Upload
others
View
13
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Doc. dr. sc. Mirna Curkovic Perica
Sveucilište u Zagrebu, Biološki odsjek PMF-a, Botanicki zavod sBotaničkim vrtom, Grupa za molekularnu mikrobiologiju
Marulicev trg 9a, 10000 Zagreb
Tel/Fax **385-1- 4843-851, e-mail: [email protected]
-molekularna fitopatologija, kultura biljnog tkiva, transformacijabiljnih tkiva (bazična i primjenjena istraživanja – važnost zapoljoprivredu i šumarstvo)
-rak kestena (biološka kontrola)
-utjecaj bioaktivnih supstancija na biljne patogene – viruse i fitoplazme
-(haploidi i dihaploidi, fiziološke posljedice)
-transformacija biljnog tkiva – utjecaj na sekundarne produktemetabolizma i horizontalni transfer gena
Prirodni arealameričkogpitomog kestenaprije unosapatogena Prirodni areal europskog pitomog
kestena
Američkipitomi kesten –osjetljiv
Gljiva Cryphonectria parasitica –uzročnik raka kestenove kore - slabparazit na azijskim kestenima
Europski pitomi kesten – osjetljiv – ali gljivahipovirulentna zbog dsRNA u citoplazmi
Cryphonectria parasitica –karantenski organizam
izaziva rane na stablu, ljuštenjekore i odumiranje
hipovirus smanjuje virulentnostgljive i sposobnost njezinograzmnožavanja
mogućnost biokontrolehipovirusom ovisi o tipuvegetativne kompatibilnosti gljive injezinom načinu razmnožavanja,te o tipu i izolatu hipovirusa
Cryphonectria hypovirus
• dsRNA u citoplazmi gljive• nema strukturnih proteina
ni viriona• U Europi samo CHV1 (od 4
vrste identificiranesekvenciranjem)Modifikacija transkriptomagljive
Širenje hipovirusa krozpopulacije gljive
• Prirodno širenje:- vertikalno – kroz aseksualne spore
(konidije) 1-99%- horizontalno – fuzija hifa između
vegetativno kompatibilnih jedinki gljive• Ljudskom aktivnošću – pokušaji biokontrole
Test vegetativne kompatibilnosti• 2 su izolata kompatibilnaako im se hife spoje
• 2 su izolata nekompatibilnaako se između njih pojavibaražna linija i/ili linijapiknida
C. parasitica – spolno razmnožavanje
Oplodnja se događa samo između gameta koje imajurazličite alele na (bialelnom) MAT lokusu
Cilj rada• ispitati proširenost hipovirusa u populacijama gljive
Cryphonectria parasitica i napraviti molekularnukarakterizaciju izolata (već radi mr.sc Lj. Krstin)
• ispitati značajke populacija gljive C. parasitica koje utječu naširenje hipovirusa:
raznolikost vc tipovaocijeniti mogućnosti rasta broja vc tipovauloga spolnog razmnožavanja gljive u oblikovanjustrukture istraživane populacije kroz ispitivanje omjeraMAT alela (PCR)molekularna karakterizacija populacija pomocu “sequence-characterized amplified regions” (SCARs) markera (Daviset al. 2005) (multiplex PCR i gene analyser)
-transformacija gljive čitavim virusom ili dijelovim NA virusa
-biološka kontrola, primjena u šumarstvu
• Fitoplazme - biljni patogeniiz razreda Mollicutes(prokarioti bez staničnestijenke, slični mikoplazmama)
•Fitoplazme - uzročnici višestotina bolesti biljaka širomsvijeta
OGROMNE ŠTETE UPOLJOPRIVREDI (PRINOS IKVALITETA
•Istraživanja otežana, jer se fitoplazme ne mogu uzgojiti nahranidbenim podlogama (tek započela klasifikacijafitoplazmi) – karakterizacija fitoplazmi na lozi, voćkama,cvijeću...
- nepoznate metode za dobivanje biljaka oslobođenih odfitoplazmi
Krčenje bolesnih biljaka
Mehanizmi interakcije biljka-fitoplazma
• simptomi su posljedica poremećaja normalne hormonskeravnoteže
• utjecaj na ekspresiju određenih gena domaćinske biljke
METODE
• izolacija ukupnih nukleinskih kiselina (TNA)
• umnožavanje fitoplazmatskog gena za 16S rRNAugnježđenom lančanom reakcijom polimeraze (nestedPCR) koristeći univerzalne i specifične parove početnica
• analiza polimorfizma duljine restrikcijskih fragmenata(RFLP) i sekvenciranje
-uzgoj haploida iz polena
-testiranje na patogene
-fiziologija zaraženihbiljaka
-diploidizacija
Gene silencing u haploidimai dihaploidima (odgovor narazličite viruse)
Agrobacterium tumefaciens
Biljna stanica
gen za selekciju transformanata (nptII)gen za željeno svojstvo
Transformirana biljna stanica
Hranidbena podloga za selekcijutransformiranih biljnih stanica
regeneracija biljaka iztransformiranih stanica
Dobivanje biljaka željenih svojstava. Transformirane biljnestanice selekcioniraju se na hranidbenoj podlozi s dodatkom antibiotika.Iz transformiranog tkiva moguce je potaknuti regeneraciju biljakapomocu biljnih regulatora rasta. Sve stanice regenerirane biljke sadržegen za željeno svojstvo, ali i gen za rezistenciju na antibiotik.
horizontalni transfer gena iztransformiranih biljaka unemodificirane, te u prirodnokompetentne bakterije u tlu
HPLC, vakumski uparivac
multifunkcionalni mikrotitarski citac fluorescencije, spektrofotometar
termostatirana tresilica, vodena kupelj s tresilicom
inkubator, autoklav, Millipore sustav za procišcavanje vode
Eppendorf centrifuga s hladenjem (ultracentrifuga)
PCR uredaji
oprema za razlicite izvedbe elektroforeze
UV-transiluminator, VIS-transiluminator, polaroid kamera
mini centrifuge, analiticka vaga, pH-metar, vrtložne mješalice
sterilna komora (laminar)
zamrzivac (-80°C), hladna komora, hladnjaci, zamrzivaci
mikroskopi (elektronski mikroskop)