MOLEKULRIS LENYOMAT POLIMER

VKONYRTEGEK KSZTSE FELLETI

PLAZMON REZONANCIA RZKELSEN

ALAPUL BIOSZENZORHOZ

Diplomamunka

Ksztette: Bognr Jlia

Tmavezet: Dr. Horvth Viola

Konzulens: Dr. Gyurcsnyi Ervin Rbert

Budapesti Mszaki s Gazdasgtudomnyi Egyetem

Szervetlen s Analitikai Kmia Tanszk

Budapest, 2010.

- 1 -

Tartalomjegyzk

Tartalomjegyzk ............................................................................................................. 1

Alkalmazott rvidtsek jegyzke.................................................................................. 4

1. Bevezets .................................................................................................................. 6

2. Irodalmi ttekints .................................................................................................. 8

2.1. Molekulris lenyomat polimerek ............................................................................ 8

2.2. Fehrje templt imprintelsnek nehzsgei ............................................................. 9

2.3. Fehrje-imprintelsi stratgik ................................................................................ 10

2.3.1. Hrom dimenzis lenyomatok hidroglek ................................................ 11

2.3.2. Ktdimenzis lenyomatok - felleti imprintels.......................................... 14

2.3.2.1. Vkony film ellltsi mdszerek ......................................................... 18

2.3.3. Epitp-mdszer ............................................................................................ 19

3. Ksrletek ............................................................................................................... 22

3.1. Vegyszerek .............................................................................................................. 22

3.2. Eszkzk, mszerek ................................................................................................ 23

3.3. Mdszerek ............................................................................................................... 23

3.3.1. EDOT kmiai polimerizcija ..................................................................... 23

3.3.2. EDOT fotokmiai polimerizcija............................................................... 24

3.3.3. Oligotron toldsa vizes kzegbe ................................................................ 24

3.3.4. Electrospotting t ksztse s vizsglata .................................................... 25

3.3.4.1. Pipettahegy hidrofilizlsa...................................................................... 25

3.3.4.2. Szigetel toldat kialaktsa ..................................................................... 25

3.3.5. Imprintelt polimerfilmek ellltsa ............................................................ 26

3.3.5.1. Polimerfilm ellltsa arany elektrd felletn ..................................... 26

3.3.5.2. Polimerfilm ellltsa SPR chip felletn ............................................. 28

3.3.6. Fehrje-ktds vizsglata a polimer filmeken ........................................... 29

3.3.6.1. Fehrje felvitele a polimer filmekre........................................................ 29

3.3.6.2. Megkttt fehrje mennyisgnek meghatrozsa ................................. 30

3.3.6.3. Mossi lpsek........................................................................................ 30

- 2 -

3.3.7. Nanorszecskk mdostsa......................................................................... 31

3.3.7.1. Avidin blokkolsa biotinnal.................................................................... 31

3.3.8. A visszaktds kirtkelse ....................................................................... 31

4. Eredmnyek s rtkelsk .................................................................................. 33

4.1. Kmiai s fotokmiai polimerizci ....................................................................... 34

4.1.1. EDOT kmiai polimerizcija ..................................................................... 34

4.1.2. EDOT fotokmiai polimerizcija............................................................... 35

4.1.3. Oligotron toldsa vizes kzegbe ................................................................ 35

4.2. Electrospotting t ksztse s vizsglata................................................................ 36

4.3. Imprintelsi ksrletek ............................................................................................. 37

4.3.1. Egylpses imprintels................................................................................. 38

4.3.2. Ktlpses imprintels ................................................................................. 40

4.3.2.1. Avidin-HRP-re imprintelt EDOT-PSS filmek........................................ 40

4.3.2.2. Avidinre imprintelt EDOT-PSS filmek .................................................. 42

4.3.2.3. Avidinre imprintelt EDOT-PSSM filmek............................................... 44

4.3.3. Imprintels nanorszecskhez kapcsolt templttal ...................................... 46

4.3.3.1. Nanorszecskk mdostsa avidinnel.................................................... 46

4.3.3.2. Mdostatlan nanorszecskk vizsglata ................................................ 50

5. sszefoglals .......................................................................................................... 58

6. Ksznetnyilvnts .............................................................................................. 60

7. Irodalomjegyzk .................................................................................................... 61

8. Fggelk ................................................................................................................. 68

8.1. Kalibrcis adatok a tormaperoxidz enzim aktivitsnak mrshez ................... 69

8.1.1. Kalibrcis adatok avidin-HRP aktivitsnak mrshez ........................... 69

8.1.2. Kalibrcis adatok biotin-HRP aktivitsnak mrshez ............................ 72

8.1.3. Kalibrcis adatok HRP aktivitsnak mrshez....................................... 74

8.2. Grafikonok forrsadatai........................................................................................... 75

8.2.1. Egy lpsben imprintelt polimer filmek ltal visszakttt avidin-HRP

mennyisge (8. bra) ............................................................................................... 75

- 3 -

8.2.2. Kt lpsben imprintelt PEDOT-PSS filmek ltal visszakttt avidin-HRP

mennyisge (9. bra) ............................................................................................... 76

8.2.3. Kt lpsben imprintelt PEDOT-PSS filmek ltal tlagosan visszakttt

avidin mennyisge, detektls biotin-HRP kapcsolsval (10. bra)...................... 77

8.2.4. Kt lpsben imprintelt PEDOT-PSSM filmek ltal tlagosan visszakttt

avidin mennyisge (11. bra) .................................................................................. 79

8.2.5. Ultrahangos kezels hatsa a peroxidz enzim aktivitsra (14. bra) ........ 81

8.2.6. Biotin-HRP s HRP visszaktdse fluidMAG-biotinra imprintelt

polimereken (17. bra) ............................................................................................ 81

8.2.7. Hozzfrhet biotin mennyisge oxlsavas kezels eltt s utn (18. bra) 82

8.3. Az egy-egy fluidMAG-biotin nanorszecskkhez kapcsold biotinok szma...... 83

8.4. A fluidMAG-biotin nanorszecskkkel trtn imprintels sorn kialakul biotin-

kthelyek vrhat szma................................................................................. 84

8.5. FluidMAG-biotin nanorszecskkkel imprintelt polimer rtegek vastagsgnak

meghatrozsa AFM felvtel alapjn ............................................................... 85

8.5.1. A 25 ciklussal polimerizlt, imprintelt polimer vastagsga......................... 86

8.5.2. Az 50 ciklussal polimerizlt, imprintelt polimer vastagsga ....................... 89

8.5.3. A 100 ciklussal polimerizlt, imprintelt polimer vastagsga....................... 92

8.5.4. A 200 ciklussal polimerizlt, imprintelt poliemr vastagsga....................... 94

- 4 -

Alkalmazott rvidtsek jegyzke

(MAAP)2-Tb(III) metakriloil-amidoantipirin-terbium

AAm akrilamid

AcPABA N-akriloil-para-aminobenzamidin

AMPS 2-akrilamido-2-metilpropnszulfonsav

APBA 3-aminofenilboronsav

APEOS -aminopropiltrietoxisziln

APS ammnium-perszulft

A-CD akriloil--ciklodextrin

BisAm N,N-metilnbisz(akrilamid)

BSA bovine serum albumin, marhaszrum albumin

CRP C-reaktv protein

Cyt citokrm-c

DHEBisAm N,N-(1,2-dihidroxietiln)-biszakrilamid

DMAEMA 2-(dimetilamino)etilmetakrilt

DMAPAAm N,N-dimetilaminopropil-akrilamid

DPA dipikolinsav

EDMA etilnglikoldimetakrilt

EDOT etiln-dioxitofn

Fbgn fibrinogn

HAPEOS (2-hidroxietil)-aminopropiltrietoxisziln

Hb hemoglobin

HEMA hidroxietilmetakrilt

HFP hexafluoropropiln

hGH human growth hormone, humn nvekedsi faktor

HRP horseradish peroxidase, tormaperoxidz enzim

IgG immunoglobulin

Lys lizozim

- 5 -

MAA metakrilsav

MAH-Cu(II) metakriloil-Cu(II)L-hisztidin komplex

MAPTAC 3-metakrilamidopropil-trimetilammnium klorid

Mb mioglobin

MW molecular weight, mltmeg

Na-PSS poli(ntrium-4-sztirolszulfont)

Na-PSSM poli(ntrium-4-sztirolszulfont-ko-maleint)

NIPAAm N-izopropil-akrilamid

NPPC o-(4-nitrofenilfoszforil)kolin

PB phospate buffer, foszft puffer

PBS phosphate buffered saline, foszft pufferelt soldat

PEG-A poli(etilnglikol) 200 diakrilt

PMOS propiltrimetoxisziln

PS polisztirol

PSS poli(sztirolszulfonsav)

PSSM poli(sztirolszulfonsav-ko-maleinsav)

RNAse ribonuklez

SPR surface plasmon resonance, felleti plazmon rezonancia

TEM transzmisszis elektronmikroszkp

TEMED N,N,N,N-tetrametilndiamin

TEOS tetraetoxisziln

tf. trfogat

TMB 3,3,5,5-tetrametilbenzidin

wt% tmegszzalk

- 6 -

1. Bevezets

A molekulris lenyomat polimerek (MIP, molecularly imprinted polymer) olyan

szorbensek, amelyek az immunreakcikhoz hasonl szelektivitssal s erssggel

kpesek felismerni s megktni egy kivlasztott vegyletet, a templtot. A MIP-ek

annak ksznhetik e klnleges tulajdonsgukat, hogy ellltsuk a szelektven

megktni kvnt vegylet jelenltben trtnik; a clszeren megvlasztott monomerek

a templt kr rendezdnek, azzal kovalens vagy msodlagos ktseket alaktanak ki,

majd ebben az elrendezsben rgzlve polimerizldnak. A templt ezutn kimoshat a

szilrd, ersen keresztkttt polimerbl, s gy olyan mikroprusokat hagy htra,

amelyek alakjukat s a kthelyek elrendezst tekintve a templt komplementert

alkotjk.

A clvegylet az irodalom tlnyom tbbsgben viszonylag egyszer molekula:

gygyszer [1,2,3], nvnyvdszer [4,5,6], vagy kismret biomolekula, pl. cukor,

aminosav [7,8,9]. A ktezres vek ta azonban a nagy molekulk, pl. fehrjk

lenyomatkpzse is a kutatsok homlokterbe kerlt [10,11,12], st egsz sejtekre is

kszlnek lenyomatok [13,14,15]. A fehrje-imprintels napjainkban mg

viszonylagosan szkebb irodalmnak oka azokban a nehzsgekben keresend, amelyek

a templt nagy mrete s komplex szerkezete miatt lpnek fel.

Az ezen problmk megoldsra irnyul trekvsek kt f csoportba sorolhatak

aszerint, hogy a nagy mret fehrjk diffzijt mikppen biztostjk a polimerben. Az

egyik lehetsg alacsony keresztktttsg polimer tmbk (glek) ellltsa, a msik

vkony, de ersen keresztkttt filmek polimerizlsa, melyek csak a felletkn (azaz

jl hozzfrhet helyen) tartalmazzk a fehrje lenyomatt.

Diplomamunkm sorn fehrje lenyomat polimer vkonyrtegeket lltottam el.

Kutatsaim kitztt clja olyan krlmnyek kidolgozsa volt, amelyek kztt

mikrocseppent robottal lehet a polimerizcis elegyet egy szenzor felletre juttatni, ott

valamilyen mdon bepolimerizlni, majd kpalkot felleti plazmon rezonancia

(imaging Surface Plasmon Resonance, iSPR) kszlkben vgezni a mossi s

visszaktdsi lpseket, ahol ezek kzvetlenl detektlhatak is.

A vlasztott iSPR rzkels elnye, hogy egyidejleg nagy szm minta

vizsglatra alkalmas. gy a fejlesztsi fzisban az adott fehrje szelektv felismersre

gyorsan optimalizlhat a monomer-sszettel. Ezt kveten pedig, az (igen tvoli)

- 7 -

alkalmazsi fzisban egyetlen mintbl szmos fehrje mennyisgi meghatrozst teszi

lehetv azltal, hogy egy szenzoron tbb, klnbz fehrjre szelektv MIP film

helyezhet el.

A polimer filmeket elszr kmiai s fotokmiai ton prbltam ellltani, de

vgl az elektrokmiai polimerizci bizonyult clravezetnek.

Az imprintelsi ksrleteket avidin modellfehrjvel vgeztem, amelyet a szenzor

felletre adszorbeltattam, s egy olyan vkony1 poli(etilndioxitiofn) rteget

igyekeztem kr nveszteni, amelybl a fehrje szabad kijutsa mg biztostott. Az

imprintelhet fellet nvelse rdekben, valamint, hogy a megengedett polimer

vastagsg jval nagyobb, teht knnyebben kontrolllhat lehessen, a fehrjt 100 nm

tmrj rszecskkhez kapcsoltam.

Habr a ksrleteim egyelre gyenge reproduklhatsga mg gtat szabott a

komolyabb sikerek elrsnek, a mdszer mindenkppen gretesnek ltszik a

lenyomatkpzs jszer megvalstsra.

1 Az avidin molekula mrete ~10 nm, gy a templtot be nem fed polimer rteg vastagsga

legfeljebb 5 nm lehet.

- 8 -

2. Irodalmi ttekints

2.1. Molekulris lenyomat polimerek

A molekulris lenyomat polimerek ellltshoz hasznlt prepolimerizcis

elegy a clmolekuln (templton) kvl az azzal klcsnhatsba lp funkcionlis

monomer(eke)t, ktrtk monomer(eke)t, inicitort, valamint oldszert is tartalmaz. A

ktrtk, n. keresztkt monomer szerepe a polimer trhlstsa, stabilizlsa, illetve

ezltal a templtfunkcionlis monomer adduktok rgztse. Az oldszer (vagy

porogn) egyrszt a polimer porzus szerkezetnek kialaktsrt felels; msrszt a

reakcih elvezetst szolglja, ezltal visszaszortja a loklis tlmelegeds okozta

mellkreakcikat.

A polimer, alkalmazsi terletnek megfelelen, tbbfle formban llthat el.

A hagyomnyos, tmbpolimerizcis eljrs sorn magas keresztkt-arnnyal, szilrd

tmb kpzdik. Ezt a tovbbi felhasznls eltt mozsrban sszetrik, s

szitafrakcionlssal klntik el a megfelel mret szemcsket. Az eljrs anyag- s

idignyes, s a lenyomathelyek rszben srlhetnek az aprts sorn.

Kromatogrfis alkalmazsokhoz ltalban gmb alak szemcsket lltanak el:

ez megvalsthat a tmbpolimerizcihoz hasonl mdon, de jval kisebb monomer

koncentrci alkalmazsval (1-5%), vagy az eredeti 40-60% monomert tartalmaz

prepolimerizcis elegy emulgelsval egy, a porognnel nem elegyed folytonos

fzisban. Ez utbbi mdszer a szuszpenzis polimerizci. Tovbbi lehetsg a

gmbszimmetrikus szemcsk ellltsra, ha a polimerizcit szilikagl vagy ms,

gmb szemcsj hordoz prusaiban vgezzk.

Kmiai s mechanikai stabilitsuknak, a templtok szles krre optimalizlhat

s olcs ellltsuknak ksznheten a molekulris lenyomat polimerek a klasszikus

bioanalitikai technikkban felvlthatjk a termszetes felismer egysgeket

(antitesteket, receptorokat, enzimeket). A MIP-ek alkalmazsa gy elkpzelhet

kromatogrfis llfzisknt (klnsen kirlis elvlasztsokban [16,17]), szilrd fzis

extrakcis tltetknt [18], szenzorok felismer rtegeknt [19], ligandumkt assay-

kben [20], valamint kataliztorknt is [21]. A fehrje-szelektv MIP-ek ezen kvl az

orvosi diagnosztikban, illetve hatanyag-clbajuttatsban is fontos szerepet jtszhatnak

[22]. A molekulris lenyomat polimerek napjainkban mg viszonylag csekly

- 9 -

gyakorlati alkalmazsa annak tudhat be, hogy pontos mkdskrl kevesebb

ismerettel rendelkeznk, mint a rgta hasznlt termszetes receptorokrl. Az 1990-es

vek ta folyamatosan bvl ez irny kutatsok (1. bra) nyomn azonban vrhatan

egyre nagyobb teret nyernek majd a MIP-ek a fent emltett alkalmazsokban.

0

100

200

300

400

500

600

1990 1995 2000 2005 2010

adot

t vb

en m

egje

lent

cik

kek

szm

a

1. bra: Molekulris lenyomat polimerek tmjban vgzett kutatsok az adott vben megjelent

cikkek szma, az ISI Web of Science keresprogrammal, molecular* imprint* kulcsszval vgzett

keress alapjn

2.2. Fehrje templt imprintelsnek nehzsgei

Fehrje templt imprintelsekor tbb olyan problmval is szembe kell nzni,

melyek nagyrszt ismeretlenek a kismolekulk lenyomatkpzsekor. Ezen nehzsgek a

fehrjk nagy mretre, sszetettsgre s rugalmas konformcijra, valamint

oldhatsgi korltokra vezethetk vissza [23].

A hagyomnyos monolit szerkezet polimerekben azok porzussga ellenre is

gtolt a nagymret fehrjk diffzija, ezltal a templt csapdzdhat a kthelyn,

illetve a visszaktds sorn nem kpes azt megkzelteni. A monolit sszetrse,

rlse felszabadthatja a nehezen hozzfrhet kthelyeket, ugyanakkor roncsolja is

azokat [24].

A fehrje rugalmas konformcijnak kvetkeztben kisebb szelektivits vrhat,

mint ami merev templtokkal elrhet. Ennek oka, hogy szmos klnbz komplex

alakulhat ki a prepolimerizcis elegyben, s az gy kialakul kthelyek rendkvl

heterognek lesznek [25]. A fehrjk rugalmas konformcija azt is lehetv teheti,

- 10 -

hogy egy fehrje beilleszkedjen egy msik templt ltal ltrehozott kthelybe, ezltal

is cskkentve az imprintelt polimer szelektivitst, klnsen fehrjecsaldok, vagy

mdostott fehrjk entitsai kztt [23].

A fehrje-imprintels sorn tovbbi kihvst jelent a polimerizcis elegy

kivlasztsa. A hagyomnyos apolris, szerves oldszerekben a fehrjk

denaturldhatnak, vagy olyan konformcikba illetve aggregtumokba

rendezdhetnek, melyek alkalmatlanok a lenyomatkpzsre. A fehrjk szmra

kedvez, kzel fiziolgis, vizes kzegben azonban az elterjedten hasznlt monomerek

nagy rsze nem, vagy csak rszben oldhat. A vizes kzeg alkalmazsnak msik

htrnya, hogy a kismolekulj lenyomatkpzs kulcsaknt szmon tartott

hidrognktssel verseng az oldszer, illetve megbontja azt a templt s a funkcionlis

monomer kztt. Ugyanakkor igazoltk, hogy ez a hats sokkal kevsb jelents

makromolekulknl, mint kis molekulk esetben [24].

2.3. Fehrje-imprintelsi stratgik

A fehrjk imprintelsekor egy alkalmas polimerizcis elegy megoldst jelenthet

mind az oldhatsgi, mind a szelektivitsi problmkra, gy a sikeres lenyomatkpzs

kulcsa a fehrjk megfelel diffzijnak biztostsa. Ennek alapveten kt irnya lehet,

amelyek a hagyomnyos, ersen keresztkttt tmbpolimerizcis eljrson alapulnak,

de klnbz mdon segtik el a fehrje mozgst. Az egyik lehetsg a diffzis

lland nvelse, a msik a diffzis thossz cskkentse. Elbbi a polimer

keresztktttsgi foknak cskkentsvel valsthat meg, mg az utbbihoz a polimer

kiterjedst kell legalbb az egyik trirnyban cskkenteni.

Turner [24] a klnbz fehrje-imprintelsi stratgikat a polimer kiterjedse

szerint osztlyozza. A hromdimenzis polimer formk esetben elengedhetetlen a

polimer nagy porozitsa s prusmrete, ami legjobban alacsony keresztktttsg

glek ellltsval biztosthat. A gyakran akrilt alap, nagy vztartalm hidroglek

az ersen keresztkttt polimerekben mrhethz kpest megnvekedett diffzis

llandjuk ltal jelentenek megoldst a templt-csapdzds problmjra. Az alacsony

fok keresztktttsg ugyanakkor a polimer hossz tv kmiai s mechanikai

stabilitst veszlyezteti. Emiatt a krnyezeti paramterek vltoztatsa (ami

szksgszeren bekvetkezik, pldul a templt eltvoltst clz erlyes mossi

- 11 -

lpsekben: savak, proteinz enzimek) knnyen a prusok sszeesshez, a

lenyomathelyek megsemmislshez vezethet a laza szerkezet glekben [24].

A felleti (vagy Turner ttekint cikkben [24] ktdimenzisknt szerepl)

imprintels sorn egy ersen keresztkttt, de vkony polimer filmet kpeznek, melyet

akr egy hordoz fellethez is rgzthetnek. A fehrje egy-egy meghatrozott

rszletnek lenyomataknt kialaktott kthelyek a vkony filmben knnyebben

hozzfrhetek, mint a hagyomnyos tmbpolimerben, mivel a fehrjnek kisebb utat

kell megtennie a polimer fellettl a kthelyekig. A mdszer htrnya, hogy a

lenyomatok heterognek, s kevsb szelektvek, mint a tmbpolimerizcival

ellltottak, mivel csak a fehrjefellet egy rszlett ismerik fel. Nagy elnyt jelent

viszont a nagyfok mobilits mellett a szenzorfellethez val kapcsols lehetsge,

valamint a hordozfellet ltal biztostott robusztussg [24].

Bossi [23] lnyegben ugyanezen kt f csoportot klnbzteti meg, azonban a

lenyomatkpzs clpontjt emeli ki mint sszehasonltsi szempontot, azaz aszerint

csoportostja az alkalmazott technikkat, hogy a fehrje alakjt vagy szekvencijt

(illetve annak egy rszlett) clozza a lenyomatkpzs. Az ltala trgyalt,

alakfelismersre kialaktott mdszerek lnyegben megegyeznek Turner hrom

dimenzis technikival, azaz a lgy polimerglek imprintelsvel, mg a

szekvencia(rszlet) felismerse vkony filmekkel, vagy az gynevezett epitp

mdszerrel valsthat meg.

Mivel a fellelhet mdszerek mindenre kiterjed besorolsa szmos szempont

szerint, vagyis csak igen sszetett mdon trtnhet, ezrt (az ttekinthetsg rdekben)

a tovbbiakban a polimer kiterjedse mint f kategria mentn mutatom be a

fehrje-imprintels leggyakrabban alkalmazott, konkrt megvalstsi lehetsgeit. Az

idzett mdszerek tbb szempont osztlyozst, s ezltal a fehrje-imprintels

szertegaz, s rszben mg kiaknzatlan lehetsgeit az 1. tblzatban foglalom ssze.

2.3.1.Hrom dimenzis lenyomatok hidroglek

A hidroglek nagy vzmegkt kpessg, (vzben) oldhatatlan, keresztkttt

homopolimer vagy hetero-kopolimer hlzatok. [26]. A hidroglek alapjt

leggyakrabban akrilt vagy szerves sziln monomerek kpezik.

A glelektroforetikus technikkban hasznlt, biokompatibilis (akrilamid s N,N-

metilnbiszakrilamid kopolimerjeknt elll) poli(akrilamid) glek gretes

- 12 -

lenyomatkpz mtrixot jelentenek, mivel a poli(akrilamid)-on, inert termszete s

tltssemlegessge kvetkeztben, alacsony nemspecifikus fehrje-ktds vrhat. Ezt

a felttelezst Liao s munkatrsainak ksrletei is altmasztjk: a templt nlkl

ksztett poli(akrilamid) gl egyik, ltaluk vizsglt fehrjt sem kttte meg [27].

Ugyanakkor, a citokrm C, hemoglobin vagy transzferrin jelenltben polimerizlt

glek szelektven megktttk a templt fehrjt. A hrom fehrje egyttes jelenltben

ksztett gl mindhrmat megkttte, vagyis egyszerre tbb(fle) templtra is

kialakthatak szelektv kthelyek [28]. Az imprintelt poliakrilamid gl nagyfok

szelektivitst jelzi, hogy egy l mioglobinra imprintelt gl csak a templt fehrjt

adszorbelta, s mg a teljes 153 aminosavbl ll szekvenciban mindssze 19 eltrst

tartalmaz, s trszerkezetben is igen hasonl (2. bra), blna mioglobint sem kttte

meg.

a) b)

2. bra: L mioglobin (a); 29) s blna mioglobin (b); 30) szerkezete

Ou s munkatrsai gy talltk, hogy az alkalmazott keresztkt-arnytl

fggetlenl, a lizozim templt mintegy 27%-a nem moshat ki az akrilamid, metakrilsav

s 2-(dimetilamino)etil-metakrilt monomerekbl kszlt glbl. Ezt azzal

magyarzzk, hogy a gyks mechanizmus polimerizci sorn a templt aminosavjai

(klnsen a triptofn, hisztidin, tirozin s cisztein) is hidrognt veszthetnek, s a

bellk keletkezett gykk kovalens ktssel beplhetnek a polimerhlba [31].

Tapasztalataik szerint a metakrilsav arnynak nvelsvel nvekszik a kimosott

templt mennyisge is, mivel a metakrilsav komplexlja a lizozimot, ezltal megvdi a

gykktl. Hjertn kutatcsoportja [28] ugyanakkor nem tartja valsznnek, hogy a

- 13 -

templt a glhlzatoz kapcsoldna, mg metakrilsav tvolltben sem: a hemoglobinra

imprintelt poli(akrilamid) gl ugyan nem volt teljesen kimoshat (a gl enyhn

elsznezdtt maradt), de ennl egy, szabad aminosavak nagy koncentrcijnak

jelenltben, egybknt azonos mdon polimerizlt gl szne sem volt halvnyabb a

kimoss utn. Mivel a szabad aminosavaknak ugyangy reaglniuk kell a gykkkel,

mint a fehrjnek, ezrt ha valban a polimerhlzatba val bepls okozn a templt

csapdzdst, gy az aminosavak jelenlte cskkentette volna ezt az effektust. Noha

nem adtak magyarzatot a kimosds elgtelensgnek okra, gy talltk, hogy a

templt nyomok mg elnysek is lehetnek a szelektv visszaktds szempontjbl,

mivel a lehetsges felismer mechanizmusok kzl a protein-protein klcsnhats sem

zrhat ki.

Liao s Hjertn azt tapasztaltk, hogy a molekulris felismers a csak akrilamidot

s N,N-metilnbisz(akrilamid)-ot tartalmaz polimermtrixban is megvalsul, (st:

akrilsav beptsvel gyenglt az adszorpci), ennek ellenre szmos szerz sikeresen

imprintelt egyb funkcionlis monomerek hozzadsval is. Az alapgl ltal knlt

hidrogn-hidakon kvl elektrosztatikus klcsnhatsi lehetsg biztosthat akrilsav-

szrmazkok [32,33] vagy ms, ionos csoportot tartalmaz monomerek [34]

beptsvel; hidrofb klcsnhats alakthat ki ciklodextrin-szrmazkokkal [35]; de

akr az igen ers s szelektv enzim-ligandum affinits is felhasznlhat a

lenyomatkpzshez [36].

Habr a termszetben megfigyelhet legspecifikusabb ktdsek is bizonyos

lncok rugalmas mozgsval jnnek ltre (pl. enzim szubsztrt induklt illeszkeds), a

mozgsszabadsg tekintetben ezekkel rokonthat hidroglek azonban jelenleg mg

nem rendelkeznek a merev polimerstruktrkhoz mrhet szelektivitssal, ppen a

kthelyek laza szerkezetbl kvetkez knny torzthatsg miatt. A lgy

poli(akrilamid) glek kmiai s mechanikai stabilitsnak nvelsre elterjedt mdszer

a polimerrteg szilikagl [35,37], chitosan [38,39] vagy agarz [40] gyngyk felletn

trtn kialaktsa. Ezltal a hidroglek a ksbb trgyaland, felleti imprintelsben is

elterjedten hasznlatosak. A glek stabilizlsra tovbbi mdszereket is ajnlanak:

Hjertn a lgy, imprintelt szemcsk kr egy ersebben keresztkttt poli(akrilamid)

rteget polimerizlt [28]. Byrne [26] olyan hidrogl kialaktst javasolta, amelyben a

fehrjkhez hasonlan eltr merevsg szerkezeti egysgek: magas keresztktttsg

felismer foltok s alacsony keresztktttsg rgik vltakoznak. Enoki s

- 14 -

munkatrsai [41] a polimerizcis elegyhez egy reverzibilisen blokkolt

monomerkomponenst is adtak, amelybl a gl ltrejttt kveten tovbbi aktv

monomereket szabadthattak fel, s gy utlagos keresztktsekkel stabilizltk a

szerkezetet. gy talltk, hogy a templt jelenltben ut-keresztkttt gl jobban

kttte a clvegyletet, mint az, amelyben a templt tvolltben vltottk ki ezt a

ksleltetett polimerizcit.

A szerves szilnvegyletekbl szol-gl reakcival elllthat polisziloxnok az

akrilamidhoz hasonlan alkalmasak lenyomatkpz mtrixnak, mivel vzoldhat

monomerekbl, enyhe krlmnyek kztt polimerizlhatak [24]. A szilanol csoportok

kitn H-ktsi lehetsget biztostanak a fehrjkkel, de klnfle funkcis csoportok

is bepthetek a szerves sziln monomerekbe, s ezltal a polimer-hlzatba. A

polisziloxnok tovbbi elnye az akrilamid-alap polimerekkel szemben a merevebb

szerkezet, s ennek ksznheten nagyobb mechanikai s kmiai stabilits.

Venton s Gudipati [42] 3-aminopropiltrietoxisziln s tetraetil-ortoszilikt

monomerekbl sikeresen ksztett urez enzimre illetve BSA-ra szelektv tmbpolimert.

Ugyanakkor az ugyanilyen sszettel polisziloxnok mioglobinra illetve hemoglobinra

imprintelve nem mutatkoztak szelektvnek egyms templtjval szemben. Az egyes

MIP-ek radsul olyan ersen ktttk mindkt fehrjt, hogy 1 M NaCl-oldattal val

moss hatsra is csak a megkttt fehrje 3-8 %-a mosdott ki. A fehrjket csak

denaturl krlmnyek kztt lehetett kioldani, ekkor azonban mr mutatkozott nmi

szelektivits: a mioglobin- illetve hemoglobin-imprintelt polimerekbl a karbamidos

kezels kevsb oldotta ki a polimerek sajt templtjt, mint a msik fehrjt.

2.3.2.Ktdimenzis lenyomatok - felleti imprintels

A vkony polimerrtegek mikrogyngyk felsznn vagy sk felleten is

kialakthatak, ennek megfelelen a felleti imprintels kt csoportjt klnbztetjk

meg: a mikrogyngy felleti imprintelst, illetve az n. blyegz, vagy mikro-kontakt

imprintelst (3. bra). Mindkt esetben lervidl a fehrje diffzis thossza a

polimerrteg fellettl a kthelyekig.

A mikrogyngy felleti imprintels sorn elszr aktivlt fellet

mikrogyngyk jelenltben a fehrjk kr rendezdnek a funkcionlis monomerek,

- 15 -

amelyekbl ez utn a gyngyk felsznn polimerrteget kpeznek. Vgl a

polimerrtegbl eltvoltjk a fehrje templtot.

Ez a mdszer tulajdonkppen tekinthet hrom dimenzis lenyomatkpzsnek is,

mivel a gyngyk felletn kialaktott rteg a teljes fehrje molekulkat magban

foglalja. A mikrogyngy-imprintels akkor vlik tisztn kt dimenzis mdszerr, ha

kellen vkony polimer rteget alaktanak ki a gyngyk felletn. Ez pldul gy

valsthat meg, ha az inicitort a gyngy felletn immobilizljk.

A 2.3.1. fejezetben mr emltett chitosan vagy agarz alapakon kvl sokfle ms

anyagbl kszlt mikrogyngyk is hasznlhatak.

Lulka s munkatrsai szilikagyngy felletn alaktottak ki ricinre, illetve annak

A s B lncra imprintelt polisziloxn rteget [43]. Azt tapasztaltk, hogy mg a

klnll lncok homogn kthelyeket eredmnyeznek, addig a teljes ricin fehrjnek

kt klnbz affinits kthely-csoportja alakul ki. Tovbb, a B lnc be tud ktdni

az A lnc lenyomataiba, de ez fordtva nem valsult meg, valamint a teljes fehrje sem

tud bektdni egyik klnll lnc lenyomatba sem. Ezt a jelensget a B lnc

rugalmasabb szerkezetvel, valamint a teljes fehrjnek a lncokhoz viszonytott

nagyobb mretvel magyarztk.

Shiomi s csoportja a fentihez hasonl mdon ksztett hemoglobinra imprintelt

polisziloxnt, de a templtot elszr imin ktssel a szilika gyngy felletre

rgztettk. Az gy imprintelt polimer nagyobb szelektivitst mutatott, mint az a MIP,

amelyet szabad hemoglobinra imprinteltek [44].

Lu s munkatrsai [45] polisztirol gyngyk felletn hoztak ltre hemoglobinra

imprintelt poli(3-aminofenilboronsav) rteget. Az alkalmazott polimer szelektven tudta

visszaktni a hemoglobint, azonban a marha szrum albumin ugyanilyen krlmnyek

kztt kpzett lenyomata nem tudta visszaktni a templt fehrjt. Ezt a szerzk az

imprintelskor s a visszaktdskor hasznlt pufferek eltr pH-jval magyarztk.

Gai [46] illetve Tan [47] csoportja vasoxid mag, mgneses rszecskk felsznn

alaktotta ki a lizinre illetve BSA-ra imprintelt polimer rteget.

Gltekin s munkatrsai arany-ezst nanoklasztereket vontak be a szmos

Bacillus s Clostridium faj sprjnak jelenltre jellemz dipikolinsavra imprintelt

polimerrteggel [48]. A lenyomatkpzs alapjul fm-koordincis, keltkpz

klcsnhatst vlasztottak, ami a templt oxocsoportja s a metakriloil-amidoantipirin-

- 16 -

terbium funkcionlis monomer terbium(III) ionjai kztt lp fel. A dipikolinsav nem

fehrje, de a fmion-koordincis imprintelsi elvet fehrjkre is alkalmazzk, a

legelterjedtebben a Cu(II)hisztidin kelci felhasznlsval. Ennek kapcsn itt

mutatnm be Odabasi s munkatrsainak cikkt is, noha k nem felleti lenyomatot,

hanem tmbpolimert ksztettek az N-metakriloil-L-hisztidin-metilszter rzkomplexe

mint funkcionlis monomer, valamint HEMA s EDMA segd monomerek

felhasznlsval, lizozim fehrje jelenltben [49]. A MIP szelektvnek bizonyult a

hisztidint szintn tartalmaz citokrm c enzimmel s humn szrum albuminnal

szemben, vagyis jobban kttte a lizozimot, mint a citokrm c-t vagy a HSA-t. zcan s

csoportja a ksbb trgyaland epitp-mdszerrel tvzte a fmion-koordincis

imprintelst: L-hisztidin lenyomatt kpeztk az Odabasi ltal is hasznlt keltkpz

monomer s EDMA kopolimerben [50]. A szuszpenzis polimerizcival ellltott,

kis mretk miatt felleten imprinteltnek tekinthet polimergyngyk nemcsak a

hisztidin enantiomerjeinek elvlasztsra bizonyultak alkalmasnak, de a felsznn

hisztidint tartalmaz citokrm c enzim elvlasztsra is (az ezzel nem rendelkez)

ribonuklez A enzimtl.

3. bra: A fehrje imprintels hrom alapvet mdszere. a) tmbfzis imprintels kis mrtkben

keresztkttt hidroglekkel. b) Mikrogyngyk felletn trtn imprintels. c) Mikro-kontakt

imprintels sk felleten. ([51] 1. brja nyomn)

- 17 -

A felleti imprintels msik megvalstsi formja az n. mikro-kontakt

imprintels. Ennek sorn a fehrjt egy egyenletes felszn hordozra adszorbeltatjk,

s vkony polimer rteget nvesztenek r, amelyet ez utn egy msik hordozhoz

rgztenek. Vgl vatosan levlasztjk azt a hordozt, melyre eredetileg a fehrjt

adszorbeltattk, gy a templt eltvoltsval elll a felletn imprintelt polimer rteg.

A mdszer elnye, hogy a templt egyltaln nem csapdzdik a polimerben, csekly

mennyisg templt is elegend a lenyomatkpzshez, s a felleti lenyomatok

homognek.

Chou s munkatrsai [52] egy veg fedlemezre adszorbeltattk a C-reaktv

protein (CRP) templtot, s a funkcionlis monomert o-(4-nitrofenilfoszforil)kolint,

amely a CRP termszetes foszforilkolin ligandumnak egy analgja. Egy msik veg

hordozra keresztkt monomert s inicitort adszorbeltattak, majd a kt veglapot

(rtelemszeren a funkcionalizlt oldalak rintkeztetsvel) egymsra helyeztk, s UV

polimerizcival rgztettk a fehrje lenyomatt. A fedlemez eltvoltsa s a templt

kimossa utn a 10 m vastag polimer rteg szelektven visszakttte a CRP-t.

Shi s munkatrsai [53] atomi simasg csillmpala felletre adszorbeltattak

hrom jelents vralkott: marha szrum albumint (BSA), immunoglobulint (Ig) s

fibrinognt. A fehrjket vkony diszacharid rteggel vontk be, ami hidrogn-hd

klcsnhatsokat alaktott ki a templttal. Ez utn egy vkony polimer rteget

vlasztottak le a mintkra, melyhez a diszacharidok kovalensen kapcsoldtak, ezltal

poliszacharid jelleg regeket kpeztek a templt krl. A polimerrteget

epoxigyantval egy veg hordozhoz rgztettk, vgl a csillmpala, majd a templt

eltvoltsval kaptk meg a felletn imprintelt polimer rteget (3. bra c)).

Visszaktdsi vizsglataik sorn az egyes MIP-ek sokkal nagyobb arnyban ktttk

meg a sajt templtjukat, mint ms fehrjket. Ktkomponens fehrje-oldatokbl a

templt minden esetben ersebben ktdtt a kompetitv fehrjnl.

A mikro-kontakt mdszer egy specilis esetnek tekinthet a Langmuir-

imprintels: ennek sorn a fehrjt egy olyan, a vz/leveg hatrfelleten elhelyezked

lipid mono- vagy kettsrtegre adszorbeltatjk, amely semleges s a fehrjvel

ellenttes tlts komponenseket tartalmaz. A lipidek a tltsknek megfelelen a

fehrje kr rendezdnek. Az gy kialakult kthelyeket ltalban a lipid rtegnek egy

hidrofb szubsztrthoz val ktsvel rgztik.

- 18 -

Turner s munkatrsai a nem-ionos metil-szteart s a kationos dioktadecil-

dimetilammnium bromid (DOMA) felletaktv komponensekbl (valamint a fehrje-

aggregci visszaszortst szolgl poli(etilnglikol)-bl) kpzett monortegre

adszorbeltattak ferritint, illetve marha szrum albumint (BSA) [54]. A rteget

oktadekntiollal hidrofbizlt QCM szenzorra immobilizltk. A fehrjk

izoelektromos pontja feletti pH-n, azaz anionos llapotban, a fehrjk trkitltse

hatrozta meg az imprintelt rtegek szelektivitst: a kisebb BSA nagy mrtkben

ktdtt a ferritin lenyomataiba is, ugyanakkor a ferritint nem kttte meg a BSA-ra

imprintelt rteg. Az a tny, hogy a ferritin kationos llapotban (pH

- 19 -

kvl a monomer s az ellenion koncentrcija, utbbi kmiai termszete, az oldszer

minsge s a hmrsklet befolysolja [58]. A film vastagsgt az thaladt tlts

mennyisge hatrozza meg.

2.3.3.Epitp-mdszer

Megfontoland alternatvt jelenthet a molekulris lenyomatkpzs sorn -

trtnjk az brmilyen formban, vagyis tetszleges polimer-geometria s templt

funkcionlis monomer klcsnhats esetn is a teljes fehrje helyett egy rvid

szekvenciarszlet templtknt val hasznlata, vagyis az epitp mdszer alkalmazsa.

A kis molekulatmeg vegyletek sikeres lenyomatkpzsbl, s az antitest-

antign klcsnhats termszetbl kiindulva Rachkov s Minoura fejlesztette ki az n.

epitp-mdszert [59]. Az immunolgia egyik legalapvetbb reakcijban a szervezet

szmra idegen fehrjemolekula felismerst annak egy kis (jellemzen legalbb 8

aminosavbl ll) szekvenciarszlete, az epitp biztostja. Ha ennek mintjra a

felismerni kvnt fehrje helyett annak egy jl hozzfrhet rszlett reprezentl,

nhny aminosavbl ll peptidet hasznlunk templtknt, akkor azt a peptid lenyomata

a teljes fehrjn is kpes lehet felismerni s szelektven megktni.

Az epitp-mdszerrel Rachkov s Minoura ltrehozott egy, a 9 aminosavbl ll

oxitocinra szelektv, metakrilt-alap polimert, az oxitocin C-terminlisa felli 3

aminosavbl ll szekvencia-rszlet imprintelsvel (4. bra) [60].

4. bra: Az epitp-mdszer; oxitocin (H2N-Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly) felismerse a C-

terminlison tallhat peptidrszlet (H2N-Tyr-Pro-Leu-Gly) imprintelsvel. A monomerelegy a

peptidrszletet tartalmazza templtknt (a), s e krl formldnak a kthelyek a polimerizci

sorn (b). A templt eltvoltst kveten kapott res kthelyekbe (c) a rvid peptid, vagy az

azonos terminlissal rendelkez oxitocin is visszaktdhet (d). [59 1. brja alapjn]

- 20 -

Nishino s munkatrsai [61] a jval nagyobb citokrm c, szrum albumin s

alkohol-dehidrogenz fehrjk szelektv felismerst valstottk meg vizes kzegben, a

megfelel fehrje C-terminlis felli 9 aminosavbl ll szekvencia-rszletnek

imprintelsvel. A vlasztott templt-hosszsg kzel egyedi kdot biztost a fehrjk

nem strukturlt rsznek azonostshoz, s ezltal nagyfok szelektivitst eredmnyez.

Rachkovk [60] templtjnak negyedik aminosavja eltrt az anyavegylettl, az YPLG

szekvencira imprintelt polimer mgis kpes volt megktni a CYIQNCPLG

szekvencij oxitocint is. Ugyanakkor Nishino s munkatrsai azt tapasztaltk, hogy a

nonapeptid templtra imprintelt filmek sokkal rzkenyebbek a szekvencia

helyessgre: az STQTALA C-terminlis BSA ktdse jelentsen lecskkent a

negyedik aminosav cserjvel kapott nonapetid-vltozatokra (STQAALA, STQLALA,

STQEALA, STQYALA) imprintelt polimereken, a pontos szekvencival imprintelt

polimeren tapasztalt ktdshez kpest.

A lenyomatok eltr szekvencia-rzkenysgt vlemnyem szerint az is

okozhatta, hogy Rachkov a peptid templt vgn, mg Nishino a peptid kzepn

elhelyezked aminosavat cserlte. A lncvgi aminosav mr valsznleg nem

gyazdott be a polimerbe, gy nem vett rszt a kthely kialaktsban. Ezzel szemben

a lnc belsejben elhelyezked aminosav bizonyosan nem lgott mg ki a polimerbl,

azaz rszt vett a kthely kialaktsban.

Brown s Puleo lizozimra, illetve a fehrje egy 16 aminosavbl ll rszletre

ksztett imprintelt polimert [62]. A teljes fehrjre imprintelt polimer 4-5-szr annyi

lizozimot kttt meg a hasonl mret ribonuklez A-hoz kpest, mind kompetitv mind

nemkompetitv krlmnyek kztt. Ugyanakkor a peptidre imprintelt polimer csak

statisztikailag nem szignifikns mrtkben kttt tbb lizozimot, mint ribonuklezt. A

szerzk ezt egyrszt az egyesvel ksztett polimerek vltozkonysgval, msrszt a

peptid templt kis mretvel magyarzzk, amely gy nagyrszt csapdzdhatott a

polimerben, s csak kis mennyisge kpezett a lizozim szmra is hozzfrhet, felleti

lenyomatokat.

Ez, a szerzk ltal adott magyarzat azonban nem koherens a korbbi

tapasztalatokkal, miszerint a csapdzds inkbb a nagyobb mret fehrjkre jellemz,

semmint a kisebb peptidekre.

- 21 -

1. tblzat: A bemutatott fehrje-imprintelsi mdszerek tbb szempont csoportostsa. Az egyes cellkban feltntett adatok: mikrogyngy anyaga (ha van) /

funkcionlis monomer(ek) / templt / hivatkozs. A rvidtsek feloldst ld. az 1. oldalon..

2D

vkony, ltalban ersen keresztkttt, felleten imprintelt filmek

polimer

kiterjedse

templt

monomer

klcsnhats

3D

tmbfzis, ltalban gyengn keresztkttt

hidroglek mikrogyngy felletnsk felleten

(mikro-kontakt imprintels)

msodrend

klcsnhats (pl.

H-hd,

elektrosztatikus

vonzs)

AAm, BisAm / Cyt / [27]AAm, BisAm / RNAse, Lys, Mb / [28]DMAEMA, MAA, AAm, BisAm / Lys / [31]MAA, AAm, BisAm / BSA / [32]DMAEMA, MAA, AAm, BisAm / hGH / [33]AAm, BisAm, AMPS, MAPTAC / Hb / [34]AAm, BisAm / Hb / [40]APEOS, TEOS / BSA, urez / [42]

PS / APBA / Hb / [45]Fe3O4 / NIPAAm, AAm, BisAAm / Lys / [46]szilika / A CD, AAm, BisAm / Hb / [35]szilika / AAm, DMAPAAm, BisAm, DHEBisAm / Lys / [37]chitosan / AAm, BisAm / Hb / [38]chitosan / AAm, BisAm / BSA / [39]agarz / AAm, BisAm / Hb / [40]szilika / HAPEOS, TEOS / ricin / [43]szilika / APEOS, PMOS / Hb / [44]Fe3O4 / MAA, EDMA / BSA / [47]

HFP / BSA, IgG, Fbgn / [53]

fmion-

koordinciMAH-Cu(II), EDMA, HEMA / Lys / [49]

Ag-Au / (MAAP)2-Tb(III) / DPA / [48]

(szuszpenzis polim.) / MAH-Cu(II), EDMA / L-His / [50]

enzim-ligandum

affinitsAcPABA, AAm, BisAm / tripszin / [36] NPPC, EDMA / CRP / [52]

epitp imprintels APEOS, TEOS / Lys / [62]

MAA, EDMA / tetrapeptid / [60]

AAm, BisAm, PEG-A / nonapeptid

/ [61]

- 22 -

3. Ksrletek

3.1. Vegyszerek

Oldszerek, gzok:

vz (gyrt: Millipore, tisztasg: MilliQ); metanol (gyrt: Merck, tisztasg: gradient grade);

tetrahidrofurn (gyrt: Sigma-Aldrich, tisztasg: >99,0%)

Gzok:

argon (gyrt: Linde, tisztasg: >99,995%); nitrogn (gyrt. Linde, tisztasg: >99,996%)

Polimerizcis elegyek sszetevi:

ammnium-perszulft (gyrt: Sigma-Aldrich, tisztasg: A.C.S. reagent), N,N,N,N-

tetrametilndiamin (gyrt: Bethesda Research Laboratories, tisztasg: electrophoresis

grade); 4,4-azobisz(4-cianovalerinsav) (gyrt: Aldrich, tisztasg: 75%)

OLIGOTRON: poli(3,4-etilndioxitoifn), tetrametakrilt vgcsoportokkal (gyrt:

Aldrich, 0,5 wt% nitrometnban); 3,4-etilndioxitiofn (gyrt: Aldrich, tisztasg: 97%);

poli(ntrium-4-sztirolszulfont-ko-maleint) (sztirolszulfonsav:maleinsav = 3:1, gyrt:

Aldrich,); poli(ntrium-4-sztirolszulfont) (gyrt: Aldrich)

avidin (gyrt: Sigma, tisztasg: 98%); avidin-HRP (gyrt: Sigma); biotin (gyrt:

Sigma, tisztasg: 99% ); biotin-HRP (gyrt: Sigma); HRP (gyrt: Sigma)

FluidMAG-biotin (gyrt: Chemicell, 100 nm hidrodinamikai tmrj, vasoxid mag,kemnyt mtrixszal bevont s biotinillt szemcsk 0,05% ntrium-azidot tartalmaz vizes

szuszpenziban. Nanorszecskk srsge: ~1,25 g/cm3, szuszpenzi koncentrcija: 10 mg/ml,

~1,81015 g-1 nanorszecske van a szraz anyagban. A nanorszecskk kapacitsa 75 g

sztreptavidin / 1 mg nanorszecske.)

Elektrdok s polimerek tiszttshoz hasznlt vegyszerek:

alumina paszta (gyrt: Buehler); knsav (gyrt: Sigma-Aldrich, 95-97%, tisztasg: puriss

p.a.); hidrogn-peroxid (gyrt: Sigma-Aldrich, 20 wt% vzben, tisztasg: puriss p.a.);

ntrium-dihidrognfoszft-monohidrt (gyrt: Fluka, tisztasg: puriss p.a.); ntrium

hidroxid (gyrt: Fluka, tisztasg: 98,0%); ntrium klorid (gyrt: Riedelde Han,

tisztasg: puriss); Tween20 (gyrt: Sigma, tisztasg: for molecular biology);

Egyb vegyszerek:

poli(diallil-dimetilammnium klorid) (gyrt: Aldrich, 20 et% vzben, tlagos MW:

200 000-350 000); poli(vinilpirrolidon) (gyrt: Sigma, tlagos MW: 360 000), brmkrezol

- 23 -

zld ntrium sja (gyrt: Sigma-Aldrich, tisztasg: A.C.S. reagent), 3,3,5,5-

tetrametilbenzidin (gyrt: Sigma, folyadk szubsztrt-rendszer ELISA teszthez); oxlsav(gyrt: Fluka, tisztasg: purum)

3.2. Eszkzk, mszerek

beprl kszlk (Turbo Vap LV, gyrt: Zymark)

kmcskever (REAX 2000, gyrt: Heildolph)

mgneses szepartor (MagnetoPURE, gyrt: Chemicell)

orbitlis rzgp ( UNIMAX 2010, gyrt: Heildolph)

ultrahangos vzfrd (Realsonic 40S, gyrt: Realtrade)

ultrahangos kever (Ultrasonic Homogenizer UH-50, gyrt: SMT Company)

UV lmpa (MINUVIS 245 nm / 366 nm, gyrt: Desaga)

optikai mikroszkp (OLYMPUS BH-2)

mikrotiter tlca olvas (Elx808, gyrt: BioTek)

potenciosztt/galvanosztt (Autolab PGSTAT100, gyrt: Metrohm)

psztz elektronmikroszkp (Inspect S50, gyrt: FEI)

atomer mikroszkp (Innova SPM, gyrt: Veeco)

profilomter (Alpha-Step 500, gyrt: Tencor Instruments)

3.3. Mdszerek

3.3.1.EDOT kmiai polimerizcija

Az EDOT kmiai polimerizcijt ammnium-perszulft (APS) oxidlszerrel s

N,N,N,N-tetrametilndiamin (TEMED) kataliztorral vgeztem. 25 mM Na-PSS

elleniont s 10 mM EDOT-ot vzben feloldottam, majd az oldatot argonnal

oxignmentestettem, s 400 l-t lezrhat vegbe mrtem. Hozzadtam 10-10 l APS

s TEMED oldatot, melyeket 0,04 0,8 M-os vizes oldatknt ksztettem el, a kvnt

mlarnynak megfelelen (ld. 2. Tblzat, V jel mintk).

Az A jel mintk esetben a monomerbl 20 mM-os oldatot ksztettem, 10%

acetonitrilt tartalmaz vzben. Az A10 jel minthoz 10-10 l, mg az A20 jelhz 20-

20 l 0,8 ill. 0,08 M koncentrcij APS ill. TEMED oldatot adtam.

- 24 -

Megmrtem az elegyek sszemrstl (kataliztor hozzadst kvet

homogenizlstl) eltelt idt az elegy elsznezdsig (polimerizci kezdete).

kd

EDOT ill.

Na-PSS

koncentrci

EDOT-PSS :

APS : TEMED

mlarny

APS

koncentrci

TEMED

koncentrci

EDOT-PSS

oldszere

V11 1 : 1 : 1 0,4 M 0,04 M

V10 1 : 1 : 0,1 0,4 M 0,04 M

V20

10 mM ill.

25 mM1 : 2 : 0,2 0,8 M 0,08 M

vz

A10 1 : 1 : 0,1 0,8 M 0,08 M

A20

20 mM ill.

25 mM 1 : 2 : 0,2 0,8 M 0,08 M

10%

acetonitril

tartalm vz

2. Tblzat: EDOT kmiai polimerizcijnak vizsglathoz alkalmazott prepolimerizcis elegyek

sszettele

3.3.2.EDOT fotokmiai polimerizcija

Az EDOT fotokmiai polimerizcijt a vzoldhat 4,4-azobisz(4-

cianovalerinsav) (ACVA) inicitorral vgeztem. 12,5 mM Na-PSS-t, 10 mM EDOT-ot

s 1 mM ACVA inicitort vzben feloldottam. Az oldatot argon tbuborkoltatsval

oxignmentestettem, majd 200 l-t kvettba pipettztam, illetve 2 l-t trgylemezre

cseppentettem, melyet egy celofnnal lezrt Petri-csszbe helyeztem. A mintkat

245 nm hullmhosszon sugrz UV-lmpval megvilgtottam, s megmrtem az

elsznezds kezdetig eltelt idt (polimerizci kezdete).

3.3.3.Oligotron toldsa vizes kzegbe

1 ml Oligotron szuszpenzit (nitrometnban) nitrogn ramban, 40 C-on szrazra

proltam, 10*100 l-es rszletekben. A beszrtott oligomert metanolban, metanol-vz

1:1 arny elegyben, illetve vzben prbltam visszaoldani, ultrahangos kever

segtsgvel. A kapott szuszpenzikat trgylemezre cseppentve optikai mikroszkppal

vizsgltam.

- 25 -

3.3.4.Electrospotting t ksztse s vizsglata

3.3.4.1. Pipettahegy hidrofilizlsa

A kvetkez mdszereket alkalmaztam a pipettahegyek hidrofilizlsra.

Nhny darab, 10 l-es polipropiln pipettahegyet poli(diallildimetilammnium

klorid) polielektrolit 20 w%-os vizes oldatba mertettem 10 percre, majd a hegyeket

vzzel mostam 10 percig, ultrahangos frdben.

Nhny msik pipettaheggyel poli(vinilpirrolidon) 50 g/l-es metanolos oldatt

szvtam fel, majd 10 s utn a folyadkot kifolyattam, s a pipettahegyet megszrtottam.

jabb 10-12 pipettahegyet oxign plazmban val kezelssel hidrofilizltam.

A hidrofilizls eredmnyessgt nyitott s lezrt vg pipettahegyen is

vizsgltam: a pipettahegy vgt brmkrezol zld festk tmny vizes oldatba

mrtottam, majd szemrevtelezssel, illetve az acl tvel lezrt hegyek esetben

mikroszkp alatt ellenriztem, hogy a kavitsban meddig kszott fel a folyadk.

3.3.4.2. Szigetel toldat kialaktsa

Egy 375 m tmrj, tmr rozsdamentes acl mikrocseppent (BioRad

Calligrapher) t vgre a hidrofilizlt, 10 l-es polipropiln pipettahegyek egyikbl

levgott toldatot illesztettem, amit hre zsugorod manyag csvel rgztettem. A

pipettahegy vgt szikvel ferdre metszettem, hogy elsegtsem a folyadk

felszvdst a kavitsba (5. bra).

5. bra: Electrospotting t felptse

- 26 -

Az electrospotting t hegyt 10 mM EDOT s 25 mM NaPSS vizes oldatba

mrtottam, majd a tt egy megtiszttott SPR szenzor arany fellethez rintve

rgztettem. Az arany mint munkaelektrd s a t mint ellenelektrd kztt 0,9 V

potencilon, 60 s alatt hoztam ltre polimer filmet a kavitsba juttatott

monomerelegybl.

3.3.5. Imprintelt polimerfilmek ellltsa

Az imprintelsi ksrletek sorn ktfle szubsztrtra (arany elektrdra s SPR

chipre), s ennek megfelelen kt klnbz elektrokmiai cella elrendezsben

ksztettem polimerfilmeket.

3.3.5.1. Polimerfilm ellltsa arany elektrd felletn

Egy 2 mm tmrj, teflon bevonat arany elektrdot 1,0 m-es, majd 0,05 m-es

alumina pasztval polroztam, majd vzben ultrahangoztam. Ez utn az elektrdot

Ag/AgCl szl szemi-referencia elektrd s platina szl ellenelektrd mellett

elektrokmiai tiszttsnak vetettem al: 0,1 M pH=7,4 foszft pufferben 300 ciklust

vgeztem fel a 3. Tblzatban lthat potencil lpcskkel [63].

potencil potencilon tarts ideje1. 1,6 V 0,1 s2. 0 V 0,1 s3. -0,8 V 0,1 s

3. Tblzat: Elektrokmiai tiszttshoz alkalmazott potencil lpcsk

Az elektrokmiai tisztts hatsra az elektrd felletn nhny nanomter

mlysgben az arany szerkezete polikristlyosbl 111 kristlyrcsv alakul. Az

elektrd elksztst vizes bltssel s nitrognnel val szrtssal fejeztem be.

A polimer filmek ellltst a 6. bra a) rszn lthat cella elrendezsben

vgeztem. Az elektrd kr koncentrikus elrendezsben egy teflon gyrt s egy

levgott pipetta hegyet rgztettem, gy egy legfeljebb 0,5 ml folyadk befogadsra

alkalmas tartlyt kaptam. Ebbe mertettem az ellenelektrdknt hasznlt platina szlat,

valamint a szemi-referencia elektrd Ag/AgCl szlat. Ezek ellepshez legalbb 50 l

prepolimerizcis elegyet kellett a cellba tlteni.

A cellt, sszelltst kveten, argon tbuborkoltatsval oxignmentestett

prepolimerizcis eleggyel tltttem fel, majd kronoamperometris mdszerrel hoztam

- 27 -

ltre a polimer filmeket, vagyis a kvnt filmvastagsgnak megfelel ideig 0,7 ill. 0,8 V

potencil feszltsget adtam az arany munkaelektrdra. A polimer filmeket vgl vzzel

bltettem, s nitrognnel szrtottam.

A prepolimerizcis elegy sszettele az egyes ksrletekben eltr volt. Az A

sszettel esetn (s ksbbi, mossi lpsekben) alkalmazott 0,01 M pH=7,4 foszft

puffert (PB-t) ntrium-dihidrogn-foszft-hidrt vizes oldatbl ksztettem, az oldat

pH-jt ntrium-hidroxid oldattal lltottam a kvnt rtkre.

NIP elegy MIP elegy

A sszettel

10 mM EDOT

25 mM NaPSS

0,01 M pH=7,4 PB-ben oldva

0,1 mg/ml avidin-HRP

a NIP elegyben oldva

B sszettel

10 mM EDOT

25 mM NaPSS

vzben oldva

C sszettel

10 mM EDOT

25 mM NaPSSM

vzben oldva

4. Tblzat: A ksrletekben alkalmazott klnbz prepolimerizcis elegyek sszettele

a) b)

6. bra: Cella elrendezsek elektrokmiai polimerizcihoz a) arany elektrd, ill. b) SPR chip

felletn.

- 28 -

3.3.5.2. Polimerfilm ellltsa SPR chip felletn

Ms mrsekhez korbban mr hasznlt SPR chipeket (szksg szerint

vegvgval kisebb darabokra vgva) piranha oldatban (3 tf. 98%-os knsav s 1 tf.

30%-os hidrogn-peroxid oldat elegye) ztatva megtiszttottam, vzzel alaposan

lebltettem, majd nitrognnel megszrtottam. A megtiszttott chipeket hrmasval a 6.

bra b) rszn lthat cellban rgztettem, kezdetben parafilm, ksbb teflon gyrs

tmtssel. Az argon tbuborkoltatssal oxignmentestett prepolimerizcis elegy fl

nitrognt fvattam a polimerizci ideje alatt.

A platina szl ellenelektrdot s az Ag/AgCl szl referencia elektrdot mindig

azon chip fl rgztettem, amelyiken ppen ltrehoztam a polimer filmet. A

munkaelektrdot aluflia segtsgvel csatlakoztattam az ramkrhz, s a kvnt

filmvastagsgnak megfelel ciklusszmban ismtelve az 5. Tblzatban ismertetett

potencil pulzusokat, ltrehoztam a polimer filmet. Amikor mindhrom chipen elkszlt

a film, a cellt sztszereltem, a chipeket vzzel lebltettem, s nitrognnel

megszrtottam. A parafilm tmts nyomt ez utn a chip tetrahidrofurnba mertsvel

tvoltottam el. Ez a PEDOT filmet rintetlenl hagyta. Vgl ismt vzzel bltettem,

s nitrognnel szrtottam a chipet. A ksbbi ksrletekben hasznlt teflon gyrs

tmts nem ragadt r a chipre, ezrt nem ignyelt tovbbi kezelst az els vizes blts,

szrts utn.

potencil potencilon tarts ideje adatrgzts idkze1. 1 V 0,05 s 0,005 s2. 0,2 V 0,05 s 0,001 s

5. Tblzat: Elektrokmiai polimerizcihoz alkalmazott potencil lpcsk

- 29 -

3.3.6.Fehrje-ktds vizsglata a polimer filmeken

3.3.6.1. Fehrje felvitele a polimer filmekre

A polimer filmekre 1-8 l fehrje-oldatot2 mrtem, az elektrdokat illetve

chipeket lefedve htldba tettem (az oldszer-prolgs minimalizlsra), majd a

jellemzen 30 perc inkubcis id leteltvel felitattam az oldatot, s az arany

szubsztrtot vzzel alaposan lebltettem, vgl megszrtottam.

Ezt a fehrje-felviteli eljrst tbbfle mvelet megvalstshoz is alkalmaztam.

Egyrszt visszaktds vizsglatakor gy vittem fel a mintkra az avidin-HRP, biotin-

HRP ill. HRP oldatot. Enzim nlkli avidin visszaktdsnek vizsglatakor az avidin

felvitelt kveten a fenti eljrst biotin-HRP oldattal is elvgeztem, gy a megkttt

avidinhez kapcsolt biotin-HRP-t tudtam kvanitfiklni.

Msrszt ezt az eljrst alkalmaztam akkor is, amikor a kt lpses imprintels

sorn az als polimer rtegre adszorbeltattam a templt avidin vagy avidin-HRP-t.

Nanorszecskhez kapcsolt avidin-HRP ill. biotin templt felvitelt ezzel

szemben a nanorszecske szuszpenzi arany szubsztrtra szrtsval oldottam meg, s

azokban a ksrletekben csak a fehrje-visszaktst valstottam meg a fenti mdon.

koncentrci [mg/ml] fehrje tpusa oldszer

0,1 avidin PB

0,1 avidin-HRP PB0,5 avidin-HRP PB0,5 biotin-HRP PB0,5 HRP PB

6. Tblzat: A ksrletek sorn alkalmazott fehrje-oldatok sszettele

2 Az imprintels sorn felmerlt nehzsgek miatt a ksrletek egy rszben mr csak biotinra

kpeztem lenyomatot, s annak a visszaktdst vizsgltam ugyanolyan mdon, mint az avidint. Habr

a biotin nem fehrje, az egyszersg kedvrt a 3.3.6. szakaszban fehrje alatt rtem a biotint is.

- 30 -

3.3.6.2. Megkttt fehrje mennyisgnek meghatrozsa

A HRP mennyisgnek meghatrozshoz kalibrcit vgeztem: 200 l TMB

reagenshez 5 l ismert koncentrcij enzim-oldatot adtam egy Eppendorf-csben,

majd az inkubcis id leteltvel 50 l 0,5 M-os knsavval lelltottam a reakcit. A

homogenizlt oldat 200 l-t mikrotiter tlcra mrtem, s mikrotiter tlca olvas

segtsgvel meghatroztam az abszorbancijt 450 nm hullmhosszon. Ezt a

mveletsort vak mintval (0,01 M pH = 7,4 foszft pufferben zrus enzimkoncentrci)

is elvgeztem.

A mintkon megkttt HRP mennyisgt azonos elven, de a minta

geometrijnak megfelelen mdostott elrendezsben mrtem. Az elektrdokat s az

SPR chipekbl vgott nyolcad darabokat az Eppendorf-csbe, mg a negyedelt SPR

chipeket egyenes talp veghenger aljra helyeztem, majd rjuk mrtem a (200 l)

TMB reagens oldatot. Nmelyik mintt nem tudtam a szk hengerben vzszintesen

elhelyezni, gy azokat nem lepte volna el teljesen a 200 l oldat. Ezekhez 400 l TMB-t

adtam, s ennek megfelelen a stop reagens knsav mennyisgt is megktszereztem,

gy a mrt abszorbancik kzvetlenl sszehasonlthatak.

3.3.6.3. Mossi lpsek

Az arany elektrdon kszlt polimer filmek mosst gy vgeztem, hogy az

elektrdot egy 2 ml mosfolyadkot tartalmaz veghengerbe mertettem, mikzben a

folyadkot kevertettem. A jellemzen 10 perces moss utn az elektrdot vzzel

lebltettem, s megszrtottam, majd a polimerben maradt fehrje mennyisgt a

3.3.6.2. szakaszban lertak szerint mrtem meg.

Az SPR chipen kialaktott polimereket mosoldatot tartalmaz fzpohrban

ultrahangos vzfrdre tettem.

Az alkalmazott mosfolyadkok az albbiak voltak:

vz

PB: 0,01 M-os, pH=7,4 foszft puffer

Tween: 5% Tween20 oldva 0,01 M-os, pH=7,4 foszft pufferben

PBS: 0,15 M NaCl oldva 0,01 M-os, pH=7,4 foszft pufferben

- 31 -

3.3.7.Nanorszecskk mdostsa

Jellemzen 20 l FluidMAG-biotin szuszpenzit 3*1 ml foszft pufferelt

soldattal (PBS: 0,01 M pH=7,4 PB-ben oldott 0,15 M NaCl) mostam, majd a msodik

moss utn a rszecskket 0,5 ml PBS-ben reszuszpendltam. (A nanorszecskket

mgneses szepartorral vlasztottam el a fellsztl.) Az sszegyjttt rszecskkhez

meghatrozott mennyisg fehrje-oldatot adtam (ez ksrletenknt eltr volt), s a

szuszpenzit 15 percig rzattam (~200 min-1). A szeparlst s a fellsz leszvst

kveten a rszecskket ismt 3*1 ml PBS oldattal, majd 3*1 ml PB oldattal mostam,

vgl a kvnt koncentrci elrshez szksges trfogat foszft pufferben

szuszpendltam.

3.3.7.1. Avidin blokkolsa biotinnal

Az 1 mg/ml-es avidin-oldathoz hromszoros anyagmennyisg biotin-oldatot

adtam 10 rszletben, minden rszlet hozzadsa utn 10 s-ig homogenizlva az oldatot.

A teljes mennyisg hozzadsa utn az oldatot mg 15 percig rzattam, hogy lehetleg

minden biotin kapcsoldjon avidinhoz, s gy tlagosan minden avidin molekula 4

kthelybl 3-at blokkoljak.

3.3.8.A visszaktds kirtkelse

A mrt abszorbancikbl az albbiak szerint szmoltam a polimereken megkttt

fehrje mennyisgt, illetve a felleti bortottsgot:

A mintk s standard oldatok abszorbanciibl kivontam az adott mrsi

sorozatban a vak mintra mrt abszorbancia rtkt, gy megkaptam az egyes

mintkra jellemz nett abszorbancikat.

A mrt nett abszorbancibl (A, aU) az adott mrs inkublsi idejhez (t, min)

tartoz kalibrcis egyenes meredeksgnek (mt, ml/mg) segtsgvel

meghatroztam, hogy milyen koncentrcij (c, mg/ml) HRP-oldatnak felel meg

az az enzimmennyisg, amely a jelet szolgltatta. A kalibrcis adatokat a

Fggelk tartalmazza.

tmAc (1)

- 32 -

A teljes reakcielegy trfogatnak (V, ml; jellemzen 0,25 ml), s az ppen mrt

enzimforma (avidin-HRP, biotin-HRP, vagy HRP) molris tmegnek (MW,

mg/mmol) ismeretben meghatroztam a polimer filmben lv (aktv)

enzimforma anyagmennyisgt (n, mol).

310MW

Vcn (2)

A polimer film tmrje (d = 3,5 mm) alapjn meghatroztam a sk felsznnek

tekintett polimer molekulris bortottsgt (b, mol/mm2).

2d

n4b (3)

- 33 -

4. Eredmnyek s rtkelsk

Diplomamunkm olyan j, molekulris lenyomatkpzsen s felleti plazmon

rezonancia rzkelsen alapul mrstechnikai eljrs kidolgozst clozta, amely

tetszleges teljes fehrjemolekulra vonatkoz imprintelsi protokoll gyors

optimalizlst, s a szenzor kialaktsnak ksznheten sszetett mintkbl tbbfle

clmolekula egyidej, szelektv detektlst teheti lehetv.

A szakirodalmi ttekintsben nagy rszletessggel trgyalt fehrje-imprintelsi

mdozatok kzl a vkony rtegek felleti lenyomatkpzst valstottam meg, de a

bemutatott mikro-kontakt imprintelstl eltr kivitelezsben. Ennek oka, hogy a

vlasztott, az automatizlhatsgot biztost mikrocseppentsi eljrssal ez a mdszer

nem megvalsthat. A felleti lenyomatkpzs elnye (a glek ellltsval szemben)

a polimer rteg nagyobb kmiai s mechanikai stabilitsa. Utbbihoz hozzjrul a

szenzor felleten val kialakts is, aminek azonban ennl is fontosabb hozadka, hogy

lehetsgess vlik nagy szm polimer film gyors s automatizlhat ellltsa s

vizsglata.

Az imprintelsi ksrleteimhez hasznlt modellfehrje, az avidin a tojsfehrjben

tallhat, tetramer szerkezet molekula. Mrete 10 nm krli, s magas izoelektromos

pontjnak (pI = 10,5) ksznheten a legtbb pH-n ersen pozitv tlts. Az avidin

templt s a vlasztott polimer (PEDOT-PSS) kztt tlnyomrszt hidrogn-hidas s

elektrosztatikus klcsnhatsokra lehet szmtani.

Az EDOT monomer redox mechanizmus polimerizcijt kmiai s fotokmiai

induklssal is elvgeztem, de a legclravezetbbnek az elektrokmiai megvalsts

bizonyult. Ehhez ltrehoztam egy olyan mikrocseppent tt, amelynek segtsgvel az

SPR felletre val felcseppentssel egyidejleg valsthat meg a monomerelegy

polimerizcija is.

Imprintelsi ksrleteimet az egyszersg kedvrt makroszkopikus mretben (a

mikrocseppentshez kpest legalbb ezerszeres trfogatban) vgeztem. Tbbfle

lenyomatkpzsi mdszert, s ktfle elektrokmiai polimerizcis eljrst is

kiprbltam. Kezdetben szabad fehrjt hasznltam templtknt, majd a polimer film

vastagsgnak jobb kontrolllhatsga rdekben nanorszecskhez prbltam

kapcsolni azokat, gy az imprintelhet polimer fellet is megnvekszik. Tovbbi elnyt

- 34 -

jelent, hogy a vlasztott, mgneses nanorszecskk alkalmazsa igen gazdasgoss

teheti az imprintelt rtegek ellltst, hiszen kls mgneses trben a

nanorszecskhez kapcsolt fehrje visszanyerhet a polimerbl, s gy jabb

lenyomatkpzshez felhasznlhat.

4.1. Kmiai s fotokmiai polimerizci

4.1.1.EDOT kmiai polimerizcija

A 3.3.1. szakaszban lertak szerint elvgeztem az EDOT monomer kmiai

polimerizcijt, klnbz arnyban alkalmazott ammnium-perszulft oxidlszer s

N,N,N,N-tetrametilndiamin (TEMED) kataliztor jelenltben. Az 7. Tblzatban

lthat, hogy a kataliztor/oxidlszer hnyados nvelse (V10, V20 mintk V11

minta) jelentsen lecskkentette a polimerizci lthat megindulsig szksges idt,

ugyanakkor a polimer vgs megjelense gy is tbb mint 3 ra alatt alakult csak ki.

Radsul a minta vilgos szne arra utal, hogy a nagy arny gykkpzds

kvetkeztben az sszefgg polimer hlzat helyett rvid lncok sokasga jtt ltre,

ami pedig a lenyomatkpzs szempontjbl clszertlen.

A fehrjk szmra mg elviselhet, 10% acetonitrilt tartalmaz kzegben

nagyobb a monomer oldhatsga, mint tiszta vzben, s a ktszeresre nvelt EDOT

koncentrci gyorsabban megindul polimerizcit is eredmnyezett (A10 s A20 jel

mintk), de a reakci teljes vgbemenetele vltozatlanul tbb rt vett ignybe. Ilyen

hossz id alatt az SPR szenzoron elhelyezett, igen kis trfogat csepp mr beszrad,

vagyis a kmiailag induklt polimerizci tl lass a kitztt cl megvalstshoz.

minta

jele

EDOT-PSS:APS:TEMED

mlarny

polimerizci

kezdetepolimer vgs megjelense

V11 1 : 1 : 1 10 perc srga oldat

V10 1 : 1 : 0,1 90 perc

V20 1 : 2 : 0,2 30 percfekets kk oldat

A10 1 : 1 : 0,1 15 perc

A20 1 : 2 : 0,2 1 perckilepedett fekete szemcsk

felett zldeskk oldat

7. Tblzat: EDOT kmiai polimerizcijnak eredmnye

- 35 -

4.1.2.EDOT fotokmiai polimerizcija

A 3.3.2. szakaszban ismertetett mdon, fotokmiai inicilssal is elvgeztem az

EDOT polimerizcijt. A tmbfzis s a cseppentett mintk is csak a megvilgts

kezdettl mrt 15-30 perc elteltvel vltak halvny srga sznv, s mindkt esetben

csak kisebb foltokban (a tmbfzis minta esetben a kvetta faln, a folyadkfelszn

felett) alakult ki a PEDOT polimerre jellemz fekete szn, tbb mint 3 ra UV

besugrzs utn. Ezekben a foltokban valsznleg beprlds, illetve a nem megfelel

oldat-homogenits kvetkeztben loklisan nagyobb monomer-koncentrci alakult ki,

s ez tette lehetv a polimerizci gyors, s sr hlzatot eredmnyez lezajlst.

Mivel azonban az EDOT maximlis vzoldhatsga (10 mM) mellett mg lass s nem

teljes a reakci vgbemenetele, ezrt a fotokmiai polimerizci sem alkalmas vkony

PEDOT filmek kialaktsra az SPR szenzor felletn.

4.1.3.Oligotron toldsa vizes kzegbe

Az EDOT (polimerizlhat metakrilt csoportokkal lezrt) oligomerje, az

Oligotron, gyorsan polimerizlhat UV fnyben, de az eredeti oldszere (nitrometn)

nem kompatibilis a fehrjkkel. Az oligomert ezrt a 3.3.3 fejezetben ismertetett mdon

megprbltam vizes kzegbe hozni.

Mivel a beszrtott oligomer egy rsze a beprlcs falra tapadt, s onnan

ultrahangos kever segtsgvel sem lehetett visszaoldani, ezrt csak az eredeti

trfogatnl kisebb mennyisg oldszert alkalmaztam a visszaoldsi prba sorn, hogy

ne hguljon jelentsen a minta.

Az optikai mikroszkpos vizsglat alapjn a nitrometnban diszperglt

oligomerek 1 m-es szemcsk formjban, egymstl elklnlten, szabadon

mozogtak. A metanolban illetve vizes metanolban (1:1) diszperglt mintban a

jellemzen 1-2 m-es, sszetapadt szemcsk kztt tbb, 5-10 m-es nagysg

aggregtum is megtallhat volt. A vizes szuszpenzi meghatrozan 4-8 m-es

aggregtumokbl llt, de kisebb mennyisgben tartalmazott 1-2 m-es szemcsket is.

Az elvgzett ksrletek alapjn az Oligotron nem diszperglhat vizes kzegben,

gy fehrjk lenyomatkpzsre alkalmatlan.

- 36 -

4.2. Electrospotting t ksztse s vizsglata

Mivel a kmiai s fotokmiai polimerizci nem bizonyult megfelelnek,

elektrokmiai ton kellett megoldani az EDOT polimerizcijt a szenzorfelleten.

A mikrocseppents sorn egy (elzleg folyadkba mertett) rozsdamentes acl tt

rint a robot a szenzor fellethez. Ahhoz, hogy a cseppentssel egyidejleg

valsthassuk meg az elektrokmiai polimerizcit is, egy olyan, szigetel anyagbl

kszlt kapillris toldattal kell elltni a tt, amelyben azonban a folyadk kpes egszen

az acl tvel val rintkezsig felkszni. Ezt a toldatot a 3.3.4.2. szakaszban lertak

szerint, pipettahegybl ksztettem el.

Az electrospotting t mint fell zrt kapillris folyadkba mertsekor a

kavitsban lv lgnyoms a kapillris emelkeds ellen hat, gy ahhoz, hogy

ugyanolyan magasra feljusson a folyadk, mint egy nyitott kapillrisban, sokkal

nagyobb adhzi szksges a kapillris bels fala s a folyadk (esetnkben vz) kztt.

Ennek elsegtsre a polipropiln felletet klnbz bevonatokkal igyekeztem

hidrofilizlni, a 3.3.4.1. szakaszban lert mdszerekkel.

Az alkalmazott polielektrolit bevonat hatsra javult a felszvkpessg, de

tovbbra is csak a nyitott hegy szvta fl a folyadkot a kell magassgig. Egy

szabadalmi leirat [64] nyomn poli(vinilpirrolidon) bevonattal is prblkoztam: az gy

hidrofilizlt, nyitott pipettahegyben igen jl emelkedett a folyadkszint, akrcsak a

plazmban kezeltekben. Vgl egy plazma-kezelt pipettaheggyel folytattam a

prblkozsokat, s azt tapasztaltam, hogy a rendelkezsre ll vgszerszmokkal

kivitelezhet legkisebb kavitsban sem volt kpes az acl tig emelkedni a

folyadkszint, a benn szorul levegbubork kvetkeztben. A pipettahegy vgt ezrt

ferdre vgtam, s gy a vz mr elrte az acl tt.

Az gy ksztett electrospotting tvel reproduklhatan sikerlt 600 m-es

tmrj PEDOT filmet ltrehozni arany felleten. A tovbbiakban az imprintelsi

ksrleteket az egyszerbb kivitelezs kedvrt makroszkopikus mretekben

vgeztem.

- 37 -

4.3. Imprintelsi ksrletek

Az imprintelsi ksrleteket egy, a tmbpolimerizcis eljrshoz hasonl

elegysszettellel kezdtem, vagyis a fehrje a monomerelegyben volt oldva.

Elektrokmiai polimerizcival vkony polimer filmet hoztam ltre, amelyben

elviekben a vletlenszeren elhelyezked fehrje molekulk nagy valsznsggel

kerltek volna a felszn kzelbe is, s gy knnyen hozzfrhet, felleti lenyomatokat

kpeztek volna (7. bra a)). Mivel azonban a vlasztott fehrje a vrakozsokkal

ellenttben- nem tudott feldsulni a felleten a polimerizci ideje alatt, ezrt ms

mdszerre trtem t.

Ennek sorn a fehrjket egy vkony, nem imprintelt polimer rtegre

adszorbeltattam, majd egy olyan vkony polimer filmet prbltam kzjk nveszteni,

amely nem lepi el a ket (7. bra b)). Az avidin molekulk tmrje mindssze 10 nm

krl van, ezrt a polimer film vastagsgt nagyon pontosan kellene tudni szablyozni.

Ez nem sikerlt, ezrt a templt eltvoltsa nehzsgekbe tkztt.

A polimer vastagsgnak jobb szablyozhatsga rdekben vgl 100 nm

tmrj nanorszecskhez kapcsolt fehrjvel imprinteltem. Ekkor a nanorszecskhez

kapcsolt templtot mr kzvetlenl az arany felletre (s nem egy als polimer rtegre)

vittem fel, majd a nanorszecskk kz PEDOT-PSS rteget polimerizltam (7. bra c)).

- 38 -

7. bra: Diplomamunkmban alkalmazott lenyomatkpzsi mdszerek. a) egy lpses imprintels:

vkony film ellltsa a templtot is tartalmaz monomerelegybl, b) kt lpses imprintels:

vkony polimer rteg ltrehozsa egy als polimer filmre adszorbeltatott templtok kr, c)

imprintels nanorszecskkkel: vkony polimer rteg ltrehozsa az arany felletre

adszorbeltatott templtok kr.

4.3.1.Egylpses imprintels

A fehrje-imprintelsi ksrleteket avidin modellfehrjvel kezdtem, amelyhez a

kzvetlen detektlhatsg kedvrt tormaperoxidz (HRP) enzim volt kapcsolva. Az

enzim mennyisgt egy reagens (TMB) nagy feleslegben trtn hozzadsval

hatroztam meg, amelynek hidrognperoxiddal trtn oxidcijt az enzim katalizlja,

s amelybl a reakci hatsra kk szn termk kpzdik (jellemz elnyelsi

hullmhossza 655 nm). Az enzimreakcit tmny knsavval lltjuk le, amely az

enzimet inaktivlja. A sav hatsra a termk talakul, srga szn lesz (jellemz

elnyelsi hullmhossza 450 nm). gy az oldat fotometris mrsekor az abszorbancibl

a keletkezett termk mennyisge, illetve ezen keresztl az enzim mennyisge

kalibrcival meghatrozhat.

- 39 -

A 3.3.5.1 szakaszban lertak szerint klnbz vastagsg imprintelt s nem

imprintelt polimer filmeket hoztam ltre az A sszettel prepolimerizcis elegyek

alkalmazsval, kronoamperometris mdon. A vkonyabb filmeket 15 s-ig, a

vastagabbakat 30 s-ig polimerizltam 0,7 V (illetve a fehrjt is tartalmaz elegyek

esetben elksrletek tapasztalataira tmaszkodva 0,8 V) potencilon. A kapott filmek

megjelensbeli sajtossgait a 8. Tblzatban foglaltam ssze. A PEDOT filmek srgs

szne 10 nm krli, mg a kkes szn 10-100 nm-es rtegvastagsgra utal.

mintajele

prepolimerizciselegy

alkalmazottpotencil

polimerizciideje

thaladttlts megjelens

E1 A MIP 0,8 V 30 s 1,16 mC kk rteg

E2 A MIP 0,8 V 15 s 0,635 mC kk gyrbensrga rteg

E3 A NIP 0,7 V 30 s 0,689 mC vilgoskkrteg

E4 A NIP 0,7 V 15 s 0,342 mC srga rteg

8. Tblzat: Egylpses polimerizcival ellltott filmek

A polimerekbl a 3.3.6.3. szakaszban lert mdon kimostam a templtot: tszr

Tween, hromszor PB, vgl vz mosoldatban val kevertetssel (10-10 percig). A

kimosottsg ellenrzst kveten 1-1 l 0,1 mg/ml-es avidin-HRP (PB-ben, 10 percig)

visszaktdst vizsgltam az elektrdokon, a 3.3.6. szakaszban lert mdon. A ktds

erssgnek vizsglatra a mintkat a 3.3.6.3. szakasz szerint foszft pufferrel, majd

tweenes oldattal mostam, mindkt lps utn megmrve a polimerekben maradt avidin-

HRP mennyisgt. A mrt abszorbancikbl kiszmtottam, hogy az egyes lpsek utn

mekkora a polimer filmek enzim-bortottsga, s a kapott rtkeket a Fggelkben,

valamint a 8. brn tntettem fel.

Lthat, hogy az imprintelt polimerek nem tudtak a referencia polimerhez kpest

nagyobb mennyisg avidin-tormaperoxidzt megktni, s a megkttt fehrje foszft

pufferrel knnyen lemosdott, azaz nem valsult meg a lenyomatkpzs. gy vltk,

ezt az okozhatta, hogy a polimerizci sorn a pozitv potencilon tartott fellethez a(z

alkalmazott pH-n) a szintn pozitv tlts avidin nem tudott kzel jutni. Ennek

lekzdsre a kvetkez ksrletekben kt lpsben vgeztem el az imprintelst.

- 40 -

0,00E+00

5,00E-16

1,00E-15

1,50E-15

2,00E-15

2,50E-15

visszakttt PB Tween

mossi lpsek

fel

leti

bort

otts

g [m

ol/m

m2 ]

: E1 (vastag MIP) : E2 (vkony MIP) : E3 (vastag NIP) : E4 (vkony NIP)

8. bra: Egy lpsben imprintelt polimer filmek ltal visszakttt avidin-HRP mennyisge.

Rszletes adatok a Fggelkben.

4.3.2.Ktlpses imprintels

4.3.2.1. Avidin-HRP-re imprintelt EDOT-PSS filmek

Els lpsben kronoamperometrisan, 15 illetve 30 s-ig tart polimerizcival,

0,7 V feszltsget alkalmazva ltrehoztam nem imprintelt rtegeket a B sszettel

elegybl. Az imprintelshez 0,1 mg/ml-es avidin-HRP oldatot adszorbeltattam a

polimerrtegekre, a 3.3.6.1. szakaszban ismertetett mdon, s megmrtem az

adszorbelt fehrje mennyisgt. Az elektrdokra (a nem imprintelt mintkra is) ez utn

jabb 15 s-ig tart, kronoamperometris polimerizcival 0,7 V-on egy msodik

PEDOT rteget nvesztettem (9. Tblzat).

1. rteg 2. rtegminta jele polim.

idejethaladt

tlts megjelensthaladt

tlts megjelens

K1 MIP 30 s 0,647 mC vilgoskk rteg 0,196 mCK2 MIP 15 s 0,290 mC narancssrga rteg 0,321 mC

zldeskk rteg

K3 NIP 30 s 0,633 mC vilgoskk rteg 0,374 mC vilgos,kkeszld rteg

K4 NIP 15 s 0,305 mC narancssrga rteg 0,332 mC v.kk gyrbensrgs rteg

9. Tblzat: Ktlpses polimerizcival ellltott PEDOT-PSS filmek

- 41 -

Miutn az imprintelt mintkon megmrtem a msodik PEDOT-PSS rtegbl

hozzfrhet templt mennyisgt, a polimereket tszri tweenes, hromszori foszft

pufferes, vgl tiszta vz mosoldatban val kevertetssel (10-10 percig) kimostam. A

templt eltvoltsnak ellenrzse utn megmrtem az avidin-HRP visszaktdst

(1 l 0,1 mg/ml-es avidin-HRP PB-ben, 10 percig), s ktszeri foszft pufferes, vgl

tweenes mosssal vizsgltam a ktds erssgt. Minden lpst kveten megmrtem

a polimerekben lv fehrje mennyisgt (9. bra). Nem tapasztaltam szignifikns

klnbsget a MIP s a NIP kztt sem kzvetlenl a visszaktds utn, sem a mossi

lpseket kveten.

0,0E+00

2,0E-16

4,0E-16

6,0E-16

8,0E-16

1,0E-15

1,2E-15

1,4E-15

1,6E-15

1,8E-15

2,0E-15

adszorbelt hozzfrhet tisztasg ell. visszakttt 1. PB 2. PB tween

mossi lpsek

fel

leti

bort

otts

g [m

ol/m

m2 ]

: K1 (vastag MI)P : K2 (vkony MIP) : K3 (vastag NIP) : K4 (vkony NIP)

9. bra: Kt lpsben imprintelt PEDOT-PSS filmek ltal visszakttt avidin-HRP mennyisge.

Rszletes adatok a Fggelkben.

A ksrletben az els problma az volt, hogy az avidin kzismerten ers

adszorpcis tulajdonsga ellenre az elmleti teljes avidin-bortottsg (8,3*10-14 mol

avidin/mm2 [65]) tredkt mrtem csak a templt als polimer rtegen val

adszorpcijakor. Feltteleztem, hogy esetleg a nagy ionerssg monomer-oldat

inaktivlja a HRP enzimet, s emiatt tnt gy, hogy nagyon kicsi az avidin

adszorpcija. Ezrt a kvetkez ksrletekben enzim nlkli avidint hasznltam

- 42 -

templtknt, s a mennyisgt kzvetetten, biotin-HRP hozzkapcsolsval mrtem

meg3.

A msik problma az volt, hogy a fels polimer rteg elkszlte utn mr csak

nagyon kis avidin-HRP mennyisg volt mrhet, ami arra utalhat, hogy a polimer rteg

nagyrszt bebortotta az avidin-HRP-t. Valszn, hogy ezutn nem is tudtam rendesen

kimosni, vagyis a kthelyek nem szabadultak fel.

4.3.2.2. Avidinre imprintelt EDOT-PSS filmek

Az j mintkat az elzekhez hasonl mdon ksztettem el, azzal a

klnbsggel, hogy az imprintelshez most avidin-HRP helyett 0,1 mg/ml avidin

oldatot hasznltam, illetve az als polimer rteget minden esetben 15 s-ig tart

polimerizcival hoztam ltre. Mivel az elz tapasztalatok azt mutattk, hogy mg a

15 s-ig polimerizlt fels rteg is bebortja a fehrjt (9. bra), ezrt az j mintk

esetben vkonyabb fels rteget ksztettem: 5 s-ig tart polimerizcival (10.

Tblzat).

A korbbihoz hasonlan, de most biotin-HRP kapcsolsn keresztl (3.3.6.1.)

megmrtem a msodik PEDOT-PSS rtegbl hozzfrhet templt mennyisgt, majd a

polimereket tszri tweenes, hromszori foszft pufferes, vgl tiszta vz mosoldatban

val kevertetssel (10-10 percig) kimostam. A templt eltvoltsnak ellenrzse utn

megmrtem az avidin visszaktdst a rtegekbe (1 l 0,1 mg/ml-es avidin PB-ben 30

percig, majd 0,5 mg/ml biotin-HRP kapcsolsa PB-bl 30 percig), s pufferes mosssal

vizsgltam a ktds erssgt, utbbi esetben mr jabb biotin-HRP kapcsolsa nlkl

(10. bra).

3 A biotin molekula az avidinnel a legersebb ismert ligandum-fehrje klcsnhatst ltesti, 15

ponton lpnek fel msodlagos kterk a kismret biotin molekula s az avidin kztt. A kialakul

komplex stabilitsi llandja 1015 M-1.

- 43 -

als rteg (15 s) fels rteg (5 s)minta jele thaladt tlts

(mC) megjelensthaladt tlts

(C) megjelens

K5 MIP 0,135 47,2K6 MIP 0,208 64,8K7 MIP 0,300 79,7K8 MIP 0,287 33,1K9 NIP 0,210 103K10 NIP 0,228 102K11 NIP 0,260 114K12 NIP 0,262

srga rteg

99,2

srga rteg

10. Tblzat: Ktlpses polimerizcival, avidinre imprintelt PEDOT-PSS filmek

0,00E+00

5,00E-16

1,00E-15

hozzfrhet tisztasg ell. visszakttt avidin PB (biotin nlk.)

fel

leti

bort

otts

g [m

ol/m

m2 ]

MIP NIP

10. bra: Kt lpsben imprintelt PEDOT-PSS filmek ltal tlagosan visszakttt avidin

mennyisge, detektls biotin-HRP kapcsolsval. A hibasvok a 2 ill. 4 prhuzamos mrs

terjedelmt jellik, rszletes adatok a Fggelkben.

A biotin-HRP-vel trtn detektlsnak (amely enzimforma nem rintkezett a

monomer oldattal), illetve a vkonyabb fels polimer rtegnek ksznheten mintegy

kt nagysgrenddel nagyobb mennyisg hozzfrhet fehrjt mrtem a kt rteg

- 44 -

polimerben a polimerizci befejezte utn. Az avidin visszaktdse nmileg nagyobb

volt az imprintelt polimeren, mint a nem-imprintelten, br a mrs szrsa

meglehetsen nagy volt. A visszaktds erssge azonban tovbbra sem bizonyult

megfelelnek, hiszen a foszft pufferes moss utn most sem volt jelents klnbsg az

imprintelt s a referencia polimerben megtartott fehrje mennyisge kztt.

A harmadik ksrlet-sorozatban a nagyobb erssg kthelyek kialaktsa

rdekben maleint egysgeket is tartalmaz poli(ntrium-4-sztirolszulfont)-ra (PSSM)

cserltem az EDOT ellenionjt. Ez j funkcis csoportokat; gyengn savas

karboxilcsoportokat is tartalmaz az ersen savas szulfonsavcsoportok mellett s

vrhatan tbb ponton tud klcsnhatst kialaktani a fehrjvel.

4.3.2.3. Avidinre imprintelt EDOT-PSSM filmek

A msodik ksrlet-sorozattal azonos mdon, de a C sszettel prepolimerizcis

elegyet (3.3.5.1) alkalmazva, elksztettem a 11. Tblzatban felsorolt, avidinre

imprintelt, kt rteg polimereket.

A msodik rtegbl hozzfrhet templt mennyisgt biotin-HRP kapcsolsval

megmrtem, majd a polimereket tszri tweenes, hromszori foszft pufferes, vgl

tiszta vz mosoldatban val kevertetssel (10-10 percig) kimostam. A templt

eltvoltsnak ellenrzse utn megmrtem az avidin visszaktdst a rtegekbe (1 l

0,1 mg/ml-es avidin PB-ben 30 percig, majd 0,5 mg/ml biotin-HRP kapcsolsa PB-bl

30 percig), s pufferes mosssal vizsgltam a ktds erssgt, utbbi esetben mr

jabb biotin-HRP kapcsolsa nlkl. A visszaktds mrst ktszer vgeztem el (11.

bra).

als rteg (15 s) fels rteg (5 s)minta jele thaladt tlts

(mC) megjelensthaladt tlts

(C) megjelens

K13 MIP 0,136 53,0K14 MIP 0,164 58,5K15 MIP 0,157 54,3K16 NIP 0,152 74,1K17 NIP 0,164 84,2K18 NIP 0,132

srga rteg

72,3

narancs-srga rteg

11. Tblzat: Ktlpses polimerizcival, avidinre imprintelt PEDOT-PSSM filmek

- 45 -

0,0E+00

5,0E-16

1,0E-15

1,5E-15

hozzfrhet(adszorbelt)

tisztasg ell. visszakttt PB-s mossutn

tisztasg ell. visszakttt PB-s mossutn

fel

leti

bort

otts

g [m

ol/m

m2 ]

MIP NIP

11. bra: Kt lpsben imprintelt PEDOT-PSSM filmek ltal tlagosan visszakttt avidin

mennyisge. A hibasvok a 3 prhuzamos mrs terjedelmt jellik, rszletes adatok a Fggelkben

A 11. brn lthat, hogy a visszaktds jl reproduklhat volt, de tovbbra

sem tanskodott sikeres lenyomatkpzsrl; nem volt klnbsg az imprintelt s a nem

imprintelt rtegek kztt, s az enyhe pufferes moss is eltvoltotta a visszakttt

fehrje zmt. A vltozatlanul alacsony szint templt-hozzfrhetsg azt sejteti, hogy

az 5 s alatt ltrehozott polimer rteg is olyan vastag, hogy befedi a fehrjt. A

tovbbiakban ezrt 100 nm tmrj, mgneses nanorszecskhez kapcsolt fehrjvel

prbltam imprintelni. gy az arany felletre rendezett nanorszecskk kz akr 50 nm

vastag polimer rteg is nveszthet (szemben a fehrje sajt mrete ltal megengedett

5 nm-es vastagsggal), anlkl, hogy a nanorszecskk s velk a fehrjk

eltemetdnnek (7. bra c)).

- 46 -

4.3.3. Imprintels nanorszecskhez kapcsolt templttal

A vasoxid maggal rendelkez, kemnyt mtrixszal bevont nanorszecskket

biotinilltan vsroltuk. A termk specifikciban szerepl adatok alapjn egy

nanorszecskhez tlagosan mintegy 500 biotin kapcsoldik (szmtsok a

Fggelkben: 8.3). A szemcsk paramgneses tulajdonsgak, vagyis nmagukban nem

mgnesesek, de kls mgneses tr segtsgvel elvlaszthatak az oldatfzistl. A tbb

vasoxid mag kvetkeztben a szemcsk az imprintelsi mechanizmust bemutat brval

(7. bra.) ellenttben szablytalan alakak (12. bra).

12. bra: TEM felvtel az sszetapadt vasoxid magokrl [66]

4.3.3.1. Nanorszecskk mdostsa avidinnel

A biotinilltan vsrolt nanorszecskkhez a 3.3.7. fejezetben ismertetett mdon

prbltam avidint kapcsolni. Mivel a kapcsolshoz a gyrt nem adott meg kidolgozott

eljrst, az els ksrletben a gyrt egy msik, hasonl termkhez tartoz kapcsolsi

protokollt adaptltam [67], s gy a fluidMAG-biotin termk specifikcijban szerepl

elmleti avidin-kt kapacits (1,410-11 mol avidin/l fluidMAG-biotin szuszpenzi)

1,8-szerest adtam a nanorszecskkhez. Mivel azonban egy avidin ngy biotint is

megkthet, gy a mdost fehrje sszekapcsolta a nanorszecskket, s szabad

szemmel is lthat aggregtumok keletkeztek (13. bra). A 2-4. ksrletekben (12.

Tblzat) ezrt mg nagyobb avidin-feleslegeket alkalmaztam, de ez sem szortotta

vissza az aggregcit. Az 5. ksrletben megprbltam az avidin ngy kthelybl

tlagosan hrmat elzetesen szabad biotinnal lektni (3.3.7.1), majd a blokkolt

avidinnel mdostani a fluidMAG-biotin rszecskket, de ez sem hozta meg a vrt

eredmnyt.

- 47 -

mdostott

fluidMAG-biotin

szuszpenzi

mdost fehrje-oldat

(0,5 mg/ml, PBS-ben)

alkalmazott

avidin-

felesleg

megjegyzs

1. 20 l 160 l avidin-HRP 1,8x

2. 20 l 200 l avidin 5x

3. 4 l 80 l avidin 10x

4. 4 l 160 l avidin 20x

5. 20 l 100 l 1mg/ml-es avidin 2,5x blokkolt avidin

6. 5 l 48,5 l avidin 5x szuszpenzi

7. 5 l 48,5 l avidin 5xblokkolt avidin,

szuszpenzi

12. Tblzat: FluidMAG-biotin rszecskk mdostsa

Valsznleg az alkalmazott igen nagy avidin-feleslegek azrt nem tudtk

megakadlyozni az aggregtum-kpzdst, mert az sszegyjttt nanorszecskkhez

trtn hozzadsukkor a vortexelst megelz pillanatokban loklisan ppen az

sszetmrtett nanorszecskk voltak nagy feleslegben. Ahhoz, hogy az avidin valban

minden pillanatban feleslegben lehessen, a nanorszecskknek hg szuszpenziban kell

lennik, amikor a fehrjvel tallkoznak. Ennek megvalstsra a 6. ksrletben a

szokott mdon megmosott nanorszecskkbl 160 l foszft pufferes szuszpenzit

ksztettem, amelyet 10 rszletben adagoltam az tszrs feleslegnyi avidint tartalmaz

oldathoz. A nanorszecske-szuszpenzi minden rszletnek hozzadsa utn 10 s-ig

homogenizltam az elegyet, majd a teljes mennyisg hozzadsa utn tovbbi 15 percig

rzattam, vgl 3.3.7. szakaszban lertak szerint mostam a rszecskket.

- 48 -

a) b)

13. bra: Elektronmikroszkpos felvtel arany felletre szrtott, a) avidinnel mdostott (12.

Tblzat/2.), illetve b) mdostatlan nanorszecskkrl. Lthat, hogy mg a mdostatlan szemcsk

homogn bortst adnak, addig a mdostott nanorszecsk aggregldtak, s csak kis hnyaduk van

jelen egyedi szemcseknt.

A szuszpenzis mdosts is aggregtumok kpzdshez vezetett, mg blokkolt

avidin alkalmazsval is, ezrt az avidin-tormaperoxidzzal mdostott szemcskbl

megfelelen hg szuszpenzit ksztettem foszft pufferben, amit kettosztottam. A

szuszpenzi egyik felt 3 s-ig ultrahangos kevervel kezeltem. Ennek hatsra az

aggregtumok sztestek, s homogn, srga oldatot kaptam. Kontrollknt a 10-4 mg/ml-

es avidin-HRP oldat (PB-ben) egyik felt ugyangy kezeltem ultrahanggal, majd a

3.3.6.2. szakaszban lert mdon meghatroztam az ultrahanggal kezelt s nem kezelt

mintk aktivitst.

- 49 -

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

3,50

4,00

nem kezelt ultrahangozott

nett

abs

zorb

anci

a [a

U]

: FluidMAG-hoz kapcsolt (F) : 0,0001 mg/ml szabad (S)

14. bra: Ultrahangos kezels hatsa a tormaperoxidz enzim aktivitsra. A hibasvok a kt-kt

prhuzamos mrs egyedi rtkeit mutatjk. Rszletes adatok a Fggelkben.

A 14. brn lthat, hogy a szabad avidin-HRP aktivitsa kevesebb mint

ktharmadra cskkent az ultrahangos kezels hatsra. Ugyanakkor a

nanorszecskhez kapcsolt enzimet tartalmaz mintban jelentsen megnvekedett az

enzimaktivits. Ezt felteheten az aggregtumok sztesse okozta, hiszen gy jelents

mennyisg enzim kerlt jl hozzfrhet helyzetbe.

Habr az ultrahangos kezelssel sikerlt aggregtumoktl mentes (15 percen tl

leped) fehrje-mdosts nanorszecskket ellltani, az ultrahang fehrje-krost

hatsa miatt ezt a mdszert nem tudtam elfogadni.

A nanorszecskk aggregci-mentes avidin-mdostsnak nehzsgei miatt a

tovbbi ksrleteimet mdostatlan nanorszecskkkel vgeztem.

- 50 -

4.3.3.2. Mdostatlan nanorszecskk vizsglata

Cseppentsi elksrlet

A fluidMAG-biotin szuszpenzibl hromszori vizes mosssal eltvoltottam a

termk tartstsra hasznlt ntrium-azid nyomokat4, majd 0,3, illetve 0,06 mg/ml

koncentrcij vizes szuszpenzikat ksztettem a rszecskkbl. Mivel korbbi

tanszki mrsek azt mutattk, hogy a templt az aranyon is jl adszorbeldik, ezrt a

nanorszecsks imprintelsi ksrletekben mr elhagytam az als polimer rteget, s a

fluidMAG-biotin szuszpenzik 5-5 l-t megtiszttott SPR szenzor felletre

pipettztam. Mindkt koncentrcibl egy-egy mintt enyhn (~200 min-1), illetve

intenzven rzatva (2000 min-1) beszrtottam. Azt tapasztaltam, hogy az enyhn

mozgatott mintkon a nanorszecskk szoros illeszkeds, nrendezd rteget

kpeztek, az eredeti cseppmrethez kpest (a felletre szrtott nanorszecskk

szmval kzel arnyosan) cskkent terleten (15. bra). Intenzv rzats hatsra

szablytalan alak, inhomogn foltok keletkeztek, gy a nanorszecskk felvitelt a

tovbbiakban enyhe rzatssal valstottam meg. Mivel a 6. bra b) rszn lthat cella

elrendezssel az 5 l-es cseppek mretnl nagyobb, 3,5 mm tmrj polimer film

hozhat ltre, ezrt a beszrtst 20 l-bl is elvgeztem. Az gy elrhet mintegy 5 mm

tmrj cseppterlet leghomognebb bortst 0,15 mg/ml-es szuszpenzi

rszrtsval kaptam, ezrt ezt a koncentrcit alkalmaztam a tovbbiakban.

15. bra: Arany felletre szrtott 5-5 l fluidMAG-biotin szuszpenzi a nanorszecskk szoros

illeszkeds nrendezdse optikai mikroszkpos felvtel

4 A ntrium-azid a HRP enzim aktivitst jelentsen cskkenti.

- 51 -

Nanorszecskk jelenltnek vizsglata

Megtiszttott SPR chipekre nem mdostott fluidMAG-biotin szemcsket

szrtottam, majd a 3.3.5.2. szakaszban bemutatott mdon a C sszettel elegybl

polimer filmet hoztam ltre a chipeken. A filmvastagsg jobb szablyozhatsga

rdekben a korbbi kronoamperometris mdszer helyett potencil pulzusokat

alkalmaztam [68]. A 250 illetve 500 ciklussal5 polimerizlt filmek egy rszt 5 percig

vzben ultrahangoztam, hogy eltvoltsam a nanorszecskket.

Elektron- illetve atomer mikroszkpos felvtelek alapjn prbltam

megllaptani, hogy az imprintelt polimer rtegekben maradtak-e nanorszecskk az

ultrahangos frdben val moss utn.

Az elektronmikroszkpos felvtelek (17. bra) ugyan kzvetlenl nem

hasonlthatak ssze, mivel klnbz nagytssal kszltek, de az megllapthat,

hogy a SEM felbontsa nem elegend ahhoz, hogy klnbsget tehessnk a templtot

tartalmaz s nem tartalmaz mintk kztt. Az elektronmikroszkppal a polimer

rtegek hatrrl ksztett elemsszettel-trkp sem mutatott egyrtelmen

elklnthet vas-gazdag s vas-szegny rgikat, holott a polimert nem tartalmaz

felletrszen nem lehettek vasoxid mag nanorszecskk, mg a vizsglt

polimerfilmben szmosan voltak.

A nanorszecskk jelenlte az atomer mikroszkppal ksztett kpeken sem volt

egyrtelmen megllapthat.

5 Ezek a ciklusszmok 12,5 ill. 25 s-ig tart kronoamperometris polimerizcinak felelnek meg.