Embed Size (px)
Citation preview
KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS
Irma Martišienė
MITOCHONDRIJŲ OKSIDACINIO FOSFORILINIMO MODULIATORIŲ ĮTAKA MIOKARDO
ELEKTROMECHANINIAM AKTYVUMUI
Daktaro disertacija
Biomedicinos mokslai, biofizika (02 B)
Kaunas, 2008
Disertacija rengta 2003 – 2007 metais Kauno medicinos universitete, Kardiologijos institute. Mokslinė vadovė habil. dr. Vida Gendvilienė (Kauno medicinos universitetas, Kardiologijos institutas, biomedicinos mokslai, biofizika – 02 B) Konsultantas habil. dr. Jonas Jurevičius (Kauno medicinos universitetas, Kardiologijos institutas, biomedicinos mokslai, biofizika – 02 B)
TURINYS
1. SANTRUMPOS..............................................................................................................................3
2. ĮVADAS ..........................................................................................................................................4
MOKSLINIS DARBO NAUJUMAS.........................................................................................................................7
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI........................................................................................................................8
3. LITERATŪROS APŽVALGA .....................................................................................................9
3.1. MIOKARDO ELEKTROMECHANINIS RYŠYS................................................................................................9
3.2. MITOCHONDRIJŲ OKSIDACINIS FOSFORILINIMAS ...................................................................................15
3.3. MIOKARDO ELEKTROMECHANINIO RYŠIO POKYČIAI ESANT ŠIRDIES NEPAKANKAMUMUI ...................18
3.4. MITOCHONDRIJŲ OKSIDACINIO FOSFORILINIMO SUTRIKIMAI ESANT ŠIRDIES NEPAKANKAMUMUI......22
3.5. ENERGETINIŲ SUBSTRATŲ METABOLIZMO POKYČIAI ESANT ŠIRDIES NEPAKANKAMUMUI ..................26
4. MEDŽIAGOS IR DARBO METODAI .....................................................................................32
4.1. MIOKARDO ELEKTROMECHANINIO AKTYVUMO REGISTRAVIMO METODIKA........................................32
4.2. VIENETINIŲ MIOKARDO LĄSTELIŲ IŠSKYRIMO IR L-TIPO CA2+ SROVĖS REGISTRAVIMO METODIKA....37
4.3. REAGENTAI ..............................................................................................................................................43
5. TYRIMŲ REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS.......................................................................44
5.1. MITOCHONDRIJŲ KVĖPAVIMO GRANDINĖS SLOPIKLIŲ IR OKSIDACINIO FOSFORILINIMO SKYRIKLIO
FCCP ĮTAKA ŽIURKĖS MIOKARDO ELEKTROMECHANINIAM AKTYVUMUI ...................................................44
5.1.1. Rotenono įtaka žiurkės miokardo elektromechaniniam aktyvumui.................................44
5.1.2. Antimicino A įtaka žiurkės miokardo elektromechaniniam aktyvumui ..........................46
5.1.3. Anoksijos įtaka žiurkės miokardo elektromechaniniam aktyvumui ................................48
5.1.4. Oksidacinio fosforilinimo skyriklio FCCP įtaka žiurkės miokardo elektromechaniniam
aktyvumui...................................................................................................................................49
5.1.5. Rotenono, antimicino A, NaCN ir FCCP įtaka izoliuotų žiurkės miokardo ląstelių L-tipo
Ca2+ srovei..................................................................................................................................55
5.2. MITOCHONDRIJŲ KVĖPAVIMO GRANDINĖS SLOPIKLIŲ IR OKSIDACINIO FOSFORILINIMO SKYRIKLIO
FCCP ĮTAKA ŽMOGAUS MIOKARDO ELEKTROMECHANINIAM AKTYVUMUI.................................................57
5.2.1. Rotenono įtaka žmogaus miokardo elektromechaniniam aktyvumui ..............................58
5.2.2. Antimicino A įtaka žmogaus miokardo elektromechaniniam aktyvumui .......................59
5.2.3. Anoksijos įtaka žmogaus miokardo elektromechaniniam aktyvumui .............................61
5.2.4. FCCP įtaka žmogaus miokardo elektromechaniniam aktyvumui....................................63
5.2.5. FCCP įtaka izoliuotų žmogaus širdies ląstelių L–tipo Ca2+ srovei ..................................67
1
Rezultatų aptarimas....................................................................................................................68
5.3. F1F0–ATPAZĖS SLOPIKLIO OLIGOMICINO ĮTAKA ŽIURKĖS MIOKARDO ELEKTROMECHANINIAM
AKTYVUMUI ENERGETINIO METABOLIZMO SLOPINIMO METU.......................................................................74
5.3.1. Oligomicino įtaka žiurkės miokardo elektromechaniniam aktyvumui mitochondrijų
kvėpavimo grandinės III komplekso slopinimo metu................................................................74
5.3.2. Oligomicino įtaka žiurkės miokardo elektromechaniniam aktyvumui mitochondrijų
kvėpavimo grandinės IV komplekso slopinimo anoksija metu .................................................76
5.3.3. Oligomicino įtaka žiurkės miokardo elektromechaniniam aktyvumui oksidacinio
fosforilinimo atskyrimo FCCP metu..........................................................................................78
5.3.4. Oligomicino įtaka žiurkės širdies ląstelių L–tipo Ca2+ srovei oksidacinio fosforilinimo
atskyrimo FCCP metu................................................................................................................83
5.4. F1F0–ATPAZĖS SLOPIKLIO OLIGOMICINO ĮTAKA ŽMOGAUS MIOKARDO ELEKTROMECHANINIAM
AKTYVUMUI ENERGETINIO METABOLIZMO SLOPINIMO METU.......................................................................84
5.4.1. Oligomicino įtaka žmogaus miokardo elektromechaniniam aktyvumui kvėpavimo
grandinės III komplekso slopinimo antimicinu A metu.............................................................84
5.4.2. Oligomicino įtaka žmogaus miokardo elektromechaniniam aktyvumui oksidacinio
fosforilinimo atskyrimo FCCP metu..........................................................................................86
5.4.3. Oligomicino įtaka žmogaus širdies ląstelių L–tipo Ca2+ srovei kvėpavimo grandinės III
komplekso slopinimo antimicinu A ir oksidacinio fosforilinimo atskyrimo FCCP metu .........90
Rezultatų aptarimas....................................................................................................................91
5.5. ENERGETINIO METABOLIZMO SUBSTRATO PIRUVATO IR β–ADRENORECEPTORIŲ AGONISTO
IZOPROTERENOLIO ĮTAKA MIOKARDO ELEKTROMECHANINIAM AKTYVUMUI..............................................93
5.5.1. Piruvato įtaka žiurkės miokardo elektromechaniniam aktyvumui...................................94
5.5.2. Piruvato ir izoproterenolio įtaka žmogaus miokardo elektromechaniniam aktyvumui ...96
Rezultatų aptarimas..................................................................................................................101
6. IŠVADOS....................................................................................................................................104
7. LITERATŪROS SĄRAŠAS .....................................................................................................105
8. PASKELBTI DARBAI..............................................................................................................125
2
1. SANTRUMPOS
β–AR – β–adrenerginiai receptoriai
AC – adenilatciklazė
ADP – adenozin-5’-difosfatas
ANT – adeninnukleotidtranslokatorius
ATP – adenozin-5’-trifosfatas
BDM – 2,3-butanodiono monoksimas
cAMP – ciklinis adenozin-3’,5’-monofosfatas
EC50 – koncentracija, 50 proc. mažinanti susitraukimo jėgą
f – dirginimo dažnis
FCCP – karbonilcianid-p-(tri-fluorometoksi)fenilhidrazonas
ICaL – Ca2+ jonų srovė, tekanti per L–tipo Ca2+ kanalus
IK1 – vidinio išlyginimo K+ srovė
Ikr – uždelsta išlyginamoji K+ srovė
Ito – trumpalaikė išeinanti K+ srovė
JSA – jaučio kraujo serumo albuminas
KATP – ATP reguliuojami K+ kanalai
mtDNR – mitochondrijų DNR
NYHA – Niujorko širdies asociacija (angl. New York Heart Association)
P – susitraukimo jėga
PDH – piruvato dehidrogenazė
PKA – baltymų kinazė A
PLB – fosfolambanas
RyR – rianodino receptorius
ROS – reaktyvios deguonies formos
SERCA – sarkoplazminio tinklo Ca2+–ATPazė
ST – sarkoplazminis tinklas
t50 – pusinis atsipalaidavimo laikas
VP – veikimo potencialas
VP50 – veikimo potencialo trukmė 50 proc. repoliarizacijos lygyje
VP90 – veikimo potencialo trukmė 90 proc. repoliarizacijos lygyje
3
2. ĮVADAS
Širdies nepakankamumas – tai viena iš sunkiausių patologijų, kuri pasireiškia kaip galutinė
įvairių širdies ligų stadija. Širdies nepakankamumas išsivysto sergant išemine, hipertenzine,
idiopatine dilatacine, restrikcine ir kitomis kardiomiopatijomis ar po miokardo infarkto [Marin-
Garcia ir kt., 2001; Stanley ir kt., 2005]. Pastaruoju metu daug pasiekta tiriant, diagnozuojant bei
gydant šią patologiją, tačiau mirtingumas nuo šios ligos didėja ir širdies nepakankamumas išlieka
viena aktualiausių medicinos problemų.
Širdies nepakankamumo metu sutrinka pagrindinė širdies funkcija – susitraukimas, kurį
sukelia depoliarizacijos metu per miokardo ląstelių sarkolemos lėtuosius (L–tipo) kalcio (Ca2+)
kanalus patenkantys Ca2+ jonai, sąlygojantys Ca2+ išsiskyrimą iš sarkoplazminio tinklo (ST) per
rianodino receptorius (RyR) ir šių jonų sąveika su kontraktiliniais širdies ląstelių baltymais
[Richard ir kt., 1998; Bers, Despa, 2006]. Miokardo susitraukimo ir atsipalaidavimo procesą taip pat
reguliuoja sarkolemos Ca2+ siurblys (Ca2+–ATPazė), nuo Na+–K+ siurblio priklausanti Na+–Ca2+
mainų sistema, ST Ca2+–ATPazė bei fosfolambanas (PLB). Šių, miokardo susitraukimo –
atsipalaidavimo procesą reguliuojančių sistemų funkcionavimui būtina adenozintrifosfato (ATP)
ryšių hidrolizės energija. Sumažėjus viduląstelinei ATP koncentracijai, sutrinka minėtų nuo ATP
priklausomų ląstelės sistemų funkcionavimas, padidėja viduląstelinė Na+ ir Ca2+ jonų koncentracija
(vystosi Ca2+ perkrova), sumažėja miokardo susitraukimo jėga, vystosi širdies nepakankamumas,
aritmijos ir negrįžtamas kardiomiocitų pažeidimas (nekrozė) [Poole-Wilson, Tones, 1988; Katoh ir
kt., 1994; Marin-Garcia ir kt., 2001]. Taigi, mitochondrijų funkcijos sutrikimas gali būti viena
pagrindinių priežasčių, sukeliančių širdies nepakankamumą.
Apie 80 – 90 proc. viso ląstelėje gaminamo ATP kiekio, kurio didžiausioji dalis (>60 proc.)
sunaudojama širdies susitraukimo – atsipalaidavimo procese, susidaro mitochondrijose oksidacinio
fosforilinimo metu [Jennings ir kt., 1978; Maier ir kt., 2000]. Mitochondrijų oksidacinio
fosforilinimo sistema sudaryta iš vidinėje mitochondrijų membranoje esančių elektronų pernašos
grandinės (I – IV fermentiniai kompleksai) ir F1F0–ATPsintazės, adeninnukleotidtranslokatoriaus
(ANT) ir fosfatų nešiklio [Buchwald ir kt.,1990; Graff ir kt., 1999; Casademont, Miro, 2002]. ATP
sintezei naudojamas mitochondrijų elektrocheminis protonų gradientas, kurio formavime dalyvauja
kvėpavimo grandinės I, III ir IV kompleksai, kurie, perduodami elektronus, iš matrikso į
tarpmembraninę erdvę, atpalaiduoja H+. Sutrikus šių kompleksų aktyvumui, sumažėja mitochondrijų
elektrocheminis gradientas ir ATP sintezė [Yuhki ir kt., 2001; Radad ir kt., 2006]. Nustatyta, kad
sergančiųjų idiopatine dilatacine kardiomiopatija ar miokardo išeminio pakenkimo metu yra
sumažėję mitochondrijų kvėpavimo grandinės I [Rouslin, 1983; Hardy ir kt., 1991; Zeviani ir kt.,
1995; Ide ir kt., 1999; Enns ir kt., 2000; Scheubel ir kt., 2002; Paradies ir kt., 2004], III [Buchwald ir
4
kt., 1990; Maurer, Zierz, 1994; Marin-Garcia, Goldenthal, 1998; Jarreta ir kt., 2000; Hoppel ir kt.,
2002; Casademont, Miro, 2002], IV [Buchwald ir kt., 1990; Zeviani ir kt., 1995; Marin-Garcia,
Goldenthal, 1998] bei F1F0–ATPazės [Marin-Garcia, Goldenthal, 1998] aktyvumai. Tačiau nėra
atlikta kompleksinių tyrimų vienodomis eksperimentinėmis sąlygomis apie kiekvieno iš kvėpavimo
grandinės kompleksų aktyvumo sutrikimų ar oksidacinio fosforilinimo atskyrimo poveikį
eksperimentinių gyvūnų ir ypač žmonių miokardo susitraukimo ir atsipalaidavimo procesams bei jų
priklausomybei nuo dirginimo dažnio, veikimo potencialų parametrams ir susitraukimą
reguliuojančiai Ca2+ srovei per sarkolemos L–tipo Ca2+ kanalus.
Vykdant intensyvią paiešką būdų, pagerinančių miokardo energetinį metabolizmą bei
susitraukimo funkciją, nustatyta, kad sutrikus kvėpavimo grandinės kompleksų aktyvumui ir
sumažėjus mitochondrijų elektrocheminiam gradientui F1F0–ATP sintazė virsta F1F0–ATPaze, kuri
pradeda hidrolizuoti ATP [Jennings ir kt., 1991; Green ir kt., 1998; Grover ir kt., 2004]. Tokiu būdu
ne tik nevyksta ATP sintezė, bet ir eikvojamas likęs ATP kiekis ląstelėse. Tokio nepageidaujamo
ATP eikvojimo sumažinimo vienu iš galimų būdų gali būti ATP hidrolizės sulėtinimas, slopinant šio
fermento aktyvumą.
Kitas būdas, kuriuo galima išsaugoti ar net padidinti miokardo ląstelių ATP kiekį, yra įvairių
energetinio metabolizmo substratų panaudojimas širdies nepakankamumo metu [Stanley ir kt.,
2005]. Atlikus tyrimus su izoliuotais ir in situ širdies preparatais, nustatyta, jog piruvatas, natūralus
alifatinis monokarboksilatas ir pagrindinis metabolinis tarpininkas žinduolių ląstelėse, didina ATP
fosforilinimo potencialą [Mallet, 2000, Hermann ir kt., 2002], viduląstelinę Ca2+ koncentraciją
žiurkės skilvelio ląstelėse [Martin ir kt., 1998], izoliuotos triušio širdies ST sugeriamo bei
išlaisvinamo iš jo Ca2+ jonų kiekį ir sustiprina kontraktilinę miokardo funkciją [Hermann ir kt.,
2000]. Nors pastaruoju metu piruvato poveikis eksperimentiniuose širdies nepakankamumo
modeliuose yra intensyviai tiriamas, tačiau nepakanka duomenų apie šio metabolizmo substrato
įtaką žmonių, sergančių širdies nepakankamumu, miokardo elektromechaninio aktyvumo
parametrams: nėra ištirta piruvato įtaka veikimo potecialų parametrams, susitraukimo
jėgos/atsipalaidavimo priklausomybėms nuo dirginimo dažnio, kurių pobūdį lemia sarkoplazminio
tinklo Ca2+–ATPazės, RyR kanalų, sarkolemos Na+–Ca2+ mainų sistemos aktyvumai [Crozatier,
1998; Pieske ir kt., 1999; Inagaki ir kt., 1999].
Širdies nepakankamumo metu pakinta ne tik ATP sintezė, bet ir β–adrenerginė miokardo
susitraukimo reguliacija, sumažėja dominuojančių β1–adrenerginių receptorių (β1–AR) aktyvumas ir
skaičius [Bristow, 1993]. Todėl β–AR agonistų panaudojimas – vienas iš širdies ir kraujagyslių
sistemos ūmių sutrikimų gydymo būdų, kurio metu ląstelėje padidinama trumpalaikė viduląstelinio
Ca2+ koncentracija (angl. Ca2+ transient), uždelsiama Ca2+ srovės inaktyvacija [Devic ir kt., 2001],
todėl didėja miokardo susitraukimo jėga.
5
Tačiau miokardo susitraukimo didinimas tik inotropinėmis medžiagomis, tokiomis, kaip β–
AR agonistais, sąlygoja ir didesnį deguonies bei įvairių energetinių substratų poreikį. Todėl
ilgalaikė inotropinių medžiagų monoterapija gali sukelti dar pavojingesnius miokardo pažeidimus
[Meyer ir kt., 1998]. Taigi, β–AR agonistų ir energetinio metabolizmo substratų (piruvato)
derinimas gali būti miokardo susitraukimo padidinimo būdu, kartu išsaugant energetinius ląstelių
resursus širdies nepakankamumo metu.
6
Mokslinis darbo naujumas
Šiame darbe vienodomis eksperimentinėmis sąlygomis pirmą kartą ištirta mitochondrijų
oksidacinio fosforilinimo kvėpavimo grandinės I, III ir IV kompleksų aktyvumo slopinimo ir
oksidacinio fosforilinimo atskyrimo įtaka žiurkės ir žmonių, sergančių širdies nepakankamumu,
miokardo elektromechaninio aktyvumo parametrams, t.y. susitraukimo jėgai, atsipalaidavimo laikui
veikimo potencialų trukmei, ramybės įtempimui bei susitraukimo jėgą reguliuojančiai L-tipo Ca2+
srovei. Atlikti kompleksiniai tyrimai parodė, kad didžiausią poveikį žiurkės ir žmogaus miokardo
elektromechaninio aktyvumo parametrams turėjo mitochondrijų kvėpavimo grandinės III ir IV
kompleksų aktyvumų slopinimas ir oksidacinio fosforilinimo atskyrimas, t.y. miokardo
susitraukimo jėga, veikimo potencialų trukmė, L-tipo Ca2+ srovė mažėjo, atsipalaidavimo laikas
lėtėjo žymiai didesniu laipsniu negu I-jo komplekso slopinimo metu, didėjo ramybės įtempimas
(kontraktūra). Nustatyta, kad žmonių, sergančių širdies nepakankamumu, miokardo
elektromechaninio aktyvumo parametrai buvo mažiau jautrūs šių kompleksų slopikliams ir
oksidacinio fosforilinimo atskyrimui.
Tiriant žiurkės ir žmogaus miokardo susitraukimo jėgos/atsipalaidavimo priklausomybių nuo
dirginimo dažnio (krūvio mėginio modelis eksperimente) kitimo pobūdį, pirmą kartą nustatyta, kad
atskyrus oksidacinį fosforilinimą su FCCP, neigiamas šių priklausomybių pobūdis išliko, tačiau
susitraukimo jėga, didinant dirginimo dažnį nuo 0,2 Hz iki 3 Hz, mažėjo žymiai didesniu laipsniu.
Nustatyti nauji eksperimentiniai faktai, kad mitochondrijų F1F0–ATPazės aktyvumo
slopinimas oligomicinu ženkliai sumažino kvėpavimo grandinės III ir IV kompleksų slopiklių ir
oksidacinio fosforilinimo skyriklio poveikį žiurkės ir žmogaus miokardo elektromechaninio
aktyvumo parametrams plačiame dirginimo dažnių diapazone (0,2 Hz – 3 Hz).
Tiriant žmonių, sergančių širdies nepakankamumu, miokardo susitraukimo jėgos
priklausomybes nuo dirginimo dažnio, pirmą kartą nustatyta, kad kompleksinis miokardo ląstelių
energetinio metabolizmo stimuliavimas piruvatu ir β–adrenerginės sistemos – izoproterenoliu,
sąlygoja žymiai efektyvesnę susitraukimo funkciją bei didelių dirginimo dažnių toleravimą, esant
širdies nepakankamumui, negu stimuliuojant šias sistemas atskirai. Klinikiniu požiūriu kombinuota
piruvato bei β–AR agonistų terapija, sąlygotų efektyvesnę sergančiųjų širdies nepakankamumu
miokardo susitraukimo funkciją ir fizinio krūvio toleravimą.
7
Darbo tikslas ir uždaviniai
Darbo tikslas: nustatyti mitochondrijų oksidacinio fosforilinimo moduliatorių įtaką miokardo
elektromechaniniam aktyvumui.
Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksų slopiklių ir oksidacinio
fosforilinimo skyriklio (FCCP) įtaką žiurkės miokardo elektromechaniniam aktyvumui.
2. Nustatyti žmogaus miokardo elektromechaninio aktyvumo parametrų pokyčius, veikiant
mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksų slopikliams ir oksidacinio fosforilinimo
skyrikliui (FCCP).
3. Ištirti F1F0–ATPazės slopiklio oligomicino įtaką žiurkės ir žmogaus miokardo
elektromechaniniam aktyvumui kvėpavimo grandinės kompleksų slopinimo sąlygomis
ar veikiant oksidacinio fosforilinimo skyrikliui.
4. Nustatyti energetinio metabolizmo substrato piruvato, β1–β2 adrenoreceptorių agonisto
izoproterenolio bei jų derinio poveikį žiurkės ir žmogaus miokardo elektromechaniniam
aktyvumui.
8
3. LITERATŪROS APŽVALGA
3.1. Miokardo elektromechaninis ryšys
Pagrindinė širdies funkcija yra susitraukimas, lemiantis kraujo tekėjimą kraujagyslių sistema
ir organizmo ląstelių aprūpinimą deguonimi bei maisto medžiagomis. Širdies susitraukimas yra
kompleksas procesų, kuriuos inicijuoja miokardo ląstelių elektrinis sujaudinimas. Depoliarizacijos
bangai, kilusiai sinusiniame mazge, pasiekus kardiomiocitus, atsidaro įtampa valdomi Na+ kanalai ir
per juos patenkantys Na+ jonai (greitoji įeinanti Na+ srovė) sukelia greitą ląstelės membranos
depoliarizaciją (veikimo potencialo depoliarizacijos fazė) (3.1 pav.). Pasiekus tam tikrą
depoliarizacijos lygį (apie –55 mV), Na+ kanalai inaktyvuojasi. Toliau sekančios VP pradinės
greitos repoliarizacijos fazę lemia trumpalaikė išeinanti K+ srovė (Ito, angl. transient outward) per
sarkolemos K+ kanalus. Miokardo VP būdinga plato fazė, susidaranti dėl padidėjusio membranos
laidumo Ca2+ jonams, kurį sukelia L–tipo Ca2+ kanalų atsidarymas, pasiekus –40 mV, per kuriuos
Ca2+ (L–tipo Ca2+ srovė – ICaL) patenka į miocito vidų. Šis Ca2+ padidėjimas sukelia Ca2+
išsiskyrimą iš sarkoplazminio tinklo (ST) per rianodino receptorius (RyR) – tai „Ca2+ sukeltas Ca2+
išsiskyrimas“ (angl. „Ca2+ induced Ca2+ release“) [Richard ir kt., 1998; Bers, 2002; Bers, Despa,
2006; Maack, O’Rourke, 2007]. Šios VP fazės metu taip pat aktyvuojasi uždelstos išlyginamosios
K+ srovės (Ikr, angl. delayed rectifier) kanalai, pro kuriuos iš ląstelės išeina K+ jonai. Plato fazės
metu Ca2+ ir K+ jonų elektriniai srautai kompensuoja vienas kitą ir apie 200 ms membraninis
potencialas beveik nekinta. Lėtai inaktyvuojantis Ca2+ kanalams, K+ jonų judėjimas iš miokardo
ląstelės pradeda vyrauti, vyksta galutinė repoliarizacija. Suaktyvėjus vidinio išlyginimo K+ srovės
(IK1, angl. inward rectifier) kanalams, baigiasi galutinė VP repoliarizacijos fazė ir tekanti IK1 srovė
formuoja ramybės potencialą [Snyders, 1999; Roden ir kt., 2002].
9
3.1 pav. Miokardo veikimo potencialas ir jo metu registruojamos jonų srovės. i Na+, ICaL – L–tipo aikė anti Ca2+
iokardo elektromechaninis ryšys (angl. excitation – contraction coupling) nurodo procesus,
kurie
VP50 ir VP90 – veikimo potencialų trukmė 50 ir 90 proc. repoliarizacijos lygyje, INa – greitoji įeinantCa2+, ICaT – T–tipo Ca2+, Na-Ca – Na+–Ca2+ mainų, Ito1 – trumpalaikė išeinanti K+, Ito2 – trumpal išeinaktyvinama K+, I – išeinanti lėtos aktyvacijos KKs
+, I – uždelsta išlyginamoji KKr+, I – labai greita uždelsta
išlyginamoji KKur
+, I – ClCl-, I – vidinio išlyginimo KK1
+, I – acetilcholinu aktyvinama KACh+ srovės. [modifikuota pagal
Snyders, 1999].
M
jungia veikimo potencialą (sujaudinimą) su kontraktilinių baltymų skersinių tiltelių
susidarymo ciklu ir raumeninės skaidulos susitraukimu (jėgos išvystymu) [Bers, 2002; Katz, 2001;
Katz, 2003; Dulhunty, 2006] (3.2 pav.). Šiame procese svarbiausią vaidmenį atlieka Ca2+ jonai,
10
patenkantys į ląstelę per sarkolemos L–tipo Ca2+ kanalus, kurie miokardo ląstelėse išsidėstę t-
tubulėse, užtikrinančiose giliai raumeninėje ląstelėje esančių struktūrų aktyvavimą. Iš tarpląstelinės
terpės per L–tipo Ca2+ kanalus patenkančių Ca2+ jonų nepakanka susitraukimui sukelti, bet jie
atlieka dvi svarbias funkcijas: (1) sukelia Ca2+ jonų išsiskyrimą iš ST, t.y. pasižymi trigeriniu
veikimu, ir (2) papildo viduląstelines Ca2+ jonų atsargas, naudojamas vėlesniems susitraukimams
[Bers, 2002]. Sarkolemoje esantys L–tipo Ca2+ kanalai yra struktūriškai arti sarkoplazminio tinklo
(ST) rianodino receptorių (RyR) ir tai užtikrina Ca2+ sukeliamą Ca2+ išsiskyrimą iš ST.
Matematiniais modeliais apskaičiuota, kad pirmąsias milisekundes po RyR atsidarymo, Ca2+
koncentracija apibrėžtoje erdvėje laikinai padidėja nuo ~10 µM iki ~7 mM [Rice ir kt., 1999;
Michailova, McCulloch, 2001]. Citozolyje laisvo kalcio koncentracijai padidėjus nuo ~100 nM iki
~1 µM [Carafoli ir kt., 2001] ir Ca2+ prisijungus prie miofilamentų baltymo troponino C,
inicijuojamas kontraktilinių baltymų aktino ir miozino siūlų šliaužimas vienas kito atžvilgiu ir
sarkomero trumpėjimas, t.y. raumens susitraukimas.
Ca -ATPazė Na -K -ATPazė2+ + +Ca -ATPazė Na -K -ATPazė2+ + +
3.2 pav. Miokardo elektromechaninio ryšio schema. NCX – Na+-Ca2+mainai; ATP – ATPazės; PLB – fosfolambanas; ST – sarkoplazminis tinklas; RyR – rianodino kanalas, [Ca]i – viduląstelinė Ca2+ koncentracija. [modifikuota pagal Bers, 2002].
11
Raumens atsipalaidavimas prasideda, kai nuo troponino C disocijuoja Ca2+ jonai. Didžioji
Ca2+ dalis grąžinam į ST per ST Ca2+–ATPazę (SERCA2aa vyraujanti miokardo ląstelėse forma)
[Frank ir kt., 2003]. Dalis Ca2+ jonų pašalinami iš ląstelės per sarkolemoje esančią Na+–Ca2+ mainų
sistem į
tam
ų
žinam
m
ąstelės bei tokio pat Ca2+ kiekio, išsiskyrusio iš ST,
grąžinim
ės produktus, t.y. ADP ir neorganinį
fosfat
1 2
(3.3 pav.). Kanalo α1 subvienetas formuoja patį kanalą, užtikrina nuo įtampos priklausomą Ca2+
,
ą. Ši sistema naudoja Na+ jonų transmembraninį gradientą, t.y. mainais tris Na+ jonus
perneša vieną Ca2+ joną prieš koncentracijos gradientą. Vidinę Na+ koncentraciją reguliuoja Na+–K+
siurblys, kuris naudodamas ATP hidrolizės energiją, tris Na+ jonus perneša į ląstelės išorę, o du K+
jonus – į ląstelės vidų. Labai nedidelė dalis citozolinio Ca2+ atsipalaidavimo metu išme a iš
ląstelės per sarkolemos Ca2+–ATPazę bei patenka į mitochondrijas per mitochondrijų Ca2+
viennašos sistemą (angl. uniporter) [Bers, 2002; Bers, Despa, 2006]. Nustatyta, kad triušių skilvelių
atsipalaidavimo metu 70 proc. citozolinio Ca2+ grįžta į ST, dalyvaujant SERCA2a, ir 28 proc. Ca2+
iš ląstelės pašalina Na+–Ca2+ mainų sistema. Tik 2 proc. Ca2+ jonų iš ląstelės pašalina mitochondrij
Ca2+ viennašos sistema ir sarkolemos Ca2+–ATPazė. Panašiomis proporcijomis miokardo diastolės
metu Ca2+ jonai pašalinami iš sarkolemos ir šuns, katės, jūrų kiaulytės bei žmogaus skilveliuose.
Žiurkės ir pelės skilvelių ST Ca2+–ATPazės aktyvumas yra didesnis: net 92 proc. citozolinio Ca2+
grą as per SERCA2a į ST ir tik 7 proc. Ca2+ išmetama iš ląstelės per Na+–Ca2+ mainų sistemą
[Bassani ir kt., 1994; Bers, Despa, 2006].
Taigi, kiekvieną kartą širdžiai susitraukiant, Ca2+ į citoplazmą patenka iš tarpląstelinio skysčio
per L–tipo Ca2+ kanalus ir iš sarkoplazminio tinklo. Kiekvieno susitraukimo etu tokio pat Ca2+
kiekio, patekusio į ląstelę, išmetimas iš l
as į ST užtikrina stabilų širdies darbą [Eisner ir kt., 2000]. Šie procesai labai glaudžiai
susiję su širdies ląstelių energetiniais resursais. Tiek Ca2+ patekimas į ląstelę per sarkolemos L–tipo
Ca2+ kanalus ir išsiskyrimas iš ST per rianodino receptorius, tiek Ca2+ grąžinimas į ST per
SERCA2a bei išmetimas iš ląstelės per nuo Na+–K+ ATPazės aktyvumo priklausomą Na+–Ca2+
mainų sistemą ir sarkolemos Ca2+ ATPazę priklauso nuo energetinių ląstelių resursų , t.y.
adenozintrifosfato (ATP) kiekio ląstelėse.
Širdies raumeninėje ląstelėje ATP naudojamas ne tik joninių siurblių veiklai, bet tiesiogiai ir
miokardo susitraukimo – atsipalaidavimo procese. ATP molekulės jungimasis prie miozino galvutės
yra pirmas susitraukimo ciklo žingsnis. Tik ATP hidroliz
ą, prisijungęs miozinas gali jungtis prie aktino, ir, atsijungus ADP ir Pi, suformuoti patvarų
aktino ir miozino junginį (vad. rigoro kompleksu). Raumuo atsipalaiduoja, kai ATP molekulė
prisijungia prie miozino galvutės ir nutraukia aktino – miozino ryšį [Katz, 2001].
Miokardo susitraukimo jėga priklauso nuo Ca2+ jonų, patenkančių į ląstelę veikimo potencialų
plato fazės metu per L–tipo Ca2+ kanalus. Šie kanalai yra heterotetrameriniai baltymų kompleksai
(molekulinė masė 400 kDa), kuriuos sudaro α , α /δ, β ir γ (kai kuriuose audiniuose) subvienetai
12
jonų
ančių subvienetų schema. P – kanalo fosforilinimo vietos, Ψ – glikozilinimo vietos. 998].
s stimuliacijos metu. Prisijungus agonistui prie β–adrenerginio
praėjimą per ląstelės membraną, yra atsakingas už kanalo selektyvumą Ca2+ jonams ir turi
specifines vietas, prie kurių jungiasi kanalo slopikliai (1,4–dihidropiridinai, fenilalkilaminai ir
benzotiazepinai). Nustatyta, kad mažiausiai 10 skirtingų genų koduoja L–tipo Ca2+ kanalų α1
subvienetą, tačiau širdies audinyje gausiai ekspresuojama tik α1C izoforma (Cav1.2) [Takimoto ir kt,
1997]. Šį subvienetą sudaro keturi homologiniai domenai, kurių kiekvienas sudarytas iš šešių
transmembraninių segmentų. Papildomi β ir α2/δ subvienetai tvirtai, tačiau ne kovalentiškai, yra
prisijungę prie α1. Šie subvienetai gali keisti (moduliuoti) kanalo biofizikines savybes ir yra
atsakingi už α1 transportavimą į plazminę membraną. α2 subvienetas yra ekstraląstelinis, o β
subvienetas – viduląstelinis. β subvienetas dalyvauja kanalo veiklos reguliacijoje, kurios metu yra
fosforilinami kanalą sudarantys baltymai. Šis subvienetas turi eilę vietų, kurios gali būti
fosforilinamos įvairių baltymų kinazių (baltymų kinazės A, C, G). δ subvienetas sudarytas iš
transmembraninio segmento, viduląstelinio galo ir išorinės grandinės, kuri jungiasi su α2
disulfidinėmis jungtimis. α2/δ subvienetai dažniausiai turi nedaug įtakos Ca2+ srovės amplitudei bei
kanalo inaktyvacijai, tačiau gali keisti aktyvacijos kinetiką [Carafoli ir kt., 2001; Serysheva ir kt.,
2002; Bodi ir kt., 2005].
3.3 pav. L–tipo Ca2+ kanalo struktūra. A. L–tipo Ca2+ kanalo struktūra. I – IV – keturi homologiniai domenai (α spiralės), kurie sudaro α1 subvienetą. [modifikuota pagal Serysheva ir kt., 2002]. B. L–tipo Ca2+ kanalą sudar[modifikuota pagal Catterall, 1
ląstelės vidus
išorė
citoplazma
A B
ląstelės vidus
išorė
ląstelės vidus
išorė
citoplazmacitoplazma
A B
Pagrindinis širdies L-tipo Ca2+ kanalų aktyvinimo ir ICaL padidinimo būdas yra nuo cAMP
priklausomas baltymų fosforilinimas. Geriausiai ištirtas kanalo aktyvumo reguliavimas,
pasireiškiantis β–adrenerginė
13
receptoriaus, aktyvuojami Gs (GTP surišantys) baltymai, kurie stimuliuoja adenilatciklazę (AC).
AC i
receptoriaus izoforma)
tetram
š ATP sintezuoja antrinį signalo pernešėją cAMP, kurio padidėjęs kiekis aktyvuoja nuo cAMP
priklausomą baltymų kinazę A (PKA). PKA fosforilina Ca2+ kanalus ir juos atidaro [Katz, 2001; El-
Armouche ir kt., 2003]. Nustatyta, kad PKA gali fosforilinti kanalo β subvienetą per Ser-459, Ser-
478 ir Ser-479 amino rūgščių liekanas [Gerhardstein ir kt., 1999], α1C subvienetą – ties Ser-1928
[De Jongh ir kt., 1996]. Kanalų aktyvinimą nutraukia Gi baltymų sukeliamas adenilatciklazės
aktyvumo slopinimas arba fosfodiesterazės, kurios hidrolizuodamos cAMP, riboja nuo cAMP
priklausomą fosforilinimą [Kamp, Hell, 2000]. Nors L-tipo Ca2+ kanalų aktyvumas labiausiai
priklauso nuo baltymų fosforilinimo, Yazawa ir kt. [1997] parodė, kad ląstelių dializė vidiniu
tirpalu su nehidrolizuojamais ATP analogais didina ICaL. Šie tyrėjai eksperimentų su jūrų kiaulyčių
širdies ląstelėmis metu nustatė, kad fiksuotos įtampos “patch clamp” metodu eksperimento eigoje
pasireiškiantį ląstelių savaiminį ICaL amplitudės mažėjimą galima pristabdyti ląsteles perfuzuojant
tirpalu su ATP ir jaučio širdies ląstelių citoplazmos mišiniu. ICaL amplitudė dalinai atsistatydavo ir
veikiant tirpalu, kuriame ATP buvo pakeistas nehidrolizuojamais analogais AMP-PNP ir AMP-
PCP. Kai ląstelės buvo perfuzuojamos tirpalu be ATP, ICaL žymiai sumažėdavo. Šie rezultatai rodo,
ATP gali keisti L–tipo Ca2+ kanalų aktyvumą ir nevykstant kanalų fosforilinimui bei dalinis ICaL
padidėjimas gali būti užtikrinamas ir nevykstant ATP hidrolizei [Yazawa ir kt., 1997].
Eksperimentų su varlės nervinėmis ląstelėmis metu nustatyta, kad ATP gali didinti ICaL nuslopinus
kinazių aktyvumą [Yuki ir kt., 1999]. Yokoshiki ir kt. [1997] parodė, kad žiurkės arterijos lygiųjų
raumenų ląstelių ICaL dydis kinta priklausomai nuo vidinio tirpalo ATP koncentracijos: mažinant
ATP koncentraciją, ICaL mažėja, didinant – didėja. Kinazių slopinimas ATP sukeliamo ICaL
padidėjimo nepanaikino. Hao ir kt. [1999] parodė, kad jūrų kiaulytės širdies ląstelių savaiminės
bazinės ICaL mažėjimas pristabdomas veikiant kanalus tirpalu su ATP ir citoplazmos ekstrakto
frakcija, nepasižyminčia fosfatazių ir kinazių aktyvumu. Tačiau Ono ir Fozzard [1992] teigia, kad
ICaL amplitudės atsistatymui po savaiminio mažėjimo būtinas L–tipo Ca2+ kanalų fosforilinimas. Šie
tyrėjai eksperimentų su triušio širdies ląstelėmis metu parodė, kad veikiant kinazių slopikliams ar
nesant PKA katalitinių subvienetų, ATP nedidina ląstelių ICaL. Taigi, ATP gali didinti ICaL tiek
dalyvaudamas kanalų fosforilinime, tiek alosteriškai sąveikaudamas su jais.
Nuo baltymų fosforilinimo priklauso ir sarkoplazminio tinklo rianodino receptorių veikla.
RyR fosforilinimas ir defosforilinimas reguliuoja Ca2+ išmetimą iš ST. Nustatyta, kad šiuos kanalus
gali fosforilinti įvairios kinazės (PKA, baltymų kalmodulino kinazė II, nuo cAMP ir cGMP
priklausančios kinazės). Vieno iš RyR2 (vyraujanti miokardo ląstelėse
erą sudarančių subvieneto fosforilinimas padidina receptoriaus jautrumą per L-tipo Ca2+
kanalus patenkantiems Ca2+ jonams ir padidina RyR2 atsidarymo tikimybę [Marx ir kt., 2000;
Marks ir kt., 2002].
14
Ca2+ sugrįžimas į ST širdies diastolės metu vyksta dalyvaujant Ca2+–ATPazei, kuri ne tik
tiesiogiai naudoja ATP, tačiau jos aktyvumą reguliuoja ir baltymas fosfolambanas (PLB).
Nefosforilintas PLB slopina SERCA2a aktyvumą. PLB in vitro gali būti fosforilinamas skirtingose
vietose: ties Ser-16, kurį fosforilina nuo cAMP priklausomos baltymų kinazės (PKA), ir ties Thr-
17, k
du raumuo atsipalaiduoja bei tuo pačiu yra perduodamas Ca2+
signa
8].
3.2. Mitochondrijų oksidacinis fosforilinimas
Pagrindinė energijos forma ląstelėje yra ATP (adenozino 5’-trifosfatas), įgalinantis savaiminių
reakcijų metu išsiski aus transporto, jonų
radiento palaikymo ir kituose energijos reikalaujančiuose procesuose. Širdies ląstelėse ATP
intetinamas mitochondrijose, kurios sudaro apie 30 proc. ląstelės tūrio ir yra išsidėsčiusios prie
ląstel
urį fosforilina baltymų kalmodulino kinazė II [Koss, Kranias, 1996]. Fosforilintas PLB
neslopina SERCA2a aktyvumo ir Ca2+ sugėrimas į ST padidėja [Colyer, Wang, 1991; Simmerman,
Jones, 1998; Frank ir kt., 2003].
Miokardo susitraukime dalyvaujantis baltymas troponinas I, būdamas susijungęs su aktinu ir
troponinu C, blokuoja aktino–miozino ryšį. Nustatyta, kad troponiną I gali fosforilinti nuo cAMP
priklausomos baltymų kinazės. Fosforilinto troponino I slopinanti sritis pajuda nuo troponino C ant
aktino-tropomiozino ir tokiu bū
las kitiems miofilamentų baltymams širdies raumens susitraukimo metu [Lindhout ir kt., 2002;
de Tombe, 2003; Messer ir kt., 2007]. Nustatyta, kad troponino I fosforilinimas proteinkinaze A
padidina miofibrilių atsipalaidavimo greitį ir tuo pačiu pagreitina skersinių tiltelių ciklo kinetiką
[Kentish ir kt., 2001] bei sumažina atsipalaidavimo sulėtėjimą, pasireiškiantį dėl padidėjusio krūvio
(eksperimentinėmis sąlygomis registruojant susitraukimo jėgos–dažnio priklausomybę) [Bilchick ir
kt., 2007].
Taigi, pagrindinės širdies ląstelių sistemos, dalyvaujančios susitraukimo – atsipalaidavimo
procesuose, tiesiogiai ar netiesiogiai (per baltymų fosforilinimą) priklauso nuo ATP. Vienų sistemų
funkcionavimui ATP reikalingas kaip ligandas, kitų – kaip fosfato grupės donoras [Szewczyk,
Pikula, 199
riančią energiją panaudoti raumenų susitraukimo, aktyv
g
s
ės sistemų, naudojančių ATP, t.y. T-tubulių, kuriose didžiausias tankis L–tipo Ca2+ kanalų,
sarkoplazminio tinklo ir miofilamentų [Territo ir kt., 2001; Dobson, Himmelreich, 2002]. Šios
sistemos širdies ląstelėse sudaro struktūrine ir funkcine prasme gerai organizuotus erdvės skyrius
(kompartmentus), kurie užtikrina ląstelės kontraktilinę funkciją [Kaasik ir kt., 2004].
15
Nustatyta, kad apie 80 – 90 proc. [Jennings ir kt., 1978] ar net daugiau kaip 95 proc. [Stanley
ir kt., 2005] viso gaminamo širdies ląstelėse ATP susidaro mitochondrijose oksidacinio
fosforilinimo metu. Daugiau kaip 75 proc. miokardo ATP sunaudoja kontraktilinio baltymo
miozino ATPazė, likusi dalis naudojama jonų homeostazei palaikyti [Ferrari, 2002]. Oksidacinio
fosfo
prijun
rilinimo sistemą sudaro mitochondrijų vidinėje membranoje esantys kvėpavimo grandinė,
F1F0–ATP sintazė ir adeninų nukleotidų translokazė (3.4 pav.), kuri mainais į ADP „perkelia“ ATP
į citoplazmą [Casademont, Miro, 2002; DiMauro, Schon, 2003]. Oksidacinio fosforilinimo sistema
skirstoma į protonovaros jėgą generuojančią ir protonovaros jėgą vartojančią dalis [Duchen, 1999].
Protonovaros jėgos generatorius yra kvėpavimo grandinė, t.y. elektronų pernašos grandinė,
kurią sudaro keturi oksidacijos – redukcijos reakcijas reguliuojantys baltymų I, II, III ir IV
kompleksai (hidrofobiniai integraliniai baltymai) ir du maži elektronų nešikliai – citochromas c ir
ubichinonas (kofermentas Q). Kompleksai turi vieną ar kelias prostetines grupes, kurios grįžtamai
gia elektronus. Tiesioginiai kvėpavimo grandinės substratai yra redukuoti NADH ir FADH2,
kurių daugiausiai susidaro riebalų rūgščių β-oksidacijos, trikarboninių rūgščių ciklo metu, mažiau –
piruvato dehidrogenazės reakcijos bei glikolizės metu [Stanley ir kt., 2005]. Elektronai grandine
keliauja per kompleksus ir galiausiai prijungiami prie molekulinio deguonies, susidarant vandeniui.
Deguonies redukcijos reakcija yra vienintelis negrįžtamas procesas, kurį katalizuoja IV kvėpavimo
grandinės kompleksas. Elektronų pernaša I (NADH-CoQ reduktazė), III (citochromo c reduktazė) ir
IV (citochromo c oksidazė) kompleksuose vyksta kartu su protonų pernaša iš mitochondrijų
matrikso į tarpmembraninę erdvę. Taip susidaro mitochondrijų elektrocheminis protonų gradientas
arba protonovaros jėga – ∆p, kurią sudaro elektrinio potencialo gradiento (∆ψ) ir protonų gradiento
(∆pH) suma. Protonovaros jėga naudojama ATP sintezei, kuri vyksta F1F0–ATP sintazei protonus
grąžinant į matriksą. [Duchen, 1999; Guertl ir kt., 2000; Hare, 2001; DiMauro, Schon, 2003;
Cortassa ir kt., 2003; Maack, O’Rourke, 2007].
16
3.4 pav. Mitochondrijų oksidacinio fosforilinimo schema. Q – kofermentas Q, C – citochromas C, ROS – reaktyvūs deguonies junginiai. Skaičiai prieš pasvirusį brūkšnelį nurodo kompleksų subvienetų skaičių, koduojamų branduolio genome, po brūkšnelio – mitochondrijų genome. [modifikuota pagal Casademont, Miro, 2002].
ATP sintetinanti F1F0–ATP sintazė yra fermentas, sudarytas iš dviejų pagrindinių kompleksų:
F1 ir F0. F1 yra vandenyje tirpus katalitinis kompleksas, sudarytas iš devynių subvienetų (α3, β3, γ,
δ, ε), iš kurių β subvienetas yra katalitinė vieta. F0 kompleksas sudarytas iš kelių subvienetų a, b2, c
(10-14) ir oligomicinui jautraus baltymo [Zheng, Ramirez, 2000]. Prie F1 komplekso grįžtamai gali
jungtis mažas (80 amino rūgščių) IF1 baltymas. Prisijungus šiam baltymui specifiškai blokuojamas
F1F0–ATPazės hidrolazinis aktyvumas. Tačiau IF1 baltymas jungiasi prie F1 komplekso esant tam
tikroms sąlygoms, t.y. esant pH 6.7 ir sumažėjus elektrocheminiam protonų gradientui (išemijos
metu pasireiškiančios sąlygos). Atsistačius protonų gradientui ir padidėjus pH, IF1 neslopina F1F0–
ATPazės hidrolazinio aktyvumo [Green, Grover, 2000; Grover ir kt., 2004].
17
3.3. Miokardo elektromechaninio ryšio pokyčiai esant širdies nepakankamumui
Susitraukimo funkcijos sutrikimas širdies nepakankamumo metu labiausiai susijęs su
viduląstelinę Ca2+ koncentraciją reguliuojančių ir nuo ATP priklausomų sistemų funkcionavimo
sutrikimais bei struktūriniu kairiojo skilvelio remodeliavimusi [Hasenfuss, Pieske, 2002; Bers,
Despa, 2006]. Kliniškai širdies nepakankamumas pasireiškia skilvelių kraujo prisipildymo ar
išstūmimo funkcijos sutrikimu [Stanley ir kt., 2005]. Sumažėjusį pakenkto miokardo susitraukimą
širdies nepakankamumo metu didžiausia dalimi įtakoja sumažėjęs Ca2+ kiekis sarkoplazminiame
tinkle. Tai gali būti susiję su mažesne ST Ca2+-ATPazės baltymų ekspresija bei silpnesniu
aktyvumu [Periasamy, Huke, 2001; Mishra ir kt., 2002; Pieske ir kt., 2002] ir padidėjusiu Ca2+
nuotėkiu dėl RyR2 hiperfosforilinimo [Marx ir kt., 2000; Hasenfuss, Pieske, 2002; Marks ir kt.,
2002; Lehnart ir kt., 2005]. Tačiau RyR2 hiperfosforilinimas (kelių to paties kanalo subvienetų
fosforilinimas), kuris dėl padidėjusio katecholaminų kiekio pasireiškia širdies nepakankamumo
metu, lemia ilgai trunkantį kanalo laidumą ir dėl to vykstantį Ca2+ jonų nuotėkį iš ST [Marx ir kt.,
2000; Marks ir kt., 2002]. Kiti tyrėjai teigia, kad esant širdies nepakankamumui, nevyksta RyR2
hiperfosforilinimas ir nekinta kanalų aktyvumas [Xiao ir kt., 2005]. Vyksta diskusija ar širdies
nepakankamumo metu sumažėja SERCA2 kiekis (ekspresija) ar sutrinka PLB fosforilinimas
[Armoundas ir kt., 2007]. Naudodami triušio širdies nepakankamumo modelį Armoundas ir kt.
[2007] nustatė sumažėjusį SERCA2a, PLB, RyR iRNR ir baltymų kiekį. Kai kurių tyrėjų nustatyta,
kad pakenktose širdyse SERCA2a kiekis gali būti ir nepakitęs, tačiau miokardo susitraukimo
funkcija sumažėjusi dėl sumažėjusio fosfolambano fosforilinimo [Munch ir kt., 1998; Houser ir kt.,
2000]. Širdies nepakankamumo metu PLB ekspresijos lygis paprastai būna nepakitęs, tačiau
sumažėjęs fosforilinimo laipsnis [Movsesian ir kt., 1994; Schmidt ir kt., 1999; Hasenfuss, Pieske,
2002; Nef ir kt., 2006]. Nustatyta, kad išemijos metu dėl sutrikusio PLB fosforilinimo sumažėjęs
SERCA2a aktyvumas turi įtakos žmogaus širdies susitraukimo funkcijos sutrikimui [Nef ir kt.,
2006]. Taigi, pakenktų širdies ląstelių ST SERCA2a sumažėjusį aktyvumą lemia padidėjęs
PLB:SERCA2a santykis ir didesnis PLB slopinantis veikimas [Bers, Despa, 2006]. Ai ir kt. [2005]
atlikę tyrimus su sergančių neišeminės kilmės širdies nepakankamu triušių miokardu nustatė, kad
ST Ca2+–ATPazės aktyvumas nežymiai sumažėjo, o SERCA2a ir PLB ekspresija bei PLB
fosforilinimas nebuvo sumažėję. Tačiau PLB fosforilinimas ties Ser16 (PKA vieta) buvo sumažėjęs,
o ties Thr17 (baltymų kalmodulino kinazės II vieta) – padidėjęs. Tai rodo, kad nors PLB
fosforilinimas yra pakitęs, tačiau funkciškai nepastebimas. Prieštaringus duomenis apie ST baltymų
ekspresijos pokyčius gali paaiškinti tyrimai, atlikti su pakenktomis šuns širdimis, kurie parodė, kad
18
baltymų, reguliuojančių Ca2+ jonų išmetimą ir patekimą į ST, ekspresijos lygis priklauso nuo
pakenkimo laipsnio ir širdies nepakankamumo progresavimo [Mishra ir kt., 2005].
Sarkoplazminio tinklo Ca2+–ATPazės pajėgumą atspindi miokardo fizinio krūvio toleravimas.
Eksperimente fizinio krūvio mėginio modeliu laikoma susitraukimo jėgos kitimo pobūdis didinant
dirginimo dažnį (jėgos–dažnio priklausomybė) [Frank ir kt., 1998; Somura ir kt., 2001; Huke ir
kt., 2003; Endoh, 2004]. Rossman ir kt. [2004] sutrikusį žmogaus miokardo atsaką į dažnio
pasikeitimus apibūdina kaip susitraukimo pakenkimo patofiziologinį markerį. Nustatyta, kad sveiko
miokardo jėgos–dažnio priklausomybė yra teigiama, t.y. dididinant dirginimo dažnį, susitraukimo
jėga didėja, tuo tarpu esant širdies nepakankamumui – mažėja, t.y. neigiama jėgos–dažnio
priklausomybė [Mulieri ir kt., 1992; Bohm ir kt., 1992; Crozatier, 1998, Inagaki ir kt., 1999].
Sveiko miokardo teigiamas susitraukimo jėgos–dažnio priklausomybės pobūdis siejamas su VP
skaičiaus padidėjimu, kuris lemia didesnio Ca2+ kiekio patekimą į miokardo ląstelę ir sutrumpėjusį
diastolinį laiką Ca2+ išmetimui iš ląstelės per Na+–Ca2+ mainus. Dėl šių priežasčių didėja Ca2+
koncentracija sarkoplazminiame tinkle ir tuo pačiu Ca2+ išsiskyrimas iš ST per RyR kanalus
kiekvieno sekančio širdies susitraukimo metu [Hasenfuss, Pieske, 2002]. Širdies nepakankamumo
metu, didėjant dirginimo dažniui dėl sumažėjusio ST Ca2+–ATPazės aktyvumo bei intensyvesnių
Na+–Ca2+ mainų sumažėja Ca2+ išsiskyrimo iš ST ir sugėrimo greitis bei kiekis ir tuo pačiu
susitraukimo jėga [Pieske ir kt., 1999; Pieske ir kt., 2002; Bers, 2000]. Taigi, pakitęs miokardo
susitraukimo jėgos–dažnio priklausomybės pobūdis yra sutrikusios viduląstelinio Ca2+ apykaitos
pasekmė. Todėl miokardo elektromechaninio aktyvumo parametrų kitimo priklausomai nuo
dirginimo dažnio pobūdis suteikia galimybę įvertinti pagrindinių širdies susitraukimą reguliuojančių
sistemų funkcionavimą.
Širdies nepakankamumo metu Ca2+ kiekio mažėjimui sarkoplazminiame tinkle gali turėti
įtakos ir rianodino receptorių hiperfosforilinimas, kuris padidina RyR2 atsidarymo tikimybę ir lemia
Ca2+ jonų nuotėkį iš sarkoplazminio tinklo [Marx ir kt., 2000; Marks ir kt., 2002]. Tačiau yra darbų,
paneigiančių RyR2 hiperfosforilinimo pasireiškimą pakenktame širdies audinyje [Jiang ir kt., 2002;
Xiao ir kt., 2005]. Nepaisant neaiškumų, susijusių su RyR2 fosforilinimu, yra nustatyta, kad RyR2
ekspresija, progresuojant širdies nepakankamumui, mažėja [Mittmann ir kt., 1998; Mishra ir kt.,
2005]. Tai gali būti viena iš sutrikusios Ca2+ homeostazės priežasčių [Houser ir kt., 2000].
Sumažėjusį ST Ca2+–ATPazės aktyvumą (paprastai 24 – 50 proc.) iš dalies kompensuoja
padidėję Na+–Ca2+ mainų sistemos baltymų ekspresija ir aktyvumas [Flesch ir kt., 1996; Hobai,
O’Rourke, 2000; Sipido ir kt., 2002; Bers, Despa, 2006]. Širdies nepakankamumo metu Na+–Ca2+
mainų sistemos aktyvumas padidėja nuo 50 proc. iki 100 proc. ir tai lemia didesnį šios sistemos
“pajėgumą” Ca2+ jonus išmesti iš ląstelės raumens diastolės metu ir tuo pačiu mažesnį Ca2+
sukaupimą ST [Bers, Despa, 2006]. Hasenfuss ir kt. [1999] nustatė, kad sergančių širdies
19
nepakankamumu žmonių miokardo ląstelėse Na+–Ca2+ mainų sistemos baltymų ekspresijos
padidėjimas bei SERCA2 ekspresijos sumažėjimas yra individualus, ir todėl ST Ca2+ kiekio
mažėjimas gali būti nulemtas padidėjusios Na+–Ca2+ mainų sistemos arba sumažėjusio SERCA2a
aktyvumo.
Hasenfuss ir Pieske [2002] išskiria du širdies nepakankamumo metu pasireiškiančius Na+–
Ca2+ mainų ir ST Ca2+–ATPazės sąveikos sutrikimų tipus: (1) kai padidėja Na+–Ca2+ mainų
sistemos baltymų kiekis, bet nepakinta ST Ca2+–ATPazės kiekis; (2) kai žymiai sumažėja ST Ca2+–
ATPazės baltymų kiekis, bet nepakinta Na+–Ca2+ mainų sistemos baltymų kiekis. Pirmuoju atveju
dėl didelio bendro ląstelės gebėjimo pašalinti citozolinį Ca2+ diastolinė miokardo funkcija išlieka
nepakitusi, tuo tarpu dėl sumažėjusio Ca2+ kaupimosi ST sistolinė funkcija susilpnėja. Antrojo tipo
širdies patologijos metu tiek Ca2+ patekimas į ST, tiek bendras citozolinio Ca2+ pašalinimas
pastebimai sumažėja. Šiuo atveju pakinta ne tik sistolinė, bet diastolinė miokardo funkcija.
Širdies nepakankamumo metu sutrikusiam Ca2+ išmetimui iš ST turi įtakos ir L–tipo Ca2+
kanalų tankio sumažėjimas bei šių kanalų fosforilinimo lygio padidėjimas [He ir kt., 2001; Chen ir
kt., 2002] ir T–tubulių tankio sumažėjimas [He ir kt., 2001; Benitah ir kt., 2002; Louch ir kt., 2004].
Tačiau kiti autoriai nustatė, kad ICaL tankis išlieka nepakitęs tiek šuns širdies nepakankamumo metu
[Kaab ir kt., 1996], tiek žmogaus diliatacinės bei išemijos kardiomiopatijos metu [Mewes, Ravens,
1994]. Įvairių eksperimentinių gyvūnėlių širdies nepakankamumo modeliuose [Gengo ir kt., 1992;
Colston ir kt., 1994; Tsuji ir kt., 2000] bei tyrimuose su diliatacine bei išemine kardiomatija
sergančiųjų žmonių miokardu [Takahashi ir kt., 1992; Gruver ir kt., 1994] nustatytas sumažėjęs
dihidropiridino jungimosi vietų skaičius (L–tipo Ca2+ kanalai dažnai literatūroje vadinami
dihidropiridinų receptoriais). Armoundas ir kt. [2007] teigia, kad skirtingi duomenys apie širdies
nepakankamumo metu L–tipo Ca2+ kanalų tankio pokyčius gali priklausyti nuo nepakankamumo
laipsnio. Tačiau šie sutrikimai lemia veikimo potencialo metu mažesnį ir nesinchroninį Ca2+
išmetimą iš ST. Dėl šios priežasties mažėja Ca2+ jonų kiekio didėjimo bei pasiskirstymo citozolyje
greitis bei, palyginus su nepažeistomis širdies ląstelėmis, didėja diastolinis Ca2+ jonų kiekis
citozolyje [Houser, Margulies, 2003; Harris ir kt., 2005].
Nustatyta, kad širdies nepakankamumo metu didėja Na+ jonų kiekis ląstelėse. Šių jonų
kaupimąsi gali lemti sumažėjęs Na+ išmetimas arba padidėjęs patekimas į ląstelę. Na+ į ląstelę
patenka įvairiais būdais, t.y. per Na+–Ca2+ mainų sistemą, Na+ kanalus ir Na+–H+ mainų sistemą, o
Na+–K+ siurblys yra vienintelis būdas Na+ išmetimui iš ląstelės [Pieske, Houser, 2003; Bers, Despa,
2006]. Taigi, padidėjęs Na+ jonų kiekis širdies nepakankamumo metu gali būti dėl sumažėjusių
Na+–K+ siurblio baltymų ekspresijos (nors baltymų ekspresija sumažėja ne visais širdies
nepakankamumo atvejais) ar aktyvumo [Semb ir kt., 1998; Pogwizd ir kt., 2003; Schwinger ir kt.,
2003; Verdonck ir kt., 2003], padidėjusio Na+–H+ mainų [Morris, 2002; Baartscheer ir kt., 2005] ar
20
Na+–Ca2+ mainų sistemos aktyvumo [Hobai, O’Rourke, 2000; Sipido ir kt., 2002; Bers, Despa,
2006].
Kontraktilinių baltymų kiekis, izoformų tipas ir fosforilinimas yra svarbūs veiksniai, nuo
kurių priklauso širdies susitraukimas. Širdies nepakankamumo metu pasireiškiantys baltymų
struktūros ir funkcijos sutrikimai gali būti susiję su sumažėjusiu miokardo susitraukimu [Kamisago
ir kt., 2000; Yang ir kt., 2001; Harris ir kt., 2002; Lim ir kt., 2008]. Nustatyta, kad žmonių,
sergančių širdies nepakankamumu, o taip pat šuns širdies nepakankamumo modelyje, yra sumažėjęs
troponino I ir troponino C fosforilinimas proteinkinaze A [Messer ir kt., 2007; El-Armouche ir kt.,
2007]. Tokiais atvejais, kai pažeidžiami kontraktiliniai ir reguliatoriniai baltymai, pvz. β–miozino
sunkioji grandinė, troponinas T, α–tropomiozinas ir mioziną jungiantis troponinas C, dažnai
ligonius ištinka ankstyva staigi mirtis [Tardiff ir kt., 1999; Marin-Garcia ir kt., 2001; Lim ir kt.,
2008].
Taigi, Ca2+ homeostazės sutrikimas dėl šių jonų apykaitą reguliuojančių sistemų
funkcionavimo sutrikimo, kontraktilinių baltymų struktūriniai bei funkciniai pakitimai širdies
nepakankamumo metu lemia miokardo susitraukimo jėgos mažėjimą ir raumens atsipalaidavimo
lėtėjimą. Kaip buvo minėta, ląstelės sistemos, reguliuojančios miokardo susitraukimo–
atsipalaidavimo procesus, yra priklausomos nuo ATP kiekio ląstelėse. Be to, susidarius Ca2+
perkrovai kardiomiocitų citoplazmoje formuojasi daug aktino-miozinos tiltelių, kuriems iširti
būtinas ATP, todėl didėja ramybės įtempimas, t.y. vystosi kontraktūra [Ebashi ir kt., 1974; Donck,
Borgers, 1993; Lancaster, Harrison, 1998]. Todėl, nepaisant struktūrinių ar ekspresijos pokyčių,
miokardo susitraukimo funkcijos širdies nepakankamumo metu viena pagrindinių mažėjimo
priežasčių yra sumažėję ląstelių energetiniai resursai [Ingwall , Weiss, 2004; Weiss ir kt., 2005;
Stanley ir kt., 2005]. Nustatyta, kad, trūkstant ATP, kurio hidrolizės energija būtina sistemų,
reguliuojančių susitraukimą, fosforilinimui ir kuris tiesiogiai dalyvauja susitraukimo-
atsipalaidavimo procese, mažėja miokardo susitraukimo jėga, lėtėja atsipalaidavimas bei mažėja
veikimo potencialų trukmė. Diskusija apie veikimo potencialų trukmės mažėjimą truko iki 1983
metų, kai Noma užregistravo išeinančią K+ srovę per ATP reguliuojamus K+ kanalus (KATP) [Noma,
1983]. Šie kanalai daugelio tyrėjų vadinami metaboliniais jutikliais [Neumann ir kt., 2003; Minami
ir kt., 2004], nes jie atsidaro tik tuomet, kai ATP koncentracija miokardo ląstelėse sumažėja iki tam
tikro lygio, t.y. žemesnio negu 1 mM. Hipoksijos, išemijos, anoksijos metu, kai slopinamas
mitochondrijų kvėpavimo grandinės IV komplekso aktyvumas, ar veikiant kitiems metaboliniams
slopikliams, ir sumažėjus viduląstelinei ATP koncentracijai iki šio lygio, atsiranda išeinanti nuo
ATP priklausanti K+ srovė, todėl mažėja veikimo potencialo trukmė [Shigematsu, Arita, 1997;
Knopp ir kt., 1999; Sasaki ir kt., 2001; Knopp ir kt., 2001]. Dėl KATP kanalų atsidarymo
sutrumpėjus veikimo potencialui, sumažėja Ca2+ kiekis patenkantis į ląstelę per L-tipo Ca2+ kanalus.
21
Dėl to sumažėja ir nuo šios srovės dydžio priklausanti susitraukimo jėga. Metabolinio streso metu
šis mechanizmas priskiriamas prie miokardo apsauginių funkcijų, nes tokiu būdu išsaugomas ir taip
sumažėjęs ATP kiekis ląstelėse. Milano ir kt. [2004] tyrimuose su žiurkės miokardu nustatė, kad
chroniškos hipoksijos metu KATP apsauginis poveikis pasireiškia, kai hipoksija pertraukiama trumpų
normalaus vėdinimo epizodų (angl. short aeration episodes), kurių metu širdies raumuo gauna
pakankamą deguonies kiekį. Hipoksijos ar išemijos sąlygomis K+ padidėjusį ištekėjimą iš ląstelės ir
veikimo potencialų trukmės trumpėjimą gali sukelti ir padidėjęs viduląstelinių Na+ ir Ca2+ jonų
kiekis. Šių jonų homeostazės palaikymui kardiomiocitų viduje reikalingas ATP, kurio išeminėmis
sąlygomis kiekis yra nepakankamas [Donck, Borgers, 1993; Di Lisa ir kt., 1995; Lancaster,
Harrison, 1998].
Kaip minėta 3.1 skyriuje, veikimo potencialų trukmė ir forma priklauso nuo
depoliarizuojančių (L–tipo Ca2+ srovė, Na+ srovė, Na+–Ca2+ mainai) ir repoliarizuojančių
(trumpalaikė išeinanti K+ srovė Ito, uždelsta išlyginamoji K+ srovė Ikr, vidinio išlyginimo K+ srovė
IK1, chloro srovė, Na+–K+ATPazė) srovių, kurios aktyvuojasi plato fazės metu, balanso. Kai kuriais
širdies nepakankamumo atvejais (dažniausiai esant galutinės stadijos širdies nepakankamumui) tiek
žmonių, tiek eksperimentinių gyvūnų miokardo veikimo potencialų trukmė yra padidėjusi
[Wickenden ir kt., 1998; Tomaselli, Marban, 1999]. Manoma, kad lemiančią įtaką VP trukmės
didėjimui šiais atvejais gali turėti sumažėjusios K+ srovės [Wickenden ir kt., 1998]. Nustatyta, kad
širdies nepakankamumo ir hipertrofijos metu mažėja trumpalaikės išeinančios K+ srovės Ito tankis
[Yao ir kt., 1997] ir dėl to didėja VP trukmė [Wickenden ir kt., 1998]. Tačiau Tomaselli ir Marban
[1999] pabrėžia, kad Ito yra trumpalaikė, todėl jos vaidmuo didesnių gyvūnų ir žmonių VP trukmei
išlieka diskusinis.
3.4. Mitochondrijų oksidacinio fosforilinimo sutrikimai esant širdies
nepakankamumui
Širdies nepakankamumo metu nustatyta funkciniai bei struktūriniai (membranų, matrikso)
mitochondrijų sutrikimai [Sharov ir kt., 1996; Sharov ir kt., 2000], t.y. sumažėja kvėpavimo
grandinės kompleksų [Sharov ir kt., 2000; Gong ir kt., 2003] ir kitų oksidacinio fosforilinimo
sistemos grandžių aktyvumai [Lesnefsky ir kt., 2001; Casademont, Miro, 2002; Stanley ir kt.,
2005], dėl to sumažėja ATP, fosfokreatino ir NAD kiekiai [Starling ir kt., 1998; Beer ir kt., 2002;
Ingwall, Weiss, 2004]. Tiriant sergančiųjų kardiomiopatija miokardo mitochondrijų funkcijos
sutrikimus, gauti skirtingi duomenys. Kai kuriomis sąlygomis aptikti atskirų kvėpavimo grandinės
22
fermentų aktyvumų sumažėjimai: I komplekso [Hardy ir kt., 1991; Zeviani ir kt., 1995; Ide ir kt.,
1999; Enns ir kt., 2000; Scheubel ir kt., 2002; Paradies ir kt., 2004], III komplekso [Buchwald ir kt.,
1990; Marin-Garcia, Goldenthal, 1998; Jarreta ir kt., 2000; Hoppel ir kt., 2002], IV komplekso
[Buchwald ir kt., 1990; Zeviani ir kt., 1995; Marin-Garcia, Goldenthal, 1998] bei F1F0–ATPazės
[Marin-Garcia, Goldenthal, 1998]. Kitomis aplinkybėmis nustatyti sudėtiniai (daugybiniai)
mitochondrijų fermentų defektai, daugiausiai susiję su III ir IV kompleksais [Marin-Garcia,
Goldenthal, 1995]. Miokardo išeminio pakenkimo metu taip pat nustatyti I bei III kompleksų
aktyvumų sumažėjimai [Rouslin, 1983; Maurer, Zierz, 1994]. Įdomu tai, kad kvėpavimo grandinės
II komplekso, kuris koduojamas branduolio DNR, aktyvumas sergančiųjų kardiomiopatija išlieka
nepakitęs [Casademont, Miro, 2002; Scheubel ir kt., 2002]. Paradies ir kt. [2004] eksperimentų su
mitochondrijomis, izoliuotomis iš žiurkės širdies, metu nustatė, kad išemijos metu I kvėpavimo
grandinės komplekso aktyvumas sumažėjo 28 proc. Teigiama, kad tokį aktyvumo pokytį galėjo
nulemti kardiolipino, kuris yra būtinas I komplekso optimaliam aktyvumui, kiekio sumažėjimas dėl
ROS susidarymo [Paradies ir kt., 2004]. Įvairių tyrimų metu parodyta, kad kvėpavimo grandinės
slopikliai mažina mitochondrijų membraninį potencialą, nuo kurio priklauso ATP sintezė.
Nustatyta, kad rotenonas didina žiurkės širdies ląstelių kultūros gliukozės sunaudojimą bei mažina
ląstelių mitochondrijų membraninį potencialą [Yuhki ir kt., 2001]. Radad ir kt. [2006] tyrimų su
embrioninėmis pelių smegenų ląstelėmis metu nustatė, kad mitochondrijų kvėpavimo grandinės I
komplekso aktyvumo slopinimas rotenonu mažino mitochondrijų membraninį potencialą, didino
reaktyvių deguonies formų susidarymą bei kvėpavimą „pastūmėjo“ labiau link anaerobinės
būsenos. I komplekso aktyvumo sumažėjimas nėra toks pavojingas kaip IV komplekso, nes
oksiduojamų substratų elektronai į kvėpavimo grandinę gali patekti per II kompleksą. Oksiduojantis
1 moliui NADH dirba visi trys protonų siurbliai (I, III, IV kompleksai) ir susidaro 3 moliai ATP.
Oksiduojant FADH2 susidaro tik 2 moliai ATP, nes tik 2 protonų siurbliai (III, IV kompleksai)
perneša protonus iš matrikso. III komplekso aktyvumo sumažėjimas gali lemti visišką kvėpavimo
blokavimą. Pats pavojingiausias yra IV komplekso aktyvumo sumažėjimas, nes katalizuoja
vienintelę negrįžtamą deguonies redukcijos reakciją ir todėl gali visiškai sustoti kvėpavimas
[Reimer, Jennings, 1992]. Tai patvirtina ir Zhang ir kt. [2001] tyrimai, kurie tyrimuose su žiurkės
hepatocitais nustatė, kad I ir II kvėpavimo grandinės kompleksų aktyvumų slopinimas rotenonu ir
tenoiltrifluoroacetonu (angl. thenoyltrifluoroacetone) viduląstelinio ATP kiekį mažino vidutiniškai,
tuo tarpu III ir IV kompleksų aktyvumų slopinimas antimicinu A ir cianidu ATP kiekį mažino
greitai ir žymiai labiau. Visi šie slopikliai sukėlė ląstelių mirtį, tik pirmu atveju tai buvo susiję su
lipidų peroksidacija, antruoju – dėl energijos sumažėjimo iki kritinio lygio [Zhang ir kt., 2001]. Be
to, Vanden Hoek ir kt. [1997] teigia, kad slopinant I komplekso aktyvumą rotenonu, elektronų
23
pernašos grandinė slopinama nepilnai ir susidaro žymiai mažiau ROS nei III ir IV kompleksų
slopinimo antimicinu A ir cianidu metu.
Mitochondrijų kvėpavimo grandinė yra vienintelė ląstelės metabolizmo vieta, kuri turi
dvigubą genetinę kontrolę: branduolio ir mitochondrijų. Mitochondrijų DNR (mtDNR) koduoja
keturių kompleksų subvienetus: septynis I komplekso subvienetus (ND1, 2, 3, 4, 4L, 5 ir 6), vieną
III komplekso subvienetą (citochromą b), tris IV komplekso subvienetus (I, II, III citochromo c
oksidazes) bei du F1F0–ATP sintazės subvienetus (A6 ir A8). Visi kiti mitochondrijų kvėpavimo
grandinės baltymai (~70) yra koduojami branduolio DNR, sintezuojami citoplazmoje ir
importuojami į mitochondrijas [Jons, 1996; Casademont, Miro, 2002; DiMauro, Schon, 2003].
Sergančiųjų kardiomiopatija širdžių mitochondrijų DNR aptinkamos įvairios mutacijos (mt
tRNR bei struktūrinių genų taškinės mutacijos, pavienės ar daugybinės delecijos), kurios lemia
sumažėjusį kvėpavimo grandinės fermentų aktyvumą [Casademont, Miro, 2002]. Aktyvumų
santykio pakitimas tarp skirtingų mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksų sutrikdo efektyvų
elektronų perdavimą elektronų grandine [Kwong, Sohal, 2000]. Miokardas (taip pat ir smegenys,
endokrininiai organai, skeleto raumenys) linkęs kaupti mutuotas mtDNR ir kai pasiekiamas kritinis
slenkstis, pasireiškia biocheminis sutrikimas. Be to, mtDNR mutacijos gali atsirasti spontaniškai
embrionuose, somatinėse ląstelėse ir sukelti atsitiktinę ligą [Casademont, Miro, 2002]. Mutacijos
gali su amžiumi kauptis visų žmonių postmitotiniuose audiniuose ir prisidėti prie
neurodegeneratyvinių ligų bei širdies nepakankamumo vystymosi [Kwong, Sohal, 2000]. mtDNR
yra labiau jautresnė mutacijoms, nei branduolio DNR, nes jai būdinga silpna reparacijos sistema,
neturi apsauginių histonų bei yra terpėje, kur vyksta oksidaciniai procesai [Graff ir kt., 1999;
Leonard, Schapira, 2000]. Manoma, kad šie pokyčiai gali atsirasti dėl reaktyvaus deguonies
kaupimosi mitochondrijose. Normaliomis sąlygomis apie 5 proc. naudojamo mitochondrijose
deguonies yra paverčiama į reaktyvų deguonį, kuris yra šalutinis elektronų pernašos grandinės
produktas. Dėl mtDNR neturėjimo efektyvios reparacinės sistemos bei apsauginių histonų,
reaktyvus deguonis reaguoja su DNR ir sukelia mutacijas. Laisvieji radikalai veikia tose vietose kur
jie ir susidaro, todėl jie taip pat pažeidžia ir elektronų pernašos grandinę. Taip yra dar labiau
pabloginama kvėpavimo funkcija, kuri dar daugiau generuoja laisvųjų radikalų, vyksta membranos
fosfolipidų ir baltymų oksidacinis pažeidimas bei įvyksta dar daugiau mtDNR mutacijų [Vanden
Hoek ir kt., 1997; Graff ir kt., 1999; Ide ir kt., 2001; Casademont, Miro, 2002; Genova ir kt., 2004].
Be to, reaktyvūs deguonies radikalai gali indukuoti ląstelės apoptozę [Kroemer ir kt., 1998; Marin-
Garcia, 2001, Hare, 2001].
Širdies nepakankamumas kartais priskiriamas prie pirminių mitochondrinių ligų (tokių kaip
mitochondrinė encefalomiopatija, MELAS, MERFF, Kearn-Sayre sindromas ir kt.), tačiau
mokslininkai diskutuoja, ar mitochondrijų funkcijos sutrikimas yra širdies nepakankamumo
24
priežastis ar pasekmė. Vieni teigia, kad idiopatinės kardiomiopatijos priežastis gali būti mtDNR,
kuri koduoja kvėpavimo grandinės kompleksų subvienetus, mutacijos [Suomalainen ir kt., 1992;
Bobba ir kt., 1995]. Kiti teigia, kad mtDNR mutacijos įvyksta dėl širdies funkcijos sutrikimo bei
padidėjusio laisvų deguonies radikalų kiekio [Sharov ir kt., 1998; Jarreta ir kt., 2000; Scheubel ir kt,
2002]. Tačiau, mitochondrijų elektronų pernašos grandinės kompleksų aktyvumų sumažėjimas
jeigu ir nėra priežastis, tai neabejotinai turi įtakos širdies nepakankamumo progresavimui
[Casademont, Miro, 2002]. Dėl pablogėjusios mitochondrijų funkcijos mažėja mitochondrijų
transmembraninis potencialas, ATP kiekis, pasireiškia susitraukimo funkcijos sutrikimas, dėl
citochromo c atsipalaidavimo gali būti indukuojama apoptozė bei galiausiai įvykti struktūriniai
miokardo pakitimai [Kroemer ir kt., 1998; Marin-Garcia ir kt., 2001; Casademont, Miro, 2002].
Mitochondrijų F1F0–ATP sintazė normaliomis sąlygomis fosforilina ADP. Tačiau, kai dėl
įvairių priežasčių (išemijos, širdies nepakankamumo) sumažėja mitochondrijų membraninis
potencialas, F1F0–ATP sintazė katalizuoja grįžtamą ATP virtimo į ADP bei neorganinį fosfatą
reakciją ir pradeda veikti kaip ATP vartotojas, t.y. tampa F1F0–ATPaze, dėl to mažėja ATP kiekis.
Eksperimentais parodyta, kad išemijos metu 35 – 50 proc. miokardo ATP buvo suvartoti šios
ATPazės [Rouslin ir kt., 1990; Jennigs ir kt., 1991]. Tokiu būdu, ATP trūkumo sąlygomis
mitochondrijos virsta nenaudingos ląstelėms, nes tampa papildomu ATP vartotoju [Duchen, 1999].
Mitochondrijų matrikse aptinkamas slopinantis baltymas IF1, kuris blokuoja F1F0–ATPazės
hidrolazinį aktyvumą. Nustatyta, kad gyvūnų miokardo ląstelėse, kurių širdies ritmas yra didelis
(žiurkės, pelės), šio baltymo neaptinkama visai arba žymiai mažiau nei gyvūnų, kurių širdies ritmas
nedidelis (triušio, šuns, taip pat ir žmogaus) [Rouslin, Broge, 1990; Takeo, Nasa, 1999; Green,
Grover, 2000; Grover ir kt., 2004]. Todėl žiurkės širdis yra informatyvus eksperimentinis objektas
ir modelis, tiriant F1F0–ATPazės aktyvumo pokyčių įtaką širdies susitraukimo funkcijai. Tačiau IF1
baltymo apsauginis poveikis nėra pakankamas, kad būtų sustabdytas miokardo ląstelių energetinių
resursų eikvojimas, padidėjus F1F0–ATPazės aktyvumui [Jennings ir kt.,1991; Grover ir kt., 2004].
Taigi, papildomas šio fermento slopinimas gali būti svarbiu apsauginiu mechanizmu, esant širdies
nepakankamumui [Jennings ir kt., 1991; Vander Heide ir kt., 1996; Grover ir kt., 2004]. Tai
pastebėta tyrimuose su žiurkės ir šuns išeminiu miokardu, kuriuose mitochondijų ATPazės slopiklis
oligomicinas sulėtino ATP koncentracijos mažėjimą ir prailgino laiką iki kontraktūros vystymosi
pradžios [Vuorinen ir kt., 1995; Green ir kt., 1998; Solaini, Harris, 2005].
Taigi, nors literatūros duomenimis širdies nepakankamumo sąlygomis mitochondrijų
kvėpavimo grandinės kompleksų, kurie dalyvauja elektrocheminio protonų gradiento formavime,
aktyvumas sumažėja, tačiau nepakanka tyrimų apie kiekvieno iš kvėpavimo grandinės kompleksų
įtaką tokiems svarbiems procesams kaip miokardo susitraukimas – atsipalaidavimas, ir ypač žmonių,
sergančių širdies nepakankamumu. Be to, svarbu nustatyti atskirų kvėpavimo grandinės kompleksų
25
blokavimo poveikį širdies ląstelių susitraukimą reguliuojančiai L–tipo Ca2+ srovei per sarkolemos L–
tipo Ca2+ kanalus. Oksidacinį fosforilinimą galima slopinti, veikiant įvairias šios sistemos grandis.
Šiame darbe I elektronų pernašos grandinės komplekso aktyvumas buvo slopinamas rotenonu, III –
antimicinu A, IV – anoksija arba NaCN.
Energetinio metabolizmo slopinimas eksperimente gali būti sukeliamas ir naudojant
oksidacinio fosforilinimo skyriklį FCCP (karbonilcianid-p-(tri-fluorometoksi)fenilhidrazonas), kuris
atskiria elektronų pernašą nuo ATP sintezės; atskirto kvėpavimo metu protonai toliau metami į
tarpmembraninę erdvę, tačiau jie dėl didelio membranos laidumo tuoj pat išsisklaido. Be protonų
gradiento F1F0–ATP sintazė negali sintetinti ATP [Kadenbach, 2003; Brennan, Berry ir kt., 2006].
Nors yra duomenų, kad žiurkės širdies mitochondrijų oksidacinio fosforilinimo dalinis atskyrimas
mažomis FCCP koncentracijomis pagerina širdies funkcijos atsistatymą po išeminio periodo, tačiau
pilnas mitochondrijų oksidacinio fosforilinimo atskyrimas sukelia susitraukimo funkcijos
nepakankamumą [Brennan, Southworth ir kt., 2006; Brennan, Berry ir kt., 2006].
3.5. Energetinių substratų metabolizmo pokyčiai esant širdies nepakankamumui
Pagrindinis suaugusio žmogaus miokardo naudojamas energetinis substratas (aerobinėmis
sąlygomis) – laisvosios riebalų rūgštys, kurių oksidacijos metu pagaminama apie 70 proc. visos
miokardo funkcijoms palaikyti reikalingos energijos [Lee ir kt., 2004]. Eksperimentiniais tyrimais
nustatyta, kad riebalų rūgštys žymiai padidina išorinės mitochondrijų membranos pralaidumą ADP.
Be to, didesnės jų koncentracijos pažeidžia išorinės ir vidinės mitochondrijų membranų vientisumą
[Oliveira, 2005].
Nors riebalų rūgščių oksidacijos metu susintetinamas didesnis ATP kiekis, nei glikolizės
metu, tačiau taip pat ir sunaudojama daugiau deguonies. Riebiųjų rūgščių atveju, tam pačiam
kiekiui ATP pagaminti sunaudojama 10 – 15 proc. daugiau deguonies, nei gliukozės atveju. Todėl
gliukozės metabolizmas deguonies atžvilgiu yra labiau efektyvus, nes naudojant tokį patį deguonies
kiekį susidaro apie 15 proc. daugiau ATP [Lee ir kt., 2004; Essop, Opie, 2004; Morrow, Givertz,
2005]. Pradinėje širdies nepakankamumo stadijoje miokardo energetinis metabolizmas išlieka
santykinai normalus, tačiau nepakankamumui progresuojant, mažėja mitochondrijų oksidacinio
metabolizmo aktyvumas, didėja glikolizės aktyvumas, dėl kateholaminų sukeltos lipolizės padidėja
laisvųjų riebalų rūgščių koncentracija kraujyje [Lopaschuk ir kt., 2005]. Intensyvi laisvųjų riebalų
rūgščių oksidacija slopina gliukozės oksidaciją, tiesiogiai blokuodama piruvato dehidrogenazę
(PDH), todėl klinikoje pacientams, sergantiems išemine širdies liga, skiriama preparatų, tokių kaip
26
perheksilinas, trimetazidinas, ranolazinas, slopinančių riebalų rūgščių oksidaciją. Manoma, kad
veikiant šioms medžiagoms, miokardas nuo riebalų rūgščių oksidacijos „pereina“ prie gliukozės
oksidacijos [Lee ir kt., 2004; Essop, Opie, 2004; Di Napoli ir kt., 2005]. Laisvos riebalų rūgštys gali
veikti kaip ląstelės kvėpavimo skyrikliai, dėl to mažėja ATP sintezė bei didėja deguonies
eikvojimas [Essop, Opie, 2004]. Taigi, padidėjęs riebalų rūgščių kiekis kraujyje didina laktato ir
protonų kaupimąsi, mažina viduląstelinį pH ir pažeidžia ląstelės funkciją. Kitos pasekmės,
susijusios su riebalų r. pertekliumi, yra sutrikusi Ca2+ jonų apykaita, oksidacinis stresas ir miocitų
apoptozė [Kristo ir kt., 2004; Morrow, Givertz, 2005]. Tai paaiškina širdies nepakankamumo metu
padidėjusią angliavandenių metabolizmo svarbą suaktyvėjus glikolizei bei sumažėjus riebiųjų
rūgščių oksidacijos intensyvumui [Sack ir kt., 1996; Lei ir kt., 2004; Stanley ir kt., 2005; Lopaschuk
ir kt., 2005]. Todėl glikolizės produktas piruvatas gali turėti įtakos viduląstelinio ATP sintezei (pav.
3.4).
MCT
3.4 pav. Miokardo substratų metabolizmo keliai. CPT-I – karnitino palmitoiltransferazė-I; FAT – riebalų rūgščių nešiklis; G 6-P – gliukozės 6-fosfatas; GLUT – gliukozės nešiklis; MCT – monokarboksilinių rūgščių nešiklis; PDH – piruvato dehidrogenazė [modifikuota pagal Stanley ir kt., 2005].
Skirtingai nei suaugusio žmogaus, embriono širdies (kurioje vyrauja hipoksinės sąlygos)
veiklai palaikyti pagrindiniu energetiniu substratu tampa angliavandeniai ir tik postnatalinio periodo
metu – laisvosios riebalų rūgštys. Miokardo išemijos metu, metaboliniai adaptaciniai mechanizmai
Piruvatas
GLUT
Glikolizė
G 6-PGlikogenas
ADP + Pi
ATPLaktatas
Mitochondrija
Citozolis
PDH
Gliukozė
Acetil-CoA
Acetil-CoA
NADH
Trikarboniniųrūgščių ciklas
Elektronų transporto grandinė
ATPazė
Riebalų rūgščių β-oksidacija
ADP+ Pi
ATP
CPT-I FAT Riebalųrūgštys
Trigli-ceridas
H+
O2
MCTPiruvatas
GLUT
Glikolizė
G 6-PGlikogenas
ADP + Pi
ATPLaktatas
Mitochondrija
Citozolis
PDHPDH
Gliukozė
Acetil-CoA
Acetil-CoA
NADH
Trikarboniniųrūgščių ciklasTrikarboniniųrūgščių ciklasTrikarboniniųrūgščių ciklas
Elektronų transporto grandinė
ATPazė
Riebalų rūgščių β-oksidacija
ADP+ Pi
ATP
CPT-I FAT Riebalųrūgštys
Trigli-ceridas
H+
O2
27
efektyviai atkartoja embrioninio energetinio metabolizmo metu vykstančius procesus [Lee ir kt.,
2004], kuriuose padidėja angliavandenių įtaka.
Nustatyta, kad širdies nepakankamumo metu ląstelių energetinis metabolizmas yra sutrikęs,
todėl pastaraisiais metais ieškoma būdų, gerinančių miokardo energetinę būseną, nuo kurios
tiesiogiai priklauso susitraukimo funkcijos efektyvumas. Vienas iš labiausiai vystomų ir tiriamų
būdų yra miokardo energetinio metabolizmo substratų naudojimas [Lopaschuk ir kt., 2002; Stanley
ir kt., 2005].
Nustatyta, kad piruvatas, kuris yra substratas tolimesnei ATP gamybai Krebso cikle bei
oksidacinio fosforilinimo metu, turi teigiamą inotropinį poveikį ir gerina kontraktilinę raumens
funkciją tiek sveikose, tiek pakenktose eksperimentinių gyvūnėlių širdyse [Yanos ir kt., 1994;
Tejero-Taldo ir kt., 1998], in vitro perfuzuotose širdyse [Scholz ir kt., 1995], izoliuotuose
miocituose [Martin ir kt., 1998]. Be to įrodyta, kad piruvatas padidina žiurkės skilvelio viduląstelinę
Ca2+ koncentraciją [Martin ir kt., 1998] bei izoliuotos triušio širdies Ca2+ jonų kiekį, patenkančio ir
išmetamo iš ST [Hermann ir kt., 2000].
Piruvatas yra alifatinis monokarboksilatas, natūraliai aptinkamas organizmo skysčiuose. Į
citoplazmą piruvato anijonai patenka susijungę su protonu, per sarkolemos monokarboksilato
protonų sąnašos sistemą (angl. simport). Nors ši sistema taip pat perneša ir kitus alifatinius
monokarboksilatus, tokius kaip laktatas ir ketoniniai kūnai, tačiau jos giminingumas piruvatui yra
daug didesnis [Mallet, 2000].
Sveiko žmogaus piruvato koncentracija plazmoje – apie 80–100 µM, t.y. mažesnė nei
gliukozės (4,1 – 6,4 mM) ar laktato (0,63 – 2,44 mM), tačiau šio metabolito koncentracija staiga
padidėja 2 – 3 kartus po fizinių krūvių, kuomet plazmos piruvato kiekis daug labiau padidėja,
lyginant su plazmos laktato koncentracija [Mallet, 2000].
Glikolizės reakcijų metu, iš vienos gliukozės molekulės susidaro 2 molekulės piruvato.
Bendra glikolizės oksidacijos iki piruvato lygtis:
Gliukozė + 2 ADP + 2 Pn + 2 NAD+ → 2 piruvato + 2 ATP + 2 NADH + 2 H+ + 2 H2O,
Reakcijos ∆Go –85 kJ/mol.
Tolesnis piruvato metabolizmas miokardo ląstelėje – mitochondrijose vykstantis oksidacinis
fosforilinimas (aerobinė jo oksidacija), kurios metu susintetinamas žymiai didesnis ATP kiekis.
Aerobinėmis sąlygomis piruvatas pilnai oksiduojamas iki anglies dvideginio (CO2) ir vandens
(H2O) [Martin ir kt., 1998].
Piruvatą iš citoplazmos į mitochondrijų matriksą perneša H+–monokarboksilato nešiklis,
esantis vidinėje mitochondrijų membranoje. Patekus į mitochondrijų matriksą vyksta nuoseklios
28
fermentinės reakcijos – katalizuojamas piruvato dekarboksilinimas iki acetil–KoA. Šią reakciją
katalizuoja piruvato dehidrogenazė (PDH) [Mallet, 2000]:
Piruvatas + NAD+ → acetil–KoA + CO2 + NADH
Reakcijos metu padidėja NADH/NAD+ ir FADH2/FAD+ santykis mitochondrijose, galintis
sąlygoti citoplazmos fosforilinimo potencialo didėjimą, kuris yra varomoji ATP sintezės jėga [Zima
ir kt., 2003]. Piruvatas didina ląstelės fosforilinimo potencialą ([ATP]/[ADP]×[Pn], [PCr]/[Pn]; Pn -
neorganinis fosfatas; PCr - fosfokreatinas), reguliuoja viduląstelinę pH bei mažina Pn koncentraciją
citoplazmoje [Scholz ir kt., 1995]. Woo ir kt. [2004] nustatė, kad etilpiruvatas padidino ATP kiekį
žiurkės širdies ląstelėse ir išsaugojo miokardo funkciją reperfuzijos metu. Nustatyta, kad esant
piruvatui, [PCr]/[Pn] santykis, atspindintis pusiausvyrą tarp energijos gamybos ir jos naudojimo,
žymiai padidėja lyginant su glikolizės substratu – gliukoze. Be to, piruvato perfuzijos metu,
nustatytas didesnis PCr koncentracijos padidėjimas bei Pn sumažėjimas, lyginant su gliukoze. Pn
koncentracijos sumažėjimas lemia miokardo susitraukimo jėgos padidėjimą. Esant didelei Pn
koncentracijai, mažesnę susitraukimo jėgą lemia aktino–miozino ATPazės slopinimas, todėl
sumažėja skersinių tiltelių tarp aktino ir miozino skaičius [Zweier, Jacobus, 1987].
Kaip minėta ankstesniame skyriuje, ląstelėse vykstančių fermentinių oksidacijos – redukcijos
reakcijų metu susidaro šalutiniai produktai – reaktyvios deguonies formos (ROS). Chemiškai ROS
yra aktyvesnės už molekulinį deguonį. Tam tikra ROS koncentracija nuolat aptinkama organizme ir
dalyvauja daugelyje fiziologinių procesų (apoptozėje, ląstelės dauginimosi reguliacijoje, signalo
perdavime ir kt.), tačiau padidėjusi ROS koncentracija gali sukelti ląstelių pažeidimus [Oliveira,
2005]. Žmogaus organizme gausu įvairių antioksidacinių sistemų, padedančių apsisaugoti nuo
žalingo ROS poveikio [Squires ir kt., 2003]. Greta minėtų piruvato poveikių, jis pasižymi ir
antioksidaciniu poveikiu, sąlygodamas viduląstelinės antioksidacinės sistemos homeostazę ir
peroksidų neutralizavimą [Bassege ir kt., 2000; Zima, ir kt., 2003]. Antioksidacinis piruvato
poveikis pasireiškia per 2 mechanizmus:
(1) piruvatas tiesiogiai neutralizuoja vandenilio ir lipidų peroksidus nefermentinių reakcijų
metu:
Piruvatas + H2O2 → acetatas + CO2 + H2O;
(2) netiesioginiu veikimu – piruvato karboksilinimo metu padidinama citrato koncentracija
miokarde [Mallet, Sun, 1999]. Citratas inhibuoja fosfofruktokinazę ir glikolizės kelias nukreipiamas
heksozės monofosfato kryptimi – pagrindiniam NADPH šaltiniui regeneruoti redukuotą glutationą
(GSH) iš oksiduotos gliutationo disulfido formos (GSSG) [Tejero-Taldo ir kt., 1999; Mallet, 2000].
29
Veikdamas šiais dviem mechanizmais, piruvatas atkuria išemijos metu sumažėjusį GSH/GSSG
santykį pažeistame miokarde [Oliveira, 2005].
Nors pastaruoju metu piruvato poveikis eksperimentiniuose širdies nepakankamumo
modeliuose yra intensyviai tiriamas, tačiau nepakanka duomenų apie šio metabolizmo substrato
įtaką žmonių, sergančių širdies nepakankamumu, susitraukimo jėgos, raumens atsipalaidavimo
laiko bei veikimo potencialų kitimui. Nėra ištirtas piruvato poveikis sergančiųjų širdies
nepakankamumu miokardo susitraukimo jėgos/atsipalaidavimo priklausomybėms nuo dirginimo
dažnio (modeliuojant širdies padidintą krūvį), kurių pobūdį lemia sarkoplazminio tinklo Ca2+–
ATPazės, RyR kanalų, sarkolemos Na+–Ca2+ mainų sistemos aktyvumai [Crozatier, 1998; Pieske ir
kt., 1999; Inagaki ir kt., 1999].
Širdies nepakankamumo metu pakinta ne tik ATP sintezė, bet ir β–adrenerginė miokardo
susitraukimo reguliacija, sumažėja dominuojančių β1–adrenerginių receptorių (β–AR) aktyvumas ir
skaičius [Bristow, 1993]. Nustatyta, kad žmogaus širdies nepakankamumo metu padidėja β–AR
kinazės kiekis. Ši kinazė, fosforilindama β–AR juos inaktyvina ir sukelia komplekso β–AR–Gs–
ACazė suirimą [Devic ir kt., 2001]. β–adrenerginės sistemos sutrikimai lemia mažesnį PKA, kuri
dalyvauja L–tipo Ca2+ kanalų, fosfolambano, RyR bei kontraktilinių baltymų fosforilinime,
aktyvumą [Brodde, 1993; Messer ir kt., 2007]. Todėl β–AR agonistų panaudojimas yra vienas iš
širdies ir kraujagyslių sistemos ūmių sutrikimų gydymo būdų, kurio metu ląstelėje padidinama
trumpalaikė viduląstelinio Ca2+ koncentracija (angl. Ca2+ transient), uždelsiama Ca2+ srovės
inaktyvacija [Devic ir kt., 2001], todėl didėja miokardo susitraukimo jėga [Altschuld ir kt., 1995].
Tačiau miokardo susitraukimo didinimas tik inotropinėmis medžiagomis, tokiomis kaip β–AR
agonistai, didina ir deguonies bei įvairių energetinių substratų poreikį [Hermann ir kt., 2002], todėl
susitraukimo efektyvumas mažėja. Būtent tai ir yra nepageidaujama β–AR agonistų savybė, gydant
pacientus, sergančius širdies nepakankamumu. Be to, nustatyta, kad didelės β–AR agonistų dozės
gali sukelti kardiomiocitų apoptozę, didinti ROS susidarymo tikimybę [Communal, Colucci, 2005].
Skirtingai nei katecholaminų sukeltas inotropizmas, piruvatas ne tik neišeikvoja, bet kartu ir
padidina energetinį miokardo ląstelių rezervą bei palaiko viduląstelinę gliutationo antioksidacinę
sistemą. Tejero-Taldo su bendraautoriais [1998] teigia, jog antioksidacinis piruvato poveikis, labiau
nei energetinio rezervo padidinimas, sustiprina teigiamą inotropinį β–AR agonistų poveikį. Todėl
kartu vykstantis β–AR ir energetinio miokardo metabolizmo stimuliavimas galėtų sumažinti žalingą
β–AR stimuliavimo poveikį, kartu išsaugant energetinius miokardo ląstelių išteklius bei padidėjusią
susitraukimo jėgą.
Eksperimentiniais tyrimais, atliktais su triušio miokardo preparatais, nustatyta, jog piruvato ir
β–adrenerginių medžiagų veikimas kartu sumažino didelių katecholaminų dozių sukeltą žalingą
energetinių išteklių eikvojimą [Hermann ir kt., 2000]. Tačiau nėra ištirta kokią įtaką turi šių
30
inotropinių medžiagų, skirtingais mechanizmais stimuliuojančių miokardo susitraukimą,
kombinacija žmonių, sergančių širdies nepakankamumu, miokardo elektromechaninio aktyvumo
parametrams, kintant širdies ritmui bei krūviui (eksperimente šios sąlygos modeliuojamos keičiant
miokardo dirginimo dažnius).
31
4. MEDŽIAGOS IR DARBO METODAI
Eksperimentiniams tyrimams naudoti Wistar žiurkių (300 – 350 g) širdies papiliariniai
raumenėliai ir žmonių kairiojo skilvelio preparatai. Eksperimentai su žiurkių širdies preparatais
atlikti laikantis tarptautinių elgesio su eksperimentiniais gyvūnais taisyklių ir gavus Lietuvos
Respublikos Valstybinės maisto ir veterinarijos tarnybos leidimą Nr. 122 (2004 m. gruodžio 3 d.
įsakymo Nr. B1-1047). Tyrimams su žmonių širdies preparatais gautas Kauno regioninio
biomedicininių tyrimų etikos komisijos leidimas Nr. BE–2–18 (2006 m. balandžio 12 d. protokolo
Nr. 39/2006).
4.1. Miokardo elektromechaninio aktyvumo registravimo metodika
Preparatų paruošimas. Žiurkių širdis buvo izoliuojama numarinus gyvūnėlį staigiu smūgiu
galvos smegenų srityje ir atvėrus krūtinės ląstą. Išimta širdis buvo preparuojama atvėsintame (+10°
C) Šv. Tomo kardiopleginiame tirpale (4.1 lentelė). Papiliariniai raumenėliai buvo izoliuojami iš
širdies kairiojo skilvelio. Raumenėlių ilgis – 2,76 ± 0,1 mm, storis – 1,4 ± 0,08 mm, svoris – 3,7 ±
0,35 mg.
Žmogaus kairiojo skilvelio preparatai (0,25 – 1 cm2) buvo paimti aortos vožtuvo protezavimo
bei mitralinio vožtuvo plastikos operacijų metu Kauno medicinos universiteto klinikose. Daugelis
pacientų prieš operaciją vartojo vaistus (kalcio kanalų, β–adrenoreceptorių, angiotenziną
konvertuojančių fermentų blokatorius, NO donorus, diuretikus ir/ar antiaritminius preparatus). Taip
pat pacientai vartojo raminamuosius vaistus, antibiotikus. Pacientų klinikiniai parametrai pateikti
rezultatų skyriuose. Izoliuoti širdies preparatai buvo transportuojami atvėsintame (+10° C) Šv.
Tomo kardiopleginiame tirpale (4.1 lentelė). Šiame tirpale buvo ruošiami eksperimentui tinkami
širdies preparatai, kurių ilgis buvo 3,66 ± 0,17 mm, storis – 1,88 ± 0,09 mm, svoris – 9,59 ± 0,92
mg.
Tiek žiurkės, tiek žmogaus izoliuotiems širdies preparatams abiejuose galuose užrišdavome
kilpeles ir dėdavome į termostatuojamą eksperimentinę kamerą, nuolatos perfuzuojamą (4 ml/min.
greičiu) oksigenuotu atitinkamai žiurkės fiziologiniu (4.2 lentelė) ar žmogaus fiziologiniu Tyrode
tirpalu (4.3 lentelė) (pH 7,4; temperatūra 36 ± 0,5°C; pO2 – 560–600 mmHg). Vieną raumenėlio
galą už kilpelės nejudamai pritvirtindavome prie kameros sienelės, kitą – prie judesio daviklio
(mechanotrono) (Harward apparatus).
32
4.1 pav. pateikta principinė įrangos miokardo elektromechaniniam aktyvumui tirti schema.
Širdies preparatas (5), patalpintas termostatuojamoje eksperimentinėje kameroje, buvo ištempiamas.
Susitraukimas registruotas izometriniu režimu, t.y. raumenėlis tempiamas tiek, kad jo susitraukimo
jėga būtų maksimali nekintant raumenėlio ilgiui. Susitraukimas registruotas judesio davikliu
(Harward aparatus, JAV) (7), kuris per diferencinį stiprintuvą (12) sujungtas su oscilografu CI-69
(16) ir savirašiu (Nihon Kohden, Japonija) (13) bei per analoginį – skaitmeninį keitiklį (Nihon,
Japonija) (14) – su kompiuteriu (15). Raumenėliai buvo dirginami chloruotais sidabriniais
elektrodais (3). Šie elektrodai per izoliacinį bloką (2) sujungti su stimuliatoriumi ESU-2 (1). Žiurkių
širdies papiliariniai raumenėliai dirginti stačiakampiais impulsais 1,5 Hz dažniu, žmogaus širdies
preparatai – 1 Hz dažniu. Impulsų trukmė 2–5 ms, amplitudė – 3–4 kartus didesnė už slenkstinę. 14
1 15
49 11 16
2 6 5
10
7 8 12
13
3
4.1 pav. Miokardo elektromechaninio aktyvumo registravimo įrangos schema. 1 – stimuliatorius ESU-2; 2 – izoliacinis blokas; 3 – stimuliuojantys elektrodai; 4 – mikroelektrodas; 5 – raumenėlis; 6 – indiferentinis elektrodas; 7- judesio daviklis (Harward aparatus); 8, 9 – stiprintuvai; 10 – kalibratorius; 11, 12 – diferenciatoriai; 13 – savirašis (Nihon Kohden, Japonija); 14 – analoginis – skaitmeninis keitiklis (Nihon, Japonija); 15 – kompiuteris; 16 – oscilografas CI-69.
Eksperimentų eiga. Žiurkės širdies papiliariniai raumenėliai bei žmogaus skilvelio preparatai
buvo perfuzuojami (apie 60 min.) oksigenuotu Tyrode fiziologiniu tirpalu, kol tiriamieji dydžiai
(susitraukimo jėga, veikimo potencialai) tapdavo pastovūs. Tiriant mitochondrijų kvėpavimo
grandinės kompleksų slopiklių poveikį miokardo elektromechaninio aktyvumo parametrams,
preparatai buvo perfuzuojami fiziologiniu tirpalu su skirtingomis I komplekso slopiklio rotenono ar
III komplekso slopiklio antimicino A, ar oksidacinio fosforilinimo skyriklio FCCP
koncentracijomis, kol registruojami parametrai pasiekė stacionarų lygį. IV komplekso blokavimui
33
naudotas anoksinis tirpalas. Anoksija buvo sukuriama raumenėlį perfuzuojant 3 mM Na2S2O4
tirpalu, kuris tirpale suriša visą deguonį (tirpalo pO2 – 0 mmHg). KATP kanalų, kurie atsidaro
sumažėjus miokardo ląstelėse ATP koncentracijai, blokavimui naudotas šių kanalų blokatorius
glineklamidas (2×10-5 M).
Mitochondrijų F1F0–ATPazės aktyvumo slopinimui naudotas oligomicinas. Raumenėliai po
60 min. perfuzijos Tyrode fiziologiniu tirpalu buvo perfuzuojami tirpalu su 2×10-5 M oligomicino,
vėliau – antimicinu A, FCCP ar anoksiniu tirpalu (3 mM Na2S2O4) su oligomicinu.
Tiriant miokardo elektromechaninio aktyvumo parametrų priklausomybę nuo dirginimo
dažnio, raumenėlių perfuzijos fiziologiniu tirpalu metu dažnis buvo keičiamas nuo 0,2 Hz iki 0,5, 1,
1,5, 2, 2,5 ir 3 Hz ir po to buvo grąžinamas pradinis dirginimo dažnis (žmogui – 1 Hz, žiurkei – 1,5
Hz). Tiriant oksidacinio fosforilinimo skyriklio FCCP, F1F0–ATPazės slopiklio oligomicino,
energetinio metabolizmo substrato piruvato, β1–β2 adrenergenių receptorių agonisto izoproterenolio
įtaką miokardo elektromechaninio aktyvumo parametrų priklausomybei nuo dirginimo dažnio,
eksperimentai buvo atliekami tokia pačia tvarka keičiant dirginimo dažnius, kaip ir perfuzijos
fiziologiniu Tyrode tirpalu metu.
Visi perfuzijai naudoti tirpalai buvo oksigenuojami (pO2 – 560-600 mmHg). Eksperimentai
buvo baigiami, reperfuzuojant raumenėlius (30 – 40 min.) oksigenuotu fiziologiniu Tyrode tirpalu.
Mikroelektrodų gamyba. Veikimo potencialus registravome mikroelektrodais (4.1 pav. 4),
užpildytais 2,5 M KCl tirpalu. Mikroelektrodus gaminome PP–830 (Narishige, Japonija) prietaisu iš
stiklo vamzdelių su kapiliaru (A-M Systems, JAV). Mikroelektrodų galiuko diametras buvo 1 – 2
mikronai. Norėdami išvengti poliarizacijos, mikroelektrodą su sidabriniu elektrodu jungėme per
agar-agaro tiltelį. Veikimo potencialus registravome kompiuteriu ir savirašiu (Nihon Kohden,
Japonija).
Tiriamieji parametrai. Pagrindiniai registruoti parametrai yra susitraukimo jėga (P), pusinis
atsipalaidavimo laikas (toliau „atsipalaidavimo laikas“), t.y. laikas per kurį raumuo atsipalaiduoja
50 proc. (t50), ramybės įtempimo kitimas (toliau „kontraktūra“) (C), veikimo potencialų trukmė 50
proc. (VP50) ir 90 proc. (VP90) repoliarizacijos lygiuose (4.2 pav.).
34
4.2 pav. Eksperimentų metu registruoti parametrai. A. P0 – susitraukimo jėgos amplitudė kontrolės sąlygomis; P – susitraukimo jėgos amplitudė po tam tikro poveikio; P/P0 (proc.). (t50)0 – pusinis atsipalaidavimo laikas kontrolės sąlygomis; t50 – pusinis atsipalaidavimo laikas po tam tikro poveikio; (t50)0/t50 (proc.). B. (VPA)0, (VP50)0 ir (VP90)0 – veikimo potencialo amplitudė, veikimo potencialo trukmė 50 proc. ir 90 proc. repoliarizacijos lygiuose kontrolės sąlygomis. VPA, VP50 ir VP90 - veikimo potencialo amplitudė, veikimo potencialo trukmė 50 proc. ir 90 proc. repoliarizacijos lygiuose po tam tikro poveikio; VP50/(VP50)0 (proc.); VP90/(VP90)0 (proc.). C. P0 – susitraukimo jėgos amplitudė kontrolės sąlygomis, a – ramybės įtempimo pokytis, C – santykinė kontraktūra.
Rezultatų analizė. Susitraukimo jėgos ir veikimo potencialų parametrų analizei naudotos
Microsoft Exell, Microcal Origin, Sigma Plot programos. Kontrolės sąlygomis, t.y. perfuzuojant
raumenėlius fiziologiniu Tyrode tirpalu ir dirginant 1,5 Hz (žiurkės širdies papiliarinius
raumenėlius) ar 1,0 Hz (žmogaus skilvelio preparatus) dažniu, susitraukimo jėga, pusinis
atsipalaidavimo laikas ir VP trukmės buvo prilyginti 100 proc. Ramybės įtempimą įvertinome
santykiniais dydžiais susitraukimo jėgos dydžio kontrolės sąlygomis atžvilgiu (4.2 pav.). Veikiant
tiriamosioms medžiagoms ar keičiant dirginimo dažnius, registruoti parametrai pateikti procentais
(± standartinė paklaida), palyginus su kontrole. Tiriant mitochondrijų kvėpavimo grandinės
kompleksų slopiklių poveikį, esant oligomicinui, tiriamųjų parametrų pokytis pateiktas procentais
(± standartinė paklaida), palyginus su oligomicino poveikiu. Eksperimentų rezultatų patikimumą
įvertinome panaudoję Stjudento t kriterijų. Tiriamųjų parametrų pokyčiai laikomi patikimais, kai
p<0,05.
Taikant Michaelis-Menten lygtį (Sigma Plot programa) nustatėme rotenono, antimicino A ir
FCCP EC50, t.y. koncentracijas, 50 proc. mažinančias susitraukimo jėgą.
35
Tirpalai ir jų ruošimas. Eksperimentuose naudojamus tirpalus ruošėme laboratorijoje iš
bazinių tirpalų ar tiesiogiai tirpinant reagentus fiziologiniame tirpale.
4.1 lentelė. Šv. Tomo kardiopleginis tirpalas
Baziniai tirpalai Eksperimentiniai tirpalai Medžiagos C (M) g/L C (mM) ml/L
NaCl 2 117,00 110 55 KCl 1 74,40 16 16
CaCl2 1 111,00 1,2 1,2 MgCl2×6H2O 1 203,20 16 16
Hepes 2,38 10 D-gliukozė 40 proc. 180,20 5 2,5
4.2 lentelė. Žiurkės fiziologinis Tyrode tirpalas
Baziniai tirpalai Eksperimentiniai tirpalai Medžiagos C (M) g/L C (mM) ml/L
NaCl 2 117,00 160 80 KCl 1 74,40 4,6 4,6
CaCl2 1 111,00 1,5 1,5 MgCl2×6H2O 1 203,20 1 1
Hepes 2,38 10 D-gliukozė 40 proc. 180,20 10 5,0
4.3 lentelė. Žmogaus fiziologinis Tyrode tirpalas
Baziniai tirpalai Eksperimentiniai tirpalai Medžiagos C (M) g/L C (mM) ml/L
NaCl 2 117,00 137 68,5 KCl 1 74,40 5,4 2,7
CaCl2 1 111,00 1,8 1,8 MgCl2×6H2O 1 203,20 0,9 0,9
Hepes 2,76 11,6 D-gliukozė 40 proc. 180,20 5 2,5
Šv. Tomo kardiopleginio ir Tyrode fiziologinių tirpalų pH sureguliuotas NaOH (1 M) tirpalu
iki 7,4.
Eksperimentų metu naudojome rotenono (10-8 M, 10-7 M, 10-6 M, 10-5 M, 3×10-5 M),
antimicino A (10-8 M, 10-7 M, 10-6 M, 3×10-6 M, 10-5 M, 3×10-5 M, 3×10-4 M), anoksinį (3 mM
Na2S2O4), FCCP (10-9 M, 10-8 M, 3×10-8 M, 10-7 M, 3×10-7 M, 10-6 M), oligomicino (2×10-5 M),
piruvato (10 mM), izoproterenolio (10-5 M) tirpalus.
Fiziologinių tirpalų su rotenonu ar antimicinu A ruošimas. Tiriamų koncentracijų tirpalai buvo
ruošiami iš bazinių rotenono ar antimicino A tirpalų (10-2 M), kurie buvo gaunami ištirpinus
atitinkamą jų kiekį DMSO.
36
Anoksinio tirpalo ruošimas. Tirpalas buvo ruošiamas tirpinant natrio ditionitą (Na2S2O4)
neoksigenuotame fiziologiniame Tyrode tirpale. Medžiaga fiziologinio tirpalo pH sumažindavo iki
7,1, todėl su NaOH (1 M) tirpalu pH buvo sureguliuojamas iki 7,4.
Fiziologinio tirpalo su FCCP ruošimas. Tiriamų koncentracijų tirpalai buvo ruošiami iš
bazinio FCCP tirpalo (10-2 M), kuris buvo gaunamas ištirpinus atitinkamą jo kiekį etanolyje.
Fiziologinio tirpalo su oligomicinu ruošimas. Tiriamos koncentracijos tirpalas buvo ruošiamas
iš bazinio oligomicino tirpalo (10-2 M), kuris buvo gaunamas ištirpinus atitinkamą jo kiekį
etanolyje. Kad medžiaga ištirptų, fiziologinis tirpalas kaitinamas iki +50 °C. Prieš perfuzuojant
raumenėlį, tirpalas buvo atvėsinamas iki +36 °C.
Fiziologinio tirpalo su piruvatu ruošimas. Tirpalas buvo ruošiamas tirpinant piruvatą
fiziologiniame Tyrode tirpale.
Fiziologinio tirpalo su izoproterenoliu ruošimas. Tiriamos koncentracijos tirpalas buvo
ruošiamas iš bazinio izoproterenolio tirpalo (10-2 M), kuris buvo gaunamas ištirpinus atitinkamą jo
kiekį distiliuotame vandenyje.
Visus eksperimentų metu naudojamus tirpalus gaminome tą pačią dieną prieš eksperimentą.
Tiriant DMSO ar etanolyje ištirpintas medžiagas, tirpiklių poveikiui įvertinti eksperimentų
pradžioje į fiziologinį tirpalą buvo įdedama atitinkama jų koncentracija.
4.2. Vienetinių miokardo ląstelių išskyrimo ir L-tipo Ca2+ srovės registravimo
metodika
Vienetiniai žiurkės ir žmogaus širdies kardiomiocitai buvo išskiriami taikant fermentinį
izoliavimo metodą.
Žiurkės širdies skilvelio ląstelių išskyrimas. Gyvūnėliai buvo numarinami staigiu smūgiu
galvos smegenų srityje. Atvėrus krūtinės ląstą, širdis buvo izoliuojama ir dedama į Petri lėkštelę su
atvėsintu ir deguonimi prisotintu žiurkės širdies ląstelių išskyrimo tirpalu (4.4 lentelė) su 1 mM
CaCl2 ir 1 mg/ml JSA (jaučio kraujo serumo albuminas). Šiame tirpale buvo kaniuliuojama širdies
aorta, kad per kaniulę (specialų stiklinį vamzdelį) tekantys tirpalai patektų į širdies vainikines
arterijas. Kaniuliuota širdis buvo perkeliama į Langerdorfo perfuzinę sistemą (4.3 pav.) ir 5 – 8
min. praplaunama kambario temperatūros išskyrimo tirpalu su 1 mM CaCl2 ir 1 mg/ml JSA, po to 5
– 10 min. – +37° C išskyrimo tirpalu be kalcio ir su 1 mg/ml JSA (perfuzijos greitis apie 4 ml/min.).
Vėliau širdelė perfuzuojama bekalciniu išskyrimo tirpalu su jungiamąjį audinį ardančiu fermentu
kolagenaze (0,5 mg/ml; type II, 281 U/mg, Worthington). Po 8 – 10 min. tirpalas buvo pakeičiamas
37
šviežiai pagamintu tokiu pačiu fermentiniu išskyrimo tirpalu, ir širdies perfuzija buvo tęsiama dar 5
– 10 min. Po širdies audinių suardymo fermentais, širdis apie 5 min. buvo plaunama bekalciniu
išskyrimo tirpalu su 1 mg/ml JSA. Visą izoliavimo laiką širdelė laikoma termostatuojamoje (+37°
C) kameroje. Po perfuzijos širdis perkeliama į Petri lėkštelę ir praplaunama nuo fermentų kambario
temperatūros bekalciniu išskyrimo tirpalu su 1 mg/ml JSA. Pašalinus prieširdžius, širdis buvo
švelniai purtoma ir karpoma, kad išsiskirtų pavienės ląstelės. Izoliuotų ląstelių suspensija buvo
laikoma išskyrimo tirpale, palaipsniui padidinus Ca2+ koncentraciją iki 1 mM. Visi išskyrimo metu
naudoti tirpalai prieš naudojimą buvo filtruojami 0,45 µm filtrais bei sotinami deguonimi. Išskirtos
širdies ląstelės buvo laikomos kambario temperatūros tirpale (4.4 lentelė).
.3 pav. Langendorfo perfuzinės sistemos schema ostatuojamos kameros, 6 – termostatuojamas „burbulų
Žmogaus širdies ląstelių išskyrimas. Žmogaus širdies ląstelės buvo izoliuojamos iš KMU
Kardi
O2O2
1 2
4
7
8
9
5
6
3
10
O2O2
1 2
4
7
8
9
5
6
3
10
41, 2, 3 – perfuzijai naudojami tirpalai, 4 - čiaupas, 5 ir 7 – termgaudytuvas“, 8 – termostatas (Thermostat U1, Vokietija), 9 – peristaltinis siurblys, 10 – perfuzuojama širdelė.
ochirurgijos klinikoje operuotų pacientų prieširdžių biopsijų. Biopsijos į laboratoriją buvo
transportuojamos atvėsintame (+10° C) Šv. Tomo kardiopleginiame tirpale (4.1 lentelė). Prieširdžio
preparatas perkeliamas į lėkštelę, užpildytą Krebso tirpalu (4.5 lentelė) su 3 mg/ml BDM ir 0,1
mg/ml EGTA. Raumens mėginys sukarpomas maždaug 1 mm3 dydžio gabalėliais. Susmulkinti
raumens gabalėliai kelis kartus praplaunami švariu Krebso tirpalu su BDM (2,3-butanodiono
38
monoksimas) ir EGTA. Praplovus, stiklinėlėje raumens gabalėliai užpilami Krebso tirpalu su 4
mg/ml JSA (>98 proc. grynumo, be riebiųjų rūgščių), 0,6 mg/ml kolagenazės (type II, 281 U/mg,
Worthington) ir 0,6 mg/ml proteazės (type XXIV; 10,5 U/mg; Sigma). Stiklinėlė įstatoma į +37° C
temperatūros termostatą – kratytuvą ir 30 – 40 min. purtoma maždaug 200 kartų per minutę
intensyvumu. Po to tirpalas nupilamas, o ant likusių stiklinėlėje gabalėlių užpilamas Krebso tirpalas
su 4 mg/ml JSA ir 1 mg/ml kolagenazės (type II, 281 U/mg, Worthington). Stiklinėlė vėl 15 – 20
min. purtoma termostate – kratytuve. Po šio purtymo, nupylus tirpalą, raumeniniai gabalėliai dar
kartą buvo užpilami naujai pagamintu Krebso tirpalu su 4 mg/ml JSA ir 1 mg/ml kolagenaze ir vėl,
tokiomis pat sąlygomis, purtomi termostate – kratytuve (15 - 20 min.). Visų purtymų metu tirpalai
buvo nuolat sotinami deguonimi. Po to ląstelės nuo likusių nesuirusių audinių buvo atskiriamos jas
filtruojant per HEPES tirpalu (4.6 lentelė) su 1 mg/ml JSA suvilgytą nailoninį filtrą. Nufiltruotas
tirpalas su ląstelėmis paskirstomas į du mėgintuvėlius, į juos pripilama HEPES tirpalo su 1 mg/ml
JSA ir ląstelės nusodinamos centrifuguojant 1 min. 500 – 900 apsisukimų per minutę greičiu. Po
visų išskyrimo etapų gautos ląstelės užpilamos laikymo tirpalu (4.7 lentelė) ir dar kartą
nusodinamos 1 minutę centrifuguojant 500 – 900 aps./min. greičiu. Po centrifugavimo nuo ląstelių
nupilamas skystis ir jos užpilamos kambario temperatūros ląstelių laikymo tirpalu.
Visi tirpalai, naudoti izoliuojant ląsteles bei jas laikant, prieš tai buvo filtruojami 0,45 µm
filtrais. Ląstelių išskyrimo eigoje mikroskopu nuolat buvo stebimas ir vertinamas ląstelių
išsiskyrimas iš audinio. Pagal ląstelių išsiskyrimo intensyvumą buvo sprendžiama, kiek laiko jas
purtyti tirpaluose su fermentais.
Ca2+srovės per L-tipo Ca2+ kanalus registracija. Kardiomiocitų L–tipo Ca2+ srovė (ICaL)
registruota fiksuotos įtampos visos ląstelės patch-clamp metodu (angl. whole–cell patch clamp) (4.4
pav. A). Šiuo metodu matuojama srovė tekanti per visus membranoje esančius veiklius kanalus.
Eksperimentams buvo naudojamos tik tos ląstelės, kurios turėjo fenotipiškai nepakitusią išvaizdą
(išreikštas skersaruožuotumas, fiksuota stačiakampio forma). ICaL matuota visiškai užblokavus kitas
jonines sroves. K+ srovės buvo nuslopintos tiek išoriniame, tiek vidiniame kontroliniame tirpale K+
jonus pakeičiant Cs+ jonais. Prieš ICaL registravimą Na+ srovės slopinimui ląstelės membrana buvo
depoliarizuojama iki -50 mV (impulso trukmė 50 ms), ir į išorinį kontrolinį tirpalą buvo įdedama 3
µM Na+ srovės slopiklio tetrodotoksino (TTX).
Registruojant ICaL, ląstelė buvo depoliarizuojama kas 8 s nuo -80 mV palaikomo pastovaus
ramybės potencialo iki 0 mV, depoliarizuojančiojo impulso trukmė buvo 400 ms (4.4 pav. B). ICaL
amplitude buvo laikomas skirtumas tarp registruojamos srovės maksimumo ir srovės, registruotos
depoliarizuojančiojo impulso 400 –ąją ms. L-tipo Ca2+ srovės registravimui ir analizei naudotas
automatizuotas “patch-clamp” stiprintuvas VP500 (Bio–Logic, Prancūzija) bei speciali programinė
įranga Visual-Patch v1.30 (Bio-Logic, Prancūzija). Tirpalai ties tiriamąja ląstele buvo keičiami
39
automatiniu tirpalų pakeitėju RSC–200 (Bio–Logic, Prancūzija). Kontrolinis išorinės perfuzijos
tirpalas (4.8 lentelė) ir išoriniai tirpalai su tiriamomis veikliomis medžiagomis buvo patiekiami prie
ląstelės, patalpinant tiriamą ląstelę ties 300 µm skersmens kapiliaro anga, per kurią buvo leidžiamas
norimos sudėties išorinis tirpalas. Tirpalo tėkmės greitis – 150 µl/min. Visi prie ląstelės tiekiami
tirpalai prieš tai buvo nufiltruoti 0,45 µm filtrais.
.4 pav. L–tipo Ca2+ jonų srovės registracija visos ląstelės „patch-clamp“ metodu 2+ ranoje esančius
Be to, ląstelė
0 s), o po to iki 0 mV (impulso trukmė 400 ms). I amplitude buvo
Mikropipetės buvo gaminamos iš stiklo vamzdelių su kapiliaru (Drummond, JAV) ir
užpild
mperatūroje (17 – 22° C), temperatūra eksperimento metu
nesik
tų analizė. Buvo tiriama rotenono, antimicino A, NaCN,
FCCP
CaCl2 1,8 mM
ATF 3 mMPCr 5 mM
(A)
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Išorinistirpalas
Vidinis tirpalas
B0
-500pA
ICa
0 mV
-80 mV
200 ms
-50 mV
50 ms
CaCl2 1,8 mM
ATF 3 mMPCr 5 mM
(A)
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Išorinistirpalas
Vidinis tirpalas
CaCl2 1,8 mM
ATP 3 mMPCr 5 mM
A
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Išorinistirpalas
Vidinis tirpalas 0
-500pA
ICa
0 mV
-80 mV
200 ms
-50 mV
50 ms
0
-500pA
ICa
0 mV
-80 mV
200 ms
-50 mV
50 ms
CaCl2 1,8 mM
ATF 3 mMPCr 5 mM
(A)
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Išorinistirpalas
Vidinis tirpalas
CaCl2 1,8 mM
ATF 3 mMPCr 5 mM
(A)
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Išorinistirpalas
Vidinis tirpalas
B0
-500pA
ICa
0 mV
-80 mV
200 ms
-50 mV
50 ms
B0
-500pA
ICa
0 mV
-80 mV
200 ms
-50 mV
50 ms
CaCl2 1,8 mM
ATF 3 mMPCr 5 mM
(A)
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Išorinistirpalas
Vidinis tirpalas
CaCl2 1,8 mM
ATP 3 mMPCr 5 mM
A
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Išorinistirpalas
Vidinis tirpalas 0
-500pA
ICa
0 mV
-80 mV
200 ms
-50 mV
50 ms
0
-500pA
ICa
0 mV
-80 mV
200 ms
-50 mV
50 ms
4A. Visos ląstelės „patch-clamp“ metodu registruojama Ca jonų srovė, tekanti per visus ląstelės membL–tipo Ca2+ kanalus. Šių eksperimentų metu kontroliuojama ir keičiama išorinio tirpalo sudėtis. dializuojama mikropipetę užpildančiu vidiniu tirpalu, kurio sudėtis eksperimento metu nebuvo keičiama. ATP – adenozino trifosfatas, PCr – kreatino fosfatas. B. Žiurkės ir žmogaus širdies miocitų L-tipo Ca2+ srovė registruota kas 8 sekundes depoliarizuojant ląstelę nuo -80 mV palaikomo ramybės potencialo iki -50 mV (5 m Calaikomas skirtumas tarp registruojamos srovės maksimumo ir srovės, registruotos 400 -ąją ms.
omos vidiniu kontroliniu tirpalu (4.9 lentelė). Mikropipečių varža, įmerkus jas į išorinį
tirpalą, buvo 0,6 – 1,3 MΩ. Prieš prisiurbiant mikropipetę prie ląstelės, buvo nustatomas fazinis
potencialas tarp išorinio ir vidinio pipetės tirpalų. Šis potencialų skirtumas buvo automatiškai
kompensuojamas. Mikropipetės galiuko skersplotyje esanti ląstelės membrana buvo pramušama -1
V, 500 ms trukmės elektriniu impulsu.
Eksperimentai atlikti kambario te
eitė daugiau nei vienu laipsniu.
Eksperimentų eiga ir rezulta
, oligomicino įtaka žiurkės ir žmogaus izoliuotų širdies ląstelių izoproterenoliu stimuliuotai
L–tipo Ca2+ srovei. Izoproterenoliu stimuliuota ICaL buvo prilyginta 100 proc. Tiriamųjų medžiagų
40
poveikis ICaL pateiktas procentais (± standartinė paklaida), palyginus su izoproterenolio poveikiu.
Tiriant mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksų slopiklių poveikį, esant oligomicinui, ICaL
pokytis pateiktas procentais (± standartinė paklaida), palyginus su oligomicino poveikiu.
Eksperimentų rezultatų patikimumą įvertinome panaudoję Stjudento t kriterijų. Duomenys laikomi
patikimais, kai p<0,05.
Tirpalai ir jų ruošimas. Eksperimentuose naudojamus tirpalus ruošėme laboratorijoje iš
bazin
4.4 lentelė. Žiurkės širdies ląstelių išskyrimo ir laikymo∗ tirpalas
ių tirpalų ar tiesiogiai tirpinant reagentus fiziologiniame tirpale.
Medžiagos C (mM) NaCl 120 KCl 5,8
N 3aHCO 4,3 KH PO2 4 1,3 MgCl2 1,5
D ė 14,1 –gliukozHEPES 20
Tirpalo pH sureguliuotas NaOH (1 M) tirpalu iki 7,15. ∗ l) ir streptomicino (0,2 mg/ml)
.5 lentelė. Krebso tirpalas
C (mM)
Ląstelių laikymui tirpalas buvo papildomas penicilino (200 U/mmišiniu.
4
Medžiagos HEPES 10 NaCl 35
D 10 –gliukozėSacharozė 134 Na HPO2 4 16 NaHCO3 25
KCl 4,7 KH PO2 4 1,2
Tirpalas stelių išskyrimą prisotinamas deguonimi. pH sureguliuotas NaOH (1 M) tirpalu iki
4.6 lentelė. HEPES tirpalas
C (mM)
prieš lą7,2.
Medžiagos HEPES 25 NaCl 130 KCl 4,8
D– zė 5 gliukoK 2H PO4 1,2
Tirpalo pH sureguliuotas NaOH (1 M) tirpalu iki pH 7,4.
41
4.7 lentelė. Žmogaus širdies ląstelių laikymo tirpalas
Medžiagos C (mM) NaCl 120 KCl 5,4
MgCl2 5 D– zė 20 gliuko
HEPES 10 N s atrio piruvata 5
Tirpalo pH sureguliuotas NaOH (1 M) tirpalu iki pH 7,4. 200 U/ml) ir streptomicino (0,2 mg/ml)
.8 lentelė. Žiurkės ir žmogaus širdies ląstelių išorinis kontrolinis tirpalas
Ląstelių laikymui tirpalas buvo papildomas penicilino (mišiniu.
4
Medžiagos C (mM) NaCl 127 CsCl 20
N 3aHCO 4 N 2 4aH PO 0,8
MgCl2 1,8 CaCl2 1,8
D ė 5 –gliukozNa tas piruva 5
HEPES 10 Tirpalo pH sureguliuotas NaOH (1 M) tirpalu iki pH 7,4.
.9 lentelė. Žiurkės ir žmogaus širdies ląstelių vidinis kontrolinis tirpalas
4
Medžiagos C (mM) CsCl 140
EGTA 5 MgCl2 4 CaCl2 0,062
Kreatino dinatrinė
fosfato druska
5
Na2ATP 3 Na2GTP 0 ,42HEPES 10
Tirpalo pH sureguliuotas CsOH (1 M) tirpalu iki pH 7,3.
42
4.3. Reagentai
Eksperimentinių tyrimų metu naudoti šių firmų reagentai:
Sigma:
NaCl – natrio chloridas (99,8 proc.), KCl – kalio chloridas (99,5 proc.), CaCl2 – kalcio chloridas (95
proc.); MgCl2×6H2O – magnio chlorido heksahidratas (99,1 proc.), HEPES – N-2-
hidroksietilpiperazino-N'-2'-etansulfoninė rūgštis (99,5 proc.), MgCl2 – magnio chloridas (99,8
proc.), NaOH – natrio hidroksidas (98,5 proc.), CsCl – cezio chloridas (99 proc.); CsOH × H2O –
cezio hidroksido monohidratas (95 proc.), rotenonas (98 proc.), antimicinas A (iš Streptomyces sp.;
90 proc.), Na2S2O4 – natrio ditionitas (≥ 85 proc.), FCCP – karbonilcianid-p-[trifluorometoksi]
fenilhidrazonas, glibenklamidas – N-(4-(2-(5-chlor-2-metoksibenzamid)etil)-fenilsulfonil)-N‘-
cikloheksilkarbamidas; oligomicinas – iš Streptomyces diastochomogenes; A,B,C oligomicinų
mišinys (95 proc.), natrio piruvatas – natrio druska (99 proc.), izoproterenolis – 1-[3’,4’-
dihidrofenil]-2-izopropilaminoetanolio hidrochloridas, NaHCO3 – natrio vandenilio karbonatas
(99,5 proc.), KH2PO4 – kalio divandenilio fosfatas (99,5 proc.), D-(+) - gliukozė (99,5 proc.),
DMSO – dimetil sulfoksidas (99,5 proc.), Na2HPO4 × 2 H2O– dinatrio vandenilio fosfato dihidratas
(≥ 99 proc.), NaH2PO4 – natrio divandenilio fosfatas (99 proc.), EGTA – etilenglikol 2-
aminoetileterio tetraacto rūgštis (97 proc.), kreatinas (kreatino fosfatas) – dinatrio kreatino fosfato
hidratas (98 proc.), Na2ATP – adenozino 5’ trifosfato dinatrio druska (95 proc.), Na2GTP –
guanozino 5' trifosfato dinatrio druska (>90 proc.), JSA – išgrynintas jaučio serumo albuminas (be
riebiųjų rūgščių; > 98 proc.), proteazė (type XXIV; bacterial, 10,5 U/mg);
Fluka:
BDM – 2,3-butanodiono monoksimas (≥ 99 proc.);
Worthington:
Kolagenazė (type II; 281 U/mg aktyvumo);
Latoxan:
TTX – tetrodotoksinas.
43
5. TYRIMŲ REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
5.1. Mitochondrijų kvėpavimo grandinės slopiklių ir oksidacinio fosforilinimo
skyriklio FCCP įtaka žiurkės miokardo elektromechaniniam aktyvumui
I grupėje eksperimentų tyrėme mitochondrijų kvėpavimo grandinės I komplekso (NADH
dehidrogenazės) slopiklio rotenono, III komplekso (citochromo c reduktazės) slopiklio antimicino
A, IV komplekso (citochromo c oksidazės) slopinimo, sukeliant anoksines sąlygas, bei oksidacinio
fosforilinimo skyriklio FCCP įtaką žiurkės širdies papiliarinių raumenėlių elektromechaninio
aktyvumo parametrams. Taip pat buvo tirtas rotenono, antimicino A, NaCN bei FCCP poveikis
žiurkės širdies ląstelių izoproterenoliu stimuliuotai L–tipo Ca2+ srovei.
Kontrolės sąlygomis, t.y. perfuzuojant raumenėlius fiziologiniu Tyrode tirpalu ir dirginant 1,5
Hz dažniu, susitraukimo jėga buvo 1,5±0,21 mN (n=56), pusinis atsipalaidavimo laikas –
45,76±1,31 ms (n=56), VP50 – 24,84±1,58 ms, VP90 – 77,94±3,39 ms (n=40).
5.1.1. Rotenono įtaka žiurkės miokardo
elektromechaniniam aktyvumui
Mitochondrijų kvėpavimo grandinės I komplekso slopiklio rotenono (10-8, 10-7, 10-6, 10-5 M)
poveikis žiurkės širdies kairiojo skilvelio papiliarinių raumenėlių elektromechaninio aktyvumo
parametrams parodytas 5.1 pav. – eksperimento metu registruotos miokardo susitraukimo jėgos (A)
ir veikimo potencialų kreivių (B) pavyzdžiai bei susitraukimo jėgos (1 kreivė) ir atsipalaidavimo
laiko (2 kreivė) kitimas (C). Didinant rotenono koncentraciją perfuziniame fiziologiniame tirpale
nuo 10-8 M iki 10-7 M susitraukimo jėga sumažėjo nežymiai, o esant 10-6 M ir 10-5 M, sumažėjo
atitinkamai iki 68,17±4,87 proc. ir 38,72±6,19 proc. (n=8) (p<0,001), palyginus su kontrole.
Reperfuzuojant raumenėlį fiziologiniu tirpalu be rotenono, P neatsistatė ir buvo 26,63±6,55 proc.
(n=6) (p<0,001), palyginus su kontrole.
44
.1 pav. Rotenono įtaka žiurkės papiliarinių raumenėlių susitraukimo jėgai, veikimo
ikiant 10-5 roteikiant rotenonui. Abscisių ašyje –
∗
Naudojant Michaelis-Menten lygtį, rotenono koncentracija, mažinanti 50 proc. žiurkės širdies
papil
entraciją iki 10-6
M, n
0
20
40
60
80
100
120
140
Para
met
rų k
itim
as(p
roc.
)
10-8 10-7 10-6 10-5
[Rotenonas] (M)
2
1
*
**
**
C
100 ms
1 m
N
A
kontrolė
rotenonas (10-6 M)
rotenonas (10-5 M)
100 ms50
mV
B
kontrolė
rotenonas (10-5 M)
0
20
40
60
80
100
120
140
Para
met
rų k
itim
as(p
roc.
)
10-8 10-7 10-6 10-5
[Rotenonas] (M)
2
1
*
**
**
C
0
20
40
60
80
100
120
140
Para
met
rų k
itim
as(p
roc.
)
10-8 10-7 10-6 10-5
[Rotenonas] (M)
2
1
*
**
**
0
20
40
60
80
100
120
140
Para
met
rų k
itim
as(p
roc.
)
10-8 10-7 10-6 10-5
[Rotenonas] (M)
2
1
0
20
40
60
80
100
120
140
Para
met
rų k
itim
as(p
roc.
)
10-8 10-7 10-6 10-5
[Rotenonas] (M)
2
1
*
**
**
C
100 ms
1 m
N
A
kontrolė
rotenonas (10-6 M)
rotenonas (10-5 M)
100 ms
1 m
N
A
100 ms
1 m
N
A
kontrolė
rotenonas (10-6 M)
rotenonas (10-5 M)
100 ms50
mV
B
kontrolė
rotenonas (10-5 M)
100 ms50
mV
B
kontrolė
rotenonas (10-5 M)
5potencialams ir atsipalaidavimo laikui. A. Eksperimentiniai susitraukimo kreivių užrašai, veikiant 10-6 ir 10-5 M rotenono. B. Eksperimentiniai veikimo potencialų užrašai, ve M nono. C. Susitraukimo jėgos (1 kreivė) ir atsipalaidavimo laiko (2 kreivė) kitimas, verotenono koncentracijos (M), ordinačių – parametrų kitimas, apskaičiuotas procentais, palyginus su kontrole. p<0,05; ∗∗ p<0,001.
iarinių raumenėlių susitraukimo jėgą (EC50), buvo (5,74±2,1)×10-6 M (n=8).
Papiliarinių raumenėlių atsipalaidavimo laikas (t50), didinant rotenono konc
ekito, tačiau esant 10-5 M rotenono, padidėjo iki 112,77±5,49 proc. (n=8) (p<0,05).
Reperfuzijos fiziologiniu tirpalu metu t50 išliko padidėjęs ir buvo 116,16±6,9 proc. (n=5) (p<0,05),
palyginus su kontrole.
45
Veikimo potencialų trukmė tiek 50 proc., tiek 90 proc. repoliarizacijos lygiuose, didėjant
rotenono koncentracijai nuo 10-8 M iki 10-6 M rotenono, nekito, o esant tirpale 10-5 M rotenono,
nežymiai padidėjo tik VP50 – iki 118,73±7,45 proc. (n=4) (p<0,05).
Žiurkės širdies papiliarinių raumenėlių ramybės įtempimas, veikiant rotenonui, nekito, t.y.
nesivystė kontraktūra.
5.1.2. Antimicino A įtaka žiurkės miokardo
elektromechaniniam aktyvumui
Mitochondrijų kvėpavimo grandinės III komplekso slopiklio antimicino A poveikis žiurkės
miokardo susitraukimo jėgai, veikimo potencialams ir atsipalaidavimo laikui pateiktas 5.2 pav.
Paveikslo A dalyje parodyti eksperimento metu registruoti miokardo susitraukimo jėgos, B –
veikimo potencialų kreivių pavyzdžiai, C – vidurkinti susitraukimo jėgos (1 kreivė) ir
atsipalaidavimo laiko (2 kreivė) kitimo duomenys. Veikiant antimicinui A, susitraukimo jėga
sumažėjo iki 85,58±1,93 proc. (n=7) (p<0,05), palyginus su kontrole, jau esant 10-8 M
koncentracijai. Didinant fiziologiniame tirpale antimicino A koncentraciją iki 10-6 M bei 10-5 M, P
sumažėjo atitinkamai iki 50,01±3,18 proc. ir 7,64±1,8 proc. (n=7) (p<0,001), palyginus su kontrole
(5.2 pav. C, 1 kreivė). Reperfuzuojant raumenėlį fiziologiniu tirpalu, P buvo 3,94±2,09 proc. (n=6)
(p<0,001), palyginus su kontrole, t.y. antimicino A poveikis buvo negrįžtamas.
Taikant Michaelis-Menten lygtį, nustatyta antimicino A EC50 žiurkės širdies papiliarinių
raumenėlių susitraukimo jėgai yra (9,99±2,55)×10-7 M (n=7).
Raumenėlių atsipalaidavimo laikas, esant mažoms antimicino A koncentracijoms (10-8, 10-7
M), nekito, joms didėjant iki 10-6 ir 10-5 M, padidėjo atitinkamai iki 116,98±5,17 proc. (p<0,05) ir
145,07±4,48 proc. (n=7) (p<0,001), palyginus su kontrole (5.2 pav. C, 2 kreivė).
46
100 ms
1 m
NA
kontrolė
antimicinas A (10-6 M)
antimicinas A (10-5 M)
B
100 ms
50 m
V
kontrolė
antimicinas A (10-6 M)
antimicinas A (10-5 M)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Para
met
rų k
itim
as(p
roc.
)
10-8 10-7 10-6 10-5
[Antimicinas A] (M)
1
2C
*
***
**
**
*
100 ms
1 m
NA
kontrolė
antimicinas A (10-6 M)
antimicinas A (10-5 M)
100 ms
1 m
NA
kontrolė
antimicinas A (10-6 M)
antimicinas A (10-5 M)
B
100 ms
50 m
V
kontrolė
antimicinas A (10-6 M)
antimicinas A (10-5 M)
B
100 ms
50 m
V
kontrolė
antimicinas A (10-6 M)
antimicinas A (10-5 M)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Para
met
rų k
itim
as(p
roc.
)
10-8 10-7 10-6 10-5
[Antimicinas A] (M)
1
2C
*
***
**
**
*
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Para
met
rų k
itim
as(p
roc.
)
10-8 10-7 10-6 10-5
[Antimicinas A] (M)
1
2C
*
***
**
**
*
5.2 pav. Antimicino A įtaka žiurkės papiliarinių raumenėlių susitraukimo jėgai, veikimo potencialams ir atsipalaidavimo laikui. A. Eksperimentiniai susitraukimo kreivių užrašai, veikiant 10-6 ir 10-5 M antimicino A. B. Eksperimentiniai veikimo potencialų užrašai, veikiant 10-6 ir 10-5 M antimicino A. C. Susitraukimo jėgos (1 kreivė) ir atsipalaidavimo laiko (2 kreivė) kitimas, veikiant antimicinui A. Abscisių ašyje – antimicino A koncentracijos (M), ordinačių – parametrų kitimas, apskaičiuotas procentais, palyginus su kontrole. ∗ p<0,05; ∗∗ p<0,001.
Žiurkės širdies papiliarinio raumenėlio veikimo potencialų trukmės VP50 ir VP90 beveik
nekito, esant tirpale 10-8 M bei 10-7 M antimicino A, o, padidėjus jo koncentracijai iki 10-5 M, VP50
sumažėjo iki 70,65±8,94 proc., VP90 – 68,41±10,24 proc. (n=6) (p<0,05), palyginus su kontrole (5.1
lentelė).
Dviejuose iš septynių eksperimentų po 16,5±12 min. antimicino A (10-5 M) veikimo pradėjo
didėti ramybės įtempimas, t.y. vystytis kontraktūra, kuri po 45±7 min. pasiekė maksimalią reikšmę
0,67±0,04.
47
5.1 lentelė. Žiurkės papiliarinių raumenėlių veikimo potencialų trukmės kitimas, veikiant antimicinui A.
Antimicino A koncentracija (M) Veikimo potencialų
trukmė 10-8
n=2 10-7
n=2 10-6
n=6 10-5
n=6 VP50 (proc.) 92,66±16,81 100,17±2,97 88,30±5,77∗ 70,65±8,94∗ VP90 (proc.) 116,29±17,37 100,05±1,95 90,41±6,47 68,41±10,24∗
Veikimo potencialų trukmės kitimas, veikiant antimicinui A, pateikiamas procentais, palyginus su kontrole. ∗p<0,05.
5.1.3. Anoksijos įtaka žiurkės miokardo
elektromechaniniam aktyvumui
Vienas pagrindinių žalingų veiksnių širdies išeminio nepakankamumo metu yra deguonies
trūkumas, sutrikus širdies koronarinei kraujotakai ir IV mitochondrijų grandinės komplekso
(citochromo c oksidazė), katalizuojančio deguonies redukcijos reakciją, aktyvumui [Silverman,
Stern, 1994; Solaini ir kt., 2005]. Esant deguonies trūkumui, mitochondrijų kvėpavimo grandinė
netenka galutinio elektronų akceptoriaus, vyksta kvėpavimo grandinės inaktyvacija, mažėja protonų
elektrocheminins gradientas [Di Lisa ir kt., 1995].
Šioje eksperimentų grupėje buvo tiriamas mitochondrijų IV kvėpavimo grandinės komplekso
slopinimo poveikis žiurkės širdies papiliarinio raumenėlio elektromechaniniam aktyvumui.
Deguonies nepakankamumo sąlygas mūsų eksperimentuose sukėlėme, naudodami natrio ditionitą (3
mM Na2S2O4), kuris suriša visą tirpale esantį deguonį (anoksija).
5.3 pav. pateiktas grafikas, kuris rodo anoksijos įtaką žiurkės širdies papiliarinių raumenėlių
susitraukimo jėgai (1 kreivė) ir ramybės įtempimui (2 kreivė). Šiomis sąlygomis susitraukimo jėga
jau po pirmųjų minučių staigiai pradėjo mažėti: po 1 min. perfuzijos anoksiniu fiziologiniu tirpalu P
sumažėjo iki 57,26±5,99 proc., po 10 min. – iki 8,36±4,24 proc. (n=5) (p<0,001), palyginus su
kontrole, o po 30 min. – iki nulio. Ramybės įtempimas pradėjo didėti po 3,3±0,89 min. (n=5), t.y.
pradėjo vystytis kontraktūra, kuri po 36,1±8,66 min. pasiekė maksimalią reikšmę (3,21±1,14) (n=5).
Raumenėlį reperfuzuojant deguonimi prisotintu fiziologiniu tirpalu, susitraukimo jėga atsistatė tik
dalinai – iki 49,21±10 proc. (n=5) (p<0,05), palyginus su kontrole, kontraktūra sumažėjo iki
1,66±0,36 (n=5).
48
.3 pav. Anoksijos įtaka žiurkės papiliarinių raumenėlių susitraukimo jėgos (1 kreivė) ir
∗ ∗∗
Papiliarinių raumenėlių atsipalaidavimas anoksijos metu lėtėjo: po 10 min. t50 padidėjo iki
121,1
5.1.4. Oksidacinio fosforilinimo skyriklio FCCP įtaka
Mitochondrijų oksidacinio fosforilinimo skyriklis FCCP veikia kaip protonoforas, t.y.
įsiter
-8,
10-7,
) ir veikimo
poten
0
20
40
60
80
100
120
0 10 20 30 40 50 60
Laikas (min.)
Susi
trau
kim
o jė
ga(p
roc.
)
0
1
2
3
4
5
1
2
Ram
ybės
įtem
pim
as
**
**
**
****
*
**
**
**
0
20
40
60
80
100
120
0 10 20 30 40 50 60
Laikas (min.)
Susi
trau
kim
o jė
ga(p
roc.
)
0
1
2
3
4
5
1
2
Ram
ybės
įtem
pim
as
**
**
**
****
*
**
**
**
5ramybės įtempimo (2 kreivė) kitimui. Abscisių ašyje – perfuzijos anoksiniu tirpalu trukmė (min.), ordinačių – susitraukimo jėga, apskaičiuota procentais, palyginus su kontrole, bei ramybės įtempimas, apskaičiuotas santykiniais vienetais. p<0,05; p<0,001.
5±8,31 proc. (n=4) (p<0,05), palyginus su kontrole. Veikimo potencialų amplitudė ir trukmė
perfuzijos anoksiniu tirpalu metu mažėjo. Veikiant anoksijai, VP50 trukmė po 20 min. sumažėjo iki
48,69±10,96 proc., VP90 – iki 46,67±10,8 proc. (n=4) (p<0,05), palyginus su kontrole.
žiurkės miokardo elektromechaniniam aktyvumui
pęs į vidinę membranos pusę, padaro ją pralaidžią H+ ir taip sumažina protoninį gradientą tarp
matrikso ir tarpmembraninės erdvės, o tai sukelia ATP sintezės slopinimą [Brennan ir kt., 2006].
Šioje grupėje eksperimentų buvo tirtas oksidacinio fosforilinimo skyriklio FCCP (10-9, 10
3×10-7 M) poveikis žiurkės miokardo elektromechaninio aktyvumo parametrams.
5.4 pav. parodyta eksperimento metu registruotos miokardo susitraukimo jėgos (A
cialų (B) kreivės bei susitraukimo jėgos (1 kreivė) ir atsipalaidavimo laiko (2 kreivė) kitimas
(C), veikiant FCCP. Didėjant FCCP koncentracijai nuo 10-9 ir 10-8 M, susitraukimo jėga sumažėjo
49
atitinkamai iki 77,22±6,47 proc. (n=6) (p<0,05) ir 60,94±7,03 proc. (n=6) (p<0,001), palyginus su
kontrole. Didinant FCCP koncentraciją iki 3×10-7 M, P mažėjo iki 6,77±2,08 proc. (n=6) (p<0,001),
palyginus su kontrole. Reperfuzuojant raumenėlius fiziologiniu tirpalu be FCCP, P nežymiai
padidėjo iki 17,02±7,22 proc. (n=4) (p<0,05), palyginus su kontrole.
.4 pav. FCCP įtaka žiurkės papiliarinių raumenėlių susitraukimo jėgai, veikimo potencialams
cialų užrašai, veikiant 10-8, 10-7, 3×10-7 M FCCP. P. Abscisių ašyje – FCCP
nus su kontrole. ∗ p<0,05; ∗∗
umens atsipalaidavimo laikas, veikiant 10-9 ir 10-8 M FCCP, padidėjo nežymiai, o esant
dides
sulėtėjo raumenėlių atsipalaidavimas.
A
1 m
N
100 ms
kontrolė
FCCP (10-9 M)
FCCP (10-8 M)
FCCP (10-7 M)
FCCP (3×10-7 M)
B
100 ms
50 m
V
kontrolė
FCCP (10-8 M)FCCP (10-7 M)FCCP (3×10-7 M)
020406080
100120140160180200220
Para
met
rų k
itim
as(p
roc.
)
*
10-9 10-8 10-7 10-6
[FCCP] (M)
1
2
**
****
**
*
C
A
1 m
N
100 ms
kontrolė
FCCP (10-9 M)
FCCP (10-8 M)
FCCP (10-7 M)
FCCP (3×10-7 M)
A
1 m
N
100 ms
kontrolė
FCCP (10-9 M)
FCCP (10-8 M)
FCCP (10-7 M)
FCCP (3×10-7 M)
B
100 ms
50 m
V
kontrolė
FCCP (10-8 M)FCCP (10-7 M)FCCP (3×10-7 M)
100 ms
50 m
V
kontrolė
FCCP (10-8 M)FCCP (10-7 M)FCCP (3×10-7 M)
020406080
100120140160180200220
Para
met
rų k
itim
as(p
roc.
)
*
10-9 10-8 10-7 10-6
[FCCP] (M)
1
2
**
****
**
*
C
020406080
100120140160180200220
Para
met
rų k
itim
as(p
roc.
)
*
10-9 10-8 10-7 10-6
[FCCP] (M)
1
2
**
****
**
*
C
B
5ir atsipalaidavimo laikui. A. Eksperimentiniai susitraukimo kreivių užrašai, veikiant 10-9, 10-8, 10-7, 3×10-7 M FCCP. B. Eksperimentiniai veikimo potenC. Susitraukimo jėgos (1 kreivė) ir atsipalaidavimo laiko (2 kreivė) kitimas, veikiant FCCkoncentracijos (M), ordinačių – parametrų kitimas, apskaičiuotas procentais, palygip<0,001.
Ra
nėms skyriklio koncentracijoms (10-7, 3×10-7 M), t50 padidėjo atitinkamai iki 151,89±9,37
proc. (n=6) (p<0,05) ir 191,09±6,17 proc. (n=6) (p<0,001), palyginus su kontrole, t.y. žymiai
50
Veikimo potencialų trukmės nekito, esant 10-9 M FCCP, o toliau didėjant jo koncentracijai iki
3×10-7 M, VP50 ir VP90 sumažėjo atitinkamai iki 61,37±11,06 proc. ir 78,93±8,95 proc. (n=5)
(p<0,
5.2 lentelė. Žiurkės papiliarinių raumenėlių veikimo potencialų trukmės kitimas, veikiant FCCP.
05), palyginus su kontrole (5.2 lentelė).
FCCP koncentracija (M) Veikimo potencialų
trukmė 10-9
n=6 10-8
n=7 10-7
n=7 3×10-7
n=5 V ) 101,84±4,15 ∗ P50 (proc. 94,72±4,29 66,13±9,71∗ 61,37±11,06VP90 (proc.) 94,57±4,44 94,65±4,04 87,01±5,33∗ 78,92±8,95∗
Veikimo potencialų kitimas, veikiant FCCP, pateikiamas procentais, palyginus su kontrole. ∗p<0,05.
.5 pav. pateiktas žiurkės papiliarinių raumenėlių ramybės įtempimo kitimas, veikiant FCCP.
Tirpale esant 10-9 ir 10-8 M FCCP, ramybės įtempimas beveik nekito (kontraktūra nesivystė), o
didin
5.5 pav. FCCP įtempimo kitimui. bscisių ašyje – FCCP koncentracijos (M), ordinačių – ramybės įtempimas, apskaičiuotas santykiniais vienetais. p<0,05.
trukmės
5
ant jo koncentraciją fiziologiniame tirpale, ramybės įtempimas pradėjo žymiai didėti ir, esant
3×10-7 M FCCP, maksimalus kontraktūros dydis buvo 1,42±0,31 (n=6) (p<0,05). Reperfuzijos
fiziologiniu tirpalu metu kontraktūra sumažėjo tik nežymiai – iki 1,21±0,35 (n=6).
0
0,5
1
1,5
2
10-9 10-8 10-7 10-6
[FCCP] (M)
Ram
ybėsįte
mpi
mas
*
*
*0
0,5
1
1,5
2
10-9 10-8 10-7 10-6
[FCCP] (M)
Ram
ybėsįte
mpi
mas
*
*
*
įtaka žiurkės papiliarinių raumenėlių ramybės A∗
51
Naudojant Michaelis-Menten lygtį, FCCP EC50 žiurkės širdies papiliarinių raumenėlių
usitraukimo jėgai buvo (1,76±0,53)×10-8 M (n=6). Palyginus su kvėpavimo grandinės kompleksų
lopiklių (rotenono, antimicino A) EC , FCCP koncentracija, 50 proc. mažinanti susitraukimo jėgą,
buvo m
inų aktyvumą), reguliuojančių
miokardo l
o jėgos kitimo priklausomai nuo dirginimo dažnio
vidurkinti duom
s
s 50
ažiausia. Tai rodo, kad žiurkės miokardo susitraukimo funkcija labiausiai pažeidžiama,
atskyrus mitochondrijų oksidacinį fosforilinimą su skyrikliu FCCP.
Kaip buvo minėta (3.3 skyrius), miokardo susitraukimo parametrų priklausomybės nuo
dirginimo dažnio pobūdis yra informatyvus rodiklis, leidžiantis spręsti apie funkcionavimą sistemų
(labiausiai ST Ca2+–ATPazės, RyR kanalų, sarkolemos Na+–Ca2+ ma
ąstelių susitraukimą–atsipalaidavimą [Pieske ir kt., 2002; Huke ir kt., 2003; Endoh,
2004], todėl buvo tikslinga nustatyti oksidacinio fosforilinimo skyriklio FCCP įtaką žiurkės
miokardo susitraukimo jėgos, pusinio atsipalaidavimo laiko ir veikimo potencialų trukmės kitimui
priklausomai nuo dirginimo dažnio. Tyrimuose buvo naudota 3×10-8 M skyriklio koncentracija, kuri
artima nustatytai jo EC50.
5.6 pav. pateiktos eksperimento metu registruotos žiurkės miokardo susitraukimo kreivės,
dirginant raumenėlį skirtingais dažniais perfuzijos fiziologiniu tirpalu (A) ir su FCCP (B) metu.
Paveikslo C dalyje parodytas susitraukim
enys, perfuzuojant raumenėlius fiziologiniu tirpalu (1 kreivė) ir tirpalu su 3×10-8 M
FCCP (2 kreivė). Miokardo susitraukimo jėgos, kaip ir kitų parametrų, dydis, perfuzuojant
raumenėlius fiziologiniu tirpalu ir dirginant 1,5 Hz dažniu, buvo laikomas kontrole ir prilygintas
100 proc. Perfuzijos fiziologiniu tirpalu metu, didėjant dirginimo dažniui (f) nuo 0,2 Hz iki 3 Hz,
susitraukimo jėga mažėjo ir, esant 3 Hz dažniui, sumažėjo iki 67,17±2,81 proc. (n=16) (p<0,001),
palyginus su kontrole, t.y. susitraukimo jėgos–dažnio priklausomybė buvo neigiama. Veikiant
FCCP (3×10-8 M), susitraukimo jėgos–dažnio priklausomybės pobūdis išliko neigiamas, tačiau P
buvo žymiai mažesnė visame dirginimo dažnių diapazone nei perfuzijos fiziologiniu tirpalu be
FCCP metu. Didinant dirginimo dažnį nuo 0,2 Hz iki 3 Hz, P sumažėjo iki 19,65±7,23 proc. (n=4)
(p<0,001), palyginus su kontrole.
52
0,2 Hz0,5 Hz
1,0 Hz1,5 Hz2,0 Hz2,5 Hz3,0 Hz
100 ms
1 m
NA
0,2 Hz0,5 Hz1,0 Hz1,5 Hz2,0 Hz2,5 Hz3,0 Hz
100 ms
1 m
N
B
0
50
100
150
200
250
Dažnis (Hz)
Susi
trau
kim
o jė
ga(p
roc.
)
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 1,5
**
**
**
** ** ** ****
* * ** ** **2
1
C
0,2 Hz0,5 Hz
1,0 Hz1,5 Hz2,0 Hz2,5 Hz3,0 Hz
100 ms
1 m
NA
0,2 Hz0,5 Hz1,0 Hz1,5 Hz2,0 Hz2,5 Hz3,0 Hz
100 ms
1 m
N
B0,2 Hz0,5 Hz
1,0 Hz1,5 Hz2,0 Hz2,5 Hz3,0 Hz
100 ms
1 m
NA
0,2 Hz0,5 Hz
1,0 Hz1,5 Hz2,0 Hz2,5 Hz3,0 Hz
100 ms
1 m
NA
100 ms100 ms
1 m
N1
mN
A
0,2 Hz0,5 Hz1,0 Hz1,5 Hz2,0 Hz2,5 Hz3,0 Hz
100 ms
1 m
N
B
0,2 Hz0,5 Hz1,0 Hz1,5 Hz2,0 Hz2,5 Hz3,0 Hz
100 ms
1 m
N
B
100 ms100 ms
1 m
N1
mN
B
0
50
100
150
200
250
Dažnis (Hz)
Susi
trau
kim
o jė
ga(p
roc.
)
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 1,5
**
**
**
** ** ** ****
* * ** ** **2
1
0
50
100
150
200
250
Dažnis (Hz)
Susi
trau
kim
o jė
ga(p
roc.
)
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 1,5
**
**
**
** ** ** ****
* * ** ** **
0
50
100
150
200
250
Dažnis (Hz)
Susi
trau
kim
o jė
ga(p
roc.
)
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 1,50
50
100
150
200
250
Dažnis (Hz)
Susi
trau
kim
o jė
ga(p
roc.
)
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 1,50 0,5 1 1,5 2 2,5 3 1,51,5
**
**
**
** ** ** ****
* * ** ** **2
1
C
5.6 pav. FCCP įtaka žiurkės papiliarinių raumenėlių susitraukimo jėgos kitimui priklausomai nuo dirginimo dažnio. A. Eksperimentiniai susitraukimo kreivių užrašai, dirginant raumenėlį įvairiais dažniais perfuzijos fiziologiniu tirpalu metu. B. Eksperimentiniai susitraukimo kreivių užrašai, dirginant raumenėlį įvairiais dažniais, veikiant 3×10-8 M FCCP. C. Susitraukimo jėgos kitimas priklausomai nuo dirginimo dažnio perfuzijos fiziologiniu tirpalu metu (1 kreivė) ir veikiant 3×10-8 M FCCP (2 kreivė). Abscisių ašyje – dirginimo dažnis (Hz), ordinačių – susitraukimo jėga, apskaičiuota procentais, palyginus su kontrole. ∗ p<0,05; ∗∗ p<0,001.
5.7 pav. parodytas raumenėlių atsipalaidavimo laiko kitimas priklausomai nuo dirginimo
dažnio perfuzuojant raumenėlius fiziologiniu tirpalu (1 kreivė) ir tirpalu su 3×10-8 M FCCP (2
kreivė). Perfuzijos fiziologiniu tirpalu metu, raumens atsipalaidavimo laikas, didinant f nuo 0,2 Hz
iki 3 Hz, nežymiai mažėjo iki 89,97±1,61 proc. (n=16) (p<0,001), palyginus su kontrole. Veikiant
FCCP (3×10-8 M), raumens atsipalaidavimo laikas, keičiant dirginimo dažnius, kaip ir perfuzuojant
raumenėlius fiziologiniu tirpalu, beveik nekito.
53
* * ** ** ****
12
60
80
100
120
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 1,5
Dažnis (Hz)
Ats
ipal
aida
vim
o la
ikas
(pro
c.)
* * ** ** ****
12
60
80
100
120
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 1,5
Dažnis (Hz)
Ats
ipal
aida
vim
o la
ikas
(pro
c.)
12
60
80
100
120
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 1,5
Dažnis (Hz)
Ats
ipal
aida
vim
o la
ikas
(pro
c.)
5.7 pav. FCCP įtaka žiurkės papiliarinių raumenėlių atsipalaidavimo laiko kitimui priklausomai nuo dirginimo dažnio. Atsipalaidavimo laiko kitimas priklausomai nuo dirginimo dažnio perfuzijos fiziologiniu tirpalu metu (1 kreivė) ir veikiant 3×10-8 M FCCP (2 kreivė). Abscisių ašyje – dirginimo dažnis (Hz), ordinačių – atsipalaidavimo laikas, apskaičiuotas procentais, palyginus su kontrole. ∗ p<0,05; ∗∗ p<0,001.
Žiurkės miokardo veikimo potencialų trukmė VP50, perfuzuojant raumenėlius fiziologiniu
tirpalu ir didinant f iki 3,0 Hz, palyginus su kontrole, nekito ir, esant 3 Hz, buvo 100,58±4,76 proc.
(n=12). Veikiant FCCP (3×10-8 M), veikimo potencialų trukmė buvo mažesnė visame dirginimo
dažnių diapazone nei perfuzijos fiziologiniu tirpalu be FCCP metu: dirginant raumenėlius 3 Hz
dažniu, VP50 sumažėjo iki 59,52±13,47 proc. (n=3), palyginus su kontrole.
Taigi, kvėpavimo grandinės I, III ir IV kompleksų aktyvumo slopinimas atitinkamai rotenonu,
antimicinu A ir anoksija, o taip pat oksidacinio fosforilinimo atskyrimas su FCCP mažino žiurkės
miokardo susitraukimo jėgą, lėtino atsipalaidavimą, mažino ar nežymiai padidino (rotenono
veikimo atveju) veikimo potencialų trukmę. Silpniausią poveikį šiems parametrams turėjo I
komplekso aktyvumo slopinimas rotenonu. Veikiant antimicinui A, anoksijai ir FCCP, didėjo
ramybės įtempimas, t.y. vystėsi miokardo kontraktūra. Žiurkės miokardo susitraukimo jėgos–dažnio
priklausomybės pobūdis buvo neigiamas ir, veikiant FCCP, išliko neigiama, tačiau susitraukimo
jėga buvo ženkliai sumažėjusi tirtame dirginimo dažnių diapazone (0,2 Hz – 3 Hz).
54
5.1.5. Rotenono, antimicino A, NaCN ir FCCP įtaka
izoliuotų žiurkės miokardo ląstelių L-tipo Ca2+ srovei
Miokardo ląstelių susitraukimo jėga yra reguliuojama Ca2+ jonų srovės (ICaL) per sarkolemos
L–tipo Ca2+ kanalus. Šių kanalų aktyvumas, kaip minėta literatūros apžvalgoje, priklauso nuo ATP,
kurio sintezė, sutrikus mitochondrijų oksidaciniam fosforilinimui, sumažėja [Yokoshiki ir kt., 1997;
Katz, 2001; El-Armouche ir kt., 2003]. Tikslinga buvo ištirti, kokią įtaką izoliuotų žiurkės
kardiomiocitų ICaL turi kvėpavimo grandinės I, III, IV kompleksų aktyvumo slopinimas atitinkamai
rotenonu, antimicinu A ir NaCN, o taip pat atskyrimas oksidacinio fosforilinimo skyrikliu FCCP.
Eksperimentų metu buvo tirta rotenono (3×10-5 M), antimicino A (10-5 M), NaCN (3×10-3 M)
ir FCCP (10-7 M) įtaka žiurkės skilvelio ląstelių izoproterenoliu (10-6 M) stimuliuotai ICaL. Tirtų
metabolizmo slopiklių įtaka buvo vertinama izoproterenoliu (10-6 M) stimuliuotos ICaL atžvilgiu, nes
stimuliuotos srovės fone labiau išryškėja blokuojantis poveikis.
Veikiant β1 – β2 adrenoceptorių agonistui izoproterenoliui (10-6 M), bazinė ICaL padidėjo iki
178,09±10,1 proc. (n= 8) (p<0,001), palyginus su kontrole.
5.8 pav. pateikta eksperimento metu registuotos 10-6 M izoproterenolio stimuliuotos ICaL
kreivės (A) ir ICaL kitimas (B), veikiant rotenonui (3×10-5 M), antimicinui A (10-5 M) ir NaCN
(3×10-3 M). Veikiant rotenonui, pirmąsias dvi veikimo minutes registruotas ICaL padidėjimas – ICaL
fasilitacija (A, c), t.y. procesas, kai dėl sumažėjusio Ca2+ išmetimo iš sarkoplazminio tinklo per
RyR2 kanalus, kuris galėjo pasireikšti dėl ląstelėse sumažėjusio ATP kiekio, sulėtėja sarkolemos L–
tipo Ca2+ kanalų inaktyvacija ir ICaL padidėja [Richard ir kt., 2006]. Po šio trumpalaikio padidėjimo
ICaL mažėjo vidutiniškai iki 73,4±9,6 proc. (n=3) (p<0,05), palyginus su izoproterenolio poveikiu.
Kvėpavimo grandinės III komplekso aktyvumo slopinimas antimicinu A (10-5 M) ir IV-jo – NaCN
(3×10-3 M) sumažino ICaL atitinkamai iki 66,04±3,32 proc. ir 70,85±11,58(n=3) (p<0,05), palyginus
su izoproterenolio poveikiu.
55
400 ms
-1,0
nA
a b c d e f
A
2,5
2,0
1,5
1,0
0,.5
0
Ca2+
srovė
(nA
)
a
bc
d
ef
Laikas (min.)
0 10 20 30
Izoproterenolis 10-6 M
Rotenonas 3×10-5 MAntimicinas A 10-5 M NaCN 3×10-3 M
B
400 ms
-1,0
nA
a b c d e f
A
400 ms
-1,0
nA
a b c d e f
400 ms
-1,0
nA
a b c d e f
A
2,5
2,0
1,5
1,0
0,.5
0
Ca2+
srovė
(nA
)
a
bc
d
ef
Laikas (min.)
0 10 20 30
Izoproterenolis 10-6 M
Rotenonas 3×10-5 MAntimicinas A 10-5 M NaCN 3×10-3 M
B
2,5
2,0
1,5
1,0
0,.5
0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,.5
0
Ca2+
srovė
(nA
)
a
bc
d
ef
Laikas (min.)
0 10 20 300 10 20 300 10 20 30
Izoproterenolis 10-6 M
Rotenonas 3×10-5 MRotenonas 3×10-5 MAntimicinas A 10-5 M NaCN 3×10-3 M
B
5.8 pav. Rotenono, antimicino A ir NaCN įtaka žiurkės širdies ląstelių izoproterenoliu stimuliuotai L–tipo Ca2+ srovei. A. Eksperimentiniai L–tipo Ca2+ srovės užrašai. B. L–tipo Ca2+ srovės kitimas. Raidėmis pažymėtas laiko momentas, kurio metu registruota A dalyje parodyta L–tipo Ca2+ srovė.
Oksidacinio fosforilinimo skyriklio FCCP poveikis izoproterenoliu stimuliuotai ICaL parodytas
5.9 pav. Perfuzijos fiziologiniu tirpalu su 10-7 M FCCP pirmosiomis minutėmis registruotas ICaL
padidėjimas, t.y. pasireiškė fasilitacijos efektas. Po trumpalaikio ICaL padidėjimo, ICaL pradėjo
mažėti vidutiniškai iki 55,42±8,96 proc. (n=3) (p<0,05), palyginus su izoproterenolio poveikiu, t.y.
slopinantis skyriklio FCCP poveikis žiurkės širdies ląstelių ICaL buvo didesnis negu kvėpavimo
grandinės I, III ar IV kompleksų slopiklių.
56
0 10 20
Laikas (min.)
30
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Ca2+
srovė
(nA
)FCCP 10-7 M
Izoproterenolis 10-6 M
0 10 20
Laikas (min.)
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Ca2+
srovė
(nA
)FCCP 10-7 M
Izoproterenolis 10-6 M
30
5.9 pav. FCCP poveikis žiurkės širdies ląstelių izoproterenoliu stimuliuotai L-tipo Ca2+ srovei.
Mūsų tyrimai parodė, kad izoliuotų žiurkės miokardo ląstelių L–tipo Ca2+ srovė, reguliuojanti
miokardo susitraukimą, mažėjo, slopinant mitochondrijų kvėpavimo grandinės I, III ir IV
kompleksų aktyvumus atitinkamai rotenonu, antimicinu A ir NaCN, ar atskiriant oksidacinį
fosforilinimą su FCCP.
5.2. Mitochondrijų kvėpavimo grandinės slopiklių ir oksidacinio fosforilinimo
skyriklio FCCP įtaka žmogaus miokardo elektromechaniniam aktyvumui
Mitochondrijų kvėpavimo grandinės atskirų kompleksų aktyvumo slopinimo ar oksidacinio
fosforilinimo atskyrimo poveikis žmogaus miokardo susitraukimo ir atsipalaidavimo procesams, jų
priklausomybei nuo dirginimo dažnio bei šiuos procesus reguliuojančioms sistemoms nėra ištirtas,
todėl sekančiame darbo etape tyrėme oksidacinio fosforilinimo slopiklių įtaką minėtiems žmogaus
elektromechaninio aktyvumo parametrams.
Šiame skyriuje pateikta mitochondrijų kvėpavimo grandinės I komplekso aktyvumo slopinimo
rotenonu, III komplekso – antimicinu A, IV komplekso – anoksija bei oksidacinio fosforilinimo
skyriklio FCCP poveikis žmogaus miokardo elektromechaninio aktyvumo parametrams. Taip pat
57
buvo tirtas oksidacinio fosforilinimo skyriklio FCCP poveikis žmogaus širdies ląstelių
izoproterenoliu stimuliuotai L–tipo Ca2+ srovei. Eksperimentai buvo atlikti su ligonių, sergančių III
ir IV NYHA funkcinės klasės širdies nepakankamumu, kairiojo skilvelio preparatais, paimtais
širdies operacijų metu KMU Kardiochirurgijos klinikoje. 12 iš tirtųjų buvo vyrai, kurių amžius
buvo 56,58±4,68 metai, 19 – moterys, kurių amžius buvo 67,11±2,77 metai. Sergančiųjų kairiojo
skilvelio išstūmimo frakcija buvo 51,08±2,21 proc. (n=31). Kontrolės sąlygomis, t.y. perfuzuojant
raumenėlius fiziologiniu Tyrode tirpalu ir dirginant 1 Hz dažniu, susitraukimo jėga buvo 0,94±0,12
mN (n=40), pusinis atsipalaidavimo laikas – 173,38±5,03 ms (n=40), VP50 – 248,96±13,38 ms,
VP90 – 398,59±17,93 ms (n=29).
5.2.1. Rotenono įtaka žmogaus miokardo
elektromechaniniam aktyvumui
Eksperimentų metu buvo tirtas mitochondrijų kvėpavimo grandinės I komplekso slopiklio
rotenono (10-6, 10-5, 3×10-5 M) poveikis žmogaus kairiojo skilvelio preparatų susitraukimo jėgai,
atsipalaidavimo laikui bei veikimo potencialų trukmei.
5.10 pav. parodyta eksperimentų metu registruotos susitraukimo jėgos (A) ir veikimo
potencialų (B) kreivės bei susitraukimo jėgos (1 kreivė) ir atsipalaidavimo laiko (2 kreivė) kitimas
(C), veikiant rotenonui. Didėjant fiziologiniame tirpale rotenono koncentracijai nuo 10-6 M iki
3×10-5 M, susitraukimo jėga mažėjo atitinkamai iki 67,38±12,35 proc. (n=5) (p<0,05) ir
48,99±14,74 proc. (n=3) (p<0,05), palyginus su kontrole. Reperfuzijos fiziologiniu tirpalu metu P
dalinai atsistatė iki 68,95±21,18 proc. (n=5), palyginus su kontrole.
Taikant Michaelis-Menten lygtį, rotenono EC50 žmogaus miokardo susitraukimo jėgai buvo
(2,38±1,22)×10-5 M (n=5).
Žmogaus miokardo preparatų atsipalaidavimo laikas, veikiant rotenonui, beveik nekito: t50
buvo 106,18±7,12 proc. ir 97,13±5,82 proc. (n=5), palyginus su kontrole, atitinkamai esant 10-6 ir
3×10-5 M rotenono. Atplaunant fiziologiniu tirpalu be rotenono, raumens atsipalaidavimo laikas
padidėjo iki 123,47±17,24 proc. (n=5), palyginus su kontrole.
58
0
20
40
60
80
100
120
140
Para
met
rų k
itim
as(p
roc.
)
10-6 10-5 10-4
[Rotenonas] (M)
1
2*
* *
C
A
100 ms
0,5
mN
kontrolėrotenonas (10-6 M)rotenonas (10-5 M)
100 ms
50 m
V
Bkontrolė
rotenonas (10-6 M)
rotenonas (10-5 M)
0
20
40
60
80
100
120
140
Para
met
rų k
itim
as(p
roc.
)
10-6 10-5 10-4
[Rotenonas] (M)
1
2*
* *
C
0
20
40
60
80
100
120
140
Para
met
rų k
itim
as(p
roc.
)
10-6 10-5 10-4
[Rotenonas] (M)
1
2*
* *
C
A
100 ms
0,5
mN
kontrolėrotenonas (10-6 M)rotenonas (10-5 M)
A
100 ms
0,5
mN
A
100 ms
0,5
mN
kontrolėrotenonas (10-6 M)rotenonas (10-5 M)
100 ms
50 m
V
Bkontrolė
rotenonas (10-6 M)
rotenonas (10-5 M)
100 ms
50 m
V
Bkontrolė
rotenonas (10-6 M)
rotenonas (10-5 M)
5.10 pav. Rotenono įtaka žmogaus miokardo susitraukimo jėgai, veikimo potencialams ir atsipalaidavimo laikui. A. Eksperimentiniai susitraukimo kreivių užrašai, veikiant 10-6, 10-5 ir 3×10-5 M rotenono. B. Eksperimentiniai veikimo potencialų užrašai, veikiant 10-6 ir 10-5 M rotenono. C. Susitraukimo jėgos (1 kreivė) ir atsipalaidavimo laiko (2 kreivė) kitimas, veikiant rotenonui. Abscisių ašyje – rotenono koncentracijos (M), ordinačių – parametrų kitimas, apskaičiuotas procentais, palyginus su kontrole. ∗ p<0,05.
Veikimo potencialų trukmės VP50 ir VP90, didėjant rotenono koncentracijai, nežymiai mažėjo:
atitinkamai iki 86,95±11,18 proc. ir 91,6±7,22 proc. (n=3), esant 10-6 M, ir iki 81,34±15,81 proc.
bei 87,28±7,25 proc. (n=3), esant 10-5 M rotenono, palyginus su kontrole.
Veikiant rotenonui, žmogaus skilvelių preparatų ramybės įtempimas nekito, t.y. nesivystė
kontraktūra.
5.2.2. Antimicino A įtaka žmogaus miokardo
elektromechaniniam aktyvumui
59
Antimicino A, slopinančio mitochondrijų kvėpavimo grandinės III komplekso aktyvumą,
poveikis žmogaus miokardo susitraukimo jėgai bei veikimo potencialams pateiktas atitinkamai 5.11
pav. A ir B dalyse (eksperimentinių kreivių pavyzdžiai). Šio slopiklio poveikis susitraukimo jėgos
ir atsipalaidavimo laiko kitimui parodytas 5.11 pav. C dalyje (šešių eksperimentų duomenų
vidurkiai).
.11 pav. Antimicino A įtaka žmogaus miokardo susitraukimo jėgai, veikimo potencialams ir
otencialų užrašai, veikiant 3×10-4 M antimicino A. . Abscisių ašyje –
centais, palyginus su kontrole.
Didėjant antimicino A koncentracijai fiziologiniame tirpale, susitraukimo jėga mažėjo: iki
89,62
ipalaidavimo laikas t50, didėjant antimicino A koncentracijai,
nežymiai didėjo ir buvo 103,8±1,47 proc. (n=6), (p<0,05) bei 106,78±5,78 proc. (n=5), palyginus su
kontrole, atitinkamai esant fiziologiniame tirpale 3×10-6 M ir 3×10-4 M antimicino A.
0,5
mN
100 ms
A kontrolėantimicinas A (3×10-6 M)
antimicinas A (3×10-5 M)
antimicinas A (3×10-4 M)
100 ms
50 m
V
Bkontrolė
antimicinas A (3×10-4 M)
0
20
40
60
80
100
120
Para
met
rų k
itim
as(p
roc.
)
10-6 10-5 10-4 10-3
[Antimicinas A] (M)
1
2
*
**
* *
C
0,5
mN
100 ms
A kontrolėantimicinas A (3×10-6 M)
antimicinas A (3×10-5 M)
antimicinas A (3×10-4 M)
0,5
mN
100 ms
A
0,5
mN
100 ms
0,5
mN
100 ms
A kontrolėantimicinas A (3×10-6 M)
antimicinas A (3×10-5 M)
antimicinas A (3×10-4 M)
100 ms
50 m
V
Bkontrolė
antimicinas A (3×10-4 M)
100 ms
50 m
V
Bkontrolė
antimicinas A (3×10-4 M)
0
20
40
60
80
100
120
Para
met
rų k
itim
as(p
roc.
)
10-6 10-5 10-4 10-3
[Antimicinas A] (M)
1
2
*
**
* *
C
0
20
40
60
80
100
120
Para
met
rų k
itim
as(p
roc.
)
10-6 10-5 10-4 10-3
[Antimicinas A] (M)
1
2
*
**
* *
C
5atsipalaidavimo laikui. A. Eksperimentiniai susitraukimo kreivių užrašai, veikiant 3×10-6, 3×10-5 ir 3×10-4 M antimicino A. B. Eksperimentiniai veikimo pC. Susitraukimo jėgos (1 kreivė) ir atsipalaidavimo laiko (2 kreivė) kitimas, veikiant antimicinui Aantimicino A koncentracijos (M), ordinačių – parametrų kitimas, apskaičiuotas pro∗ p<0,05; ∗∗ p<0,001.
±5,64 proc., esant 3×10-6 M, ir iki 41,66±8,8 proc. (n=5) (p<0,001), esant 3×10-4 M
antimicino A, palyginus su kontrole.
Žmogaus miokardo preparatų ats
60
Veikimo potencialų trukmės VP50 ir VP90 sumažėjo tik veikiant 3×10-4 M antimicino A:
atitinkamai iki 90,76±5,03 proc. ir 95,85±2,13 proc. (n=5) (p<0,05), palyginus su kontrole (5.3
lentelė).
5.3 le
Antimicino A koncentracija (M)
ntelė. Žmogaus miokardo veikimo potencialų trukmės kitimas, veikiant antimicinui A.
Veikimo potencialų -6 -5 -4
trukmė 3×10n=5
3×10n=6
3×10n=5
VP50 (proc.) 97,88±2,10 96,50±3,79 90,76±5,03 V ) 97,81 ,13∗ P90 (proc. ±1,74 95,90±2,31 95,85±2
Veikimo potencial itimas, veikiant antim palyginus su kontrole. ∗p<0,05.
preparatų ramybės įtempimo nekeitė.
audojant Michaelis-Menten lygtį, antimicino A EC50 žmogaus miokardo susitraukimo jėgai
buvo
elektromechaniniam aktyvumui
Mitochondrijų kvėpavimo grandinės IV komplekso slopinimo poveikis žmogaus miokardo
elektromechaninio aktyvumo parametrams buvo tiriamas kaip ir eksperimentuose su žiurkės
apiliariniais raumenėliais (5.1.3 skyrius).
rdo susitraukimo jėgos (A) ir veikimo potencialų (B)
ekspe
ių raumenėlių
susitr
ų trukmės k icinui A, pateikiamas procentais,
III kvėp inė so slo timicinu A žmogaus skilvelio avimo grand s komplek aktyvumo pinimas an
N
(1,21±0,76)×10-4 M (n=6).
5.2.3. Anoksijos įtaka žmogaus miokardo
p
Anoksinės sąlygos buvo sukuriamos, perfuzuojant žmogaus skilvelio preparatus fiziologiniu
tirpalu su 3×10-3 M natrio ditionito (Na2S2O4), surišančio visą tirpale esantį deguonį.
5.12 pav. parodyta žmogaus mioka
rimentinės kreivės bei susitraukimo jėgos kitimas (C), registruoti anoksijos metu. Veikiant
anoksijai, susitraukimo jėga mažėjo, tačiau žymiai lėčiau negu žiurkės papiliarin
aukimo jėga. Net po 50 min. perfuzijos anoksiniu tirpalu susitraukimo jėga nesumažėjo iki
nulio ir buvo 9,23±3,56 proc. (n=6) (p<0,001), palyginus su kontrole. Reperfuzijos oksigenuotu
fiziologiniu tirpalu metu susitraukimo jėga dalinai atsistatė iki 36,33±13,44 proc. (n=6) (p<0,05),
palyginus su kontrole. Dviejuose iš šešių eksperimentų didėjo ramybės įtempimas. Šiuose
eksperimentuose kontraktūra pradėjo vystytis po 11±5,66 min. ir pasiekė maksimalią reikšmę po
29±22,63 min., kuri buvo 1,75±0,94 (n=2).
61
Žmogaus miokardo atsipalaidavimo laikas, priešingai negu žiurkės papiliarinių raumenėlių,
anoksijos metu, beveik nekito: t50 po 10 min. anoksijos poveikio buvo 92,3±9,74 proc. (n=4),
palyginus su kontrole.
Veikimo potencialų trukmės VP50 ir VP90, perfuzuojant žmogaus miokardo preparatus
anoksiniu fiziologiniu tirpalu 20 min., sumažėjo atitinkamai iki 65,46±9,95 proc. ir 71,07±8,39
proc. (n=5) (p<0,05), palyginus su kontrole, t.y. mažesniu laipsniu negu žiurkės papiliarinių
raum
Eksperimentiniai susitraukimo kreivių užrašai, veikiant anoksijai (po 20 min.). . Eksperimentiniai veikimo potencialų užrašai, veikiant anoksijai (po 20 min.). . Susitraukimo jėgos kitimas, veikiant anoksijai. Abscisių ašyje – perfuzijos anoksiniu tirpalu trukmė (min.), ordinačių susitraukimo jėga, apskaičiuota procentais, palyginus su kontrole. ∗ p<0,05; ∗∗ p<0,001.
enėlių VP trukmės, veikiant anoksijai. Glibenklamidas (2×10-5 M), specifinis ATP-
reguliuojamų K+ kanalų, kurie atsidaro sumažėjus ATP koncentracijai ląstelėse, blokatorius
padidino anoksijos sukeltą VP50 ir VP90 sumažėjimą atitinkamai iki 84,77±13,7 proc. ir 93,77±8,3
(n=3) proc., palyginus su kontrole.
5.12 pav. Anoksijos įtaka žmogaus miokardo susitraukimo jėgai ir veikimo potencialams. A.BC–
62
5.2.4. FCCP įtaka žmogaus miokardo elektromechaniniam
aktyvumui
elektromechaninio aktyvumo parametram giškai kaip eksperimentuose su žiurkės
enėliais.
nt 10-9 M FCCP, susitraukimo jėga ir atsipalaidavimo laikas nekito.
Didė
Oksidacinio fosforilinimo skyriklio FCCP (10-9, 10-8, 10-7, 10-6 M) poveikis žmogaus skilvelio
s buvo tirtas analo
papiliariniais raum
5.13 pav. pateikta eksperimento metu registruotos susitraukimo jėgos (A) ir veikimo
potencialų kreivės (B) bei susitraukimo jėgos (1 kreivė) ir atsipalaidavimo laiko (2 kreivė) kitimas
(C), veikiant FCCP. Veikia
jant FCCP koncentracijai P mažėjo, o atsipalaidavimo laikas didėjo. Didžiausias šių parametrų
pokytis užregistruotas esant tirpale 10-7 ir 10-6 M FCCP: P sumažėjo atitinkamai iki 52,33±10,41
proc. (n=5) (p<0,05) ir 8,31±3,09 proc. (n=5) (p<0,001), t50 padidėjo atitinkamai iki 112,47±4,64
proc. (n=5) (p<0,05) ir 121,4±3,36 proc. (n=5) (p<0,05), palyginus su kontrole. Reperfuzijos
fiziologiniu tirpalu metu tiek susitraukimo jėga, tiek atsipalaidavimo laikas neatsistatė, t.y. FCCP
poveikis buvo negrįžtamas.
A
100 ms
0,5
mN
kontrolė
FCCP (10-8 M)
FCCP (10-6 M)
FCCP (10-7 M)
0
20
40
60
80
100
120
140
Para
met
rų k
itim
as(p
roc.
)
10-9 10-8 10-7 10-6
[FCCP] (M)
1
2
C
*
**
**
100 ms
50 m
V FCCP (10-6 M)
kontrolėFCCP (10-7 M)
BA
100 ms
0,5
mN
kontrolė
FCCP (10-8 M)
FCCP (10-6 M)
FCCP (10-7 M)
A
100 ms
0,5
mN
kontrolė
FCCP (10-8 M)
FCCP (10-6 M)
FCCP (10-7 M)
0
20
40
60
80
100
120
140
Para
met
rų k
itim
as(p
roc.
)
10-9 10-8 10-7 10-6
[FCCP] (M)
1
2
C
*
**
**
0
20
40
60
80
100
120
140
Para
met
rų k
itim
as(p
roc.
)
10-9 10-8 10-7 10-6
[FCCP] (M)
1
2
C
*
**
**
100 ms
50 m
V FCCP (10-6 M)
kontrolėFCCP (10-7 M)
B
100 ms
50 m
V FCCP (10-6 M)
kontrolėFCCP (10-7 M)
B
63
5.13 pav. FCCP įtaka žmogaus miokardo susitraukimo jėgai, veikimo potencialams ir
mo kreivių užrašai, veikiant 10 , 10 ir 10 M FCCP.
t FCCP. Abscisių ašyje – FCCP
Žmogaus miokardo veikimo potencialų trukmė VP50, veikiant mažoms FCCP koncentracijoms
(10-9,
90
5.4 lentelė. Žmogaus miokardo veikimo potencialų trukmės kitimas, veikiant FCCP.
FCCP koncentracija (M)
atsipalaidavimo laikui. A. Eksperimentiniai susitrauki -8 -7 -6
B. Eksperimentiniai veikimo potencialų užrašai, veikiant 10-6 M FCCP. as, veikianC. Susitraukimo jėgos (1 kreivė) ir atsipalaidavimo laiko (2 kreivė) kitim
koncentracijos (M), ordinačių – parametrų kitimas, apskaičiuotas procentais, palyginus su kontrole. ∗ p<0,05; ∗∗ p<0,001.
10-8 M), nekito, o jai padidėjus iki 10-6 M – sumažėjo iki 55,49±3,08 proc. (n=4) (p<0,001).
VP , didėjant FCCP koncentracijai iki 10-6 M, mažėjo iki 88,08±7,52 proc., palyginus su kontrole
(5.4 lentelė). Glibenklamidas (2×10-5 M) FCCP sumažintas VP ir VP padidino atitinkamai iki
84,19±3,24 proc. (n=3) (p<0,05) ir 113,35±23,62 proc. (n=3), palyginus su kontrole.
50 90
Veikimo
p 10-9 10-6otencialų
trukmė n=4
10-8
n=4 10-7
n=4 n=4 V ) 103,58±4,04 101,01±1,43 94,35±1,91∗ 55,49±3,08∗∗ P50 (proc.VP90 (proc.) 96,61±2,04 95,56±0,75∗ 94,17±0,87∗ 88,08±7,52
Veikimo potenci itim FCC s lyg ole. ∗p<0,05;
mogaus miokardo ramybės įtempimas, veikiant FCCP, priešingai nei eksperimentuose su
žiurk
ardo susitraukimo jėgai buvo
(1,99
sidacinio fosforilinimo skyriklio
FCCP
kreiv
alų trukmės k as, veikiant P, pateikiama procentais, pa inus su kontr∗∗p<0,001.
Ž
ės papiliariniais raumenėliais, nekito, t.y nesivystė kontraktūra.
Naudojant Michaelis-Menten lygtį, FCCP EC50 žmogaus miok
±1,11)×10-7 M (n=5). Palyginus su kvėpavimo grandinės slopiklių EC50, kaip ir
eksperimentuose su žiurkės miokardu, žmogaus miokardo susitraukimo funkcija buvo jautriausia
sąlygoms, kai atskirtas mitochondrijų oksidacinis fosforilinimas.
Kaip ir eksperimentuose su žiurkės miokardu, tyrėme ok
(10-7 M, koncentracija artima nustatytai EC50) poveikį žmogaus miokardo susitraukimo
jėgos, atsipalaidavimo laiko ir veikimo potencialų trukmės priklausomybėms nuo dirginimo dažnio.
5.14 pav. pateiktos eksperimento metu registruotos žmogaus skilvelio preparatų susitraukimo
ės, dirginant raumenėlį skirtingais dažniais perfuzijos tik fiziologiniu tirpalu (A) ir fiziologiniu
tirpalu su FCCP (10-7 M) (B) metu. Paveikslo C dalyje pateiktas susitraukimo jėgos kitimas
priklausomai nuo dirginimo dažnio perfuzijos fiziologiniu tirpalu (1 kreivė) ir su FCCP (2 kreivė)
metu. Perfuzuojant raumenėlius fiziologiniu tirpalu, susitraukimo jėgos–dažnio priklausomybė
buvo neigiama, t.y. didinant dirginimo dažnį nuo 0,5 Hz iki 3 Hz, miokardo susitraukimo jėga
mažėjo ir esant 3 Hz buvo 32,01±5,09 proc. (n=7) (p<0,001), palyginus su kontrole. Veikiant FCCP
64
(10-7 M), susitraukimo jėgos–dažnio priklausomybė išliko neigiama, tačiau susitraukimo jėga buvo
mažesnė visame dirginimo dažnių diapazone. Padidinus dirginimo dažnį iki 3 Hz susitraukimo jėga
sumažėjo iki 20,5±3,65 proc. (n=4) (p<0,001), palyginus su kontrole.
0,2 Hz
0,5
mN
100 ms
0,5 Hz1,0 Hz1,5 Hz2,0 Hz2,5 Hz3,0 Hz
100 ms0,
5 m
N
0,2 Hz0,5 Hz1,0 Hz1,5 Hz2,0 Hz2,5 Hz3,0 Hz
A B
0
20
40
60
80
100
120
140
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 1
Dažnis (Hz)
Susi
trau
kim
o jė
ga(p
roc.
)
1
2
*
**
****
**
* ** *
****
****
C
0,2 Hz
0,5
mN
100 ms
0,5 Hz1,0 Hz1,5 Hz2,0 Hz2,5 Hz3,0 Hz
100 ms0,
5 m
N
0,2 Hz0,5 Hz1,0 Hz1,5 Hz2,0 Hz2,5 Hz3,0 Hz
A B0,2 Hz
0,5
mN
100 ms
0,5 Hz1,0 Hz1,5 Hz2,0 Hz2,5 Hz3,0 Hz
0,2 Hz
0,5
mN
0,5
mN
100 ms
0,5 Hz1,0 Hz1,5 Hz2,0 Hz2,5 Hz3,0 Hz
100 ms0,
5 m
N
0,2 Hz0,5 Hz1,0 Hz1,5 Hz2,0 Hz2,5 Hz3,0 Hz
100 ms0,
5 m
N0,
5 m
N
0,2 Hz0,5 Hz1,0 Hz1,5 Hz2,0 Hz2,5 Hz3,0 Hz
A B
0
20
40
60
80
100
120
140
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 1
Dažnis (Hz)
Susi
trau
kim
o jė
ga(p
roc.
)
1
2
*
**
****
**
* ** *
****
****
C
0
20
40
60
80
100
120
140
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 1
Dažnis (Hz)
Susi
trau
kim
o jė
ga(p
roc.
)
1
2
*
**
****
**
* ** *
****
****
0
20
40
60
80
100
120
140
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 1
Dažnis (Hz)
Susi
trau
kim
o jė
ga(p
roc.
)
1
2
*
**
****
**
* ** *
****
****
C
5.14 pav. FCCP įtaka žmogaus miokardo susitraukimo jėgos kitimui priklausomai nuo dA
irginimo dažnio. . Eksperimentiniai susitraukimo kreivių užrašai, dirginant raumenėlį įvairiais dažniais perfuzijos fiziologiniu tirpalu
irginimo dažnio perfuzijos fiziologiniu tirpalu metu (1 kreivė) ir veikiant FCCP (10-7 M) (2
kreiv
metu. B. Eksperimentiniai susitraukimo kreivių užrašai, dirginant raumenėlį įvairiais dažniais, veikiant FCCP (10-7 M). C. Susitraukimo jėgos kitimas priklausomai nuo dirginimo dažnio perfuzijos fiziologiniu tirpalu metu (1 kreivė) ir veikiant 10-7 M FCCP (2 kreivė). Abscisių ašyje – dirginimo dažnis (Hz), ordinačių – susitraukimo jėga, apskaičiuota procentais, palyginus su kontrole. ∗ p<0,05; ∗∗ p<0,001.
5.15 pav. pateiktas žmogaus miokardo atsipalaidavimo laiko kitimas priklausomai nuo
d
ė). Raumenėlių atsipalaidavimo laikas, perfuzuojant fiziologiniu tirpalu ir didinant dirginimo
dažnį nuo 0,2 Hz iki 3 Hz, mažėjo iki 48,08±8,44 proc. (n=4) (p<0,05), palyginus su kontrole. Esant
fiziologiniame tirpale FCCP, t50 nežymiai padidėjo tik didelių dirginimo dažnių diapazone, t.y. nuo
2 Hz iki 3 Hz.
65
5.15 pav. FCCP dirginimo dažAtsipalaidavim etu (1 kreivė) ir
eikiant 10-7 M FCCP (2 kreivė). Abscisių ašyje – dirginimo dažnis (Hz), ordinačių – atsipalaidavimo laikas, čiuotas procentais, palyginus su kontrole. ∗ p<0,05; ∗∗ p<0,001.
mogaus miokardo veikimo potencialai siaurėjo. Esant 3,0 Hz dirginimo dažniui, VP50 sumažėjo iki
7,09±4,59 proc. (n=5) (p<0,001), palyginus su kontrole. Veikiant FCCP (10-7 M), VP50 kitimas
prikla
do susitraukimo jėgą ir veikimo potencialų trukmę, tačiau mažesniu laipsniu negu žiurkės
miok
0
20
40
60
80
100
120
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 1
Dažnis (Hz)
Ats
ipal
aida
vim
o la
ikas
(pro
c.)
12*
*
**
** *
*
0
20
40
60
80
100
120
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 1
Dažnis (Hz)
Ats
ipal
aida
vim
o la
ikas
(pro
c.)
12*
*
**
** *
*
įtaka žmogaus miokardo atsipalaidavimo laiko kitimui priklausomai nuo nio.
o laiko kitimas priklausomai nuo dirginimo dažnio perfuzijos fiziologiniu tirpalu mvapskai
Perfuzuojant raumenėlius fiziologiniu tirpalu ir didinant dirginimo dažnį nuo 0,2 Hz iki 3 Hz,
ž
4
usomai nuo dirginimo dažnio buvo panašus kaip ir perfuzijos fiziologiniu tirpalu be FCCP
metu.
Taigi, kvėpavimo grandinės I, III ir IV kompleksų aktyvumo slopinimas atitinkamai rotenonu,
antimicinu A ir anoksija, o taip pat oksidacinio fosforilinimo atskyrimas su FCCP, mažino žmogaus
miokar
ardo. Žmogaus miokardo atsipalaidavimas pastebimai sulėtėjo tik atskiriant oksidacinį
fosforilinimą su FCCP, o nežymi kontraktūra vystėsi slopinant IV komplekso aktyvumą anoksija.
Žmogaus miokardo susitraukimo jėgos–dažnio priklausomybės pobūdis buvo neigiamas ir, veikiant
FCCP, išliko neigiamas, tačiau susitraukimo jėga buvo ženkliai sumažėjusi tirtame dirginimo
dažnių diapazone (0,2 Hz – 3 Hz).
66
5.2.5. FCCP įtaka izoliuotų žmogaus širdies ląstelių L–tipo
Ca2+ srovei
Tiriant oksidacinio fosforilinimo skyriklio FCCP įtaką žmogaus širdies ląstelių
izoproterenoliu (10-6 M) stimuliuotai L–tipo Ca2+ srovei, nustatėme, kad veikiant 10-7 M FCCP, ICaL
nekito arba nežymiai sumažėjo iki 84,68±14,74 proc. (n=2), palyginus su izoproterenolio poveikiu.
5.16 pav. parodytos eksperimento metu registruotos bazinė (A, a) ir izoproterenoliu (10-6 M)
aktyvuotos žmogaus prieširdžio ląstelės ICaL kreivės (A, b, c, d, e) ir ICaL kitimas (B), veikiant 3×10-
7 M FCCP.
Penkių eksperimentų duomenimis, 10-6 M izoproterenolio padidino bazinę ICaL iki
353,43±70,36 proc. (n=5) (p<0,05), palyginus su kontrole. Esant išoriniame tirpale 3×10-7 M FCCP,
ICaL, pirmosiomis minutėmis padidėjusi dėl fasilitacijos, mažėjo iki 62,31±3,93 proc. (n=5)
(p<0,001), palyginus su izoproterenolio poveikiu. Nutraukus perfuziją tirpalu su FCCP, ląstelių ICaL
atsistatė tik dalinai.
5.16 pav. FCCP įtaka žmogaus širdies ląstelių izoproterenoliu stimuliuotai L-tipo Ca2+ srovei.
-1,0
nA
400 ms
a b c d eA
1,8
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Ca2+
srovė
(nA
)
0 5 10 15 20
Izoproterenolis 10-6 M
FCCP 3×10-7 M
Laikas (min.)
a
bc
d
e
B
-1,0
nA
400 ms
a b c d eA
-1,0
nA
-1,0
nA
400 ms
a b c d eA
1,8
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Ca2+
srovė
(nA
)
0 5 10 15 20
Izoproterenolis 10-6 M
FCCP 3×10-7 M
Laikas (min.)
a
bc
d
e
B1,8
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Ca2+
srovė
(nA
)
0 5 10 15 20
Izoproterenolis 10-6 M
FCCP 3×10-7 M
Laikas (min.)
a
bc
d
e
1,8
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Ca2+
srovė
(nA
)
0 5 10 15 20
Izoproterenolis 10-6 M
FCCP 3×10-7 M
Laikas (min.)
1,8
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0
1,8
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Ca2+
srovė
(nA
)
0 5 10 15 200 5 10 15 200 5 10 15 20
Izoproterenolis 10-6 M
FCCP 3×10-7 MFCCP 3×10-7 M
Laikas (min.)
a
bc
d
e
B
67
A. EksB. L–tCa2+ srovė.
Taigi, izoliuotų žmogaus miokardo ląstelių izoproterenoliu stimuliuota L–tipo Ca2+ srovė
mažė
kompleks
o
pimo. Šių parametrų kitimo dydis buvo skirtingas, priklausomai nuo to, kuri
o grandis buvo slopinama. Kvėpavimo grandinės I komplekso aktyvumo
slopinimas rotenonu turėjo mažiausią įtaką minėtiems žiurkės ir žmogaus miokardo
elektromechaninio aktyvumo parametrams, t.y. žymiai mažesniu laipsniu mažėjo miokardo
susitraukimo jėga, veikimo potencialų trukmė (žmogaus miokardo tyrimuose) arba ji netgi padidėjo
(žiurkės miokardo tyrimuose), lėtėjo atsipalaidavimas. Veikiant rotenonui, žiurkės ir žmogaus
miokardo ramybės įtempimas nekito, t.y. nesivystė kontraktūra. Mūsų tyrimai parodė, kad žmonių,
sergančių širdies nepakankamumu, miokardo elektromechaninio aktyvumo parametrai buvo mažiau
jautrūs I-jo kvėpavimo komplekso slopiklio rotenono poveikiui negu žiurkės miokardo. Tai
patvirtina mūsų nustatytos rotenono koncentracijos, 50 proc. mažinančios miokardo susitraukimo
jėgą (EC50) – žmogaus miokardo tyrimuose EC50 buvo (2,38±1,22)×10-5 M, t.y. didesnė negu
žiurkės miokardo EC50 – (5,74±2,1)×10-6 M. Kvėpavimo grandinės I komplekso slopinimas
rotenonu lėtino žiurkės miokardo atsipalaidavimą, tačiau neturėjo įtakos žmogaus miokardo
atsipalaidavimo laikui.
Mūsų tyrimų rezultatai parodė, kad didžiausią neigiamą poveikį žiurkės ir žmogaus miokardo
elektromechaninio aktyvumo parametrams turi mitochondrijų kvėpavimo grandinės III, IV
kompleksų aktyvumų slopinimas bei oksidacinio fosforilinimo atskyrimas. Žiurkės miokardo
susitraukimo jėga, slopinant kvėpavimo grandinės III-jo komplekso aktyvumą antimicinu A, IV-jo
– anoksija ar atskiriant oksidacinį fosforilinimą skyrikliu FCCP sumažėjo atitinkamai iki 7,64±1,8
proc., iki nulio ir iki 6,77±2,08 proc. Žiurkės miokardo atsipalaidavimas, veikiant šiems oksidacinio
fosforilinimo slopikliams, taip pat žymiai sulėtėjo, sumažėjo veikimo potencialų trukmė, be to,
perimentiniai L–tipo Ca2+ srovės užrašai. ipo Ca2+ srovės kitimas. Raidėmis pažymėtas laiko momentas, kurio metu registruota A dalyje parodyta L–tipo
jo, atskiriant oksidacinį fosforilinimą su FCCP, tačiau mažesniu laipsniu negu žiurkės
miokardo ląstelių ICaL.
Rezultatų aptarimas
Mūsų eksperimentinių tyrimų duomenimis, mitochondrijų kvėpavimo grandinės atskirų
ų slopinimas, I-mojo rotenonu, III-ojo – antimicinu A, IV-ojo – anoksija ar NaCN, o taip
oksidacinio fosforilinimo atskyrimas su FCCP, mažino žiurkės ir žmogaus miokardo susitraukimo
jėgą, veikimo potencialų trukmę bei L–tipo Ca2+ srovę, bei didino arba nekeitė atsipalaidavim
laiko bei ramybės įtem
oksidacinio fosforilinim
šiomis sąlygomis didėjo ramybės įtempimas, t.y. vystėsi miokardo kontraktūra. Žmogaus miokardo
68
susitraukimo jėgos mažėjimas, atsipalaidavimo sulėtėjimas bei veikimo potencialų trukmės
as, slopinant III-jo ir IV-jo kompleksų aktyvumus antimicinu A ir anoksija bei atskiriant
ksidacinį fosforilinimą su FCCP, buvo žymiai mažiau išreikšti palyginus su žiurkės miokardo šių
param a
FCCP EC50 – (1,99±1,11)×10-7 M (žiurkės miokardo EC50 (1,76±0,53)×10-8
), t.y. šios koncentracijos buvo didesnės negu žiurkės miokardo tyrimuose.
Kaip buvo minėta (3.2 skyrius inės I, III ir IV kompleksams
ūdingi protonų siurbliai, pro kuriuos, vykstant elektronų transportui grandine, išmetami protonai iš
matri
ina suaugusių žiurkių izoliuotų kardiomiocitų ∆ψm ir ATP koncentraciją
ląstel
sumažėjim
o
etrų kitimu. Žmogaus miokardo tyrimuose antimicino A koncentracija, 50 proc. m žinanti
miokardo susitraukimo jėgą (EC50), buvo (1,21±0,76)×10-4 M (žiurkės miokardo EC50 –
(9,99±2,55)×10-7 M), o
M
), mitochondrijų kvėpavimo grand
b
kso į tarpmembraninę erdvę. Taip susiformuoja mitochondrijų elektrocheminis potencialas,
kuris reikalingas ATP sintezei. [Graff ir kt., 1999; Duchen, 1999]. Oksiduojamų substratų
elektronai į kvėpavimo grandinę gali patekti ne tik per I kompleksą (NADH dehidrogenazė), bet ir
per II kompleksą (sukcinato dehidrogenazė), todėl I komplekso aktyvumo slopinimas rotenonu
mūsų eksperimentuose nesukėlė žymaus elektromechaninio aktyvumo parametrų kitimo. Panašius
rezultatus gavo ir Sward ir kt., kurie tyrė mitochondrijų funkcijos sutrikimo įtaką žiurkės lygiesiems
raumenims ir nustatė, kad rotenono slopinantis poveikis vidinės Ca2+ koncentracijos svyravimui,
kuris proporcingas susitraukimo jėgos kitimui, buvo mažesnis, nei antimicino A [Sward ir kt.,
2002]. Tuo tarpu, slopinant III ir IV kompleksų aktyvumus, sustoja elektronų transportas
mitochondrijų kvėpavimo grandine ir labai sumažėja elektrocheminis gradientas, kuris būtinas ATP
sintezei, ir ATP kiekis ląstelėse [Graff ir kt., 1999; Duchen, 1999].
Mitochondrijų elektrocheminis gradientas ir membraninis potencialas (∆ψm) sumažėja ir
atskiriant oksidacinį foforilinimą skyrikliu FCCP, kuris veikdamas kaip protonoforas, perneša H+ iš
tarpmembraninės mitochondrijų erdvės į matriksą taip sumažindamas protonų gradientą ir, tuo
pačiu, ATP sintezę [Brennan ir kt., 2006]. Tai patvirtina Di Lisa ir kt. tyrimai, atlikti, naudojant
mitochondrijų membraniniam potencialui jautrius fluorescencinius dažus JC-1 ar TMRM
(tetrametilrodamino metilo esterį). Nustatyta, kad anoksija (kvėpavimo grandinės IV komplekso
slopiklis) ir FCCP maž
ėse [Di Lisa ir kt., 1995]. Panašius rezultatus paskelbė Delcamp ir autoriai, konfokalinio
fluorescencinio mikroskopo ir membraninio potencialo indikatoriaus TMRM pagalba tirdami jūrų
kiaulytės miokardo ląstelių mitochondrijų membraninio potencialo ir ląstelių ilgio kitimą, veikiant
anoksijai. Autoriai nustatė, kad anoksija sukelia mitochondrijų depoliarizaciją (nuo –110 mV iki
maždaug –50 mV) ir žymų ląstelių ilgio sumažėjimą, t.y. kontraktūrą [Delcamp ir kt., 1998]. Chen
ir autoriai, naudodami TMRM dažą, nustatė, kad glikolizės slopinimas 2-deoksigliukoze (10 mM)
ar jodoacetatu (0,1 mM) nemažino pelių embriono širdies ∆ψm, tačiau oksidacinio fosforilinimo
slopinimas protonoforu FCCP (500 nM), ženkliai jį sumažino, taip pat sumažėjo veikimo potencialų
69
trukmė, trumpalaikis viduląstelinio Ca2+ „pliūpsnis“ (Ca2+ transients), pailgėjo atrioventrikulinio
laidumo laikas [Chen ir kt., 2007].
Taigi, sumažėjus mitochondrijų elektrocheminiam potencialui, kuris reikalingas ATP sintezei,
sumažėja ir ATP kiekis miokardo ląstelėse [Graff ir kt., 1999; Duchen, 1999]. Nustatyta, kad
išemijos metu, kai dėl O2 trūkumo slopinamas kvėpavimo grandinės IV komplekso aktyvumas,
šeško širdies viduląstelinis ATP kiekis sumažėjo nuo 5-10 mM iki <100 µM, t.y. sumažėjo apie 90
proc. [Elliott ir kt., 1992]. Perfuzuojant šuns širdies skilvelio miocitus fiziologiniu tirpalu be
gliuk
u ATP reguliuojamų K+ kanalų
slopi
ozės ir su I komplekso slopikliu rotenonu, ląstelėse ATP kiekis sumažėjo 67 proc. [Hohl,
Altschuld, 1991], o veikiant viščiuko širdies miocitų kultūrą jodoacetatu (glikolizės slopiklis) ir
rotenonu, ATP kiekis sumažėjo 92 proc. [Piwnica-Worms ir kt., 1992]. Li ir kt., tirdami kvėpavimo
grandinės slopinimo poveikį oposumo inkstų epitelinėms ląstelėms, nustatė, kad, veikiant cianidui,
ATP kiekis po 2 min. sumažėjo nuo 25,8 iki 10,5 mmol/mg baltymo, t.y. 60 proc.; panašiu laipsniu
ATP kiekis kito ir veikiant antimicinui A [Li ir kt., 1993].
Netiesioginiu ATP kiekio sumažėjimo miokardo ląstelėse rodikliu yra nuo ATP kiekio
priklausomos K+ srovės atsiradimas (IKATP) per sarkolemos ATP reguliuojamus K+ kanalus, kurie
atsidaro sumažėjus viduląstelinei ATP koncentracijai, ir dėl to sumažėja veikimo potencialų trukmė
[Noma, 1983; Sasaki ir kt., 2001; Knopp ir kt., 2001; Sah ir kt., 2001; Zhang ir kt., 2001; Pelzmann
ir kt., 2003]. Ankstesni mūsų laboratorijoje atlikti tyrimai parodė, kad jūrų kiaulytės miokardo
veikimo potencialų trukmė, sumažėjusi dėl hipoksijos poveikio (kvėpavimo grandinės IV
komplekso aktyvumo slopiklis), padidėja, slopinant IKATP specifini
kliu glibenklamidu [Gendvilienė, Mačianskienė, 1997]. Žmogaus miokardo veikimo potencialų
trukmė (VP90) šiuose mūsų tyrimuose, sumažėjusi dėl atsiradusios IKATP veikiant anoksijai (iki
71,07±8,39 proc.) ar atskyrus oksidacinį fosforilinimą skyrikliu FCCP (iki 88,08±7,52 proc.), taip
pat padidėjo (atitinkamai iki 93,77±8,3 proc. ir 113,35±23,62 proc.), slopinant šią srovę
glibenklamidu. Taigi, šie rezultatai patvirtina ATP kiekio sumažėjimą miokardo ląstelėse, slopinant
kvėpavimo grandinės IV komplekso aktyvumą bei atskiriant oksidacinį fosforilinimą su FCCP, ir su
tuo susijusį miokardo susitraukimo jėgos bei veikimo potencialų trukmės sumažėjimą mūsų
eksperimentuose.
Sumažėjus ląstelėse ATP koncentracijai, atsidaro ne tik sarkolemos ATP reguliuojami K+
kanalai ir trumpėja veikimo potencialai, bet sutrinka ir kitų ląstelės sistemų, priklausomų nuo ATP
ir reguliuojančių miokardo ląstelių susitraukimą, funkcionavimas, t.y. sutrinka sarkolemos L–tipo
Ca2+ kanalų, Na+–K+ ATPazės ir nuo jos priklausomos Na+–Ca2+ mainų sistemos, sarkoplazminio
tinklo Ca2+–ATPazės, fosfolambano, RyR kanalų veikla [Steenbergen ir kt., 1990; Goldhaber ir kt.,
1991; Bonz ir kt., 1998].
70
Mūsų tyrimai parodė, kad mitochondrijų kvėpavimo grandinės I, III ir IV kompleksų
aktyvumo slopinimas ar oksidacinio fosforilinimo atskyrimas su FCCP, mažino žiurkės ir žmogaus
izoliu
kanalų aktyvumą ne tik dalyvaudamas
fosfo
(Ca2+–ATPazių) veikla, ląstelių viduje kaupiasi Na+ ir Ca2+ jonai (vystosi Ca2+
perkr
bei IV kompleksų aktyvumus bei atskyrus oksidacinį fosforilinimą su
FCCP, o žmogaus – tik slopinant IV komplekso aktyvumą.
otų širdies ląstelių izoproterenoliu stimuliuotą ICaL. L–tipo Ca2+ kanalus sudarančių baltymų
fosforilinimas baltymų kinaze A (PKA) yra pagrindinis šių kanalų aktyvinimo ir ICaL didinimo
būdas ir vyksta tokiu ląstelinės signalizacijos keliu: β–adrenoreceptorių agonistams (šiuo atveju
izoproterenoliui) sąveikaujant su β–adrenoreceptoriais, aktyvuojami GTP rišantys baltymai (Gs),
kurie stimuliuoja adenilatciklazę (AC) ir dėl to padidėjusi cAMP koncentracija aktyvuoja PKA, kuri
fosforilina L–tipo Ca2+ kanalus bei susitraukimo procese dalyvaujančius baltymus [Katz, 2001; El-
Armouche ir kt., 2003]. L–tipo Ca2+ kanalų fosforilinimas didina jų atsidarymo tikimybę ir atviros
būsenos laiką, dėl to padidėja ICaL [Hartzell ir kt., 1991; Hove-Madsen ir kt., 1996; Bunemann ir kt.,
1999]. Šiam fosforilinimo procesui PKA, kaip substratą, naudoja ATP, todėl, sumažėjus ATP
koncentracijai miokardo ląstelėse, kinta L–tipo Ca2+ kanalų aktyvumas ir ICaL mažėja. Be to,
nustatyta, kad viduląstelinis ATP gali reguliuoti Ca2+
rilinime, bet ir tiesiogiai alosteriškai sąveikaudamas su šiais kanalais [Yokoshiki ir kt., 1997;
Losito ir kt., 1998]. Tyrimų su jūrų kiaulytės ir triušio skilvelių miocitais metu nustatyta, kad,
slopinant energetinį metabolizmą su FCCP ar 2-deoksigliukoze, mažėja L–tipo Ca2+ srovė ir
susitraukimo jėga, aktyvuojasi nuo ATP priklausoma K+ srovė bei didėja viduląstelinio Ca2+ kiekis
[Goldhaber ir kt., 1991]. Nemažai yra duomenų, kad energetinio metabolizmo slopinimo metu
sumažėja viduląstelinis pH. Vidinės terpės parūgštėjimas taip pat gali slopinti L–tipo Ca2+ kanalų
aktyvumą ir ICaL [Bullock, Wray, 1998; Sperelakis, 2002]. Taigi, sumažėjusi L–tipo Ca2+ srovė ir
padidėjusi K+ srovė per KATP kanalus dėl ATP kiekio ląstelėse sumažėjimo mitochondrijų
kvėpavimo grandinės kompleksų aktyvumo slopinimo ir oksidacinio fosforilinimo atskyrimo metu
galėjo lemti veikimo potencialų trukmės bei susitraukimo jėgos sumažėjimą mūsų eksperimentuose.
Dėl sumažėjusios ICaL mažėja ir iš sarkoplazminio tinklo per RyR kanalus išmetamo Ca2+
jonų, kurie būtini susidaryti aktino miozino tilteliams raumens susitraukimo–atsipalaidavimo
procese, kiekis. Tokiu būdu mažėja ir miokardo susitraukimo jėga. Trūkstant ATP, sutrinka Na+–K+
siurblio ir nuo jo priklausančios Na+–Ca2+ mainų sistemos, taip pat sarkolemos bei sarkoplazminio
tinklo Ca2+ siurblių
ova) [Katoh ir kt., 1994; Lancaster, Harrison, 1998]. Esant Ca2+ pertekliui, formuojasi daug
aktino-miozino tiltelių, kuriems iširti taip pat reikalingas ATP (miozino skersinių tiltelių sukibimui
su aktinu ir atsipalaidavimui nuo jo reikia apie 75 proc. ląstelės ATP [Ferrari, 2002]), todėl lėtėja
raumens atsipalaidavimas, t.y. ilgėja atsipalaidavimo laikas, pradeda vystytis miokardo ląstelių
kontraktūra. Kontraktūra mūsų eksperimentuose vystėsi, slopinant žiurkės miokardo mitochondrijų
kvėpavimo grandinės III
71
Kaip buvo minėta, miokardo susitraukimo/atsipalaidavimo priklausomybės nuo dirginimo
dažnio pobūdis (krūvio mėginio modelis eksperimente) leidžia spręsti apie širdies ląstelių
energetinę būseną (energetinius rezervus) ir apie sistemų, tiesiogiai ar netiesiogiai (per baltymų
fosforilinimą) priklausančių nuo ATP ir reguliuojančių susitraukimo–atsipalaidavimo procesą,
funkcionavimą, o taip pat apie miokardo pajėgumą, kintant fiziniam krūviui.
Mūsų darbe nebuvo galimybės ištirti sveiko žmogaus miokardo susitraukimo jėgos ir kitų
parametrų priklausomybės nuo dirginimo dažnio, tačiau literatūros duomenimis, sveikų
eksperimentinių gyvūnų (išskyrus žiurkės) ir žmogaus miokardui būdinga teigiama susitraukimo
jėgos–dažnio priklausomybė, t.y. didinant dirginimo dažnį susitraukimo jėga didėja [Schwinger ir
kt., 1997; Bavendiek ir kt., 1998; Reuter ir kt., 1999; Maier ir kt., 2000; Endoh, 2004]. Teigiamas
susitraukimo jėgos–dažnio priklausomybės pobūdis siejamas su veikimo potencialų skaičiaus
padidėjimu, kuris sąlygoja padidėjusį patenkančio Ca2+ kiekį į ląstelę ir sutrumpėjusį diastolinį
laiko tarpą Ca2+ pašalinimui per Na+–Ca2+ mainų sistemą. Visi šie komponentai lemia Ca2+ kiekio
sarkoplazminiame tinkle padidėjimą ir su tuo susijusį didesnio Ca2+ kiekio (Ca2+ pliūpsnio)
išsiskyrimą per ST RyR kanalus kiekvieno širdies raumens susitraukimo ciklo metu [Schlotthauer ir
kt., 1998; Hasenfuss, Pieske, 2002]. Tuo tarpu eksperimentiniuose gyvūnų širdies nepakankamumo
modeliuose ir žmonių, sergančių širdies nepakankamumu, miokardo susitraukimo jėga, didinant
dirginimo dažnį, mažėja, t.y. jėgos–dažnio priklausomybė neigiama [Pieske ir kt., 1998; Inagaki ir
kt., 1999; Brixius ir kt., 2001; Piacentino ir kt., 2003; Endoh, 2004].
Neigiama susitraukimo jėgos–dažnio priklausomybė būdinga ir kai kuriems smulkiems
graužikams, kurių miokardo susitraukimo jėga labiausiai priklauso nuo Ca2+ kiekio išmetamo iš
sarkoplazminio tinklo ir ST Ca2+–ATPazės (SERCA2) aktyvumo, t.y. pelėms ir žiurkėms
[Bouchard, Rose, 1989; Maier ir kt., 2000, Taylor ir kt., 2004].
Sergančiųjų širdies nepakankamumu neigiamas miokardo ląstelių susitraukimo jėgos–dažnio
pobūdis yra sutrikusios viduląstelinio Ca2+ apykaitos pasekmė, kurią lemia ST Ca2+–ATPazės
aktyvumo bei kiekio sumažėjimas, sumažėjęs iš ST per RyR kanalus išskiriamo Ca2+ kiekis,
miofilamentų jautrumas Ca2+ bei padidėjęs sarkolemos Na+–Ca2+ mainų sistemos aktyvumas
[Ezzaher ir kt., 1992; Pieske ir kt., 1995; O’Rourke ir kt., 1999, Piacentino ir kt., 2003]. Munch ir
kt. nustatė sumažėjusį ST Ca2+–ATPazės aktyvumą sergančiųjų dilatacine kardiomiopatija
miokarde ir susiejo tai su fosfolambano (PLB) serino16 ir treonino17 liekanų fosforilinimo
sumažėjimu [Munch ir kt., 2000]. Defosforilinta PLB forma slopina ST Ca2+–ATPazės aktyvumą
[MacLennan, Kranias, 2003]. Tyrimai, atlikti naudojant žiurkės širdies nepakankamumo modelį,
patvirtino sumažėjusį PLB serino16 liekanų fosforilinimą ir su tuo susijusį ST Ca2+–ATPazės
aktyvumo sumažėjimą [Sande ir kt., 2002]. Susilpnėjusi ST Ca2+–ATPazės veikla sąlygoja mažesnį
ir lėtesnį Ca2+ kiekio sukaupimą ST, todėl kiekvieno vėlesnio dirginimo metu išsiskiria vis mažiau
72
Ca2+,
nt dirginimo dažniui,
žiurk
tai, taip pat, galėjo sąlygoti
susitr
au jautrus oksidacinio fosforilinimo
slopi
mažėja viduląstelinė jo koncentracija, reikalinga susitraukimo procesui, lėtėja
atsipalaidavimas.
Mūsų tyrimų duomenimis, dirginimo dažnio didinimas nuo 0,2 Hz iki 3 Hz taip pat mažino
žiurkės papiliarinių raumenėlių ir žmonių, sergančių širdies nepakankamumu, miokardo
susitraukimo jėgą, t.y. jėgos–dažnio priklausomybė buvo neigiama. Didėja
ės miokardo atsipalaidavimo laikas bei veikimo potencialų trukmė beveik nekito, tuo tarpu
žmonių miokardo – mažėjo. Susitraukimo jėgos priklausomybės nuo dažnio neigiamas pobūdis
išliko, atskyrus oksidacinį fosforilinimą skyrikliu FCCP, tačiau didėjant dirginimo dažniui, žiurkės
ir žmogaus miokardo susitraukimo jėga mažėjo žymiai didesniu laipsniu, o atsipalaidavimas
sulėtėjo. Akivaizdu, kad, didinant dirginimo dažnį, didėja susitraukimų skaičius ir ATP naudojimas
ląstelės kontraktilinio aparato ir sistemų, reguliuojančių susitraukimo procesą, kurių
funkcionavimas priklauso nuo ATP. Todėl širdies nepakankamumo sąlygomis ir slopinant
mitochondrijų oksidacinį fosforilinimą (su FCCP), sutrikus ATP sintezei ir sumažėjus miokardo
ląstelėse ATP kiekiui, dirginimo dažnio didėjimas sukėlė tokį žymų miokardo susitraukimo jėgos
sumažėjimą mūsų eksperimentuose.
Sergančiųjų širdies nepakankamumu miokardo atsipalaidavimas yra labai sulėtėjęs lyginant su
sveikų širdžių miokardu [Hasenfuss ir kt., 1994]. Daugelyje mūsų eksperimentų, dirginant žmogaus
miokardo preparatus dideliais dažniais (2 Hz – 3 Hz), jie nespėdavo atsipalaiduoti, nes tam
reikalingas laikas buvo daug ilgesnis nei dirginimo periodas, o
aukimo jėgos sumažėjimą.
Mūsų eksperimentiniai tyrimai parodė, kad žmogaus miokardo elektromechaninio aktyvumo
parametrų kitimas, slopinant oksidacinį fosforilinimą, buvo mažesnis negu žiurkės miokardo, t.y.
žmonių, sergančių širdies nepakankamumu, miokardas yra maži
klių sukeltiems metabolizmo pokyčiams. Kairiojo skilvelio miokardo preparatai buvo paimti
širdies vožtuvų korekcijos ir koronarų šuntavimo operacijų metu iš ligonių, sergančių III ir IV
NYHA funkcinės klasės širdies nepakankamumu. Literatūros duomenimis, šių patologijų metu,
vyksta miokardo remodeliavimasis, dėl to keičiasi širdies veikla ir jos reguliavimas, t.y. sumažėja
raumens išvystoma susitraukimo jėga, lėtėja atsipalaidavimas, sumažėja kardiomiocitų jautrumas
Ca2+ jonams, katecholaminams, sumažėja ST Ca2+–ATPazės kiekis, padidėja Na+–Ca2+ mainų
sistemos aktyvumas [Sipido ir kt., 2002; Pieske ir kt., 2002; Bers, Despa, 2006]. Šie, miokardo
remodeliavimosi išdavoje įvykę pokyčiai galėjo sąlygoti mažesnius žmonių, sergančių širdies
nepakankamumu, miokardo elektromechaninio aktyvumo parametrų pokyčius, stebimus slopinant
oksidacinį fosforilinimą mūsų eksperimentuose.
73
5.3. F1F0–ATPazės slopiklio oligomicino įtaka žiurkės miokardo
elektromechaniniam aktyvumui energetinio metabolizmo slopinimo metu
icino A (1’ kreivė).
Žinoma, kad sutrikus elektronų transportui kvėpavimo grandine ar atskyrus oksidacinį
fosforilinimą ir sumažėjus mitochondrijų membraniniam potencialui, ne tik sumažėja ATP sintezė
bet ir F1F0-ATP sintazė virsta F1F0-ATPaze, kuri protonų gradiento atstatymui eikvoja ląstelės ATP
ir taip dar labiau didina ATP trūkumą [Rouslin ir kt., 1990; Jennings ir kt., 1991; Duchen, 1999;
Green, Grover, 2000; Grover ir kt., 2004]. Tokio nepageidaujamo ATP eikvojimo sumažinimo
vienu iš galimų būdų gali būti ATP hidrolizės sulėtinimas, slopinant šio fermento aktyvumą. Todėl
buvo atlikti eksperimentai, kuriuose tyrėme oligomicino (F1F0–ATPazės slopiklio) įtaką žiurkės ir
žmogaus miokardo elektromechaniniam aktyvumui mitochondrijų kvėpavimo grandinės III ir IV
kompleksų slopinimo metu ar atskyrus oksidacinį fosforilinimą.
5.3.1. Oligomicino įtaka žiurkės miokardo
elektromechaniniam aktyvumui mitochondrijų kvėpavimo
grandinės III komplekso slopinimo metu
Eksperimentų metu buvo tiriama mitochondrijų kvėpavimo grandinės III komplekso slopiklio
antimicino A įtaka žiurkės širdies papiliarinių raumenėlių elektromechaninio aktyvumo
parametrams F1F0–ATPazės aktyvumo slopinimo oligomicinu sąlygomis. Eksperimentų pradžioje
žiurkės širdies papiliariniai raumenėliai buvo perfuzuojami fiziologiniu tirpalu su 2×10-5 M
oligomicino, po 20 min. į tirpalą buvo įdedama 10-5 M antimicino A. Perfuzija fiziologiniu tirpalu
su oligomicinu ir antimicinu A truko 40–50 min. Registruojamų parametrų pokyčiai buvo vertinami
oligomicino poveikio atžvilgiu.
5.17 pav. parodyta eksperimento metu registruotos žiurkės papiliarinio raumenėlio
susitraukimo (A) ir veikimo potencialų (B) kreivės, veikiant oligomicinui (2×10-5 M) ir
oligomicinui kartu su antimicinu A (10-5 M) . Paveikslo C dalyje pateikta susitraukimo jėgos
kinetika, veikiant 10-5 M antimicino A su 2×10-5 M oligomicino (1 kreivė). Palyginimui pateiktas
susitraukimo jėgos kitimas, esant tirpale tik 10-5 M antim
74
5.17 pav. Oligomicino ir antimicino A įtaka žiurkės papiliariniųraumenėlių susitraukimo jėgai ir veikimo potencialams. A. Eksperimentiniai susitraukimo kreivių užrašai, veikiant tik 2×10-5 M oligomicino ir kartu su 10-5 M antimicino A.
. Eksperimentiniai veikimo potencialų užrašai, veikiant tik 2×10-5 M oligomicino ir kartu su 10-5 M antimicino A.
. Susitraukimo jėgos kitimas, veikiant 2×10-5 M oligomicino ir 10-5 M antimicino A (1 kreivė) ir tik 10-5 M antimicino A (1’procent
omicino, žymiai lėčiau mažino susitraukimo jėgą: po 40 min. P
suma
inu A ir oligomicinu,
eveik nepakito ir atitinkamai buvo 100,25±10,83 proc. ir 93,24±6,22 proc. (n=5), palyginus su
oligomicino poveikiu., t.y. padidėjusios lyginant tik su antimicino A poveikiu.
BC
kreivė). Abscisių ašyje – perfuzijos tirpalais trukmė (min.), ordinačių – susitraukimo jėga, apskaičiuota ais, palyginus su oligomicino poveikiu (1 kreivė) ir kontrole (1’ kreivė). ∗ p<0,05; ∗∗ p<0,001.
Veikiant oligomicinui (2×10-5 M), žiurkės miokardo susitraukimo jėga sumažėjo iki
57,1±6,54 proc. (n=5) (p<0,001), atsipalaidavimo laikas nežymiai prailgėjo iki 108,9±5,99 proc.
(n=5), palyginus su kontrole. Oligomicinas veikimo potencialų trukmės nekeitė – VP50 buvo
95,29±7,07 proc., VP90 – 98,96±3,66 proc. (n=5), palyginus su kontrole. Antimicinas A (10-5 M),
esant fiziologiniame tirpale olig
žėjo iki 25,24±4,83 proc. (n=5) (p<0,001), palyginus su oligomicino poveikiu, tuo tarpu
veikiant tik antimicinui A – iki 7,64±1,8 proc. (n=7) (p<0,001), palyginus su kontrole. Raumenėlių
atsipalaidavimo laikas padidėjo panašiai, kaip ir veikiant tik antimicinui A (10-5 M) – iki
150,73±17,87 proc. (n=5) (p<0,05), palyginus su oligomicino poveikiu. Veikimo potencialų
trukmės VP50 ir VP90, perfuzuojant raumenėlius fiziologiniu tirpalu su antimic
b
75
Ramybės įtempimas pradėjo didėti tik po 31,5±2,1 min. dviejuose iš penkių eksperimentų ir
po 42,5±3,5 min. pasiekė maksimalią reikšmę 0,55±0,2. Veikiant vien tik antimicinui A, santykinė
kontraktūra pradėjo vystytis jau po 16,5±12 min.
5.3.2. Oligomicino įtaka žiurkės miokardo
elektromechaniniam aktyvumui mitochondrijų kvėpavimo
grandinės IV komplekso slopinimo anoksija metu
Tiriant anoksijos įtaką žiurkės širdies elektromechaninio aktyvumo parametrams F1F0–
ATPazės aktyvumo oligomicinu slopinimo sąlygomis, eksperimentų pradžioje papiliariniai
raumenėliai buvo perfuzuojami fiziologiniu tirpalu su 2×10-5 M oligomicino, o po 20 min. –
fiziologiniu tirpalu su 2×10-5 M oligomicino ir 3 mM Na2S2O4 Šiuo tirpalu papiliariniai raumenėliai
buvo perfuzuojami 50–60 min.
Oligomicinas (2×10-5 M) žiurkės širdies papiliarinių raumenėlių susitraukimo jėgą sumažino
iki 65,03±4,87 proc. (n=8) (p<0,001), atsipalaidavimo laiką nežymiai padidino iki 103,6±2,27 proc.
ligomicinu metu susitraukimo jėga mažėjo, tačiau lėčiau nei veikiant tik anoksijai. Po 30 min. P
suma
(n=8), palyginus su kontrole. Veikiant oligomicinui, miokardo veikimo potencialų trukmė nežymiai
sumažėjo: VP50 – iki 90,15±7,38 proc., VP90 – iki 89,48±7,81 proc. (n=6), palyginus su kontrole.
5.18 pav. parodytas susitraukimo jėgos kitimas, veikiant anoksijai ir oligomicinui (1 kreivė)
ir – tik anoksijai (1’ kreivė). Papiliarinių raumenėlių perfuzijos anoksiniu tirpalu kartu su
o
žėjo iki 18,25±5,32 proc. (n=8) (p<0,001) (anoksijos poveikyje P buvo sumažėjusi iki nulio), o
po 45 min. – iki 6,4±3,4 proc. (n=6) (p<0,001), palyginus su oligomicino poveikiu.
76
0
ir
69,33
73 (n=6), t.y.
nežymi i didesnė nei veikiant tik anoksijai.
5.18 pav. Oligomicino ir anoksijos įtaka žiurkės papiliarinių raumenėlių susitraukimo jėgai. Susitraukimo jėgos kitimas, veikiant 2×10-5 M oligomicino ir anoksijai (1 kreivė) ir tik anoksijai (1’ kreivė). Abscisių ašyje – perfuzijos tirpalais trukmė (min.), ordinačių – susitraukimo jėga, apskaičiuota procentais, palyginus su oligomicino poveikiu (1 kreivė) ir kontrole (1’ kreivė). ∗ p<0,05; ∗∗ p<0,001.
Raumens atsipalaidavimo laikas t50 padidėjo, o veikimo potencialų trukmės VP50 ir VP90
sutrumpėjo, veikiant anoksijai ir esant tirpale oligomicino, mažesniu laipsniu negu veikiant tik
anoksijai, ir buvo atitinkamai 111,01±7,13 proc. (n=8), 59,64±16,95 proc. (n=4) (p<0,05),
±20,6 proc. (n=4), palyginus su oligomicino poveikiu.
Perfuzija anoksiniu tirpalu su oligomicinu lėmė ilgesnį laiko tarpą iki kontraktūros vystymosi
pradžios ir maksimalios jos reikšmės: kontraktūra pradėjo vystytis po 7,25±1,79 min. ir pasiekė
maksimumą po 49,08±3,28 min. (n=6) (veikiant tik anoksijai atitinkamai – po 3,3±0,89 min. ir
36,1±8,66 min. (n=5)). Maksimali kontraktūra šiomis sąlygomis buvo 5,29±0,
a
20
40
Susi
tra
1
**
**
****
**
**** ** **
60
80
0 10 20 30 40 50
Laikas (min.)
ukim
o jė
ga(p
roc.
)
1'**
*
*
**
100
120
0
60
80
0 10 20 30 40 50
Laikas (min.)
ukim
o jė
ga(p
roc.
)
1'**
100
120
20
40
Susi
tra
1
**
**
****
0
60
80
0 10 20 30 40 50
Laikas (min.)
ukim
o jė
ga(p
roc.
)
1'**
*
*
**
100
120
20
40
Susi
tra
1
**
**
****
**
**** ** **
77
5.3.3. Oligomicino įtaka žiurkės miokardo
elektromechaniniam aktyvumui oksidacinio fosforilinimo
atskyrimo FCCP metu
Mitochondrijų kvėpavimo grandinės III ir IV kompleksų slopiklių įtakos žiurkės miokardo
elektromechaninio aktyvumo parametrams tyrimai, oligomicinu slopinant F1F0–ATPazės aktyvumą,
parodė, kad šiomis sąlygomis III ir IV kompleksų slopiklių neigiamas poveikis tirtiems
parametrams buvo mažesnis.
Šiame skyriuje pateikti oksidacinio fosforilinimo skyriklio FCCP (10-9, 10-8, 10-7, 3×10-7 M)
poveikio žiurkės miokardo elektromechaniniam aktyvumui duomenys F1F0–ATPazės aktyvumo
oligom inu slopinimo metu. Pradžioje eksperimentų F1F0–ATPazės aktyvumas buvo slopinamas
erfuzuojant raumenėlius fiziologiniu tirpalu su 2×10-5 M oligomicino, po 20 min. į tirpalą
u
okardo susitraukimo jėgos (A) ir
eikimo potencialų (B) kreivės bei susitraukimo jėgos (1 kreivė) ir atsipalaidavimo laiko (2 kreivė)
itimas (C), veikiant oligomicinui ir FCCP. Palyginimui paveikslo C dalyje pateikta susitraukimo
jėgos ( 2
±3,92 proc. (n=5) (p<0,05), VP90 –
98,43
e oligomicino tokia skyriklio koncentracija P sumažino
beveik iki nulio.
Pagal Michaelis-Menten lygtį, nustatyta oksidacinio fosforilinimo skyriklio FCCP EC50
žiurkės miokardo susitraukimo jėgai, slopinant F1F0-ATPazės aktyvumą oligomicinu buvo
(3,34±3,20)×10-8 M.
ic
p
didėjančiomis koncentracijomis buvo dedama FCCP. Kiekvienos skyriklio koncentracijos tirpal
perfuzija truko 20 min.
5.19 pav. pateikta eksperimento metu registruotos žiurkės mi
v
k
1’ kreivė) ir atsipalaidavimo laiko ( ’ kreivė) kitimas veikiant tik FCCP.
Veikiant oligomicinui (2×10-5 M), susitraukimo jėga sumažėjo iki 61,58±7,53 proc. (n=5)
(p<0,001), palyginus su kontrole. Atsipalaidavimo laikas bei veikimo potencialų trukmė beveik
nekito: t50 buvo 103,52±8,67 proc. (n=5), VP50 – 107,86
±4,95 proc. (n=5), palyginus su kontrole. Esant tirpale oligomicino, 10-9 ir 10-8 M FCCP
labiau mažino susitraukimo jėgą nei veikiant tik FCCP – P sumažėjo atitinkamai iki 69,87±11,22
proc. ir 43,25±14,75 proc. (n=5) (p<0,05), palyginus su oligomicino poveikiu. Didėjant FCCP
koncentracijai iki 3×10-7 M, susitraukimo jėga mažėjo iki 18,76±6,13 proc. (n=5) (p<0,001), tačiau
mažesniu laipsniu negu veikiant tik FCCP. B
78
5 o beveik toks pats kaip ir veikiant tik FCCP, t.y padidėjo iki 183,9±16,9 proc.
(n=5) (p<0,05), palyginus su oligomicino poveikiu.
Žiurkės papiliarinių raumenėlių veikimo potencialų trukmės, veikiant oligomicinui ir FCCP,
priešingai nei veikiant tik FCCP, didėjo (5.5 lentelė). Šiomis sąlygomis, didėjant FCCP
5.19 pav. Oligomicino ir FCCP įtaka žiurkės papiliarinių raumenėlių susitraukimo jėgai, veikimo potencialams ir atsipalaidavimo laikui. A. Eksperimentiniai susitraukimo kreivių užrašai, veikiant tik 2×10-5 M oligomicino ir kartu su 10-9, 10-8, 10-7, 3×10-7 M FCCP. B. Eksperimentiniai veikimo potencialų užrašai, veikiant tik 2×10-5 M oligomicino ir kartu su 10-7, 3×10-7 M FCCP. C. Susitraukimo jėgos, veikiant 2×10-5 M oligomicino ir FCCP (1 kreivė) ir tik FCCP (1’ kreivė), bei atsipalaidavimo laiko, veikiant 2×10-5 M oligomicino ir FCCP (2 kreivė) ir tik FCCP (2’ kreivė), kitimas. Abscisių ašyje – FCCP koncentracijos (M), ordinačių – parametrų kitimas, apskaičiuotas procentais, palyginus su oligomicino poveikiu (1, 2 kreivės) ir kontrole (1’, 2’ kreivės). ∗ p<0,05; ∗∗ p<0,001.
Raumenėlių atsipalaidavimo laikas, esant fiziologiniame tirpale oligomicino (2×10-5 M) ir 10-
9, 10-8 ar 10-7 M FCCP buvo didesnis nei veikiant tik FCCP. Tik esant 3×10-7 M FCCP
koncentracijai, t 0 buv
100 ms
1 m
N
Akontrolė
oligomicinas (2×10-5 M)+FCCP (10-9 M)+FCCP (10-8 M)+FCCP (10-7 M)
+FCCP (3×10-7 M) 50 m
V
100 ms
B
kontrolėoligomicinas (2×10-5 M)+FCCP (10-7 M)+FCCP (3×10-7 M)
020406080
Para
me
100120140160180200220
trų
kitim
as(p
roc.
)
10-9 10-8 10-7 10-6
1'1
**
**
****
****
[FCCP] (M)
2'
2*
*
** ***
C
*
100 ms
1 m
N
Akontrolė
oligomicinas (2×10-5 M)+FCCP (10-9 M)+FCCP (10-8 M)+FCCP (10-7 M)
+FCCP (3×10-7 M)
100 ms
1 m
N
Akontrolė
oligomicinas (2×10-5 M)+FCCP (10-9 M)+FCCP (10-8 M)+FCCP (10-7 M)
+FCCP (3×10-7 M) 50 m
V
B
100 ms
kontrolėoligomicinas (2×10-5 M)+FCCP (10-7 M)+FCCP (3×10-7 M)
50 m
V
B
kontrolėoligomicinas (2×10-5 M)+FCCP (10-7 M)+FCCP (3×10-7 M)
100 ms
020406080
Para
me
100120140160180200220
trų
kitim
as(p
roc.
)
2'
2*
*
** ***
C
10-9 10-8 10-7 10-6
1'1
**
**
****
****
[FCCP] (M)
*
020406080
Para
me
100120140160180200220
trų
kitim
as(p
roc.
)
10-9 10-8 10-7 10-6
1'1
**
**
****
****
[FCCP] (M)
2'
2*
*
** ***
*
020406080
Para
me
100120140160180200220
trų
kitim
as(p
roc.
)
10-9 10-8 10-7 10-6
1'1
[FCCP] (M)
2'
2
020406080
Para
me
100120140160180200220
trų
kitim
as(p
roc.
)
2'
2
10-9 10-8 10-7 10-6
1'1
10-9 10-8 10-7 10-6
1'1
**
**
****
****
2'
2*
*
** ***
C
*
[FCCP] (M)[FCCP] (M)
79
koncentracijai iki 3×10-7 M, VP50 ir VP90 padidėjo atitinkamai iki 159,21±28,99 proc. (n=5)
(p<0,05) ir 123,01±19,77 proc. (n=5), palyginus su oligomicino poveikiu.
5.5 lentelė. Žiurkės papiliarinių raumenėlių veikimo potencialų trukmės kitimas, veikiant oligomicinui ir FCCP.
FCCP koncentracija (M) Veikimo potencialų
trukmė 10-9
n=5 10-8
n=5 10-7
n=5 3×10-7
n=5 VP50 (proc.) 108,61±4,95 105,44±17,68 130,35±30,91 159,21±28,99∗ VP90 (proc.) 100,55±1,93 101,18±11,34 110,62±23,95 123,01±19,77
Veikimo potencialų trukmės kitimas, veikiant 2×10-5 M oligomicino ir FCCP, pateikiamas procentais, palyginus su oligomicino poveikiu, prilygintu 100 proc. ∗p<0,05.
5.20 pav. pateiktas ramybės įtempimo kitimas, veikiant FCCP ir oligomicinui (1 kreivė) ir tik
FCCP (1’ kreivė). Esant oligomicinui, ramybės įtempimas pradėjo didėti, t.y. pradėjo vystytis
kontraktūra, jau esant 10-9 M ir 10-8 M FCCP ir buvo didesnė nei veikiant tik FCCP, tačiau, esant
3×10-7 M FCCP, kontraktūra buvo 0,73±0,16 (n=4), t.y., žymiai mažesnė nei sąlygomis be
oligomicino.
įtaka žiurkės papiliarinių raumenėlių ramybės įtempimo itimui.
RamyCP
1F0-ATPazės aktyvumo slopinimo
oligomicinu sąlygomis, parodytas 5.21 pav.: A dalyje – susitraukimo kreivių pavyzdžiai, dirginant
5.20 pav. Oligomicino ir FCCP k
bės įtempimo kitimas, veikiant 2×10-5 M oligomicino ir FCCP (1 kreivė) ir tik FCCP (1’ kreivė). Abscisių ašyje – FC koncentracijos (M), ordinačių – ramybės įtempimas, apskaičiuotas santykiniais vienetais. ∗ p<0,05.
Oksidacinio fosforilinimo skyriklio FCCP poveikis žiurkės papiliarinių raumenėlių
susitraukimo jėgos priklausomybei nuo dirginimo dažnio, F
0
0,5
Ram
ybė
1
1,5
2
s įte
mpi
mas
*0
1
**
1'
*
*
*
*
10-9 10-8 10-7 10-6
[FCCP] (M)
0,5
Ram
ybė
1
1,5
2
s įte
mpi
mas
1
1'
10-9 10-8 10-7 10-6
[FCCP] (M)
0
0,5
Ram
ybė
1
1,5
2
s įte
mpi
mas
1
**
1'
*
*
*
*
*
10-9 10-8 10-7 10-6
[FCCP] (M)
80
raum
eikiant oligomicinui (2×10-5 M) ir dirginant 1,5 Hz dažniu, susitraukimo jėga sumažėjo iki
mai buvo 96,98±3,95 proc. (n=4), 99,29±6,39 proc. (n=3), palyginus su
5.21 pav. Oligomicino ir FCCP įtaka žiurkės papiliarinių raumenėlių susitraukimo jėgos kitimui priklausomai nuo dirginimo dažnio. A. Eksp entiniai susitraukimo kreivių užrašai, dirginant raumenėlį įvairiais dažniais, perfuzijos fiziologiniu tirpalu
FCCP.
o dažnis omicino
poveikiu 3 kreivė). ∗ p<0,05; ∗∗ p<0,001.
enėlį skirtingais dažniais perfuzuojant fiziologiniu tirpalu, B dalyje – fiziologiniu tirpalu su
oligomicinu (2×10-5 M) ir FCCP (3×10-8 M). Paveikslo C dalyje pateikti vidurkinti susitraukimo
jėgos kitimo duomenys, perfuzuojant fiziologiniu tirpalu (1 kreivė), su 3×10-8 M FCCP (2 kreivė)
ir su 3×10-8 M FCCP ir 2×10-5 M oligomicino (3 kreivė).
V
64,28±12,45 proc. (n=4) (p<0,05), atsipalaidavimo laikas t50 ir veikimo potencialų trukmė VP50
beveik nekito ir atitinka
kontrole.
0,2 Hz0,5 Hz1,0 Hz
erimmetu. B. Eksperimentiniai susitraukimo kreivių užrašai, dirginant raumenėlį įvairiais dažniais, veikiant 2×10-5 M oligomicino su 3×10-8 MC. Susitraukimo jėgos kitimas priklausomai nuo dirginimo dažnio perfuzijos fiziologiniu tirpalu metu (1 kreivė), veikiant tik 3×10-8 M FCCP (2 kreivė) ir kartu su 2×10-5 M oligomicino (3 kreivė). Abscisių ašyje – dirginim(Hz), or načių – susitraukimo jėga, apskaičiuota procentais, palyginus su kontrole (1, 2 kreivės) ir su oligdi
(
1,5 Hz2,0 Hz2,5 Hz3,0 Hz
1 m
N
1 m
N
100 ms 100 ms
0,2 H
1,5 Hz2,0 Hz2,5 Hz
A B
z0,5 Hz1,0 Hz
3,0 Hz
0
3,0 Hz
,2 Hz0,5 Hz1,0 Hz
0
50
100
150
200
250
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 1,5
Dažnis (Hz)
Susi
trau
kim
o jė
ga(p
roc.
)
**
**
*********
*
*
* * * * **
** * ** ** **
1
23
C
1,5 Hz2,0 Hz2,5 Hz
1 m
N
1 m
N
100 ms 100 ms
0,2 H
1,5 Hz2,0 Hz2,5 Hz
A B
z0,5 Hz1,0 Hz
3,0 Hz
0
3,0 Hz
,2 Hz0,5 Hz1,0 Hz1,5 Hz2,0 Hz2,5 Hz
1 m
N1
mN
1 m
N1
mN
100 ms100 ms 100 ms100 ms
0,2 H
1,5 Hz2,0 Hz2,5 Hz
A B
z0,5 Hz1,0 Hz
3,0 Hz
0
50
100
150
200
250
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 1,5
Dažnis (Hz)
Susi
trau
kim
o jė
ga(p
roc.
)
**
**
*********
*
*
* * * * **
** * ** ** **
1
23
C
0
50
100
150
200
250
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 1,5
Dažnis (Hz)
Susi
trau
kim
o jė
ga(p
roc.
)
**
**
*********
*
*
* * * * **
** * ** ** **
1
23
0
50
100
150
200
250
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 1,5
Dažnis (Hz)
Susi
trau
kim
o jė
ga(p
roc.
)
**
**
*********
*
*
* * * * **
** * ** ** **
1
23
C
81
Didinant dirginimo dažnį nuo 0,2 Hz iki 3 Hz, papiliarinių raumenėlių perfuzijos fiziologiniu
tirpalu su 2×10-5 M oligomicino ir 3×10-8 M FCCP metu, susitraukimo jėga mažėjo, tačiau buvo
didesnė visame dirginimo dažnių diapazone nei perfuzijos tik su FCCP metu: esant 3,0 Hz
dirginimo dažniui, P sumažėjo iki 46,41±11,9 proc. (n=4) (p<0,05), palyginus su oligomicino
poveikiu.
5.22 pav. parodytas žiurkės širdies atsipalaidavimo laiko kitimas priklausomai nuo dirginimo
dažnio perfuzijos fiziologiniu tirpalu metu (1 kreivė) ir veikiant oligomicinui su FCCP (3 kreivė).
Palyg
5.22 pav. Oligomicino ir FCCP įtaka žiurkės papiliarinių raumenėlių atsipalaidavimo laiko kitimui priklausomai nuo dirginimo dažnio. Atsipalaidavimo laiko kitimas priklausomai nuo dirginimo dažnio, perfuzuojant fiziologiniu tirpalu (1 kreivė), veikiant tik 3×10-8 M FCCP (2 kreivė) ir kartu su 2×10-5 M oligomicino (3 kreivė). Abscisių ašyje – dirginimo dažnis (Hz), ordinačių – atsipalaidavimo laikas, apskaičiuotas procentais, palyginus su kontrole (1, 2 kreivės) ir su oligomicino poveikiu (3 kreivė). ∗ p<0,05; ∗∗ p<0,001.
Esant tirpale 2×10-5 M oligomicino ir 3×10-8 M FCCP, t50 buvo nežymiai didesnis tirtame
dažnių diapazone negu perfuzijos fiziologiniu tirpalu ar fiziologiniu tirpalu tik su FCCP (3×10-8 M).
Veikimo potencialų trukmė VP50, perfuzuojant raumenėlius fiziologiniu tirpalu su oligomicinu
ir FCCP ir didinant dirginimo dažnius nuo 0,2 Hz iki 3 Hz, priešingai negu perfuzijos tik su FCCP
metu, nežymiai didėjo, ir esant 3,0 Hz dažniui buvo 132,26±30,51 proc. (n=3), palyginus su
inimui pateiktas raumens atsipalaidavimo laiko kitimas veikiant tik FCCP (2 kreivė).
60
80
100
120
140
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 1,5
Dažnis (Hz)
Ats
ipal
aida
vim
o la
ikas
(pro
c.)
12
3
* *
* **
** ** ****
60
80
100
120
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 1,5
Dažnis (Hz)
Ats
ipal
aida
vim
o la
ikas
(pro
c.)
140
60
80
100
120
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 1,5
Dažnis (Hz)
Ats
ipal
aida
vim
o la
ikas
(pro
c.)
140
12
3
* *
* **
** ** ****
oligomicino poveikiu.
82
5.3.4. Oligomicino įtaka žiurkės širdies ląstelių L–tipo Ca2+
srovei oksidacinio fosforilinimo atskyrimo FCCP metu
o jėgai buvo mažesnis, buvo atlikta eksperimentų grupė, kur buvo tiriama oligomicino ir
FCCP
tinamas
ligomicino atžvilgiu.
5.23 pav. parodytas eksperimento metu registruotas žiurkės širdies ląstelių 10-6 M
izoproterenoliu stimuliuotos ICaL kitimas, veikiant 3×10-5 M oligomicino ir 10-7 M FCCP. Veikiant
oligomicinui, ląstelių izoproterenoliu stimuliuota ICaL išliko nepakitusi. Pridėjus į išorinį tirpalą
FCCP (10-7 M), ICaL pirmosiomis minutėmis padidėjusi dėl fasilitacijos efekto, toliau veikiant FCCP
sumažėjo iki izoproterenolio stimuliuotos ICaL lygio, t.y. beveik nepakito ir buvo 95,69±3,36 proc.
(n=4), palyginus su oligomicino poveikiu. Tai rodo, kad F1F0–ATPazės aktyvumo slopinimas
oligomicinu panaikino FCCP slopinantį poveikį žiurkės širdies ląstelių ICaL.
Nustačius, kad slopinant F1F0–ATPazės aktyvumą oligomicinu, kvėpavimo grandinės
kompleksų slopiklių ir oksidacinio fosforilinimo skyriklio FCCP poveikis žiurkės miokardo
susitraukim
įtaka žiurkės širdies ląstelių izoproterenoliu stimuliuotai L–tipo Ca2+ srovei. Šiuose
eksperimentuose, kaip ir registruojant žiurkės papiliarinių raumenėlių susitraukimo jėgos,
atsipalaidavimo laiko ir VP trukmių kitimą, FCCP poveikis Ca2+ srovei buvo ver
o
5.23 pav. Oligomicino ir FCCP įtaka žiurkės širdies ląstelių izoproterenoliu stimuliuotai L–tipo Ca2+ srovei.
20 25 30 35
0,75
1,50
2,25
3,00
0
10 150
Izoproterenolis 10-6 M
Oligomicinas 3x10-5 MFCCP 10-7 M
2,25
3,00
Laikas (min.)
Ca2+
srovė
(nA
)
20 25 30 35
0,75
1,50
0
10 150
ė (n
A)
Izoproterenolis 10-6 M
Oligomicinas 3x10-5 MFCCP 10-7 M
Ca2+
srov
Laikas (min.)
83
5.4. F1F0–ATPazės slopiklio oligomicino įtaka žmogaus miokardo
lektromechaniniam aktyvumui energetinio metabolizmo slopinimo metue
etinio metabolizmo slopinimo metu. Eksperimentai buvo atlikti analogiškai,
kaip
etu
Šioje eksperimentų grupėje buvo tirtas oligomicino (2×10-5 M) ir antimicino A (3×10-4 M)
poveikis, žmogaus miokardo elektromechaninio aktyvumo parametrams. Po 20 min. perfuzijos
tirpalu su 2×10-5 M oligomicino, susitraukimo jėga sumažėjo iki 84,91±8,61 proc., atsipalaidavimo
laikas t50 ir veikimo potencialų trukmės VP50 ir VP90 beveik nekito ir buvo atitinkamai 101,57±1,95
proc. (n=4), 107,23±1,44 proc. (n=4) (p<0,05) ir 105,83±5,98 proc. (n=4), palyginus su kontrole.
5.24 pav. parodyta eksperimento metu registruotos žmogaus miokardo susitraukimo (A) ir
veikimo potencialų (B) kreivės, veikiant tik oligomicinui ir kartu su antimicinu A. Paveikslo C
dalyje pateikta susitraukimo jėgos kinetika, veikiant antimicinui A (3×10-4 M) su oligomicinu
(2×10-5 M) (1 kreivė) ir tik antimicinui A (3×10-4 M) (1’ kreivė). Kaip ir eksperimentuose su
žiurkės miokardu, F1F0–ATPazės aktyvumo slopinimas oligomicinu lėmė lėtesnį žmogaus
miokardo susitraukimo jėgos mažėjimą, veikiant antimicinui A: P buvo 66,96±7,02 proc. (n=4),
<0,05), palyginus su oligomicino poveikiu, t.y. apie 25 proc. didesnė negu veikiant tik antimicinui
.
Tiriant energetinio metabolizmo slopiklių įtaką žmogaus miokardo elektromechaniniam
aktyvumui nustatėme, kad didžiausią neigiamą poveikį, kaip ir žiurkės miokardo
elektromechaniniam aktyvumui, turėjo mitochondrijų kvėpavimo grandinės III, IV kompleksų
aktyvumų slopinimas bei oksidacinio fosforilinimo atskyrimas. Nustatyti, kokią įtaką šiomis
sąlygomis turėjo F1F0–ATPazės aktyvumas, buvo atlikti eksperimentai, kuriuose buvo tiriama šio
fermento slopiklio oligomicino poveikis žmogaus miokardo elektromechaninio aktyvumo
parametrų kitimui energ
ir su žiurkės širdies papiliariniais raumenėliais, energetinio metabolizmo slopiklių įtaka
registruotiems parametrams buvo vertinama oligomicino atžvilgiu.
5.4.1. Oligomicino įtaka žmogaus miokardo
elektromechaniniam aktyvumui kvėpavimo grandinės III
komplekso slopinimo antimicinu A m
(p
A
84
Raumens atsipalaidavimo laikas šiomis sąlygomis nežymiai padidėjo iki 105,35±2,4 proc.
(n=4) (p<0,05), kaip ir veikiant tik antimicinui A. Tiek veikiant tik antimicinui A, tiek antimicinui
A su olig
su
ligomicinu ir antimicinu A buvo atitinkamai 96,76±4,89 proc. ir 103,47±10 proc. (n=4), palyginus
su oli
A. EkB. Eks
omicinu, žmogaus miokardo ramybės įtempimas nekito, t.y. nesivystė kontraktūra.
Veikimo potencialų trukmės VP50 ir VP90, perfuzuojant raumenėlius fiziologiniu tirpalu
o
gomicino poveikiu, t.y. beveik nepakito kaip ir veikiant tik anticimicinui A.
kontrolė
oligomicinas (2×10-5 M)
+ antimicinas A (3×10-4 M)
5.24 pav. Oligomicino ir antimicino A įtaka žmogaus miokardo susitraukimo jėgai ir veikimo potencialams.
sperimentiniai susitraukimo kreivių užrašai, veikiant tik 2×10-5 M oligomicino ir kartu su 3×10-4 M antimicino A. perimentiniai veikimo potencialų užrašai, veikiant tik 2×10-5 M oligomicino ir kartu su 3×10-4 M antimicino A.
C. Susitraukimo jėgos kitimas, veikiant 2×10-5 M oligomicino ir 3×10-4 M antimicino A (1 kreivė) ir tik 3×10-4 M antimicino A (1’ kreivė). Abscisių ašyje – perfuzijos tirpalais trukmė (min.), ordinačių – susitraukimo jėga, apskaičiuota procentais, palyginus su oligomicino poveikiu (1 kreivė) ir kontrole (1’ kreivė). ∗ p<0,05; ∗∗ p<0,001.
0,5
mN
100 ms
Akontrolėoligomicinas (2×10-5 M)
50 m
V
100 ms
B
+ antimicinas A (3×10-4 M)kontrolė
oligomicinas (2×10-5 M)
+ antimicinas A (3×10-4 M)
0,5
mN
100 ms
Akontrolė
oligomicinas (2×10-5 M)
+ antimicinas A (3×10-4 M)
0,5
mN
100 ms
A
0,5
mN
100 ms
Akontrolėoligomicinas (2×10-5 M)
50 m
V
100 ms
B
+ antimicinas A (3×10-4 M)
kontrolėoligomicinas (2×10-5 M)
50 m
V
100 ms
B
+ antimicinas A (3×10-4 M)
20
120
Susi
trau
kipr
oc.)
C
40
60
80
100
mo
jėga
(
1
1'
** * * *
**
20
120
Susi
trau
kipr
oc.)
C
00 5 10 15 20 25 30
Laikas (min.)
40
60
80
100
mo
jėga
(
1
1'
** * * *
**
20
120
Susi
trau
kipr
oc.)
00 5 10 15 20 25 30
Laikas (min.)
40
60
80
100
mo
jėga
(
1
1'
** * * *
**
20
120
Susi
trau
kipr
oc.)
C
00 5 10 15 20 25 30
Laikas (min.)
40
60
80
100
mo
jėga
(
1
1'
** * * *
**
00 5 10 15 20 25 30
Laikas (min.)
85
5.4.2. Oligomicino įtaka žmogaus miokardo
elektromechaniniam aktyvumui oksidacinio fosforilinimo
Tiriant FCCP (10-9, 10-8, 10-7, 10-6 M) įtaką žmogaus miokardo preparatų elektromechaninio
aktyvumo parametrams F1F0–ATPazės slopinimo oligomicinu sąlygomis, nustatyta, kad
oligomicinas (2×10-5 M) mažino susitraukimo jėgą iki 82,49±4,79 proc. (n=7) (p<0,05), veikimo
potencialų trukmes VP50 ir VP90 atitinkamai iki 89,76±1,25 proc. ir 91,59±1,8 proc. (n=5) (p<0,05),
palyginus su kontrole, ir nekeitė atsipalaidavimo laiko (101,81±2,54 proc. (n=7).
5.25 pav. parodytos eksperimentų metu registruotos žmogaus miokardo susitraukimo (A) ir
veikimo potencialų (B) kreivės bei susitraukimo jėgos (1 kreivė) ir atsipalaidavimo laiko (2 kreivė)
kitimas (C), veikiant oligomicinui ir FCCP. Palyginimui pateiktas susitraukimo jėgos (1’ kreivė) ir
atsipalaidavimo laiko (2’ kreivė) kitimas veikiant tik FCCP (C).
5.25 pav. Oligomicino ir FCCP įtaka žmogaus miokardo susitraukimo jėgai, veikimo potencialams ir atsipalaidavimo laikui.
atskyrimo FCCP metu
0,5
mN
100 ms
kontrolė
oligomicinas (2×10-5 M)
+FCCP (10-6 M)
A
50 m
V
100 ms
kontrolė
oligomicinas (2×10-5 M)
+FCCP (10-6 M)
B
0
20
40
60
C
80
100
kiti
mas
(
120
oc.)
140
Para
met
rųpr
10-9 10-8 10-7 10-6
[FCCP] (M)
1
1'
2'*
****
2*
*
***
0,5
mN
100 ms
kontrolė
oligomicinas (2×10-5 M)
+FCCP (10-6 M)
A
0,5
mN
100 ms
kontrolė
oligomicinas (2×10-5 M)
+FCCP (10-6 M)
A
50 m
V
100 ms
kontrolė
oligomicinas (2×10-5 M)
+FCCP (10-6 M)
B
50 m
V
100 ms
kontrolė
oligomicinas (2×10-5 M)
+FCCP (10-6 M)
B
0
20
40
60
Para
met
rų
CC 140
80
100
kiti
mas
(
120
oc.)
pr
0
20
40
60
Para
met
rų
140
10-9 10-8 10-7 10-6
[FCCP] (M)
1
1'
2'*
****
2*
*
***
80
100
kiti
mas
(
120
oc.)
pr
0
20
40
60
Para
met
rų
140
10-9 10-8 10-7 10-6
[FCCP] (M)
1
1'
2'
2
10-9 10-8 10-7 10-6
[FCCP] (M)
1
1'
2'*
****
2*120
oc.)
80
100
kiti
mas
(pr
*
***
86
A. Eksperimentiniai s P. B. Eksperimentiniai v . C. Su -5 imo laiko CP konc , 2 kreivės) ir kontrole (1’, 2’ kreivės). ∗
Didėjant FCCP koncentracijai ir esant fiziologiniam tirpale oligomicino, susitraukimo jėga
ažėjo, tačiau mažesniu laipsniu, negu veikiant tik FCCP. Esant tirpale 2×10-5 M oligomicino ir 10-
6 M F
miai sumažėjo, o
esant
M iki 10-8 M, nekito, o didėjant
CCP koncentracijai iki 10-6 M, VP50 sumažėjo iki 76,28±10,06 proc., VP90 – iki 88,15±5,70 proc.
(n=5) (p<0,05), t.y. panašiu laipsniu kaip ir nesant tirpale oligomicino.
5.6 lentelė. Žmogaus miokardo veikimo potencialų trukmės kitimas, veikiant oligomicinui ir FCCP.
FCCP koncentracija (M)
usitraukimo kreivių užrašai, veikiant tik 2×10-5 M oligomicino ir kartu su 10-6 M FCCeikimo potencialų užrašai, veikiant tik 2×10-5 M oligomicino ir kartu su 10-6 M FCCP
sitraukimo jėgos, veikiant 2×10 M oligomicino ir FCCP (1 kreivė) ir tik FCCP (1’ kreivė), bei atsipalaidav, veikiant 2×10-5 M oligomicino ir FCCP (2 kreivė) ir tik FCCP (2’ kreivė), kitimas. Abscisių ašyje – FCentracijos (M), ordinačių – parametrų kitimas, apskaičiuotas procentais, palyginus su oligomicino poveikiu (1
p<0,05; ∗∗ p<0,001.
m
CCP, P sumažėjo iki 20,76±4,39 proc. (n=7) (p<0,001), palyginus su oligomicino poveikiu.
Veikiant tik FCCP, tokia skyriklio koncentracija P sumažino iki 8,31±3,09 proc. (n=5) (p<0,001),
palyginus su kontrole.
Raumens atsipalaidavimo laikas, esant tirpale oligomicino ir didėjant FCCP koncentracijai
nuo 10-9 M iki 10-7 M, priešingai negu veikiant tik FCCP, nedidėjo, o netgi nežy
10-6 M FCCP buvo 112,02±18,86 proc. (n=7), palyginus su oligomicino poveikiu. Ramybės
įtempimas, veikiant oligomicinui su FCCP, kaip ir veikiant tik FCCP, nekito.
Veikimo potencialų trukmių kitimas pateiktas 5.6 lentelėje. VP50 ir VP90, esant fiziologiniame
tirpale oligomicino ir didėjant FCCP koncentracijoms nuo 10-9
F
Veikimo potencialų
trukmė 10-9
n=5 10-8
n=5 10-7
n=5 10-6
n=5 VP50 (proc.) 102,92±3,50 100,22±4,36 94,29±6,44 76,28±10,06∗ VP90 (proc.) 99,17±2,94 96,48±3,31 92,47±3,32∗ 88,15±5,70∗
Veikimo potencialų trukmės kitimas, veikiant 2×10-5 M oligomicino ir FCCP, pateikiamas procentais, palyginus su oligomicino poveikiu, prilygintu 100 proc. ∗p<0,05.
Pagal Michaelis-Menten lygtį, nustatyta oksidacinio fosforilinimo skyriklio FCCP EC50
žmogaus miokardo susitraukimo jėgai, kai slopinamas mitochondrijų F1F0–ATPazės aktyvumas
oligomicinu, buvo (3,96±0,86)×10-7 M. Ši koncentracija yra didesnė, lyginant su FCCP EC50,
nesant tirpale oligomicino ((1,99±1,11)×10-7 M). Taigi, mūsų gauti duomenys leidžia teigti, kad
F1F0–ATPazės aktyvumo slopinimas oligomicinu, apsaugo miokardo ląsteles nuo ATP išeikvojimo
ir sumažina oksidacinio fosforilinimo skyriklio FCCP sukeltus miokardo elektromechaninio
aktyvumo parametrų pokyčius.
87
5.26 pav. pateiktos eksperimento metu registruotos žmogaus miokardo susitraukimo kreivės,
dažniais ir perfuzuojant fiziologiniu tirpalu (1
reivė), tirpalu su FCCP (10-7 M) (2 kreivė) ir FCCP (10-7 M) su oligomicinu (2×10-5 M) (3
kreiv
5.26
dirginant raumenėlį skirtingais dažniais perfuzijos fiziologiniu tirpalu (A) ir tirpalu su oligomicinu
(2×10-5 M) ir FCCP (10-7 M) (B) metu. Paveikslo C dalyje pateikti vidurkinti susitraukimo jėgos
itimo duomenys, dirginant raumenėlį skirtingaisk
k
ė).
0,5 Hz1,0 Hz
pav. Oligomicino ir FCCP įtaka žmogaus miokardo susitraukimo jėgos kitimui priklausomai nuo dirginimo dažnio. A. Eksperimentiniai susitraukimo kreivių užrašai, dirginant raumenėlį įvairiais dažniais perfuzijos fiziologiniu tirpalu metu. B. Eksperimentiniai susitraukimo kreivių užrašai, dirginant raumenėlį įvairiais dažniais, veikiant 2×10-5 M oligomicino su 10-7 M FCCP. C. Susitraukimo jėgos kitimas priklausomai nuo dirginimo dažnio perfuzijos fiziologiniu tirpalu metu (1 kreivė), veikiant tik 10-7 M FCCP (2 kreivė) ir kartu su 2×10-5 M oligomicino (3 kreivė). Abscisių ašyje – dirginimo dažnis (Hz), ordinačių – susitraukimo jėga, apskaičiuota procentais, palyginus su kontrole (1, 2 kreivės) ir su oligomicino poveikiu (3 kreivė). ∗ p<0,05; ∗∗ p<0,001.
1,5 Hz2,0 Hz2,5 Hz3,0 Hz
100 ms
0,5
mN
A
0,2 Hz
0,2 Hz0,5 Hz1,0 Hz1,5 Hz2,0 Hz2,5 Hz3,0 Hz
100 ms
0,5
mN
B
00 0,5 1 1,5
20
40
60
80
120
2 2,5 3 1
Dažnis (Hz)
Susi
trau
kim
o jė
garo
c.)
100(p
140 *C
**
**
**
* ** * 3
* * ***
0,5 Hz1,0 Hz
***
1
**
****
**
*2
1,5 Hz2,0 Hz2,5 Hz3,0 Hz
100 ms
0,5
mN
A
0,2 Hz
0,2 Hz0,5 Hz1,0 Hz1,5 Hz2,0 Hz2,5 Hz3,0 Hz
100 ms
0,5
mN
B0,5 Hz1,0 Hz1,5 Hz2,0 Hz2,5 Hz3,0 Hz
100 ms
0,5
mN
A
0,2 Hz0,5 Hz1,0 Hz1,5 Hz2,0 Hz2,5 Hz3,0 Hz
A
100 ms
0,5
mN
100 ms100 ms
0,5
mN
A
0,2 Hz
0,2 Hz0,5 Hz1,0 Hz1,5 Hz2,0 Hz2,5 Hz3,0 Hz0,
5 m
N
B
0,2 Hz0,5 Hz1,0 Hz1,5 Hz2,0 Hz2,5 Hz3,0 Hz
100 ms100 ms
0,5
mN
B
0,5
mN
100 ms100 ms
B
00 0,5 1 1,5
20
40
60
80
120
2 2,5 3 1
Dažnis (Hz)
Susi
trau
kim
o jė
garo
c.)
100(p
140 *C
**
**
**
* ** * 3
* * ***
***
1
**
****
**
*2
00 0,5 1 1,5
20
40
60
80
120
2 2,5 3 1
Dažnis (Hz)
Susi
trau
kim
o jė
garo
c.)
100(p
140 *140
**
**
**
* ** * 3
* * ***
***
1
**
****
**
*2
00 0,5 1 1,5
20
40
60
80
120
2 2,5 3 1
Dažnis (Hz)
Susi
trau
kim
o jė
garo
c.)
100(p
00 0,5 1 1,5
20
40
60
80
120
2 2,5 3 1
Dažnis (Hz)
Susi
trau
kim
o jė
garo
c.)
100(p
140 *C
**
**
**
* ** * 3
* * ***
1
****
***
****
*2
88
Veikiant 2×10-5 M oligomicino, susitraukimo jėga sumažėjo iki 84,35±9,6 proc. (n=3),
atsipalaidavimo laikas ir VP50 nepakito ir atitinkamai buvo 101,34±3,61 proc. (n=3), 97,09±9,23
proc. (n=3), palyginus su kontrole.
Esant 1,0 Hz dirginimo dažniui ir veikiant 2×10-5 M oligomicino su 10-7 M FCCP, žmogaus
miokardo susitraukimo jėga sumažėjo iki 82,25±2,25 proc. (n=3) (p<0,05), palyginus su
oligomicino poveikiu. Esant tirpale oligomicino (2×10-5 M) ir FCCP (10-7 M) ir didinant dirginimo
dažnį nuo 0,2 Hz iki 2 Hz, P mažėjo, tačiau buvo didesnė nei veikiant tik FCCP. Susitraukimo jėgos
kitimas, dirginant raumenėlius dideliais dažniais (2,5 Hz ir 3 Hz) buvo panašus kaip ir veikiant tik
FCCP: dirginant raumenėlius 3 Hz dažniu, P sumažėjo iki 21,78±5,82 proc. (n=3) (p<0,05),
palyginus su oligomicino poveikiu.
5.27 pav. parodytas žmogaus miokardo atsipalaidavimo laiko kitimas priklausomai nuo
dirginimo dažnio perfuzijos fiziologiniu tirpalu metu (1 kreivė) ir veikiant oligomicinui su FCCP (3
kreivė). Palyginimui pateiktas raumens atsipalaidavimo laiko kitimas veikiant tik FCCP (2 kreivė).
Perfuzuojant raumenėlius fiziologiniu tirpalu su oligomicinu (2×10-5 M) ir FCCP (10-7 M), ir
didinant dirginimo dažnį nuo 0,2 Hz iki 3 Hz, atsipalaidavimo laikas taip pat mažėjo, tačiau buvo
nežymiai didesnis visame dažnių diapazone negu perfuzuojant tirpalu tik su FCCP, t.y. raumenėlių
atsipalaidavimas pagreitėjo. Didinant f iki 3 Hz, t50 sumažėjo iki 56,72±5,28 proc. (n=3) (p<0,05),
palyginus su oligomicino poveikiu.
10 M oligomicino (3 kreivė). Abscisių ašyje – dirginimo dažnis (Hz), rdinačių – atsipalaidavimo laikas, apskaičiuotas procentais, palyginus su kontrole (1, 2 kreivės) ir su oligomicino oveikiu (3 kreivė). ∗ p<0,05; ∗∗ p<0,001.
5.27 pav. Oligomicino ir FCCP įtaka žmogaus miokardo atsipalaidavimo laiko kitimui priklausomai nuo dirginimo dažnio. Atsipalaidavimo laiko kitimas priklausomai nuo dirginimo dažnio, perfuzuojant fiziologiniu tirpalu (1 kreivė), veikiant tik 10-7 M FCCP (2 kreivė) ir kartu su 2× -5
op
00 0,5 1
20
40
60
80
100
120
1,5 2 2,5 3 1
Ats
ipal
aida
vim
o la
ikas
(pro
c.)
12
3
** *
*
**
**
**
*
Dažnis (Hz)
00 0,5 1
20
40
60
80
100
120
1,5 2 2,5 3 1
Ats
ipal
aida
vim
o la
ikas
(pro
c.)
12
3
** *
*
**
**
**
*
Dažnis (Hz)
89
2 Hz iki 3 Hz, mažėjo panašiu laipsniu, kaip ir perfuzijos
fiziol
o grandinės III komplekso slopinimo
a
FCCP poveikį elektromechaniniam aktyvumui. Kadangi
miokardo susitraukimo jėga yra reguliuojama Ca2+ jonų srovės per L–tipo Ca2+ kanalus, tikslinga
buvo ištirti ICaL kitimą, veikiant minėtiems energetinio metabolizmo slopikliams F1F0–ATPazės
aktyvumo slopinimo oligomicinu metu. Šioje eksperimentų grupėje buvo tirta 10-5 M antimicino A
ir 3×10-7 M FCCP įtaka izoliuotų žmogaus prieširdžio ląstelių izoproterenoliu (10-6 M) stimuliuotai
L–tipo Ca2+ srovei, esant išoriniame tirpale 3×10-5 M oligomicino. ICaL kitimas veikiant antimicino
A ar FCCP buvo vertinamas oligomicino poveikio atžvilgiu.
5.28 pav. pateiktas eksperimento metu registruotas žmogaus prieširdžio ląstelės ICaL kitimas,
veikiant izoproterenoliui (10-6 M), FCCP (3×10-7 M), oligomicinui (3×10-5 M) ir oligomicinui
(3×10-5 M) kartu su FCCP (3×10-7 M) ar antimicinu A (10-5 M). Šiame eksperimente akivaizdus
oligomicino apsauginis poveikis izoproterenoliu stimuliuotai ICaL metabolinio slopinimo metu:
veikiant tik FCCP (3×10-7 M), ICaL sumažėjo, o pašalinus FCCP iš išorinio fiziologinio tirpalo, ICaL
dalinai atsistatė. Toliau sekanti perfuzija fiziologiniu tirpalu su oligomicinu (3×10-5 M) sumažino
, tačiau, įdėjus FCCP (3×10-7 M) ar antimicino A (3×10-5 M) į tirpalą su oligomicinu, ICaL išliko
buvo 94,88±11,39 proc, o veikiant FCCP (3×10-7 M) –
Veikimo potencialų trukmė VP50, veikiant oligomicinui (2×10-5 M) ir FCCP (10-7 M), ir
didėjant dirginimo dažniui nuo 0,
oginiu tirpalu su FCCP, ar tik fiziologiniu tirpalu, t.y. oligomicinas ir FCCP neturėjo įtakos
VP50 priklausomybės nuo dirginimo dažnio pobūdžiui.
5.4.3. Oligomicino įtaka žmogaus širdies ląstelių L–tipo
Ca2+ srovei kvėpavim
ntimicinu A ir oksidacinio fosforilinimo atskyrimo FCCP
metu
Eksperimentuose su žmogaus miokardo preparatais nustatėme, kad F1F0–ATPazės aktyvumo
slopinimas oligomicinu sumažino kvėpavimo grandinės III komplekso slopiklio antimicino A bei
oksidacinio fosforilinimo skyriklio
ICaL
nepakitusi. Vidurkintais 3 eksperimentų duomenimis, F1F0–ATPazės slopinimo oligomicinu metu
veikiant antimicinui A (10-5 M), ICaL
92,56±12,73 proc. (n=3), palyginus su oligomicino poveikiu.
90
r
ik
ių
5.28 pav. FCCP, oligomicino ir antimicino A įtaka žmogaus širdies ląstelių izoproterenoliu stimuliuotai L–tipo Ca2+ srovei.
Rezultatų aptarimas
Mūsų tyrimai parodė, kad F1F0–ATPazės slopiklis oligomicinas sulėtino ir sumažino žiurkės
bei žmogaus miokardo susitraukimo jėgos ir veikimo potencialų trukmės mažėjimą, slopinant
kvėpavimo grandinės III ar IV (žiurkės miokardo) kvėpavimo grandinės kompleksų aktyvumus
atitinkamai antimicinu A ir anoksija ar atskiriant oksidacinį fosfo ilinimą su FCCP. Oligomicinas
panaikino slopinantį FCCP pove į žiurkės miokardo bei FCCP ir antimicino A poveikį žmogaus
izoliuotų miokardo ląstelių L–tipo Ca2+srovei. Oligomicinas taip pat sulėtino antimicino A ir
anoksijos sukeltą žiurkės miokardo kontraktūros vystymąsi. Veikiant oligomicinui su oksidacinio
fosforilinimo skyrikliu FCCP, žiurkės ir žmogaus jėgos–dažnio priklausomybės pobūdis nors ir
išliko neigiamas, tačiau didelių dažn diapazone susitraukimo jėga buvo didesnė negu veikiant tik
FCCP.
1,8
FCCP 3×10-7M Izoproterenolis 10-6 M
MAntimicinas A 10-5MOligomicinas 3×10-5M
1,6
1,4
1,2
0,6
0,4
0,2
Ca2+
srovė
(nA
)
1,0
0,8
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
FCCP 3×10-71,8
FCCP 3×10-7M Izoproterenolis 10-6 M
MAntimicinas A 10-5MOligomicinas 3×10-5M
FCCP 3×10-7
1,6
1,4
1,2
0,6
0,4
0,2
Ca2+
srovė
(nA
)
1,0
0,8
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 550 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
Laikas (min.)Laikas (min.)
91
Kaip buvo minėta 3.2 skyriuje, mitochondrijų oksidacinio fosforilinimo F1F0-ATP sintazė,
umažėju mitochondrijų membraniniui potencialui (širdies išemijos ir nepakankamumo metu),
atalizuoja grįžtamą ATP virtimo į ADP bei neorganinį fosfatą reakciją ir pradeda veikti kaip ATP
artotojas, t.y. tampa F1F0–ATPaze. Šiomis sąlygomis, ir taip trūkstant ląstelėse ATP,
mitochondrijos tampa pagrindiniu ATP vartotoju, dėl to ATP kiekis dar labiau sumažėja. Tai
patvirtino ir eksperimentiniai tyrimai, kurie parodė, kad 35–50 proc. viso ATP kiekio išemijos metu
buvo suvartota būtent šios F1F0–ATPazės [Jennings ir kt., 1991; Duchen, 1999].
Todėl sąlygomis, kai slopinamas kvėpavimo grandinės kompleksų aktyvumas ar atskiriamas
oksidacinis fosforilinimas ir miokardo ląstelėse sutrinka ATP sintezė bei sumažėja jo kiekis, vienu
iš galimų miokardo elektromechaninio aktyvumo pažeidimo sumažinimo būdų gali būti F1F0–
ATPazės slopiklių panaudojimas.
Mūsų gautus rezultatus patvirtina ir kitų autorių eksperimentiniai tyrimai, kuriuose
mitochondijų F1F0–ATPazės slopikliai oligomicinas ir aurovertinas sulėtina ATP koncentracijos
mažėjimą šuns ir žiurkės išeminiame miokarde ir prailgina laiką iki kontraktūros vystymosi
pradžios [Jennings ir kt., 1991; Vuorinen ir kt., 1995; Green ir kt., 1998]. Autoriai F1F0–ATPazės
slopinimą deguonies nepakankamumo sąlygomis priskiria prie galimų ATP išsaugojimo
mechanizmų. Svarbu paminėti, kad oligomicinas nėra specifinis F1F0–ATPazės slopiklis, nes gali
blokuoti tiek sintazinį, tiek hidrolazinį fermento aktyvumą [Jennings ir kt., 1991; Grover ir kt.,
oligomicinui. Grover ir kt. patvirtino, kad išemijos metu ne tik oligomicinas ir aurovertinas, bet ir
specifinis slopiklis BMS-199264, kuris selektyviai blokuoja tik F1F0–ATPazės hidrolazinį
aktyvumą ir silpnai veikia arba visa aktyvumui, žymiai padidino
TP koncentraciją žiurkės išeminės širdies kardiomiocituose ir kontraktilinę funkciją [Grover ir kt.
2004
s nepilnai slopina ATP hidrolizę, todėl papildomas F1F0–ATPazės hidrolazinio aktyvumo
slopinimas, gali sulėtinti ir sumažinti miokardo elektromechaninio aktyvumo parametrų kitimą
s
k
v
2004]. Tai paaiškina mūsų eksperimentų metu registruotą žiurkės papiliarinių raumenėlių ir
žmogaus skilvelio susitraukimo jėgos ir veikimo potencialų trukmės nedidelį sumažėjimą, veikiant
i neturi įtakos sintaziniui fermento
A
].
Mitochondrijų matrikse aptinkamas baltymas (IF1), kuris selektyviai slopina F1F0–ATP
sintazės hidrolazinį aktyvumą. Tačiau gyvūnų širdyse, kurioms būdingas greitas susitraukimas, pvz.
žiurkės, šio baltymo yra labai nedaug [Rouslin, Broge, 1990; Takeo, Nasa, 1999; Ylitalo ir kt.,
2001; Green, Grover, 2000; Grover ir kt., 2004]. Tuo tarpu žmogaus, kaip ir didesnių gyvūnų
širdyse, ekspresuojama palyginti didelis IF1 baltymo kiekis [Jennings ir kt., 1991; Rouslin ir kt.,
1995; Ylitalo ir kt., 2001]. Mitochondrijų protonų gradiento ar ląstelių pH mažėjimas iki 6.7, t.y.
sąlygos pasireiškiančios išemijos metu, sukelia IF1 baltymo grįžtamą jungimąsi prie F1F0–ATPazės
ir fermento hidrolazinio aktyvumo slopinimą [Lippe ir kt., 1996]. Tačiau nustatyta, kad IF1
baltyma
92
energ
vumui
s nepakankamumui, nustatyta, kad piruvatas, natūralus alifatinis
karbo
kimo jėgos ir deguonies poreikio padidėjimo bei energetinių resursų sumažėjimo [Ko ir kt.,
1993
etinio metabolizmo slopinimo metu [Green, Grover, 2000; Grover ir kt., 2004]. Tai patvirtina
ir mūsų minėti eksperimentinių tyrimų rezultatai, kuriuose oksidacinio fosforilinimo slopinimo
sąlygomis F1F0–ATPazės aktyvumas buvo slopinamas oligomicinu.
5.5. Energetinio metabolizmo substrato piruvato ir β–adrenoreceptorių agonisto
izoproterenolio įtaka miokardo elektromechaniniam akty
Vykdant intensyvią paiešką būdų, pagerinančių miokardo energetinį metabolizmą bei
susitraukimo funkciją, esant širdie
ksilatas ir pagrindinis metabolinis tarpininkas žinduolių ląstelėse, didina ATP kiekį miokardo
ląstelėse, fosforilinimo potencialą ir miokardo susitraukimą [Hermann ir kt., 1999; Mallet, 2000;
Hermann ir kt., 2002]. Tačiau šio metabolizmo substrato įtaka miokardo elektromechaninio
aktyvumo parametrams, o ypač žmonių, sergančių širdies nepakankamumu, nėra pakankamai ištirta.
Taip pat nenustatytas piruvato poveikis šių parametrų priklausomybėms nuo dirginimo dažnio,
kurių kitimo pobūdis leidžia spręsti apie širdies ląstelių energetinę būseną (energetinius rezervus) ir
apie sistemų, tiesiogiai ar netiesiogiai (per baltymų fosforilinimą) priklausančių nuo ATP ir
reguliuojančių susitraukimo–atsipalaidavimo procesą, funkcionavimą, o taip pat apie miokardo
pajėgumą, kintant fiziniam krūviui.
Klinikinėje praktikoje širdies susitraukimo funkcijos atstatymui ūmaus nepakankamumo
metu, o taip pat pooperaciniam širdies veiklos po širdies operacijų ar koronarų revaskuliarizacijos
atstatymui yra naudojami β–adrenoreceptorių agonistai [Becker ir kt., 1986; Majerus ir kt., 1989].
Tačiau β–adrenerginė stimuliacija katecholaminais sukuria disproporciją tarp miokardo
susitrau
; Zhou ir kt., 1995]. Tai, savo ruožtu, dar labiau padidina energijos trūkumą ir miokardo
pažeidimą tuo metu, kai energetiniai rezervai, esant širdies nepakankamumui, yra ir taip sumažėję
[Majerus ir kt., 1989; Mallet, 2000]. Todėl buvo tikslinga ištirti, kokį poveikį gali turėti piruvato,
kaip energetinio metabolizmo substrato, papildymas izoproterenoliu stimuliuoto žmogaus miokardo
susitraukimo jėgai, atsipalaidavimo laikui, veikimo potencialų trukmei ir jų priklausomybėms nuo
dirginimo dažnio.
Šioje grupėje eksperimentų tyrėme metabolizmo substrato piruvato, β–adrenoreceptorių
agonisto izoproterenolio bei piruvato kartu su izoproterenoliu poveikį žiurkės ir žmonių, sergančių
širdies nepakankamumu, miokardo elektromechaninio aktyvumo parametrams bei jų
priklausomybei nuo dirginimo dažnio.
93
5.5.1. Piruvato įtaka žiurkės miokardo
Šioje grupėje eksperimentų, perfuzuojant žiurkės papiliarinius raumenėlius fiziologiniu tirpalu
ontrolė), susitraukimo jėga buvo 1,49±0,49 mN, pusinis atsipalaidavimo laikas – 48,95±3,68 ms,
VP50
elektromechaniniam aktyvumui
(k
– 20,75±3,95 ms (n=4).
5.29 pav. pateiktos eksperimento metu registruotos žiurkės papiliarinio raumenėlio
susitraukimo (A) ir veikimo potencialų kreivės (B), veikiant piruvatui (10 mM). Po 20 min.
perfuzijos tirpalu su 10 mM piruvato, susitraukimo jėga padidėjo iki 160,23±10,75 proc. (n=4)
(p<0,05), atsipalaidavimo laikas – iki 116,52±4,76 proc. (n=4) (p<0,05), VP50 – iki 107,42±5,40
proc. (n=4), palyginus su kontrole.
5.29 pav. Eksperimentiniai žiurkės papiliarinio raumenėlio susitraukimo (A) ir veikimo potencial (B) kreivių užrašai, veikiant 10 mM piruvato.
5.30 pav. pateiktos eksperimento metu registruotos žiurkės širdies susitraukimo jėgos kreivės,
keičiant dirginimo dažnius ir perfuzuojant raumenėlius tik fiziologiniu tirpalu (A) ir su piruvatu (B).
ų
0,2 Hz0,5 Hz1,0 Hz1,5 Hz2,0 Hz2,5 Hz3,0 Hz
100 ms
1m
N
A 0,2 Hz0,5 Hz1,0 Hz1,5 Hz2,0 Hz2,5 Hz3,0 Hz
100 ms
1m
N
B0,2 Hz0,5 Hz1,0 Hz1,5 Hz2,0 Hz2,5 Hz3,0 Hz
100 ms
1m
N
A 0,2 Hz0,5 Hz1,0 Hz1,5 Hz2,0 Hz2,5 Hz3,0 Hz
100 ms
1m
N
A
100 ms
1m
N
100 ms100 ms
1m
N1
mN
A 0,2 Hz0,5 Hz1,0 Hz1,5 Hz2,0 Hz2,5 Hz3,0 Hz
100 ms
1m
N
B 0,2 Hz0,5 Hz1,0 Hz1,5 Hz2,0 Hz2,5 Hz3,0 Hz
100 ms
1m
N
B
100 ms
1m
N
100 ms100 ms
1m
N1
mN
B
kontrolė
100 ms
1 m
N
A
piruvatas (10 mM)
B
100 ms
50 m
V
piruvatas (10 mM)kontrolėkontrolė
100 ms
1 m
N
A
piruvatas (10 mM)kontrolė
100 ms100 ms
1 m
N1
mN
A
piruvatas (10 mM)
B
100 ms
50 m
V
piruvatas (10 mM)kontrolė
B
100 ms
50 m
V
B
100 ms
50 m
V
piruvatas (10 mM)kontrolė
94
5.30 pav. Eksperimentiniai žiurkės papiliarinio raumenėlio susitraukimo kreivių užrašai, irginant raumenėlį įvairiais dažniais perfuzijos fiziologiniu tirpalu metu (A) ir veikiant 10 M piruvato (B).
Veikiant 10 mM kitimo pobūdis
buvo panašus kaip ir perfuzijos fiziologiniu tirpalu m ė), tačiau esant tirpale
piruvatui, P buvo žym (5.31 pav. 2 kreivė).
adidėjus dirginimo dažniui iki 3 Hz, susitraukimo jėga buvo 87,63±7,07 proc. (n=4), tuo tarpu
nesan
5.31 pav. Piruvato įtaka žiurkės papiliarinių raumenėlių susitraukimo jėgos kitimui priklausomai nuo dirginimo dažnio.
kreivė) metu. Piruvatas (10 mM) padidino t50 iki 116,52±4,76 proc. (n=4) (p<0,05), palyginus su
kontrole. Didinant dirginimo dažnį iki 3 Hz, žiurkės miokardo t50 nežymiai mažėjo, tačiau išliko
didesnis (104,82±1,17 proc. (n=4) (p<0,05), palyginus su kontrole) palyginus su raumens
atsipalaidavimo laiku perfuzuojant tik fiziologiniu tirpalu (89,97±1,61 proc. (n=4) (p<0,05)).
Grąžinus 1,5 Hz dirginimo dažnį, t50 padidėjo iki 116,12±1,08 proc. (n=4) (p<0,001), palyginus su
kontrole.
dm
piruvato ir didinant dirginimo dažnį nuo 0,2 Hz iki 3 Hz , P
etu (5.31 pav. 1 kreiv
iai didesnė visame dirginimo dažnių diapazone
P
t fiziologiniame tirpale piruvato – 67,17±2,81 proc. (n=4) (p<0,001), palyginus su kontrole.
0
50
100
150
200
250
300
350
mo
jėga
(pro
c.)
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 1,5
Dažnis (Hz)
Susi
trau
ki
1
2
**
**
*
*
*
** ** ** **
**
**
0
50
100
150
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 1,5
Dažnis (Hz)
Susi
trau
ki
1
2
200
250
300
350
mo
jėga
(pro
c.)
**
**
*
*
*
** ** ** **
**
**
Susitraukimo jėgos kitimas priklausomai nuo dirginimo dažnio, perfuzuojant fiziologiniu tirpalu (1 kreivė) ir veikiant 10 mM piruvato (2 kreivė). Abscisių ašyje – dirginimo dažnis (Hz), ordinačių – susitraukimo jėga, apskaičiuota procentais, palyginus su kontrole. ∗ p<0,05; ∗∗ p<0,001.
5.32 pav. pateiktas žiurkės miokardo atsipalaidavimo laiko kitimas dirginant raumenėlius
(1 kreivė) ir fiziologiniu tirpalu su piruvatu (2 skirtingais dažniais perfuzijos fiziologiniu tirpalu
95
atsipalaidavimo laiko kitimui
Atsipalaidavim ologiniu tirpalu (1 kreivė) ir veikiant – atsipalaidavimo laikas, apskaičiuot
enėlius 1,5 Hz
dažniu, nežym ėjant dirginimo
kontrole.
elektromechaniniam aktyvumui
ipalaidavimo laikas – 176,08±15,21 ms, VP50 – 256,63±56,41 ms (n=31).
600 0,5 1 1,5 2 2,5 3 1,5
Dažnis (Hz)
At
oc.)
140
5.32 pav. Piruvato įtaka žiurkės papiliarinių raumenėliųpriklausomai nuo dirginimo dažnio.
o laiko kitimas priklausomai nuo dirginimo dažnio, perfuzuojant fizi 10 mM piruvato (2 kreivė). Abscisių ašyje – dirginimo dažnis (Hz), ordinačių
as procentais, palyginus su kontrole. ∗ p<0,05; ∗∗ p<0,001.
Veikimo potencialų trukmė VP50, veikiant piruvatui bei dirginant raum
iai padidėjo iki 107,42±5,40 proc. (n=4), palyginus su kontrole. Did
dažniui iki 3 Hz, VP50 nežymiai mažėjo ir, esant 3 Hz, buvo 89,05±7,76 proc. (n=4), palyginus su
5.5.2. Piruvato ir izoproterenolio įtaka žmogaus miokardo
Šioje eksperimentų grupėje miokardo preparatai buvo paimti iš ligonių, sergančių III ir IV
NYHA funkcinės klasės širdies nepakankamumu. 21 iš tirtųjų buvo vyrai, kurių amžiaus vidurkis
57,2±3,5 metų, ir 10 – moterys, jų amžiaus vidurkis – 62,5±1,7 metų. Sergančiųjų kairiojo skilvelio
išstūmimo frakcija buvo 39,86±3,14 proc. (n=31). Kontrolėje, t.y. perfuzuojant raumens preparatus
fiziologiniu tirpalu ir dirginant 1,0 Hz dažniu, miokardo susitraukimo jėga buvo 0,9±0,21 mN,
pusinis ats
80
100
120si
pala
idav
imo
laik
as(p
r
1
2* * *
**
* * ** ** ** **
****
**
600 0,5 1 1,5 2 2,5 3 1,5
Dažnis (Hz)
At
oc.)
140
1
2* * *
**
* * ** ** ** **
****
**
80
100
120si
pala
idav
imo
laik
as(p
r
96
5.33 pav. parodytos eksperimento metu registruotos žmogaus miokardo preparatų
susitraukimo jėgos (A) ir veikimo potencialų (B) kreivės, veikiant piruvatui. Piruvatas (10 mM)
padidino žmogaus miokardo susitraukimo jėgą iki 171,32±13,10 proc. (n=12) (p<0,001), nekeitė
atsipalaidavimo laiko – 99,32±3,09 proc. (n=12), ir nežymiai padidino veikimo potencialų trukmę
(VP50) – iki 111,33±7,46 proc. (n=5) (p<0,05), palyginus su kontrole.
vės, dirginant raumenėlį skirtingais dažniais perfuzijos fiziologiniu tirpalu metu (A, a ir
B, b), fiziologiniu tirpalu su piruvatu (A, a’), su piruvatu ir izoproterenoliu (B, b’). Paveikslo C
dalyje pateikti vidurkinti susitraukimo jėgos kitimo duomenys.
piruvatas (10 mM)
A
kontrolė
100 ms
0,5
mN
Bkontrolėpiruvatas (10 mM)
50 m
V
100 ms
piruvatas (10 mM)
A
kontrolė
100 ms
0,5
mN
piruvatas (10 mM)
A
kontrolė
100 ms
0,5
mN
A
kontrolė
100 ms
0,5
mN
Bkontrolėpiruvatas (10 mM)
50 m
V
100 ms
Bkontrolėpiruvatas (10 mM)
50 m
V
100 ms
5.33 pav. Eksperimentiniai žmogaus miokardo susitraukimo jėgos (A) ir veikimo potencialų (B) užrašai, veikiant 10 mM piruvato.
5.34 pav. pateiktos eksperimento metu registruotos žmogaus miokardo preparatų susitraukimo
jėgos krei
97
5.34 pav. Piruvato ir izoproterenolio įtaka žmogaus miokardo susitraukimo jėgos kitimui riklausomai nuo dirginimo dažnio. Eksperimentiniai susitraukimo kreivių užrašai, dirginant raumenėlį įvairiais dažniais perfuzijos fiziologiniu tirpalu etu (a) ir veikiant 10 mM piruvato (a’).
B. Eksperimentiniai susitraukimo kreivių užrašai, dirginant raumenėlį įvairiais dažniais perfuzijos fiziologiniu tirpalu metu (b) ir veikiant 10 mM piruvato su 10-5 M izoptroterenolio (b’). C. Susitraukimo jėgos kitimas priklausomai nuo dirginimo dažnio perfuzijos fiziologiniu tirpalu metu (1 kreivė), veikiant 10 mM piruvato (2 kreivė), 10-5 M izoproterenolio (3 kreivė) ir 10 mM piruvato su 10-5 M izoproterenolio (4 kreivė). Abscisių ašyje – dirginimo dažnis (Hz), ordinačių – susitraukimo jėga, apskaičiuota procentais, palyginus su kontrole. ∗ p<0,05; ∗∗ p<0,001.
. Piruvato ir izoproterenolio įtaka žmogaus miokardo susitraukimo jėgos kitimui riklausomai nuo dirginimo dažnio. Eksperimentiniai susitraukimo kreivių užrašai, dirginant raumenėlį įvairiais dažniais perfuzijos fiziologiniu tirpalu etu (a) ir veikiant 10 mM piruvato (a’).
B. Eksperimentiniai susitraukimo kreivių užrašai, dirginant raumenėlį įvairiais dažniais perfuzijos fiziologiniu tirpalu metu (b) ir veikiant 10 mM piruvato su 10-5 M izoptroterenolio (b’). C. Susitraukimo jėgos kitimas priklausomai nuo dirginimo dažnio perfuzijos fiziologiniu tirpalu metu (1 kreivė), veikiant 10 mM piruvato (2 kreivė), 10-5 M izoproterenolio (3 kreivė) ir 10 mM piruvato su 10-5 M izoproterenolio (4 kreivė). Abscisių ašyje – dirginimo dažnis (Hz), ordinačių – susitraukimo jėga, apskaičiuota procentais, palyginus su kontrole. ∗ p<0,05; ∗∗ p<0,001.
0,5 Hz1,0 Hz1,5 Hz2,0 Hz2,5 Hz3,0 Hz
ppA.mA.m
0,5 Hz1,0 Hz1,5 Hz2,0 Hz2,5 Hz3,0 Hz
0,2 Hz
100 ms
0,5
mN
Bb
0,5 Hz1,0 Hz1,5 Hz2,0 Hz2,5 Hz3,0 Hz
0,2 Hz 1,0 Hz1,5 Hz2,0 Hz2,5 Hz3,0 Hz
0,5 Hz
100 ms
0,5
mN
100 ms
0,5
mN
a a’A 0,2 Hz
0
50
100
0 0,5 1 1,5 2 2,5
Susi
t 150
200
250
300
450
3 1
Dažnis (Hz)
rauk
imo
jėga
(pro 350
400
c.)
12* *
****
** **
*
** ****
3
4
*
**
*****
** ***
C
0,5 Hz1,0 Hz1,5 Hz2,0 Hz2,5 Hz3,0 Hz
0,2 Hz
100 ms
0,5
mN
b’
0,5 Hz1,0 Hz1,5 Hz2,0 Hz2,5 Hz3,0 Hz
0,2 Hz
100 ms
0,5
mN
Bb
0,5 Hz1,0 Hz1,5 Hz2,0 Hz2,5 Hz3,0 Hz
0,2 Hz
100 ms
0,5
mN
100 ms
0,5
mN
Bb
**
0,5 Hz1,0 Hz1,5 Hz2,0 Hz2,5 Hz3,0 Hz
0,2 Hz 1,0 Hz1,5 Hz2,0 Hz2,5 Hz3,0 Hz
0,5 Hz
100 ms
0,5
mN
100 ms
0,5
mN
a a’A 0,2 Hz
0
50
100
0 0,5 1 1,5 2 2,5
Susi
t 150
200
250
300
450
3 1
Dažnis (Hz)
rauk
imo
jėga
(pro 350
400
c.)
12* *
****
** **
*
** ****
3
4
*
**
*****
** ***
C
0,5 Hz1,0 Hz1,5 Hz2,0 Hz2,5 Hz3,0 Hz
0,2 Hz
100 ms
0,5
mN
b’
0,5 Hz1,0 Hz1,5 Hz2,0 Hz2,5 Hz3,0 Hz
0,2 Hz 1,0 Hz1,5 Hz2,0 Hz2,5 Hz3,0 Hz
0,5 Hz
100 ms
A 0,2 Hz
**
100 ms
0,5
mN
0,5
mN
a a’0,5 Hz1,0 Hz1,5 Hz2,0 Hz2,5 Hz3,0 Hz
0,2 Hz 1,0 Hz1,5 Hz2,0 Hz2,5 Hz3,0 Hz
0,5 Hz
100 ms100 ms
0,5
mN
100 ms100 ms
0,5
mN
0,5
mN
0,5
mN
100 ms100 ms
A 0,2 Hz
0,5
mN
0,5
mN
a a’
0
50
100
0 0,5 1 1,5 2 2,5
Susi
t 150
200
250
300
450
3 1
Dažnis (Hz)
rauk
imo
jėga
(pro 350
400
c.)
12* *
****
** **
*
** ****
3
4
*
**
*****
** ***
C
**
0
50
100
0 0,5 1 1,5 2 2,5
Susi
t 150
200
250
300
450
3 1
Dažnis (Hz)
rauk
imo
jėga
(pro 350
400
c.)
12* *
****
** **
*
** ****
3
4
*
**
*****
** ***
C
0,5 Hz1,0 Hz1,5 Hz2,0 Hz2,5 Hz3,0 Hz
0,2 Hz
100 ms
0,5
mN
b’ 0,5 Hz1,0 Hz1,5 Hz2,0 Hz2,5 Hz3,0 Hz
0,2 Hz
100 ms
0,5
mN
100 ms
0,5
mN
b’
**
98
Miokardo susitraukimo jėgos (5.34 pav., 1 kreivė), atsipalaidavimo laiko (5.35 pav., 1
kreivė) ir veikimo potencialų trukmės priklausomybės nuo dirginimo dažnio buvo neigiamos, t.y.
didėjant dirginimo dažniui nuo 0,2 Hz iki 3 Hz, šie parametrai mažėjo. Padidėjus f iki 3 Hz, P
sumažėjo iki 33,42±4,28 proc. (n=12) (p<0,001), t50 – iki 55,43±2,60 proc. (n=12) (p<0,001), VP50
– iki 44,40±5,03 proc. (n=6) (p<0,001), palyginus su kontrole.
Veikiant piruvatui (10 mM), žmogaus miokardo susitraukimo jėgos–dažnio priklausomybės
pobūdis nepakito, t.y. išliko neigiamas, tačiau susitraukimo jėga buvo didesnė visame dirginimo
dažnių diapazone, lyginant su susitraukimo jėgos kitimu perfuzijos fiziologiniu tirpalu metu (5.34
pav., 2 kreivė). Padidinus dirginimo dažnį iki 3 Hz, P sumažėjo iki 42,98±5,49 proc. (n=12)
(p<0,001). Grąžinus pradinį 1 Hz dažnį, susitraukimo jėga atsistatė iki 149,12±12,13 proc (n=12)
(p<0,001), palyginus su kontrole.
5.35 pav. parodytas žmogaus miokardo atsipalaidavimo laiko kitimas priklausomai nuo
dirginimo dažnio perfuzijos fiziologiniu tirpalu metu (1 kreivė), veikiant tik piruvatui (10 mM) (2
kreivė), izoproterenoliui (10-5 M) (3 kreivė ) ir piruvatui su izoproterenoliu (4 kreivė).
-5
perfuzijos fiziologiniu tirpalu be piruvato metu. Padidinus f iki 3 Hz, t50 sumažėjo iki 62,67±5,15
0
20
40
60
80
100
120
140
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 1
Dažnis (Hz)
Ats
ipal
aida
vim
o la
ikas
(pro
c.)
12
34
** ****
** ** ** **
**
**
** **
** **** **
** ****
*** *
* * * *
*
0
20
40
60
80
100
120
140
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 1
Dažnis (Hz)
Ats
ipal
aida
vim
o la
ikas
(pro
c.)
12
34
** ****
** ** ** **
**
**
** **
** **** **
** ****
*** *
* * * *
*
5.35 pav. Piruvato ir izoproterenolio įtaka žmogaus miokardo atsipalaidavimo laiko kitimui priklausomai nuo dirginimo dažnio. Atsipalaidavimo laiko kitimas priklausomai nuo dirginimo dažnio, perfuzuojant fiziologiniu tirpalu (1 kreivė), veikiant 10 mM piruvato (2 kreivė), 10-5 M izoproterenolio (3 kreivė) ir 10 mM piruvato su 10 M izoproterenolio (4 kreivė). Abscisių ašyje – dirginimo dažnis (Hz), ordinačių – atsipalaidavimo laikas, apskaičiuotas procentais, palyginus su kontrole. ∗ p<0,05; ∗∗ p<0,001.
Didinant dirginimo dažnį ir veikiant piruvatui (10 mM), t50 kitimas buvo panašus kaip ir
99
proc.
ncialų trukmė VP50 mažėjo panašiu
laipsn
5.36 pav. Eksperimentiniai žmogaus miokardo veikimo potencialų užrašai, dirginant raumenėlį įvairiais dažniais perfuzijos fiziologiniu tirpalu metu (A) ir veikiant 10 mM piruvato (B).
Kaip buvo minėta, esant širdies nepakankamumui, pakinta ne tik ATP sintezė, bet ir β–
adrenerginė miokardo susitraukimo reguliacija, sumažėja dominuojančių β1–adrenerginių receptorių
(β1–AR) aktyvumas ir skaičius [Brodde, 1993; Barros ir kt., 1999; Devic ir kt., 2001]. Todėl vienu
iš širdies veiklos ūmaus nepakankamumo gydymo būdų yra β–AR agonistų panaudojimas. Tačiau
miokardo susitraukimo didinimas tik β–AR agonistais sąlygoja ir didesnį deguonies bei energetinių
ubstratų poreikį, o ilgalaikė tokių inotropinių medžiagų monoterapija gali sukelti dar
avojingesnius miokardo pažeidimus [Meyer ir kt., 1998]. Todėl tikslinga buvo nustatyti, ar β–AR
(n=4), palyginus su kontrole. Keičiant dirginimo dažnį nuo 0,2 Hz iki
o susitraukimo jėgos–dažnio priklausomybės
pobūdžio nekeit
kreivė).
(n=12) (p<0,001), palyginus su kontrole. Grąžinus 1 Hz dirginimo dažnį, t50 atsistatė iki
pradinio lygio, t.y. 97,36±2,96 proc. (n=12).
5.36 pav. parodytos eksperimento metu registruotos veikimo potencialų kreivės, dirginant
raumenėlius įvairiais dažniais perfuzijos fiziologiniu tirpalu metu (A) ir veikiant piruvatui (B).
Didėjant dirginimo dažniui nuo 0,2 Hz iki 3 Hz, veikimo pote
iu tiek perfuzijos fiziologiniu tirpalu metu, tiek fiziologiniu tirpalu su 10 mM piruvato:
padidinus f iki 3 Hz – VP50 atitinkamai sumažėjo iki 44,4±5,03 proc. ir 44,77±8,61 proc. (n=6)
(p<0,001), palyginus su kontrole.
100 ms 100 ms
50 m
V
50 m
V
A
s
p
agonistų ir energetinio metabolizmo substrato piruvato kombinavimas gali pagerinti žmonių,
sergančių širdies nepakankamumu, miokardo susitraukimo funkciją.
Stimuliuojant β1–β2 adrenerginius receptorius izoproterenoliu (10-5 M), P padidėjo iki
122,15±10,25 proc. (p<0,05)
3 Hz, izoproterenolis, kaip ir piruvatas, neigiam
ė, tačiau P buvo didesnė tirtame dirginimo dažnių diapazone (5.34 pav., C, 3
0,2 Hz0,5 Hz1,0 Hz1,5 Hz
0,2 Hz
2,0 Hz2,5 Hz3,0 Hz
0,5 Hz1,0 Hz
1,5 Hz2,0 Hz2,5 Hz3,0 Hz
B
100 ms 100 ms
50 m
V
50 m
V
A
0,2 Hz0,5 Hz1,0 Hz1,5 Hz
0,2 Hz
2,0 Hz2,5 Hz3,0 Hz
0,5 Hz1,0 Hz
1,5 Hz2,0 Hz2,5 Hz3,0 Hz
100 ms100 ms 100 ms100 ms
50 m
V50
mV
50 m
V50
mV
A
0,2 Hz0,5 Hz1,0 Hz1,5 Hz
0,2 Hz
2,0 Hz2,5 Hz3,0 Hz
0,5 Hz1,0 Hz
1,5 Hz2,0 Hz2,5 Hz3,0 Hz
B
100
Veikiant piruvatui (10 mM), β1–β2 adrenerginių receptorių stimuliacijos izoproterenoliu metu,
t.y. kartu su izoproterenoliu, susitraukimo jėga padidėjo iki 236,91±25,31 proc. (n=12) (p<0,05),
palyg
i 78,51±12,31 proc. (n=12) (p<0,001), palyginus su kontrole.
Raumenėlių atsipalaidavimo laikas, veikiant izoproterenoliui (10-5 M), sumažėjo iki
58,92±3,19 proc. ir išliko mažesnis prie visų dirginimo dažnių: esant 3 Hz t50 buvo 43,18±7,01
proc. (n=4) (p<0,05), palyginus su kontrole (5.35 pav., 3 kreivė). Dirginant 1 Hz dažniu ir veikiant
izoproterenoliui kartu su piruvatu, t50 sumažėjo iki 67,75±2,42 proc. (n=12) (p<0,001), palyginus su
kontrole. Didėjant dirginimo dažniui, t50 mažėjo, tačiau buvo nežymiai didesnis negu veikiant tik
izoproterenoliui: esant 3 Hz dažniui, t50 buvo 47,06±2,99 proc. (n=12) (p<0,001), palyginus su
kontrole.
Veikimo potencialų trukmė VP50, didėjant dirginimo dažniui iki 3 Hz, mažėjo panašiu laipsniu
tiek perfuzijos fiziologiniu tirpalu su izoproterenoliu metu, tiek su piruvatu, tiek su izoproterenoliu
ir piruvatu kartu: atitinkamai iki 48,16±3,09 proc., 44,77±8,61 proc., 48,34±6,35 proc. (n=4)
(p<0,05), palyginus su kontrole.
t., 2003; Kristo ir kt., 2004;
Kewe
potencialo padidėjimu [Mallett, Bunger, 1994; Mallet, Sun 1999], neorganinio fosfato [Mallett,
Bunger, 1994; Scholz ir kt., 1995; Mallet, Sun, 1999] bei viduląstelinio H+ koncentracijų
inus su kontrole, t.y. žymiai didesniu laipsniu negu jiems veikiant atskirai. Be to, susitraukimo
jėga, veikiant piruvatui kartu su izoproterenoliu ir didinant dirginimo dažnį nuo 0,2 Hz iki 3 Hz,
nors ir mažėjo, tačiau buvo žymiai didesnė visame dirginimo dažnių diapazone (5.34 pav., C, 4
kreivė) nei perfuzijos fiziologiniu tirpalu metu (5.34 pav., C, 1 kreivė), ar fiziologiniu tirpalu tik su
piruvatu (5.34 pav., C, 2 kreivė) ar izoproterenoliu (5.34 pav., C, 3 kreivė). Padidėjus dirginimo
dažniui iki 3 Hz, P sumažėjo tik ik
Rezultatų aptarimas
Šiame skyriuje pateikti energetinio metabolizmo substrato piruvato poveikio žiurkės ir
žmonių, sergančių širdies nepakankamumu, miokardo elektromechaninio aktyvumo parametrams
bei jų priklausomybei nuo dirginimo dažnio tyrimų rezultatai parodė, kad piruvatas didino žiurkės ir
žmogaus miokardo susitraukimo jėgą, lėtino atsipalaidavimą ar jo nekeitė (žmogaus miokardo) bei
nežymiai prailgino veikimo potencialus. Teigiamą inotropinį piruvato poveikį nustatė ir kiti autoriai
tyrimuose su normaliu, hipoksiniu ar išemijos pakenktu triušio, kiaulės ir žiurkės miokardu [Bunger
ir kt., 1988; Martin ir kt., 1998; Hermann ir kt., 2000; Zima ir k
loh ir kt., 2007], o taip pat su izoliuotais žmonių, sergančių širdies nepakankamumu,
miokardo preparatais [Hermann ir kt., 1999, 2002; Mallet, 2000; Mallet ir kt., 2005].
Literatūros duomenimis, piruvato inotropinis poveikis aiškinamas citozolio fosforilinimo
101
sumažėjimu [Hasenfuss, Pieske, 2002] ir intensyvesne ST Ca2+ apykaita [Hermann ir kt., 2002].
Egzogeninis piruvatas didina fosforilinimo potencialą ([ATP]/[ADP][Pn] ir [PCr]/[Pn]) bei laisvąją
energ
02;
Zima
s-redukcijos reakcijų metu, veikimo [Bassege ir kt., 2000; Mallet, 2000; Zima ir kt.,
2003
čiau ji buvo žymiai didesnė tirtame dažnių diapazone
(0,2 Hz – 3 Hz) nei perfuzuojant raumenėlius fiziologiniu tirpalu be piruvato. Žmogaus miokardo
atsipalaidavimo laikas ir VP trukmė, didinant dirginimo dažnį mažėjo panašiu laipsniu tiek
perfuzijos fiziologiniu tirpalu be pir o laikas
ir VP trukmė, padidėję, veikiant piruvatui, nežymiai mažėjo didinant dirginimo dažnį. Taigi,
nerg
imo kaskada,
sąlygojanti L–tipo Ca2+ kanalų fosforilinimą, Ca2+ srovės per šiuos kanalus ir susitraukimo jėgos
iją, gaunamą ATP hidrolizės metu (∆GATP) [Mallet, Sun 1999, Hermann ir kt., 2000]. Padidėję
fosforilinimo potencialas bei ATP ir fosfokreatino (PCr) koncentracijos sąlygoja neorganinio
fosfato (Pn), slopinančio aktino–miozino ATPazės aktyvumą, sumažėjimą. Todėl didėja skersinių
tiltelių susidarančių tarp aktino ir miozino skaičius, tuo pačiu ir miokardo susitraukimo jėga
[Mallet, 2000]. Be to, nustatyta, kad, veikiant piruvatui, padidėjus viduląstelinėms ATP ir PCr
koncentracijoms, ST Ca2+–ATPazės aktyvumas ir Ca2+ sukaupimas sarkoplazminiame tinkle
padidėja, o tai, savo ruožtu, sąlygoja didesnį išskiriamo “Ca2+ pliūpsnio” kiekį ir susitraukimo jėgos
padidėjimą [Mallet, Bunger, 1994; Martin ir kt., 1998; Hasenfuss, Pieske, 2002; Maier ir kt., 20
ir kt., 2003]. Veikimo potencialų platėjimas gali būti sąlygotas padidėjusios L–tipo Ca2+
srovės, padidėjus L–tipo Ca2+ kanalų fosforilinimui, o tai taip pat iššaukia “Ca2+ pliūpsnio” kiekio ir
susitraukimo jėgos padidėjimą. Nežymus žiurkės miokardo atsipalaidavimo sulėtėjimas, veikiant
piruvatui, gali būti dėl padidėjusio miofilamentų jautrumo Ca2+ jonams ir stipresnio skersinių
tiltelių ryšio [Hasenfuss ir kt., 2002]. Be to, čia gali pasireikšti ir antioksidacinis piruvato poveikis,
apsaugojantis miokardo ląsteles nuo žalingo ROS, reaktyvių deguonies formų, susidarančių
oksidacijo
; Oliveira, 2005].
Tiriant žiurkės ir žmogaus miokardo elektromechaninio aktyvumo parametrų priklausomybes
nuo dirginimo dažnio, nustatėme, kad, veikiant piruvatui, susitraukimo jėgos–dažnio
priklausomybės neigiamas pobūdis išliko, ta
uvato, tiek su piruvatu. Žiurkės miokardo atsipalaidavim
e etinio metabolizmo substratas piruvatas žymiai padidino žiurkės ir sergančiųjų širdies
nepakankamumu miokardo susitraukimo jėgą bei pagerino miokardo didelių dažnių toleravimą.
Tiriant β–AR agonisto izoproterenolio įtaką, žmonių, sergančių širdies nepakankamumu,
miokardo elektromechaninio aktyvumo parametrams bei jų priklausomybėms nuo dirginimo dažnio,
nustatėme, jog izoproterenolis (10-5 M) padidino miokardo susitraukimo jėgą, greitino
atsipalaidavimą bei nežymiai mažino VP trukmę. Izoproterenolis nepakeitė šių parametrų
priklausomybių nuo dirginimo dažnio neigiamo pobūdžio, tačiau susitraukimo jėga buvo
padidėjusi, o atsipalaidavimas pagreitėjęs tirtų dirginimo dažnių diapazone (0,2 Hz – 3 Hz).
Stimuliuojant β–AR izoproterenoliu, aktyvinama viduląstelinė signalo perdav
102
padid
sų tyrimai, kuriuose žmonių, sergančių širdies nepakankamumu, miokardo
susitr
ir
pager
ėjimą. Viduląstelinės kaskados metu aktyvinta PKA taip pat dalyvauja troponino I
(sąlygodama kontraktilinės sistemos jautrumo Ca2+ sumažėjimą) bei sarkoplazminio tinklo PLB
(padidindama Ca2+ grąžinimą į ST per Ca2+–ATPazę) fosforilinime [Barros ir kt., 1999], todėl
greitėja ir raumens atsipalaidavimas.
Kaip buvo minėta, katecholaminai klinikinėje praktikoje naudojami įvairiais atvejais, įskaitant
ūmų širdies nepakankamumą, poopercinį širdies veiklos atstatymą po širdies operacijų ar koronarų
revaskuliarizacijos, širdies veiklos sutrikimą, susijusį su kardiogeniniu ar septiniu šoku [Felker,
O’Connor, 2001]. Tačiau β–adrenerginės stimuliacijos metu padidėjusi susitraukimo jėga sąlygoja
didesnį deguonies bei miokardo energetinių išteklių poreikį [Hermann ir kt., 2000], o energetinių
substratų sunaudojimui viršijus jų gamybą (ypač širdies nepakankamumo metu), miokardo
susitraukimo efektyvumas mažėja. Tai yra viena pagrindinių nepageidaujamų β–AR agonistų
savybių. Be to, β–adrenerginis stimuliavimas sąlygoja miofilamentų jautrumo Ca2+ sumažėjimą dėl
troponino I fosforilinimo, o taip pat ST Ca2+–ATPazės aktyvumo padidėjimą dėl PLB fosforilinimo
[Hermann ir kt., 2000]. Todėl nemaža dalis padidėjusio Ca2+ „iššvaistoma“ dėl miofilamentų
nejautrumo. Padidėjus cAMP koncentracijai ląstelėse, intensyvėja ir „bergždžias ciklas“,
sąlygojantis dar didesnį deguonies eikvojimą [Opie, 1984].
Todėl piruvato, kaip energetinio metabolizmo substrato, panaudojimas β–adrenerginės
stimuliacijos metu gali papildyti miokardo ląstelių ATP išteklius ir pagerinti izoproterenoliu
stimuliuotą žmogaus miokardo susitraukimo jėgą, atsipalaidavimo laiką, veikimo potencialų trukmę
ir jų priklausomybes nuo dirginimo dažnio.
Tai patvirtino mū
aukimo jėga buvo žymiai didesnė, veikiant piruvatui (10 mM) ir izoproterenoliui (10-5 M)
kartu, nei piruvato ar izoproterenolio monoperfuzijos metu. Be to, didėjant dirginimo dažniui (0,2
Hz – 3 Hz), susitraukimo jėga išliko daug didesnė visame dažnių diapazone. Piruvato ir
izoproterenolio kombinacijos poveikis žmonių, sergančių širdies nepakankamumu, miokardo
elektromechaninio aktyvumo parametrų priklausomybei nuo dirginimo dažnio, literatūros
duomenimis nebuvo tirtas, todėl neturėjome galimybės palyginti mūsų gautų rezultatų su kitų
autorių duomenimis.
Taigi, energetinio metabolizmo stimuliavimas piruvatu ir β–adrenerginės sistemos
izoproterenoliu žymiai padidino sergančiųjų širdies nepakankamumu miokardo susitraukimo jėgą
ino didelių dažnių toleravimą. Klinikiniu požiūriu kombinuota piruvato bei β–AR agonistų
terapija, sąlygotų efektyvesnę sergančiųjų širdies nepakankamumu miokardo susitraukimo funkciją
ir fizinio krūvio toleravimą.
103
6. IŠVADOS
tencialų trukmę, L–tipo Ca srovę, lėtino atsipalaidavimą bei
4
e parametrai išliko padidėję tirtame dažnių diapazone
1. Mitochondrijų kvėpavimo grandinės III ir IV kompleksų aktyvumų slopinimas (atitinkamai
antimicinu A, anoksija ar NaCN) ir oksidacinio fosforilinimo atskyrimas (FCCP) žymiai
didesniu laipsniu mažino žiurkės ir žmonių, sergančių širdies nepakankamumu, miokardo
susitraukimo jėgą, veikimo po 2+
didino ramybės įtempimą negu I-ojo komplekso aktyvumo slopinimas rotenonu.
2. Žmonių, sergančių širdies nepakankamumu, miokardo elektromechaninio aktyvumo
parametrai buvo mažiau jautrūs mitochondrijų kvėpavimo grandinės I, III ir IV kompleksų
slopikliams ir oksidacinio fosforilinimo skyrikliui negu žiurkės miokardo.
3. Mitochondrijų F1F0–ATPazės aktyvumo slopinimas oligomicinu sumažino kvėpavimo
grandinės III ir IV kompleksų slopiklių ir oksidacinio fosforilinimo skyriklio poveikį žiurkės
ir žmonių, sergančių širdies nepakankamumu, miokardo elektromechaninio aktyvumo
parametrams bei jų kitimą, didėjant dirginimo dažniui oksidacinio fosforilinimo atskyrimo
metu.
. Energetinio metabolizmo substratas piruvatas didino žiurkės ir žmonių, sergančių širdies
nepakankamumu, miokardo susitraukimo jėgą, atsipalaidavimo laiką ir veikimo potencialų
trukmę, nekeitė susitraukimo jėgos bei atsipalaidavimo laiko priklausomybės nuo dirginimo
dažnio neigiamo pobūdžio, tačiau ši
(0,2 – 3 Hz).
5. Kompleksinis žmogaus miokardo ląstelių energetinio metabolizmo aktyvavimas piruvatu ir
β–adrenerginės sistemos – izoproterenoliu, sąlygojo efektyvesnę miokardo susitraukimo
funkciją bei didelių dirginimo dažnių toleravimą, esant širdies nepakankamumui.
104
7. LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Ai X, Curran JW, Shannon TR, Bers DM, Pogwizd SM. Ca2+/calmodulin-dependent protein
kinase modulates cardiac ryanodine receptor phosphorylation and sarcoplasmic reticulum
Ca2+ leak in heart failure. Circ Res. 2005; 97:1314:22.
2. Altschuld RA, Starling RC, Hamlin RL, Billman GE, Hensley J, Castillo L, Fertel RH, Hohl
CM, Robitaille PML, Jones LR, Xiao RP, Lakatta EG. Response of failing canine and
human heart cells to β2-adrenergic stimulation. Circulation. 1995; 92:1612-8.
3. Armoundas AA, Rose J, Aggarwal R, Stuyvers BD, O’Rourke B, Kass DA, Marban E,
Shorofsky SR, Tomaselli GF, Balke CW. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2007;
292:H1607-18.
4. Baartscheer A, Schumacher CA, van Borren MM, Belterman CN, Coronel R, Opthof T,
Fiolet JW. Chronic inhibition of Na+/H+-exchanger attenuates cardiac hypertrophy and
prevents cellular remodeling in heart failure. Cardiovasc Res. 2005; 65:83-92.
5. Barros Rde A, Okoshi MP, Cicogna AC. Beta-adrenergic pathway in healthy and
hypertrophied hearts. Arq Bras Cardiol. 1999; 72(5):641-56.
6. Bassani JWM, Bassani RA, Bers DM. Relaxation in rabbit and rat cardiac cells: species–
dependent differences in cellular mechanisms. J Physiol. 1994; 476:279-93.
7. Bassenge E, Sommer O, Schwemmer M, Bunger R. Antioxidant pyruvate inhibits cardiac
formation of reactive oxygen species through changes in redox state. Am J Physiol Heart
Circ Physiol. 2000; 279:H2431-8.
8. Bavendiek U, Brixius K, Münch G, Zobel C, Müller-Ehmsen J, Schwinger RHG. Effect of
inotropic interventions on the force-frequency relation in the human heart. Basic Research
in Cardiology. 1998; 93:76-85.
9. Becker LC, Levine JH, DiPaula AF, Guarnieri T, Aversano T. Reversal of dysfunction in
postischemic stunned myocardium by epinephrine and postextrasystolic potentiation. J Am
Coll Cardiol. 1986; 7:580-9.
10. Beer M, Seyfarth T, Sandstede J, Landschutz W, Lipke C, Kostler H, von Kienlin M, Harre
K, Hahn D, Neubauer S. Absolute concentrations of high-energy phosphate metabolites in
normal, hypertrophied, and failing human myocardium measured noninvasively with 31P-
SLOOP magnetic resonance spectroscopy. J Am Coll Cardiol. 2002; 40:1267-74.
105
11. Benitah JP, Kerfant BG, Vassort G, Richard S, Gomez AM. Altered communication
between L-type calcium channels and ryanodine receptors in heart failure. Fron Biosci.
2002; 7:e263-75.
12. Bers DM, Despa S. Cardiac myocytes Ca2+ and Na+ regulation in normal and failing hearts.
13.
14.
15.
DA, Murphy AM. Heart failure-associated alterations in troponin I phosphorylation impair
16. haracterization of
mitochondrial DNA in primary cardiomyopathies . Clin Chim Acta. 1995; 243:181-9.
18.
tions for the medical treatment of the heart failure. Clin Investig. 1992; 70:421-5.
9. Bonz A, Siegmund B, Ladilov Y, Vahl CF, Piper HM. Metabolic recovery of isolated adult
20.
21. erry RG, Baghai M, Duchen MR, Shattock MJ. FCCP is cardioprotective at
concentrations that cause mitochondrial oxidation without detectable depolarisation.
22.
dependent
cardioprotection independent of KATP channel activation. Cardiovasc Res. 2006; 72:313-21.
23. Bristow MR. Changes in myocardial vascular receptors in heart failure. Am J Cardiol. 1993;
22:61A-71A.
24. Brixius K, Hoischen S, Reuter H, Lasek K, Schwinger RH. Force-frequency relationship in
multicellular muscle strips and single cardiomyocytes of human failing and nonfailing
hearts. J Cardiol Fail. 2001; 7(4):335-41.
J Pharmacol Sci. 2006; 100:315-22.
Bers DM. Calcium fluxes involved in control of cardiac myocyte contraction. Circ Res.
2000; 87:275-81.
Bers DM. Cardiac excitation–contraction coupling. Nature. 2002; 415:198-205.
Bilchick KC, Duncan JG, Ravi R, Takimoto E, Champion HC, Gao WD, Stull LB, Kass
ventricular relaxation-afterload and force-frequency responses and systolic function. Am J
Physiol Heart Circ Physiol. 2007; 292:H318-25.
Bobba A, Giannattasio S, Pucci A, Cippolis R, Camaschella C, Marre E. C
17. Bodi I, Mikala G, Koch SE, Akhter SA, Schwartz A. The L-type calcium channel in the
heart: the beat goes on. J Clin Invest. 2005; 115:3306-17.
Bohm M, La Rosee K, Schmidt U, Schulz C, Schwinger RH, Erdmann E. Force-frequency
relationship and inotropic stimulation in the nonfailing and failing human myocardium:
implica
1
rat cardiomyocytes after energy depletion: existence of an ATP threshold? J Mol Cell
Cardiol. 1998; 30(10):2111-9.
Bouchard RA, Rose D. Analysis of the interval-force relationship in rat and canine
ventricular myocardium. Am J Physiol. 1989; 257(6 Pt 2):H2036-47.
Brennan JP, B
Cardiovasc Res. 2006; 72:322-30.
Brennan JP, Southworth R, Medina RA, Davidson SM, Duchen MR, Shattock MJ.
Mitochondrial uncoupling, with low concentration FCCP, induces ROS-
106
25. Brodde OE. β-adrenoceptors in cardiac disease. Pharmacol Ther. 1993; 60:405-30.
26. Buchwald A, Till H, Un
the mitochondrial respiratory chain in human dilated cardiomyopathy. Eur Heart J. 1990;
11:509-16.
28. . Functional regulation of L-type
29. potential and
30. ella L, Branca D, Brini M. Generation, control, and processing of cellular
31.
bryonic mouse
34.
ltered in failing human ventricular myocytes and recover
35.
activity in tachycardia heart failure. Cell Calcium. 1994;
36.
of phospholamban. J Biol Chem. 1991; 266:17486-93.
38.
-55.
39. Crozatier B. Force-frequency relations in nonfailing and failing animal myocardium. Basic
Res Cardiol. 1998; 93:46-50.
terberg C, Oberschmidt R, Figulla HR, Wiegand V. Alterations of
27. Bullock AJ, Wray S. The effects of metabolic inhibition on force, Ca2+ and pHi in guinea-
pig ureteric smooth muscle. Eur J Physiol. 1998; 435:240-6.
Bunemann M, Gerhardstein BL, Gao T, Hosey MM
calcium channels via protein kinase A-mediated phosphorylation of the β2 subunit. J Biol
Chem. 1999; 274:33851-4.
Bunger R, Mallet RT, Hartman A. Pyruvate enhanced phosphorylation
inotropism in normoxic and postichemic isolated working heart. Near-complete prevention
of reperfusion contractile failure. Eur J Biochem. 1988; 180:221-33.
Carafoli E, Sant
calcium signals. Crit Rev Biochem Mol Biol. 2001; 36:107-260.
Casademont J, Miro O. Electron transport chain defects in heart failure. Heart Fail Rev.
2002; 7:131-9.
32. Catterall WA. Structure and function of neuronal Ca2+ channels and their role in
neurotransmitter release. Cell. 1998; 24(5-6):307-23.
33. Chen F, De Diego C, Xie L-H, Yang J-H, Klitzner TS, Weiss JN. Effects of metabolic
inhibition on conduction, Ca transients, and arrhythmia vulnerability in em
hearts. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2007; 293:H2472-8.
Chen X, Piacentino V 3rd, Furukawa S, Goldman B, Margulies KB, Houser SR. L-type Ca2+
channel density and regulation are a
after support with mechanical assist devices. Circ Res. 2002; 91:517-24.
Colston JT, Kumar P, Chambers JP, Freeman GL. Altered sarcolemmal calcium channel
density and Ca2+-pump ATPase
16:349-56.
Colyer J, Wang JH. Dependence of cardiac sarcoplasmic reticulum calcium pump activity
on the phosphorylation status
37. Communal C, Colluci WS. The control of cardiomyocyte apoptosis via the beta-adrenergic
signaling pathways. Arch Mal Coeur Vaiss. 2005; 98(3):236-41.
Cortassa S, Aon MA, Marban E, Winslow RL, O’Rourke B. An integrated model of cardiac
mitochondrial energy metabolism and calcium dynamics. Biophys J. 2003; 84:2734
107
40. De Jongh KS, Murphy BJ, Colvin AA, Hell JW, Takahashi M, Catterall WA. Specific
phosphorylation of a site in the full-length form of the alpha 1 subunit of the cardiac L-type
calcium channel by adenosine 3’,5’-cyclic monophosphate-dependent protein kinase.
41. : mechanics and regulation. J Biomech. 2003; 36:721-
42. s C, Ralenkotter L, Cole PS, Hadley RW. Intramitochondrial [Ca2+] and
ion. Am J
43.
sed to
45. ective action of trimetazidine and
46. 03;
47.
se to human. Biochim Biophys Acta. 2002; 1553:261-7.
7:349-57.
50. tion coupling from the 1950s into the new millennium.
51.
iac muscle. Circ Res. 2000; 87:1087-94.
failure. J Mol Cell Cardiol. 2007; 43(2):223-9.
Biochemistry.1996; 35:10392-402.
de Tombe PP. Cardiac myofilaments
30.
Delcamp TJ, Dale
membrane potential in ventricular myocytes exposed to anoxia-reoxygenat
Physiol. 1998; 275:H484-94.
Devic E, Xiang Y, Gould D, Kobilka B. β-adrenergic receptor subtype – specific signaling
in cardiac myocytes from β1 and β2 adrenoceptor knockuot mice. Mol Pharmacol. 2001;
60:577-83.
44. Di Lisa F, Blank PS, Colonna R, Gambassi G, Silverman HS, Stern MD, Hansford RG.
Mitochondrial membrane potential in single living adult rat cardiac myocytes expo
anoxia or metabolic inhibition. J Physiol. 1995; 486:1-13.
Di Napoli P, Taccardi AA, Barsotti. Long term cardioprot
potential effect on the inflammatory process in patients with ischaemic dilated
cardiomyopathy. Heart. 2005; 91:161-5.
DiMauro S, Schon EA. Mitochondrial respiratory–chain diseases. N Engl J Med. 20
348:2656-68.
Dobson GP, Himmelreich U. Heart design: free ADP scales with absolute mitochondrial and
myofibrillar volumes from mou
48. Donck LV, Borgers M. Inhibition of sodium and calcium overload pathology in the
myocardium: a new cytoprotective principle. Cardiovasc Res. 1993; 2
49. Duchen MR. Contribution of mitochondria to animal physiology: from homeostatic sensor
to calcium signalling and cell death. J Physiol. 1999; 516:1-17.
Dulhunty AF. Excitation – contrac
Clin Exp Pharmacol Physiol. 2006; 33(9):763-72.
Ebashi S, Ohnishi S, Abe S, Maruyama K. A spinlabel study on calcium-induced
conformational changes of troponin components. J Biochem. 1974; 75:211-3.
52. Eisner DA, Choi HS, Diaz ME, O’Neill SC, Trafford AW. Integrative analysis of calcium
cycling in card
53. El-Armouche A, Polhmann L, Schlossarek S, Starbatty J, Yeh YH, Nattel S, Dobrev D,
Eschenhagen T, Carrier L. Decreased phosphorylation levels of cardiac myosin-binding
protein-C in human and experimental heart
108
54. El-Armouche A, Zolk O, Rau T, Eschenhagen T. Inhibitory G-proteins and their role in
55. mith GL, Eisner DA, Allen DG. Metabolic changes during ischemia and their
56. lian ventricular myocardium:
57.
l respiratory chain complex I deficiency with clinical and
58. . 2004; 25:1765-8.
2):H1710-5.
1; 142(3):393-401.
:992-1002.
65. V, Mačianskienė R. ATF-reguliuojamų K-kanalų įtakos hipoksiniam miokardui
66. cardial
gen
desensitization of the adenylyl cyclase pathway in heart failure. Cardiovasc Res. 2003;
60:478-87.
Elliot AC, S
role in contractile failure in isolated ferret hearts. J Physiol (Lond). 1992; 454:467-90.
Endoh M. Force-frequency relationship in intact mamma
physiological and pathophysiological relevance. Eur J Pharmacol. 2004; 500:73-86.
Enns GM, Bennett MJ, Hoppel CL, Goodman SI, Weisiger K, Ohnstad C, Golabi M,
Packman S. Mitochondria
biochemical features of long-chain 3-hydroxyacyl-coenzyme A dehydrogenase deficiency. J
Pediatr. 2000; 136:251-4.
Essop MF, Opie LH. Metabolic therapy for heart failure. Eur Heart J
59. Ezzaher A, el Houda Bouanani N, Crozatier B. Force-frequency relations and response to
ryanodine in failing rabbit hearts. Am J Physiol. 1992; 263 (6 Pt
60. Felker GM, O’Connor CM. Inotropic therapy for heart failure: an evidence-based approach.
Am Heart J. 200
61. Ferrari R. Healthy versus sick myocytes: metabolism, structure and function. Eur Heart J
Supplements. 2002; 4:G1-12.
62. Flesch M, Schwinger RH, Schiffer F, Frank K, Sudkamp M, Kuhn-Regnier F, Arnold G,
Bohm M. Evidence for functional relevance of an enhanced expression of the Na+-Ca2+
exchanger in failing human myocardium. Circulation. 1996; 94
63. Frank K., Bolck B, Bavendiek U, Schwinger RHG. Frequency dependent force generation
correlates with sarcoplasmic calcium ATPase activity in human myocardium. Basic Res
Cardiol. 1998; 93:405-11.
64. Frank KF, Bolck B, Erdmann E, Schwinger RH. Sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase
modulates cardiac contraction and relaxation. Cardiovasc Res. 2003: 57:20-7.
Gendvilienė
elektrofiziologiniai tyrimai. Medicina. 1997. 33(2):101-5.
Gengo PJ, Sabbah HN, Steffen RP, Sharpe JK, Kono T, Stein PD, Goldstein S. Myo
beta adrenoceptor and voltage sensitive calcium channel changes in a canine model of
chronic heart failure. J Mol Cell Cardiol. 1992; 24:1361-9.
67. Genova ML, Pich MM, Bernacchia A, Bianchi C, Biondi A, Bovina C, Falasca AI,
Formiggini G, Castelli GP, Lenaz G. The mitochondrial production of reactive oxy
species in relation to aging and pathology. Ann N Y Acad Sci. 2004; 1011:86-100.
109
68. Gerhardstein BL, Puri TS, Chien AJ, Hosey MM. Identification of the sites phosphorylated
by cyclic AMP-dependent protein kinase on the β2 subunit of L-type voltage-dependent
calcium channels. Biochemistry. 1999; 38:10361-70.
Goldhaber JI, Parker JM, Weiss JN69. . Mechanisms of excitation-contraction coupling failure
-8.
72. Grover GJ. The IF1 protein inhibitor protein of the mitochondrial F1F0 ATPase.
73.
al F1F0 ATPase inhibition. Am J
74.
yocardium by mitochondrial F1F0-ATPase: effect
Circ Physiol. 2004; 287:H1747-55.
Res
76. Path. 2000;
77. alpastatin and ATP together
ivity in the
79. ilure progression. Circ Res. 2001;
during metabolic inhibition in guinea-pig ventricular myocytes. J Physiol. 1991; 443:371-
86.
70. Gong G, Liu J, Liang P Guo T, Hu Q, Ochiai K, Hou M, Ye Y, Wu X, Mansoor A, From
AH, Ugurbil K, Bache RJ, Zhang J. Oxidative capacity in failing hearts. Am J Physiol Heart
Circ Physiol. 2003; 285:H541
71. Graff C, Clayton DA, Larsson N-G. Mitochondrial medicine – recent advances. J Intern
Med. 1999; 246:11-23.
Green DW,
Biochim Biophys Acta. 2000; 1458:343-55.
Green DW, Murray HN, Sleph PG, Wang FL, Baird AJ, Rogers WL, Grover GJ.
Preconditioning in rat hearts is independent of mitochondri
Physiol. 1998; 274:90-7.
Grover GJ, Atwal KS, Sleph PG, Wang F-L, Monshizadegan H, Monticello T, Green DW.
Excessive ATP hydrolysis in ischemic m
of selective pharmacological inhibition of mitochondrial ATPase hydrolase activity. Am J
Physiol Heart
75. Gruver EJ, Morgan JP, Stambler BS, Gwathmey JK. Uniformity of calcium channel number
and isometric contraction in human right and left ventricular myocardium. Basic
Cardiol. 1994; 89:139-48.
Guertl, B, Noehammer Ch, Hoefler G. Metabolic cardiomyopathies. Int J Exp
81:349-72.
Hao LY, Kameyama A, Kameyama M. A cytoplasmic factor, c
reverse run-down of Ca2+ channel activity in guinea-pig heart. J Physiol. 1999; 514(3):687-
99.
78. Hardy L, Clark JB, Darley-Usmar VM, Smith DR, Stone D. reoxygenation-dependent
decrease in mitochondrial NADH: CoQ reductase (complex I) act
hypoxic/reoxygenated rat heart. Biochem J. 1991; 274:133-7.
Hare JM. Oxidative stresss and apoptosis in heart fa
89:198-200.
110
80. Harris DM, Mills GD, Chen X, Kubo H, Berretta RM, Votaw VS, Santana LF, Houser SR.
Alterations in early action potential repolarization causes localized failure of sarcoplasmic
reticulum Ca2+ release. Circ Res. 2005; 96:543-50.
ckout
82. alcium
83.
n hemodynamics and left ventricular function in patients with
94;
84. Cell Cardiol.
85. t SE, Preuss M, Pieske B, Maier LS, Prestle J, Minami
Circulation. 1999; 99:641-8.
iling human
89. N, Hasenfuss G, Janssen PML.
90. 2+ exchange activity in canine
91.
81. Harris SP, Bartley CR, Hacker TA, McDonald KS, Douglas PS, Greaser ML, Powers PA,
Moss RL. Hypertrophic cardiomyopathy in cardiac myosin binding protein-C kno
mice. Circ Res. 2002; 90:594-601.
Hartzell HC, Mery PF, Fischmeister R, Szabo G. Sympathetic regulation of cardiac c
current is due exclusively to cAMP-dependent phosphorylation. Nature. 1991;
351(6327):573-6.
Hasenfuss G, Holubarsch CH, Hermann HP, Astheimer K, Pieske B, Just H. Influence of the
force-frequency relation o
nonfailing hearts and in patients with failing dilated cardiomyopathy. Eur Heart J. 19
15:164-70.
Hasenfuss G, Pieske B. Calcium cycling in congestive heart failure. J Mol
2002: 34:951-69.
Hasenfuss G, Schillinger W, Lehnar
K, Just H. Relationship between Na+-Ca2+ - exchanger protein levels and diastolic function
of failing human myocardium.
86. He J, Conklin MW, Foell JD, Wolff MR, Haworth RA, Coronado R, Kamp TJ. Reduction in
density of transverse tubules and L-type Ca2+ channels in canine tachycardia-induced heart
failure. Cardiovasc Res. 2001; 49:298-307.
87. Hermann HP, Pieske B, Schwazmuler E, Keul J, Just H, Hasenfuss G. Beneficial
hemodynamic effects of pyruvate in patients with congestive heart failure. Lancet. 1999;
353:1321-3.
88. Hermann HP, Zeitz o, Lehnart SE, Keweloh B, Datz N, Hasenfuss G, Janssen PML.
Potentiation of beta-adrenergic inotropic response by pyruvate in fa
myocardium. Cardiovasc Res. 2002; 53:116-23.
Hermann HP, Zeitz O, Lehnart SE, Keweloh B, Datz
Pyruvate potentiates inotropic effects of isoproterenol and Ca2+ in rabbit cardiac muscle
preparations. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2000; 279:H702-8.
Hobai IA, O’Rourke B. Enhanced Ca2+-activated Na+-Ca
pacing-induced heart failure. Circ Res. 2000; 87:690-8.
Hohl CM, Altschuld RA. Response of isolated adult canine cardiac myocytes to prolonged
hypoxia and reoxygenation. Am J Physiol. 1991; 260:C383-91.
111
92. Hoppel CL, Moghaddas S, Lesnefsky EJ. Interfibrillar cardiac mitochondrial complex III
defects in the aging rat hearts. Biogerontology. 2002; 3:41-4.
Houser AR, Margulies KB. Is depressed myocyte c93. ontractility centrally involved in heart
94.
rtrophied and failing heart. J Mol Cell Cardiol. 2000; 32:1595-607.
96. , Abraham WT, Periasamy M. Altered force-frequency
tron transport complex I is a potential source of
98.
ndrial DNA damage and dysfunction associated with oxidative
99.
f the transition from physiological to
100.
irc Res. 2004; 95:135-45.
1
J. Mitochondrial function in heart muscle patients with idiopathic dilated
102.
y in myocardial ischemia in the dog. Circ Res. 1978; 92:187-214.
1
104. aldivia HH. Abnormal Ca2+
105. Jons DR. The other human genome. Mitochondrial DNA and disease. Nat Med. 1996;
2:1065-8.
failure? Circ Res. 2003; 92:350-8.
Houser SR, Piacentino V 3rd, Weisser J. Abnormalities of calcium cycling in the
hype
95. Hove-Madsen L, Mery P-F, Jurevicius J, Skeberdis AV, Fishmeister R. Regulation of
myocardial calcium channels by cyclic AMP metabolism. Basic Res Cardiol. 1996; 91:1-8.
Huke S, Liu LH, Biniakiewicz D
response in non-failing hearts with decreased SECA pump-level. Cardiovasc Res. 2003;
59:668-77.
97. Ide T, Tsutsui H, Kinugawa S, Utsumi H, Kang D, Hattori N, Uchida K, Arimura K,
Egashira K, Takeshita A. Mitochondrial elec
oxygen free radicals in the failing myocardium. Circ Res. 1999; 85:357-63.
Ide T. Tsutsui H, Hayashidani S, Kang D, Suematsu N, Nakamura K, Utsumi H, Hamasaki
N, Takeshita A. Mitocho
stress in failing hearts after myocardial infarction. Circ Res. 2001; 88:529-35.
Inagaki M, Yokota M, Izawa H, Ishiki R, Nagata K, Iwase M, Yamada Y, Koide M, Sobue
T. Impaired force-frequency relations in patients with hypertensive left ventricular
hypertrophy. A possible physiological marker o
pathological hypertrophy. Circulation. 1999; 99:1822-30.
Ingwall JS, Weiss RG. Is the failing heart energy starved? On using chemical energy to
support cardiac function. C
01. Jarreta D, Orus J, Barrientos A, Miro O, Roig E, Heras M, Moraes CT, Cardellach F,
Casademont
cardiomyopathy. Cardiovasc Res. 2000; 45:860-5.
Jennings RB, Hawkins HK, Lowe JE. Relation between high energy phosphate and letal
injur
03. Jennings RB, Reimer KA, Steenbergen C. Effect of inhibition of the mitochondrial ATPase
on net myocardial ATP in total ischemia. J Mol Cell Cardiol. 1991; 23:1383-95.
Jiang MT, Lokuta AJ, Farrell EF, Wolff MR, Haworth RA, V
release, but normal ryanodine receptor, in canine and human heart failure. Circ Res. 2002;
91:1015-22.
112
1
8:262-73.
1
108. sic uncoupling of oxidative phosphorylation. Biochim
109.
lf PK, Wigle ED, Seidman JG, Seidman CE. Mutations in sarcomere
110.
111. toh H, Nakamura T. The role of Na+/H+ exchange and the Na+/K+ pump in the
994; 203:93-8.
1
113. ed by maladaptive proliferative
114.
inase A accelerates relaxation and crossbridge
115.
f contraction in isolated rabbit myocardium. Eur J Heart Fail. 2007; 9(8):754-
116.
P-sensitive K+ channels in mouse cardiac
117.
c myocytes. Cardiovasc
118. m OW, Krieger KH. The effects of
06. Kaab S, nuss HB, Chiamvimonvat N, O’Rourke B, Pak PH, Kass DA, Marban E, Tomaselli
GF. Ionic mechanism of action potential prolongation in ventricular myocytes from dogs
with pacing-induced heart failure. Circ Res. 1996; 7
07. Kaasik A, Joubert F, Ventura-Clapier R, Veksler V. A novel mechanism of regulation of
cardiac contractility by mitochondrial functional state. FASEB J. 2004; 18:1219-27.
Kadenbach B. Intrinsic and extrin
Biophys Acta. 2003; 1604:77-94.
Kamisago M, Sharma SD, DePalma SR, Solomon S, Sharma P, McDonough B, Smoot L,
Mullen MP, Woo
protein genes as a cause of dilated cardiomyopathy. N Engl J Med. 2000; 343:1688-96.
Kamp TJ, Hell JW. Regulation of cardiac L-type calcium channels by protein kinase A and
protein kinase C. Circ Res. 2000; 87(12):1095-102.
Katoh H, Sa
regulation of [Na+]i during metabolic inhibition in guinea pig myocytes. Biochem Biophys
Research Comm. 1
12. Katz A. Physiology of the heart. 3th edition. Philadelphia, USA: Lippincott Williams &
Wilkins. 2001.
Katz AM. Heart failure: a hemodynamic disorder complicat
responses. J Cell Mol Med. 2003; 7(1):1-10.
Kentish JC, McCloskey DT, Layland J, Palmer S, Leiden JM, Martin AF, Solaro RJ.
Phosphorylation of troponin I by protein k
cycle kinetics in mouse ventricular musle. Circ Res. 2001; 88:1059-65.
Keweloh B, Janssen PML, Siegel U, Datz N, Zeitz O, Hermann HP. Influence of pyruvate
on economy o
61.
Knopp A, Thierfelder S, Doepner B, Benndorf K. Mitochondria are the main ATP source for
a cytosolic pool controlling the activity of AT
myocytes. Cardiovasc Res. 2001; 52:236-45.
Knopp A, Thierfelder S, Koopmann R, Biskup C, Bohle T, Benndorf K. Anoxia generates
rapid and massive opening of KATP channels in ventricular cardia
Res. 1999; 41:629-40.
Ko W, Zelano JA, Fahey AL, Berman K, Lang D, Iso
amrinone versus dobutamine on myocardial mechanics and energetics after hypothermic
global ischemia. J Thorac Cardiovasc Surg. 1993; 105:1015-24.
113
1
1
attenuates stunning and reduces infarct size in in vivo
121. th/life regulator in
122.
123.
hibition and upon restoration of mitochondrial respiration in rat ventricular
124.
1
1
127. chain disorders I: mitochondrial
128. ppel CL. Mitochondrial dysfunction in
129. poxia on intracellular ATP and cytosolic
130. wathmey JK, Hajjar
ntractility.
131.
e interaction of the inhibitory region of human cardiac troponin I with the C-
19. Koss KL, Kranias EG. Phospholamban: a prominent regulator of myocardial contractility.
Circ Res. 1996; 79:1059-63.
20. Kristo G, Yoshimura Y, Niu J, Keith BJ, Mentzer RM, Bunger R, Lasley RD. The
intermediary metabolite pyruvate
porcine myocardium. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2004; 286:H517-24.
Kroemer G, Dallaporta B, Resche-Rigon M. The mitochondrial dea
apoptosis and necrosis. Ann Rev Physiol. 1998; 60:619-42.
Kwong LK, Sohal RS. Age-related changes in activities of mitochondrial electron transport
complexes in various tissues of the mouse. Arch Biochem Biophys. 2000; 373:16-22.
Lancaster MK, Harrison SM. Changes in contraction, cytosolic Ca2+ and pH during
metabolic in
myocytes. Exp Physiol. 1998; 83:349-60.
Lee L, Horowitz J, Frenneaux M. Metabolic manipulation in ischaemic heart disease, a
novel approach to treatment. Eur Heart J. 2004; 25:634-41.
25. Lehnart SE, Wehrens XH, Marks AR. Defective ryanodine receptor interdomain
interactions may contribute to intracellular Ca2+ leak: a novel therapeutic target in heart
failure. Circulation. 2005; 111:3342-6.
26. Lei B, Lionetti V, Yong ME, Chandler MP, D’Agostino C, Kang E, Altajeros M, Matsuo K,
Hintze TH, Stanley WC, Recchia FA. Paradoxical down regulation of the glucose oxidation
pathway despite enhanced flux in severe heart failure. J Mol Cell Cardiol. 2004; 36:567-76.
Leonard JV, Schapira AHV. Mitochondrial respiratory
defects. Lancet. 2000. 355:299-304.
Lesnefsky EJ, Moghaddas S, Tandler B, Kerner J, Ho
cardiac disease: ischemia-reperfusion, aging, and heart failure. J Mol Cell Cardiol. 2001;
33:1065-89.
Li HY, Dai LJ, Quamme GA. Effect of chemical hy
Mg2+ levels. J Lab Clin Med. 1993; 122:260-72.
Lim CC, Yang H, Yang M, Wang C-K, Shi J, Berg EA, Pimentel DR, G
RJ, Helmes M, Costello CE, Huo S, Lia R. A novel mutant cardiac troponin C disrupts
molecular motions critical for calcium binding affinity and cardiomyocyte co
Biophys J. 2008; 22.
Lindhout DA, Li MX, Schieve D, Sykes BD. Effects of T142 phosphorylation and mutation
R145G on th
domain of human cardiac troponin C. Biochemistry. 2002; 41:7267-74.
114
132. Lippe G, Polizio F, Di Pancrazio F, Dabbeni-Sala F, Bortolotti N, Desideri A, Mavelli I.
Characterization of the binding of Fe(III) to F1F0ATPase from bovine heart mitochondria.
FEBS Lett. 1996; 379(3):231-5.
133. Lopaschuk GD, Rebeyka IM, Allard MF. Metabolic modulation. A means to mend a broken
heart. Circulation. 2002; 105:140-2.
134. Lopaschuk GD, Stanley WA, Lopaschuk CC. Metabolic approach in heart failure: the
rationale for metabolic interventions. Heart Metab. 2005; 27:5-10.
th loss of T-tubules – a comparison to
137.
ll Biol. 2003; 4(7):566-77.
l. 2000; 415:198-205.
142. let R. Pyruvate: metabolic protector of cardiac performance. Soc Exp Biol Med. 2000;
143.
994; 1224:22-32.
145. chondrial metabolism of pyruvate is required for its enhancement of
146.
135. Losito VA, Tsushima RG, Diaz RJ, Wilson GJ, Backx PH. Preferential regulation of rabbit
cardiac L-type Ca2+ current by glycolytic derived ATP via direct allosteric pathway. J
Physiol. 1998; 511:67-78.
136. Louch WE, Bito V, Heinzel FR, Macianskiene R, Vanhaecke J, Flameng W, Mubagwa K,
Sipido KR. Reduced synchrony of Ca2+ release wi
Ca2+ release in human failing cardiomyocytes. Cardiovasc Res. 2004; 62:63-73.
Maack C, O’Rourke B. Excitation–contraction coupling and mitochondrial energetics. Basic
Res Cardiol. 2007; 102:369-92.
138. MacLennan DH, Kranias EG. Phospholamban: a crucial regulator of cardiac contractility.
Nat Rev Mol Ce
139. Maier LS, Barckhausen JW, Baryalei M, Pieske B. Ca2+ handling in isolated human atrial
myocardium. Am J Physiol Heart Circ Physio
140. Maier LS, Braunhalter J, Horn W, Weichert S, Pieske B. The role of SR Ca(2+)-content in
blunted inotropic responsiveness of failing human myocardium. J Mol Cell Cardiol. 2002;
34:455-67.
141. Majerus TC, Dasta JF, Bauman JL, Danziger LH, Ruffolo RR. Dobutamine: 10 years later.
Pharmacotherapy. 1989; 9:245-59.
Mal
223(2):136-48.
Mallet RT, Bunger R. Energetic modulation of cardiac inotropism and sarcoplasmic
reticular Ca2+ uptake. Biochim Biophys Acta. 1
144. Mallet RT, Sun J, Knott EM, Sharma AB, Olivencia-Yurvati AH. Metabolic
cardioprotection by pyruvate: recent progress. Exp Biol Med. 2005; 230:435-43.
Mallet RT, Sun J. Mito
cardiac function and energetics. Cardiovasc Res. 1999; 42:149-61.
Marin-Garcia J, Goldenthal MJ, Moe GW. Mitochondrial pathology in cardiac failure.
Cardiovasc Res. 2001; 49:17-26.
115
147. Marin-Garcia J, Goldenthal MJ, Pirpont ME, Ananthakrishnan R. Impaired mitochondrial
function in idiopathic dilated cardiomyopathy: biochemical and molecular analysis. J
148.
uting factor? Circulation. 2002;
150. alcium
151. RD, Mentzer RM Jr. Pyruvate augments calcium
hearts. Cell. 2000; 101:365-76.
154.
ailure. J Mol Cell Cardiol. 2007; 42:247-59.
156. weloh B, Guth K, Holmes JW, Pieske B, Lehnart SE, Just H, Hasenfuss G.
consumption in muscle strip preparations.
157.
158. i P, Corno AF, Raddatz E, Morel S, von Segesser LK, Samaja M.
159. annels as metabolic
sensors: studies of Kir6.x null mice. Diabetes. 2004; 53:S176-80.
Cardiac Failure. 1995; 1:285-91.
Marin-Garcia J, Goldenthal MJ. Mitochondrial DNA defects in cardiomyopathies.
Cardiovasc Pathol. 1998; 7:205-13.
149. Marks AR, Reiken S, Marx SO. Progression of heart failure: is protein kinase A
hyperphosphorylation of the ryanodine receptor a contrib
105:272-5.
Martin BJ, Valdivia HH, Bunger R, Lasley RD, Mentzer RM. Pyruvate augments c
transients and cell shortening in rat ventricular myocytes. Am J Physiol Heart Circ Physiol.
1998; 274:H8-17.
Martin BJ, Valvidia HH, Bunger R, Lasley
transients and cell shortening in rat ventricular myocytes. Am J Physiol. 1998; 274(1 Pt
2):H8-17.
152. Marx SO, Reiken S, Hisamatsu Y, Jayaraman T, Burkhoff D, Rosemblit N, Marks AR. PKA
phosphorylation dissociates FKBP12.6 from the calcium release channel (ryanodine
receptor): defective regulation in failing
153. Maurer I, Zierz S. Mitochondrial respiratory chain enzyme activities in tetralogy of Fallot.
Clin Investig. 1994; 72:358-63.
Messer AE, Jacques AM, Marston SB. Troponin phosphorylation and regulatory function in
human heart muscle: dephosphorylation of Ser23/24 on troponin I could account for the
contractile defect in end-stage heart f
155. Mewes T, Ravens U. L-type calciumcurrents of human myocytes from ventricle of non-
failing and failing hearts and from atrium. J Mol Cell Cardiol. 1994; 26:1307-20.
Meyer M, Ke
Frequency-dependence of myocardial energetics in failing human myocardium as quantified
by a new method for the measurement of oxygen
J Mol Cell Cardiol. 1998; 30(8):1459-70.
Michailova A, McCulloh A. Model study of ATP and ADP buffering, transport of Ca(2+) and
Mg(2+), and regulation of ion pumps in ventricular myocyte. Biophys J. 2001; 81:614-29.
Milano G, Bianciard
Myocardial impairment in chronic hypoxia is abolished by short aeration episodes:
involvement of K+ATP channels. Exp Biol Med. 2004; 229:1196-205.
Minami K, Miki T, Kadowaki T, Seino S. Roles of ATP-sensitive K+ ch
116
160. Mishra S, Gupta RC, Tiwari N, Sharov VG, Sabbah HN. Molecular mechanisms of reduced
sarcoplasmic reticulum Ca2+ uptake in human failing left ventricular myocardium. J Heart
Lung Transplant. 2002; 21(3): 366-73.
anger expression in left ventricle myocardium of dogs
162. r aspects of contractile
163.
argets. 2002; 6:291-8.
165. pholamban
irculation. 1992; 85:1743-50.
phospholamban, and
168.
a2+ release channel (ryanodine channel) in human myocardium. J Mol Med.
169. olck B, Schwinger RH, Hamm Ch, Kostin S, Schaper J,
contribute to contractile dysfunction in human hibernating myocardium.
170. to the concerted action of
171. .
t failure, I: experimental
173. l alterations observed in hyperglycaemic rats – what can
we learn from cell biology? Cur Diab Rev. 2005; 1:11-21.
161. Mishra S, Sabbah HN, Rastogi S, Imai M, Gupta RC. Reduced sarcoplasmic reticulum Ca2+
uptake and increased Na+-Ca2+ exch
with progression in heart failure. Heart Vessels. 2005; 20:23-32.
Mittmann C, Eschenhagen T, Scholz H. Cellular and molecula
dysfunction in heart failure. Cardiovasc Res. 1998; 39:267-75.
Morris K. Targeting the myocardial sodium-hydrogen exchange for treatment of heart
failure. Expert Opin Ther T
164. Morrow DA, Givertz MM. Modulation of myocardial energetics. Emerging evidence for a
therapeutic target in cardiovascular disease. Circulation. 2005; 112:3218-21.
Movsesian MA, Karimi A, Green K, Jones LR. Ca2+-transporting ATPase, phos
and calsequestrin levels in nonfailing and failing human myocardium. Circulation. 1994;
90:653-7.
166. Mulieri LA, Hasenfuss G, Leavitt B, Allen PD, Alpert NR. Altered myocardial force-
frequency relation in human heart failure. C
167. Munch G, Bolck B, Hoischen S, Brixius K, Bloch W, Reuter H, Schwinger RH. Unchanged
protein expression of sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase,
calsequestrin in terminally failing human myocardium. J Mol Med. 1998; 76: 434-41.
Munch G, Bolck B, Sugaru A, Schwinger RH. Isoform expression of the sarcoplasmic
reticulum C
2000; 78(6):352-60.
Nef HM, Mollmann H, Skwara W, B
Elsasser A.Reduced sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase activity and dephosphorylated
phospholamban
Mol Cell Biochem. 2006; 282(1-2):53-63.
Neumann D, Schlattner U, Wallimann T. A molecular approach
kinases involved in energy homeostasis. Biochem Soc Trans. 2003; 31:169-74.
Noma A. ATP regulated K+ channels in cardiac muscle. Nature. 1983; 385:147-8
172. O’Rourke B, Kass DA, Tomaselli GF, Kaab S, Tunin R, Marban E. Mechanisms of altered
excitation-contraction coupling in canine tachycardia-induced hear
studies. Circ Res. 1999; 84(5):562-70.
Oliveira PJ. Cardiac mitochondria
117
174. Ono K, Fozzard HA. Phosphorylation restores activity of L–type calcium channels after
rundown in inside-out patches from rabbit cardiac cells. J Physiol. 1992; 454:673-88.
Opie LH. Adequacy of oxygenati175. on of isolated perfused heart. Basic Res Cardiol. 1984;
176. , Di Venosa N, Federici A, Ruggiero FM. Decrease in
177. , Hallstrom S, Schaffer P, Lang P, Nadlinger K, Birkmayer GD, Vrecko K,
179. V, Weber CR, Chen X, Weisser-Thomas R, Margulies KB, Bers DM. Cellular
180. diovasc Res. 2003;
181. r M, Holubarsch C, Weirich J, Posival H, Minami K, Just
8-46.
184.
nd stage failing human myocardium. Basic Res
185. C-
186. + in animal models of
79:300-6.
Paradies G, Petrosillo G, Pistolese M
mitochondrial complex I activity in ischemic/reperfused rat heart. Involvement of reactive
oxygen species and cardiolipin. Circ Res. 2004; 94:53-9.
Pelzmann B
Reibnegger G, Koidl B. NADH supplementation decreases pinacidil-primed IK(ATP) in
ventricular cardiomyocytes by increasing intracellular ATP. Br J Pharmacol. 2003;
139(4):749-54.
178. Periasamy M, Huke S. SERCA level is a critical determinant of Ca2+ homeostasis and
cardiac contractility. J Mol Cell Cardiol. 2001; 33(6): 1053-63.
Piacentino
basis of abnormal calcium transients of failing human ventricular myocytes. Circulation.
2003; 92(6):651-8.
Pieske B, Houser SR. [Na+]i handling in the failing human heart. Car
57:874-86.
Pieske B, Kretschmann B, Meye
H, Hasenfuss G. Alterations in intracellular calcium handling associated with the inverse
force-frequency relation in human dilated cardiomyopathy. Circulation. 1995; 92(5):1169-
78.
182. Pieske B, Maier LS, Bers DM, Hasenfuss G. Ca2+ handling and sarcoplasmic reticulum Ca2+
content in isolated failing and nonfailing human myocardium. Circ Res. 1999; 85:3
183. Pieske B, Maier LS, Schmidt-Schweda S. Sarcoplasmic reticulum Ca2+ load in human heart
failure. Basic Res Cardiol. 2002; 97(1): I63-71.
Pieske B, Trost S, Schutt K, Minami K, Just H, Hasefuss G. Influence of forskolin on the
force-frequency behavior in nonfailing a
Cardiol. 1998; 93:66-75.
Piwnica-Worms D, Chiu ML, Kronauge JF. Divergent kinetics of 201TI and 99 mT
SESTAMIBI in cultured chick ventricular myocytes during ATP depletion. Circulation.
1992; 85:1534-41.
Pogwizd SM, Sipido KR, Verdonck F, Bers DM. Intracellular Na
hypertrophy and heart failure: contractile function and arrhythmogenesis. Cardiovasc Res.
2003; 57:887-96.
118
187. Poole-Wilson PA, Tones MA. Sodium exchange during hypoxia and reoxygenation in the
isolated rabbit heart. J Mol Cell Cardiol. 1988; 20:15-22.
Radad K, Rausch WD, Gille G. Rote188. none induces cell death in primary dopaminergic
189. infarction. The Heart and
190. rce-frequency relationship is
193. Perrier E, Fauconnier J, Perrier R, Pereira L, Gomez AM. Benitah J-P. “Ca2+-
195. ouser
196. , Gruppe IL. ATP depletion and mitochondrial functional loss during
197.
hemic slow and fast heart-rate hearts. J Bioenerg
198. phate in situ
fast heart
199.
3-8.
lation. 1996; 94:2837-42.
culture by increasing ROS production and inhibiting mitochondrial respiration. Neurochem
Int. 2006; 49(4):379-86.
Reimer KA, Jennings RB. Myocardial ischemia, hypoxia and
Cardiovascular System, edited by Fozzard HA et al. New York. 1992; 1875-1973.
Reuter H, Zobel C, Brixius K, Bolck B, Schwinger RH. The fo
dependent on Ca(2+)-influx via L-type- and SR-Ca(2+)- channels in human heart. Basic Res
Cardiol. 1999; 94(3):159-70.
191. Rice JJ, Jafri MS, Winslow RL. Modeling gain and gradedness of Ca2+ release in the
functional unit of the cardiac dyadic space. Biophys J. 1999; 77:1871-84.
192. Richard S, Leclercq F, Lemaire S, Piot C, Nargeot J. Ca2+ currents in compensated
hypertrophy and heart failure. Cardiovasc Res. 1998; 37:300-11.
Richard S,
induced Ca2+ entry” or how the L-type Ca2+ channel remodels its own signalling pathway in
cardiac cells. Prog Biophys Mol Biol. 2006; 90:118-35.
194. Roden DM, Balser JR, George AL, Anderson ME. Cardiac ion channels. Annu Rev Physiol.
2002; 64:431-75.
Rossman EI, Petre RE, Chaudhary KW, Piacentino V 3rd, Janssen PM, Gaughan JP, H
SR. Abnormal frequency-dependent responses represent the pathophysiologic signature of
contractile failure in human myocardium. J Mol Cell Cardiol. 2004; 36(1):33-42.
Rouslin W, Broge CW
ischemia in slow and fast-heart rate hearts. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 1990;
259:H1759-66.
Rouslin W, Broge CW, Guerrieri F, Capozza G. ATPase activity, IF1 content, and proton
conductivity of ESMP from control and isc
Biomembr. 1995; 27(4):459-66.
Rouslin W, Broge CW. Regulation of the mitochondrial adenosine 5’-triphos
during ischemia and in vitro in intact and sonicated mitochondria from slow and
rate species. Arch Biochem Biophys. 1990; 280:103-11.
Rouslin W. Mitochondrial complexes I, II, III, IV and V in myocardial ischemia and
autolysis. Am J Physiol. 1983; 224:H74
200. Sack MN, Rader TA, Park S, Bastin J, McCune SA, Kelly DP. Fatty acid oxidation enzyme
gene expression is downregulated in the failing heart. Circu
119
201. Sah R, Ramirez RJ, Kaprielian R, Backx PH. Alterations in action potential profile enhance
excitation-contraction coupling in rat cardiac myocytes. J Physiol. 2001; 533:201-14.
202. Sande JB, Sjaastad I, Hoen IB, Bokenes J, Tonnessen T, Holt E, Lunde PK, Christensen G.
Reduced level of serine(16) phosphorylated phospholamban in the failing rat myocardium: a
203.
. Am J Physiol Heart Circ Physiol.
204.
not due to disturbed mitochondrial gene expression. J Am Coll Cardiol.
205. , Hasenfuss G, Pieske B.
206. J, Kim CS, Lebeche D, Doye AA, Gwathmey JK. Human heart failure:
ban. Am J Physiol. 1999; 277:H474-80.
208. inger RH, Brixius K, Bavendiek U, Hoischen S, Muller-Ehmsen J, Bolck B, Erdmann
13-20.
ll Cardiol. 1998; 30:1311-28.
major contributor to reduced SERCA2 activity. Cardiovasc Res. 2002; 53(2):382-91.
Sasaki N, Sato T, Marban E, O’Rourke B. ATP consumption by uncoupled mitochondria
activates sarcolemmal KATP channels in cardiac myocytes
2001; 280:H1882-8.
Scheubel RJ, Tostlebe M, Simm A, Rohrbach S, Prodzinsky R, Gellerich FN, Silber R-E,
Holtz J. Dysfunction of mitochondrial respiratory chain complex I in human failing
myocardium is
2002; 40:2174-81.
Schlotthauer K, Schattmann J, Bers DM, Minan K, Just H
Frequency-dependent changes in contribution of SR Ca2+ to Ca2+ transients in failing human
myocardium assessed with ryanodine. J Mol Cell Cardiol. 1998; 30:1285-94.
Schmidt U, Hajjar R
cAMP stimulation of SR Ca2+-ATPase activity and phosphorylation level of
phospholam
207. Scholz TD, Laughlin MR, Balaban RS, Kupriyanov VV, Heineman FW. Effect of substrate
on mitochondrial NADH, cytosolic redox state, and phosphorylated compounds in isolated
hearts. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 1995; 268:H82-91.
Schw
E. Effect of cyclopiazonic acid on the force-frequency relationship in human nonfailing
myocardium. J Pharmacol Exp Ther. 1997; 283(1):286-92.
209. Schwinger RH, Bundgaard H, Muller-Ehmsen J, Kjeldsen K. The Na, K-ATPase in the
failing human heart. Cardiovasc Res. 2003; 57:9
210. Semb SO, Lunde PK, Holt E, Tonnessen T, Christensen G, Sejersted OM. Reduced
myocardial Na+, K+-pump capacity in congestive heart failure following myocardial
infarction in rats. J Mol Ce
211. Serysheva II, Ludtke SJ, Baker MR, Chiu W, Hamilton SL. Structure of the voltage–gated
L-type Ca2+ channel by electron cryomicroscopy. Proc Natl Acad Sci USA. 2002; 99:10370-
5.
212. Sharov VG, Goussev A, Lesh M, Goldstein S, Sabbah HN. Abnormal mitochondrial
function in myocardium of dogs with chronic heart failure. J Mol Cell Cardiol. 1998;
30:1757-62.
120
213. Sharov VG, Todor AV, Silverman N, Goldstein S. Sabbah HN. Abnormal mitochondrial
respiration in failed human myocardium. J Mol Cell Cardiol. 2000; 32:2361-7.
215. . Ionic basis of ischemic cardiac injury: insights from cellular
216. tion, and
217.
a new target for therapy? Cardiovasc Res. 2002; 53:782-805.
in patients with hypertrophic
221. n electric field mechanism for transmission of excitation between
222.
J Physiol
223.
. Physiol Rev. 2005; 85:1093-129.
225. tts JA, London RE. Correlation between cytosolic free
226. , Peltonen L, Somer H. Inherited
214. Shigematsu S, Arita M. Anoxia-induced activation of ATP-sensitive K+ channels in guinea
pig ventricular cells and its modulation by glycolysis. Cardiovasc Res. 1997; 35:273-82.
Silverman HS, Stern MD
studies. Cardiovasc Res. 1994; 28:581-97.
Simmerman HKB, Jones LR. Phospholamban: protein structure, mechanism of ac
role in cardiac function. Physiol Rev. 1998; 78:921-47.
Sipido KR, Volders PG, Vos MA, Verdonck F. Altered Na/Ca exchange activity in cardiac
hypertrophy and heart failure:
218. Snyders DJ. Structure and function of cardiac potassium channels. Cardiovasc Res. 1999;
42(2):377-90.
219. Solaini G, Harris DA. Biochemical dysfunction in heart mitochondria exposed to ischaemia
and reperfusion. Biochem J. 2005; 390:377-94.
220. Somura F, Izawa H, Iwase M, Takeichi Y, Ischiki R, Nishiwaza T, Noda A, Nagata K,
Yamada Y, Yokota M. Reduced myocardial sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase mRNA
expression and biphasic force-frequency relations
cardiomyopathy. Circulation. 2001; 104:658-63.
Sperelakis N. A
myocardial cells. Circ Res. 2002; 91(11):985-7.
Squires JE, Sun J, Caffrey JL, Yoshishige D, Mallet RT. Acetoacetate augments β-
adrenergic inotropism of stunned myocardium by antioxidant mechanism. Am
Heart Circ Physiol. 2003; 284:H1340-7.
Stanley WC, Recchia FA, Lopachuk GD. Myocardial substrate metabolism in the normal
and failing heart
224. Starling RC, Hammer DF, Altschuld RA. Human myocardial ATP content and in vivo
contractile function. Mol Cell Biochem. 1998; 180:171-7.
Steenbergen C, Murphy E, Wa
calcium, contracture, ATP, and irreversible ischemic injury in perfused rat heart. Circ Res.
1990; 66:135-46.
Suomalainen A, Paetau A, Leinonen H, Majander A
idiopathic dilated cardiomyopathy with multiple deletions of mitochondrial DNA. Lancet.
1992; 340:1319-20.
227. Sward K, Dreja K, Lindqvist A, Persson E, Hellstrand P. Influence of mitochondrial
inhibition on global and local [Ca2+](I) in rat tail artery. Circ Res. 2002; 90(7):792-9.
121
228. Szewczyk A, Pikula S. Adenosine 5’-triphosphate: an intracellular metabolic messenger.
Biochim Biophys Acta. 1998; 1365:333-53.
229. Takahashi T, Allen PD, Lacro RV, Marks AR, Dennis AR, Schoen FJ, Grossman W, Marsh
JD, Izumo S. Expression of dihydropyridine receptor (Ca2+ channel) and calsequestrin genes
in the myocardium of patients with end-stage heart failure. J Clin Invest. 1992; 90:927-35.
231. erbonne JM, Levitan ES. Distribution, splicing and glucocorticoid-
232.
in T mutations result in allele-specific phenotypes in a mouse model for
233.
rdiovasc Res.
234.
l Cell Cardiol. 1998; 30:2327-39.
Cardiovasc Res. 2000; 48:300-9.
rdiol. 1997; 29:2441-50.
; 28:103-12.
230. Takeo S, Nasa Y. Role of energy metabolism in the preconditioned heart – a possible
contribution of mitochondria. Cardiovasc Res. 1999; 43:32-43.
Takimoto K, Li D, N
induced expression of cardiac alpha 1C and alpha 1D voltage-gated Ca2+ channel mRNAs. J
Mol Cell Cardiol. 1997; 29(11):3035-42.
Tardiff JC, Hewett TE, Palmer BM, Olsson C, Factor SM, Moore RL, Robbins J, Leinwand
LA. Cardiac tropon
hypertrophic cardiomyopathy. J Clin Invest. 1999; 104:469-81.
Taylor DG, Parilak LD, LeWinter MM, Knot HJ. Quantification of the rat left ventricle
force and Ca2+-frequency relationships: similarities to dog and human. Ca
2004; 61:77-86.
Tejero-Taldo MI, Sun J, Caffrey JL, Mallet RT. Pyruvate potentiates β-adrenergic
inotropism of stunned guinea-pig myocardium. J Mo
235. Tejero-Taldo MS, Caffrey JL, Sun J, Mallet RT. Antioxidant properties of pyruvate mediate
its potentiation of β-adrenergic inotropism in stunned myocardium. J Mol Cell Cardiol.
1999; 31:1862-72.
236. Territo PR, French SA, Dunleavy MC, Evans FJ, Balaban RS. Calcium activation of heart
mitochondrial oxidative phosphorylation: rapid kinetics of mVO2, NADH, AND light
scattering. J Biol Chem. 2001; 276:2586-99.
237. Tomaselli GF, Marban E. Electrophysiological remodelling in hypertrophy and heart failure.
Cardiovasc Res. 1999; 42:270-83.
238. Tsuji Y, Opthof T, Kamiya K, Yasui K, Liu W, Lu Z, Kodama II. Pacing-induced heart
failure causes a reduction of delayed rectifier potassium currents along with decreases in
calcium and transient outward currents in rabbit ventricle.
239. Vanden Hoek TL, Shao Z, Li C, Schumacker PT, Becker LB. Mitochondrial electron
transport can become a significant source of oxidative injury in cardiomyocytes. J Mol Cell
Ca
240. Vander Heide RS, Hill ML, Reimer KA, Jennings RB. Effect of reversible ischemia on the
activity of the mitochondrial ATPase: relationship to ischemic preconditioning. J Mol Cell
Cardiol. 1996
122
241. Verdonck F, Volders PG, Vos MA, Sipido KR. Increased Na+ concentration and altered
Na/K pump activity in hypertrophied canine ventricular cells. Cardiovasc Res. 2003;
242. IE.
243. ATP flux through creatine kinase in the normal,
244. sushima R, Fishman GI, Backx PH.
. Ethyl pyruvate preserves cardiac function and attenuates oxidative injury
246. C, Lai FA, Walsh MP, Warltier DC, Cheng
247. Phenotypic deficits in mice expressing a
249. g GN. Differential effects of myocardial infarction
phosphorylation. Pflugers Arch.
251.
ssinen I. Reversible ischemic inhibition of F(1)F(0)-ATPase in rat and
252.
le cells of rat mesenteric artery. Am J Physiol. 1997;272(2):H814-9.
57:1035-43.
Vuorinen K, Ylitalo K, Peuhkurinen K, Raatikainen P, Ala-Rami A, Hassinen
Mechanisms of ischemic preconditioning in rat myocardium. Circulation. 1995; 91:2810-8.
Weiss RG, Gerstenblith G, Bottomley PA.
stressed, and failing human heart. Proc Natl Acad Sci USA. 2005; 102:808-13.
Wickenden AD, Kaprielian R, Kassiri Z, Tsoporis JN, T
The role of action potential prolongation and altered intracellular calcium handling in the
pathogenesis of the heart failure. Cardiovasc Res. 1998; 37:312-23.
245. Woo YJ, Taylor MD, Cohen JE, Jayasankar V, Bish LT, Burdick J, Pirolli TJ, Berry MF,
Hsu V, Grand T
after prolonged myocardial ischemia. J Thorac Cardiovasc Surg. 2004; 127:1262-9.
Xiao B, Jiang MT, Zhao M, Yang D, Sutherland
H, Chen SR. Characterization of a novel PKA phosphorylation site, serine-2030, reveals no
PKA hyperphosphorylation of the cardiac ryanodine receptor in canine heart failure. Circ
Res. 2005; 96:847-55.
Yang Q, Osinska H, Klevitsky R, Robbins J.
myosin binding protein C lacking the titin and myosin binding domains. J Mol Cell Cardiol.
2001; 33:1649-58.
248. Yanos J, Patti MJ, Stanko R. Hemodynamic effects of intravenous pyruvate in the intact,
anesthetized dog. Crit Care Med. 1994; 22:844-50.
Yao JA, Zhou YY, Jiang M, Fan JS, Tsen
on transient outward, delayed rectifier and inward rectifier currents in rat ventricle. Biophys
J. 1997; 72:A143.
250. Yazawa K, Kameyama A, Yasui K, Li JM, Kameyama M. ATP regulates cardiac Ca2+
channel activity via a mechanism independent of protein
1997; 433(5):557-62.
Ylitalo K, Ala-Rami A, Vuorinen K, Peuhkurinen K, Lepojarvi M, Kaukoranta P,
Kiviluoma K, Ha
human myocardium. Biochim Biophys Acta. 2001; 1504(2-3):329-39.
Yokoshiki H, Katsube Y, Sperelakis N. Regulation of Ca2+ channel currents by intracellular
ATP in smooth musc
123
253. Yuhki KI, Miyauchi T, Kakinuma Y, Murakoshi N, Maeda S, Goto K, Yamaguchi I, Suzuki
T. Endothelin-1 production is enhanced by rotenone, a mitochondrial complex I inhibitor, in
254.
-
255. le A. OXPHOS defects and
256.
ation-dependent and –independent cell death:
257.
:1115-23.
259. skamper J, Mejia-Alvarez R, Blatter LA. Pyruvate modulates cardiac
cultured rat cardiomyocytes. J Cardiovasc Pharmacol. 2001; 38(6):850-6.
Yuki T, Yamaoka K, Seyama I. Regulation of L- and N-types of Ca2+ channels by
intracellular ATP4- infrog dorsal root ganglion neurons. Pflugers Arch. 1999; 438(2): 117
21.
Zeviani M, Mariotti C, Antozzi C, Fratta GM, Rustin P, Prel
mitochondrial DNA mutations in cardiomyopathy. Muscle Nerve. 1995; 3:S170-4.
Zhang JG, Tirmenstein MA, Nicholls-Grzemski FA, Fariss MW. Mitochondrial electron
transport inhibitors cause lipid peroxid
protective role of antioxidants. Arch Biochem Biophys. 2001; 393:87-96.
Zheng J, Ramirez VD. Inhibition of mitochondrial proton F0F1-ATPase/ATP synthase by
polyphenolic phytochemicals. British J of Pharmacol. 2000; 130
258. Zhou Z, Lasley RD, Hegge JO, Bunger R, Mentzer RM. Myocardial stunning: A therapeutic
conundrum. J Thorac Cardiovasc Surg. 1995; 110:1391-401.
Zima AV, Kock
sarcoplasmic reticulum Ca2+ release in rats via mitochondria-dependent and independent
mechanisms. J Physiol. 2003; 550:765-83.
260. Zweier JL, Jacobus WE. Substrate-induced alterations of high energy phosphate metabolism
and contractile function in the perfused heart. J Biol Chem. 1987; 262:8015-21.
124
8. PASKELBTI DARBAI
niai Straips
1
komple
C
2
respira
myocar
3. V. G
moduli uanian
Jo
4. I. M
human heart failure: effect of pyruvate and isoproterenol. Rocz. Akad. Med. Bialymst. 2005;
5
5. D. Z vilienė, I. Martišienė, R. Treinys, J.Jurevičius. Oksidacinio fosforilinimo
sk
Journal
6. V. G
dažnio, enalino įtaka žmogaus miokardo susitraukimui esant įvairioms širdies
pa
7. H. G nė, D. Zablockaitė, I. Martišienė, A. Stankevičius. Prokainamido ir jo
su
elektro
8
kalio k tės
miokardo elektromechaniniam aktyvumui. Medicina 2006 (Kaunas); 42(9): 829-35.
. V. Gendvilienė, I. Martišienė, D. Zablockaitė, J. Jurevičius. Mitochondrijų kvėpavimo grandinės
ksų blokavimo įtaka miokardo elektromechaniniam aktyvumui. Lithuanian Journal of
ardiology. 2003; 2:120-5.
. V. Gendvilienė, I. Martišienė, D. Zablockaitė, J. Jurevičius. Effect of inhibition of mitochondrial
tory chain complexes and ATP-synthase on the electromechanical activity of rat
dium. Biologija. 2004; 2 (2 priedas): 33-5.
endvilienė, D. Zablockaitė, H. Gurskaitė, I. Martišienė, A. Stankevičius. Kalio kanalų (KACh)
atorių anticholinerginis poveikis prieširdžių elektromechaniniam aktyvumui. Lith
urnal of Cardiology, 2004; 11(3): 183-7.
artišienė, V. Gendvilienė, D. Zablockaitė, H. Gurskaitė. The force-frequency relationship in
0:241-3.
ablockaitė, V. Gend
yriklio FCCP poveikis žmogaus ir žiurkės miokardo elektromechaniniam aktyvumui. Lithuanian
of Cardiology 2005; 12(1): 55-9.
endvilienė, D. Zablockaitė, I. Martišienė, H. Gurskaitė, J. Jurevičius, R. Benetis. Dirginimo
Ca2+ jonų ir izopr
tologijoms. Lithuanian Journal of Cardiology 2005; 12(2): 123-9.
urskaitė, V. Gendvilie
lfonilkarbamidinių analogų anticholinerginis poveikis jūrų kiaulyčių prieširdžių
mechaniniam aktyvumui. Medicina 2005 (Kaunas); 41(12):1054-60.
. V. Gendvilienė, D. Zablockaitė, H. Gurskaitė, I. Martišienė, A. Stankevičius. ATF-reguliuojamų
analų moduliatorių, N-(2-piridil)-N’-(4-toluol) sulfonilkarbamidų, įtaka jūrų kiauly
125
9
uncoup
myocar
Tezės
1. I. Martišienė, A. Babušytė, V. Gendvilienė. Piruvato įtaka žmogaus miokardo elektromechaninio
a
jaunųjų io 19–30
d
2. I. M ų ir ATP sintazės
b
asis su raj.), 2004 m.
b
3
human
Inform en, Branicki Palace, Bialystok [Poland],
2
4. I. Martišienė, V. Gendvilienė. Piruvato ir β-adrenerginių agonistų įtaka miokardo jėgos – dažnio
priklausomybei esant širdies nepakankamumui. Lietuvos sveikatos mokslų studentų ir jaunųjų
tyrėjų konferencija, KMU Studentų mokslinė draugija. Kaunas, 2005 m. balandžio 28 d. – gegužės
5 d.; p. 51-52.
5. V. Gendvilienė, D. Zablockaitė, I. Martišienė, J. Jurevičius, R. Benetis. Effect of Ca2+ and
stimulation frequency on the contraction force of failing human myocardium. 15th World Congress
WSCTS (World Society of Cardio-Thoracic Surgeons). Vilnius, 2005 June 19–23; Abstracts. The
Journal of Cardiovascular Surgery; 46 (suppl. 1 to No. 3): p. 140-141.
6. D. Zablockaitė, V. Gendvilienė, I. Martišienė, H. Gurskaitė, J. Jurevičius. Oksidacinio
fosforilinimo skyriklio FCCP ir ATP-sintazės slopiklio oligomicino įtaka žmogaus miokardo
elektromechaniniam aktyvumui. Lietuvos biochemikų draugijos IX-asis suvažiavimas–konferencija.
Biochemija: mokslas ir žinių visuomenė. Tolieja (Molėtų raj.), 2006 m. birželio 16–18 d.d., p. 83-
84.
. D. Zablockaitė, V. Gendvilienė, I. Martišienė, J. Jurevičius. Effect of oxidative phosphorylation
ler FCCP and F1F0-ATPase inhibitor oligomycin on the electromechanical activity of human
dium. Adv. Med. Sci. 2007; 52:89-93.
ktyvumo parametrų priklausomybei nuo dirginimo dažnio. Lietuvos sveikatos mokslų studentų ir
tyrėjų konferencija, KMU Studentų mokslinė draugija. Kaunas, 2004 m. balandž
.d., p. 33-34.
artišienė, V. Gendvilienė. Mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleks
lokavimo įtaka miokardo elektromechaniniam aktyvumui. Lietuvos biochemikų draugijos VIII-
važiavimas–konferencija. Biochemija mokslų sandūroje. Tolieja (Molėtų
irželio 18–20 d.d.; p. 50.
. I. Martišienė, V. Gendvilienė, D. Zablockaitė, H. Gurskaitė. The force-frequency relationship in
heart failure: effect of pyruvate and isoproterenol. Euroregional conference on Building
ation Society in the Healthcare in Euroregion Niem
005 February 17–19; Programme and Book of Abstracts, p. 36.
126
Pranešimai
nė, A. Babušytė, V. Gendvilienė. Piruvato įtaka žmogaus miokardo elektromechaninio
. I. Martišienė, V. Gendvilienė. Piruvato ir β-adrenerginių agonistų įtaka miokardo jėgos – dažnio
. I. Martišienė, V. Gendvilienė, D. Zablockaitė. Effect of pyruvate and β-adrenoceptors agonists on
u universitetas, Estija, 2005 m. birželio 15 d. – 21 d.
draugijos IX-asis suvažiavimas–konferencija. Biochemija: mokslas ir žinių visuomenė.
olieja (Molėtų raj.), 2006 m. birželio 16 d. – 18 d.
human heart. Baltic Summer School 2006 „Stem Cell
iology: future perspectives and possible treatment options“. Kylio universitetas, Vokietija, 2006
1. I. Martišie
aktyvumo parametrų priklausomybei nuo dirginimo dažnio. Lietuvos sveikatos mokslų studentų ir
jaunųjų tyrėjų konferencija, KMU Studentų mokslinė draugija. Kaunas, 2004 m. balandžio 19 d.
2
priklausomybei esant širdies nepakankamumui. Lietuvos sveikatos mokslų studentų ir jaunųjų
tyrėjų konferencija, KMU Studentų mokslinė draugija. Kaunas, 2005 m. gegužės 4 d.
3
the force-frequency relationship in human heart failure. First Nordic-Baltic postgraduate summer
school in cellular bioenergetics “Mitochondria in myocytes: methodological aspects and
dysfunction in cardiovascular disease”. Tart
4. D. Zablockaitė, V. Gendvilienė, I. Martišienė, H. Gurskaitė, J. Jurevičius. Oksidacinio
fosforilinimo moduliatorių įtaka žmogaus miokardo elektromechaniniam aktyvumui. Lietuvos
biochemikų
T
5. I. Martišienė, V. Gendvilienė, D. Zablockaitė. Effect of pyruvate and β-adrenoceptors agonists on
the electromechanical activity in failing
B
m. rugpjūčio 20 d. – rugsėjo 10 d.
127
PADĖKA
Nuoširdžiai dėkoju darbo vadovei habil. dr. Vidai Gendvilienei ir konsultantui, laboratorijos
čiui už suteiktas teorines bei praktines žinias ir pagalbą, atliekant
s: dr. Reginai Mačianskienei, dr. Rimutei Prievelienei, dr. Rimantui
o bei rašymo metu.
vedėjui, habil. dr. Jonui Jurevi
eksperimentus bei rengiant disertaciją.
Nuoširdžiai dėkoju dr. Danguolei Zablockaitei už praktinius, metodinius patarimus ir pagalbą,
atliekant eksperimentus. Taip pat dėkoju visiems buvusiems ir esantiems Membranų biofizikos
laboratorijos darbuotojam
Treiniui, dr. Hertai Gurskaitei, vyr. inž. Antanui Navalinskui, inž. Vandai Burbulytei už
konsultacijas ir visapusišką pagalbą.
Darbo vadovei, visiems darbuotojams ir artimiesiems ypatingai esu dėkinga už nuoširdų
moralinį palaikymą disertacijos rengim
128
