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FIBROSIS QUÍSTICA
CURSO 2006 - 2007Nº 7
I.S.B.N. 13 978-84 -611-5159-2
Nº Registro: 0716627
Depósito Legal: M-5672-2007
Título: Actualizaciones en el Laboratorio Clínico
Editor: Asociación Española de Biopatología Médica
Distribuye: AEBM
Fecha de Distribución: Mayo 2007
Imprime: GAYCE, S.A. (C/ Comandante Zorita, 49 - 28020 MADRID)
1
FIBROSIS QUÍSTICA
Carolina Peña Tejeiro. Facultativo especialista de área. Servicio Análisis Clínicos.
Hospital Universitario Santa Cristina. Madrid.
Concepción Alonso Cerezo. Facultativo especialista de área. Unidad de Genética.
Servicio Análisis Clínicos. Hospital Universitario de la Princesa. Madrid.
1. INTRODUCCIÓN
La fibrosis quística (FQ) es una enfermedad genética autosómica recesiva (AR), es
decir, el paciente debe ser portador de mutaciones en ambos genes CFTR (cystic
fibrosis transmenbrane conductance regulator) para que se manifieste la
enfermedad. Si el individuo es heterocigoto, es portador asintomático (presenta un
alelo mutado y otro no). El gen de la FQ se identificó y clonó en 1989 y se localiza
en el brazo largo del cromosoma 7. Consta de 250 kb, distribuidos en 27 exones, y
codifica una glicoproteína transmembrana de 1.480 aminoácidos, que funciona como
un canal de cloro regulado por el cAMP1 2. El gen CFTR codifica una proteína que es
sintetizada en el núcleo y conlleva una serie de procesos antes de quedar finalmente
situada en la membrana celular. Comprende 1.480 residuos aminoacídicos, funciona
como un canal de cloro dependiente de AMPc y produce la apertura del canal. Por su
estructura, esta proteína se incluye en la familia de transportadores “ATP-binding
cassette (ABC transporters)”. La proteína CFTR tiene dos dominios que atraviesan la
membrana celular (MSD1 y MSD2) seis veces cada uno, una región citoplasmática
con dos dominios de unión a ATP (NBD1 y NBD2) y un dominio regulador (R) que
contiene varios lugares de fosforilación para PKA. Los extremos amino y
carboxiterminal son también intracelulares. Esta proteína se ha identificado en el
epitelio interno de las vías respiratorias, en las glándulas sudoríparas, páncreas,
intestino, hígado, testículos, y en el plexo coroideo. La función principal de esta
proteína es la conductibilidad a los iones de cloro, y se cree que presenta otras
funciones fisiológicas como puede ser la absorción de sodio3 4 5. (Figura 1)
2
Figura 1. Representación gráfica de la proteína CFTR en la membrana celular. C. Merlo, M Boyle.
Johns Hopkins University. http://www.hopkins-genomics.org/cf/cf_patho.html (consulta el 05/05/07)
Su alteración produce un transporte anormal de iones en las células epiteliales de
diferentes localizaciones, sobre todo del tracto gastrointestinal y respiratorio,
ocasionando disfunción de glándulas exocrinas que se manifiesta por un aumento de
electrolitos en sudor, insuficiencia pancreática, infección respiratoria y azoospermia
obstructiva. La FQ es la enfermedad de herencia AR grave más frecuente en
población caucásica. La frecuencia varía entre los distintos grupos étnicos, y se
estima en 1:3.300 recién nacidos vivos para blancos caucásicos, 1:9.500 para
hispanos, 1:11.200 para indios americanos, 1:15.300 para afroamericanos y 1:32.100
para asiáticos. En España, la incidencia de FQ es de 1 por cada 3500 nacidos6. La
frecuencia en la población Caucasiana de heterocigotos es uno en 22-28.
Se caracteriza por una gran variabilidad tanto en la clínica como en las mutaciones
genéticas, siendo la enfermedad pulmonar la principal causa de morbilidad y
mortalidad.
La media de supervivencia ha pasado de los 5 años en 1963 a los 35.7 años en el
periodo 1999-2001, siendo la esperanza de vida actual de 40 años. El aumento de la
3
esperanza de vida se debe a un diagnóstico y un tratamiento precoz en Unidades
Multidisciplinarias Específicas, a avances en tratamiento nutricional y al uso de
antibióticos en infección respiratoria. El diagnóstico no es fácil. Durante los últimos
años se han modificado los criterios diagnósticos, tanto los clínicos como los de
laboratorio, incorporando nuevas pruebas diagnósticas y modificando el significado
de las ya utilizadas7 8 9.
Los criterios diagnósticos10 actuales se resumen en la tabla I. Están basados en la
presencia de características fenotípicas compatibles con la FQ o en la historia de
enfermedad en hermanos o primos, o en un cribado neonatal positivo junto con una
prueba de laboratorio que evidencie disfunción del CFTR (detección de una
concentración de cloro superior a 60 mmol/L, detección de dos mutaciones reconocidas
de FQ o demostración de alteraciones en el transporte iónico a través del epitelio
nasal11.
Tabla 1. Criterios Diagnósticos de Fibrosis Quística (FQ)
Presencia de uno o más criterios clínicos • Características fenotípicas típicas de FQ: enfermedad respiratoria o digestiva compatible, ausencia bilateral de conductos deferentes, los síndromes de pérdida salina por el sudor • Historia familiar de fibrosis quística (hermanos o primos) • Prueba positiva en el cribado neonatal (elevación tripsina inmunoreactiva)
Positividad de una o más pruebas que evidencien disfunción de la proteína reguladora de la conductancia transmembrana (CFTR): • Una concentración elevada de cloro en el sudor (mayor de 60 meq/L) en dos o más ocasiones • Detección de dos mutaciones de fibrosis quística • Alteración de la diferencia del potencial nasal característica
2. ETIOPATOGENIA
La causa de la FQ es el defecto en la producción o función de una proteína de la
membrana celular denominada CFTR, que regula el paso del ión cloro, por lo que
también se le conoce como el canal del cloro. El CFTR se encuentra en la mayoría de los
epitelios. El CFTR anómalo produce una alteración del transporte iónico de las
4
secreciones de glándulas exocrinas, provocando obstrucción de conductos pancreáticos,
glándulas salivales, intestino, epidídimo y bronquios.
Las mutaciones suelen ser cambios puntuales que afectan a uno o pocos nucleótidos, si
bien se han detectado deleciones que causan la pérdida de la mayor parte del gen
CFTR. Las distintas mutaciones se pueden clasificar12 en:
• “Missense”: se produce un cambio de nucleótido que determina la sustitución de un
aminoácido. Representan el 45% de todas las mutaciones.
• “Frameshift”: la inserción o deleción de un nucleótido produce una alteración en la
pauta de lectura. Representan un 20% de todas las mutaciones.
• “Splicing”: modificaciones en el corte y empalme del gen CFTR. Representan un 16%
de todas las mutaciones.
• “Nonsense” o mutaciones sin sentido: la mutación origina un codón de terminación.
Representan un 14% de todas las mutaciones.
• Inserción o deleción de varios aminoácidos o parte del gen CFTR. Representa un 5%
de todas las mutaciones.
Existen más de 1.500 mutaciones asociadas con la FQ13, por lo que se han dividido en 5
clases basadas en la influencia de la función y estructura del CFTR14 (figura 2).
� Mutaciones Clase I: Interfiere directamente con la producción de CFTR. Incluye
aquellas mutaciones que dan lugar a ausencia de proteína debido a mutaciones
“nonsense”, “frameshift” o de “splicing”.
� Mutaciones Clase II: Desorganiza el mecanismo de transporte del CFTR desde el
retículo endoplásmico al sitio de operación en la membrana apical. Este es el caso de la
mutación F508
� Mutaciones Clase III: Causa defectos en la regulación del CFTR dependiente del
ATP o fosforilación. Es el caso de las mutaciones “missense” que afectan a la unión de
ATP
� Mutaciones Clase IV: Altera la conducción anómala del flujo de iones cloruro. Estas
mutaciones son del tipo “missense” y están localizadas en los dominios transmembrana.
� Mutaciones Clase V: Reduce la síntesis de la proteína CFTR funcional
Las mutaciones de clase I y II se relacionan con insuficiencia pancreática (IP), mientras
que las mutaciones de clase III y IV y V se manifiestan con una amplia variabilidad
clínica.
5
Figura 2: Defectos en el gen CFTR en FQ. Representación esquemática de la biosíntesis y función del
CFTR en las células epiteliales y los mecanismos de disfunción asociados a las diferentes mutaciones
de FQ. C. Merlo, M Boyle. Johns Hopkins University. http://www.hopkins-
genomics.org/cf/cf_patho.html (consulta el 05/05/07)
3. CLINICA
El cuadro clínico depende del genotipo y del tiempo de evolución. Hay una gran
variedad en relación a la edad de inicio y el ritmo de progresión de la enfermedad. Son
indicadores de suma importancia para el diagnóstico:
• Respiratorios:
o Vía aérea superior: pólipos nasales y enfermedad de senos paranasales.
o Vía aérea inferior: taquipnea y tiraje persistente, bronquiolitis recurrente,
asma atípica, tos crónica, neumonía recurrente, bronquiectasias, hemoptisis,
atropamiento aéreo bilateral y atelectasia persistente. Aunque también
pueden ocurrir en pacientes con otras patologías, los cultivos de esputo
persistentemente positivos a Staphylococcus aureus, Burkholderia cepacia, o
Missense A455E Alternative Splicing 3849+10kbC->T
Missense R117H
Missense G551D
Missense AA deleción deltaF508
Nonsense G542X Frameshift 394delTT Splice junction 1717-1G->A
Síntesis reducida
Alteración conducció
Defecto regulación
Alteración transporte
No síntesis
Consecuencias moleculares de las mutaciones CFTR
6
Aspergillus fumigatus son sugestivos de FQ. La infección bronquial persistente
con Pseudomonas aeruginosa mucoide es casi patonogmónica.
• Gastrointestinal y nutricionales: ileo meconial, ictericia neonatal prolongada,
malabsorción-esteatorrea, prolapso rectal, cirrosis, hipertensión portal, pancreatitis.
• Síndromes perdedores de sal: pérdida aguda de sal, alcalosis metabólica crónica
• Alteraciones urogenitales en el varón que originan azoospermia obstructiva y
ausencia de conductos deferentes
• Otros: fallo de crecimiento, historia familiar positiva, sabor salado en el sudor,
cristales de sal en cuero cabelludo y frente, edema e hiponatremia, alcalosis metabólica.
La FQ diagnosticada en la edad adulta difiere considerablemente de la forma de
presentación en la infancia15. Aproximadamente el 90% de los pacientes presentan
clínica respiratoria (con alteración de la función pulmonar de leve a moderada o
incluso normal), y tan sólo un 15% tiene insuficiencia pancreática. Aunque la mayoría
de los pacientes presenta bronquiectasias difusas, la colonización bronquial crónica
por Pseudomonas aeruginosa es menos frecuente, predominando otros gérmenes
como Haemophilus influenzae y Staphylococcus aureus. Con menor frecuencia, la
enfermedad se diagnostica tras episodios repetidos de pancreatitis, o en un estudio
por infertilidad al detectarse una azoospermia con ausencia bilateral de conductos
deferentes.
4. DIAGNÓSTICO
Ante la sospecha de existencia de FQ (figura 3), la prueba diagnóstica determinante es
el test del sudor que consiste en la cuantificación de iones de sodio y cloro en el sudor,
ya que esta enfermedad produce una presencia excesiva de estos iones.
No obstante, puede hacerse la confirmación diagnóstica mediante el estudio genético
con una muestra de sangre. Dada el gran número de mutaciones del gen actualmente
identificadas, si bien un resultado positivo de esta prueba es siempre concluyente, no
sucede así cuando el resultado es negativo y no puede descartarse definitivamente la
posibilidad de que exista la enfermedad. En este caso hay que recurrir a otras pruebas
diagnósticas, como la determinación de la diferencia de potencial nasal.
7
Fig. 3. Algoritmo diagnóstico de la fibrosis quística (FQ).
4.1. Prueba Del Sudor
En la mayoría de las ocasiones, el diagnóstico de FQ puede ser confirmado
determinando la concentración de cloro en el sudor mediante un método validado.
The National Committee for Clinical Laboratory Standards ha publicado una guía para
realizar el procedimiento adecuado mediante la iontoforesis con pilocarpina en la
superficie flexora del antebrazo y recolectando el sudor con papel de filtro o gasa
prepesados (técnica de Gibson y Cooke) o a través un disco cóncavo y tubo espiral
de plástico (Macroduct)16. Un peso del sudor del mínimo del 75 mg (método de
Gibson y Cooke) debe de recogerse durante un período 30 minutos para asegurar
una secreción de sudor de 1 g/M2/min. La muestra mínima de sudor a analizar debe
ser de 15 µl con el método Macroduct. Las concentraciones de cloro en el sudor
iguales o superiores a 60 mmol/L en dos ocasiones confirman el diagnóstico de FQ.
Esta prueba es positiva en el 90% de individuos con los CF17 18 y es recomendable
realizarla por personal del laboratorio experto.
Sospecha clínica deFibrosis Quística (FQ)
Prueba del sudor Estudio genético
Positivo(CI >60mmol/L)
Negativo/Dudoso:(CI <40mmol/L/ CI:40-60mmol/L)
Negativo Positivo(2 mutaciones)
Diferencia De Potencial Nasal Transepitelial
Diagnóstico de FQDiagnóstico de FQ
Normal: se excluye FQ
PositivoDiagnostico de FQ
Sospecha clínica deFibrosis Quística (FQ)
Prueba del sudor Estudio genético
Positivo(CI >60mmol/L)
Negativo/Dudoso:(CI <40mmol/L/ CI:40-60mmol/L)
Negativo Positivo(2 mutaciones)
Diferencia De Potencial Nasal Transepitelial
Diagnóstico de FQDiagnóstico de FQ
Normal: se excluye FQ
PositivoDiagnostico de FQ
8
Sin embargo, los resultados deben interpretarse siempre en el contexto de cada
paciente (edad y características clínicas)19. Así, los valores de Cloro superiores a 40
mmol/L en niños menores de 3 meses son muy indicativos de FQ. Los niveles entre
40 y 60 mmol/L se han descrito en algunos pacientes adultos; estos valores
intermedios no pueden considerarse normales, pero tampoco diagnósticos, por lo que
deben llevarse a cabo otras técnicas que permitan corroborar o no la presencia de la
enfermedad. Por otra parte, una prueba del sudor negativa no excluye el diagnóstico.
Con la edad la concentración de sodio en el sudor aumenta de forma más acusada
en controles que en pacientes que la concentración de cloro. En adultos controles no
son infrecuentes concentraciones de sodio de 60 a 80 mmol/L20. En casos con
concentraciones borderline de cloro puede ser útil el análisis de la relación cloro/sodio
que en la mayoría de los pacientes con FQ es superior a 1 mientras que en los
controles aparece raramente.
Resultados falsamente positivos se pueden encontrar en múltiples enfermedades que
cursan con cloro alto en sudor como: pseudohipoaldosteronismo congénito,
hipotiroidismo no tratado, insuficiencia suprarrenal no tratada, mucopolisacaridosis tipo
I, Insuficiencia adrenal no tratada, dermatitis atópica, déficit de glucosa 6-fosfato-
deshidrogenasa, etc. Los falsos negativos son escasos y pueden verse en errores
técnicos, en los pacientes con edema e hiponatremia o cuando las cantidades de sudor
recogidas son insuficientes.
4.2 Medición De Diferencia De Potencial Nasal Transepitelial (DPN)
Especialmente útil en pacientes con concentraciones de cloro normales y en los que
no se identifican las dos mutaciones del gen de la FQ.
La composición electrolítica del líquido periepitelial viene determinada por la
capacidad de las células epiteliales de transportar iones, como el cloro y el sodio,
generando una diferencia de potencial transepitelial que puede medirse in vivo en la
mucosa nasal (DPN). La medición de este potencial permite establecer un patrón de
anormalidad en pacientes con FQ, como consecuencia del aumento en la reabsorción
de sodio que lo hace más electronegativo, existiendo escaso solapamiento con los
valores observados en la población sana (media DPN en la FQ, –46 mV frente a DPN
en la población sana –19 mV). La presencia de pólipos nasales, inflamación de las
9
fosas nasales, traumatismos o mala colocación de los electrodos en ellas pueden
modificar la DPN, por lo que todas estas situaciones deben valorarse siempre
cuidadosamente21 22.
Se requieren 2 electrodos conectados a un voltímetro (dispositivo de medida Tholy-
Medicap®), uno colocado sobre la mucosa nasal del cornete inferior, y otro en el tejido
celular subcutáneo del antebrazo. Un valor inferior a -40 mV se considera patológico.
Los valores obtenidos en sujetos sanos no sobrepasan nunca este valor. Se precisan 2
determinaciones anormales de DPN registradas en 2 días diferentes para aceptar la
disfunción de la CFTR. Pueden observarse falsos negativos cuando la integridad del
epitelio está alterada.
La técnica de la medida de la diferencia de potencial nasal no está estandarizada, y
sólo se lleva a cabo en algunas Unidades de FQ. Requiere la colaboración del paciente
(difícil en niños menores de 7 años) y la experiencia del técnico que realiza la prueba.
4.3 Cribado en el Recién Nacido
Existen diferentes estrategias de cribado para la detección de la fibrosis quística, una
dirigida hacia la reducción de la prevalencia de nacimientos con la enfermedad y otra
cuyo objetivo sería la mejora del pronóstico cuando es diagnosticado mediante un
programa de cribado. La reducción del número de los nacimientos depende de la
identificación de las parejas portadoras que presenten un riesgo elevado de tener
embarazos afectados y se detecta en etapas preconcepcionales o durante el
embarazo.
Existen varios programas de cribado de FQ. Actualmente la tripsina inmunoreactiva
(TIR) en sangre del talón es la primera prueba que se realiza en la mayoría de los
programas de cribado neonatal. El tripsinógeno se sintetiza en el páncreas; la
obstrucción al paso del contenido pancreático al conducto excretor produce un
"reflujo" de éste hacia el plasma, elevando la cantidad de tripsina en la sangre de
niños con FQ. Los niveles sanguíneos de tripsina inmunorreactiva están elevados de 5
a 10 veces en los recién nacidos afectos que en los no afectos. La muestra se toma
al tercer día de vida y ayuda a un diagnóstico precoz, evitando el riesgo de
10
compromiso nutricional de los primeros meses de vida. Presenta una buena eficacia
diagnóstica, ya que a una sensibilidad del 85.7% le corresponde una especificidad del
99.6%. Pese a ello, el valor predictivo positivo de la TIR es bajo.
Se utiliza ensayos inmunorreactivos de tripsinógeno. La determinación se realiza
mediante el análisis en sangre seca recogida en tira de Guthrie23. Se puede detectar
mediante técnicas de inmunofluorescencia a tiempo retardado (DELFIA),
enzimoinmunoensayo (ELISA) o radioinmunoensayo (RIA). Dependiendo del método
utilizado los valores obtenidos pueden tener diferentes interpretaciones en cuanto a las
cifras de normalidad. Con el DELFIA se consideran normal la concentración por debajo
de 60 ng/ml.
Se han planteado muchos protocolos utilizando el contenido de albúmina en el meconio
o el TIR de forma independiente, combinado entre ellos o junto con pruebas de ADN.
Los programas de cribado que originalmente se basaron en la prueba del meconio se
han cambiado a la prueba del TIR, tanto sola o en combinación de pruebas de ADN. Sin
embargo, no existe un consenso acerca de la estrategia a utilizar, los puntos de corte o
el tiempo de la prueba. Como consecuencia se observa una elevada variabilidad entre
los diferentes programas de cribado. Actualmente alguna comunidad autónoma no
recomienda establecer un programa de cribado neonatal sistemático y generalizado de
la FQ en todos los recién nacidos aunque si plantea realizarlo de manera selectiva a los
niños de los llamados grupos de riesgo24.
4.4 Otras pruebas
En los pacientes diagnosticados de FQ se utiliza el estudio de la función pancreática, el
examen de la grasa fecal o las pruebas radiológicas.
4.4.1. El estudio de la función pancreática
El estadio inicial de la insuficiencia pancreática se detecta mediante el tests directo de
la secretina pancreozimina. Esta prueba tiene el inconveniente de ser invasivo.
11
La insuficiencia pancreática clínicamente manifiesta se detecta mediante el tests oral
como el pancreolauril, o el PABA (ácido para-aminobenzóico). En las heces la tripsina y
la quimotripsina son muy bajas o no existen en absoluto.
La presencia de niveles bajos elastasa 1 en heces indican la existencia de insuficiencia
pancreática exocrina. La determinación se realiza mediante la técnica ELISA usando dos
anticuerpos monoclonales contra la elastasa humana por lo que no existe interferencia
con los suplementos orales de enzimas pancreáticas. Se consideran normales valores
por encima de 175-200 mg/g de peso seco.
Al inicio de la enfermedad las proteínas séricas totales son normales y al evolucionar la
enfermedad produce un incremento de las fracciones α1, α2 y γ globulinas y
disminución la albúmina.
Las vitaminas liposolubles (A, D, E y K), los ácidos grasos esenciales, los niveles
sanguíneos de carotenoides y el colesterol total en ayunas son bajos cuando el
pacientes tiene esteatorrea25.
4.4.2 Examen de grasa fecal
La medición del contenido de grasa fecal confirma la esteatorrea. Las pruebas de
absorción de las grasas aportan una valoración indirecta de la función exocrina
pancreática. La excreción fecal de grasa sirve también para evaluar la respuesta de la
enzimoterapia, efectuándose con la dieta habitual del paciente y sin suprimir la
administración de enzimas26. Antiguamente el método utilizado era la titulación de Van
de Kamer. Actualmente se utiliza la técnica de reflexión en el infrarrojo cercano para el
análisis de heces en adultos y niños, (la cantidad de luz absorbida por la materia
orgánica: C, N, O, H, a una longitud de onda puede ser determinada y la composición
química de la muestra cuantificarse) que permite la determinación de 5 parámetros:
agua, grasa, nitrógeno, almidón y azúcar27.
La valoración cuantitativa de grasa en heces (48-72 horas, menor 7 g de grasa en 24
horas para una dieta con 100 g de grasa) es el "patrón oro" para establecer el
diagnóstico de malabsorción. La esteatorrea aparece cuando se ha perdido el 90% de la
12
función pancreática. Se considera esteatorrea leve de 7 a 10 g de grasa en 24 horas,
moderada de 10 a 20 g de grasa en 24 horas y grave mayor de 20 g de grasa en 24
horas.
4.4.3. Análisis De Semen
En el semen de pacientes diagnosticados de FQ o de CBAVD (ausencia congénita
bilateral de conductos deferentes) presentan una azoospermia con disminución del
volumen del semen (menos de 2 ml) con: un descenso de pH (pH menor de 7;
normal: pH>8); elevación de la concentración de ácido cítrico (mayor de
2000mg/100ml; normal: 400-1500mg/100ml); elevación de la concentración de
fosfatasa ácida (760-1140 mµ/ml; normal: 140-290 mµ/ml); descenso de la
concentración de fructosa (30-80 mg/100ml; normal 250-720 mg/100ml) y fracaso
en coagular. El varón debe ser evaluado por un urólogo que en ausencia de
conductos deferentes debe de solicitar el estudio genético.
4.4.4 Técnicas de imagen y otras
Las radiografías de tórax, de cavidades paranasales, la tomografía computarizada (TC)
torácica y las pruebas de función pulmonar son fundamentales a la hora de valorar el
estado funcional del sistema respiratorio. Los pacientes revelan hipoxemia y reducción
de la capacidad vital forzada (CVF), del volumen espiratorio forzado en un segundo
(VEF1) y de la relación VEF1/CVF, con aumento del volumen residual y de la relación
entre el volumen residual y la capacidad pulmonar total. El 50% de los pacientes con
FQ muestran signos de hiperreactividad de la vía aérea25.
4.5 Genética Molecular
Se requiere la demostración de la existencia de dos mutaciones causantes de alguno de
los mecanismos básicos que alteran la función del CFTR. Se han descrito más de 1.400
mutaciones diferentes capaces de inducir distintos fenotipos de FQ. Se debe de utilizar
siempre debido a que nos da información pronostica y permite proporcionar consejo
genético la familia. La información sobre las mutaciones, la suministra el Consorcio
13
para el Análisis Genético de la FQ a través de Internet (http:
//www.genet.sickkids.on.ca/cftr/)
4.5.1. Indicaciones
Es útil en el diagnóstico de individuos sintomáticos de FQ y de CBAVD, en la prueba del
portador (en pacientes de riesgo y sus parejas reproductivas), en los programas de
screening poblacional de FQ de las muestras con hipertripsinemia) y en el diagnóstico
prenatal (en los embarazos de riesgo de FQ y en los cuales se ha identificado por
ecografía hiperrefringencia intestinal).
4.5.2. Métodos moleculares
El ADN se puede extraer de las muestras que proceden de los leucocitos en sangre
periférica, manchas de sangre seca (tiras de Guthrie –la utilizada para el cribado
neonatal-), enjuagues bucales, raspado bucal, líquido amniótico, vellosidades coriónicas
o células de muestras de orina.
Posteriormente se amplia mediante la reacción de cadena de polimerasa (PCR) y, se
detecta las mutaciones específicas mediante los métodos de electroforesis o
fluorescencia.
Existen mutaciones específicas cuyas frecuencias varían entre los diferentes grupos
étnicos. La primera mutación descrita y la más frecuente a nivel mundial es la mutación
∆F508. Se produce una deleción de tres nucleótidos en el exón 10; la mutación ∆F508
produce la pérdida de fenilalanina en la posición 508 de la proteína. Entre las
comunidades del norte de Europa, la mutación ∆F508 es la más frecuente (30-87% de
todas las mutaciones), y es la causante de aproximadamente un cuarto de todas las
afecciones. En nuestro medio, las mutaciones ∆F508 y G542X son las que se han
detectado con mayor frecuencia, en un 50 y en un 8% respectivamente, mientras que
el resto de las mutaciones detectadas no supera el 3% de los casos28. Sin embargo,
menos de un tercio de los judíos Ashkenazi portadores del gen de la fibrosis quística
presentan la mutación ∆F50829.
Las mutaciones pueden conllevar por una parte a la formación de una proteína
defectuosa, como es el caso de la mutación R553X debido a un RNAm inestable o una
proteína cortada. Por otro lado, las mutaciones ∆F508 o G408C pueden dar lugar a que
14
la proteína mutada no es procesada a su forma glucosilada madura y no se sitúa
correctamente en la membrana apical.
El riesgo para un individuo de ser portador cuando no se identifica ninguna mutación
con el test genético, depende de la sensibilidad del test empleado en la población
estudiada. ; R = q (1-S)/[q (1-S) + (1-q)] (la proporción de los individuos que son
negativos con el test pero son realmente portadores comparados a todos los individuos
verdaderos negativos, los portadores con un resultado negativo y los individuos con el
test negativo que son verdaderos negativos porque no son portadores de mutaciones).
R = riesgo de ser un portador; S = sensibilidad de la prueba, proporción de los alelos
del mutados del gen CFTR en una población dada que puede ser identificada con la
prueba; q = frecuencia de portadores en una población dada. La fórmula simplificada
del riesgo de un individuo de ser portador cuando no se identifica ninguna mutación con
con el test genético es R = q (1-S)30.
4.5.2.1 Análisis dirigido de la mutación
• Paneles de mutación.
La estrategia para realizar un diagnóstico molecular se elabora en función de la
heterogeneidad alélica de cada población. En 2004, el Colegio Americano de Genética
Médica31 (ACMG) recomienda realizar un panel de 23 a 25 mutaciones. Lógicamente, la
tasa de mutaciones detectadas con este panel varía según la población analizada. Así, en
la población judía Ashkenazi se detecta un 97% de las FQ, mientras que en la Hispano-
Americana se diagnostica el 57%32.
En la actualidad se dispone de kits comerciales que incluyen 31 de las mutaciones más
frecuentes (∆F508, F508C, ∆I507, Q493X, V520F, 1717-1G→T, G542X, G551D, R553X,
R560T, S549R, 3849+10kbC→T, 3849+4A→G, R1162X, 3659delC, W1282X, 3905insT,
N1303K, G85E, 621+1G→T, R117H, Y122X, 711+1G→T, 1078delT, R347P, R347H,
R334W, A455E, 1898+1G→A, 2183AA→G y 2789+5G→A), las cuales cubren el 80% de
las detectadas en pacientes diagnosticados en la población española infantil.
15
• Análisis de Duplicación/Deleción.
Mediante la técnica de Multiplex ligation dependent probe (MLDP) se puede detectar
deleciones no identificadas por análisis secuencial.
• Análisis de la zona T/TG
Una zona abreviada de cinco timinas (5T) en el intron 8 del gen CFTR se encuentra en el
aproximadamente 10% de individuos en la población en general. Cuando se encuentra
junto con una mutación severa de CFTR, 5T puede dar lugar a la infertilidad masculina, a
la fibrosis quistica no clásica, o un fenotipo normal. Consiste en una cadena corta de TG
de 11,12 o 13 repeticiones. Una zona más larga del TG (12 o 13) conjuntamente con
una zona más corta de T (5) tiene el efecto nocivo más fuerte en el intron 8. Para probar
si el número de las repeticiones del TG adyacente a 5T influyen en la penetrancia de la
enfermedad, estudiaron a 98 pacientes con infertilidad masculina debido a la ausencia
congénita de los conductos deferentes, 9 pacientes con CF no clásica, y 27 individuos
fértiles. Cada uno de los individuos en este estudio tenía una mutación severa de CFTR
en un gene de CFTR y 5T en el otro. De los individuos fértiles, el 78% (21 de 27) tenían
5T adyacente a 11 repeticiones del TG, comparadas con el 9% (10 de 107) de individuos
afectados. Inversamente, el 91% (97 de 107) de individuos afectados tenían 12 o 13
repeticiones del TG, contra solamente el 22% (6 de 27) de los individuos fértiles
(P<.00001). Esos individuos con 5T adyacente a 12 o 13 repeticiones del TG eran
substancialmente más probables exhibir un fenotipo anormal que lo de 5T adyacente a
11 repeticiones del TG. Entonces, la determinación del número de la repetición del TG
permitirá una predicción más exacta benignidad versus los alelos patógenos 5T. El
análisis de la zona de T/TG está indicado en los varones con CBAVD o con sospecha del
mismo, los individuos con los FQ no clásica, o los adultos portadores de 5T con
alteraciones reproductivas o cuando se detecta la mutación R117H 33.
4.5.2.2. Análisis secuencial
Mediante la secuenciación de todos los exones, los intrones, los bordes intron/exon, y las
regiones promotoras se detectan más el de 98% de las mutaciones del CFTR34.
16
4.5.3 Correlación Genotipo-Fenotipo
El genotipo CFTR más frecuente en los pacientes con FQ es la homocigosis para la
mutación F508del. Da lugar a un fenotipo grave de FQ, con inicio temprano de las
manifestaciones clínicas características, la enfermedad pulmonar crónica, la insuficiencia
pancreática y los niveles altos de electrolitos en el sudor35.
Respecto a la presencia (PI) o ausencia (PS) de insuficiencia pancreática, el genotipo
CFTR tiene una fuerte correlación. Las mutaciones asociadas a PI (∆F508, G542X,
G551D, N1303K, W1282X, R553X, 621+1G T, 1717-1G A), son denominadas
“severas”, y las asociadas a PS (R117H o P205S) son “leves”. La mutación R334W se
asocia a IP de inicio tardío con gran variabilidad inter e intrafamiliar36.
La correlación del genotipo con la severidad de la enfermedad pulmonar es mala y se
observa muy distintos grados de afectación entre pacientes con genotipo idéntico. Los
pacientes homocigotos ∆F508 presentan enfermedad pulmonar generalmente severa,
pero muy variable37. Es probable la participación de otros genes modificadores del
fenotipo de la FQ influya en la variabilidad del fenotipo pulmonar. Entre otros genes
moduladores se ha descrito polimorfismos como β-defensinas 1 y 2, TGF-β (tumor
growth factor), α1-antitripsina y la lectina de unión a manosa38.
La severidad de la enfermedad pulmonar en individuos con una o dos mutaciones
R117H depende de la presencia de repetición de timinas en el intrón 839.
Algunas mutaciones generan sólo infertilidad en varones, sin otro tipo de manifestación,
como ocurre en la R117H-7T, y se diagnostica cuando se estudia infertilidad y
azooespermia.
5. CONSEJO GENÉTICO
5.1 Padres de un probando con FQ.
Los padres no afectados son obligados portadores (heterocigotos) y tienen una
alteración en una copia del gen de CFTR. Si los alelos causantes de desórdenes
relacionados con el CFTR se han identificado en el probando, se debe estudiar a los
17
padres con la prueba molecular. Si no, la prueba del cloruro del sudor debe realizarse.
Los portadores son asintomáticos. En raras ocasiones, un progenitor puede ser
diagnosticado como afecto al diagnosticar al niño. Los desórdenes relacionados con el
CFTR se heredan de una manera AR. En la concepción, un individuo afectado tiene una
probabilidad del 25% de ser afectado, del 50% de ser portador asintomático, y del
25% de no ser portador . En una persona no afecta que no se le ha realizado el estudio
molecular tiene un riesgo de ser portador de dos tercios.
5.2 Descendiente de un probando femenino con FQ
Las hembras con FQ son fértiles. El riesgo de que los descendientes hereden un segundo
alelo depende del estado de portador de su pareja. El estudio molecular de CFTR se debe
ofrecer a su pareja para determinarse es portador. Si la pareja es portadora, el
descendiente estará en riesgo de padecer FQ.
5.3 Descendiente de un probando masculino con FQ
Los varones con FQ pueden concebir hijos con las técnicas de reproducción asistida. Un
varón afectado transmitirá un alelo a cada uno de sus descendientes. El riesgo que su
hijo herede un segundo alelo depende del estado de su pareja. La prueba
genética molecular de CFTR se debe ofrecer a su pareja para determinar su estado de
portador. Si la pareja es portadora, el descendiente estará en riesgo de padecer FQ.
5.4 Otros miembros de la familia.
Los hermanos y las hermanas de un portador conocido de la mutación de CFTR, tienen
un riesgo del 50% de ser portadores.
6. Diagnostico prenatal
El estudio de las mutaciones del gen CFTR debe realizarse en los familiares de primer
grado de los pacientes con FQ cuando se planteen la posibilidad de tener descendencia.
Se han propuesto dos tipos de cribado que no son excluyentes entre sí: el secuencial y
el de ambos miembros de la pareja a la vez. En el cribado secuencial se analiza primero
uno de la pareja, y si éste es positivo, se analiza posteriormente al otro, lo que reduce
18
el número de pruebas realizadas. Si los dos individuos son portadores, y se ofrece la
posibilidad de realizar un estudio prenatal durante el embarazo por biopsia de las
vellosidades coriónicas entre la semana 10-12 de gestación. Esta opción está indicada
en las parejas en que ambos son portadores de un alelo del gen.
7. Diagnostico preconcepcional
Se realiza en el sujeto antes de la concepción con el fin de diagnosticar los posibles
riesgos de concebir un hijo con enfermedades o anomalías genéticas, hereditarias o
cromosómicas. El contenido de la consulta preconcepcional en pacientes portadores de
mutaciones del gen CFTR incluye:
• La evaluación del riesgo preconcepcional en función a los datos obtenidos por la
historia clínica y el examen físico de la mujer respecto a su patología
• Valoración reciente de la patología pulmonar y digestiva mediante espirometría,
radiografía de tórax y analítica completa
• Valoración de otros factores de riesgo no relacionados con la enfermedad de base,
tanto gineco-obstétrico como generales
• Acciones educativas y promotoras de la salud generales y especificas para esta
enfermedad
Como consecuencia de estas acciones sanitarias, podemos llegar a un asesoramiento o
consejo reproductivo. En este consejo o asesoramiento preconcepcional se debe basar
tanto los riesgos maternos como los riesgos potenciales para el embrión-feto y el recién
nacido derivados de la repercusión de la FQ, sobre el proceso gestacional y del
embarazo sobre la enfermedad crónica materna.
8. Diagnóstico preimplantacional:
Detecta las posibles alteraciones genéticas que pudieran tener los preembriones in vitro,
y transfiere los normales a la mujer para la concepción. Requiere técnicas de
reproducción asistida y la coordinación entre especialistas en fertilidad y endocrinos. Es
necesaria su confirmación mediante la realización diagnóstico prenatal40. Está indicado
en las parejas que ambos son portadores heterocigotos con riesgo de un 25% de tener
descendencia con FQ, y está identificada la mutación.
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9. Tratamiento
El tratamiento rutinario41 de la FQ comprende la enfermedad respiratoria, la
insuficiencia pancreática exocrina y la desnutrición.
9.1. Enfermedad respiratoria
• La fisioterapia respiratoria pretende ayudar al aclaramiento mucociliar,
disminuido en estos enfermos, en la limpieza de detritus y bacterias en las vías
aéreas para expulsarlas al exterior. Puede realizarse por diferentes métodos:
percusión del torax, ejercicio físico, dispositivos mecánicos como el flutter y
técnicas específicas de respiración o de tos.
• La Antibioterapia oral, intravenosa e inhalada para las infecciones respiratorias.
El/los antibiótico/s se eligen según la capacidad mínima inhibitoria (CMI) de éstos
frente a las bacterias cultivadas de muestras de secreciones respiratorias
(antibiograma), o en su defecto, se trata de forma empírica.
• El tratamiento con antiinflamatorios por vía oral o inhalada (ibuprofeno,
prednisona, budesonida, fluticasona), mucolíticos por vía inhalada (DNAsa,
suero salino fisiológico) brocodilatadores por vía inhalada no está generalizado
a todos los enfermos.
• Las infecciones virales pueden ser factores precipitantes o que facilitan la
infección bacteriana, por lo que las vacunas contra la gripe, varicela y,
posiblemente, contra el virus sincitial respiratorio están indicadas
• La oxigenoterapia va dirigida a mantener PaO2 entre 60-80 mmHg o la
saturación de oxígeno en hemoglobina en el 93% sin provocar aumento de
PaCO2.
• En algunos casos se puede considerar un trasplante de pulmón.
9.2 Insuficiencia pancreática exocrina
• Las enzimas pancreáticas: Se puede requerir suplementos enzimáticos para
conseguir las mínimas pérdidas fecales de grasas, proteínas, vitaminas y ácidos
biliares, mejorando la digestión y la absorción de alimentos y vitaminas
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liposolubles, aunque el 10-15% de los enfermos con FQ presentan buena función
pancreática y no necesitan tomar enzimas pancreáticas con las comidas.
• Los pacientes con insuficiencia pancreática deben recibir suplementos de
vitaminas liposolubles (A, D, E y K).
9.3 Desnutrición
El estado nutricional de un paciente debe de ser controlado estrechamente desde
que es diagnosticado de FQ para diagnosticar un fallo de nutrición incipiente y en
este caso, indicando una dieta hipercalórica.
21
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NOTAS
