Click here to load reader
Upload
cloris
View
206
Download
4
Embed Size (px)
DESCRIPTION
ICDC, China CDC. NDM-1 基因的检测与确认. 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所. NDM-1 简介. 一个新发现的耐药基因,全长 826bp 编码 1 型新德里金属 β- 内酰胺酶 造细菌成对碳青酶烯类药物耐药 位于质粒上 最初发现在肺炎克雷伯杆质粒 pKpANDM-1 上 Genbank FN396876 ( 2009.11.24 ) 具有可移动性 可在不同种属细菌间转移 革兰阴性:肠杆菌科、不动杆菌、假单胞菌 革兰阳性:?? - PowerPoint PPT Presentation
Citation preview
ICDC, China CDC
NDM-1 基因的检测与确认
ICDC, China CDC
中国疾病预防控制中心传染病预防控制所
ICDC, China CDC
NDM-1 简介
一个新发现的耐药基因,全长 826bp
编码 1 型新德里金属 β- 内酰胺酶 造细菌成对碳青酶烯类药物耐药
位于质粒上 最初发现在肺炎克雷伯杆质粒 pKpANDM-1 上 Genbank FN396876 ( 2009.11.24 )
具有可移动性 可在不同种属细菌间转移 革兰阴性:肠杆菌科、不动杆菌、假单胞菌 革兰阳性:?? E.coli Genbank AB571289 ( 2010.07.10 )
ICDC, China CDC
NDM-1 的基因检测
1. PCR 检测2. 序列测定——最终确认
检测对象: 已经过表型筛检的菌株进行 NDM-1 基因确认 对大批菌株直接进行筛检 对标本的检测
高通量、快速、准确
ICDC, China CDC
PCR 检测方法——模板制备
模板制备:菌株、标本1. 菌株( 1 ) G- 细菌: a. 水煮模板:新鲜培养物悬浊于 100-200μl 纯水 沸水浴 10min 以上 8000rpm 以上离心 5min
吸取上清, -20 ℃ 保存 b. 试剂盒提取基因组 DNA (说明书)
ICDC, China CDC
PCR 检测方法——模板制备1. 菌株( 2 ) G+ 细菌: a. 试剂盒提取基因组 DNA (说明书) 溶菌酶充分作用 b. 水煮模板:新鲜培养物悬浊于 100-200 μ l 纯水 低温反复冻融( -40 ℃ 以下或液氮) 沸水浴 10min 以上 8000rpm 以上离心 5min
吸取上清, -20 ℃ 保存
2. 标本:根据标本类型不同选择相应的试剂盒
ICDC, China CDC
PCR 检测——引物选择1. 引物选择:
扩增片段位于 CDS 正向的 191-482 位置(反向 345-636 位置) 483-769 位置(反向 58-344 位置) 引物特异性较好,理论上无非特异扩增片段
引物 引物序列( 5 '→ 3 ') 产物大小( bp) 退火温度 ( )℃
引物 1
17U-191 CAGCACACTTCCTATCTC 292 55
17L-465 CCGCAACCATCCCCTCTT
引物 2
F-58 GGCGGAATGGCTCATCACGA 286 60
R-344 CGCAACACAGCCTGACTTTC
ICDC, China CDC
PCR 检测—— PCR 体系 引物合成稀释 冻干粉末,开启前 10000rpm 离心 5min
小心开盖,防止粉末喷出 1.0OD+268 μ l 纯水,充分震荡混匀 ,浓
度 20 μ M ( 20 μ mol/L )
20 μ l 体系(右图) 若使用含有 Mg2+ 的 10×buffer 的加
入量同上表, MgCl2 体积用水补齐 PCR Premix 预混液(根据说明书)
成分 体积( μl)
10×buffer 2
dNTP ( 10mM each) 1.6
MgCl2 ( 2.5mM) 1.2
Primer-F ( 20μM ) 1
Primei-R ( 20μM ) 1
Taq ( 5U/μl) 0.2
纯水 12
DNA 1ng
总体积 20
ICDC, China CDC
PCR 检测—— PCR 体系
没有阳性对照,如何确保体系正常运转
同批 配置体系时:增加 1 管不使用 NDM-1 引物 加入常用引物及模板,扩增其他已知片段
人工合成长片段 DNA 作为阳性对照?? 不建议合成:首次发现时如何排除“污染”质疑 如果一定要合成:在中间区域加入若干数量的突变位点 作为区别合成片段与实际阳性片段的标志
ICDC, China CDC
PCR 检测—— PCR 反应条件与电泳
反应条件:(约耗时 1 小时 25 分钟)94 5min℃
94 15sec℃
Tm 30sec 25℃ 个循环72 30sec℃
72 5min℃
电泳: 1.5%琼脂糖电泳 marker : DL2000
ICDC, China CDC
基因序列测定——最终确认
PCR 阳性结果:携带 NDM-1 基因 非特异扩增 最终确认:序列测定 测序公司,当天得到结果
测序样品: 100 μ l 以上 PCR 产物 引物及其浓度:上下游引物各 10 μ l ( 20uM ) 测序要求:双向、测通,提供拼接好的序列
ICDC, China CDC
基因序列测定——测序结果判读
测序彩图:峰体清晰、无套峰
ICDC, China CDC
基因序列测定——测序结果判读
双向测序结果拼接
起始段结果( 10-30bp )、反应结果段结果( >500bp )不可用
ICDC, China CDC
基因序列测定——序列比对 下载参考序列: Genbank : FN396876.1
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/255031061
AB571289 、 HQ171206 、 HM853678
将测度序列与参考序列比对: 常用软件: Clustal 、 DNAstar 、 Mega……
最终确认是否为 NDM-1 基因序列 判定该细菌携带 NDM-1 基因
ICDC, China CDC
NDM-1 基因携带与耐药
抗生素敏感性——细菌表型特征 耐药基因正确表达,表现出细菌的抗生素敏感性 一种细菌可具有多种耐药机制 NDM-1只是其中一种 该细菌表现出的抗生素敏感性是各种耐药机制综合表现的结果
NDM-1 基因的检测与确认——基于基因水平的判断 菌株 A携带 NDM-1 基因 菌株 A 的耐药谱, NDM-1 基因对于这株菌的作用 —— 具体问题具体分析
ICDC, China CDC
谢谢大家!!