Nativni Peparat i Bojenje Bakterija, Kultivisanje Bakterija

Ass.Azra Bačić,DVM

1

NATIVNI PEPARAT I BOJENJE BAKTERIJA,

KULTIVISANJE BAKTERIJA

FARMACEUTSKO - ZDRAVSTVENI FAKULTET UNT

PRIJE SVEGA?DA PONOVIMO!!!

Osnovni dijelovi mikroskopa su:a - podlogab - nepomični dio stalkac - pomični dio stalkad - tubusd1 - prostor za prizmue - stolićf - "revolver" za objektiveg - objektivh - okulari - veliki ili makrometarski vijakj - mali ili mikrometarski vijakk - zrcalo (ili drugi izvor svjetla)l - ABBE-ov kondenzorm - vijak za vertikalno pomicanje kondenzoran - iris-zaslono - okvir za filterep - vijak za horizontalno pomicanje kondenzora

Mikrobiološki preparati- mikrobiološke preparate pravimo u cilju posmatranja

MO (morfologija, struktura, oblik, raspored ćelija, pokretljivost…)

- Preparat može da bude:1. Nativni preparat - posmatranje živih MO2. Fiksirani preparat

Nativni preparat• posmatranje živih MO (pokretljivost)• nedostatak-slaba vidljivost, mogućnost infekcije,

jednokratna upotreba zbog brzog sušenja• procedura pripreme:

1. Na predmetnicu se stavlja uzorak (u slučaju tečne kulturestavlja se kap suspenzije, u slučaju čvrste podloge u kap vodeunosi se materijal iz kulture)

2. Pokrovnica3. Mikroskopiranje

Pravljenje razmaza

Fiksirani preparat• prednosti-višekratna upotreba, ne postoji

mogućnost infekcije, posmatranje strukture, oblika i morfologije

• procedura pripreme:1. Nanošenje suspezije na predmetnicu i pravljenje razmaza2. Sušenje na vazduhu3. Fiksiranje (provlačenjem kroz plamen) kako bi se ubili MO i

fiksirali ih za predmetnicu4. Bojenje preparata5. Mikroskopiranje

Fiksiranje preparata

Bojenje preparata1. Prosto bojenje - koristi se 1 boja

-uočavanje oblika i rasporeda ćelija-boje koje se primenjuju: kristal violet, fuksin,

metilensko plavo…2. Složeno bojenje - koristi se 2 ili više boje

-uočavanje morfologije i strukture ćelije-tipovi složenog bojenja: bojenje po Gramm-u, bojenje acido-alkoholrezistentnih bakterija,bojenje kapsula, bojenje endospora , bojenjenukleinskih kiselina, bojenje flagela

Mikrobiološke boje• organska jedinjenja koja boje odreñene ćelijske

strukture• Prema porjeklu dele se na:1. prirodne: šafranin (šafran), lakmus (lišajevi)2. vještačke (anilinske boje):• soli koje prilikom pravljenja vodenih rastvora

disosuju:1. bazno – katjonske boje (kristal violet, fuksin…)2. kiselo – anjonske boje, negativno bojenje (eozin)3. neutralno -neutralno crveno

Mikrobiološke boje• Svaka boja mora da sadrži dve grupe:

1. hromoformnu (nosilac karaktera boje, NO2)2. auksohromnu (el. disocijacija, OH‾, NH2)

Prosto bojenje• Procedura:1. Pravljenje razmaza2. Sušenje (na vazduhu)3. Fiksiranje4. Bojenje

-kristal violetom (na predmetnicu staviti filter papir i nanju nanijeti boju, nakon 1-2 min ukloniti filter papir, preparat isprati vodom, osušiti filter papirom, mikroskopiranje)

-šafraninom-postupak je identičan, filter papir nijeneophodno stavljati na preparat prije bojenja

Procedura prostog bojenja

Složeno bojenje-bojenje po Gramm-u

• 1884. danski histolog Christian Gram razvio metodbojenja u cilju diferencijacije bakterijskih ćelija i nukleusa eukariotskih celija

• diferencijalna slika (identifikacija Gr+ i Gr- bakterija)• na osnovu razlike u grañi ćel. zida Gr+ bakterije boje

se ljubičasto, dok se Gr- bakterije boje crveno• metoda se zasniva na sukcesivnoj primjeni

– kristal violeta (osnovna boja)– lugola (učvršćivač) – rastvor I u KI– etanola (obezbojivač) 70% ili 95%– karbol fuksina (suprotna boja)

Procedura bojenja po Gramm-u

• Nakon pravljenja razmaza, sušenja na vazduhu i fiksiranja pristupa se proceduri bojenja preparata

1. bojenje kristal violetom 1-2 min (neophodno je staviti na preparat filter papir)

2. lugol 1-2 min3. ispiranje vodom4. ispiranje etanolom 5-10 sec5. ispiranje vodom6. bojenje karbol fuksinom 1-2 min7. ispiranje vodom, sušenje filter papirom,

mikroskopiranje

Procedura bojenja po Gramm-u

KULTIVISANJE BAKTERIJA

Za uspešno gajenje mikroorganizama u laboratorijineophodno je da budu ispunjeni sljedeći uslovi:

1. Odgovarajući sastav podloge2. Odgovarajuća pH vrijednost podloge3. Odgovarajući sastav atmosfere u kojoj se mo gaje

(npr. anaerobni mo zahtevaju atmosferu bez O2)4. Odgovarajuća temperatura inkubacije (termostata)5. Odsustvo konkurentskih organizama tj. organizama

kontaminanata (ulaze u kompetitivne odnose sagajenim mo i često prevladaju i potisnu gajeni mo)

pH-metar Termostat

Hranljive podloge

• služe za kultivisanje mo u laboratorijskim uslovima i izvorisu materija za njihov rast i razmnožavanje

• nikad ne obezbeñuju uslove identične sredini iz koje su mo izolovani

• ne postoji univerzalna podloga• mogu sadržati neorganske i organske materije, ili samo

jedne od njih, uzavisnosti od potreba mo koji se kultivišu• mineralne soli -višestruka uloga (utiču na pH, imaju

puferske karakteristike, obezbjeñuju adekvatan osmotskipritisak, aktiviraju enzime…)

• destilovana voda-u slobodnom (tečne podloge) ili vezanomstanju (čvrste podloge)

Hranljive podloge

• voda-dobija se prelivanjem 1kg goveñeg mesa sa 2l hladnedestilovane vode i kuhanjem smjese 30min (voda koja isparidopuni se novom), a potom filtriranjem tečnosti kroz gazu i filter papir; dehidrirana mesna voda naziva se mesniekstrakt

• peptoni-kompleksne smjese polipeptida, peptida i aminokiselina, dobijaju se enzimskom razgradnjom proteina(tripsinom, pepsinom) i rastvorljivi su u vodi

• ugljeni hidrati-najdostupniji izvor energije, dodaju se u obliku mono-, di- ili polisaharida

• ekstrakt kvasca -kompleksni izvor vitamina, posebno B grupe

Hranljive podloge• agar-sastojak skoro svih čvrstih hranljivih podloga, dobija

se od alge Gellidium corneum, ne rastvara se u hladnoj vodi, rastvaranjem u ključaloj vodi gradi koloidni rastvor, kojihladjenjem ispod 45°C prelazi u gel, daje hranljivimpodlogama čvrstinu, a samo neke marinske bakterijskevrste imaju sposobnost razlaganja agra

• mogu da sadrže i:– tjelesne tečnosti (žuč, serum, krv i dr.)– indikatore– antibiotike– boje i dr.

• standardna podloga za gajenje bakterija je hranljivi agar iliMPA (meso-peptonski agar)

Podjela hranljivih podloga

• Prema porjeklu:1. Prirodne hranljive podloge -biljnog (krompir, mrkva…) ili

životinjskog porjekla (krv, jaje, žuč…)2. Sintetičke (vještačke) hranljive podloge –sadrže samo

sintetske materije čiji je hemijski sastav jasno definisan3. Polusintetičke –hemijski sastav nije jasno definisan,

pored materija sa jasno definisanim hemijskim sastavomsadrže i prirodne sastojke (pepton, serum, kvaščevekstrakt…)


• Prema konzistenciji (agregatnom stanju):1. Tečne podloge -ne sadrže agar, u svom nazivu obično nose

naziv voda ili bujon (mesna voda, mesnopeptonski bujon…), primjenjuju se najčešće za dobijanje biomase zabiohemijska, fiziološka ili genetska ispitivanja

2. Čvrste podloge -sadrže 2% agar, u svom nazivu nose nazivagar (mesnopeptonski agar), primenjuju se najčešće začuvanje stok kultura (kulture iz kolekcije), za izolacijučiste kulture ili za ispitivanje kulturelnih osobina

3. Polučvrste (polutečne) podloge –sadrže 0,5-0,15% agara, koriste se za ispitivanje pokretljivosti mo

čvrsta /agar

kosi agar

tekuća/bujon

duboki agarpolučvrsta podloga

Kultivacija mikroorganizama


• Prema namjeni:1. Neselektivne podloge –sadrže veću količinu

hranljivih materija i obezbjeñuju rast velikom br. mo, koriste se za odreñivanje brojnosti bakterijakoje se razvijaju pri odreñenim uslovima sredine(npr. ukupnog broja aerobnih mezofilnih bakterija), najčešće korišćena podloga ove vrste je mesnopeptonski agar (MPA) koji se često koristi i kao osnovni sastojak složenih podloga, mesnopeptonski bujon (MPB) je istog sastava samone sadrži agar

Hranjivi bujon i hranjivi agar(osnovne podloge)

Podjela hranljivih podloga2. Selektivne podloge –sadrže odreñene materije koje

omogućavaju rast i razmnožavanje jednoj grupi mo, a onemogućavaju razvoj drugih grupa; primer selektivne podloge je podloga sa 6,5% NaCl-a (omogućava rast halofilnih bakterija); selektivne podloge na kojima rastu Gr-, a ne rastu Gr+ (ilibar većina), sadrže žučne soli, bazični fuksin, eozin, metilen plavo…; podloge koje inhibiraju rast Gr-, a omogućavaju rast Gr+ bakterijama sadrže antibiotike; tečne podloge ovog tipa nazivaju se podloge zaobogaćenje, primer ovakve podloge je Selenit F bujon(sadrži Na selenit koji onemogućava rast velikom br. bakterija, a omogućava rast bakterijama roda Salmonellai Shigella)

SS (Salmonella/Shigella) agar(inhibira rast gram pozitivnih bakterija)

Cetrimid agar (zaizolaciju pseudomonasa– inhibira porastenterobakterija)


3. Diferencijalne podloge –omogućavaju rast više grupa mo, koje je zbog prisustva odreñenih supstanci ili indikatoramoguće razlikovati;primjer ovakve podloge je krvni agar; krvni agar dobijase dodavanjem 5-10% defibrinisane krvi, najčešće ovčijeili goveñe u sterilni, još uvek tečni hranljivi agar ili bazuza krvni agar; krvni agar ne sadrži indikatore, ali se nanjemu mogu razlikovati tipovi hemolize (razlaganjeeritrocita i hemoglobina od strane bakterije)

Diferencijalne podloge- krvi agar

Diferencijalne podloge


4. Kombinovane podloge -istovremeno su i selektivne i diferencijalne; endo agar sadrži bazični fuksin i laktozu i na njemu se diferenciraju bakterije koje fermentišu laktozu (njihovekolonije su obojene crveno) od onih koje je ne fermentišu (kolonije su obojene blijedo roze ili su bezbojne), a selektivna je jer sprečava rast Gr+ bakterija; MSA (Manitol Salt Agar) sadrži 7,5% NaCl, omogućavajući rast malom br. mo, pre svegapredstavnicima roda Staphylococcus, sadrži i manitol, pa se stafilokoke mogu razlikovati po tome da li fermentišu manitol (podloga menja boju iz crvene u žutu) ili ne fermentišu (podloga ne mjenja boju); Mc Conkey agar sadrži žučne solii kristal violet kojiinhibiraju rast Gr+ bakterija, a laktoza pozitivnebakterije obojene su crveno ili intenzivno roze

Endo agar

MacConkey Agar

Sastav podloge: laktoza kaoizvor ugljika; neutralno crvenilokao indikator; žučne soli

lijevo: laktoza negativne kolonijedesno: laktoza pozitivne kolonije

Manitol-slani agar zaizolaciju stafilokoka(visoka koncentracijaNaCl inhibira rast gramnegativnih bakterija


• Prema namjeni podloge se mogu još podjeliti na:1. Podloge za čuvanje2. Podloge za izolaciju3. Podloge za subkultivisanje4. Podloge za kultivisanje posebne vrste mikroorganizama5. Biohemijske podloge i dr.

Hranjive podloge

• Bez obzira na vrstu svaka podloga mora da zadovoljisljedeće kriterije:– Da sadrži sve potrebne materije za razvoj mo koji se

kultiviše– Da bude sterilna– Da ima odreñenu pH vrijednost– Da bude prozirna i bistra kako bi mogli da se prate rast

i razmnožavanje bakterija (pojava kolonija) i uoče promjene podloge kao posljedica njihove metaboličkeaktivnosti

Pravljenje hranljive podloge

• Koriste se dehidratizovane podloge, koje se pripremaju prema preskripciji proizvoñača

• Većina komercijalnih podloga je u praškastom obliku, pa ih je potrebno rastvoriti u vodi prije sterilizacije(sterilizacija se vrši u autoklavu)

Pravljenje hranljivih podloga

• u slučaju čvrstih podloga neophodno je otopiti agar (agar je otopljen kada je rastvor potpuno bistar)

• podesiti pH vrijednost dodavanjem NaOH ili NaCl, pH vrijednosttreba da bude za 0,1-0,2 viša od predviñene, jer prilikomsterilizacije dolazi do pada pH vrijednosti

• sterilizacija podloga u autoklavu• podloga namjenjena za razlivanje u petri ploče, steriliše se u

erlenmajeru u količini do 2/3 njegove zapremine• podloga za kosi agar se razliva u epruvete u količini od 5ml• podloga se prohladi na oko 50°C i pristupa njenom razlivanju• za gajenje mo u tečnoj podlozi najčešće se koriste erlenmajeri

ili epruvete, dok se za gajenje mo na čvrstoj podlozi koristepetri ploče ili epruvete sa “kosim agarom”

Izolacija mikroorganizama

• Od kada je Koch zapazio da se na površini krompira, koji je koristio kao podlogu za gajenje mo, razvijajupojedinačne i različite bakterijske kolonije, koristese metode izolacije mo pomoću čvrste podloge

• Mikroorganizmi mogu da se izoluju iz različitihuzoraka (vode, zemljišta, hrane, urina…)

• Kada se radi o uzorku vode, on se u laboratoriju donosiu sterilnoj boci, a zatim uzorak zasijava na podlogumetodom razmazivanja

Osnovne tehnike zasijavanjamikroorganizama

• Zasijavanje-postupak kojim se mo dovodi u kontaktsa hranljivom podlogom

• Metode zasijavanja mikroorganizama:

1. Metoda prelivanja (pour plate)2. Metoda razmazivanja (spread plate)3. Zasijavanje ubodom4. Zasijavanje potezom

Metoda prelivanja (pour plate)

• u petrijevu posudu aseptično se sipa odreñenorazblaženje uzorka (najčešće 1ml), a potom se prelije sterilnom podlogom otopljenom i ohlañenomna 45°C

• kružnim pokretanjem petrijeve posude uzorak i podloga se dobro izmješaju

• kada se podloga stegne, petrijeve posude se okrenu i inkubiraju

Metoda prelivanja (pour plate)

sipanje uzorka prelivanje sterilnom podlogom

kružno pokretanje petrijeve posude(mješanje uzoraka i podloge)

inkubacija

Metoda razmazivanja (spread plate)

• Na površini razlivenog i ohlañenog agara stavi se 0,5ml uzorka ili manje, a potom se pomoću sterilne staklenešpatule razmaže po površini podloge

Zasijavanjepotezom

Zasijavanje potezom

Zasijavanje ubodom

• Koristi se pri zasijavanju čvrste hranljive podlogerazlivene u epruvetama

• Sterilnom igličastom ezom uzme se kolonijamikroorganizama i zatim ubode u hranljivu podlogu

• Zasijane petri ploče se obilježavaju na poklopcu (vrstapodloge, uzorak, datum zasijavanja)

• Inkubacija se vrši u termostatu, pri čemu se petriploče odlažu u obrnutom položaju (tako da je poklopacsa donje strane)

• Nakon inkubacije iz kulture se pravi mikroskopskipreparat bojen po Gramm-u, da bi se uvjerilo da se u kulturi nalazi samo 1 morfološki oblik bakterija, kojese boje jedinstveno po Gramm-u

• u slučaju da kultura nije čista pristupa se postupkuiščišćavanja

Dobijanje čiste kulture

• čista kultura-bakterijska kultura koja je nastala iz 1 ćelije• za identifikaciju jedne vrste bakterija neophodan je rad sa

čistim kulturama, kako se ne bi dobili pogrešni rezultati• u slučaju da kultura nije čista pristupa se postupku

iščišćavanja• Najčešće primenjivana metoda je metoda iscrpljivanja

Metoda iscrpljivanja• Dio kolonije se uzima ezom i prenosi u drugu petri

ploču i raznosi cik-cak pokretima tako da pokriva cjelupovršinu, a zatim se ploča okreće za 90° i ista površinaagara prelazi cik-cak potezima

• Postupak se ponavlja na još 2-3 petri ploče

Dobijanje čiste kulture• Drugi način podrazumjeva da se na jedan dio ploče zasije

inokulum sa ishodišne kolonije se (kultura koja se iščišćava), spali se eza, a potom se dio zasijane kulturerazmazuje na nezasijani dio podloge, eza se ponovo spali, a postupak ponavlja 3-4x na istoj ploči, nakon inkubacije u slučaju da je kultura bila čista, u dijelovima podloge koji suposljednji zasijani javlja se 1 tip pojedinačnih kolonija, u slučaju da kolonija nije bila čista javiće se 2 ili više različitih tipova kolonija

Rast i razmnožavanje bakterija

vrijeme udvostručenja - generacijsko vrijeme

Vrijeme potrebno da se broj bakterijskih ćelija udvostruči

(da od 1 bakterijske ćelije nastanu 2)

• Generacijsko vrijeme- kreće se od 20 minuta do 24 sata(izračunava se prema log ili eksponecijalnoj fazi

krivulje rasta)• Escherichia coli

20 minuta (u 7 sati od 1 bakterije nastane 1 milijon ćelija)

• Mycobacterium tuberculosis

Nutritivni faktori

• Hemijske potrebe• Izvori esencijalnih nutrijenata• Transportni mehanizmi

Potrebne hemijske tvari/spojevi

• Ugljik (svi organski spojevi)• Azot (proteini)• Sumpor (proteini i vitamini)• Fosfor (DNA, RNA, ATP)Hemijski elementi potrebni u tragovimaPotrebni u vrlo malim količinama, bakterija ih

lako nalazi u prirodi gdje ih ima u izobilju-Željezo -Bakar-Molibden -Cink

Faktori rasta

• Esencijalni organski dodatci• Ne sintetizira ih sama bakterija– Moraju biti dodani mediju u kojem se kultiviraju bakterije

• npr. amino kiseline, vitamini (Haemophilus influenzae)

Izvor ugljika

• HETEROTROFIOvise o drugim oblicima života– Organske molekule– npr. šećeri, proteini, masti• AUTOTROFI– ("auto-" = “vlastito") = sami sebi

proizvode hranu– Anorganske molekule

Izvor energije

• KEMOHETEROTROFI dobivaju energiju i ugljik iz organskih spojeva – SAPROFITI ili PARAZITI

• FOTOAUTOTROFI izvor energije je sunčeva svjetlost koju pretvaraju u hemijsku energiju; primarni proizvoñači organske tvari za heterotrofe ; primarni proizvoñači kisika

• KEMOAUTOTROFI Dobivaju energiju iskorištavanjem organskih tvari; izvor ugljika –anorganski spojevi;

• LITOAUTOTROFIne koriste ni sunčevu svjetlost niti organske tvari; potpuno su ovisni o anorganskim spojevima

Fizikalni faktori neophodni za mikrobni

rast (faktori okoline)

• Temperatura• Atmosfera (plin)• Kisik• Ugljični dioksid• pH• Osmotski pritisak• (Koncentracija soli)

UTJECAJ TEMPERATURE NA BAKTERIJSKI RAST

• Više temperature ubrzavaju hemijske rakcije, ~ dvostruko se ubrzava za svakih 10 0C

• Porastom temperature ubrzava se rast ćelija do odreñene granice.

• Previsoke temperature dovode do denaturacije proteina i nukleinskih kiselina, gubitka neophodnih enzima i izostanka/gubitka metabolizma

• Svaki organizam karakteriziraju 3 temperature:1. minimalna temperatura, ispod koje nema bakterijskog rasta2. optimalna temperatura, pri kojoj je bakterijski rast najbrži3. maksimalna temperatura, iznad koje nema bakterijskog rasta

pH

• Većina bakterija raste pripH od 6,5 do 7,5

• ACIDOFILI (pH 1,0 – 5,5)Lactobacillus acidophilus

• ALKALOFILI (pH 8,5 – 11,5)Bacillus alcalophilus

Osmotski pritisak

Bakterije (sadrže oko 80-90% vode) su bolje prilagodene nižem osmotskom pritisku (npr. voda iz vodovoda)

• PLAZMOLIZA – ako je osmotski tlak visok

Osmotolerantni organizmi (HALOFILI)

• Manje tolerantni-Većina gram-negativnih bakterija

• Tolerantniji-Staphylococcus aureus-Gljive

Kisik (O2)

• Akceptor elektrona tokom aerobnog disanja

• Efikasniji od drugih akceptora (NO3, SO4 i CO3)

• Neutralizacija kisikovih radikalaSuperoksid dizmutaza (SOD) KatalazaPeroksidaza

“Zvono” sa svijećom

Atmosfera sasniženim O2,povišenim CO2

(oko 5% CO2)

ANAEROBI

Documents

Nativni Peparat i Bojenje Bakterija, Kultivisanje Bakterija