Embed Size (px)
DESCRIPTION
Luận văn tốt nghiệp Dược sĩ đại học Trường Đại Học y Dược Cần Thơ
Citation preview
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ
LÊ THANH HUY
NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG CÔNG THỨC
VIÊN NANG CHỨA CAO DIẾP CÁ
Houttuynia cordata Thunb.
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
Ths. NGUYỄN THỊ LINH TUYỀN
Cần Thơ - 2011
LỜI CÁM ƠN
Em xin gửi lòng biết ơn sâu sắc nhất đến cô ThS. Nguyễn Thị Linh Tuyền đã
trực tiếp hướng dẫn, hết lòng truyền đạt kiến thức và giúp đỡ em trong suốt quá trình
thực hiện luận văn.
Em xin chân thành cám ơn thầy DS. Lâm Thanh Hùng và thầy ThS. Đỗ Châu
Minh Vĩnh Thọ đã tận tình hướng dẫn và tạo điều kiện cho em thực hiện tốt luận văn.
Em xin chân thành cám ơn Quý Thầy Cô và Anh Chị ky thuật viên bộ môn Công
Nghiệp Dược, bộ môn Dược Liệu, bộ môn Hóa Phân Tích - Kiểm Nghiệm - Độc Chất,
bộ môn Bào Chế đã hỗ trợ dụng cụ, hóa chất, trang thiết bị, giúp đỡ em hết lòng trong
quá trình thực hiện luận văn.
Em xin chân thành cám ơn Hội đồng chấm khóa luận tốt nghiệp Dược sy đại học
đã dành thời gian xem xét, góp ý và sửa chữa để luận văn được hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cám ơn Quý Thầy Cô trường Đại Học Y Dược Cần Thơ đã
dìu dắt, trang bị kiến thức cho em trong suốt năm năm học vừa qua.
Xin cám ơn các bạn Đoan Trang, Hoa Hạ, Diễm Huỳnh, Mạnh Hùng, Trọng
Tính, Anh Tuấn,Thanh Sang, các bạn lớp Dược khóa 32, các bạn ở cùng nhà trọ đã
luôn động viên, chia sẻ, giúp đỡ trong thời gian qua.
Con xin cám ơn gia đình - chỗ dựa vững chắc nhất giúp con vượt qua mọi khó
khăn thử thách trong công việc và trong cuộc sống.
Cần Thơ, tháng 06 năm 2011.
Lê Thanh Huy
LỜI CAM ĐOAN
Tôi tên Lê Thanh Huy xin cam đoan đây là công trình
nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận
văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ
công trình nào khác.
Cần Thơ, tháng 06 năm 2011.
Lê Thanh Huy
i
MỤC LỤC
Mục lục........................................................................................................................ i
Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt.........................................................................v
Danh mục các bảng....................................................................................................vi
Danh mục các hình ảnh.............................................................................................vii
Danh mục các sơ đồ.................................................................................................viii
ĐẶT VẤN ĐỀ............................................................................................................1
Chương 1 – TỔNG QUAN.........................................................................................3
1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY DIẾP CÁ.................................................................3
1.1.1. Đặc điểm thực vật.....................................................................................3
1.1.2. Phân bố sinh thái.......................................................................................3
1.1.3. Thành phần hóa học..................................................................................4
1.1.3.1. Flavonoid..........................................................................................4
1.1.3.2. Tinh dầu............................................................................................4
1.1.3.3. Alkaloid............................................................................................5
1.1.3.4. Các thành phần khác........................................................................5
1.1.4. Tác dụng dược lý......................................................................................5
1.1.5. Công dụng.................................................................................................6
1.2. CÔNG NGHỆ BÀO CHẾ VIÊN NANG CỨNG............................................7
1.2.1. Khái quát về thuốc viên nang...................................................................7
1.2.1.1. Định nghĩa........................................................................................7
1.2.1.2. Ưu điểm của viên nang cứng............................................................7
1.2.2. Thành phần viên nang...............................................................................7
1.2.2.1. Vỏ nang............................................................................................7
1.2.2.2. Thành phần dược chất trong viên nang............................................8
1.2.3. Quy trình bào chế thuốc viên nang cứng từ dược liệu..............................9
1.3. SƠ LƯỢC VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO......10
1.3.1. Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký..........................................11
1.3.1.1. Hệ số dung lượng...........................................................................11
ii
1.3.1.2. Hệ số chọn lọc................................................................................11
1.3.1.3. Hệ số bất đối xứng.........................................................................11
1.3.1.4. Độ phân giải...................................................................................11
1.3.1.5. Số đĩa lý thuyết và hiệu lực cột......................................................12
1.3.2. Một số ứng dụng của phương pháp HPLC.............................................12
1.3.2.1. Phân tích định tính..........................................................................12
1.3.2.2. Phân tích định lượng......................................................................12
1.4. GIỚI THIỆU MỘT SỐ CHẾ PHẨM CHỨA CAO DIẾP CÁ......................13
1.4.1. An trĩ vương...........................................................................................13
1.4.2. Helaf........................................................................................................13
1.4.3. Cenditan.................................................................................................14
Chương 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...........................15
2.1. NGUYÊN LIỆU, CHẤT CHUẨN, HÓA CHẤT VÀ TRANG THIẾT BỊ...15
2.1.1. Nguyên liệu và chất chuẩn......................................................................15
2.1.2. Hóa chất..................................................................................................15
2.1.3. Trang thiết bị...........................................................................................16
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................................................................16
2.2.1. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng quercetin bằng phương
pháp HPLC.......................................................................................................16
2.2.1.1. Khảo sát các điều kiện sắc ký tối ưu..............................................16
2.2.1.2. Khảo sát phương pháp xử lý mẫu cao Diếp cá và viên nang chứa
cao Diếp cá..................................................................................................17
2.1.1.3. Thẩm định quy trình định lượng....................................................20
2.2.2. Xây dựng công thức viên nang chứa cao Diếp cá...................................21
2.2.2.1. Thiết kế công thức viên nang chứa cao Diếp cá.............................21
2.2.2.2. Phương pháp khảo sát đặc tính của khối bột thuốc và đo độ rã của
viên nang....................................................................................................23
2.2.2.3. Quy trình điều chế viên nang chứa cao Diếp cá.............................24
2.2.3. Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cho viên nang chứa cao Diếp cá.....24
iii
2.2.3.1. Hình thức cảm quan.......................................................................24
2.2.3.2. Độ đồng đều khối lượng.................................................................24
2.2.3.3. Độ tan rã.........................................................................................24
2.2.3.4. Độ ẩm.............................................................................................24
2.2.3.5. Định tính.........................................................................................24
2.2.3.6. Định lượng.....................................................................................25
Chương 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU....................................................................27
3.1. XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG
QUERCETIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC...................................................27
3.1.1. Khảo sát các điều kiện sắc ký tối ưu.......................................................27
3.1.2. Khảo sát quy trình xử lý mẫu cao Diếp cá và viên nang chứa cao
Diếp cá..............................................................................................................28
3.1.3. Thẩm định quy trình định lượng quercetin.............................................30
3.1.3.1. Xác định tính tương thích hệ thống................................................30
3.1.3.2. Thẩm định phương pháp phân tích.................................................31
3.2. THIẾT KẾ CÔNG THỨC VIÊN NANG CHỨA CAO DIẾP CÁ...............35
3.2.1. Lựa chọn hàm lượng cao........................................................................35
3.2.2. Lựa chọn hàm lượng tá dược hút............................................................35
3.2.3. Lựa chọn công thức tối ưu cho viên nang chứa cao Diếp cá..................36
3.2.3.1. Độ ẩm.............................................................................................37
3.2.3.2. Góc chảy.........................................................................................37
3.2.3.3. Tỷ trọng biểu kiến..........................................................................37
3.2.3.4. Phân bố cỡ hạt................................................................................38
3.2.3.5. Độ tan rã.........................................................................................39
3.3. KIỂM NGHIỆM VIÊN NANG CHỨA CAO DIẾP CÁ...............................40
3.3.1. Hình thức cảm quan................................................................................40
3.3.2. Đồng đều khối lượng..............................................................................40
3.3.3. Độ tan rã..................................................................................................41
3.3.4. Độ ẩm......................................................................................................41
iv
3.3.5. Định tính.................................................................................................41
3.3.5.1. Bằng phản ứng hóa học..................................................................41
3.3.5.2. Bằng SKLM...................................................................................41
3.3.6. Định lượng..............................................................................................42
3.4. XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN VIÊN NANG CHỨA CAO DIẾP CÁ...........42
3.4.1. Tiêu chuẩn ky thuật.................................................................................42
3.4.2. Kết quả kiểm nghiệm..............................................................................46
Chương 4 - BÀN LUẬN...........................................................................................47
4.1. Về xây dựng và thẩm định quy trình định lượng quercetin trong cao Diếp cá
và viên nang chứa cao Diếp cá.............................................................................47
4.2. Về nghiên cứu xây dựng công thức cho viên nang chứa cao Diếp cá...........47
4.3. Về xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cho viên nang chứa cao Diếp cá.......48
Chươg 5 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.................................................................49
5.1. Kết luận..........................................................................................................49
5.2. Kiến nghị.......................................................................................................49
TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................51
v
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
AOACHiệp hội các nhà hoá học phân tích quốc tế
(Association of Official Analytical Chemists)
CHCl3 Chloroform
CH3CN Acetonitril
DĐVN Dược điển Việt Nam
dtvđ Tỷ trọng trước va đập
dsvđ Tỷ trọng sau va đập
HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao
(High Performance Liquid Chromatography)
MeOH Methanol
RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)
SD Độ lệch chuẩn (Standard Deviation)
SKLM Sắc ký lớp mỏng
STT Số thứ tự
TB Trung bình
tR Thời gian lưu
TT Thuốc thử
UV Tử ngoại (Ultra Violet)
Vtvđ Thể tích trước va đập
Vsvđ Thể tích sau va đập
vi
DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1. Các hóa chất, tá dược sử dụng trong nghiên cứu.....................................15
Bảng 2.2. Các thiết bị dùng trong nghiên cứu..........................................................16
Bảng 2.3. Phương pháp pha các dung dịch có nồng độ thấp hơn.............................17
Bảng 2.4. Các công thức thiết kế tối ưu công thức viên nang..................................22
Bảng 2.5. Định tính viên nang chứa cao Diếp cá bằng phản ứng hóa học...............25
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống trên 6 lần tiêm mẫu chuẩn...30
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống trên 6 lần tiêm mẫu thử.......30
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát tính tuyến tính phương pháp định lượng bằng HPLC. .33
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát độ chính xác phương pháp định lượng bằng HPLC.....34
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng bằng HPLC......34
Bảng 3.6. Các công thức thiết kế để xác định hàm lượng cao thích hợp..................35
Bảng 3.7. Độ ẩm các công thức C1, C2, C3, C4......................................................35
Bảng 3.8. Các công thức thiết kế để xác định hàm lượng tá dược hút.....................35
Bảng 3.9. Độ ẩm các công thức H1, H2, H3, H4.....................................................36
Bảng 3.10. Các công thức thiết kế tối ưu hóa công thức viên nang.........................36
Bảng 3.11. Độ ẩm các công thức khảo sát (T1 – T10).............................................37
Bảng 3.12. Góc chảy các công thức khảo sát (T1 – T10).........................................37
Bảng 3.13. Tỷ trọng biểu kiến của các công thức khảo sát (T1 – T10)....................37
Bảng 3.14. Phân bố cỡ hạt của các công thức khảo sát (T1 – T10)..........................38
Bảng 3.15. Độ rã các công thức khảo sát (T1 – T10)...............................................39
Bảng 3.16. Kết quả kiểm nghiệm độ đồng đều về khối lượng.................................40
Bảng 3.17. Kết quả đo độ rã.....................................................................................41
Bảng 3.18. Kết quả đo độ ẩm...................................................................................41
Bảng 3.19. Kết quả định tính viên nang chứa cao Diếp cá.......................................41
Bảng 3.20. Kết quả kiểm nghiệm viên nang Diếp cá..............................................46
vii
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Trang
Hình 1.1. Cây Diếp cá................................................................................................3
Hình 1.2. Công thức cấu tạo của quercitrin và isoquercitrin......................................4
Hình 1.3. Sơ đồ cấu tạo chung của một hệ thống HPLC..........................................10
Hình 1.4. Cách xác định thời gian chết (t0) và thời gian lưu (tR)..............................11
Hình 1.5. Cách xác định số đĩa lý thuyết..................................................................12
Hình 1.6. Chế phẩm An Trĩ Vương..........................................................................13
Hình 1.7. Chế phẩm Helaf........................................................................................13
Hình 1.8. Chế phẩm Cenditan..................................................................................14
Hình 2.1. Phương pháp xác định góc nghỉ của bột, hạt thuốc..................................24
Hình 3.1. Sắc ký đồ 3D mẫu thử ở bước sóng từ 250nm – 450nm..........................27
Hình 3.2. Sắc ký đồ contour mẫu thử.......................................................................27
Hình 3.3. Sắc ký đồ các dịch thủy phân quercetin sau 1h, 2h và 3h........................28
Hình 3.4. Sắc ký đồ mẫu thử trước và sau khi loại tạp bằng SPE tự chế.................29
Hình 3.5. Sắc ký đồ mẫu chuẩn................................................................................31
Hình 3.6. Sắc ký đồ mẫu thử....................................................................................31
Hình 3.7 Sắc ký đồ mẫu trắng..................................................................................31
Hình 3.8. Sắc ký đồ mẫu dung môi..........................................................................32
Hình 3.9. Sắc ký đồ mẫu dung dịch nước acid phosphoric 0,2%.............................32
Hình 3.10. Kết quả chồng phổ mẫu chuẩn, mẫu dung môi, mẫu tá dược và mẫu
dung dịch nước acid phosphoric 0,2%......................................................................32
Hình 3.11. Biểu đồ tính tuyến tính của phương pháp định lượng bằng HPLC........33
Hình 3.12. Biểu đồ phân bố cỡ hạt của các công thức từ T1 đến T5.......................38
Hình 3.13. Biểu đồ phân bố cỡ hạt của các công thức từ T6 đến T10.....................39
Hình 3.14. Kết quả định tính bằng SKLM viên nang chứa cao Diếp cá..................41
viii
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 1.1. Tóm tắt quy trình sản xuất viên nang cứng...............................................9
Sơ đồ 2.1. Tóm tắt quy trình xử lý mẫu thử..............................................................19
1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Quay về với thiên nhiên là xu hướng của thế kỷ XXI. Trong lĩnh vực Dược, các
thuốc có nguồn gốc từ dược liệu ngày càng được quan tâm nhiều hơn. Trước đây,
người ta thường hiểu chỉ có một số nước phương Đông như Trung Quốc, Việt Nam,
…mới có nhiều sản phẩm từ thiên nhiên. Thực tế, theo Tổ Chức Y Tế Thế Giới
(WHO) hiện có tới 60% dân số sử dụng các sản phẩm này từ các nước châu Á như
Ấn Độ, Thái Lan đến các nước Châu Phi và My La Tinh. Trong đó có nhiều nhóm,
loại thuốc chiếm tỷ trọng cao: chẳng hạn chiết xuất thực vật chữa phì đại tiền liệt
tuyến lành tính có tới 100 biệt dược, chiếm tới 25 – 36% (Pháp, Đức) 3,5 – 10,5%
(Italia, Tây Ban Nha) so với tổng số dược phẩm chữa bệnh này. 32
Việt Nam là nước nhiệt đới gió mùa, động thực vật phong phú là tiền đề tốt để
phát triển các sản phẩm từ dược liệu. Nguồn dược liệu dồi dào là nền tảng cho việc
hình thành các cơ sở sản xuất thuốc từ dược liệu. Theo thống kê của Bộ Y tế, cả
nước hiện có hơn 300 cơ sở sản xuất thuốc từ dược liệu trong nước, trong đó có 10
cơ sở đông dược đạt chuẩn thực hành tốt sản xuất thuốc của WHO. Nhiều công ty
dược cũng có thương hiệu riêng từ thế mạnh của cây dược liệu. 31
Trong các loại dược liệu phổ biến, Diếp cá là loại rau ăn quen thuộc hằng ngày
được nhân dân ta sử dụng làm thuốc với nhiều tác dụng: trị táo bón, trĩ, mụn nhọt,
lở ngứa,….Tuy nhiên có một số bất tiện trong việc sử dụng dược liệu này như khó
ăn và không thể ăn với lượng lớn. Mặt khác, việc sử dụng dược liệu như thực phẩm
hay các sản phẩm không được chuẩn hóa và kiểm soát chặt chẽ sẽ ảnh hưởng lớn
đến tính an toàn và hiệu quả trị liệu. Vì vậy, đề tài nghiên cứu xây dựng công thức
viên nang chứa cao Diếp cá được thực hiện với những mục tiêu cụ thể như sau:
1. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng quercetin trong cao Diếp cá và
viên nang chứa cao Diếp cá.
2. Xây dựng công thức viên nang chứa cao Diếp cá.
3. Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cho viên nang bào chế được.
2
Ý nghĩa của đề tài:
1. Góp phần nghiên cứu và cung cấp cơ sở lý luận bào chế các chế phẩm từ
cao dược liệu.
2. Là cơ sở cho các nghiên cứu sau này trên quy mô pilot và công nghiệp.
Hình 1.1. Cây Diếp cá.
3
Chương 1 – TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY DIẾP CÁ:
Tên khác: Lá giấp, rau giấp cá, tạp thái, ngư tinh thảo, rau vẹn.
Tên khoa học: Houttuynia cordata Thunb.
Họ lá giấp: Saururaceae.
1.1.1. Đặc điểm thực vật: [6], [13], [16]
Cây thảo, sống lâu năm, cao 20 – 40cm, thân
ngầm mọc bò ngang trong đất, màu trắng, hơi có
lông, bén rễ ở các mấu. Thân đứng nhẵn, màu lục
hoặc tím đỏ. Lá mọc so le, hình tim, đầu nhọn,
mặt trên màu lục sẫm, mặt dưới màu tím, hơi có
lông mọc theo gân lá của cả hai mặt, gân chính 7;
cuốn lá dài, có bẹ, lá kèm có lông ở mép.
Cụm hoa mọc ở ngọn thân thành bông dài 2 –
2,5cm, mang nhiều hoa nhỏ màu vàng nhạt; tổng
bao gồm 4 lá bắc màu trắng nom như một chiếc
hoa riêng lẻ; hoa không có bao hoa; nhị 3. Quả
nang mở ở đỉnh; hạt hình trái xoan nhẵn. Toàn thân vò ra có mùi tanh như mùi cá.
Mùa hoa quả: tháng 5 – 7.
1.1.2. Phân bố sinh thái: [13], [16]
Diếp cá phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới châu Á, từ Nhật
Bản, Trung Quốc đến Việt Nam, Lào, Ấn Độ và các nước Đông Nam Á khác. Ở
Việt Nam, cây mọc hoang dại ở các tỉnh miền núi, trung du và đồng bằng. Cây còn
được trồng ở nhiều nơi để làm rau và làm thuốc. Diếp cá thuộc cây ưu ẩm và hơi
chịu bóng, thường mọc ở đất ẩm, nhiều mùn dọc theo các bờ khe suối, mương nước
trong thung lũng và ở vùng đồng bằng. Cây sinh trưởng gần như quang năm, mạnh
nhất trong mùa xuân hè, có hoa quả hàng năm trên những cây không bị ngắt ngọn
và hái lá thường xuyên, có khả năng tái sinh chồi mạnh từ thân rễ.
4
1.1.3. Thành phần hóa học:
1.1.3.1. Flavonoid:
Các flavonoid đáng chú ý là: afzelin, phloretin, rutin, quercitrin (quercetin 3-
rhamnosid), isoquercitrin (quercetin 3-glucosid), dioxy – flavonon. [6]
quercitrin isoquercitrin
Hình 1.2. Công thức cấu tạo của quercitrin và isoquercitrin.
Các flavonoid khác là dạng glycosid của quercetin như: [12], [18], [19], [27]
- Quercetin-3-O-β-D-galactosid-7-O-beta-D-glucosid
- Quercetin-3-O-β-D-galactopyranosid (hyperin)
- Quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-7-O-β-D-glucopyranosid
- Quercetin-3-O-α-L-arabinofuranosid (avicularin)
Trong đó quercitrin, isoquercitin và phloretin được coi là những hợp chất có tác
dụng chống ung thư và tác dụng ngăn chặn gốc tự do. [18], [19]
1.1.3.2. Tinh dầu:
Toàn thân Diếp cá chứa tinh dầu, đây là thành phần làm cho dược liệu có mùi
đặc biệt. Thành phần chủ yếu là nhóm aldehyde và các dẫn chất ceton như methyl-
n-nonylceton, 1-decanal, 1-dodecanal là những chất không có tác dụng kháng
khuẩn, chất có tác dụng kháng khuẩn là 3-oxododecanal, đây là thành phần chính
của tinh dầu nhưng không bền và dễ bị phân hủy khi chưng cất. Nhóm terpen bao
gồm các chất: α-pinen, camphen, myrcen, limonen, linalol, bornyl acetat, geraniol
và caryophylen. [6]
Ngoài ra tinh dầu Diếp cá còn chứa acid hữu cơ: acid caprinic, laurinaldehyde,
benzamid, acid hexadecanoic, acid decanoid, acid palmitic, acid linoleic, acid oleic,
acid stearic,…lipid và vitamin K. [6], [30]
5
1.1.3.3 Alkaloid:
Từ Diếp cá đã phân lập được β-sitosterol [14], sáu alkaloid có hoạt tính sinh
học là aristolactam B(1), piperolactam A(2), aristolactam A(3), norcepharadione
B(4), cepharadione B(5) và splendidine(6) cũng được tìm thấy trong dịch chiết
methanol phần trên mặt đất của cây Diếp cá. [23]
1.1.3.4.Các thành phần khác:
Nước: 91,5%, protid: 2,9%, glucid: 2,7%, lipid: 0,5%, cellulose:1,8%, Calci:
0,3mg, Kali: 0,1mg, tiền vitamin A: 1,26mg, vitamin C: 68mg (trong 100g rau Diếp
cá tươi). [13]
Ngoài ra Diếp cá còn chứa Sắt (Fe), Magnesi (Mg), Mangan (Mn), không tìm
thấy các kim loại nặng như Arsen (As), Cadimi (Cd), Chrom (Cr), hoặc Chì (Pb)
trong mẫu phân tích. [20]
1.1.4. Tác dụng dược lý:
Tác dụng kháng virus: [21]
Theo Kyoko Hayashi và cộng sự Diếp cá ức chế trực tiếp virus herpes chủng 1
(HSV-1), virus cúm, virus gây suy giảm miễn dịch mắc phải ở người loại 1 (HIV-1)
mà không biểu hiện độc tính, nhưng không chống lại poliovirus và coxsackie virus.
Mức độ giảm virus liên quan đến thời gian xử lý bằng thuốc. Ba thành phần chính
có tác dụng là: xeton methyl n-nonyl, aldehyde lauryl, và aldehyde capryl.
Tác dụng chống ung thư máu: [17]
Công trình nghiên cứu của Chang Jung-San và cộng sự, mục đích để đánh giá
tác dụng chống ung thư máu của H.cordata và Bidens pilosa. Năm dòng tế bào ung
thư máu, theo thứ tự là L1210, U937, K562, Raji và P3HR1 được nuôi cấy với chất
chiết xuất của H. cordata và Bidens pilosa. Kết quả cho thấy chiết xuất từ các dược
liệu trên có tác dụng ngăn chặn 5 dòng tế bào này.
Tác dụng chống viêm tuyến vú: [29]
Công trình nghiên cứu được thực hiện tại Trường đại học Thú y, thuộc Viện đại
học Nông nghiệp Zbejiang, Hangzbou, Trung Quốc. Từ Houttuynia cordata, các
nhà nghiên cứu đã chiết xuất được chất Houttuynia, sau đó cho Houttuynia phản
6
ứng với bisulphat natri để có được chất Houttuynin bisulphat natri. Từ chất này, họ
đã chế biến được một dung dịch tiêm vào vú để điều trị bệnh viêm tuyến vú ở bò.
Thử nghiệm trên 52 trường hợp viêm tuyến vú ở bò được chia làm 2 nhóm:
nhóm 1 tiêm 80mg dung dịch H. bisulphat Na và nhóm 2 tiêm 800.000 đơn vị
Penicillin kết hợp với 1g Streptomycin. Kết quả cho thấy 88,2% viêm tuyến vú đã
điều trị khỏi với H.bisulphat Na, so với 90% được chữa lành với Penicillin +
Streptomycin. Như vậy, không có sự khác biệt đáng kể trong điều trị viêm tuyến vú
cấp tính giữa 2 nhóm trên.
Các tác dụng khác:
Diếp cá còn có tác dụng kháng khuẩn [26], kháng viêm [22], chống oxy hóa
[28]. Dịch chiết nước Diếp cá dùng điều trị cho bệnh nhân viêm xoang mãn tính và
polyp mũi [25].
1.1.5. Công dụng: [6], [13], [16]
Diếp cá được dùng trị táo bón, trĩ, mụn nhọt, lở ngứa, trẻ con lên sởi, viêm phổi
hoặc phổi có mủ, đau mắt đỏ hoặc đau mắt do nhiễm trực khuẩn mủ xanh, viêm
ruột, kiết lỵ, bí tiểu tiện, kinh nguyệt không đều.
Ở Trung Quốc, một hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn đã được phân lập từ cây
diếp cá và bào chế thành thuốc viên và thuốc tiêm để trị bệnh nhiễm khuẩn.
Ở Nhật Bản, thân rễ Diếp cá có trong thành phần của một số chế phẩm thuốc
dùng chữa một số bệnh của phụ nữ.
7
1.2. CÔNG NGHỆ BÀO CHẾ VIÊN NANG CỨNG:
1.2.1. Khái quát về thuốc viên nang:2
1.2.1.1. Định nghĩa:
Thuốc nang là dạng thuốc uống chứa một hay nhiều hoạt chất trong vỏ nang
cứng hay mềm với nhiều kiểu dáng và kích thước khác nhau. Vỏ nang được làm từ
gelatin và có thể được thêm các chất phụ gia không gây độc hại cho cơ thể người.
Thuốc nang cứng có vỏ nang gồm hai phần hình trụ lồng khích vào nhau, mỗi phần
có một đầu kín, đầu kia hở. Thuốc đóng trong nang thường ở dạng rắn (bột hay
cốm).
1.2.1.2. Ưu điểm của viên nang cứng:
Viên nang là dạng viên dễ uống, dễ nuốt và có màu sắc phong phú hơn dạng
viên nén.
Dược chất đóng vào viên nang có thể ở nhiều dạng: bột, cốm, vi hạt, vi nang,
viên nang nhỏ, viên nén hoặc phối hợp các dạng trên trong cùng một vỏ nang.
Sự phối hợp này có thể giúp cách ly các thành phần tương kỵ hoặc điều chế
viên nang phóng thích kéo dài bằng cách phối hợp các vi hạt hoặc vi nang phóng
thích dược chất tại nhiều thời điểm và vị trí khác nhau trong đường tiêu hóa dễ dàng.
So với viên nén, viên nang là dạng thuốc tương đối dễ nghiên cứu để xây dựng
công thức. Dễ triển khai sản xuất ở các quy mô khác nhau, có thể sử dụng các máy
đóng nang thủ công trong quy mô nhỏ hoặc các máy đóng nang bán tự động và tự
động trong quy mô sản xuất lớn.
Viên nang là dạng viên ít gặp phải các vấn đề về sinh khả dụng do khối thuốc
trong nang không bị nén chặt nên viên dễ rã hơn viên nén.
1.2.2. Thành phần viên nang:2
1.2.2.1. Vỏ nang:
Vỏ nang được chế tạo từ nguyên liệu chính là gelatin, các chất màu, chất tạo độ
đục như titan dioxyd và các chất phụ gia khác.
Vỏ nang cũng có thể chế tạo từ dẫn chất cellulose, loại vỏ nang này ít được sử
dụng vì độ tan kém và giá thành cao.
8
1.2.2.2. Thành phần dược chất trong viên nang:
Xây dựng công thức cho viên nang
Khối thuốc (hạt, bột) để đóng vào nang phải có 2 tính chất cơ bản là độ trơn
chảy, tính chịu nén. Các thuộc tính này có thể thay đổi nhất định tùy thuộc vào thiết
bị đóng thuốc vào nang.
Cần lưu ý là các dược chất có tính hút ẩm cao có khả năng làm mềm vỏ nang,
các dược chất có tính kiềm cao hoặc acid cao cũng có thể làm hỏng vỏ nang.
Để tăng lưu tính và khả năng chịu nén của khối thuốc, có thể áp dụng phương
pháp xát hạt khô hoặc xát hạt ướt.
Kích thước của hạt nên phù hợp để có thể đảm bảo hạt chảy đều vào nang đồng
thời hạn chế được sai số khối lượng thuốc trong nang.
Các tá dược thông thường dùng để điều chế khối bột gồm:
Tá dược độn: Các loại tá dược độn dùng trong viên nén như tinh bột, lactose,
dicalci phosphat đều có thể được dùng trong viên nang. Các loại tinh bột dập thẳng
như tinh bột tiền gelatin hóa, tinh bột phun sấy có thể được dùng để gia tăng lưu
tính và tính chịu nén của khối hạt.
Tá dược trơn: tá dược trơn giúp cho hạt chảy đều. Sự trơn chảy của khối hạt
hoặc bột cần thiết cho tất cả các máy đóng nang khác nhau.. Độ trơn chảy đặc biệt
cần thiết trong trường hợp đóng thuốc theo nguyên tắc đĩa phân liều. Các tá dược
trơn thường dùng là Mg stearate, talc, tinh bột bắp,…
Tá dược chống dính: các tá dược chống dính vừa có tác dụng làm tăng lưu tính
của khối bột (hoặc hạt) vừa tránh sự kết dính của bột thuốc lên các bề mặt kim loại.
Tá dược rã: tá dược rã có thể không cần thiết trong trường hợp đóng bột không
nén vào nang. Trong trường hợp có xát hạt hoặc trong trường hợp có nén ép (máy
có đĩa phân liều hoặc vít phân liều) thì nên có tá dược rã để giúp thuốc phóng thích
nhanh. Nên sử dụng các tá dược siêu rã để có thể chọn được kiểu nang nhỏ.
9
1.2.3. Quy trình bào chế thuốc viên nang cứng tư dược liêu: 1,2
Sơ đồ 1.1. Tóm tắt quy trình sản xuất viên nang cứng.
Điều chế khối thuốc: thông thường điều chế khối thuốc bằng phương pháp xát
hạt khô hoặc xát hạt ướt. Đối với dược liệu thường tiến hành như sau:
Chiết kiệt hoạt chất từ dược liệu bằng phương pháp và dung môi thích hợp.
Xử lý dịch chiết để thu được cao đặc hoặc cao khô.
Do bột thuốc làm từ dược liệu hút ẩm rất mạnh nên phải khảo sát và phối
hợp cao dược liệu với tá dược hút ẩm, tá dược độn theo tỷ lệ phù hợp nhằm
giữ ổn định và bảo quản khối bột thuốc.
Ep cốm, phối hợp tá dược trơn chảy thích hợp.
Sửa hạt và kiểm tra chất lượng hạt.
Đóng nang: Trong trường hợp điều chế một lượng nhỏ viên nang để dùng cho
một số bệnh nhân hoặc thử nghiệm lâm sàng các thuốc mới, khối thuốc có thể được
đóng vào nang bằng tay (không dùng thiết bị). Trong sản xuất có thể sử dụng các
máy đóng nang thủ công, bán tự động và máy đóng nang tự động tùy theo quy mô
sản xuất khác nhau.
Điều chế khối thuốc
Đóng nang
Lau nang – Đánh bóng
Đóng gói
Thành phẩm
Vỏ nang
10
Lau nang – đánh bóng: sau khi đóng thuốc vào nang, các viên nang cần được
loại bụi và đánh bóng trước khi đóng gói. Tùy theo điều kiện trang thiết bị có sẵn,
có thể áp dụng các phương pháp: loại bụi bằng phương pháp thủ công, loại bụi và
đánh bóng trong nồi bao, loại bụi bằng hệ thống lau và đánh bóng viên.
1.3. SƠ LƯỢC VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO: [9]
Sắc ký lỏng hiệu năng cao đôi khi còn được gọi là sắc ký lỏng áp suất cao
(High-Pressure) là ky thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên
một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất
cao. Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ là tùy
thuộc vào loại pha tĩnh đã sử dụng.
Ngày nay, HPLC đã và đang được sử dụng trong nhiều lĩnh vực phân tích hóa học nói
chung cũng như trong kiểm tra chất lượng thuốc và phân tích sinh dược học nói riêng.
Trong phân tích thuốc bằng phương pháp sắc ký, phần lớn các dược điển đều sử dụng sắc
ký phân bố.
Hình 1.3. Sơ đồ cấu tạo chung của một hệ thống HPLC.
11
1.3.1. Các thông số đặc trưng của quá trình sắc kí:
1.3.1.1. Hê số dung lượng k’ (Capacity factor):
Trong đó:
k': hệ số dung lượng.
tR: thời gian lưu.
t’R: thời gian lưu hiệu chỉnh.
t0: thời gian chết.
Cần chọn cột, pha động,…sao cho k’
nằm trong khoảng tối ưu: 1 ≤ k’ ≤ 8.
1.3.1.2. Hê số chọn lọc α:
Quy ước ở đây B là chất bị lưu giữ mạnh hơn A nên α > 1.
Để tách riêng 2 chất thường chọn 1,05 ≤ α ≤ 2,0.
1.3.1.3. Hê số bất đối xứng:
Trong đó:
W1/20: độ rộng đỉnh ở 1/20 chiều cao.
f: khoảng cách từ đường cao của đỉnh đến chân trước của đỉnh ở 1/20 chiều cao.
1.3.1.4. Độ phân giải Rs:
Trong đó: TRB, tRA: thời gian lưu của 2 pic liền kề nhau (B và A).
WB, WA: độ rộng pic đo ở đáy các pic.
W1/2B, W1/2A: độ rộng pic đo ở nữa chiều cao pic.
Hình 1.4. Xác định thời gian chết (t0)
và thời gian lưu (tR).
12
1.3.1.5. Số đĩa lý thuyết và hiêu lực cột:
Hiệu lực cột được đo bằng thông số: số đĩa lý thuyết N của cột.
Trong đó:
W: chiều rộng đo ở đáy pic.
W1/2: chiều rộng pic đo ở nữa chiều
cao pic.
1.3.2. Một số ứng dụng của phương pháp HPLC:
1.3.2.1. Phân tích định tính:
Định tính các hợp chất là một phần cốt lõi của bất cứ một phương pháp HPLC
nào. Phân tích định tính bằng HPLC chủ yếu thục hiện bằng 3 cách sau đây:
Dựa vào các dữ liệu về sự lưu.
Phân tích định tính các chất thu được từ HPLC quy mô phân tích.
Phân tích phổ nghiệm online các đỉnh HPLC.
1.3.2.2. Phân tích định lượng:
Nguyên tắc: việc định lượng các chất bằng HPLC có thể dựa vào sự so sánh
chiều cao của đỉnh hay so sánh diện tích đỉnh của chất cần xác định với một hay
nhiều mẫu chuẩn đã biết trước nồng độ.
Các phương pháp định lượng:
Phương pháp quy về 100% diện tích.
Phương pháp dùng chuẩn ngoại.
Phương pháp dùng chuẩn nội.
Phương pháp thêm chất chuẩn.
Hình 1.5. Cách xác định số đĩa lý thuyết.
13
1.4. GIỚI THIỆU MỘT SỐ CHẾ PHẨM CHỨA CAO DIẾP CÁ:
1.4.1. An trĩ vương: Công ty Cổ phần sản xuất và Thương mại Hồng Bàng.
CÔNG THỨC:
Hàm lượng trong một viên:
Cao Diếp cá 450 mg
Cao Đương quy 150 mg
Magie carbonat 108 mg
Rutin 25 mg
Curcumin 10 mg
CÔNG DỤNG:
Hỗ trợ điều trị và giúp phòng ngừa bệnh trĩ, cải thiện các triệu chứng của bệnh
trĩ (chảy máu, sa búi trĩ, đau rát, ngứa...) và các biến chứng xuất huyết của bệnh trĩ
(sa trực tràng, viêm nứt hậu môn...).
Hỗ trợ điều trị và phòng ngừa táo bón.
Giúp bảo vệ và tăng sức bền của tĩnh mạch, tăng cường sức khỏe tĩnh mạch và
đường tiêu hóa.
1.4.2. Helaf: Công ty cổ phần dược Hậu Giang.
CÔNG THỨC:
Hàm lượng trong một viên:
Cao khô Diếp cá 210 mg
Cao khô Rau má 45 mg
Kollidon CL - M, sáp ong trắng,
dầu nành, vỏ nang gelatin
CÔNG DỤNG:
Helaf có tác dụng hỗ trợ điều trị trĩ, táo bón và kiết lỵ.
Helaf giúp giải nhiệt, thông tiểu, mát gan, giải độc, kháng viêm, giúp vết
thương chóng lành và mau lên da non, tăng cường hệ miễn dịch của cơ thể.
Hình 1.6. Chế phẩm An Trĩ Vương.
Hình 1.7. Chế phẩm Helaf.
14
1.4.3. Cenditan: Công ty cổ phầm dược phẩm 3/2.
CÔNG THỨC:
Hàm lượng trong một viên:
Cao diếp cá 75mg
Bột rau má 300mg
CÔNG DỤNG:
Trị táo bón, trĩ.
Giải nhiệt, thông tiểu, mát gan, giải độc.
Chương 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Hình 1.8. Chế phẩm Cenditan.
15
2.1. NGUYÊN LIỆU, CHẤT CHUẨN, HÓA CHẤT VÀ TRANG THIẾT BỊ:
2.1.1. Nguyên liêu và chất chuẩn:
Cao Diếp cá được cung cấp bởi công ty TNHH ADC tại Ô Môn, KV Thới Hưng,
phường Long Hưng, quận Ô Môn, Thành phố Cần Thơ. Số lô: SE-HCO1-0210.
Quercetin chuẩn do Bộ Y Tế – Viện kiểm nghiệm TP.HCM cung cấp, số lô
104050609, hàm lượng 91,34% C15H10O7, nước 8,51%.
2.1.2. Hóa chất:
Bảng 2.1. Các hóa chất, tá dược sử dụng trong nghiên cứu.
STT Tên nguyên liêu, hóa chất Nguồn gốc Tiêu chuẩn
1 Acetonitril Merck Phân tích HPLC
2 Acid chlohyric Trung Quốc Tinh khiết PA
3 Acid formic Trung Quốc Tinh khiết PA
4 Acid phosphoric Merck Phân tích HPLC
5 Chloroform Trung Quốc Tinh khiết PA
6 Ethanol 96% Việt Nam TCCS
7 Ethyl acetat Trung Quốc Tinh khiết PA
8 Magnesi Trung Quốc Tinh khiết PA
9 Magnesi carbonate Việt Nam TCCS
10 Methanol Merck Phân tích HPLC
11 Natri hydroxyd Trung Quốc Tinh khiết PA
12 Natri sulfat Trung Quốc Tinh khiết PA
13 Sắt (III) clorid Trung Quốc Tinh khiết PA
12 Talc My USP 30
2.1.3. Trang thiết bị:
Bảng 2.2. Các thiết bị dùng trong nghiên cứu.
16
STT Tên thiết bị Số hiêu Nguồn gốc
1 Bếp điện JK 071 Nhật
2 Bể siêu âm Elma Đức
3 Cân phân tích Ep 214C-Ohaus My
4 Máy đo độ rã Pharma test Đức
5 Máy sát hạt và sửa hạt FGS Đức
6 Máy trộn Misuko JBJ103 Nhật
7 Tủ sấy Memmerk Đức
8 Máy soi UV 2 bước sóng ENF-2400C/EF My
9 Máy HPLC Hitachi L200 Nhật
10 Cân sấy ẩm hồng ngoại MX-50 My
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:
2.2.1. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng quercetin bằng phương
pháp HPLC:
2.2.1.1. Khảo sát các điều kiên sắc ký tối ưu:
Tiến hành chạy sắc ký trên quercetin chuẩn để tìm các điều kiện sắc ký tối ưu.
Chạy sắc ký với mẫu thử ở điều kiện sắc ký thăm dò, tiến hành thay đổi các
điều kiện sắc ký để đỉnh chính (tương ứng với quercetin) đạt các thông số sắc ký.
Chuẩn bị mẫu chuẩn: cân chính xác 25mg chuẩn đối chiếu quercetin cho vào
bình định mức 50ml, thêm 30ml methanol, siêu âm trong 10 phút và bổ sung
methanol đến vạch, lắc đều để có dung dịch mẹ có nồng độ 500µg/ml.
Từ dung dịch mẹ, tiến hành pha các dung dịch có nồng độ thấp hơn như sau: lấy
chính xác một lượng thể tích dung dịch mẹ cho vào bình định mức, thêm methanol
vừa đủ thu được dung dịch có nồng độ theo yêu cầu. Các số liệu pha mẫu được trình
bày trong bảng 2.3.
Bảng 2.3. Phương pháp pha các dung dịch có nồng độ thấp hơn.
STT Dung dịch mẹ Bình định mức Nồng độ dung dịch thu được
17
(ml) (ml) (µg/ml)
1 1 10 50
2 2 10 100
3 3 10 150
4 4 10 200
5 5 10 250
6 6 10 300
Chuẩn bị mẫu thử: tiến hành theo mục 2.2.1.2.
2.2.1.2. Khảo sát phương pháp xử lý mẫu cao Diếp cá và viên nang chứa cao
Diếp cá để định lượng quercetin:
Tiến hành chiết và theo dõi:
- Quá trình chiết quercetin từ dịch thủy phân cao Diếp cá.
- Thời gian để phản ứng thủy phân xảy ra hoàn toàn: dịch thủy phân sau
mỗi 1 giờ được chiết kiệt Quercetin bằng CHCl3, theo dõi các dịch thủy
phân sau 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ,...
- Quá trình loại tạp.
Theo dõi bằng thuốc thử FeCl3 trong cồn và sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi
Chloroform – Ethyl acetat – Acid formic (5:4:1). Phát hiện bằng đèn UV ở bước
sóng 254 nm, nhúng thuốc thử FeCl3 trong cồn.
Quy trình chuẩn bị mẫu thử cao Diếp cá:
Cân chính xác khoảng 1 g cao Diếp cá, hòa tan với 10 ml ethanol 25%, lọc,
chuyển vào bình lắng gạn, thêm vào 20 ml chloroform, lắc đều 5 phút, rút bỏ dịch
chloroform. Dịch nước còn lại hòa tan với 10 ml dung dich HCl 10%/cồn 25% đun
hồi lưu. Dịch thủy phân thu được lắc với với 20 ml chloroform trong 5 phút, chuyển
vào bình lắng gạn để yên 60 phút, rút lấy dịch chloroform. Lặp lại 3 lần. Gộp dịch
chloroform lắc với với 20 ml nước. Rút dịch chloroform lọc qua Na2SO4 sau đó đem
cô đến dịch CHCl3 đậm đặc (A1).
18
Dịch A1 cho qua cột SPE tự chế để loại tạp. Cho 20 ml chloroform qua cột SPE
để loại tạp phân cực, tiếp theo cho 40ml hỗn hợp CHCl3: EtOAc – 6:4 để lấy phân
đoạn chứa quercetin. Cô phân đoạn chứa quercetin đến cắn (A2).
Hòa tan cắn A2 trong methanol rồi cho vào bình định mức 10ml, bổ sung đủ
thể tích, lọc sơ bộ. Sau đó lọc qua màng lọc 0,45µm, bỏ vài ml dung dịch đầu trước
khi bơm vào hệ thống.
Quy trình chuẩn bị mẫu thử viên nang chứa Cao diếp cá:
Cân 20 nang, tính khối lượng trung bình của bột thuốc trong nang, nghiền thành
bột mịn. Cân lượng bột thuốc tương ứng với 1g cao Diếp cá, hòa tan trong 10 ml
cồn 25%, lọc thu lấy dịch lọc, rửa cắn với khoảng 2 ml cồn 25%, thêm vào 20 ml
chloroform, lắc đều 5 phút, chuyển vào bình lắng gạn, rút bỏ dịch chloroform. Dịch
nước còn lại hòa tan với 10 ml dung dich HCl 10%/cồn 25% đun hồi lưu. Dịch thủy
phân thu được lắc với 20 ml chloroform trong 5 phút, chuyển vào bình lắng gạn để
yên 60 phút, rút lấy dịch chloroform. Lặp lại 3 lần. Gộp dịch chloroform lắc với 20
ml nước. Rút dịch chloroform lọc qua Na2SO4 sau đó đem cô đến dịch CHCl3 đậm
đặc (A1).
Các bước còn lại xử lý như đối với mẫu thử cao Diếp cá.
19
Sơ đồ 2.1. Tóm tắt quy trình xử lý mẫu thử.
HCl 10% / cồn 25%Thủy phân 3h
Cao Diếp cá(Viên Diếp cá)
Dịch cồn 25%
Dịch thủy phân
Dịch CHCl3
Dịch CHCl3 đậm đặc
Hòa tan vào cồn 25%, lọcLắc với CHCl3, gạn bỏ lớp CHCl3
Lắc với H2O, gạn bỏ lớp nước. Lọc qua Na2SO4
Cô đến dịch CHCl3 đậm đặc
Lắc với CHCl3 3 lần
Dịch SPE chứa Quercetin
Cột SPE tự chế
Cắn
Cô đến cắn
20
2.1.1.3. Thẩm định quy trình định lượng:
Tính tương thích hê thống:
Tính tương thích hệ thống của quy trình phân tích được xác định trên giá trị và độ lặp
lại của các thông số ky thuật của hệ thống khi tiến hành thực hiện quy trình trên mẫu chuẩn
và mẫu thử với 6 lần tiêm mẫu liên tiếp.
- Tiến hành: Chuẩn bị mẫu thử và mẫu chuẩn.
Chạy sắc ký 6 lần với mẫu chuẩn và mẫu thử.
Khảo sát các thông số: thời gian lưu, diện tích đỉnh.
Xử lý thống kê các giá trị thu được.
- Yêu cầu: RSD ≤ 2%.
Thẩm định quy trình:
Tính đặc hiệu
- Tiến hành: Chuẩn bị mẫu thử và mẫu trắng (là mẫu chỉ gồm tá dược),
mẫu dung môi pha mẫu, mẫu dung dịch nước acid phosphoric
0,2%.
Tiến hành chạy sắc ký.
- Yêu cầu: Mẫu trắng, mẫu dung môi, mẫu dung dịch nước acid
phosphoric 0,2% không có các pic trùng với đỉnh chính
(tương ứng với quercetin).
Tính tuyến tính
- Tiến hành: Chạy sắc ký và xác định hàm lượng 6 dung dịch chuẩn với
nồng độ khác nhau.
Xây dựng đường chuẩn và xác định R2.
Thẩm định lại phương trình đường chuẩn bằng phương pháp
thống kê.
- Yêu cầu: R2 ≥ 0,99.
21
Độ chính xác
- Tiến hành: Xử lý 6 mẫu thử nồng độ bằng nhau.
Xác định hàm lượng quercetin trong mỗi mẫu thử.
Tính hàm lượng trung bình và RSD%.
- Yêu cầu: RSD nằm trong giới hạn cho phép của AOAC.
Độ đúng
- Tiến hành: Thêm lượng chất chuẩn quercetin tương ứng với khoảng
80%, 100%, 120% hàm lượng quercetin có trong mẫu thử.
Định lượng tìm lại hàm lượng hàm lượng quercetin đã thêm
vào để xác định tỷ lệ phục hồi.
- Yêu cầu: Tỷ lệ phục hồi trong giới hạn cho phép của AOAC.
2.2.2. Xây dựng công thức viên nang chứa cao Diếp cá:
Quá trình nghiên cứu như sau: thiết kế công thức → tạo hạt → khảo sát đặc tính
của hạt → đóng nang → thử độ rã → lựa chọn công thức chế phẩm.
Công thức được thiết kế dựa theo phương pháp cổ điển của Gauss – Geidell. 8
2.2.2.1. Thiết kế công thức viên nang chứa cao Diếp cá:
Lựa chọn hàm lượng cao thích hợp:
Cao dược liệu có khả năng hút ẩm rất lớn, hàm lượng cao càng nhiều thì khả
năng hút ẩm càng mạnh. Vì vậy, chọn hàm lượng cao thích hợp sao cho giảm bớt
lượng tá dược sử dụng mà vẫn đảm bảo độ ẩm thích hợp cho việc đóng nang là điều
cần thiết. Để thực hiện điều này chúng tôi tiến hành như sau:
- Thiết kế các công thức với hàm lượng cao khác nhau, giữ nguyên tỷ lệ tá dược
hút tối đa có thể sử dụng trong công thức.
- Tiến hành tạo hạt và khảo sát độ ẩm lúc cân bằng để tìm hàm lượng cao thích
hợp.
- Hàm lượng cao thích hợp là hàm lượng cao cao nhất và có độ ẩm bột thuốc lúc
cân bằng ≤ 5%.
22
Lựa chọn hàm lượng tá dược dính:
Cao dược liệu có độ dính khá lớn, vì vậy có thể làm ẩm bằng nước và tiến hành
sát hạt, tuy nhiên tỷ lệ bột mịn thường cao. Do vậy chúng tôi chọn PVP K30 làm tá
dược dính với hàm lượng là 2%.
Lựa chọn hàm lượng tá dược hút:
Xây dựng công thức với hàm lượng tá dược hút lần lượt là 0%, 5%, 10%, 15%,
xác định độ ẩm lúc cân bằng của khối bột thuốc.
Chọn hàm lượng tá dược hút sao cho độ ẩm lúc cân bằng < 5%.
Lựa chọn tá còn lại và tối ưu công thức viên nang:
Sau khi chọn hàm lượng cao và các loại tá dược, chúng tôi tiến hành thiết kế 10
công thức với 2 loại tá dược độn A và B có tỷ lệ: 3:1, 2:1, 1:1, 1:2,1:3; tỷ lệ tá dược
hút ở giá trị tối đa và tối thiểu, cố định tá dược dính và cao.
Bảng 2.4. Các công thức thiết kế tối ưu công thức viên nang.
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
Cao Diếp cá A% A% A% A% A% A% A% A% A% A%
MgCO3 X1% X1% X1% X1% X1% X2% X2% X2% X2% X2%
Tá dược
độn AY1% Y2% Y3% Y4% Y5% Y1% Y2% Y3% Y4% Y5%
Tá dược
độn BY5% Y4% Y3% Y2% Y1% Y5% Y4% Y3% Y2% Y1%
PVP K30 2% 2% 2% 2% 2% 2% 2% 2% 2% 2%
Talc 1% 1% 1% 1% 1% 1% 1% 1% 1% 1%
Tiến hành khảo sát các đặc tính của khối bột thuốc: góc chảy, sự phân bố cỡ
hạt, độ ẩm; đo độ rã của viên nang thành phẩm và chọn công thức tối ưu.
23
2.2.2.2. Phương pháp khảo sát đặc tính của khối bột thuốc và đo độ rã của
viên nang:
Đo độ ẩm của khối bột thuốc: đo độ ẩm bằng cân sấy ẩm hồng ngoại với các
thông số như sau
- Lượng cân: khoảng 3g.
- Nhiệt độ sấy: 105oC.
- Tốc độ độ ẩm tới hạn: 0,01%/phút.
Khảo sát sự phân bố cỡ hạt:
Cân 50g bột thuốc, cho qua bộ rây gồm các rây 0,45mm; 0,3mm; 0,2mm, lắc
đều 5 phút, cân lượng bột còn lại trên mỗi rây, vẽ đường phân bố cỡ hạt.
Xác định tỷ trọng biểu kiến trước và sau khi gõ:
Xác định tỷ trọng biểu kiến trước khi gõ (tỷ trọng thô) và tỷ trọng biểu kiến sau
khi gõ (tỷ trọng vỗ) theo công thức sau:
Với:
: Tỷ trọng biểu kiến của hạt.
M: Khối lượng của hạt.
Vb: Thể tích biểu kiến của hạt.
Tỷ trọng biểu kiến sau khi gõ xác định theo USP30 trên máy đo tỷ trọng biểu
kiến Pharma test touch.
Xác định lưu tính của hạt: đo góc chảy
Cân 50g bột thuốc, đổ hạt chảy liên tục để tạo thành khối chóp và xác định góc
nghỉ α biết:
Trong đó:
h: chiều cao khối bột.
r: bán kính đáy của khối bột.
24
Hình 2.1. Phương pháp xác định góc nghỉ của bột, hạt thuốc.
Độ tan rã:
Thực hiện theo DĐVN IV, phụ lục 11.4.
2.2.2.3. Quy trình điều chế viên nang chứa cao diếp cá:
- Trộn đều cao Diếp cá với magnesi carbonat, tá dược độn A và B bằng tay sau
đó bằng máy trộn, sấy khối bột ở 50oC trong 12 giờ.
- Pha tá dược dính: pha PVP K30 nồng độ 7,5% trong cồn 50%.
- Trộn đều khối bột thuốc với tá dược dính, sát hạt qua rây 1,2mm, tốc độ vòng
70 vòng/phút, sau đó sấy trong tủ sấy 12 giờ ở 50oC.
- Sửa hạt qua rây 0,6mm, tốc độ vòng 50 vòng/phút, thêm bột talc, trộn hành
tinh 5 phút.
- Đóng nang số 0 bằng máy đóng nang thủ công (the capsule machine).
2.2.3. Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiêm cho viên nang chứa cao Diếp cá:
2.2.3.1. Hình thức cảm quan: quan sát bằng mắt thường.
2.2.3.2. Độ đồng đều khối lượng: thử theo DĐVN IV, phụ lục 11.3.
2.2.3.3. Độ tan rã: thử theo DĐVN IV, phụ lục 11.6.
2.2.3.4. Độ ẩm: đo độ ẩm bằng cân sấy ẩm hồng ngoại giống mục 2.2.2.2.
2.2.3.5. Định tính:
Bằng phản ứng hóa học:
Cho bột thuốc trong nang vào cối chày và nghiền thành bột mịn. Cân một lượng
bột thuốc tương ứng khoảng 0,5g cao Diếp cá hòa tan trong khoảng 15ml cồn 96%,
đun nóng nhẹ. Lọc lấy dịch lọc chia làm 3 ống nghiệm làm các phản ứng.
2r
h
α
25
Bảng 2.5. Định tính viên nang chứa cao Diếp cá bằng phản ứng hóa học.
Thuốc thử Cách tiến hành Yêu cầu
NaOH 1%Nhỏ vào ống nghiệm vài giọt
NaOH 1%.
Dung dịch chuyển sang
màu vàng sáng.
FeCl3 1%Nhỏ vào ống nghiệm vài giọt
FeCl3 1%.
Dung dịch chuyển sang
màu xanh đen.
Mg + HCl đậm đặc
Cho dịch chiết vào ống nghiệm
lớn đã chứa sẵn một ít bột Mg kim
loại. Thêm từ từ theo thành ống
nghiệm 1 – 2 ml HCl đậm đặc.
Xuất hiện màu đỏ.
Bằng sắc ký lớp mỏng:
Mẫu chuẩn: cho một ít tinh thể quercetin vào ống nghiệm, thêm vài giọt
methanol để hòa tan.
Mẫu thử: cân một lượng bột thuốc đã nghiền mịn tương ứng với khoảng 0,5g
cao Diếp cá, hòa tan trong 5ml cồn 96%, lọc thu lấy dịch lọc. Thêm vào 5ml dung
dịch HCl 10% rồi đun cách thủy để thủy phân. Lắc dịch đã thủy phân với 10ml
chloroform, lấy dịch thủy phân chấm sắc ký.
Bản mỏng: silicagel F254 (Merck).
Hệ dung môi: Chloroform – Ethyl acetat – Acid formic (5:4:1).
Phát hiện: bằng đèn UV ở bước sóng 254nm, nhúng thuốc thử FeCl3 trong cồn.
2.2.3.6. Định lượng:
Định lượng bằng phương pháp HPLC.
Các điều kiện HPLC thực hiện theo các điều kiện tối ưu đã khảo sát, dung dịch
chuẩn và thử thực hiện theo mục 2.2.1.2.
Hàm lượng quercetin trong một nang:
26
Trong đó:
St: diện tích đỉnh mẫu thử.
Sc: diện tích đỉnh mẫu chuẩn.
Cc: nồng độ chất chuẩn trong dung dịch (µg/ml).
m: khối lượng bột thuốc đã cân (gam).
P: khối lượng trung bình của viên (gam).
a: Hàm lượng cao trong viên nang.
Yêu cầu: hàm lượng quercetin nằm trong giới hạn 218,25 µg đến 266,76 µg
tính theo khối lượng trung bình của bột thuốc trong nang.
27
Chương 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG
QUERCETIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC:
3.1.1. Khảo sát các điều kiên sắc ký tối ưu:
Hình 3.1. Sắc ký đồ 3D mẫu thử ở bước sóng từ 250nm – 450nm.
Hình 3.2. Sắc ký đồ contour mẫu thử.
28
Nhận xét: ở bước sóng 370nm, quercetin có đỉnh cực đại hấp thu ít bị ảnh
hưởng bởi các tạp khác có trong mẫu thử.
Qua thực nghiệm chúng tôi đề xuất các điều kiện sắc ký tối ưu như sau:
- Cột: LiChrospher RP-18 (250 x 4mm, 5m).
- Dung môi pha động: MeOH - dịch ước acid phosphoric 0,2% (60:40).
- Bước sóng phát hiện: 370nm.
- Tốc độ dòng: 0,8ml/phút.
- Nhiệt độ: 25oC.
3.1.2. Khảo sát quy trình xử lý mẫu cao Diếp cá và viên nang chứa cao Diếp cá:
UV 254 Thuốc thử FeCl3
Hình 3.3. Sắc ký đồ các dịch thủy phân quercetin sau 1h, 2h và 3h.
Nhận xét: qua 3 giờ thủy phân đã thủy phân hết các quercetin dạng glycosid có
trong mẫu thử.
1h 2h 3h C 1h 2h 3h C
29
UV 254 Thuốc thử FeCl3
Hình 3.4. Sắc ký đồ mẫu thử trước và sau khi loại tạp bằng SPE tự chế.
Chú thích:
- 1. Dịch CHCl3 trước khi qua cột SPE
- 2. Dịch CHCl3 loại tạp
- 3. Dịch chứa Quercetin
Nhận xét: sau khi qua SPE tự chế đã loại được phần lớn các tạp kém phân cực
và các tạp phân cực trong mẫu thử.
C C21 3 1 2 3
30
3.1.3. Thẩm định quy trình định lượng quercetin:
3.1.3.1. Xác định tính tương thích hê thống:
Kết quả thực nghiệm để đánh giá tính tương thích hệ thống của phương pháp
HPLC định lượng quercetin được trình bày trong bảng 3.1. và bảng 3.2.
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống trên 6 lần tiêm mẫu chuẩn.
STTThời gian
lưu (tR)
Diên tích
đỉnh (S)
Hê số dung
lượng (k’)
Số đĩa
lý thuyết (N)
1 7,567 29435569 1,410 629
2 7,467 28338432 1,417 600
3 7,580 28285507 1,442 618
4 7,693 28461905 1,478 628
5 7,727 29062188 1,440 633
6 7,527 28337809 1,457 622
TB 7,594 28653568,330 1,441 622
SD 0,098 479523,498 0,025 12
RSD% 1,29 1,673 1,735 1,929
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống trên 6 lần tiêm mẫu thử.
STTThời gian
lưu (tR)
Diên tích
đỉnh (S)
Hê số dung
lượng (k’)
Số đĩa
lý thuyết (N)
1 7,633 60625893 1,461 653
2 7,427 58274555 1,400 660
3 7,400 58195873 1,418 677
4 7,487 59030548 1,421 679
5 7,573 59311624 1,427 675
6 7,647 59127296 1,457 678
TB 7,528 59094298,170 1,431 669
SD 0,015 477612,043 0,024 14
RSD% 0,199 0,808 1,677 1,644
31
3.1.3.2. Thẩm định phương pháp phân tích:
a. Tính đặc hiêu:
Hình 3.5. Sắc ký đồ mẫu chuẩn.
Hình 3.6. Sắc ký đồ mẫu thử.
Hình 3.7 Sắc ký đồ mẫu trắng.
32
Hình 3.8. Sắc ký đồ mẫu dung môi.
Hình 3.9. Sắc ký đồ mẫu dung dịch nước acid phosphoric 0,2%.
Hình 3.10. Kết quả chồng phổ mẫu chuẩn, mẫu dung môi, mẫu tá dược
và mẫu dung dịch nước acid phosphoric 0,2%.
33
Nhận xét: mẫu trắng, mẫu dung môi, mẫu nước acid không có đỉnh hấp thu tại
thời gian lưu 7,727 phút. Quy trình đạt tính đặc hiệu.
b. Tính tuyến tính và miền giá trị:
Bảng 3.3.Kết quả khảo sát tính tuyến tính của phương pháp định lượng bằng HPLC.
Mẫu chuẩn Nồng độ (µg/ml) Diên tích đỉnh
1 50 28285507
2 100 60085198
3 150 90543111
4 200 121819257
5 250 161937814
6 300 191125387
Hình 3.11. Biểu đồ tính tuyến tính của phương pháp định lượng bằng HPLC.
Nhận xét: R2 = 0,9991 > 0,99 trong khoảng [50µg/ml, 300µg/ml]. Có sự tương
quan rõ rệt giữa độ hấp thu và nồng độ trong khoảng [50µg/ml, 300µg/ml].
Khảo sát thống kê bằng phần mềm Ms-Excel với công cụ Regression cho thấy:
- F = 1205,280 > 6,61. Phương trình hồi quy có tính tương thích.
- Hệ số Bo = - 6137293,733, to = -2,033 < t0,05 = 2,571. Hệ số Bo không có ý nghĩa.
Diê
n t
ích
đỉn
h
Nồng độ (µg/ml)
y = 657733,368x – 6137293,733R2 = 0,9991
y = 657733,368x – 6137293,733R2 = 0,9991
34
- Hệ số B = 657733,368, t = 34,717 > t0,05 = 2,571. Hệ số B có ý nghĩa.
Phương trình hồi quy có dạng: y = 657733,368x
c. Độ chính xác:
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát độ chính xác của phương pháp định lượng bằng HPLC.
MẫuHàm lượng (µg)
quercetin/1g cao Diếp cáKết quả thống kê
1 928,48 N = 6, f = 5, = 970,02
SD = 37,76
RSD% = 3,89%
P = 95% (α = 0,05)
t = 2,57, e = ± 39,62
2 925,46
3 990,12
4 959,73
5 1008,35
6 1007,96
Kết luận: RSD% = 3,89% < 5,3%. Quy trình đạt độ chính xác theo AOAC.
d. Độ đúng:
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng bằng HPLC.
MẫuMức khảo
sát
Lượng thêm
vào (µg)
Lượng tìm
thấy (µg)
Tỷ lê phục
hồi (%)
Tỷ lê phục
hồi TB (%)
1
80%
800 784,293 98,037
95,8632 800 742,214 92,777
3 800 774,210 96,776
4
100%
1000 909,080 90,908
90,5095 1000 914,122 91,412
6 1000 892,058 89,206
7
120%
1200 1145,754 95,479
96,1918 1200 1152,425 96,035
9 1200 1164,682 97,057
TB 94,187
35
Kết luận: tỷ lệ hồi phục là 94,187% trong khoảng (90 – 107%), quy trình đạt độ
đúng theo AOAC.
3.2. THIẾT KẾ CÔNG THỨC VIÊN NANG CHỨA CAO DIẾP CÁ:
3.2.1. Lựa chọn hàm lượng cao:
Bảng 3.6. Các công thức thiết kế để xác định hàm lượng cao thích hợp.
C1 C2 C3 C4
Cao Diếp cá 30% 40% 50% 60%
MgCO3 9% 12% 15% 18%
Tá dược độn A 58% 45% 32% 19%
PVP K30 2% 2% 2% 2%
Talc 1% 1% 1% 1%
Bảng 3.7. Độ ẩm các công thức C1, C2, C3, C4.
Lần đo 1 Lần đo 2 Lần đo 3 Trung bình
C1 3,62% 3,73% 3,80% 3,72%
C2 3,94% 4,04% 4,03% 4,00%
C3 4,57% 4,63% 4,60% 4,60%
C4 5,30% 5,44% 5,59% 5,44%
Nhận xét: Công thức với hàm lượng cao 60% có độ ẩm > 5%, vì vậy công thức
với hàm lượng cao 50% được chọn.
3.2.2. Lựa chọn hàm lượng tá dược hút:
Bảng 3.8. Các công thức thiết kế để xác định hàm lượng tá dược hút.
H1 H2 H3 H4
Cao Diếp cá 50% 50% 50% 50%
MgCO3 0% 5% 10% 15%
Tá dược độn B 47% 42% 37% 32%
PVP K30 2% 2% 2% 2%
Talc 1% 1% 1% 1%
36
Bảng 3.9. Độ ẩm các công thức H1, H2, H3, H4.
Lần đo 1 Lần đo 2 Lần đo 3 Trung bình
H1 - - - -
H2 5,52% 5,38% 5,00% 5,30%
H3 4,86% 4,75% 4,73% 4,78%
H4 4,40% 4,52% 4,43% 4,45%
Chú thích: (-) các công thức không thực hiện được.
Nhận xét: Khi chọn hàm lượng MgCO3 ≥ 10% thì công thức đạt độ ẩm ≤ 5%.
Vì vậy, chúng tôi chọn hàm lượng MgCO3 ở 2 mức 10% và 15% để đưa vào thiết kế
công thức.
3.2.3. Lựa chọn công thức tối ưu cho viên nang chứa cao Diếp cá:
Bảng 3.10. Các công thức thiết kế tối ưu công thức viên nang.
Công thứcCao
Diếp cá
Magnesi
carbonat
Tá dược
độn A
Tá dược
độn B
PVP
K30Talc
T1 50% 10% 27,7% 9,3% 2% 1%
T2 50% 10% 24,7% 12,3% 2% 1%
T3 50% 10% 18,5% 18,5% 2% 1%
T4 50% 10% 12,3% 24,7% 2% 1%
T5 50% 10% 9,3% 27,7% 2% 1%
T6 50% 15% 27,7% 9,3% 2% 1%
T7 50% 15% 24,7% 12,3% 2% 1%
T8 50% 15% 18,5% 18,5% 2% 1%
T9 50% 15% 12,3% 24,7% 2% 1%
T10 50% 15% 9,3% 27,7% 2% 1%
37
3.2.3.1. Độ ẩm:
Bảng 3.11. Độ ẩm các công thức khảo sát (T1 – T10).
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
Lần 1 4,73% 4,71% 4,80% 4,70% 4,75% 4,52% 4,54% 4,60% 4,53% 4,60%
Lần 2 4,70% 4,68% 4,73% 4,75% 4,80% 4.51% 4,51% 4,70% 4,56% 4,56%
Lần 3 4,76% 4,71% 4,72% 4,71% 4,87% 4,47% 4,45% 4,68% 4,56% 4,67%
TB 4,73% 4,7% 4,75% 4,72% 4,81% 4,50% 4,50% 4,66% 4,55% 4,61%
Nhận thấy các công thức đều có độ ẩm <5% , đạt yêu cầu về độ ẩm.
3.2.3.2. Góc chảy:
Bảng 3.12. Góc chảy các công thức khảo sát (T1 – T10).
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
h 3,4 3,8 3,5 3,5 3,5 3,4 3,1 3,5 3,4 3,5
r 4,5 4,8 4,7 4,5 4,6 5 4,7 4,5 4,5 4,6
tgα 0,756 0,792 0,745 0,778 0,761 0,680 0,660 0,778 0,756 0,761
α 37,1o 38,4o 36,7o 37,9o 37,3o 34,2o 33,4o 37,9o 37,1o 37,3o
Nhận xét: các công thức khảo sát đều có góc chảy tốt, phù hợp để đóng nang.
3.2.3.3. Tỷ trọng biểu kiến:
Bảng 3.13. Tỷ trọng biểu kiến của các công thức khảo sát (T1 – T10).
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
Vtvđ (ml) 78 80 78 75 72 81 76 74 76 76
Vsvđ (ml) 67 68 69 66 64 70 67 66 67 67
dtvđ (g/ml) 0,64 0,63 0,64 0,67 0,69 0,62 0,66 0,68 0,66 0,66
dsvđ (g/ml) 0,75 0,74 0,72 0,76 0,78 0,71 0,75 0,76 0,75 0,75
Nhận xét: các công thức đều có tỷ trọng sau va đập trong khoảng 0,71 – 0,78.
Từ đó tính được phân suất nén < 5%.
38
3.2.3.4. Phân bố cỡ hạt:
Bảng 3.14. Phân bố cỡ hạt của các công thức khảo sát (T1 – T10).
<0,2 mm 0,2 – 0,3 mm 0,3 – 0,45 mm 0,45 – 0,6 mm
T1 42,80% 26,60% 23,30% 7,30%
T2 34,58% 25,66% 28,04% 11,72%
T3 27,50% 29,10% 31,72% 11,68%
T4 9,98% 18,04% 45,14% 26,84%
T5 7,04% 22,20% 45,58% 21,44%
T6 28,20% 30,72% 32,56% 8,52%
T7 20,74% 27,50% 40,02% 11,74%
T8 13,36% 25,06% 42,64% 18,84%
T9 17,68% 30,00% 37,50% 14,82%
T10 13,02% 26,94% 44,36% 15,68%
Hình 3.12. Biểu đồ phân bố cỡ hạt của các công thức từ T1 đến T5.
39
Hình 3.13. Biểu đồ phân bố cỡ hạt của các công thức từ T6 đến T10.
Từ các biểu đồ 3.12. và biểu đồ 3.13. cho thấy:
- Các công thức T1, T2, T3, T6, T7 có tỷ lệ hạt mịn tương đối lớn (> 20%).
- Các công thức T4, T5, T8, T9, T10 có tỷ lệ hạt mịn nhỏ (< 20%) và phân bố
cỡ hạt phù hợp cho đóng nang.
3.2.3.5. Độ tan rã:
Bảng 3.15. Độ tan rã các công thức khảo sát (T1 – T10).
Công thức T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
Thời gian
rã (phút)10 10,5 9,5 9 9 8,5 8,5 8 7,5 7,5
Các công thức đều có thời gian rã < 30 phút, đạt yêu cầu về độ tan rã của viên
nang theo DĐVN IV. Trong đó công thức T9 và T10 có thời gian rã ngắn nhất.
Từ các kết quả trên chúng tôi chọn công thức T9 làm công thức tối ưu cho viên
nang chứa cao Diếp cá.
40
3.3. KIỂM NGHIỆM VIÊN NANG CHỨA CAO DIẾP CÁ:
3.3.1. Hình thức cảm quan:
Viên nang cứng số 0, đầu xanh đậm, đầu xanh nhạt. Bột thuốc trong nang màu
nâu đen, vị đắng hơi ngọt, mùi đặc trưng.
3.3.2. Độ đồng đều khối lượng:
Bảng 3.16. Kết quả kiểm nghiệm độ đồng đều về khối lượng.
STTKhối lượng
nang thuốc
Khối lượng
nang rỗng
Khối lượng
bột thuốc
% So với
KLTB
% Chênh lêch
so với KLTB
1 0,5855 0,0969 0,4886 98,74 1,26
2 0,5976 0,0976 0,5000 101,04 1,04
3 0,5732 0,0947 0,4785 96,69 3,31
4 0,5901 0,097 0,4931 99,65 0,35
5 0,5771 0,0956 0,4815 97,30 2,70
6 0,5651 0,089 0,4761 96,21 3,79
7 0,5972 0,0959 0,5013 101,30 1,30
8 0,5812 0,0972 0,4840 97,81 2,19
9 0,5991 0,0989 0,5002 101,08 1,08
10 0,6050 0,0963 0,5087 102,80 2,80
11 0,5942 0,0954 0,4988 100,80 0,80
12 0,5723 0,0922 0,4801 97,02 2,98
13 0,6129 0,0992 0,5137 103,81 3,81
14 0,6053 0,096 0,5093 102,92 2,92
15 0,6135 0,0952 0,5183 104,74 4,74
16 0,5876 0,0997 0,4879 98,59 1,41
17 0,6112 0,0967 0,5145 103,97 3,97
18 0,5783 0,0947 0,4836 97,73 2,27
41
19 0,5933 0,0901 0,5032 101,69 1,69
20 0,5699 0,0942 0,4757 96,13 3,87
KLTB = 0,49493.3.3. Độ tan rã: Thời gian rã: 7,5 phút đạt.
Bảng 3.17. Kết quả đo độ rã.
Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB
7,5 phút 7,5 phút 7,5 phút 7,5 phút
3.3.4. Độ ẩm: Kết quả trung bình của 3 lần đo là 4,52% đạt.
Bảng 3.18. Kết quả đo độ ẩm.
Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB
4,45% 4,6% 4,51% 4,52%
3.3.5. Định tính:
3.3.5.1. Bằng phản ứng hóa học:
Bảng 3.19. Kết quả định tính viên nang chứa cao Diếp cá.
Thuốc thử Kết quả
NaOH 10% Màu vàng sáng (+)
FeCl3 5%/ cồn 96% Màu xang đen (+)
Mg + HCl đậm đặc Màu đỏ (+)
3.3.5.2. Bằng SKLM:
Kết quả:
42
UV 254 Thuốc thử FeCl3
3.3.6. Định lượng:
Kết quả định lượng viên nang chứa cao Diếp cá: áp dụng công thức ơ mục 2.2.3.6.
Sc = 60085198; St = 62727371; Cc = 100 (µg/ml); m = 1,0334g; P = 0,4959g
Hàm lượng trong 1 viên: 249,98 µg Đạt.
3.4. XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN VIÊN NANG CHỨA CAO DIẾP CÁ:
3.4.1. Tiêu chuẩn kỹ thuật:
1. YÊU CẦU KỸ THUẬT:
1.1. Công thức pha chế cho một viên nang:
Cao Diếp cá 250mg
Tá dược vừa đủ 1 viên
1.2. Nguyên liêu:
Cao Diếp cá Đạt tiêu chuẩn cơ sở
Tá dược A Đạt tiêu chuẩn
Tá dược B Đạt tiêu chuẩn
Magnesi carbonate Đạt tiêu chuẩn cơ sở
Talc Đạt tiêu chuẩn USP 27
Hình 3.14. Kết quả định tính bằng SKLM viên nang chứa cao Diếp cá.
T C T C
43
Povidon K30 Đạt tiêu chuẩn USP 27
Cồn 96% Đạt tiêu chuẩn DĐVN IV
1.3. Chất lượng thành phẩm:
1.3.1. Tính chất: Viên nang cứng số 0, đầu xanh đậm, đầu xanh nhạt. Bột thuốc
trong nang màu nâu đen, vị đắng hơi ngọt, mùi đặc trưng.
1.3.2. Độ đồng đều khối lượng: ± 7,5% so với khối lượng trung bình của bột thuốc
trong nang.
1.3.3. Độ tan rã: không quá 30 phút.
1.3.4. Độ ẩm: không quá 5%.
1.3.5. Định tính: Phải có phản ứng đặc trưng của Diếp cá.
1.3.6. Định lượng: mỗi viên phải chứa quercetin trong giới hạn 218,25 µg đến
266,76 µg tính theo khối lượng trung bình của bột thuốc trong nang.
2. PHƯƠNG PHÁP THỬ:
2.1. Tính chất: kiểm tra bằng cảm quan chế phẩm phải đạt các yêu cầu đã nêu.
2.2. Độ đồng đều khối lượng: thử theo DĐVN IV, phụ lục 11.3.
2.3. Độ tan rã: thử theo DĐVN IV, phụ lục 11.6.
2.4. Độ ẩm: đo độ ẩm bằng cân sấy ẩm hồng ngoại với các thông số như sau:
- Lượng cân: khoảng 3g.
- Nhiệt độ sấy: 105oC.
- Tốc độ độ ẩm tới hạn: 0,01%/phút.
2.5. Định tính:
A. Bằng phản ứng hóa học:
Cho bột thuốc trong nang vào cối chày và nghiền thành bột mịn. Cân một lượng bột
thuốc tương ứng khoảng 0,5g cao Diếp cá hòa tan trong khoảng 15ml cồn 96%, đun
nóng nhẹ. Lọc lấy dịch lọc chia làm 3 ống nghiệm làm các phản ứng.
Nhỏ vào ống nghiệm thứ nhất vài giọt Natri hydroxyd 1% (TT). Dung dịch chuyển
sang màu vàng sáng.
Nhỏ vào ống nghiệm thứ hai vài giọt Sắt (III) clorid 1% (TT). Dung dịch chuyển
sang màu xanh đen.
44
Cho dịch chiết vào ống nghiệm thứ 3 đã chứa sẵn một ít bột Magnesi kim loại.
Thêm từ từ theo thành ống nghiệm 1 – 2 ml dung dich HCl đậm đặc. Dung dịch
xuất hiện màu đỏ.
B. Bằng sắc ký lớp mỏng:
Bản mỏng Silicagel F254 (Merck).
Dung môi khai triển: Chloroform – Ethyl acetat – Acid formic (5:4:1).
Dung dich chuẩn: cho một ít tinh thể quercetin vào ống nghiệm, thêm vài giọt
methanol để hòa tan.
Dung dich thử: cân một lượng bột thuốc đã nghiền mịn tương ứng với khoảng 0,5g
cao Diếp cá, hòa tan trong 5ml cồn 96%, lọc thu lấy dịch lọc. Thêm vào 5ml dung
dich HCl 10% (TT) rồi đun cách thủy để thủy phân. Lắc dịch đã thủy phân với 10ml
chloroform, lấy dịch chloroform chấm sắc ký.
Cách tiến hành: chấm riêng biệt lên bản mỏng 20µl mỗi dung dịch. Triển khai sắc
ký cho đến khi dung môi đi được khoảng 10cm. Làm khô bản mỏng, kiểm tra dưới
ánh sáng đèn tử ngoại ở bước sóng 254nm và bằng dung dich Sắt (III) clorid 1%/
cồn 96% (TT). Trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có vết trùng với sắc ký đồ của
dung dịch chuẩn.
2.6. Định lượng:
Tiến hành bằng phương pháp sắc ký lỏng.
Pha động: Methanol – dung dich nước acid phosphoric 0,2% (60:40).
Dung dich chuẩn: cân chính xác khoảng 50mg quercetin chuẩn vào trong bình định
mức 50ml, hòa tan và pha loãng bằng methanol (TT) đến định mức, trộn đều. Pha
loãng 5ml dung dịch thu được thành 50ml với methanol (TT), trộn đều. Lọc qua
màng lọc 0,45µm.
Dung dich thử:
Cân 20 nang, tính khối lượng trung bình của bột thuốc trong nang, nghiền thành bột
mịn. Cân lượng bột thuốc tương ứng với 1g cao Diếp cá, hòa tan trong 10ml cồn
25% (TT), lọc thu lấy dịch lọc, rữa cắn với khoảng 2ml cồn 25% (TT), thêm vào
20ml chloroform, lắc đều 5 phút, chuyển vào bình lắng gạn, rút bỏ dịch chloroform.
45
Dịch nước còn lại hòa tan với 10ml dung dich HCl 10%/cồn 25% đun hồi lưu. Dịch
thủy phân sau đó lắc với 15ml chloroform trong 5 phút, chuyển vào bình lắng gạn
để yên 60 phút, rút lấy dịch chloroform. Lặp lại đến khi chiết kiệt quercetin. Gộp
dịch chloroform lắc với 20ml nước. Rút dịch chloroform lọc qua natri sulfat khan
sau đó đem cô đến dịch chloroform đậm đặc.
Dịch Chloroform đậm đặc cho qua cột SPE tự chế (1,0g silica kích thước hạt 40µm
– 63µm, chiều dài cột 70mm, đường kính 12mm) để loại tạp. Cho 20ml chloroform
qua cột SPE để loại tạp phân cực, tiếp theo cho 40ml hỗn hợp CHCl3: EtOAc – 6:4
để lấy phân đoạn chứa quercetin. Cô phân đoạn chứa quercetin đến cắn.
Hòa tan cắn trong methanol rồi cho vào bình định mức 10ml, bổ sung đủ thể tích,
lọc sơ bộ. Sau đó lọc qua màng lọc 0,45µm.
Điều kiện sắc ký:
Cột thép không gỉ (25cm x 4,0mm) được nhồi pha tĩnh C (5µm).
Nhiệt độ cột: 25oC.
Detector DAD, bước sóng phát hiện 370nm.
Tốc độ dòng: 0,8ml/phút.
Thể tích tiêm: 20µl.
Cách tiến hành:
Kiểm tra khả năng thích hợp của hệ thống sắc ký: Tiến hành sắc ký đối với dung
dịch chuẩn. Phép thử chỉ có giá trị khi độ lệch chuẩn tương đối của diện tích peak
quercetin trong 6 lần tiêm lặp lại nhỏ hơn 2,0%.
Tiến hành sắc ký lần lượt đối với dung dịch chuẩn và dung dịch thử.
Tính hàm lượng quercetin có trong một viên nang dựa vào diện tích peak trên sắc
ký đồ thu được của dung dịch thử, dung dịch chuẩn và hàm lượng quercetin có
trong mẫu chuẩn.
3. ĐÓNG GÓI – GHI NHÃN - BẢO QUẢN:
Đóng gói: Đóng trong chai nhựa có chất hút ẩm, mỗi chai 100 viên hoặc ép vĩ bấm,
mỗi vĩ 10 viên.
46
Nhãn: đúng quy chế.
Bảo quản: Nơi khô mát, tránh ánh sáng, nhiệt độ không quá 30oC.
3.4.2. Kết quả kiểm nghiêm:
Bảng 3.20. Kết quả kiểm nghiêm viên nang Diếp cá.
Chỉ tiêu Tiêu chuẩn Kết quả
Tính chất Viên nang cứng số 0, đầu xanh
đậm, đầu xanh nhạt. Bột thuốc
trong nang màu nâu đen, vị đắng
hơi ngọt, mùi đặc trưng.
Đúng
Độ đồng đều khối lượng Khối lượng trung bình ±7,5% Đạt (0,4949 ±
4,79%)
Độ tan rã Không quá 30 phút Đạt (7,5 phút)
Độ ẩm Không quá 5% Đạt (4,52%)
Định tính
A. Bằng phản ứng hóa học
Dd NaOH 1%
Dd FeCl3 1%
Mg/HCl đậm đặc
B. Bằng SKLM
Màu vàng sáng
Màu xanh đen
Màu đỏ
Dung dịch thử phải cho một vết
tương đương về màu sắc và Rf với
Đúng
Đúng
Đúng
Đúng
47
dung dịch chuẩn.
Định lượng Mỗi viên phải chứa quercetin trong
giới hạn 218,25 µg đến 266,76 µg
tính theo khối lượng trung bình của
bột thuốc trong nang.
Đạt
(249,98µg/viên)
Kết luận: Viên nang Diếp cá đạt tiêu chuẩn cơ sở.
Chương 4 - BÀN LUẬN
4.1. VỀ XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG
QUERCETIN TRONG CAO DIẾP CÁ VÀ VIÊN NANG CHỨA CAO DIẾP CÁ:
Diếp cá chứa phần lớn các flavonoid có aglycon là quercetin. Vì vậy, dùng
quercetin như là chất đánh dấu để kiểm soát chất lượng cao Diếp cá và viên nang
chứa cao Diếp cá là phù hợp.
Mẫu cao Diếp cá và mẫu viên nang chứa cao Diếp cá được xử lý để đảm bảo
quá trình thủy phân các flavonoid được xảy ra hoàn toàn, quá trình loại tạp được
triệt để, đảm bảo an toàn cho hệ thống HPLC.
Với kết quả thu được sau khi thẩm định, các yêu cầu về tính tương thích hệ
thống, tính đặc hiệu, độ đúng, độ chính xác, tính tuyến tính và miền giá trị của
phương pháp HPLC cho cao Diếp cá và viên nang chứa cao Diếp cá cho thấy
phương pháp đáp ứng quy trình định lượng và không bị ảnh hưởng bởi sự hiện diện
của chất khác như tá dược, dung môi hòa tan mẫu,...
4.2. VỀ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG CÔNG THỨC CHO VIÊN NANG
CHỨA CAO DIẾP CÁ:
Bào chế viên nang thường không quá phức tạp như viên nén, thành phần khối
thuốc tương đối đơn giản, không phải dùng nhiều loại tá dược như viên nén. Mặt
48
khác, bào chế viên nén từ dược liệu không cho cảm quan tốt. Viên sau khi nén phải
được bao đường hoặc bao phim, đòi hỏi ky thuật và thiết bị phức tạp. Vì vậy, đề tài
chọn dạng bào chế là viên nang.
Để bào chế viên nang thì yếu tố quan trọng nhất của khối bột thuốc là hàm ẩm
và khả năng hút ẩm vì chúng có thể làm hư vỏ nang. Ngoài ra, cần phải chọn tá
dược phù hợp sao cho lượng tá dược sử dụng là ít nhất. Bằng các thiết kế nghiên
cứu đơn giản của Gauss – Geidell, đề tài đã chọn được tá dược hút ẩm là MgCO 3
với hàm lượng là 15%, tá dược độn phù hợp, hàm lượng cao trong khối bột thuốc là
50%.
Để đảm bảo chắc chắn viên nang sau khi bào chế đạt độ đồng đều khối lượng
thì khối bột thuốc bào chế được phải có tỷ lệ hạt mịn nhỏ, phân bố kích thước hạt
phù hợp và độ trơn chảy tốt. Để thực hiện điều đó, đề tài đã sử dụng povidon K30
làm tá dược dính để giảm tỷ lệ bột mịn, sử dụng talc để khối bột thuốc trơn chảy tốt
đồng thời thiết kế lựa chọn công thức có phân bố cỡ hạt phù hợp.
Về độ tan rã, viên nang bào chế được có độ tan rã tốt. Thời gian rã là 7,5 phút,
thấp hơn nhiều so với tiêu chuẩn độ tan rã của viên nang theo DĐVN IV là không
quá 30 phút.
4.3. VỀ XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN KIỂM NGHIỆM CHO VIÊN NANG
CHỨA CAO DIẾP CÁ:
Việc xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghệm viên nang chứa cao Diếp cá được dựa
trên tiêu chuẩn kiểm nghiệm thuốc viên nang theo DĐVN IV bao gồm các chỉ tiêu:
Hình thức cảm quan, độ đồng đều khối lượng, độ tan rã, độ ẩm, định tính, định
lượng. Viên nang bào chế được đạt các chỉ tiêu trên.
Tuy nhiên, tiêu chuẩn kiểm nghiệm cần bổ sung thêm chỉ tiêu độ nhiễm khuẩn
và độc tính bất thường để đảm bảo rằng quá trình chuyển dạng bào chế không làm
phát sinh độc tính bất thường cũng như sự xâm nhập của các vi khuẩn, nấm mốc
gây bệnh.
49
Chương 5 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
5.1. KẾT LUẬN:
Đề tài đã xây dựng và thẩm định quy trình định lượng quercetin trong cao Diếp
cá và viên nang chứa cao Diếp cá đạt các yêu cầu về tính tương thích hệ thống, tính
đặc hiệu, tính tuyến tính, độ chính xác và độ đúng.
Về nghiên cứu xây dựng công thức viên nang chứa cao Diếp cá: đã xây dựng
được công thức và bào chế thành công viên nang chứa cao Diếp cá đạt các chỉ tiêu
đề ra.
Công thức cho một viên nang như sau:
Cao Diếp cá 250mg
Tá dược A 61,5mg
Tá dược B 123,5mg
Magnesi carbonate 75mg
Talc 5mg
Povidon K30 10mg
Về xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cho viên nang chứa cao Diếp cá: đã xây
dựng được bản dự thảo tiêu chuẩn kiểm nghiệm dựa vào các tiêu chuẩn kiểm
nghiệm viên nang theo DĐVN IV. Các tiêu chuẩn kiểm nghiệm bao gồm:
50
1. Tính chất: Viên nang cứng số 0, đầu xanh đậm, đầu xanh nhạt. Bột thuốc
trong nang màu nâu đen, vị đắng hơi ngọt, mùi đặc trưng.
2. Độ đồng đều khối lượng: ± 7,5% so với khối lượng trung bình của bột thuốc
trong nang.
3. Độ tan rã: không quá 30 phút.
4. Độ ẩm: không quá 5%.
5. Định tính: Phải có phản ứng đặc trưng của Diếp cá.
6. Định lượng: mỗi viên phải chứa quercetin trong giới hạn 218,25 µg đến
266,76 µg tính theo khối lượng trung bình của bột thuốc trong nang.
5.2. KIẾN NGHỊ:
Đưa thêm chỉ tiêu độc tính bất thường và chỉ tiêu độ nhiễm khuẩn vào tiêu
chuẩn kiểm nghiệm cho viên nang chứa cao Diếp cá.
Nghiên cứu sự ổn định của chế phẩm.
Tiến hành sản xuất một số mẻ ở quy mô pilot để thẩm định lại các thông số
công nghệ trước khi triển khai sản xuất lớn.
51
TÀI LIỆU THAM KHẢOTiếng viêt:
1. Bộ môn Bào chế - Trường Đại Học Dược Hà Nội (2008), Bào chế và sinh
dược học các dạng thuốc tập 2, NXB Y Học, Hà Nội.
2. Bộ môn Bào chế - Trường Đại Học Y Dược TP.HCM (2007), Bào chế học
tập 2, NXB Y Học chi nhánh TP. Hồ Chí Minh, TP. Hồ Chí Minh.
3. Bộ môn Hóa phân tích, Kiểm nghiệm, Độc chất - Trường Đại Học Y Dược
Cần Thơ (2010), giáo trình Kiểm nghiệm thuốc, tài liệu lưu hành nội bộ, Cần
Thơ.
4. Bộ môn Hóa phân tích, Kiểm nghiệm, Độc chất - Trường Đại Học Y Dược
Cần Thơ (2009), Hóa phân tích 2, Tài liệu lưu hành nội bộ, Cần Thơ.
5. Bộ Y Tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, NXB Y Học, Hà Nội.
6. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương,… (2004), Cây thuốc
và động vật làm thuốc ở Việt Nam, NXB Khoa học và Kĩ thuật, Hà Nội, tr.
321-323.
52
7. Võ Thị Kim Chi (2008), Nghiên cứu bào chế viên nang Linh chi - Đương
quy, luận văn tốt nghiệp Dược sĩ đại học, Trường Đại Học Y Dược TP.HCM,
TP. Hồ Chí Minh.
8. Nguyễn Thị Chung (2007), Ứng dụng tối ưu hóa thống kê trong nghiên cứu
phát triển dược phẩm, Tài liệu lưu hành nội bộ, TP. Hồ Chí Minh.
9. Nguyễn Minh Đức (2006), Sắc ký lỏng hiệu năng cao và một số ứng dụng
vào nghiên cứu, kiểm nghiệm dược phẩm, dược liệu và hợp chất tự nhiên,
NXB Y Học chi nhánh TP. Hồ Chí Minh, TP. Hồ Chí Minh.
10. Trần Thị Việt Hoa, Lê Thi Kim Oanh (2008), “Phân lập và xác định cấu trúc
một số hợp chất từ cây Diếp Cá (Houttuynia cordata Thumb.) của Việt
nam”, Tạp chí phát triển KH&CN, 11 (07), tr. 73-77.
11. Hoàng Ngọc Hùng, Vũ Chu Hùng (2006), Tá dược và chất phụ gia dùng
trong dược phẩm, mỹ phẩm và thực phẩm, NXB Y Học, Hà Nội.
12. Hoàng Thanh Hương, Trần Quỳnh Hoa, Hà Việt Bảo, Nguyễn Danh Thục
(2002), “Góp phần nghiên cứu thành phần flavonoid chiết xuất từ lá cây Diếp
cá - Houttuynia cordata Thunb. của Việt Nam”, Tạp chí dược học, (9), 13-
15.
13. Đỗ Tất Lợi (2000), Những cây thuốc và vi thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà
Nội, tr. 40-41.
14. Nguyễn Nhật Thành (2001), Nghiên cứu kỹ thuật điều chế viên nang đại bổ
âm từ bài thuốc cùng tên, luận văn tốt nghiệp thạc sy dược học, Trường Đại
Học Y Dược TP.HCM, TP. Hồ Chí Minh.
15. Nguyễn Đăng Thoại, Trần Ngọc Dân, Đỗ Thị Minh Thuận, Hoàng Minh
Châu, Nguyễn Thiện Hải, Nguyễn Đức Tuấn (2009), “Xây dựng quy trình
định lượng flavonoid toàn phần trong cao Bạch quả, viên bao phim O.P.Can
và quercetin trong huyết tương người bằng phương pháp HPLC”, Y học
TPHCM-Chuyên đề Dược, 13 (1), tr.78-83.
53
16. Trường Đại học Dược Hà Nội (2002), Bài giảng dược liệu. NXB Y học, Hà
Nội, tr. 205-207.
Tiếng Anh
17. Chang Jung - San, Chiang Lien - Chai, Chen Chi - Chain, Liu Li - The,
Wang Kuo - Chih, Lin Chun - Ching (2001), “Antileukemic activity of
Bidens pilosa L. var. minor (Blume) Sherff and Houttuynia cordata Thunb”,
The American journal of Chinese medicine, 29 (2), pp. 303-312.
18. Cho E. J., Yokozawa T., Rhyu D. Y., Kim S. C., Shibahara N., and Park J. C.
(2003), “Study on the inhibitory effects on korean medicinal plants and their
main compounds on the 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical”,
Phytomedicine, 10 (6-7), pp. 544-551.
19. Cho E. J., Yokozawa T., Rhyu D. Y., Kim S. C., Shibahara N., and Park J. C.
(2003), “The inhibitory effects of 12 medical plants and their compoment
compound no lipid peroxidation ”, Am. J. Chin. Med, 31 (6), pp. 907-917.
20. Corlett J. L., Clegg M. S., Keen C. L., Grivetti L. E. (2002), “Mineral content
of culinary and medicinal plants cultivated by Hmong refugees living in
Sacramento, Califonia”, Int. J. Food Sci. Nutr., 53 (2), pp. 117-128.
21. Hayashi, Kyoko; Kamiya, Mioko; Hayashi, Toshimitsu (1995), “Virucidal
Effects of the Steam Distillate from Houttuynia cordata and its Components
on HSV-1, Influenza Virus, and HIV”, Planta Med, 61(03), pp. 237-241.
22. In Sik Kim, Joo-Hwan Kim, Jin Sook Kim, Chi-Young Yun, Dong-Hee Kim
and Ji-Sook Lee (2007), “The inhibitory effect of Houttuynia cordata extract
on stem cell factor-induced HMC-1 cell migration”, Journal of
Ethnopharmacology, 112 (1), pp. 90-95.
23. Kim SK, Ryu SY, No J, Choi SU, Kim YS (2001), “Cytotoxic alkaloids from
Houttuynia cordata, Korea Research Institute of Chemical Technology”,
Taejeon, Arch Pharm Res, 24(6), pp. 518-21.
54
24. Ladislav Kokoska và Vojtech Rada (2001), “Antibacterial Activity of
Houttuynin Sodium Bisulphate (HSB)”, Czech J. Food Sci, 19 (1), pp. 37-40.
25. Li C, Zhao Y, Liang C, An H (2001)., “Observations of the curative effect
with various liquid for post operative irrigation of ESS of treating chronic
sinusitis and nasal polyps”, Lin Chuang Er Bi Yan Hou Ke Za Zhi, 15(2), pp.
53-54.
26. Lien-Chai Chiang, Jung-San Chang, Chi-Chain Chen, Lean-Teik Ng, Chun-
Ching Lin (2003), “Anti-Herpes Simplex Virus Activity of Bidens pilosa and
Houttuynia cordata”, The American Journal of Chinese Medicine, 31 (3), pp.
355-362.
27. Meng J., Dong X. P., Zhou Y. S., Jiang Z. H., Leung S. Y., Zhao Z. Z.
(2006), “study on chemical constituents of flavonoid in fresh herb of
Houttuynia cordata”, Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 32 (16), pp. 1335-1337.
28. Ng L. T., Yen F. L., Liao C. W., Lin C. C. (2007), “Protective effect of
Houttuynia cordata extract on bleomycin-induced pulmonary fibrosis in
rate”, Am. J. Chin. Med., 35 (3), pp. 465-475.
29. S. H. Hu và A. F. Du (1997), “Treatment of Bovine Mastitis with Houttuynin
Sodium Bisulphate”, Journal of Veterinary Medicine Series B, 44, pp. 365-
370.
30. Tutupalli L. V., Chaubal M. G. (1975), “Saururaceae. V. Composition of
essential oil from foliage of Houtuynia cordata and chemo systematics of
Saururaceae”, Lioydia, 38 (2), pp. 92-96.
Bài báo:
31. Bộ Tài nguyên và Môi trường Việt Nam (2010), “Cây dược liệu cần được
quan tâm bảo tồn”, http://www.monre.gov.vn ngày 15/06/2010.
55
32. Viện Khoa học nghiên cứu Nhân tài Nhân lực (2009), “Sản xuất thuốc từ
nguồn gốc thiên nhiên: đi tắt đón đầu cách nào?”, http://nhantainhanluc.com/
ngày 19/06/2009.
1
PHỤ LỤC 1TIÊU CHUẨN QUERCETIN CHUẨN
2
PHỤ LỤC 2TIÊU CHUẨN CAO DIẾP CÁ
3
PHỤ LỤC 3KẾT QUẢ 6 MẪU THẨM ĐỊNH ĐỘ CHÍNH XÁC
Mẫu Lượng cân Diên tích đỉnh Nồng độ Hàm lượng1 1.0428 58175756 96.82 928.482 1.0132 56340463 93.77 925.463 1.0147 60366326 100.47 990.124 1.0253 59124310 98.40 959.735 1.0102 61205139 101.86 1008.356 1.0036 60781545 101.16 1007.96
Trung bình 970.02
4PHỤ LỤC 4
KẾT QUẢ PHÂN TÍCH PHƯƠNG TRÌNH HỒI QUY
SUMMARY OUTPUT
Regression Statistics
Multiple R0.99875779
5
R Square0.99751713
2Adjusted R Square 0.99668951
Standard Error3037521.57
2Observations 5
ANOVA df SS MS F Significance F
Regression 1 1.11206E+16 1.11206E+16 1205.280226 5.25464E-05Residual 3 2.76796E+13 9.22654E+12Total 4 1.11482E+16
CoefficientsStandard
Error t Stat P-value Lower 95% Upper 95% Lower 95.0% Upper 95.0%Intercept -8287879 4075262.831 - 0.134861715 - 4681426.13 - 4681426.13
Nồng độ (µg/ml)
Diên tích đỉnh
50 28285507100 60085198150 90543111200 121819257250 161937814300 191125387
52.033704167 21257184.14 9 21257184.14 9
50 666950.162 19210.97322 34.71714599 5.25464E-05 605812.2713728088.052
7 605812.2713728088.052
7
6PHỤ LỤC 5
KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH ĐỘ ĐÚNG
Mức khảo sát
Lượng cân
Lượng có sẵn
Lượng thêm vào
Diên tích đỉnh
Nồng độ đo
Lượng tổng cộng tìm được
Lượng tìm thấy
Tỷ lê hồi phục
Tỷ lê hồi phục trung
bình
80%
1.0321,001.06
1 800 108745246 178.535 1785.35 784.293 98.037
95.8631.069
1,036.951 800 108368284 177.917 1779.17 742.214 92.777
1.0791,046.65
2 800 110907977 182.086 1820.86 774.210 96.776
100%
1.0521,020.46
1 1000 117527613 192.954 1929.54 909.080 90.908
90.5091.095
1,062.172 1000 120375323 197.629 1976.29 914.122 91.412
1.0441,012.70
1 1000 116018134 190.476 1904.76 892.058 89.206
120%
1.0731,040.83
1 1200 133184101 218.659 2186.59 1,145.754 95.479
96.1911.049
1,017.551 1200 132172426 216.998 2169.98 1,152.425 96.035
1.0321,001.06
1 1200 131914554 216.574 2165.74 1,164.682 97.05794.187
7
