastazama (stadij 4), što

umanjuje kliničku vrijednost ovog postupka (Tsao i sur., 2001; Jung i sur., 1997; Glaeser i

sur., 1997; Brownbridge i sur., 2001; Farthmann i sur., 1998; Mellado i sur., 1999;

Proebstle i sur., 2000; Mellado i sur., 1996; Battayani i sur., 1995; Kunter i sur., 1996;

Quereux i sur., 2001; Smith i sur., 1991; Schittek i sur., 1999a; Schrader i sur., 2000; Kulik

i sur., 2001; Reinhold i sur., 1997; Mellado i sur., 2002; Reynolds i sur., 2003).

U literaturi su ponuđena tri moguća objašnjenja ovih rezultata koja se međusobno

ne isključuju. Szenajch i suradnici su pokazali da se vjerojatnost pozitivnog nalaza

tirozinaze u perifernoj krvi bolesnika s melanomom povećava razmjerno s brojem

analiziranih uzoraka krvi pojedinog bolesnika, na osnovu čega su pretpostavili da su

melanomske stanice prisutne u cirkulaciji gotovo svih melanomskih bolesnika, ali je njihov

broj manji od praga detekcije metode (Szenajch i sur., 2002). Temeljem toga Szenajch i

suradnici su pretpostavili da bi se klinička vrijednost određivanja cirkulirajućih

melanomskih stanica povećala kada bi se analizirao veći volumen krvi (otprilike 50 mL, za

razliku od uobičajenih 5 – 10 mL) ili kada bi se istom bolesniku u više navrata uzeo veći

broj uzoraka krvi za analizu, što je oboje teško izvodivo u rutinskoj kliničkoj praksi

(Szenajch i sur., 2002).

128

Reinhold i suradnici su pokazali da su među uzorcima krvi istog melanomskog

bolesnika uzimanima u vremenskim razmacima po 2 sata neki bili pozitivni, a neki

negativni na tirozinazu (Reinhold i sur., 1997). Kako bi objasnili dobivene rezultate

ponudili su objašnjenje negativnog nalaza tirozinaze u perifernoj krvi bolesnika s

udaljenim metastazama temeljeno na modelu metastatskog procesa po kojem se tumorske

stanice otpuštaju u cirkulaciju nasumično i diskontinuirano (Reinhold i sur., 1997).

Sukladno ovom objašnjenju, klinička vrijednost određivanja cirkulirajućih melanomskih

stanica povećala bi se kada bi se analiziralo više uzoraka krvi uzetih istom bolesniku u

različito vrijeme, što je tehnički teško izvedivo, budući da se uzorci krvi najčešće uzimaju

bolesnicima za vrijeme rutinskih kontrolnih pregleda.

Moguće je i da je negativan nalaz tirozinaze u perifernoj krvi bolesnika s udaljenim

metastazama rezultat gubitka ili značajnog smanjenja ekspresiju gena za tirozinazu u dijelu

melanomskih stanica tijekom tumorske progresije uslijed dediferencijacije (Schittek i sur.,

1999a; Kulik i sur., 2001). Chen i suradnici su pronašli različitu razinu ekspresije

tirozinaze u različitim tkivnim uzorcima melanoma, među kojima manji dio nije uopće

eksprimirao tirozinazu (Chen i sur., 1995). U tom bi se slučaju klinička vrijednost

određivanja cirkulirajućih melanomskih stanica mogla povećati uvođenjem dodatnih

biljega uz tirozinazu.

U ovom istraživanju je kao dodatni biljeg uz tirozinazu istražen MITF. MITF je u

dosadašnjim istraživanjima pokazao visoku specifičnost i osjetljivost kao biljeg za

imunohistokemijsku dijagnostiku melanoma, ali dosad, po mojim saznanjima, nije

istraživan kao biljeg za otkrivanje cirkulirajućih melanomskih stanica metodom RT-PCR

(King i sur. 1999; Miettinen i sur. 2001; Granter i sur. 2002; O'Reilly i sur; 2001; Salti i

sur., 2000). RT-PCR analiza je pokazala visoku razinu ekspresije MITF-a u većini

staničnih linija melanoma i zdravih melanocita, dok u drugim (nemelanomskim i

nemelanocitnim) tumorskim i zdravim staničnim linijama nije nađena ekspresija MITF-a

(Vachtenheim i sur., 1999; Selzer i sur., 2002).

Na osnovu tih rezultata pretpostavio sam da bi MITF mogao poslužiti i kao biljeg za

otkrivanje cirkulirajućih melanomskih stanica metodom RT-PCR.

U ovom istraživanju vrijednost MITF-a bila je pozitivna u 8 od 77 (10,4%) bolesnika

u stadiju 1, 11 od 66 (16,7%) bolesnika u stadiju 2, 6 od 36 (16,7%) bolesnika u stadiju 3

te u 5 od 14 (35,7%) bolesnika u stadiju 4 po AJCC. Od ukupno 201 bolesnika 32 (15,9%)

ih je imalo pozitivnu vrijednost MITF-a, 20 (10,0%) pozitivnu vrijednost tirozinaze, a

129

samo 4 (1,9%) pozitivnu vrijednost oba biljega. Povezanost distribucije vrijednosti

tirozinaze i vrijednosti MITF-a nije se pokazala statistički značajnom. Curry i suradnici su

u skupini 123 melanomskih bolesnika pokazali da nema statistički značajne povezanosti

između vrijednosti tirozinaze i vrijednosti biljega Melan-A/MART-1 (Curry i sur., 1998).

Ovi rezultati su u skladu s hipotezama da dio melanomskih stanica tijekom tumorske

progresije može izgubiti ili smanjiti ekspresiju gena za tirozinazu te da su cirkulirajuće

melanomske stanice heterogene s obzirom na razinu ekspresije pojedinih melanomskih

biljega.

Analiza MITF-a, kao dodatnog biljega uz tirozinazu, omogućila je otkrivanje

cirkulirajućih melanomskih stanica u većeg broja bolesnika s melanomom u odnosu na

analizu samo tirozinaze. Od ukupno 201 bolesnika njih 48 (23,9%) je imalo pozitivnu

vrijednost barem jednog biljega (tirozinaze ili MITF-a) dok ih je samo 20 (10,0%) imalo

pozitivnu vrijednost tirozinaze.

Većina drugih istraživanja je također potvrdila vrijednost određivanja dodatnih biljega

uz tirozinazu. Kulik i suradnici su pokazali u skupini 80 melanomskih bolesnika da

određivanje biljega Melan-A/MART-1 uz tirozinazu omogućuje otkrivanje cirkulirajućih

melanomskih stanica u 10% više bolesnika nego određivanje samo tirozinaze (Kulik i sur.,

2001). U istraživanju Schittek i suradnika na 225 melanomskih bolesnika njih 72 (32,0%)

je imalo pozitivnu vrijednost tirozinaze ili Melan-A/MART-1, dok ih je 50 (22,2%) imalo

pozitivnu vrijednost tirozinaze, što znači da je određivanje biljega Melan-A/MART-1 uz

tirozinazu povećalo osjetljivost otkrivanja cirkulirajućih melanomskih stanica za 30%

(Schittek i sur., 1999a). Reynolds i suradnici su određivali četiri biljega (tirozinazu, gp100,

MAGE-3 i Melan-A/MART-1) u skupini 118 melanomskih bolesnika i pokazali su da je

10 – 21% (ovisno o biljegu) bolesnika pozitivno kada se gleda samo jedan biljeg, dok ih je

47% pozitivno kada se gledaju sva četiri biljega (Reynolds i sur., 2003). I druga su

istraživanja pokazala da određivanje dodatnih biljega uz tirozinazu omogućuje otkrivanje

cirkulirajućih melanomskih stanica u većeg broja bolesnika s melanomom u odnosu na

analizu samo tirozinaze (Schrader i sur., 2000; Curry i sur., 1998). Hoon i suradnici su

pokazali da je određivanje četiri biljega (tirozinaze, p97, MUC18 i MAGE-3) statistički

značajno bolje nego određivanje samo tirozinaze (Hoon i sur., 1995). Također su pokazali

da je broj pozitivnih biljega statistički značajno povezan sa stadijem bolesti te je neovisan

prognostički čimbenik za predviđanje recidiva bolesti (Hoon i sur., 1995; Hoon i sur.,

2000). Za razliku od svih navedenih istraživanja, Brownbridge i suradnici su pokazali u

skupini 211 melanomskih bolesnika da dodatno određivanje biljega Melan-A/MART-1 ne

130

omogućuje otkrivanje cirkulirajućih melanomskih stanica u većeg broja bolesnika s

melanomom u odnosu na analizu samo tirozinaze (Brownbridge i sur., 2001). U njihovom

istraživanju, svi bolesnici koji su imali pozitivnu vrijednost biljega Melan-A/MART-1

imali su ujedno i pozitivnu vrijednost tirozinaze (Brownbridge i sur., 2001).

Ovo istraživanje nije uključivalo praćenje ispitanika tako da nije bilo moguće

odrediti stvarnu prognostičku vrijednost ispitivanih biljega u smislu povezanosti s

preživljenjem i razdobljem bez znakova bolesti. Međutim, pokazalo se da postoji trend

povećanja udjela bolesnika s pozitivnom vrijednošću biljega (i tirozinaze i MITF-a) sa

porastom stadija bolesti po AJCC. Kako stadij bolesti po AJCC predstavlja objektivnu

prognostičku kategoriju, ovi rezultati upućuju na moguću prognostičku vrijednost oba

biljega (tirozinaze i MITF-a) (Balch i sur., 2001b).

U drugim istraživanjima također je uočen veći udio bolesnika s pozitivnom

vrijednosti tirozinaze u višem stadiju bolesti po AJCC (Proebstle i sur., 2000; Mellado i

sur., 1996; Farthmann i sur., 1998; Hoon i sur., 2000; Brossart i sur., 1993; Curry i sur.,

1998; Carillo i sur., 2002; Szenajch i sur., 2003). Međutim, u nekim istraživanjima ovakva

povezanost između udjela bolesnika s pozitivnom vrijednosti tirozinaze i stadija bolesti po

AJCC nije uočena (Mellado i sur., 2002; Gogas i sur., 2002; Kulik i sur., 2001; Ranieri i

sur., 2005; Mellado i sur., 1999; Reynolds i sur., 2003). Povezanost vrijednosti drugih

biljega uz tirozinazu sa stadijem bolesti istraživana je u manjem broju istraživanja. Hoon i

suradnici su u uzorcima krvi melanomskih bolesnika određivali četiri različita biljega

(tirozinazu, p97, MUC18 i MAGE-3) i pokazali da je broj pozitivnih biljega u korelaciji sa

stadijem bolesti (Hoon i sur., 2000). U navedenom istraživanju pokazano je da je udio

bolesnika s pozitivnom vrijednosti tirozinaze i MAGE-3 biljega veći u višem stadiju

bolesti, dok za biljege MUC18 i p97 nije uočena ovakva povezanost sa stadijem (Hoon i

sur., 2000). Koyanagi i suradnici su određivali četiri biljega (Melan-A/MART-1, MAGE-3,

PAX-7 (engl. paired box gene 7) i 4-N-acetilgalaktozamintransferazu (GalNAc

transferaza)) i također pokazali da je broj pozitivnih biljega u korelaciji sa stadijem bolesti

(Koyanagi i sur., 2005a).

Također sam istražio postoji li povezanost između distribucije vrijednosti bijega

(tirozinaze i MITF-a) i nekih prognostičkih čimbenika u bolesnika s melanomom. U

skupini svih bolesnika distribucija vrijednosti biljega (tirozinaze i MITF-a) nije se

statistički značajno razlikovala između skupina bolesnika ženskog i muškog spola.

131

Međutim, u izdvojenoj skupini bolesnika s lokaliziranim melanomom u kojih je spol

značajan prognostički čimbenik, udio bolesnika s pozitivnom vrijednosti tirozinaze bio je

značajno veći u skupini bolesnika ženskog spola, dok se distribucija vrijednosti MITF-a

niti u ovoj izdvojenoj skupini bolesnika nije statistički značajno razlikovala između

skupina bolesnika ženskog i muškog spola. U većini drugih istraživanja nije nađena

povezanost između distribucije vrijednosti ispitivanih biljega (najčešće tirozinaze) i spola

bolesnika (Schittek i sur., 1999a; Mellado i sur., 1996; Mellado i sur., 1999; Gogas i sur.,

2002; Mellado i sur., 2002; Hoon i sur., 2000). Međutim, u dva istraživanja pokazan je

značajno veći udio bolesnika s pozitivnom vrijednosti tirozinaze u bolesnika muškog spola

(Proebstle i sur., 2000; Farthmann i sur., 1998). Ovi rezultati su u skladu s rezultatima

istraživanja koja su pokazala da je prognoza lošija u bolesnika muškog spola (Balch i sur.,

2001a; Gershenwald i sur., 2003). Veći udio bolesnika s pozitivnom vrijednosti tirozinaze

u bolesnika ženskog spola u skupini bolesnika s lokaliziranim melanomom pokazan u

ovom istraživanju nije u skladu s rezultatima drugih istraživanja otkrivanja cirkulirajućih

melanomskih stanica niti sa podacima o boljoj prognozi u bolesnika ženskog spola.

Međutim, u drugim istraživanjima povezanost vrijednosti biljega i spola nije istraživana u

izdvojenoj skupini bolesnika s lokaliziranim melanomom. No, budući da ne mogu ponuditi

biološko ni kliničko objašnjenje ovog rezultata, moguće je da je on posljedica slučajne

distribucije unutar skupine ispitanika.

U ovom istraživanju nije bilo značajne razlike u dobi između skupine bolesnika s

pozitivnom vrijednošću i onih s negativnom vrijednošću biljega (tirozinaze i MITF-a). U

većini drugih istraživanja također nije nađena povezanost između distribucije vrijednosti

ispitivanih biljega (najčešće tirozinaze) i dobi bolesnika (Mellado i sur., 1999; Gogas i sur.,

2002; Mellado i sur., 2002; Hoon i sur., 2000). Jedino su Schittek i suradnici pokazali da

su bolesnici s pozitivnom vrijednosti biljega (tirozinaze ili Melan-A/MART-1) značajno

stariji od bolesnika s negativnom vrijednosti, što je u skladu s podacima o lošijoj prognozi

u starijih bolesnika (Schittek i sur., 1999a).

U ovom istraživanju nije bilo značajne razlike u debljini primarnog tumora između

skupine bolesnika s pozitivnom i onih s negativnom vrijednošću tirozinaze, dok je debljina

bila značajno veća u skupini bolesnika s pozitivnom vrijednošću MITF-a u odnosu na

skupinu bolesnika s negativnom vrijednošću MITF-a. U nekim drugim istraživanjima nije

nađena povezanost između distribucije vrijednosti ispitivanih biljega (najčešće tirozinaze) i

debljine primarnog tumora (Hoon i sur., 1995; Hoon i sur., 2000; Mellado i sur., 2002;

Mellado i sur., 1999; Gogas i sur., 2002; Mellado i sur., 1996; Kulik i sur., 2001; Blaheta i

132

sur., 2001). Međutim, u nekim istraživanjima je potvrđena povezanost između distribucije

vrijednosti ispitivanih biljega i debljine primarnog tumora. Farthmann i suradnici su

pokazali da je udio bolesnika s pozitivnom vrijednosti tirozinaze značajno veći u bolesnika

s tumorom debljim od 4 mm, nego u onih s tumorom debljine do 4mm (Farthmann i sur.,

1998). Curry i suradnici su pokazali da se postotak bolesnika s pozitivnom vrijednosti

tirozinaze povećava s porastom debljine tumora (Curry i sur., 1998). Quereux i suradnici

su pokazali da je udio bolesnika s pozitivnom vrijednosti tirozinaze značajno veći u

bolesnika s tumorom debljim od 3 mm, nego u onih s tumorom debljine do 3mm (Quereux,

2001). Schittek i suradnici su pokazali da su bolesnici s pozitivnom vrijednosti biljega

(tirozinaze ili Melan-A/MART-1) imali statistički značajno deblji primarni tumor (Schittek

i sur., 1999a). Navedeni rezultati, kao i rezultat ovog istraživanja za MITF, u skladu su s

rezultatima istraživanja koja pokazuju da bolesnici s debljim primarnim tumorom imaju

značajno lošiju prognozu i povećan rizik za razvoj metastaza regionalnih limfnih čvorova,

in transit-metastaza i lokalnog recidiva (Gershenwald i sur., 2003; Balch i sur., 2001c;

Balch i sur., 2001a; Lens i sur., 2002; Kretschmer i sur., 2002). Na osnovu ovih rezultata

može se pretpostaviti da je u debljih tumora učestalija diseminacija tumorskih stanica koje

se mogu otkriti metodom RT-PCR u perifernoj krvi. Takva diseminacija tumorskih stanica

može biti povezana s povećanim rizikom od nastanka metastaza i lokalnog recidiva.

U ovom istraživanju distribucija vrijednosti biljega (tirozinaze i MITF-a) nije se

značajno razlikovala između različitih skupina bolesnika s obzirom na lokalizaciju

primarnog tumora. U većini drugih istraživanja također nije nađena povezanost između

distribucije vrijednosti ispitivanih biljega i lokalizacije primarnog tumora (Hoon i sur.,

2000; Mellado i sur., 2002; Mellado i sur., 1999; Mellado i sur., 1996; Schittek i sur.,

1999a). Jedino su Proebstle i suradnici pokazali da je udio bolesnika s pozitivnom

vrijednosti tirozinaze značajno manji u bolesnika s primarnim melanomom na udovima,

nego u bolesnika s drugim lokalizacijama primarnog tumora, što je u skladu s podacima o

lošijoj prognozi bolesnika s lokalizacijom primarnog melanoma na trupu i glavi i vratu u

odnosu na udove (Proebstle i sur., 2000; Balch i sur., 2001a; Garbe i sur., 1995;

Gershenwald i sur., 2003).

U ovom istraživanju su dobivene pozitivne vrijednosti oba istraživana biljega

(tirozinaze i MITF-a) i u bolesnika s primarnim melanomom oka te pozitivne vrijednosti

tirozinaze u bolesnika s nepoznatim primarnim melanomom. Međutim, broj tih bolesnika

je bio premalen (4 bolesnika s primarnim melanomom oka i 7 bolesnika s nepoznatim

primarnim melanomom) da bi se ti rezultati statistički obradili i usporedili s rezultatima

133

drugih istraživanja koja su također pokazala da se metodom RT-PCR cirkulirajuće

melanomske stanice mogu naći i u krvi bolesnika s primarnim melanomom oka i

nepoznatim primarnim melanomom (Farthmann i sur., 1998; Glaeser i sur., 1997;

Waldmann i sur., 2000; Waldmann i sur., 1999; Boldin i sur., 2005).

U ovom istraživanju distribucija vrijednosti biljega (tirozinaze i MITF-a) nije se

značajno razlikovala između skupine bolesnika s primarnim tumorom histološkog tipa

SSM i skupine bolesnika s primarnim tumorom histološkog tipa NM. Bolesnika s drugim

histološkim tipovima primarnog tumora (ALM, LMM i dr.) je bilo premalo, pa se podatke

za njih nije moglo vjerodostojno statistički obraditi. U nekim drugim istraživanjima

također nije nađena povezanost između distribucije vrijednosti ispitivanih biljega

(tirozinaze) i histološkog tipa primarnog tumora (Mellado i sur., 2002; Mellado i sur.,

1999; Proebstle i sur., 2000; Mellado i sur., 1996). Međutim, Farthmann i suradnici su

pokazali da je udio bolesnika s pozitivnom vrijednosti tirozinaze značajno veći u skupini

bolesnika s primarnim melanomom histološkog tipa NM i s nepoznatim histološkim tipom,

u odnosu na skupinu bolesnika s primarnim melanomom histološkog tipa ALM, SSM i

LMM (Farthmann i sur., 1998). Schittek i suradnici su pokazali da je udio bolesnika s

pozitivnom vrijednosti biljega (tirozinaze ili Melan-A/MART-1) značajno veći u skupini

bolesnika s primarnim tumorom histološkog tipa ALM i LMM u odnosu na skupinu

bolesnika s primarnim tumorom histološkog tipa SSM i NM (Schittek i sur., 1999a).

U ovom istraživanju udio bolesnika s pozitivnom vrijednosti biljega (tirozinaze i

MITF-a) nije se statistički značajno razlikovao između skupine bolesnika s ulceriranim i

onih s neulceriranim melanomom. Ovi rezultati su u skladu s rezultatima istraživanja koje

je također pokazalo da nema povezanosti između distribucije vrijednosti istraživanog

biljega (tirozinaze) i ulceracije primarnog tumora (Gogas i sur., 2002).

U ovom smo istraživanju pokazali da ne postoji trend povećanja udjela bolesnika s

pozitivnom vrijednošću biljega (ni tirozinaze, niti MITF-a) sa porastom stupnja po Clarku.

U drugim istraživanjima također nije nađena povezanost između distribucije vrijednosti

ispitivanih biljega (najčešće tirozinaze) i stupnja po Clarku (Quereux i sur., 2001; Kulik i

sur., 2001; Mellado i sur., 2002; Mellado i sur., 1999; Gogas i sur., 2002; Hoon i sur.,

2000; Hoon i sur., 1995). Međutim, udio bolesnika s pozitivnom vrijednosti tirozinaze u

ovom je istraživanju bio značajno veći u skupini bolesnika sa stupnjem po Clarku 5 u

odnosu na skupinu bolesnika sa stupnjem po Clarku manjim od 5, dok je udio bolesnika s

pozitivnom vrijednosti MITF-a bio značajno veći u skupini bolesnika sa stupnjem po

Clarku većim od 2 u odnosu na skupinu bolesnika sa stupnjem po Clarku 1 i 2. Ovi

134

rezultati se ne mogu usporediti s rezultatima drugih istraživanja jer u njima povezanost

distribucije ispitivanih biljega i stupnja po Clarku nije bila istraživana na ovako detaljan

način. Jedno moguće objašnjenje ovih rezultata je da u određenom koraku progresije

melanoma koji se patohistološki očituje prijelazom u viši stupanj po Clarku dolazi i do

povećane ekspresije pojedinih melanomskih biljega. Tako bi se na osnovu rezultata ovog

istraživanja moglo zaključiti da je prijelaz iz stupnja po Clarku 2 u stupanj po Clarku 3

praćen povećanom ekspresijom gena za MITF, dok je prijelaz iz stupnja po Clarku 4 u

stupanj po Clarku 5 praćen povećanom ekspresijom gena za tirozinazu. Ovi rezultati koji

upućuju na povišenu ekspresiju gena za MITF koja prethodi povišenoj ekspresiji gena za

tirozinazu imaju smisla budući da je MITF transkripcijski čimbenik koji potiče

transkripciju gena za tirozinazu. Međutim, kako bi ova hipoteza dobila vjerodostojnost

rezultate ovog istraživanja treba potvrditi u drugim istraživanjima na većoj skupini

bolesnika s melanomom.

U ovom istraživanju udio bolesnika s pozitivnom vrijednosti biljega (tirozinaze i

MITF-a) nije se statistički značajno razlikovao između različitih skupina s obzirom na

prisutnost i lokalizaciju metastaza regionalnih limfnih čvorova. Gogas i suradnici su

također pokazali da nema povezanosti između distribucije vrijednosti istraživanog biljega

(tirozinaze) i prisutnosti metastaza regionalnih limfnih čvorova, dok povezanost

distribucije vrijednosti biljega s lokalizacijom metastaza regionalnih limfnih čvorova nije

istraživana u drugim, meni poznatim, istraživanjima (Gogas i sur., 2002).

U ovom istraživanju u skupini svih bolesnika s metastazama regionalnih limfnih

čvorova udio bolesnika s pozitivnom vrijednosti tirozinaze bio je statističko značajno veći

u skupini bolesnika s više od jednim regionalnim limfnim čvorom zahvaćenim

metastazama nego u skupini bolesnika s jednim regionalnim limfnim čvorom zahvaćenim

metastazama. Povezanost distribucije vrijednosti MITF-a i broja regionalnih limfnih

čvorova zahvaćenih metastazama nije nađena u navedenoj skupini bolesnika. Međutim, u

izdvojenoj skupini bolesnika u stadiju 3 po AJCC u kojih je broj regionalnih limfnih

čvorova zahvaćenih metastazama značajan prognostički čimbenik pokazano je da je udio

bolesnika s pozitivnom vrijednosti i tirozinaze i MITF-a značajno veći u bolesnika s većim

brojem regionalnih limfnih čvorova zahvaćenih metastazama. U drugim istraživanjima nije

nađena povezanost između distribucije vrijednosti ispitivanih biljega i broja regionalnih

limfnih čvorova zahvaćenih metastazama (Curry i sur., 1998; Mellado i sur., 1996; Hoon i

sur., 1995). Rezultati ovog istraživanja su u skladu s istraživanjima koja pokazuju da je u

bolesnika s metastazama regionalnih limfnih čvorova najvažniji prognostički čimbenik

135

upravo broj limfnih čvorova zahvaćenih metastazama (Balch i sur., 2001a; Gershenwald i

sur., 2003). Što je broj regionalnih limfnih čvorova zahvaćenih metastazama veći to je

prognoza lošija (Balch i sur., 2001a; Gershenwald i sur., 2003).

U ovom istraživanju udio bolesnika s pozitivnom vrijednosti biljega (tirozinaze i

MITF-a) nije se statistički značajno razlikovao između različitih skupina s obzirom na

lokalizaciju udaljenih metastaza. Hoon i suradnici su također pokazali da nema

povezanosti između distribucije vrijednosti istraživanih biljega (tirozinaza, p97, MUC18 i

MAGE-3) i lokalizacije udaljenih metastaza (Hoon i sur., 1995). U nekim drugim

istraživanjima je pokazano da je pozitivna vrijednost tirozinaze značajno učestalija u

bolesnika s udaljenim metastazama u visceralnim organima u odnosu na bolesnike s

udaljenim metastazama na koži i u limfnim čvorovima (Battayani i sur., 1995; Glaeser i

sur., 1997; Jung i sur., 1997). Kako je broj bolesnika s udaljenim metastazama u ovom

istraživanju bio malen (značajno manji nego u drugim navedenim istraživanjima), smatram

da nije opravdano izvoditi zaključke na osnovu ovih dobivenih rezultata.

Rezultate koji se odnose na povezanost distribucije vrijednosti biljega i prisutnosti

udaljenih metastaza, broja udaljenih metastaza te lokalnog recidiva nisam posebno

raspravio budući da ta povezanost nije istraživana u drugim istraživanjima, a i broj

ispitanika s lokalnim recidivom odnosno s udaljenim metastazama je bio malen u ovom

istraživanju.

Broj bolesnika s drugim primarnim melanomom, recidivom metastaza regionalnih

limfnih čvorova i satelitskim metastazama u ovom istraživanju bio je premalen da bi se

podaci o vrijednosti biljega u tih skupina bolesnika vjerodostojno statistički obradili i

usporedili s rezultatima drugih istraživanja.

Istražio sam i postoji li povezanost između distribucije vrijednosti bijega (tirozinaze

i MITF-a) i prethodne terapije. U ovom istraživanju udio bolesnika s pozitivnom

vrijednosti biljega (tirozinaze i MITF-a) nije se statistički značajno razlikovao između

skupine bolesnika koji su prethodno primali sistemsku terapiju (kemoterapiju i/ili

imunoterapiju) i skupine bolesnika koji nisu prethodno primali sistemsku terapiju. I druga

su istraživanja pokazala da se udio bolesnika s pozitivnom vrijednosti biljega (tirozinaze)

ne razlikuje značajno između skupine bolesnika koji su prethodno primali sistemsku

terapiju i skupine bolesnika koji nisu (Jung i sur., 1997; Waldmann i sur., 1999; Mellado i

sur., 1999; Mellado i sur., 1996). U ovo istraživanje, kao i u druga navedena istraživanja,

bili su uključeni bolesnici koji su primali sistemsku terapiju različito vrijeme prije

136

uzimanja uzorka krvi za analizu. Kako mogući utjecaj sistemske terapije na prisutnost

cirkulirajućih melanomskih stanica može biti i privremen, moguće je da sistemska terapija

ipak značajno utječe na udio bolesnika s pozitivnom vrijednosti biljega iako to ovo

istraživanje i druga navedena istraživanja nisu pokazala.

Vjerodostojniji pristup temelji se na analizi više uzoraka krvi istog bolesnika

dobivenih prije sistemske terapije i u različitim vremenskim točkama nakon početka

terapije. Tako su Schmidt i suradnici pokazali da je 81% bolesnika koji su prije terapije

imali pozitivnu vrijednosti tirozinaze tri tjedna nakon početka terapije imalo negativnu

vrijednost tirozinaze (Schmidt i sur., 2002). Reynolds i suradnici su pokazali da postoji

statistički značajni trend smanjenja udjela bolesnika s pozitivnom vrijednosti biljega s

vremenom proteklim od početka terapije melanomskom vakcinom (Reynolds i sur., 2003).

Ovi rezultati upućuju na utjecaj sistemske terapije na smanjenje broja cirkulirajućih

melanomskih stanica. Međutim stvarni klinički i prognostički značaj takvog utjecaja treba

tek istražiti. Za razliku od navedenih istraživanja, Szenajch i suradnici, analizirajući uzorke

krvi istih bolesnika prije i nakon početka sistemske terapije, nisu pokazali značajan utjecaj

terapije na distribuciju vrijednosti biljega (tirozinaze) (Szenajch i sur., 1998).

U ovom istraživanju nije nađena povezanost između udjela bolesnika s pozitivnom

vrijednosti biljega (tirozinaze i MITF-a) i vremena proteklog od operacije melanoma. U

nekim drugim istraživanjima također nije nađena povezanost između udjela bolesnika s

pozitivnom vrijednosti biljega i vremena proteklog od operacije melanoma (Quereux i sur.,

2001; Reynolds i sur., 2003; Brownbridge i sur., 2001). Curry i suradnici su, naprotiv,

pokazali da je učestalost pozitivne vrijednosti tirozinaze veća u uzorcima krvi dobivenim

unutar tri mjeseca nakon operacije melanoma nego u uzorcima krvi dobivenim više od tri

mjeseca nakon operacije (Curry i sur., 1998).

U nekim drugim istraživanjima istraživana je i stvarna prognostička vrijednost

određivanja cirkulirajućih melanomskih stanica. U većini su ovih istraživanja bolesnici s

pozitivnim nalazom biljega (najčešće tirozinaze) u perifernoj krvi imali značajno povećan

rizik od recidiva bolesti i kraće preživljenje (Mellado i sur., 1999; Schrader i sur., 2000;

Curry i sur., 2001; Proebstle i sur., 2000; Mellado i sur., 1996; Battayani i sur., 1995;

Kunter i sur., 1996; Gogas i sur., 2002; Mellado i sur., 2002; Reynolds i sur., 2003;

Schittek i sur., 1999a; Hoon i sur., 2000; Koyanagi i sur., 2005b). Međutim, objavljeni su i

rezultati istraživanja u kojima određivanje cirkulirajućih melanomskih stanica u bolesnika

137

s melanomom nije pokazalo prognostičku vrijednost (Waldmann i sur., 2000; Brownbridge

i sur., 2001; Ranieri i sur., 2005; Queraux i sur., 2000).

Ovo istraživanje je po prvi puta pokazalo vrijednost MITF-a kao specifičnog

biljega za otkrivanje cirkulirajućih melanomskih stanica metodom RT-PCR. Dobiveni

rezultati pokazuju da analiza MITF-a uz tirozinazu poboljšava otkrivanje cirkulirajućih

melanomskih stanica u odnosu na analizu samo tirozinaze. U ovom istraživanju je udio

bolesnika s pozitivnom vrijednosti MITF-a bio veći u višem stadiju po AJCC što upućuje

na moguću prognostičku vrijednost MITF-a. Međutim, da bi se odredila stvarna

prognostička vrijednost MITF-a kao biljega za određivanje cirkulirajućih melanomskih

stanica potrebno je provesti prospektivnu studiju u kojoj će bolesnici biti praćeni dovoljno

dugo. Tek će se na osnovu rezultata takve studije moći odrediti stvarna klinička vrijednosti

MITF-a kao biljega za otkrivanje cirkulirajućih melanomskih stanica metodom RT-PCR.

138

6. ZAKLJUČCI

139

1) I tirozinaza i MITF su pokazali visoku specifičnost kao biljezi za određivanje

cirkulirajućih melanomskih stanica metodom RT-PCR (ni jedan od uzoraka krvi 40

zdravih ispitanika nije bio pozitivan ni na tirozinazu niti na MITF).

2) Prag detekcije oba biljega (tirozinaze i MITF-a) bio je dovoljno nizak da omogući

otkrivanje najmanje 50 melanomskih stanica u 10 mL periferne krvi, odnosno jedne

melanomske stanice među 0,82 x 106 leukocita periferne krvi.

3) Analiza MITF-a, kao dodatnog biljega uz tirozinazu, omogućila je otkrivanje

cirkulirajućih melanomskih stanica u većeg broja bolesnika s melanomom u odnosu

na analizu samo tirozinaze.

4) I za tirozinazu i za MITF nađen je statistički značajni trend povećanja udjela

bolesnika s pozitivnom vrijednošću biljega sa porastom stadija bolesti, što upućuje

na moguću prognostičku vrijednost oba biljega.

5) Nije nađena statistički značajna povezanost između distribucije vrijednosti biljega

(tirozinaze i MITF-a) i dobi bolesnika, lokalizacije primarnog melanoma,

histološkog tipa primarnog melanoma, ulceracije primarnog melanoma, prisutnosti

metastaza regionalnih limfnih čvorova, lokalizacije metastaza regionalnih limfnih

čvorova i lokalizacije udaljenih metastaza.

6) U skupini bolesnika s lokaliziranom bolešću (stadiji 1 i 2 po AJCC), ali ne i u

skupini svih bolesnika, nađen je statistički značajno veći udio bolesnika s pozitivnom

vrijednosti tirozinaze u bolesnika ženskog spola. Distribucija vrijednosti MITF-a nije

se statistički značajno razlikovala između različitih skupina bolesnika s obzirom na

spol.

7) Debljina primarnog tumora bila je statistički značajno veća u skupini bolesnika s

pozitivnom vrijednošću MITF-a u odnosu na skupinu bolesnika s negativnom

vrijednošću MITF-a. Distribucija vrijednosti debljine primarnog tumora nije se

statistički značajno razlikovala između skupine bolesnika s pozitivnom i onih s

negativnom vrijednošću tirozinaze.

140

8) Udio bolesnika s pozitivnom vrijednosti tirozinaze bio je značajno veći u skupini

bolesnika sa stupnjem po Clarku 5 u odnosu na skupinu bolesnika sa stupnjem po

Clarku manjim od 5, dok je udio bolesnika s pozitivnom vrijednosti MITF-a bio

značajno veći u skupini bolesnika sa stupnjem po Clarku većim od 2 u odnosu na

skupinu bolesnika sa stupnjem po Clarku 1 i 2.

9) U skupini bolesnika u stadiju 3 po AJCC udio bolesnika s pozitivnom vrijednosti

biljega (tirozinaze i MITF-a) bio je značajno veći u bolesnika s većim brojem

regionalnih limfnih čvorova zahvaćenih metastazama.

10) Nije nađena statistički značajna povezanost između distribucije vrijednosti biljega

(tirozinaze i MITF-a) i prethodne sistemske terapije te vremena proteklog od

operacije melanoma.

141

7. CITIRANA LITERATURA

142

Abbasi NR, Shaw HM, Rigel DS, Friedman RJ, McCarthy WH, Osman I, Kopf AW, Polsky D. Early diagnosis of cutaneous melanoma: revisiting the ABCD criteria. JAMA 2004; 292(22):2771-2776. Affeldt JC, Minckler DS, Azen SP, Yeh L. Prognosis in uveal melanoma with extrascleral extension. Arch Ophthalmol 1980;98(11):1975-1979. Agarwala SS, Kirkwood JM. Interferons and adjuvant therapy. U: Balch CM, Houghton AN, Sober AJ, Soong SJ, urednici. Cutaneous melanoma. 4. izdanje. St Louis (MO): Quality Medical Publishing; 2003. str. 605-621. Ainslie J, Peters LJ, McKay MJ. Radiotherapy for primary and regional melanoma. U: Balch CM, Houghton AN, Sober AJ, Soong SJ, urednici. Cutaneous melanoma. 4. izdanje. St Louis (MO): Quality Medical Publishing; 2003. str. 449-471. Amae S, Fuse N, Yasumoto K, Sato S, Yajima I, Yamamoto H, Udono T, Durlu YK, Tamai M, Takahashi K, Shibahara S. Identification of a novel isoform of microphthalmia-associated transcription factor that is enriched in retinal pigment epithelium. Biochem Biophys Res Commun 1998; 247: 710-715. Amiel J, Watkin PM, Tassabehji M, Read AP, Winter RM. Mutation of the MITF gene in albinism-deafness syndrome (Tietz-syndrome). Clin Dysmorphol 1998; 7: 17-20. Ang CG, Kelly JW, Fritschi L, Dowling JP. Characteristics of familial and non-familial melanoma in Australia. Melanoma Res 1998; 8(5):459-464. Atallah E, Flaherty L. Treatment of metastatic malignant melanoma. Curr Treat Options Oncol 2005;6(3):185-193. Atkins MB, Kunkel L, Sznol M, Rosenberg SA. High-dose recombinant interleukin-2 therapy in patients with metastatic melanoma: long-term survival update. Cancer J Sci Am 2000;6 Suppl 1:S11-14. Autier P, Dore JF, Gefeller O, Cesarini JP, Lejeune F, Koelmel KF, Lienard D, Kleeberg UR. Melanoma risk and residence in sunny areas. EORTC Melanoma Co-operative Group. European Organization for Research and Treatment of Cancer. Br J Cancer 1997; 76(11):1521-1524. Baker M, Gillanders WE, Mikhitarian K, Mitas M, Cole DJ. The molecular detection of micrometastatic breast cancer. Am J Surg 2003; 186(4):351-358. Balch CM, Buzaid AC, Soong SJ, Atkins MB, Cascinelli N, Coit DG, Fleming ID, Gershenwald JE, Houghton A, Kirkwood JM, McMasters KM, Mihm MF, Morton DL, Reintgen DS, Ross MI, Sober A, Thompson JA, Thompson JF. Final version of the American Joint Committee on Cancer staging system for cutaneous melanoma. J Clin Oncol 2001; 19(16): 3635-3648.b Balch CM, Gershenwald JE, Buzaid AC, Cascinelli N, Soong SJ. Staging and classification. U: Balch CM, Houghton AN, Sober AJ, Soong SJ, urednici. Cutaneous melanoma. 4. izdanje. St Louis (MO): Quality Medical Publishing; 2003. str. 55.-76.

143

Balch CM, Ross MI. Sentinel lymphadenectomy for melanoma – is it a substitute for elective lymphadenectomy? Ann Surg Oncol 1999; 6(5):416-41. Balch CM, Soong SJ, Gershenwald JE, Thompson JF, Reintgen DS, Cascinelli N, Urist M, McMasters KM, Ross MI, Kirkwood JM, Atkins MB, Thompson JA, Coit DG, Byrd D, Desmond R, Zhang Y, Liu PY, Lyman GH, Morabito A. Prognostic factors analysis of 17,600 melanoma patients: validation of the American Joint Committee on Cancer melanoma staging system. J Clin Oncol 2001; 19(16):3622-3634.a Balch CM, Soong SJ, Murad TM, Smith JW, Maddox WA, Durant JR. A multifactorial analysis of melanoma. IV. Prognostic factors in 200 melanoma patients with distant metastases (stage III). J Clin Oncol 1983; 1(2):126-134. Balch CM, Soong SJ, Smith T, Ross MI, Urist MM, Karakousis CP, Temple WJ, Mihm MC, Barnhill RL, Jewell WR, Wanebo HJ, Desmond R; Investigators from the Intergroup Melanoma Surgical Trial. Long-term results of a prospective surgical trial comparing 2 cm vs. 4 cm excision margins for 740 patients with 1-4 mm melanomas. Ann Surg Oncol 2001; 8(2):101-108.c Barth A, Wanek LA, Morton DL. Prognostic factors in 1,521 melanoma patients with distant metastases. J Am Coll Surg 1995;181(3):193-201. Bataille V, Sasieni P, Cuzick J, Hungerford JL, Swerdlow A, Bishop JA. Risk of ocular melanoma in relation to cutaneous and iris naevi. Int J Cancer 1995;60(5):622-626. Battayani Z, Grob JJ, Xerri L, Noe C, Zarour H, Houvaeneghel G, Delpero JR, Birmbaum D, Hassoun J, Bonerandi JJ. Polymerase chain reaction detection of circulating melanocytes as a prognostic marker in patients with melanoma. Arch Dermatol 1995;131(4):443-447. Battyani Z, Xerri L, Hassoun J, Bonerandi JJ, Grob JJ. Tyrosinase gene expression in human tissues. Pigment Cell Res 1993;6(6):400-405. Bell DJ, Wilson MW. Choroidal melanoma: natural history and management options. Cancer Control 2004;11(5):296-303. Bellows CF, Belafsky P, Fortgang IS, Beech DJ. Melanoma in African-Americans: trends in biological behavior and clinical characteristics over two decades. J Surg Oncol 2001;78(1):10-16. Bence Jones H. Papers on chemical pathology, lecture III. Lancet 1847; 2:88-92. Bentley NJ, Eisen T, Goding CR. Melanocyte-specific expression of the human tyrosinase promoter: activation by the microphthalmia gene product and role of the initiator. Mol Cell Biol 1994; 14: 7996-8006. Bertolotto C,Abbe P,Hemesath TJ, Bille K, Fisher DE, Ortonne JP,Ballotti R. Microphthalmia gene product as a signal transducer in cAMP-induced differentiation of melanocytes. Cell Biol 1998; 142: 827-835.

144

Bessho A. Tabata M. Kiura K. Takata I. Nagata T. Fujimoto N. Kunisada K. Ueoka H. Harada M. Detection of occult tumor cells in peripheral blood from patients with small cell lung cancer by reverse transcriptase-polymerase chain reaction. Anticancer Res 2000;20(2B):1149-1154. Blaheta HJ, Schittek B, Breuninger H, Sotlar K, Ellwanger U, Thelen MH, Maczey E, Rassner G, Bueltmann B, Garbe C. Detection of melanoma micrometastasis in sentinel nodes by reverse transcription-polymerase chain reaction correlates with tumor thickness and is predictive of micrometastatic disease in the lymph node basin. Am J Surg Pathol 1999;23(7):822-828. Bojunga J, Kusterer K, Schumm-Draeger PM, Usadel KH. Polymerase chain reaction in the detection of tumor cells: new approaches in diagnosis and follow-up of patients with thyroid cancer. Thyroid 2002;12(12):1097-1107. Boldin I, Langmann G, Richtig E, Schwantzer G, Ardjomand N, Wegscheider B, El-Shabrawi Y. Five-year results of prognostic value of tyrosinase in peripheral blood of uveal melanoma patients. Melanoma Res 2005;15(6):503-507. Borgstein PJ, Meijer S, Van Diest PJ. Are locoregional cutaneous metastases in melanoma predictable. Ann Surg Oncol 1999; 6(3):315-321. Bosserhoff AK, Dreau D, Hein R, Landthaler M, Holder WD, Buettner R. Melanoma inhibitory activity (MIA), a serological marker of malignant melanoma. Recent Results Cancer Res 2001;158:158-168. Bosserhoff AK, Lederer M, Kaufmann M, Hein R, Stolz W, Apfel R, Bogdahn U, Buettner R. MIA, a novel serum marker for progression of malignant melanoma. Anticancer Res 1999;19(4A):2691-2693. Bostick PJ, Morton DL, Turner RR, Huynh KT, Wang HJ, Elashoff R, Essner R, Hoon DS. Prognostic significance of occult metastases detected by sentinel lymphadenectomy and reverse transcriptase-polymerase chain reaction in early-stage melanoma patients. J Clin Oncol 1999;17(10):3238-3244. Boyano MD, Garcia-Vazquez MD, Lopez-Michelena T, Gardeazabal J, Bilbao J, Canavate ML, Galdeano AG, Izu R, Diaz-Ramon L, Raton JA, Diaz-Perez JL. Soluble interleukin-2 receptor, intercellular adhesion molecule-1 and interleukin-10 serum levels in patients with melanoma. Br J Cancer 2000;83(7):847-852. Boyum A. A one-stage procedure for isolation of granulocytes and lymphocytes from human blood. Scand J Clin Lab Invest 1968; 21: 51-55 (Suppl. 97).a Boyum A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Scand J Clin Lab Invest 1968; 21: 77-89 (Suppl. 97).b Breslow A. Thickness, cross-sectional areas and depth of invasion in the prognosis of cutaneous melanoma. Ann Surg 1970; 172:902-908.

145

Brossart P, Keilholz U, Willhauck M, Scheibenbogen C, Mohler T, Hunstein W. Hematogenous spread of malignant melanoma cells in different stages of disease. J Invest Dermatol 1993101(6):887-889. Brownbridge GG, Gold J, Edward M, MacKie RM. Evaluation of the use of tyrosinase-specific and melanA/MART-1-specific reverse transcriptase-coupled-polymerase chain reaction to detect melanoma cells in peripheral blood samples from 299 patients with malignant melanoma. Br J Dermatol 2001;144(2):279-287. Burchill SA, Lewis IJ, Abrams KR, Riley R, Imeson J, Pearson AD, Pinkerton R, Selby P. Circulating neuroblastoma cells detected by reverse transcriptase polymerase chain reaction for tyrosine hydroxylase mRNA are an independent poor prognostic indicator in stage 4 neuroblastoma in children over 1 year. J Clin Oncol 2001;19(6):1795-1801. Buttner P, Garbe C, Bertz J, Burg G, d'Hoedt B, Drepper H, Guggenmoos-Holzmann I, Lechner W, Lippold A, Orfanos CE, i sur. Primary cutaneous melanoma. Optimized cutoff points of tumor thickness and importance of Clark's level for prognostic classification. Cancer 1995; 75(10):2499-2506. Buzaid AC, Ross MI, Balch CM, Soong S, McCarthy WH, Tinoco L, Mansfield P, Lee JE, Bedikian A, Eton O, Plager C, Papadopoulos N, Legha SS, Benjamin RS. Critical analysis of the current American Joint Committee on Cancer staging system for cutaneous melanoma and proposal of a new staging system. J Clin Oncol 1997;15(3):1039-1051. Buzaid AC, Sandler AB, Hayden CL, Scinto J, Poo WJ, Clark MB, Hotchkiss S. Neuron-specific enolase as a tumor marker in metastatic melanoma. Am J Clin Oncol 1994;17(5):430-431. Carrillo E, Prados J, Melguizo C, Marchal JA, Velez C, Serrano S, Boulaiz H, Merida JA, Aranega A. Reverse transcriptase-polymerase chain reaction detection of circulating tumor cells in patients with melanoma: correlation with clinical stage, tumor thickness and histological type. Pathol Int 2002;52(4):294-299. Carroll PR, Lee KL, Fuks ZY, Kantoff PW. Cancer of the prostate. U: DeVita VT Jr, Hellman S, Rosenberg SA, urednici. Cancer: principles and practice of oncology. 6. izdanje. Philadelphia (PA): Lippincott Williams & Wilkins; 2001. str. 1418-1469. Castaldo G. Tomaiuolo R. Sanduzzi A. Bocchino ML. Ponticiello A. Barra E. Vitale D. Bariffi F. Sacchetti L. Salvatore F. Lung cancer metastatic cells detected in blood by reverse transcriptase-polymerase chain reaction and dot-blot analysis. J Clin Oncol 1997;15(11):3388-3393. Chang AE, Karnell LH, Menck HR. The National Cancer Data Base report on cutaneous and noncutaneous melanoma: a summary of 84 836 cases from the past decade. Cancer 1998; 83:1664-1678. Chen YT, Stockert E, Tsang S, Copland KA, Old LJ. Immunophenotyping of melanomas for tyrosinase: implications for vaccine development. Proc Natl Acad Sci USA 1995; 92:8125-8129.

146

Chomczynski P i Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry 1987; 162: 156-159. Chung MH, Gupta RK, Essner R, Ye W, Yee R, Morton DL. Serum TA90 immune complex assay can predict outcome after resection of thick (> or =4 mm) primary melanoma and sentinel lymphadenectomy. Ann Surg Oncol 2002;9(2):120-126. Cillo U, Navaglia F, Vitale A, Molari A, Basso D, Bassanello M, Brolese A, Zanus G, Montin U, D'Amico F, Ciarleglio FA, Carraro A, Bridda A, Burra P, Carraro P, Plebani M, D'Amico DF. Clinical significance of alpha-fetoprotein mRNA in blood of patients with hepatocellular carcinoma. Clin Chim Acta 2004;347(1-2):129-138. Clark WH Jr, Elder DE, Guerry D 4th, Braitman LE, Trock BJ, Schultz D, Synnestvedt M, Halpern AC. Model predicting survival in stage I melanoma based on tumor progression. J Natl Cancer Inst 1989;81(24):1893-1904. Clark WH Jr, From L, Bernardino EA, Mihm MC. The histogenesis and biologic behavior of primary human malignant melanomas of the skin. Cancer Res 1969;29(3):705-727. Clark WH, Elder DE, Van Horn M. The biologic forms of malignant melanoma. Hum Pathol 1986; 17:443-450. Clark WH, Reimer RR, Greene M, Ainsworth AM, Mastrangelo MJ. Origin of familial malignant melanomas from heritable melanocytic lesions. 'The B-K mole syndrome'. Arch Dermatol 1978; 114(5):732-738. Clemente CG, Mihm MC Jr, Bufalino R, Zurrida S, Collini P, Cascinelli N. Prognostic value of tumor infiltrating lymphocytes in the vertical growth phase of primary cutaneous melanoma. Cancer 1996; 77(7):1303-1310. Coit DG, Ferrone CR. Recurrent regional metastases. U: Balch CM, Houghton AN, Sober AJ, Soong SJ, urednici. Cutaneous melanoma. 4. izdanje. St Louis (MO): Quality Medical Publishing; 2003. str. 439.- 448. Conley J, Latters R, Orr W. Desmoplastic malignant melanoma (a rare variant of spindle cell melanoma). Cancer 1971; 28:914-936. Crowson AN, Magro CM, Barnhill RL, Mihm MC. Pathology. U: Balch CM, Houghton AN, Sober AJ, Soong SJ, urednici. Cutaneous melanoma. 4. izdanje. St Louis (MO): Quality Medical Publishing; 2003. str. 171.-202. Curry BJ, Myers K, Hersey P. Polymerase chain reaction detection of melanoma cells in the circulation: relation to clinical stage, surgical treatment, and recurrence from melanoma. J Clin Oncol 1998;16(5):1760-1769. Curry BJ, Myers K, Hersey P. Utility of tests for circulating melanoma cells in identifying patients who develop recurrent melanoma. Recent Results Cancer Res 2001;158:211-230. Danson S, Lorigan P. Improving outcomes in advanced malignant melanoma: update on systemic therapy. Drugs 2005;65(6):733-743.

147

De Vries E, Bray FI, Coebergh JW, Parkin DM. Changing epidemiology of malignant cutaneous melanoma in Europe 1953-1997: rising trends in incidence and mortality but recent stabilizations in western Europe and decreases in Scandinavia. Int J Cancer 2003; 107(1):119-126. Deguchi T, Doi T, Ehara H, Ito S, Takahashi Y, Nishino Y, Fujihiro S, Kawamura T, Komeda H, Horie M. Detection of micrometastatic prostate cancer cells in lymph nodes by reverse transcriptase-polymerase chain reaction. Cancer Res 1993;53(22):5350-5354. Delattre O, Zucman J, Melot T, Garau XS, Zucker JM, Lenoir GM, Ambros PF, Sheer D, Turc-Carel C, Triche TJ. The Ewing family of tumors-a subgroup of small-round-cell tumors defined by specific chimeric transcripts. N Engl J Med 1994;331(5):294-299. Dessureault S, Soong SJ, Ross MI, Thompson JF, Kirkwood JM, Gershenwald JE, Coit DG, McMasters KM, Balch CM, Reintgen D; American Joint Committee on Cancer (AJCC) Melanoma Staging Committee. Improved staging of node-negative patients with intermediate to thick melanomas (>1 mm) with the use of lymphatic mapping and sentinel lymph node biopsy. Ann Surg Oncol 2001;8(10):766-770. Diener-West M, Earle JD, Fine SL, Hawkins BS, Moy CS, Reynolds SM, Schachat AP, Straatsma BR; Collaborative Ocular Melanoma Study Group. The COMS randomized trial of iodine 125 brachytherapy for choroidal melanoma, III: initial mortality findings. COMS Report No. 18. Arch Ophthalmol 2001;119(7):969-982. Diener-West M, Hawkins BS, Markowitz JA, Schachat AP. A review of mortality from choroidal melanoma. II. A meta-analysis of 5-year mortality rates following enucleation, 1966 through 1988. Arch Ophthalmol 1992;110(2):245-250. Dorsky RI, Moon RT, Raible DW. Control of neural crest cell fate by the Wnt signalig pathway. Nature 1998; 396: 370-373. Elwood JM, Gallagher RP. Body site distribution of cutaneous malignant melanoma in relationship to patterns of sun exposure. Int J Cancer 1998; 78(3):276-280. Elwood JM, Jopson J. Melanoma and sun exposure: an overview of published studies. Int J Cancer 1997;73(2):198-203. Elwood M, Aitken JF, English DR. Prevention and screening. U: Balch CM, Houghton AN, Sober AJ, Soong SJ, urednici. Cutaneous melanoma. 4. izdanje. St Louis (MO): Quality Medical Publishing; 2003. str. 93.-120. Essner R, Conforti A, Kelley MC, Wanek L, Stern S, Glass E, Morton DL. Efficacy of lymphatic mapping, sentinel lymphadenectomy, and selective complete lymph node dissection as a therapeutic procedure for early-stage melanoma. Ann Surg Oncol 1999;6(5):442-449. Evans RD, Kopf AW, Lew RA, Rigel DS, Bart RS, Friedman RJ, Rivers JK. Risk factors for the development of malignant melanoma-I: Review of case-control studies. J Dermatol Surg Oncol 1988;14(4):393-408.

148

Faries MB, Gupta RK, Ye X, Hsueh EC, Morton DL. Melanoma-inhibiting activity assay predicts survival in patients receiving a therapeutic cancer vaccine after complete resection of American Joint Committee on Cancer stage III melanoma. Ann Surg Oncol 2004;11(1):85-93. Farthmann B, Eberle J, Krasagakis K, Gstottner M, Wang N, Bisson S, Orfanos CE. RT-PCR for tyrosinase-mRNA-positive cells in peripheral blood: evaluation strategy and correlation with known prognostic markers in 123 melanoma patients. J Invest Dermatol 1998;110(3):263-267. Feezor RJ, Copeland EM, Hochwald SN. Significance of micrometastases in colorectal cancer. Ann Surg Oncol 2002; 9(10):944-953. Ferlay J, Bray F, Pisani P, Parkin DM. GLOBOCAN 2002: Cancer incidence, mortality and prevalence worldwide. IARC CancerBase No. 5. version 2.0, IARC Press, Lyon, Francuska 2004. Fidler IJ. Metastasis: quantitative analysis of distribution and fate of tumor emboli labeled with 125I-5-iodo-2’-deoxyuridine. J Natl Cancer Inst 1970;45(4):773-782. Ford D, Bliss JM, Swerdlow AJ, Armstrong BK, Franceschi S, Green A, Holly EA, Mack T, MacKie RM, Osterlind A, i sur. Risk of cutaneous melanoma associated with a family history of the disease. The International Melanoma Analysis Group (IMAGE). Int J Cancer 1995; 62(4):377-381. Fuse N, Yasumoto K, Suzuki H, Takahashi K, Shibahara S. Identification of a melanocyte-type promoter of the microphthalmia-associated transcription factor gene. Biochem Biophys Res Comun 1996; 219: 702-707. Fuse N, Yasumoto K, Takeda K, Amae S, Yoshizawa M, Udono T, Takahashi K, Tamai M, Tomita Y, Tachibana M, Shibahara S. Molecular cloning of cDNA encoding a novel microphthalmia-associated transcription factor isoform with a distinct amino-terminus. J Biochem 1999; 126: 1043-1051. Garbe C, Buttner P, Bertz J, Burg G, d'Hoedt B, Drepper H, Guggenmoos-Holzmann I, Lechner W, Lippold A, Orfanos CE, i sur. Primary cutaneous melanoma. Identification of prognostic groups and estimation of individual prognosis for 5093 patients. Cancer 1995; 75(10):2484-2491. Garbe C, McLeod GR, Buettner PG. Time trends of cutaneous melanoma in Queensland, Australia and Central Europe. Cancer 2000; 89(6):1269-1278. Gershenwald JE, Balch CM, Soong SJ, Thompson JF. Prognostic factors and natural history. U: Balch CM, Houghton AN, Sober AJ, Soong SJ, urednici. Cutaneous melanoma. 4. izdanje. St Louis (MO): Quality Medical Publishing; 2003. str. 25.-54. Gershenwald JE, Thompson W, Mansfield PF, Lee JE, Colome MI, Tseng CH, Lee JJ, Balch CM, Reintgen DS, Ross MI. Multi-institutional melanoma lymphatic mapping experience: the prognostic value of sentinel lymph node status in 612 stage I or II melanoma patients. J Clin Oncol 1999;17(3):976-983.

149

Gershenwald JE, Tseng CH, Thompson W, Mansfield PF, Lee JE, Bouvet M, Lee JJ, Ross MI. Improved sentinel lymph node localization in patients with primary melanoma with the use of radiolabeled colloid. Surgery 1998;124(2):203-210. Ghossein RA, Bhattacharya S. Molecular detection and characterization of circulating tumor cells and micrometastases in prostatic, urothelial, and renal cell carcinomas. Semin Surg Oncol 2001;20(4):304-311. Ghossein RA, Coit D, Brennan M, Zhang ZF, Wang Y, Bhattacharya S, Houghton A, Rosai J. Prognostic significance of peripheral blood and bone marrow tyrosinase messenger RNA in malignant melanoma. Clin Cancer Res 1998;4(2):419-428. Gilbey AM, Burnett D, Coleman RE, Holen I. The detection of circulating breast cancer cells in blood. J Clin Pathol 2004;57(9):903-911. Gilchrest BA, Eller MS, Geller AC, Yaar M. The pathogenesis of melanoma induced by ultraviolet radiation. N Engl J Med 1999; 340(17):1341-1348. Glaser R, Rass K, Seiter S, Hauschild A, Cristophers E, Tilgen W. Detection of circulating melanoma cells by specific amplification of tyrosinase complementary DNA is not a reliable tumor marker in melanoma patients: a clinical two-center study. J Clin Oncol 1997;15(8):2818-2825. Gogas H, Kefala G, Bafaloukos D, Frangia K, Polyzos A, Pectasides D, Tsoutsos D, Panagiotou P, Ioannovich J, Loukopoulos D. Prognostic significance of the sequential detection of circulating melanoma cells by RT-PCR in high-risk melanoma patients receiving adjuvant interferon. Br J Cancer 2002;87(2):181-186. Goldstein AM, Fraser MC, Clark WH, Tucker MA. Age at diagnosis and transmission of invasive melanoma in 23 families with cutaneous malignant melanoma/dysplastic nevi. J Natl Cancer Inst 1994; 86(18):1385-1390. Goydos JS, Patel KN, Shih WJ, Lu SE, Yudd AP, Kempf JS, Bancila E, Germino FJ. Patterns of recurrence in patients with melanoma and histologically negative but RT-PCR-positive sentinel lymph nodes. J Am Coll Surg 2003; 196(2):196-204. Granter SR, Weilbaecher KN, Quigley C, Fisher DE. Role for microphthalmia transcription factor in the diagnosis of metastatic malignant melanoma. Appl Immunohistochem 2002; 10: 47-51. Greene MH, Clark WH, Tucker MA, Kraemer KH, Elder DE, Fraser MC. High risk of malignant melanoma in melanoma-prone families with dysplastic nevi. Ann Intern Med 1985; 102(4):458-465. Guerry D, Synnestvedt M, Elder DE, Schultz D. Lessons from tumor progression: the invasive radial growth phase of melanoma is common, incapable of metastasis, and indolent. J Invest Dermatol 1993;100(3):342S-345S. Halpern AC, Marghoob AA, Sober AJ. Clinical characteristics. U: Balch CM, Houghton AN, Sober AJ, Soong SJ, urednici. Cutaneous melanoma. 4. izdanje. St Louis (MO): Quality Medical Publishing; 2003. str. 135.-159.

150

Hansen CB, Wadge LM, Lowstuter K, Boucher K, Leachman SA. Clinical germline genetic testing for melanoma. Lancet Oncol 2004;5(5):314-319. Harpio R, Einarsson R. S100 proteins as cancer biomarkers with focus on S100B in malignant melanoma. Clin Biochem 2004;37(7):512-518. Hearing VJ, Jimenez M. Mammalian tyrosinase-the critical regulatory control point in melanocyte pigmentation. Int J Biochem 1987;19(12):1141-1147. Hemesath TJ, Price ER, Takemoto C, Badalian T, Fisher DE. MAP kinase links the transcription factor microphthalmia to c-Kit signaling in melanocytes. Nature 1998; 391: 298-301. Hemesath TJ, Steingrimsson E, McGill G, Hansen MJ, Vaught J, Hodgkinson C, Arnheiter H, Copeland NG, Jenkins NA, Fisher DE. Microphthalmia, a critical factor in melanocyte development, defines a discrete transcription factor family. Genes Dev 1994; 8: 2770-2780. Hodgkinson CA, Moore KJ, Nakayama A, Steingrimsson E, Copeland NG, Jenkins NA, Arnheiter H. Mutations at the mouse microphthalmia locus are associated with defects in a gene encoding a novel basic-helix-loop-helix-zipper protein. Cell 1993; 74: 395-404. Hodgkinson CA, Nakayama A, Li H, Swenson LB, Opdecamp K, Asher JH, Arnheiter H, Glaser T. Mutations at the anophthalmic white locus in Syrian hamsters: haploinsufficiency in the Mitf gene mimics human Waardenburg syndrome type 2. Hum Mol Genet 1998; 7:703-708. Hoon DS, Bostick P, Kuo C, Okamoto T, Wang HJ, Elashoff R, Morton DL. Molecular markers in blood as surrogate prognostic indicators of melanoma recurrence. Cancer Res 2000;60(8):2253-2257. Hoon DS, Kuo CT, Wascher RA, Fournier P, Wang HJ, O’Day SJ. Molecular detection of metastatic melanoma cells in cerebrospinal fluid in melanoma patients. J Invest Dermatol 2001;117:375-378. Hoon DS, Wang Y, Dale PS, Conrad AJ, Schmid P, Garrison D, Kuo C, Foshag LJ, Nizze AJ, Morton DL. Detection of occult melanoma cells in blood with a multiple-marker polymerase chain reaction assay. J Clin Oncol 1995;13(8):2109-2116. Hrvatski zavod za javno zdravstvo, služba za epidemiologiju. Incidencija raka u Hrvatskoj 1976. – 2002., bilteni br. 1 – 27. Zagreb: Hrvatski zavod za javno zdravstvo, služba za epidemiologiju; 1978. - 2004. Isager P, Ehlers N, Overgaard J. Prognostic factors for survival after enucleation for choroidal and ciliary body melanomas. Acta Ophthalmol Scand 2004; 82(5):517-525. Iversen K, Robins RE. Mucosal malignant melanomas. Am J Surg 1980; 139(5):660-664. Janssens N, Janicot M, Perera T, Bakker A. Housekeeping genes as internal standards in cancer research. Mol Diagn 2004;8(2):107-113.

151

Jemal A, Devesa SS, Hartge P, Tucker MA. Recent trends in cutaneous melanoma incidence among whites in the United States. J Natl Cancer Inst 2001; 93(9):678-683. Jeng KS, Sheen IS, Tsai YC. Circulating messenger RNA of alpha-fetoprotein: a possible risk factor of recurrence after resection of hepatocellular carcinoma. Arch Surg 2004;139(10):1055-1060. Johnson PW, Burchill SA, Selby PJ. The molecular detection of circulating tumour cells. Br J Cancer 1995;72(2):268-276. Jung FA, Buzaid AC, Ross MI, Woods KV, Lee JJ, Albitar M, Grimm EA. Evaluation of tyrosinase mRNA as a tumor marker in the blood of melanoma patients. J Clin Oncol 1997;15(8):2826-2831. Karakousis CP, Balch CM, Urist MM, Ross MM, Smith TJ, Bartolucci AA. Local recurrence in malignant melanoma: long-term results of the multiinstitutional randomized surgical trial. Ann Surg Oncol 1996; 3(5):446-452. Kashani-Sabet M. Melanoma genomics. Curr Oncol Rep 2004;6(5):401-405. Kefford RF, Newton Bishop JA, Bergman W, Tucker MA. Counseling and DNA testing for individuals perceived to be genetically predisposed to melanoma: A consensus statement of the Melanoma Genetics Consortium. J Clin Oncol 1999;17(10):3245-3251. Kelley MC, Gupta RK, Hsueh EC, Yee R, Stern S, Morton DL. Tumor-associated antigen TA90 immune complex assay predicts recurrence and survival after surgical treatment of stage I-III melanoma. J Clin Oncol 2001;19(4):1176-1182. Kelley MC, Jones RC, Gupta RK, Yee R, Stern S, Wanek L, Morton DL. Tumor-associated antigen TA-90 immune complex assay predicts subclinical metastasis and survival for patients with early stage melanoma. Cancer 1998;83(7):1355-1361. Kelly JW, Sagebiel RW, Calderon W, Murillo L, Dakin RL, Blois MS. The frequency of local recurrence and microsatellites as a guide to reexcision margins for cutaneous malignant melanoma. Ann Surg 1984; 200(6):759-763. Kienle P, Weitz J, Klaes R, Koch M, Benner A, Lehnert T, Herfarth C, von Knebel Doeberitz M. Detection of isolated disseminated tumor cells in bone marrow and blood samples of patients with hepatocellular carcinoma. Arch Surg 2000;135(2):213-218. King R, Weilbaecher KN, McGill G, Cooley E, Mihm M, Fisher DE. Microphthalmia transcription factor a sensitive and specific melanocyte marker for melanoma diagnosis. Am J Pathol 1999; 155: 731-738. Kirkwood JM, Ibrahim JG, Sosman JA, Sondak VK, Agarwala SS, Ernstoff MS, Rao U. High-dose interferon alfa-2b significantly prolongs relapse-free and overall survival compared with the GM2-KLH/QS-21 vaccine in patients with resected stage IIB-III melanoma: results of intergroup trial E1694/S9512/C509801. J Clin Oncol 2001;19(9):2370-2380.

152

Koch SE, Lange JR. Amelanotic melanoma: the great masquerader. J Am Acad Dermatol 2000; 42: 731-734. Koyanagi K, Kuo C, Nakagawa T, Mori T, Ueno H, Lorico AR Jr, Wang HJ, Hseuh E, O'Day SJ, Hoon DS. Multimarker quantitative real-time PCR detection of circulating melanoma cells in peripheral blood: relation to disease stage in melanoma patients. Clin Chem 2005; 51(6):981-988.a Koyanagi K, O'Day SJ, Gonzalez R, Lewis K, Robinson WA, Amatruda TT, Wang HJ, Elashoff RM, Takeuchi H, Umetani N, Hoon DS. Serial monitoring of circulating melanoma cells during neoadjuvant biochemotherapy for stage III melanoma: outcome prediction in a multicenter trial. J Clin Oncol 2005; 23(31):8057-8064.b Kraemer KH, Lee MM, Andrews AD, Lambert WC. The role of sunlight and DNA repair in melanoma and nonmelanoma skin cancer. The xeroderma pigmentosum paradigm Arch Dermatol 1994; 130(8):1018-1021. Kraemer KH, Tucker M, Tarone R, Elder DE, Clark WH. Risk of cutaneous melanoma in dysplastic nevus syndrome types A and B. N Engl J Med 1986; 315(25):1615-1616. Krementz ET, Feed RJ, Coleman WP, Sutherland CM, Carter RD, Campbell M. Acral lentiginous melanoma. A clinicopathologic entity. Ann Surg 1982;195(5):632-645. Kretschmer L, Preusser KP, Neumann C. Locoregional cutaneous metastasis in patients with therapeutic lymph node dissection for malignant melanoma: risk factors and prognostic impact. Melanoma Res 2002; 12(5):499-504. Kruger S, Garbe C, Buttner P, Stadler R, Guggenmoos-Holzmann I, Orfanos CE. Epidemiologic evidence for the role of melanocytic nevi as risk markers and direct precursors of cutaneous malignant melanoma. Results of a case control study in melanoma patients and nonmelanoma control subjects. J Am Acad Dermatol 1992; 26(6):920-926. Kulik J, Nowecki ZI, Rutkowski P, Ruka W, Rochowska M, Skurzak H, Siedlecki JA. Detection of circulating melanoma cells in peripheral blood by a two-marker RT-PCR assay. Melanoma Res 2001;11(1):65-73. Kunter U, Buer J, Probst M, Duensing S, Dallmann I, Grosse J, Kirchner H, Schluepen EM, Volkenandt M, Ganser A, Atzpodien J. Peripheral blood tyrosinase messenger RNA detection and survival in malignant melanoma. J Natl Cancer Inst 1996;88(9):590-594. Kurusu Y. Yamashita J. Ogawa M. Detection of circulating tumor cells by reverse transcriptase-polymerase chain reaction in patients with resectable non-small-cell lung cancer. Surgery 1999;126(5):820-826. Kwon BS, Haq AK, Pomerantz SH, Halaban R. Isolation and sequence of a cDNA clone for human tyrosinase that maps at the mouse c-albino locus. Proc Natl Acad Sci USA 1987;84(21):7473-7477. Lacroix J. Becker HD. Woerner SM. Rittgen W. Drings P. von Knebel Doeberitz M. Sensitive detection of rare cancer cells in sputum and peripheral blood samples of patients with lung cancer by preproGRP-specific RT-PCR. Int J Cancer 2001;92(1):1-8.

153

Lee M, Goodall J, Versategui C, Ballotti R, Goding CR. Direct regulation of the microphthalmia promoter by Sox10 links Waardenburg-Shah syndrome (WS4)-associated hypopigmentation and deafness to WS2. J Biol Chem 2000; 275: 37978-37983. Lens MB, Dawes M, Newton-Bishop JA, Goodacre T. Tumour thickness as a predictor of occult lymph node metastases in patients with stage I and II melanoma undergoing sentinel lymph node biopsy. Br J Surg 2002; 89(10):1223-1227. Lens MB, Newton-Bishop JA, Boon AP. Desmoplastic malignant melanoma: a systematic review. Br J Dermatol 2005; 152 (4): 673-678. Leon P, Daly JM, Synnestvedt M, Schultz DJ, Elder DE, Clark WH. The prognostic implications of microscopic satellites in patients with clinical stage I melanoma. Arch Surg 1991; 126(12):1461-1468. Li G, Passebosc-Faure K, Gentil-Perret A, Lambert C, Genin C, Tostain J. Cadherin-6 gene expression in conventional renal cell carcinoma: a useful marker to detect circulating tumor cells. Anticancer Res 2005;25(1A):377-381. Li KKC, Goodall J, Goding CR, Liao SK, Wang CH, Lin YC, Hiraga H, Nojima T, Nagashima K, Schaefer KL, Lee KAW. The melanocyte inducing factor MITF is stably expressed in cell lines from human clear cell sarcoma. Br J Cancer 2003; 89: 1072-1078. Li N, Mangini J, Bhawan J. New prognostic factors of cutaneous melanoma: a review of the literature. J Cutan Pathol 2002;29(6):324-340. Li W, Stall A, Shivers SC, Lin J, Haddad F, Messina J, Glass LF, Lyman G, Reintgen DS. Clinical relevance of molecular staging for melanoma: comparison of RT-PCR and immunohistochemistry staining in sentinel lymph nodes of patients with melanoma. Ann Surg 2000;231(6):795-803. Lister JA, Robertson CP, Lepage T, Johnson SL, Raible DW. nacre encodes a zebrafish microphthalmia-related protein that regulates neural-crest-derived pigment cell fate. Developement 1999; 126: 3757-3767. Liu XZ, Newton VE, Read AP. Waardenburg syndrome type II: phenotypic findings and diagnostic criteria. Am J Med Genet 1995; 55: 95-100. Liu Y, Wu MC, Qian GX, Zhang BH. Detection of circulating hepatocellular carcinoma cells in peripheral venous blood by reverse transcription-polymerase chain reaction. Hepatobiliary Pancreat Dis Int 2002;1(1):72-76. Mangini J, Li N, Bhawan J. Immunohistochemical markers of melanocytoc lesions: a review of their diagnostic usefulness. Am J Dermatopathol 2002; 24(3):270-281. Manola J, Atkins M, Ibrahim J, Kirkwood J. Prognostic factors in metastatic melanoma: a pooled analysis of Eastern Cooperative Oncology Group trials. J Clin Oncol 2000;18(22):3782-3793.

154

Marghoob AA, Slade J, Kopf AW, Salopek TG, Rigel DS, Bart RS. Risk of developing multiple primary cutaneous melanomas in patients with the classic atypical-mole syndrome: a case-control study. Br J Dermatol 1996;135(5):704-11. Margolese RG, Fisher B, Hortobagyi GN, Bloomer WD. Neoplasms of the breast. U: Kufe DW, Pollock RE, Weichselbaum RR, Bast RC, Gansler TS, Holland JF, Frei E, urednici. Cancer medicine. 6. izdanje. Hamilton (Kanada): BC Decker Inc; 2003. Marrett LD, King WD, Walter SD, From L. Use of host factors to identify people at high risk for cutaneous malignant melanoma. CMAJ 1992; 147(4):445-453. Martinez-Pineiro L, Rios E, Martinez-Gomariz M, Pastor T, de Cabo M, Picazo ML, Palacios J, Perona R. Molecular staging of prostatic cancer with RT-PCR assay for prostate-specific antigen in peripheral blood and lymph nodes: comparison with standard histological staging and immunohistochemical assessment of occult regional lymph node metastases. Eur Urol 2003;43(4):342-350. McKay MJ, Peters LJ, Ainslie J. Radiotherapy for distant metastases and clinical radiobiology of melanoma. U: Balch CM, Houghton AN, Sober AJ, Soong SJ, urednici. Cutaneous melanoma. 4. izdanje. St Louis (MO): Quality Medical Publishing; 2003. str. 573-586. McKiernan JM, Buttyan R, Bander NH, de la Taille A, Stifelman MD, Emanuel ER, Bagiella E, Rubin MA, Katz AE, Olsson CA, Sawczuk IS. The detection of renal carcinoma cells in the peripheral blood with an enhanced reverse transcriptase-polymerase chain reaction assay for MN/CA9. Cancer 1999;86(3):492-497. McMasters KM. The Sunbelt Melanoma Trial. Ann Surg Oncol 2001;8(9 Suppl):41S-43S. Mellado B, Colomer D, Castel T, Munoz M, Carballo E, Galan M, Mascaro JM, Vives-Corrons JL, Grau JJ, Estape J. Detection of circulating neoplastic cells by reverse-transcriptase polymerase chain reaction in malignant melanoma: association with clinical stage and prognosis. J Clin Oncol 1996;14(7):2091-2097. Mellado B, Del Carmen Vela M, Colomer D, Gutierrez L, Castel T, Quinto L, Fontanillas M, Reguart N, Domingo-Domenech JM, Montagut C, Estape J, Gascon P. Tyrosinase mRNA in blood of patients with melanoma treated with adjuvant interferon. J Clin Oncol 2002;20(19):4032-4039. Mellado B, Gutierrez L, Castel T, Colomer D, Fontanillas M, Castro J, Estape J. Prognostic significance of the detection of circulating malignant cells by reverse transcriptase-polymerase chain reaction in long-term clinically disease-free melanoma patients. Clin Cancer Res 1999;5(7):1843-1848. Miettinen M, Fernandez M, Franssila K, Gatalica Z, Lasota J, Sarlomo-Rikala M. Microphthalmia transcription factor in the immunohistochemical diagnosis of metastatic melanoma - comparison with four other melanoma markers. Am J Surg Pathol 2001; 25: 205-211.

155

Miliotes G, Lyman GH, Cruse CW, Puleo C, Albertini PA, Rapaport D, Glass F, Fenske N, Soriano T, Cuny C, Van Voorhis N, Reintgen D. Evaluation of new putative tumor markers for melanoma. Ann Surg Oncol 1996;3(6):558-563. Miller SJ, Balch CM. Biopsy. U: Balch CM, Houghton AN, Sober AJ, Soong SJ, urednici. Cutaneous melanoma. 4. izdanje. St Louis (MO): Quality Medical Publishing; 2003. str. 163-170. Miyajima Y, Kato K, Numata S, Kudo K, Horibe K. Detection of neuroblastoma cells in bone marrow and peripheral blood at diagnosis by the reverse transcriptase-polymerase chain reaction for tyrosine hydroxylase mRNA. Cancer 1995;75(11):2757-2761. Mochii M, Mazaki Y, Mizuno N, Hayashi H, Eguchi G. Role of mitf in differentiation of chicken pigmented epithelial cells. Develop Biol 1998; 193: 47-62. a Mochii M, Ono T, Matsubara Y, Eguchi G. Spontaneous trans-difdferentiation of quail pigmented epithelium cell is accompanied by a mutation in the Mitf gene. Develop Biol 1998; 196: 145-159. b Molnar B, Sipos F, Galamb O, Tulassay Z. Molecular detection of circulating cancer cells. Role in diagnosis, prognosis and follow-up of colon cancer patients. Dig Dis 2003; 21(4):320-325. Moore KJ. Insight into the microphthalmia gene. Trends Genet 1995; 11:442-448. Morton DL, Bostick PJ. Will the true sentinel node please stand? Ann Surg Oncol 1999;6(1):12-14. Mou DC, Cai SL, Peng JR, Wang Y, Chen HS, Pang XW, Leng XS, Chen WF. Evaluation of MAGE-1 and MAGE-3 as tumour-specific markers to detect blood dissemination of hepatocellular carcinoma cells. Br J Cancer 2002;86(1):110-116. Muhlbauer M, Langenbach N, Stolz W, Hein R, Landthaler M, Buettner R, Bosserhoff AK. Detection of melanoma cells in the blood of melanoma patients by melanoma-inhibitory activity (MIA) reverse transcription-PCR. Clin Cancer Res 1999;5(5):1099-1105. NIH Consensus conference. Diagnosis and treatment of early melanoma. JAMA 1992; 268(10):1314-1319. Noppen C, Luescher U, Zuber M, Spagnoli GC, Schaefer C. Detection of tumor associated antigen gene expression in peripheral blood by RT-PCR in combination with the mRNA isolation kit for blood/bone marrow. Biochemica 1997;4:11-13. O’Rourke TJ. Tumor markers. U: Calabresi P, Schein PS, urednici. Medical oncology: basic principles and clinical management of cancer, 2. izdanje. New York: McGraw-Hill; 1993. str. 163-172. Opdecamp K, Vancooren P, Riviere M, Arnheiter H, Motta R, Szpier J, Szpier C. The rat microphthalmia-associated transcription factor gene (Mitf) maps at 4q34-q41 and is mutated in the mib rats. Mammal Genome 1998; 9:617-621.

156

O'Reilly F, Brat DJ, McAlpine BE, Grossniklaus HE, Folpe AL, Arbiser JL. Microphthalmia transcription factor immunohistochemistry: a useful diagnostic marker in the diagnosis and detection of cutaneous melanoma, sentinel lymph node metastases, and extracutaneous melanocytic neoplasms. J Am Acad Dermatol 2001; 45: 414-419. Parkin DM, Whelan SL, Ferlay J, Teppo L, Thomas DB, urednici. Cancer incidence in five continents, vol. 8, IARC scientific publication br. 155. Lyon, Francuska 2002. Paterlini P. Clinical implications of spontaneous and iatrogenic dissemination of tumor cells in patients with primary liver cancer. C R Seances Soc Biol Fil 1998;192(2):283-288. Petrinović R, Demirović J, Juretić A. Laboratorijska dijagnostika malignih tumora. U Šamija M, urednik. Onkologija. Zagreb: Medicinska naklada; 2000. str. 92-99. Pfleiderer C, Zoubek A, Gruber B, Kronberger M, Ambros PF, Lion T, Fink FM, Gadner H, Kovar H. Detection of tumour cells in peripheral blood and bone marrow from Ewing tumour patients by RT-PCR. Int J Cancer 1995;64(2):135-139. Pollock PA, Weeraratna A, Trent JM. Genetics and molecular staging. U: Balch CM, Houghton AN, Sober AJ, Soong SJ, urednici. Cutaneous melanoma. 4. izdanje. St Louis (MO): Quality Medical Publishing; 2003. str. 687.-712. Price ER, Ding HF, Badalian T, Bhattacharyal S, Takemoto C, Yao TP, Hamesath TJ, Fisher DE. Lineage-specific signaling in melanocytes: c-Kit stimulation recruits p300/CBP to microphthalmia. J Biol Chem 1998; 29: 17938-17986. Proebstle TM, Jiang W, Hogel J, Keilholz U, Weber L, Voit C. Correlation of positive RT-PCR for tyrosinase in peripheral blood of malignant melanoma patients with clinical stage, survival and other risk factors. Br J Cancer 2000;82(1):118-123. Qi ZL, Xiao L, Gao YT, Du JM, Jing L. Expression and clinical significance of surfactant protein D mRNA in peripheral blood of lung cancer patients. Ai Zheng 2002;21(7):772-775. Quereux G, Denis M, Khammari A, Lustenberger P, Dreno B. Prognostic value of tyrosinase reverse-transcriptase polymerase chain reaction in metastatic melanoma. Dermatology 2001;203(3):221-225. Quinn MJ, Crotty KA, Thompson JF, Coates AS, O'Brien CJ, McCarthy WH. Desmoplastic and desmoplastic neurotropic melanoma: experience with 280 patients. Cancer 1998; 83(6):1128-1135. Ranieri JM, Wagner JD, Wiebke EA, Azuaje R, Smith ML, Wenck S, Daggy J, Coleman JJ. Lack of prognostic importance of reverse-transcriptase polymerase chain reaction detection of circulating messenger RNA in patients with melanoma. Plast Reconstr Surg 2005;115(4):1058-1063. Rehli M, Den Elzen N, Cassady AI, Ostrowski MC, Hume DA. Cloning and characterization of the murine genes for bHLH-ZIP transcription factors TFEC and TFEB reveal a common gene organization for all MiT subfamily members. Genomics 1999; 56: 111-120.

157

Reinhold U, Ludtke-Handjery HC, Schnautz S, Kreysel HW, Abken H. The analysis of tyrosinase-specific mRNA in blood samples of melanoma patients by RT-PCR is not a useful test for metastatic tumor progression. J Invest Dermatol 1997;108(2):166-169. Reintgen D, Einstein AB. The role of research in cost containment. Cancer Control 1995;2(5):429-431. Reintgen DS, Cruse CW, Wells KE, Saba HI, Fabri PJ. The evaluation of putative tumor markers for malignant melanoma. Ann Plast Surg 1992;28(1):55-59. Reintgen DS, McCarty KS, Woodard B, Cox E, Seigler HF. Metastatic malignant melanoma with an unknown primary. Surg Gynecol Obstet 1983; 156(3):335-340. Reintgen DS, Thompson JF, Gershenwald JE. Intraoperative mapping and sentinel node technology. U: Balch CM, Houghton AN, Sober AJ, Soong SJ, urednici. Cutaneous melanoma. 4. izdanje. St Louis (MO): Quality Medical Publishing; 2003. str. 353-377. Reynolds SR, Albrecht J, Shapiro RL, Roses DF, Harris MN, Conrad A, Zeleniuch-Jacquotte A, Bystryn JC. Changes in the presence of multiple markers of circulating melanoma cells correlate with clinical outcome in patients with melanoma. Clin Cancer Res 2003;9(4):1497-1502. Rhodes AR, Wood WC, Sober AJ, Mihm MC. Nonepidermal origin og malignant melanoma associated with giant congenital nevocellular nevus. Plast Reconstr Surg 1981; 6786):782-790. Ries LAG, Eisner MP, Kosary CL, Hankey BF, Miller BA, Clegg L, Mariotto A, Feuer EJ, Edwards BK (urednici). SEER Cancer Statistics Review, 1975-2002, National Cancer Institute. Bethesda, MD, http://seer.cancer.gov/csr/1975_2002/, based on November 2004 SEER data submission, posted to the SEER web site 2005. Rimoldi D, Lemoine R, Kurt AM, Salvi S, Berset M, Matter M, Roche B, Cerottini JP, Guggisberg D, Krischer J, Braun R, Willi JP, Antonescu C, Slosman D, Lejeune FJ, Lienard D; Groupe Melanome Lemanique. Detection of micrometastases in sentinel lymph nodes from melanoma patients: direct comparison of multimarker molecular and immunopathological methods. Melanoma Res 2003;13(5):511-520. Ringel MD. Molecular detection of thyroid cancer: differentiating “signal” and “noise” in clinical assays. J Clin Endocrinol Metab 2004;89(1):29-32. Ross MI, Balch CM, Cascinelli N, Edwards MJ. Excision of primary melanoma. U: Balch CM, Houghton AN, Sober AJ, Soong SJ, urednici. Cutaneous melanoma. 4. izdanje. St Louis (MO): Quality Medical Publishing; 2003. str. 209-230.a Ross MI, Stern SJ. Mucosal melanomas. U: Balch CM, Houghton AN, Sober AJ, Soong SJ, urednici. Cutaneous melanoma. 4. izdanje. St Louis (MO): Quality Medical Publishing; 2003. str. 297-308.b Ruiter DJ, Brocker EB. Immunohistochemistry in the evaluation of melanocytic tumors. Semin Diagn Pathol 1993;10(1):76-91.

158

Sahel JA, Polans A, Mehta MP, Auchter RM, Albert DM. Intraocular melanoma. U: DeVita VT Jr, Hellman S, Rosenberg SA, urednici. Cancer: Principles and Practice of Oncology. 6. izdanje. Philadelphia (PA): Lippincott Williams & Wilkins; 2001. str. 2070-2090. Saito T, Kobayashi M, Harada R, Uemura Y, Taguchi H. Sensitive detection of small cell lung carcinoma cells by reverse transcriptase-polymerase chain reaction for prepro-gastrin-releasing peptide mRNA. Cancer 2003;97(10):2504-2511. Salti GI, Manougian T, Farolan M, Shilkaitis A, Majumdar D, Das Gupta TK. Microphthalmia transcription factor: a new prognostic marker in intermediate-thickness cutaneous malignant melanoma. Cancer Res 2000; 60: 5012-5016. Šamija M, Orešić V, Solarić M I suradnici. Rak prostate. Zagreb: Medicinska naklada; 2002. Saornil MA. Iris colour and uveal melanoma. Can J Ophthalmol 2004;39(4):448-452. Schamhart DH, Maiazza R, Kurth KH. Identification of circulating prostate cancer cells: a challenge to the clinical implementation of molecular biology (review). Int J Oncol 2005;26(3):565-577. Schittek B, Blaheta HJ, Florchinger G, Sauer B, Garbe C. Increased sensitivity for the detection of malignant melanoma cells in peripheral blood using an improved protocol for reverse transcription-polymerase chain reaction. Br J Dermatol 1999;141(1):37-43.b Schittek B, Bodingbauer Y, Ellwanger U, Blaheta HJ, Garbe C. Amplification of MelanA messenger RNA in addition to tyrosinase increases sensitivity of melanoma cell detection in peripheral blood and is associated with the clinical stage and prognosis of malignant melanoma. Br J Dermatol 1999;141(1):30-36.a Schleiermacher G, Peter M, Oberlin O, Philip T, Rubie H, Mechinaud F, Sommelet-Olive D, Landman-Parker J, Bours D, Michon J, Delattre O. Increased risk of systemic relapses associated with bone marrow micrometastasis and circulating tumor cells in localized ewing tumor. J Clin Oncol 2003;21(1):85-91. Schmidt H, Sorensen BS, von der Maase H, Bang C, Agger R, Hokland M, Nexo E. Quantitative RT-PCR assessment of melanoma cells in peripheral blood during immunotherapy for metastatic melanoma. Melanoma Res 2002;12:585-592. Schrader AJ, Probst-Kepper M, Grosse J, Kunter U, Franzke A, Sel S, Atzpodien E, Buer J. Tumour microdissemination and survival in metastatic melanoma. Anticancer Res 2000;20(5B):3619-3624. Schwartzentruber DJ, Rosenberg SA. Interleukins. U: Balch CM, Houghton AN, Sober AJ, Soong SJ, urednici. Cutaneous melanoma. 4. izdanje. St Louis (MO): Quality Medical Publishing; 2003. str. 623-643. Scotto J, Fraumeni JF Jr, Lee JA. Melanomas of the eye and other noncutaneous sites: epidemiologic aspects. J Natl Cancer Inst 1976; 56(3):489-491.

159

Seidensticker MJ, Behrens J. Biochemical interactions in the wnt pathway. Biochim Biophys Acta 2000; 1495: 169-182. Selzer E, Wacheck V, Lucas T, Heere-Rees E, Wu M, Weilbaecher KN, Schlegel W, Valent P, Wrba F, Pehamberger H, Fisher D, Jansen B. The melanocyte-specific isoform of the microphthalmia transcription factor affects the phenotype of human melanoma. Cancer Res 2002; 62:2098-2103. Serrone L, Zeuli M, Sega FM, Cognetti F. Dacarbazine-based chemotherapy for metastatic melanoma: thirty-year experience overview. J Exp Clin Cancer Res 2000;19(1):21-34. Severi G, Giles GG, Robertson C, Boyle P, Autier P. Mortality from cutaneous melanoma: evidence for contrasting trends between populations. Br J Cancer 2000;82(11):1887-1891. Shariat SF, Roudier MP, Wilcox GE, Kattan MW, Scardino PT, Vessella RL, Erdamar S, Nguyen C, Wheeler TM, Slawin KM. Comparison of immunohistochemistry with reverse transcription-PCR for the detection of micrometastatic prostate cancer in lymph nodes. Cancer Res 2003;63(15):4662-4670. Sheen IS, Jeng KS, Shih SC, Wang PC, Chang WH, Wang HY, Shyung LR, Lin SC, Kao CR, Tsai YC, Wu TY. Does surgical resection of hepatocellular carcinoma accelerate cancer dissemination? World J Gastroenterol 2004;10(1):31-36. Sheffield MV, Yee H, Dorvault CC, Weilbaecher KN, Eltoum IA, Siegal GP, Fisher DE, Chhieng DC. Comparison of five antibodies as markers in the diagnosis of melanoma in cytologic preparations. Am J Clin Pathol 2002;118(6):930-936. Shibahara S, Takeda K, Yasumoto K, Udono T, Watanabe K, Saito H, Takahashi K. Microphthalmia-associated transcription factor (MITF): multiplicity in structure, function, and regulation. J Invest Dermatol Symp Proc 2001; 6: 99-104. Shibahara S. Yasumoto KI. Amae S. Udono T. Watanabe KI. Saito H. Takeda K. Regulation of pigment cell-specific gene expression by MITF. Pigm Cell Res 2000; 13: 98-102. (Suppl 8) Shimazui T, Yoshikawa K, Uemura H, Kawamoto R, Kawai K, Uchida K, Hirao Y, Saga S, Akaza H. Detection of cadherin-6 mRNA by nested RT-PCR as a potential marker for circulating cancer cells in renal cell carcinoma. Int J Oncol 2003;23(4):1049-1054. Shivers SC, Wang X, Li W, Joseph E, Messina J, Glass LF, DeConti R, Cruse CW, Berman C, Fenske NA, Lyman GH, Reintgen DS. Molecular staging of malignant melanoma: correlation with clinical outcome. JAMA 1998;280(16):1410-1415. Singh AD, Rennie IG, Seregard S, Giblin M, McKenzie J. Sunlight exposure and pathogenesis of uveal melanoma. Surv Ophthalmol 2004;49(4):419-428. Singh AD, Topham A. Incidence of uveal melanoma in the United States: 1973-1997. Ophthalmology 2003;110(5):956-961. Singletary SE, Tucker SL, Boddie AW Jr. Multivariate analysis of prognostic factors in regional cutaneous metastases of extremity melanoma. Cancer 1988;61(7):1437-1440.

160

Sirott MN, Bajorin DF, Wong GY, Tao Y, Chapman PB, Templeton MA, Houghton AN. Prognostic factors in patients with metastatic malignant melanoma. A multivariate analysis. Cancer 1993;72(10):3091-3098. Smith B, Selby P, Southgate J, Pittman K, Bradley C, Blair GE. Detection of melanoma cells in peripheral blood by means of reverse transcriptase and polymerase chain reaction. Lancet 1991;338(8777):1227-1229. Smith DR. Gel electrophoresis of DNA. U: Rapley R, Walker JM, urednici. Molecular biomethods handbook. 1. izdanje. Totowa (NJ): Humana Press; 1998. str. 17-33. Sotomayor MG, Yu H, Antonia S, Sotomayor EM, Pardoll DM. Advances in gene therapy for malignant melanoma. Cancer Control 2002;9(1):39-48. Spatz A, Calonje E, Handfield-Jones S, Barnhill RL. Spitz tumors in children: a grading system for risk stratification. Arch Dermatol 1999; 135(3):282-285. Stahlecker J, Gauger A, Bosserhoff A, Buttner R, Ring J, Hein R. MIA as a reliable tumor marker in the serum of patients with malignant melanoma. Anticancer Res 2000;20(6D):5041-5044. Stam-Posthuma JJ, van Duinen C, Scheffer E, Vink J, Bergman W. Multiple primary melanomas. J Am Acad Dermatol 2001; 44(1):22-27. Su SL, Boynton AL, Holmes EH, Elgamal AA, Murphy GP. Detection of extraprostatic prostate cells utilizing reverse transcription-polymerase chain reaction. Semin Surg Oncol 2000;18(1):17-28. Swerdlow AJ, Weinstock MA. Do tanning lamps cause melanoma? An epidemiologic assessment. J Am Acad Dermatol 1998; 38(1):89-98. Swetter SM. Dermatological perspectives of malignant melanoma. Surg Clin North Am 2003; 83(1): 77-95. Szenajch J, Jasinski B, Synowiec A, Kulik J, Chomicka M, Struzyna J, Nowecki Z, Rutkowski P, Ruka W, Kupsc W, Siedlecki JA, Wiktor-Jedrzejczak W. Prognostic value of multiple reverse transcription-PCR tyrosinase testing for circulating neoplastic cells in malignant melanoma. Clin Chem 2003; 49(9):1450-1457. Szenajch J, Jasinski B, Kozak A, Kulik J, Chomicka M, Struzyna J, Nowecki Z, Rutkowski P, Ruka W, Kupsc W, Siedlecki J, Wiktor-Jedrzejczak W. Multiple RT-PCR tyrosinase testing reveals that melanoma cells circulate in the blood of melanoma patients at the frequency more than 10 times below the detection threshold. Melanoma Res 2002;12(4):399-401. Szenajch J, Kozak A, Kruszewski AA, Babiej E, Chomicka M, Struzyna J, Wiktor-Jedrzejczak W. The effect of chemo- and chemoimmunotherapy on the presence of circulating melanoma cells in peripheral blood. Preliminary results. Acta Biochim Pol 1998;45(1):95-102.

161

Tachibana M, Perezjurado LA, Nakayama A, Hodgkinson CA, Li X, Schneider M, Miki T, Fex J, Francke U, Arnheiter H. Cloning of MITF, the human homolog of the mouse microphthalmia gene and assignment to chromosome 3p14.1-p12.3. Hum Mol Genet 1994; 3:553-557. Tachibana M, Takeda K, Nobukuni Y, Urabe K, Long JE, Meyers KA, Aaronson SA, Miki T. Ectopic expression of MITF, a gene for Waardenburg syndrome type 2, converts fibroblasts to cells with melanocyte characteristics. Nature Genet 1996; 14: 50-54. Tachibana M. A cascade of genes related to Waardenburg syndrome. J Invest Dermatol Symp Proc 1999; 4: 126-129. Tachibana M. Evidence to suggest that expression of MITF induces melanocyte differentiation and haploinsufficiency of MITF causes Waardenburd syndrome type 2A. Pigment Cell Res 1997; 10: 25-33. Tachibana M. MITF: a stream flowing for pigment cells. Pigment Cell Res 2000; 13: 230-240. Takeda K, Takernoto C, Kobayashi I, Watanabe A, Nobukuni Y, Fisher DE, Tachibana M. Ser298 of MITF, a mutation site in Waardenburg syndrome type 2, is a phosphorylation site with functional significance. Hum Mol Genet 2000; 9: 125-132. a Takeda K, Yasumoto K, Kawaguchi N, Udono T, Watanabe K, Saito H, Takahashi K, Noda M, Shibahara S. Mitf-D, a newly identified isoform, expressed in the retinal pigment epithelium and monocyte-lineage cells affected by Mitf mutations. Biochim Biophys Acta 2002; 1574: 15-23. Takeda K, Yasumoto K, Takada R, Takeda S, Watanabe K, Udono T, Saito H, Takahashi K, Shibahara S. Induction of melanocyte-specific microphthalmia-associated transcription factor by Wnt-3a. J Biol Chem 2000; 275: 14013-14016. b Takeuchi H, Morton DL, Kuo C, Turner RR, Elashoff D, Elashoff R, Taback B, Fujimoto A, Hoon DS. Prognostic significance of molecular upstaging of paraffin-embedded sentinel lymph nodes in melanoma patients. J Clin Oncol 2004;22(13):2671-2680. Tanabe KK, Reintgen DS, Balch CM. Local Recurrences and their management. U: Balch CM, Houghton AN, Sober AJ, Soong SJ, urednici. Cutaneous melanoma. 4. izdanje. St Louis (MO): Quality Medical Publishing; 2003. str. 263-273. Tassabehji M, Newton VE, Read AP. Wasrdenburg syndrome type 2 caused by mutations in the human microphthalmia (MITF) gene. Nature Genet 1994; 8: 251-255. Tassabehji M, Read AP, Newton VE, Harris R, Balling R, Gruss P, Strachnan T. Waardenburg’s syndrome patients have mutations in the human homologue of the pax3 paired box gene. Nature 1992; 355: 635-636. Tessier MH, Denis MG, Lustenberger P, Dreno B. Detection of circulating neoplastic cells by reverse-transcriptase and polymerase chain reaction in malignant melanoma. Ann Dermatol Venereol 1997; 124(9):607-611.

162

Thompson JF, Scolyer RA, Kefford RF. Cutaneous melanoma. Lancet 2005;365(9460):687-701. Thompson JF, Uren RF, Coventry BJ, Chatterton BE. Lymphoscintigraphy. U: Balch CM, Houghton AN, Sober AJ, Soong SJ, urednici. Cutaneous melanoma. 4. izdanje. St Louis (MO): Quality Medical Publishing; 2003. str. 329-352. Titus-Ernstoff L, Perry AE, Spencer SK, Gibson JJ, Cole BF, Ernstoff MS. Pigmentary characteristics and moles in relation to melanoma risk. Int J Cancer 2005;116(1):144-149. Tsao H, Nadiminti U, Sober AJ, Bigby M. A meta-analysis of reverse transcriptase-polymerase chain reaction for tyrosinase mRNA as a marker for circulating tumor cells in cutaneous melanoma. Arch Dermatol 2001;137(3):325-330. Tsao H, Sober AJ. Acquired precursor lesions and markers of increased risk for cutaneous melanoma. U: Balch CM, Houghton AN, Sober AJ, Soong SJ, urednici. Cutaneous melanoma. 4. izdanje. St Louis (MO): Quality Medical Publishing; 2003. str. 121-133. Tucker MA, Halpern A, Holly EA, Hartge P, Elder DE, Sagebiel RW, Guerry D, Clark WH. Clinically recognized dysplastic nevi. A central risk factor for cutaneous melanoma. JAMA 1997; 277(18):1439-1444. Udono T, Yasumoto K, Takeda K, Amae S, Watanabe K, Saito H, Fuse N, Tachibana M, Takahashi K, Tamai M, Shibahara S. Structural organization of the human microphthalmia-associated transcription factor gene containing four alternative promoters. Biochim Biophys Acta 2000; 1491: 205-219. Uemura H, Nakagawa Y, Iwai A, Okajima E, Okajima E, Yoshikawa K, Hirao Y. Detection of circulating MN/CA9 positive renal cell carcinoma cells during operation. Aktuelle Urol 2003;34(4):270-272. Ulrich J, Bonnekoh B, Bockelmann R, Schon M, Schon MP, Steinke R, Roessner A, Schmidt U, Gollnick H. Prognostic significance of detecting micrometastases by tyrosinase RT/PCR in sentinel lymph node biopsies: lessons from 322 consecutive melanoma patients. Eur J Cancer 2004;40(18):2812-2819. Vachtenheim J, Novotna H. Expression of genes for microphthalmia isoformes, Pax3, and MSG1, in human melanomas. Cell Mol Biol 1999; 45: 1075-1082. Veronesi U, Adamus J, Aubert C, Bajetta E, Beretta G, Bonadonna G, Bufalino R, Cascinelli N, Cocconi G, Durand J, De Marsillac J, Ikonopisov RL, Kiss B, Lejeune F, MacKie R, Madej G, Mulder H, Mechl Z, Milton GW, Morabito A, Peter H, Priario J, Paul E, Rumke P, Sertoli R, Tomin R. A randomized trial of adjuvant chemotherapy and immunotherapy in cutaneous melanoma. N Engl J Med 1982;307(15):913-916. Versategui C, Bille K, Ortonne JP, Ballotti R. Regulation of the microphthalmia-assiciated transcription factor gene by the Waardenburg syndrome type 4 gene, SOX10. J Biol Chem 2000; 275: 30757-30760.

163

Vogel I, Kalthoff H. Disseminated tumour cells. Their detection and significance for prognosis of gastrointestinal and pancreatic carcinomas. Virchows Arch 2001; 439(2):109-117. Waldmann V, Deichmann M, Bock M, Jackel A, Naher H. The detection of tyrosinase-specific mRNA in bone marrow is not more sensitive than in blood for the demonstration of micrometastatic melanoma. Br J Dermatol 1999;140(6):1060-1064. Waldmann V, Deichmann M, Jaeckel A. Disseminierte Melanomazellen in Blut und Knochenmark. Bedeutung und Nachweis durch potenzielle Tumormarker. Hautarzt 2001;52:298-303.a Waldmann V, Wacker J, Deichmann M, Jackel A, Bock M, Naher H. Prognosis of metastatic melanoma: no correlation of tyrosinase mRNA in bone marrow and survival time. Recent Results Cancer Res 2001;158:118-125.b Wang X, Heller R, VanVoorhis N, Cruse CW, Glass F, Fenske N, Berman C, Leo-Messina J, Rappaport D, Wells K, DeConti R, Moscinski L, Stankard C, Puleo C, Reintgen D. Detection of submicroscopic lymph node metastases with polymerase chain reaction in patients with malignant melanoma. Ann Surg 1994;220(6):768-774. Wassberg C, Thorn M, Yuen J, Ringborg U, Hakulinen T. Second primary cancers in patients with cutaneous malignant melanoma: a population-based study in Sweden. Br J Cancer 1996; 73(2):255-259. Watanabe A, Takeda K, Ploplis B, Tachibana M. Epistatic relationship between Waardenburg syndrome genes MITF and PAX3. Nature Genet 1998; 18: 283-286. Weinstock MA, Sober AJ. The risk of progression of lentigo maligna to lentigo maligna melanoma. Br J Dermatol 1987;116(3):303-310. Widlund HR, Fisher DE. Microphthalmia-associated transcription factor: a critical regulator of pigment cell development and survival. Oncogene 2003; 22: 3035-3041. World Medical Association Declaration of Helsinki: ethical principles for medical research involving human subjects. J Postgrad Med 2002;48:206-208. Wu M, Hamesath TJ, Takemoto CM, Horstmann MA, Wells AG, Price ER, Fisher DZ, Fisher DE. C-Kit triggers dual phosphorylations, which couple activation and degradation of the essential melanocyte factor Mi. Genes Dev 2000; 14: 301-312. Yajima I, Sato S, Kimura T, Yasumoto K, Shibahara S, Goding CR, Yamamoto H. An L1 element intronic insertion in the black-eyed-white (Mitf mi-bw) gene: the loss of a single Mitf isoform responsible for the pigmentary defect and inner ear deafness. Hum Mol Genet 1999; 8: 1431-1441. Yamashita J, Matsuo A, Kurusu Y, Saishoji T, Hayashi N, Ogawa M. Preoperative evidence of circulating tumor cells by means of reverse transcriptase-polymerase chain reaction for carcinoembryonic antigen messenger RNA is an independent predictor of survival in non-small cell lung cancer: a prospective study. J Thorac Cardiovasc Surg 2002;124(2):299-305.

164

Yasumoto K, Amae S, Udono T, Fuse N, Takeda K, Shibahara S. A big gene linked to small eyes encodes multiple Mitf isoforms: Many promoters make light work. Pigm Cell Res 1998; 11: 329-336. Yasumoto K, Mahalingam H, Suzuki H, Yoshizawa M, Yokoyama K, Shibahara S. Transcriptional activation of the melanocyte-specific genes by the human homolog of the mouse microphthalmia protein. J Biochem 1995; 118: 874-881. Yaziji H, Gown AM. Immunohistochemical markers of melanocytic tumors. Int J Surg Pathol 2003;11(1):11-15. Zarour HM, Kirkwood JM. Melanoma vaccines: early progress and future promises. Semin Cutan Med Surg 2003;22(1):68-75. Zieglschmid V, Hollmann C, Bocher O. Detection of disseminated tumor cells in peripheral blood. Crit Rev Clin Lab Sci 2005;42(2):155-196.

165

8. ŽIVOTOPIS

166

OSOBNI PODACI

Ime i prezime Ivan Šamija

Adresa Nad lipom 4A, 10000 Zagreb Telefon +385 1 3787647, mobitel: +385 91 5335259

Telefaks Elektronička pošta isamija@kbsm.hr

Državljanstvo Republika Hrvatska Datum rođenja 25.11.1976.

RADNO ISKUSTVO

Datumi (od – do) od rujna 2000. do danas

Ustanova zaposlenja

Klinička bolnica Sestre milosrdnice, Klinika za onkologiju i nuklearnu medicinu, Zagreb

Naziv radnog mjesta

znanstveni novak na projektu Biološki biljezi tumora debelog crijeva, MZT #134011

Područje rada molekularna dijagnostika tumora, istraživanje tumorskih biljega

ŠKOLOVANJE

Datum 2004. – Studij doktorski studij (kao treća godina poslijediplomskog studija)

Ustanova Prirodoslovno-matematički fakultet Sveučilišta u Zagrebu

Datum 2001. – Studij poslijediplomski studij biologije, smjer imunobiologija i

fiziologija Ustanova Prirodoslovno-matematički fakultet Sveučilišta u Zagrebu

Datum 1995. – srpanj 2000. Studij dipl. inž. biologije, smjer molekularna biologija

Ustanova Prirodoslovno-matematički fakultet Sveučilišta u Zagrebu Diplomski rad Učinkovitost aciklovira i ganciklovira u liječenju tumora genom za

timidin-kinazu (izrađen u Zavodu za molekularnu medicinu Instituta Ruđer Bošković, pod vodstvom dr. Jasminke Pavelić)

napomena prosjek ocjena studija 4,9

Datum 1991. – 1995. Ustanova V prirodoslovno-matematička gimnazija, Zagreb

napomena 1993. drugo mjesto na gradskom natjecanju iz biologije

167

USAVRŠAVANJE U INOZEMSTVU

Godina 1999. Mjesto Stanford, SAD

Ustanova Stanford University School of Medicine, Stanford University Područje istraživanja rezistencije tumora na kemoterapiju u laboratoriju pod

vodstvom prof. dr. Branimira Sikica

Godina 1997. Mjesto Basel, Švicarska

Ustanova Zentrum für Lehre und Forschung, Kantonspital Basel Područje istraživanja ekspresije gena za ljudske tumorske antigene u grupi

pod vodstvom prof. dr. Michaela Heberera NAGRADE

Godina 1997.

Nagrada Rektorova nagrada Nagrađeni rad Ekspresija gena za citokine u mononuklearnim stanicama periferne

krvi mastektomiranih bolesnica tijekom radioterapije

Godina 1995. Nagrada nagrada časopisa Priroda za najbolji maturalni rad

Nagrađeni rad Imunologija tumora

ČLANSTVO

• Hrvatsko imunološko društvo • Hrvatsko biološko društvo • Hrvatski liječnički zbor • Mreža mladih znanstvenika (jedan od osnivača i koordinator radne skupine

Znanost u društvu)

ZNANSTVENI INTERESI

• imunologija tumora • molekularna biologija tumora • primjena imunologije i molekularne biologije u dijagnostici i liječenju tumora

168

POPIS OBJAVLJENIH RADOVA Znanstveni radovi citirani u Current Contents-u:

Šamija M, Juretić A, Solarić M, Šamija I, Bingulac-Popović J, Grahovac B, Stanec M, Orešić V. RT-PCR detection of tyrosinase, gp100, MART1/Melan-A, and TRP-2 gene transcripts in peripheral blood of melanoma patients. Croat Med J 2001;42:477-482.

Šamija I, Lukač J, Marić-Brozić J, Kusić Z. Microphthalmia-associated transcription factor and tyrosinase as markers of melanoma cells in blood of patients with melanoma. Croat Med J 2004;45(2):142-148.

Radovi u ostalim časopisima:

Ivan Šamija, Mirko Šamija, Zvonko Kusić. Mogućnosti određivanja diseminiranih stanica raka prostate. Medix – specijalizirani medicinski dvomjesečnik, broj 60/61, studeni 2005.

Kongresna priopćenja u Current Contents časopisima:

Mateša N, Šamija I, Tabain I, Hrašćan R, Kusić Z. Cytomorphological changes and Galectin-3 and CD44v6 positivity by RT-PCR method in benign thyroid lesions. J Cytopathol 2005 16(Suppl.2):3. (31st European Congress of Cytology, Pariz, 2. – 5. listopada 2005.)

Sažeci u zbornicima skupova:

Lukač J, Šamija I, Hrašćan R, Jazvić M, Bolanča A, Brozić J, Kusić Z. Molekulski biljezi malignog melanoma. 1. Kongres Hrvatskog onkološkog društva s međunarodnim sudjelovanjem, Zagreb, 28.-30. studenoga 2001. (pozvano predavanje)

Šamija I, Hrašćan R, Jazvić M, Kusić Z, Lukač J, Marić-Brozić J. Detekcija melanomskih stanica u perifernoj krvi lančanom reakcijom polimerazom nakon reverzne transkripcije. 1. Kongres Hrvatskog onkološkog društva s međunarodnim sudjelovanjem, Zagreb, 28.-30. studenoga 2001.

Šamija I, Hrašćan R, Jazvić M, Kusić Z, Lukač J, Marić-Brozić J. Detection of melanoma cells in peripheral blood by reverse-transcription-polymerase chain reaction. 1st Croatian congress on molecular life sciences, Opatija, 9.-13. lipnja 2002.

Šamija I, Mateša N, Hrašćan R,Tabain I, Lukač J,Kusić Z. Galectin-3 and CD44v6 expression in fine-needle aspirates of thyroid lesions. 8th Croatian biological congress with international participation, Zagreb, 27. rujna – 2. listopada 2003.

169

Šamija I, Lukač J, Marić-Brozić J, Kusić Z. Microphthalmia transcription factor and tyrosinase as markers for detection of melanoma cells in the blood of melanoma patients by RT-PCR. Annual meeting of the Croatian immunological society, Brijuni, 17.-19. listopada 2003.

Mateša N, Šamija I, Tabain I, Hrašćan R, Lukač J, Kusić Z. RT-PCR analysis of Galectin-3 and CD44v6 expression in fine-needle aspirates of thyroid lesions. XV International congress of cytology, Santiago de Chile, 11.-15. travnja 2004.

Šamija I, Lukač J. Određivanje cirkulirajućih melanomskih stanica. 2. Kongres Hrvatskog onkološkog društva HLZa s međunarodnim sudjelovanjem, Opatija, 20.-23. lipnja 2004. (pozvano predavanje)

Šamija I, Mateša N, Lukač J, Hrašćan R, Tabain I, Kusić Z. Galectin-3 and CD44v6 as markers for preoperative diagnosis of thyroid lesions. Annual meeting of the Croatian immunological society, Opatija, 8.-10. listopada 2004.

Mateša N, Šamija I, Tabain I, Kusić Z. Cytomorphological changes and Galectin-3 positivity by RT-PCR method in benign thyroid lesions. 3. Hrvatski kongres kliničke citologije s međunarodnim sudjelovanjem, Opatija, 8.-11. svibnja 2005.

Šamija I, Lukač J, Marić-Brozić J, Šitum M, Končar Mubrin M, Kusić Z. Microphthalmia-associated transcription factor and tyrosinase as markers of melanoma cells in blood of patients with melanoma. Annual meeting of the Croatian immunological society, Božava – Dugi otok, 29. rujna – 2. listopada 2005. Marić-Brozić J, Šamija I, Lukač J, Bolanča A, Ikić D, Kusić Z. Interferon alpha u adjuvantnoj terapiji melanoma. 3. Hrvatski onkološki kongres s međunarodnim sudjelovanjem. Zagreb, 15.–18. ožujka 2006. (pozvano predavanje) Šamija I, Lukač J, Kusić Z. Eksperimentalni lijekovi za melanom. 3. Hrvatski onkološki kongres s međunarodnim sudjelovanjem. Zagreb, 15.–18. ožujka 2006. (pozvano predavanje)

170