NÁVOD NA TESTOVÁNÍ AKTIVITY

FLUORESCENČNÍ ČOČKY S

IMOBILIZOVANÝM ENZYMEM POMOCÍ ZAŘÍZENÍ SAFIBRA

1

1) Bioreaktor

2) Termostat

3) Clarkova kyslíkova elektroda

4) Fluorescenční sonda

5) Jemné nastavení intenzity záření

6) Hrubé nastavení intenzity záření

7) Zapínače kanálů

8) Přívod vzduchu a dusíku

9) Připojení k termostatu

10) Bio Console

11) Bio Controller

12) Počítač pro ovládání zařízení Safibra

13) SOMS5 pro zapnutí detektoru záření

14) Detektor záření Safibra

12

13

12

10

11

1415

16

15) Tlaková nádoba s N2

16) Vzduchový ventil 2

34

56

8

7

9 9

3

Vložení čočky do bioreaktoru

4

1 2

31) Naplň bioreaktor

pufrem nebo médiem a vlož vhodné míchadlo.

2) Pomocí pinzety umísti fluorescenční čočku na optickou sondu (obr. 1-3).

5

1 2

1) Uzavři bioreaktor a připoj bílou hadici na přívod vzduchu (c).

2) Připoj bioreaktor k termostatu (a – přívod vody z termostatu, b – odvod vody do termostatu) .

3) Připoj Clarkovu elektrodu (obr. 1 a 2).

a

b

6

c

1) Zakryj zdroj záření a bioreaktor černým hadrem .

2) Zapni termostat (označeno na obr. 1).

3) Červeným ventilem zapni přívod vzduchu do bioreaktoru (obr. 2).

4) Zapni zdroj záření SOMS5 (obr. 3)

5) Zapni počítač (přihlášení jméno – host, heslo – Heslo1)

21

7

6) Zapni řídící jednotku Bio Console.

Rozsvítí se obrazovka řídící jednotky Bio Controller ADI 1010. 8

SPOUŠTĚNÍ PROGRAMU PRO MĚŘENÍ LIFETIMU FLUORESCENCE

9

1) Na ploše obrazovky počítače připojenému k detektoru záření vyber ikonu Safibra Sync. 2.0_new (na obr.)

2) Objeví se okno Data acquisition 2.0

Vyčkej statusu Ready.

1 2

10

V ikoně Measure vyber program Fluorescence miltipoint new sensor (SYNCDET).

11

Objeví se následující okno Fluorescence measurement - multipoint.

12

V okně Parameters

1) vyplň Start ch.: 1 a Stop ch.: 1,

2) vyplň Time constant 10,

3) zruš zaškrtnutí generate automatically,

4) pomocí napěťového šroubu detektoru nastav nastav intenzitu prvního okna

13

1) Otevři TotalCommander.

2) Zkopíruj cestu pro uložení dat do pole Output point (zmáčkni v TotalCommanderu pravým tlačítkem na horní řádek s adresářem – zmáčkni Ctrl+C – V řádku Output file zmáčkni Ctrl+V).

3) Za lomítko adresáře napiš jméno souboru pro uložení dat ve formě: nazev.csv.

14

V okně Status vyber Manual channel switch 1.

Channel 0 se změní v 1

15

Zmáčkni tlačítko Open graph.Objeví se černé okno časové závislosti doby života fluorescence. 16

KALIBRACE DOBY ŽIVOTA FLUORESCENCE SENZORU NA AEROBNĚ-ANAEROBNÍ

PODMÍNKY

17

Nastavení aerobních podmínek, tj. minimální hodnoty doby života

fluorescence.

18

Nastav 15% průtok vzduchu do biorektoru:

1) Na řídící jednotce Bio Controller zmáčkni tlačítko Menu.

2) Černým kolečkem vyber Manual Control.

3) Zmáčkni tlačítko Menu.

4) Černým kolečkem vyber Air Massflow Controller (na obr.).

5) Zmáčkni tlačítko Start/Stop.

6) Černý kolečkem nastav 15% (na obr.).

7) Zmáčkni postupně tlačítka Start/Stop a Setp.

Krok 6Krok 4

19

Po nastavení průtoku vzduchu do biorektoru vyletí kulička v průtokoměru na jednotce Bio Console.

Zmáčkni tlačítko Start v ikoně programu Fluorescence measurement.

Detail

20

V okně grafu se objeví šum doby života fluorescence v aerobních podmínkách. 21

Po nasycení média/pufru v bioreaktoru kyslíkem nakalibruj na jednotce Bio Controller Clarkovu kyslíkovou elektrodu na 100% nasycení kyslíkem:

1) Zmáčkni tlačítko Calib.

2) Zmáčkni tlačítko dO2.

3) Černým kolečkem vyber Calibration (na obr.).

4) Zmáčkni tlačítko Calib.

5) Černým kolečkem nastav 100% (na obr.).

6) Zmáčkni tlačítko Calibration.

7) Zmáčkni tlačítko Setp.

8) Třetí sloupec v Bio Controller ukazující koncentraci O2 v bioreaktoru se nastaví na 100% (na obr.).

Krok 3 Krok 5

Krok 8

22

Nastavení anaerobních podmínek

23

Vypni přívod vzduchu do bioreaktoru - viz str. 19 s tím rozdílem, že se hodnota Air Massflow Controller přenastaví černým kolečkem z hodnoty 15% na 0 %.

24

2) Zapni přívod dusíku do bioreaktoru postupným zapnutím ventilů 1, 2 a 3.

1

3

3) Na jednotce Bio Console nastav ventilem 3 průtok dusíku na 1 ml/min.

2

1) Vypni přívod vzduchu do bioreaktoru - viz str. 19 s tím rozdílem, že se hodnota Air Massflow Controller přenastaví černým kolečkem z hodnoty 15% na 0 %

Krok 2

Krok 3

25

V okně časové závislosti doby života fluorescence se vlivem snižující se koncentrace O2 v bioreaktoru postupně zvyšuje hodnota doby života fluorescence (obr. 1). Po poklesu koncentrace O2 v bioreaktoru (jednotka Bio Console na obr. 2), vyčkej ustálení lifetimu fluorescence při anaerobních podmínkách (na obr. 2)

1

2

1

26

Opětovné nastavení aerobních podmínek

27

1) Postupně vypni přívod N2 do bioreaktoru v pořadí ventilů na dusíkové bombě 3, 2 a 1 (str. 25).

2) Zapni přívod O2 do bioreaktoru (str. 19).

3) Vyčkej poklesu hodnoty lifetimu fluorescence na původní hodnotu.

28

TESTOVÁNÍ ODEZVY FLUORESCENČNÍHO SENZORU S

ENZYMEM NA KONCENTRACI SUBSTRÁTU

29

1) Stříkačkou naber vzorek substrátu.

2) Skleněnou tyčinkou ve víku bioreaktoru nastříkni vzorek substrátu do bioreaktoru (na obr.).

3) Odezva enzymu imobilizovaného na fluorescenční čočce se projeví vzrůstem (schodem) lifetimu fluorescence v grafu.

Krok 2

Krok 3

nástřik

30

POPIS OKEN PROGRAMU FLUORESCENCE

MEASUREMENT MULTIPOINT NEW SENSOR

31

32

TAU – doba života fluorescenceCHANNEL – nastavený měřící kanál detektoruINTENSITIES – intenzity fluorescence ve 4 oknech (intenzita v 1. okně max. 9.999 E 6)TIME CONSTANT – RANGE – měřicí rozsah

OKNO PARAMETERSREADOUT PERIOD – časová perioda snímání dat doby života fluorescenceCHANNEL SWITCH PERIOD –Start ch., Stop ch. –TIMECONST DELAY –SAMPLE NAME, OPERATOR NAME, NOTE – pole pro vpisování poznámek k experimentůmOUTPUT FILE – pole pro vkládání cesty pro uložení dat

33

OKNO STATUSVALUES MEASURED– počet naměřených datCURRENT DATA MARKER – počet poznámek vložených do grafuDATA MARKER NOTE – vložení poznámky do grafu (vožení pomocí tlačítka Set new marker) MANUAL CHANNEL SWITCH – nastavení použitého kanálu detektoruOPEN GRAPH – otevření okna časové závislosti doby života fluorescenceGRAPH TIME SCALE, GRAPH Y-SCALE – nastavení měřítek os grafu

34

OKNO ADDITIONAL CONTROLSNENASTAVUJE SE!!!!Slouží ke kalibraci programu pro různé čočky

35

OKNO O2 CONCENTRATIONNemusí se nastavovat!!!Kalibrace koncentrace kyslíku v bioreaktoru (měřeno Clarkovou elektrodou) na dobu života fluorescence.

36

OKNO FAULT DETECTIONNENASTAVUJE SE!!!DETERMINATION COEFFICIENT OF EXPONENTIAL FIT – koeficient pro vypočítání doby života fluorescenceFLUORESCENCE DECAY GRAPH – graf zhášení fluorescence

37

OKNO LOGUkládání softwarových procesů