Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng một số chất phân lập được từ lá cây gạo.pdf

P

NGHPHÁP

SỐ

TRƯ

HIÊN CP XÁCỐ CHẤ

KHÓA L

ƯỜNG Đ

KIỀU

CỨU C ĐỊNẤT PH

LÁ

LUẬN T

H

BỘ Y ẠI HỌC

THỊ B

XÂYNH HÀHÂN L

Á CÂY

TỐT NG

HÀ NỘI

TẾ C DƯỢC

ÍCH HU

Y DỰNÀM LLẬP Đ

Y GẠO

GHIỆP D

- 2013

C HÀ NỘ

UỆ

NG PHLƯỢNĐƯỢ

O

DƯỢC S

ỘI

HƯƠNNG MỢC TỪ

Ĩ

NG MỘT Ừ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

KIỀU THỊ BÍCH HUỆ

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT

SỐ CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ LÁ CÂY GẠO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

PGS.TS. Thái Nguyễn Hùng Thu Nơi thực hiện: 1. Trung tâm kiểm nghiệm Dược phẩm và Mỹ

phẩm Hà Nội 2. Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất Đại

học Dược Hà Nội

HÀ NỘI - 2013

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện đề tài “Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác

định hàm lượng một số chất phân lập được từ lá cây Gạo”, ngoài sự làm việc

nghiêm túc, sự cố gắng, nỗ lực hết mình của bản thân, tôi đã nhận được rất nhiều sự

khích lệ từ phía nhà trường, thầy cô, gia đình và bạn bè.

Trước hết, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:

PGS.TS. Thái Nguyễn Hùng Thu

người đã dành nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu, tạo mọi điều

kiện thuận lợi để tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.

Đồng thời, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới: PGS.TS. Nguyễn Thái An

– Bộ môn Dược liệu, NCS. Hồ Thị Thanh Huyền, DS. Phạm Lê Minh đã cho tôi

những đóng góp quý giá về đề tài.

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên Bộ môn

Hóa phân tích – Độc chất - trường Đại học Dược Hà Nội, các cán bộ Trung tâm

Kiểm nghiệm dược phẩm và mỹ phẩm Hà Nội đã hỗ trợ tôi trong quá trình nghiên

cứu.

Xin trân trọng cảm ơn quý thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội, đặc biệt là

những thầy cô đã trực tiếp giảng dạy tôi suốt thời gian học tập tại trường.

Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn gia đình, bạn bè đã động viên tôi về mọi

mặt và giúp đỡ tôi tận tình trong quá trình học tập, nghiên cứu, là động lực không

nhỏ để tôi có kết quả ngày hôm nay.

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 05 năm 2013

Kiều Thị Bích Huệ

MỤC LỤC

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC BẢNG

ĐẶT VẤN ĐỀ……………………………………………………………………

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN………………………………………….………......

1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY GẠO……………………………………………..

1.1.1. Đặc điểm thực vật……………………………………….…………

1.1.2. Tính vị và công năng của cây Gạo…………………………………

1.1.3. Bộ phận sử dụng…………………………………………………...

1.1.4. Thành phần hóa học………………………………………………..

1.2. TỔNG QUAN VỀ LÁ CÂY GẠO………………………………………….

1.2.1. Daucosterol………………………………………………………...

1.2.2. Stigmasterol………………………………………………………..

1.2.3. Mangiferin……………………………………………………...…..

1.2.4. Lupeol……………………………………………………………...

1.2.5. Taraxeryl acetat…………………………………………………….

1.2.6. Taraxerol…………………………………………………….……..

1.2.7. 7α-hydroxysitosterol…………………………………………..…..

1.3. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU

NĂNG CAO (HPLC)…………………………………………………….....

1.3.1. Nguyên tắc của HPLC……………………………………………..

1.3.2. Các thông số đặc trưng cho quá trình sắc ký………………………

1

2

2

2

2

3

3

4

4

5

6

7

8

9

10

10

10

11

1.3.3. Ứng dụng của kỹ thuật HPLC…………………………………..….

1.4. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ (LC-MS)……………..…

1.4.1. Nguyên tắc…………………………………………………………

1.4.2. Máy khối phổ………………………………………………….…...

1.4.3. Ứng dụng của phân tích khối phổ trong định tính các chất…….….

1.4.4. Một số kỹ thuật LC-MS……………………………………………

CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………….…

2.1. ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ TRANG THIẾT BỊ……………

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu……………………………………………...

2.1.2. Dụng cụ thiết bị…………………………………………………….

2.1.3. Hóa chất, thuốc thử………………………………………………...

2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU……………………………………………......

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……………………………………..……

2.3.1. Chuẩn bị mẫu thử…………………………………………………..

2.3.2. Chuẩn bị dung dịch đối chiếu (chuẩn)……………………...……..

2.3.3. Khảo sát và tìm điều kiện sắc ký………………………………..…

2.3.4. Thẩm định phương pháp phân tích………………………………..

2.3.5. Phương pháp xử lý số liệu…………………………………………

CHƯƠNG III. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ………………………...………

3.1. HÀM ẨM VÀ HIỆU SUẤT CHIẾT CẮN TOÀN PHẦN…………………

3.1.1. Hàm ẩm của dược liệu…………………………………………......

3.1.2. Hiệu suất chiết……………………………………………………...

3.2. KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ………………………………………...

3.3. XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT CỦA CÁC HỢP CHẤT NGHIÊN CỨU….

12

14

14

14

16

17

18

18

18

18

18

19

19

19

20

21

21

23

24

24

24

24

24

27

3.4. ĐỊNH TÍNH CÁC HỢP CHẤT TRÊN SẮC KÝ ĐỒ………………………

3.5. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CÁC CHẤT

TRONG LÁ CÂY GẠO BẰNG HPLC……………………………………

3.5.1. Kiểm tra sự phù hợp của hệ thống sắc ký……………………..….

3.5.2. Độ lặp lại…………………………………………………………...

3.5.3. Khoảng nồng độ tuyến tính……………………………………….

3.5.4. Độ đúng………………………………………………………...…..

3.5.5. Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ………..…..

3.6. ỨNG DỤNG ĐỊNH LƯỢNG CÁC CHẤT TRONG LÁ CÂY GẠO……..

3.7. BÀN LUẬN…………………………………………………………....…...

3.7.1. Về phương pháp xử lý mẫu………………………………………...

3.7.2. Về khảo sát điều kiện sắc ký…………………………………….…

3.7.3. Về kết quả định lượng các chất trong lá cây Gạo………………….

3.7.4. Về thẩm định phương pháp định lượng……………………………

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT………………………………………………………

KẾT LUẬN…………………………………………………………………

ĐỀ XUẤT…………………………………………………………………...

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

30

32

32

34

34

39

42

43

43

43

43

44

44

46

46

46

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

ESI: ion hóa bằng phun điện từ (Electronspray ionization)

GC-MS: Sắc ký khí ghép khối phổ (Gas chromatography–mass spectrometry)

HO-1: Heme oxygenase – 1

HPLC: Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HUVEC: Tế bào thuộc màng trong ống dây rốn (Human umbilical vein

endothelial cell)

LC-MS: Sắc ký lỏng ghép khối phổ (Liquid Chromatography – Mass

Spectrometry)

LOD: Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

LOQ: Giới hạn định lượng (Limit of Qualification)

MeCN: Acetonitril

MeOH: Methanol

MS: Khối phổ (Mass Spectrometry)

NMR: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance)

PDA: Detector PDA (Photodiode Array)

RSD: Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)

S/N: Tín hiệu/nhiễu đường nền (Signal/Noise)

SD: Độ lệch chuẩn (Standard Deviation)

SKĐ: Sắc ký đồ

STT: Số thứ tự

TP: Thành phần

tR: Thời gian lưu

UV-VIS: Tử ngoại khả kiến (Ultraviolet visible)

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Sơ đồ khối của máy khối phổ………………………………………. 15

Hình 1.2. Sơ đồ bộ tứ cực chập ba…………………………………………….. 16

Hình 3.1. SKĐ của hỗn hợp 7 chất nghiên cứu……………………………….. 26

Hình 3.2. SKĐ của dịch chiết toàn phần lá cây Gạo………………………….. 26

Hình 3.3. SKĐ của hợp chất mangiferin phân lập được từ lá Gạo …………… 27

Hình 3.4. SKĐ của hợp chất daucosterol phân lập được từ lá Gạo…………… 28

Hình 3.5. SKĐ của hợp chất 7α-hydroxysitosterol phân lập được từ lá Gạo…. 28

Hình 3.6. SKĐ của hợp chất lupeol phân lập được từ lá Gạo………………… 28

Hình 3.7. SKĐ của hợp chất taraxeryl acetat phân lập được từ lá Gạo……..… 29

Hình 3.8. SKĐ của hợp chất stigmasterol phân lập được từ lá Gạo…………... 29

Hình 3.9. SKĐ của hợp chất taraxerol phân lập được từ lá Gạo……………… 29

Hình 3.10. Phổ khối lượng ứng với pic của mangiferin trên

SKĐ của mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu……………………...

30

Hình 3.11. Phổ khối lượng ứng với pic của daucosterol trên

SKĐ của mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu………………..……

30

Hình 3.12. Phổ khối lượng ứng với pic của 7α-hydroxysitosterol trên

SKĐ của mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu………………..…….

31

Hình 3.13. Phổ khối lượng ứng với pic của lupeol trên

SKĐ của mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu………………..…….

31

Hình 3.14. Phổ khối lượng ứng với pic của taraxeryl acetat trên

SKĐ của mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu……………………...

31

Hình 3.15. Phổ khối lượng ứng với pic của stigmasterol trên

SKĐ của mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu…………………..….

32

Hình 3.16. Phổ khối lượng ứng với pic của taraxerol trên

SKĐ của mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu…………………..…

32

Hình 3.17. SKĐ của mẫu trắng (dung môi pha mẫu)……………………….… 33

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1. Độ ẩm bột dược liệu…………………………………………….….. 24

Bảng 3.2. Một số thông số thể hiện sự phù hợp của hệ HPLC đã lựa chọn…… 33

Bảng 3.3. Kết quả khảo sát độ lặp lại với các chất nghiên cứu…….…………. 34

Bảng 3.4. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của mangiferin…….… 34

Bảng 3.5. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của daucosterol……… 35

Bảng 3.6. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính

của 7α-hydroxysitosterol……………………………………………

36

Bảng 3.7. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của lupeol…………… 36

Bảng 3.8. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của taraxeryl acetat…. 37

Bảng 3.9. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của stigmasterol……... 38

Bảng 3.10. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của taraxerol……….. 38

Bảng 3.11. Tổng hợp kết quả khảo sát độ đúng của 7 hợp chất……………….. 39

Bảng 3.12. Kết quả khảo sát độ đúng với mangiferin…………………………. 39

Bảng 3.13. Kết quả khảo sát độ đúng với daucosterol………………………… 40

Bảng 3.14. Kết quả khảo sát độ đúng với 7α-hydroxysitosterol……………… 40

Bảng 3.15. Kết quả khảo sát độ đúng với lupeol……………………………… 40

Bảng 3.16. Kết quả khảo sát độ đúng với taraxeryl acetat…………………….. 41

Bảng 3.17. Kết quả khảo sát độ đúng với stigmasterol………………………... 41

Bảng 3.18. Kết quả khảo sát độ đúng với taraxerol…………………………… 41

Bảng 3.19. Kết quả khảo sát LOD và LOQ (µg/ml) …………………………. 42

Bảng 3.20. Kết quả xác định hàm lượng từng chất trong

mẫu dược liệu nghiên cứu…………………………………………

42

- 1 -

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây Gạo còn được gọi là Bông gạo, Mộc miên, Gòn…vốn là loài cây đã rất

quen thuộc đối với mỗi người dân Việt Nam, đặc biệt là người dân miền Bắc. Theo

kinh nghiệm dân gian, nhiều bộ phận của cây như vỏ thân, hoa và nhựa được sử

dụng để trị các bệnh như viêm loét dạ dày, viêm loét ngoài da, thấp khớp, bó gãy

xương, kiết lỵ [6], [15], [20]. Các nhà khoa học trên thế giới đã tiến hành nghiên

cứu hóa thực vật cũng như thử tác dụng sinh học của lá Gạo và cho những kết quả

rất đáng ngạc nhiên về tiềm năng chữa các bệnh “thời đại” như bảo vệ gan, hạ huyết

áp, hạ đường huyết [40], [44]…

Từ lá cây Gạo ở Việt Nam, Hồ Thị Thanh Huyền và cộng sự đã nghiên cứu

về phương pháp chiết xuất và đã phân lập 07 hợp chất là 7-hydroxysitosterol,

daucosterol, mangiferin, lupeol, stigmasterol, taraxerol và taraxeryl acetat.

Ngày nay, trên thế giới xu hướng trở về với thiên nhiên, tìm kiếm nguồn

thuốc mới và sử dụng thuốc từ thảo dược ngày càng tăng. Ở Việt Nam, với lợi thế

về địa hình và khí hậu đã tạo ra nguồn tài nguyên cây cỏ vô cùng phong phú cũng

như nguồn dược liệu dồi dào cùng với tri thức sử dụng cây cỏ làm thuốc từ lâu đời.

Tuy nhiên, nhiều loài cây được sử dụng rộng rãi theo kinh nghiệm dân gian mà

chưa có hoặc có rất ít nghiên cứu có giá trị khoa học. Cần có các nghiên cứu xác

định hàm lượng các hợp chất đã tìm thấy trong dược liệu để đánh giá đúng tiềm

năng của nguồn dược liệu và góp phần tiêu chuẩn hóa nguyên liệu trong quá trình

hiện đại hóa các thuốc có nguồn gốc dược liệu. Do đó, đề tài “Nghiên cứu xây

dựng phương pháp xác định hàm lượng một số chất phân lập được từ lá cây

Gạo” đã được thực hiện nhằm các mục đích sau:

1. Xây dựng được một quy trình định lượng đồng thời một số hợp chất đã

được phân lập từ lá cây Gạo bằng phương pháp HPLC.

2. Ứng dụng phương pháp xây dựng được để sơ bộ xác định hàm lượng 7-

hydroxysitosterol, daucosterol, mangiferin, lupeol, stigmasterol,

taraxerol và taraxeryl acetat có trong một mẫu lá cây Gạo thu hái được.

- 2 -

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN

1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY GẠO

1.1.1. Đặc điểm thực vật

Tên khoa học: Bombax malabaricum DC., họ Gạo (Bombacaceae).

Tên đồng nghĩa: Bombax ceiba L., Gossampinus malabarica (DC.) Merr.,

Salmalia malabarica (DC.) Schott et Endl, Bombax heptaphylla Cavl.

Tên khác: Gòn rừng, Mộc miên thụ, Mạy mìn, Mạy nghịu (Tày).

Cây gỗ to, cao tới 15m hay hơn. Thân có gai hình chùy và có bạnh vè ở gốc.

Cành mọc ngang với những gai hình nón; cành non dày, không gai. Lá mọc so le,

kép chân vịt, gồm 5-7 lá chét, hình mác hoặc hình trứng, gốc thuôn, đầu nhọn, dài

9-15 cm, rộng 4-5 cm, hai mặt nhẵn, mép nguyên, cuống chung dài hơn phiến lá,

dài từ 20-25cm.

Cụm hoa mọc ở đầu cành thành chùm, màu đỏ, nở trước khi cây ra lá từ

tháng 1 tới tháng 3, cuống hoa ngắn, nhỏ, khỏe. Hoa to, đều, lưỡng tính. Đài dầy,

hình chuông, có 5 răng tù và ngắn màu nâu xám, bao bọc lấy nụ hoa, khi hoa nở thì

rách ra thành 3-5 mảng không đều. Tràng 5 cánh nạc, rời nhau, mặt ngoài phủ lông

nhung. Nhị rất nhiều hợp thành 5 bó hoặc 6 bó (không thành ống), ngắn hơn cánh

hoa, bó nằm trong 2 cuống cánh khác nhau. Bầu thượng 5 ô, một vòi mang 5 đầu

nhụy, bầu hình nón, có lông màu trắng nhạt. Mùa hoa tháng 2 – 3, mùa quả tháng 5

– 7 [6], [7], [11], [15], [20].

1.1.2. Tính vị và công năng của cây Gạo

- Hoa Gạo có vị ngọt, tính mát, có tác dụng thanh nhiệt, lợi thấp, tiêu viêm,

thu liễm [5].

- Vỏ thân cây Gạo có vị đắng, tính mát, có tác dụng lợi tiểu, tiêu sưng, gây

nôn [18], khu phong, trừ thấp, tiêu thũng [5]. Theo tài liệu Ấn Độ, nước sắc vỏ thân

có tác dụng làm dịu viêm, cầm máu [5].

- Rễ có vị đắng, tính mát, có tác dụng kích thích, bổ, cũng có tác dụng gây

nôn và giảm đau [19], ngoài ra còn có tác dụng thanh nhiệt, lợi thấp, thu liễm, chỉ

huyết, tán kết, chỉ thống. Ở Indonesia, nước ép rễ có tác dụng hạ sốt [5].

- 3 -

- Lá Gạo được dùng rất tốt cho đái dắt, phát ban, chữa thiếu máu, chữa lỵ

[21], được sử dụng để điều trị thấp khớp, viêm da, nhiễm trùng da, phát ban, sưng

hạch, kiết lỵ, tiểu tiện khó khăn, chữa rắn cắn và có tác dụng nhuận tràng. Ngoài ra

còn được dùng trong các trường hợp thiếu máu, rong kinh, huyết trắng, vô sinh [22],

[32]. Theo y học cổ truyền phía Nam Pakistan, lá B.malabaricum DC. được sử dụng

như là một thuốc trị giun sán [29].

- Hạt bông Gạo làm tăng tiết sữa ở phụ nữ sau khi sinh [19].

- Nhựa gôm chích từ thân cây Gạo được dùng chữa lậu, kiết lỵ, cầm máu,

rong kinh, kích dục [5].

1.1.3. Bộ phận sử dụng

Toàn cây được sử dụng cho các mục đích khác nhau:

- Vỏ thân thu hái quanh năm, tốt nhất vào mùa xuân [19] nhưng cũng có tài

liệu cho rằng tốt nhất vào mùa hè [6]. Vỏ thân mang về cạo bỏ vỏ thô bên ngoài, rửa

sạch, thái nhỏ, phơi khô sắc uống hoặc dùng tươi giã nát để đắp ngoài [15].

- Lá non làm dịu và lợi sữa.

- Rễ, hoa, nhựa cũng dùng làm thuốc chữa bệnh.

- Gỗ dùng làm phao, làm hòm gỗ.

- Sợi quả dùng làm bông, nệm, gối.

1.1.4. Thành phần hóa học

Trong cuốn “Pharmacology of Bombax Ceiba Linn” (2012), VartikaJain và

Surendra K. Verma đã tổng hợp được trong lá có tannin, carbonhydrat, flavonoid,

courmarin, steroid, triterpenoid [49]. Từ lá cũng đã có những nghiên cứu phân lập

được Shamimin và Mangiferin [23], [44].

Trong khóa luận dược sỹ của Trần Thị Điểm Anh, đã kiểm tra định tính các

chất trong vỏ thân và kết quả cho thấy thành phần có courmarin, flavonoid, alkaloid,

saponin [3]. Mặt khác, một số nhà khoa học trên thế giới đã phân lập được các chất

Lupeol, Shamimicin từ vỏ thân cây Gạo [25], [45].

Theo Võ Văn Chi, hạt Gạo chứa chất béo, tinh dầu [6].

- 4 -

Trong tài liệu “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam”, nhựa gôm cây Gạo

có chứa acid catechutanic [15].

Hồ Thị Thanh Huyền và cộng sự đã phân lập và xác định được cấu trúc các

thành phần hóa học của cây Gạo là: Lupeol, Friedenin, Epicatechin, Sphingerin,

Daucosterol, Stigmasterol, Mangiferin, Taraxeryl acetat, Taraxerol, 7α-

hydroxysitosterol, Ergosterol peroxide, Aurantiamid acetat, Octadeca-9,12-dienoic.

1.2. TỔNG QUAN VỀ LÁ CÂY GẠO

Năm 1999, Faizi S. và Ali M. đã phân lập được shamimin – một flavonol C-

glycoside mới có dạng bột màu vàng nhạt từ dịch chiết ethanol của lá B.malabarium

DC. có cấu trúc 2-(2,4,5-trihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxy-6-C-

glucopyranosylosy-4H-1-benzopyran-4-ori) [28].

Năm 2011 và 2012, từ dịch chiết methanol của lá khô B.malabaricum DC.,

NCS. Hồ Thị Thanh Huyền và cộng sự đã phân lập được 7 chất là Daucosterol,

Stigmasterol, Mangiferin, Lupeol, Taraxeryl acetat, Taraxerol, 7α-

hydroxysitosterol.

1.2.1. Daucosterol

1.2.1.1. Nguồn gốc

Năm 2012, Hồ Thị Thanh Huyền và cộng sự đã phân lập được Daucosterol

từ vỏ thân và lá cây gạo [12].

Theo [40], từ 492,2g dược liệu khô cây Arctotis arctotoides có thể phân lập

được 120mg Daucosterol.

Theo [53], Daucosterol còn có trong rễ, thân, lá cây Plumbago zeylanica L.

với hàm lượng trong lá lớn nhất (từ 49,6mg – 96,7mg/100g dược liệu tùy theo thời

điểm thu hoạch).

Theo [26], từ 3kg hạt khô của cây Arctium lappa L. phân lập được 30mg

Daucosterol.

Ngoài ra, Daucosterol còn được phân lập từ cây mộc ký ngũ hùng

Dendrophtoe pentandra sống ký sinh trên cây mít Artocapus integrifolia và cây na

- 5 -

Annona squamosa [8], thân cây Thàn mát thuỳ dày (Millettia pachyloba – họ

Leguminocae) [14].

1.2.1.2. Tính chất

- Công thức phân tử: C35H60O6 (M = 576,85 g/mol).

- Tên khoa học: Stigmast-5-en-3-yl D-glucopyranoside.

- Tính chất vật lý: Chất bột vô định hình màu trắng, t°nc = 284-286°C [8],

[14], tan trong MeOH, aceton, ethyl acetat, [α]D = −44,6°C (C = 0,9, pyridin) [33].

1.2.1.3. Tác dụng và công dụng

- Theo [34], nghiên cứu in vitro trên chuột của Lee JH và cộng sự tại đại

học Dongduk Women đã đưa ra kết quả Daucosterol giúp bảo vệ tế bào chuột bởi

nấm men Candida. Daucosterol có tác dụng điều hoà miễn dịch cơ thể, thông qua

việc làm tăng hoạt tính của tế bào CD4 và Th1 tại chuột, qua đó làm giảm sinh

trưởng của tế bào nấm men Candida albicans.

1.2.2. Stigmasterol


Stigmasterol được tìm thấy trong vỏ thân và lá cây Gạo [13], ngoài ra

Stigmasterol còn được tìm thấy trong đậu nành bằng phương pháp HPLC [35].

Theo [41], từ 492,2g dược liệu khô cây Arctotis arctotoides có thể phân lập

được 30mg Stigmasterol.

Theo [49], nghiên cứu đã phân lập được 65mg Stigmasterol từ 10g lá cây

Rubus suavissimus, họ Rosoideae.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Lee%20JH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17335944

- 6 -


- Công thức phân tử: C29H48O (M = 412,69 g/mol).

- Tên khoa học: (24S)-24-ethylcholesta-5,22-dien-3β-ol.

- Tính chất vật lý: Chất bột kết tinh màu trắng, t°nc = 170°C, tan trong các

dung môi hữu cơ thông thường, rất dễ tan trong benzen, ethyl ether, ethanol, không

tan trong nước, λmax = 257 nm, [α]D22

= −51°C (C = 2, cloroform) [24].


- Theo Richard E và cộng sự [43], Phytosterols có tác dụng làm giảm

Lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL-C), là một trong những chỉ số biểu thị mức độ

cholesterol máu. Một kết quả tương tự cũng được tìm thấy qua nghiên cứu [42] của

Padmanabhan P Nair và cộng sự, Stigmasterol có tác dụng giảm sự hấp thu

Cholesterol vào máu, do đó làm giảm nguy cơ béo phì và nguy cơ ung thu ruột.

- Stigmasterol còn được dùng làm nguyên liệu để tổng hợp progesterol [46].

Progesterol là một hormon quan trọng trong cơ thể. Progesterol có thể dùng một

mình để tránh thai và điều trị nhiều loại bệnh, bao gồm xuất huyết tử cung bất

thường, vô kinh, lạc nội mạc tử cung, ung thư vú, thận, ăn mất ngon và sụt cân do

AIDS. Do đó, việc tổng hợp ra progesterol mang tính thực tiễn rất cao.

1.2.3. Mangiferin


Mangiferin có ở lá, vỏ thân và vỏ rễ cây xoài Mangiferin indica với hàm

lượng khác nhau tùy từng vùng và tùy từng giống xoài, khoảng 3% ở vỏ thân và

khoảng 1,6% ở lá [15].

Năm 2011, Nguyễn Thị Thúy đã phân lập được Mangiferin từ lá cây gạo

[18].

- 7 -



- Tên khoa học: 2-β-D-glucopyranosyl-1,3,6,7-tetrahydroxy-9H-xanthen-9-

on.

- Tính chất vật lý: Bột kết tinh mịn, màu vàng ánh lục, không mùi hay mùi

nhẹ [4]; hơi tan trong hỗn hợp aceton – nước (1 : 1), tan trong cồn metylic, cồn

etylic, thực tế không tan trong nước lạnh, cloroform [9]; t°nc = 258 - 261°C; phổ tử

ngoại của dung dịch chế phẩm 0,001% trong methanol, trong khoảng 220 – 400 nm

phải có hấp thụ cực đại ở các bước sóng 241±2 nm, 258±2nm, 316±2 nm, 366±2

nm [4].


- Mangiferin có tác dụng kháng virus đối với nhóm Herpes, cho hiệu lực ức

chế trên giai đoạn đầu quá trình tái sinh virus Herpes [51].

- Mangiferin có tác dụng kích thích miễn dịch trên cả 2 loại miễn dịch thể

dịch và miễn dịch tế bào [10].

- Ngoài ra, những nghiên cứu mới đây còn cho thấy mangiferin có tác dụng

hạ đường huyết do làm tăng độ nhạy cảm của mô tế bào đích với insulin và ức chế

thoái giáng tế bào glycogen ở gan [47].

1.2.4. Lupeol


- Lupeol được tìm thấy trong các loại rau như bắp cải trắng, hạt tiêu, cà

chua; trong trái cây như ô liu, quả sung, xoài và trong cây thuốc như Bombax ceiba,

Tamarindus indica, Sebastiania adenophora… với hàm lượng rất khác nhau: quả ô

liu chứa 3µg/g quả, lá lô hội chứa 2803µg/g lá khô… [39].

- Năm 2012, Phùng Thị Hồng đã phân lập được lupeol từ vỏ thân cây Gạo

- 8 -

với hàm lượng khoảng 20mg trong 700g vỏ thân khô [13].



- Tên khoa học: 3β-hydroxylup-20(29)en.

- Tính chất vật lý: Lupeol là tinh thể hình kim, màu trắng đục; tan tốt trong

dầu, đặc biệt là chuỗi monoglycerid, diglycerid và propylen glycol monocaprylat,

tan 6,7 – 10mg/ml ethanol ở 22°C, λmax = 350 nm [37].


- Lupeol đã được nghiên cứu để chứng minh các tác dụng dược lý khác

nhau trong cả điều kiện in vitro và in vivo. Chúng bao gồm các tác dụng có lợi đối

với tình trạng viêm, ung thư, viêm khớp, tiểu đường, bệnh tim mạch, độc tính trên

thận và nhiễm độc gan… [36], [39].

- Năm 2003, Young-Jea You và cộng sự tiến hành sàng lọc một số dược

liệu thu hái tại Việt Nam có tác dụng antiangiogenic cho thấy dịch chiết methanol

của vỏ thân cây Gạo (cụ thể là lupeol) có tác dụng antiangiogenic trên dòng tế bào

thuộc màng trong ống dây rốn (HUVEC) [38], [50].

1.2.5. Taraxeryl acetat


- Năm 2012, Nguyễn Hải Ngọc đã phân lập được hai chất là Taraxeryl

acetat và Taraxerol từ lá cây Gạo [17].


- Công thức phân tử: C32H52O2 (M = 468,75 g/mol)

- 9 -

- Tên khoa học: D-Friedoolean-14-en-3β-yl acetate.

- Tính chất vật lý: t°nc = 303-305°C; [α]D = +10,5° (C = 1,8, cloroform)

[54].


- Tác dụng điều trị ung thư dạ dày do làm chậm quá trình phát triển của tế

bào ung thư dạ dày AGS [52].

1.2.6. Taraxerol


- Ngoài xuất hiện trong lá cây Gạo, Taraxerol còn được tìm thấy trong vỏ

cây Cupania dentata (họ Sapindaceae) với 52,2 mg khi tiến hành chiết và phân lập

982g dược liệu khô [30].



- Tên khoa học: D-Friedoolean-14-en-3-ol.

- Tính chất vật lý: tinh thể màu trắng, tan trong benzene, chloroform, ether;

ít tan trong rượu; t°nc = 279 - 280°C; [α]D = +2,9 (C = 0,490, cloroform) [30].

- 10 -


- Tương tự như Taraxeryl acetat, Taraxerol cũng có tác dụng điều trị ung

thư dạ dày do làm chậm quá trình phát triển của tế bào AGS [52].

1.2.7. 7α-hydroxysitosterol


- Thành phần 7α-hydroxysitosterol đã được phân lập từ lá cây Gạo vào năm

2012 [17].

- Bên cạnh đó, chất này cũng được tìm thấy trong hạt giống cây đậu đũa

Vigna sinensis [27].



- Tên khoa học: 7α-hydroxy(3β)-Stigmast-5-en-3-ol.

- Tính chất vật lý: bột màu trắng, t°nc=219-220; [α]D = −45,0ºC (C=0,25,

CHCl3) [27].


- Theo [27], các thành phần trong hạt giống cây đậu đũa Vigna sinensis nói

chung và 7α-hydroxysitosterol nói riêng đều được đánh giá là hiệu quả trên Heme

oxygenase – 1 (HO-1) – một enzym được xem như là có tác dụng ngăn cản sự ly

giải heme thành carbon monoxid và sắt tự do, giúp tăng sự tác động của HO-1 trên

dòng tế bào HepG2.

1.3. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

1.3.1. Nguyên tắc của HPLC

HPLC là một kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột

chứa các hạt pha tĩnh. Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của

chúng giữa 2 pha, tức là liên quan đến ái lực tương đối của chất này với pha tĩnh và

- 11 -

pha động. Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột phụ thuộc vào các yếu tố trên. Các

chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bởi detector và được ghi lại nhờ máy ghi

và bộ phận xử lý số liệu thành SKĐ với các thông tin về pic của chất phân tích. Quá

trình tách sắc ký tốt thì hỗn hợp có bao nhiêu thành phần sẽ có bấy nhiêu pic riêng

biệt được tách ra trên sắc đồ.

Tùy thuộc vào cơ chế của quá trình tách sắc ký mà ta có những kỹ thuật sắc

ký khác nhau: Sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion, sắc ký loại cỡ,

sắc ký ái lực, sắc ký các đồng phân quang học. Trong đó sắc ký lỏng phân bố được

sử dụng rộng rãi nhất hiện nay [1], [16].

1.3.2. Các thông số đặc trưng cho quá trình sắc ký [1]

1.3.2.1. Thời gian lưu (tR)

Thời gian lưu tR là khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi chất

phân tích đến detector. Trên cùng một điều kiện HPLC đã chọn, thời gian lưu của

mỗi chất là hằng định, vì vậy có thể dùng thời gian lưu để phát hiện định tính các

chất.

Thời gian lưu phụ thuộc các yếu tố:

- Bản chất của pha tĩnh.

- Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động.

- Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan.

- Trong một số trường hợp còn phụ thuộc pH của pha động.

1.3.2.2. Hệ số dung lượng k’

Hệ số dung lượng mô tả tốc độ lưu của cấu tử phân tích trong cột:

trong đó: VS: thể tích pha tĩnh

VM: thể tích pha động

CS: nồng độ pha tĩnh

CM: nồng độ pha động

k' phụ thuộc vào bản chất chất phân tích, bản chất 2 pha phân tích, dựa vào

hệ số VS/VM.

- 12 -

Thường chọn k’= 1-5.

1.3.2.3. Số đĩa lý thuyết

Mỗi cột sắc ký có thể phân thành nhiều lớp mỏng xếp sát nhau gọi là đĩa lý

thuyết. Ở mỗi đĩa lý thuyết sẽ diễn ra sự phân bố cân bằng tức thời của chất tan giữa

pha tĩnh và pha động. Số đĩa lý thuyết là đại lượng đặc trưng cho hiệu lực cột sắc

ký.

N: số đĩa lý thuyết

H: chiều cao pic

tR: thời gian lưu

W: chiều rộng của pic

1.3.2.4. Độ phân giải của cột

Độ phân giải của cột đánh giá khả năng tách định lượng hai chất trong hỗn

hợp trên cột sắc ký:

RS: độ phân giải

(tR)A: thời gian lưu chất A

(tR)B: thời gian lưu chất B

W1/2A: chiều rộng pic A ở phân nửa chiều cao của pic

W1/2B: chiều rộng pic B ở phân nửa chiều cao của pic

1.3.3. Ứng dụng của kỹ thuật HPLC

1.3.3.1. Định tính [2]

Người ta có thể dùng HPLC để định tính bằng một số cách sau:

- So sánh thời gian lưu của các chất phân tích trong dung dịch thử với thời

gian lưu của chất chuẩn chạy cùng điều kiện sắc ký.

- So sánh phổ (chồng phổ) UV-VIS của chất thử với chất chuẩn trên

detector DAD (có hệ số match > 0,995).

- Có thể kết nối HPLC – phổ IR hoặc HPLC – MS định tính dựa vào nhóm

chức (IR) hoặc số khối (MS).

- 13 -

1.3.3.2. Định lượng

Tất cả các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng

độ của chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó.

Có 4 phương pháp định lượng thường được sử dụng trong sắc ký là:

- Phương pháp chuẩn ngoại

- Phương pháp chuẩn nội

- Phương pháp thêm chuẩn

- Phương pháp chuẩn hóa diện tích

Trong khuôn khổ của khóa luận này tôi xin trình bày cụ thể về phương pháp

chuẩn ngoại.

Đây là phương pháp định lượng cơ bản, trong đó cả 2 mẫu chuẩn và thử đều

được tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện, so sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic

của mẫu thử với diện tích (hoặc chiều cao) pic mẫu chuẩn sẽ tính được nồng độ của

các chất trong mẫu thử.

Có thể sử dụng phương pháp chuẩn hóa 1 điểm hoặc chuẩn hóa nhiều điểm:

Chuẩn hóa một điểm

Chọn nồng độ của mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng độ của mẫu thử. Tính nồng độ

của mẫu thử theo công thức:

Cx =

Cx: Nồng độ mẫu thử.

CS: Nồng độ mẫu chuẩn.

Sx: Diện tích của pic chất phân tích trong mẫu thử.

SS: Diện tích của pic chất phân tích trong mẫu chuẩn.

Chuẩn hóa nhiều điểm

Cách tiến hành: Chuẩn bị 1 dãy chuẩn với các nồng độ chất chuẩn tăng dần

rồi tiến hành sắc ký. Các đáp ứng thu được là các diện tích hoặc chiều cao pic ở mỗi

điểm nồng độ chuẩn. Vẽ đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa diện tích S (hoặc chiều

cao H) của pic với nồng độ của chất chuẩn. Sử dụng đoạn tuyến tính của đường

chuẩn để tính toán nồng độ của chất cần xác định. Có thể tính theo 2 cách:

- 14 -

- Áp dữ liệu diện tích (hoặc chiều cao) pic của chất thử vào đường chuẩn sẽ

suy ra được nồng độ của nó.

- Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính mô tả quan hệ giữa diện tích

pic (hoặc chiều cao) với nồng độ của chất cần xác định.

S = a + b.C

S: Diện tích pic

a: Giao điểm của đường chuẩn với trục tung

b: Độ dốc của đường chuẩn

C: Nồng độ của chất thử.

Dựa vào phương trình hồi quy này ta tính được nồng độ của chất thử.

Cx = Error!

Chú ý: Độ lớn của diện tích pic Sx (hoặc chiều cao pic) mẫu thử phải nằm

trong đoạn tuyến tính của đường chuẩn [1], [16].

1.4. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ (LC-MS) [1]

LC-MS là kỹ thuật phân tích dựa trên sự kết hợp sắc ký lỏng hiệu năng cao

và phân tích khối phổ. Sự kết hợp này tạo nên một hệ thống có những ứng dụng

rộng lớn trong phân tích.

1.4.1. Nguyên tắc

Khối phổ (Mass Spectrometry – MS) là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng

và điện tích ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phần tử hoặc nguyên tử mẫu.

Tỷ số này được biểu thị bằng đơn vị khối lượng nguyên tử hoặc bằng Dalton (Da).

Các ion được tạo thành trong buồng ion hóa, được gia tốc và tách riêng nhờ

bộ phân tích khối trước khi đến detector. Tín hiệu tương ứng với các ion sẽ được

thể hiện bằng một số vạch (pic) có cường độ khác nhau, tập hợp thành một khối phổ

đồ hoặc phổ khối, cung cấp thông tin để định tính, xác định cấu trúc và định lượng

các chất.

1.4.2. Máy khối phổ

1.4.2.1. Bộ nạp mẫu (Inlet)

- 15 -

Đưa mẫu vào máy. Nếu mẫu ở dạng lỏng hoặc rắn phải chuyên mẫu sang

dạng hơi bằng cách thích hợp. Có thể nạp mẫu trực tiếp hoặc nối với đầu ra của một

thiết bị phân tích khác như sắc ký khí, sắc ký lỏng siêu giới hạn (SFC), điện di mao

quản (CE).

Hình 1.1. Sơ đồ khối của máy khối phổ

1.4.2.2. Bộ nguồn ion (Ion source)

Ion hóa các phân tử, nguyên tử của mẫu ở trạng thái khí hoặc hơi, khử dung

môi để đưa tiếp ion vào bộ phân tích khối, cách ly phần tạo ion ở áp suất khí quyển

với bộ phận nằm trong chân không sâu. Và rút ra ngoài các phân tử trung hòa, ion

khác dấu có thể ảnh hưởng tới phép đo.

Các kỹ thuật ion hóa đã được phát triển và sử dụng là: Va chạm electron, ion

hóa hóa học, ion hóa bằng nguồn ion phun sương khử solvat, ion hóa hóa học ở áp

suất khí quyển, ion hóa bởi nguồn ion bằng giải hấp.

Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng kỹ thật ion hóa bằng phun điện từ -

Electronspray ionization (ESI).

1.4.2.3. Bộ phân tích khối (Mass Analyzer)

Tách các ion theo tỷ số m/z. Các ion được gia tốc và tách riêng nhờ tác dụng

của từ trường, điện trường để đi đến detector. Có thể phân bộ phận tích khối thành 4

loại:

- Bộ phân tích từ (Magnetic Analyser)

- Bộ phân tích tứ cực (Quadrupole)

- Bộ phân tích thời gian bay (Time of Flight Analyser – TOF)

- 16 -

- Bộ phân tích cộng hưởng ion cyclotron (Ion cyclotron resonance analyser

– ICR)

Đề tài này chúng tôi sử dụng máy khổi phổ có bộ phân tích khối là bộ phân

tích tứ cực chập ba.

Bộ tứ cực chập ba (Triple Quadrupole Analyser): Bộ phân tích khối gồm ba

bộ tứ cực nối tiếp nhau. Bộ Q1 và Q3 làm nhiệm vụ phân tích khối, bộ Q2 làm

nhiệm vụ va chạm ion để phân tách thành các mảnh khối nhỏ hơn, đó là ion con.

Hình 1.2. Sơ đồ bộ tứ cực chập ba.

Bộ phân tích tứ cực chập ba còn gọi là Tandem Mass Analyser. Kỹ thuật

phân tích khối phổ kiểu này là khối phổ 2 lần (MS/MS). Kỹ thuật này thường được

dùng để khẳng định cấu trúc các chất hữu cơ và phân tích hỗn hợp nhiều thành phần

chưa được tinh chế sạch.

1.4.2.4. Detector

Detector có nhiệm vụ chuyển các ion đến thành tín hiệu điện đo bằng hệ điện

tử của máy khối phổ. Hiện có 2 dạng truyền thống:

- Nhân eclectron (electron myltiplier)

- Nhân quang (photomultiplier)

1.4.2.5. Bộ xử lý dữ liệu (Data System)

Tín hiệu điện từ detector được khuyếch đại trước khi chuyển thành tín hiệu

số phục vụ xử lý dữ liệu theo yêu cầu khác nhau như: ghi phổ khối, so sánh với thư

viện phổ, định lượng…

1.4.3. Ứng dụng của phân tích khối phổ trong định tính các chất

- Phân tích khối phổ có thể cho rất chính xác khối lượng các ion phân tử

M+, (M + 1)

+, (M + 2)

+. Đây là đặc trưng quan trọng của hợp chất hóa học. Bên

cạnh đó, xem xét thêm các pic đồng vị, tỷ số cường độ của chúng cùng với khối

lượng của vài mảnh ion có thể xác định được công thức nguyên của chất phân tích.

- 17 -

- Trong phân tích dược, thường sử dụng kết nối GC-MS hoặc LC-MS. Có

thể so sánh phổ nghiên cứu với thư viện phổ có trong máy hoặc phổ nghiên cứu với

chất đối chiếu để khẳng định thành phần định tính của mẫu.

1.4.4. Một số kỹ thuật LC-MS

- Kỹ thuật phân tích toàn thang (FULL SCAN)

Cho đầy đủ thông tin về các chất phân tích trong mẫu ion, tuy nhiên phương

pháp này có độ nhạy không cao, nhiễu đường nền có thể lớn.

- Kỹ thuật phân tích chọn lọc ion (SIM, Selected Ion Monitoring)

Kỹ thuật này chỉ cho khối phổ kế nhận diện một ion và ghi sắc đồ theo thời

gian, kỹ thuật SIM nhạy hơn FULL SCAN từ 10 tới 100 lần tùy theo thiết bị.

- Kỹ thuật MS/MS

Trong kỹ thật MS/MS một ion chọn lọc ở chế độ MS lần 1 được phân tích

bằng cách sử dụng năng lượng bẻ gãy, tạo ra một hoặc vài ion con đặc trưng ở chế

độ phân tích MS lần 2. Kỹ thuật MS/MS được sử dụng để tăng độ chọn lọc và tăng

độ nhạy do làm giảm nhiễu đường nền rất đáng kể.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kỹ thuật MS/MS để định tính 7 hợp

chất có trong lá cây Gạo.

- 18 -

CHƯƠNG II.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ TRANG THIẾT BỊ

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

Mẫu nghiên cứu là lá của cây Gạo (được làm khô tự nhiên) thu hái tại Hương

Sơn (Mỹ Đức, Hà Nội) và đã được TS. Trần Huy Thái (Viện Sinh thái và Tài

nguyên sinh học) giám định tên khoa học là: Bombax malabaricum DC., họ Gạo

(Bombacaceae).

2.1.2. Dụng cụ, thiết bị

- Máy sắc ký lỏng khối phổ Shimadzu LC/MS 8030 có kết nối thêm

detector SPD-20A (có khả năng phân tích UV-VIS trong vùng 190-700nm) của

Trung tâm Kiểm nghiệm Dược phẩm và Mỹ phẩm Hà Nội.

- Cột sắc ký Zorbax C18 (250mm x 4,6 mm; 5μm) kết hợp bảo vệ cột

Phenomenex C18 (ODS, Octadecyl; cartridge 15×30mm ID).

- Cân phân tích Mettler Toledo độ chính xác 0,01mg.

- Máy đo hàm ẩm Precisa XM 60, max 124g, d=0,001g.

- Bộ lọc dung môi, lọc mẫu với màng lọc 0,45 µm.

- Bộ sinh hàn hồi lưu và bình cầu.

- Máy li tâm Hettich của Đức.

- Nồi đun cách thủy.

- Pipet tự động 1000µl, 100 µl và 10 µl.

- Các dụng cụ thủy tinh khác: Bình định mức, pipet, ống đong, ống ly tâm,

phễu lọc, màng lọc …

2.1.3. Hóa chất và thuốc thử

- Hóa chất tinh khiết phân tích: acid formic.

- Dung môi loại dùng cho HPLC: methanol, acetonitril.

- 19 -

- Các hợp chất đã phân lập được từ lá cây Gạo là mangiferin, lupeol,

taraxerol, taraxeryl acetat, stigmasterol, 7-hydroxysitosterol và daucosterol đã

được tinh chế và nhận dạng cấu trúc bằng các phương pháp phổ MS và NMR.

2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Đánh giá tổng tạp có trong các mẫu hợp chất phân lập và tinh chế được

bằng phương pháp chuẩn hóa diện tích.

- Khảo sát các điều kiện sắc ký với HPLC để có thể tách hoàn toàn các hợp

chất trong hỗn hợp 7 hợp chất nghiên cứu với nhau và với các hợp chất khác trong

cao lỏng lá cây Gạo.

- Định tính các pic trên SKĐ dựa vào thời gian lưu và kết hợp với MS kết

nối.

- Thẩm định các điều kiện định lượng một số hợp chất trên với chất đối

chiếu là các chất phân lập được đã qua nhận dạng cấu trúc và xác định tổng tạp chất

bằng phương pháp chuẩn hóa diện tích.

- Áp dụng để sơ bộ xác định hàm lượng 7 hợp chất trên có trong mẫu lá cây

Gạo đã thu hái được.

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1. Chuẩn bị mẫu thử

Qua thử nghiệm với nhiều biện pháp xử lý mẫu khác nhau, chúng tôi xử lý

mẫu theo phương pháp ngâm lạnh.

Xác định độ ẩm của bột dược liệu:

Lá sau khi sấy khô, nghiền thành bột khô. Lấy khoảng 2g bột mẫu nghiên

cứu để xác định độ ẩm của dược liệu. Bật máy đo độ ẩm, điều chỉnh nhiệt độ 110oC,

rắc bột dược liệu lên đĩa cân và trải đều lên mặt đĩa, đậy đĩa cân và đợi máy tự động

hiện kết quả lên màn hình, đọc kết quả. Tiến hành 3 lần, lấy kết quả trung bình.

Chiết xuất:

Cân khoảng 500g dược liệu lá cây (đã xác định độ ẩm trước) được làm nhỏ,

ngâm lạnh 3 lần với methanol trong 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ. Thu dịch chiết, lọc,

gộp dịch lọc cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, thu và cân cắn toàn phần thu

- 20 -

được. Cắn được bảo quản ở 4°C.

Tính hiệu suất chiết:

Hàm lượng % của cắn toàn phần so với khối lượng bột dược liệu được tính

theo công thức sau:

X: Hàm lượng (%)

M: Khối lượng dược liệu đem chiết (g)

x: Độ ẩm dược liệu (%).

a: Khối lượng cắn toàn phần thu được (g).

Pha dung dịch thử:

Lấy chính xác khoảng 0,5g cắn toàn phần, hòa tan hoàn toàn trong methanol

định mức thành 25ml dung dịch, lọc qua bông thủy tinh, rồi qua màng lọc 0,45µm

trước khi tiêm mẫu vào hệ thống HPLC.

2.3.2. Chuẩn bị dung dịch đối chiếu (chuẩn)

2.3.2.1. Kiểm tra độ tinh khiết của các hợp chất nghiên cứu phân lập được

- Chất nghiên cứu được cân chính xác và hòa tan thành các dung dịch trong

methanol và tiêm vào hệ thống sắc ký.

- Độ tinh khiết của các hợp chất nghiên cứu được đánh giá qua tổng tạp có

trong chúng sau khi phân lập và tinh chế để xác định cấu trúc. Tổng tạp của các hợp

chất được đánh giá theo phương pháp chuẩn hóa diện tích.

2.3.2.2. Pha các dung dịch đối chiếu gốc

Vì các chất khảo sát đều tan tốt trong methanol nên tôi quyết định chọn

methanol làm dung môi để pha dung dịch chuẩn.

Cân chính xác một lượng từng chất nghiên cứu đã phân lập và tinh chế được,

cho vào bình định mức 25ml, thêm vừa đủ methanol, lắc đều cho tan hoàn toàn.

Dung dịch này dùng để kiểm tra tổng tạp và được pha loãng thích hợp để xây dựng

dãy dung dịch chuẩn.

2.3.3. Khảo sát và tìm điều kiện sắc ký

- 21 -

Cột sắc ký

Qua tham khảo các tài liệu nghiên cứu về phương pháp tách chiết, định

lượng một số thành phần trong cây gạo, tôi thấy các phương pháp đều sử dụng sắc

ký pha đảo. Hiện nay sắc ký phân bố pha đảo là phương pháp được sử dụng khá phổ

biến với nhiều tính ưu việt. Do đó, tôi đã lựa chọn sắc ký phân bố pha đảo trong

nghiên cứu này.

Sử dụng cột hiện có là Cột Zorbax C18 (250mm × 4,6 mm; 5 µm) kết hợp

cột bảo vệ Phenomenex C18 (ODS, Octadecyl; cartridge 15x30mm ID).

Pha động:

Là một trong những yếu tố quyết định thời gian lưu giữ các chất phân tích và

hiệu quả của sự tách sắc ký.

Qua nghiên cứu tính chất lí hóa của các chất và nghiên cứu một số tài liệu

tham khảo, các dung môi thường sử dụng là methanol, acetonitril, acid formic,

nước. Tiến hành khảo sát với chế độ gradient dung môi giữa 2 kênh là

A: acid formic 0,1% trong acetonitrile

B: acid formic 0,1% trong methanol

2.3.4. Thẩm định phương pháp phân tích

Phép định lượng các chất trong lá cây Gạo bằng phương pháp HPLC được

thẩm định thông qua các chỉ tiêu:

- Kiểm tra sự phù hợp của hệ thống sắc ký

- Độ lặp lại

- Tính tuyến tính

- Độ đúng

- Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ

2.3.4.1. Kiểm tra sự phù hợp của hệ thống sắc ký

Đánh giá độ phù hợp của hệ thống là phép thử nhằm đánh giá độ ổn định của

toàn hệ thống phân tích bao gồm các yếu tố như: máy móc thiết bị, hệ thống điện,

cách tiến hành phân tích, mẫu thử …

- 22 -

Các hệ số được sử dụng để đánh giá độ phù hợp của hệ thống là độ phân giải

(Rs), độ lệch chuẩn tương đối khi tiêm mẫu lặp lại (RSD) của các đáp ứng phân tích.

Tiến hành: tiêm 6 lần mẫu chuẩn vào hệ thống HPLC, tiến hành sắc ký với

điều kiện đã chọn.

Yêu cầu: RSD không lớn hơn 2%

2.3.4.2. Độ lặp lại của phương pháp

Độ lặp lại của một phương pháp pháp phân tích là mức độ thống nhất giữa

các kết quả riêng biệt khi quy trình phân tích được áp dụng lặp đi lặp lại nhiều lần

trên cùng một mẫu đồng nhất.

Độ chính xác được biểu thị bằng RSD.

Tiến hành:

- Phân tích 1 mẫu 6 lần song song.

- Xác định kết quả theo đường chuẩn, tiến hành trong cùng điều kiện.

- Tính độ lặp lại bằng cách tính độ lệch chuẩn tương đối giữa giá trị của các

lần định lượng.

Yêu cầu: RSD ≤ 5%

2.3.4.3. Tính tuyến tính

Để đảm bảo phép định lượng cho kết quả chính xác, thường chọn khoảng

nồng độ có sự tương quan tuyến tính giữa đáp ứng phân tích (diện tích pic) với nồng

độ chất phân tích.

Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa diện tích pic (hay chiều cao) và

nồng độ chất cần phân tích. Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ từ thấp nhất đến

cao nhất trong một đường chuẩn có đáp ứng tuyến tính.

Tính chất tuyến tính được biểu thị bằng phương trình hồi quy: y = ax + b với

hệ số tương quan tuyến tính r.

Tiến hành:

- Chuẩn bị dãy chất chuẩn có nồng độ biến thiên trong khoảng thích hợp.

- Tiêm mẫu.

- Xây dựng phương trình hồi quy và xác định hệ số tương quan r.

- 23 -

- Tính lại nồng độ chất chuẩn trong các mẫu theo phương trình hồi quy, xác

định lại độ đúng so với giá trị thực của từng nồng độ.

Yêu cầu: Hệ số tương quan r > 0,995

2.3.4.4. Độ đúng

Độ đúng được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn, là tỷ lệ phần trăm

giữa lượng chất chuẩn tìm lại được so với lượng chất chuẩn đã thêm vào mẫu thử.

Yêu cầu: Độ tìm lại: 95-105%

2.3.4.5. Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ

Xác định LOD và LOQ dựa vào tỷ lệ đáp ứng so với nhiễu đường nền (S/N),

tỉ lệ S/N được tiến hành bằng cách so sánh đáp ứng của mẫu trắng từ đó tính được

nồng độ tối thiểu của chất phân tích có thể phát hiện được.

Tiến hành: Pha loãng dung dịch chuẩn từ nồng độ ban đầu đến nồng độ thấp

nhất có thể phát hiện được bằng sắc ký sao cho vẫn nằm trong khoảng tuyến tính

- LOD: là nồng độ tối thiểu của chất phân tích tại đó cho các pic có tín hiệu

bằng 3 lần nhiễu đường nền (S/N =3).

- LOQ: là nồng độ chất phân tích tại đó có tín hiệu bằng 10 lần nhiễu

đường nền (S/N = 10).

2.3.5. Phương pháp xử lý số liệu

- Các kết quả sắc ký được xử lý bằng các phần mềm Chemstation của thiết

bị HPLC.

- Sử dụng các phương pháp xử lý thống kê trong phân tích với các đại

lượng đặc trưng kết hợp với sự hỗ trợ tính toán của Microsoft Office Excel.

- 24 -

CHƯƠNG III. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

3.1. HÀM ẨM VÀ HIỆU SUẤT CHIẾT CẮN TOÀN PHẦN

3.1.1. Hàm ẩm của dược liệu:

Lấy 3 mẫu ngẫu nhiên ở 3 vị trí khác nhau của mẫu dược liệu đem xác định

độ ẩm. Kết quả thu được tại bảng 3.1.

Bảng 3.1. Độ ẩm mẫu dược liệu

Thứ tự Khối lượng dược liệu (g) Độ ẩm (%)

1 2,0054 4,28

2 2,1031 4,43

3 2,0062 4,46

Trung bình 2,0382 4,39

3.1.2. Hiệu suất chiết

Khối lượng cắn toàn phần:

Cân 510,36 g dược liệu lá cây Gạo (độ ẩm 4,39%) đã được làm nhỏ, ngâm

lạnh 3 lần với methanol trong 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ. Thu hồi dịch chiết, lọc, gộp

dịch lọc được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cắn. Cắn được cô

đến khối lượng không đổi, thu được 21,12g cắn toàn phần, đem bảo quản ở 4ºC.

Hiệu suất chiết:

trong đó: M = 510,36(g)

x = 4,39%

a = 21,12(g)

Hiệu suất X = 4,33%

3.2. KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ

Tiến hành khảo sát điều kiện sắc ký với cột hiện có là Cột Zorbax C18

(250mm × 4,6 mm; 5 µm) kết hợp cột bảo vệ Phenomenex C18 (ODS, Octadecyl;

- 25 -

cartridge 15x30mm ID). Quá trình khảo sát tiến hành ở nhiệt độ phòng là 25ºC.

Sử dụng detector SPD-20A, chọn bước sóng phát hiện 280 nm để dung hòa

khả năng phát hiện của các hợp chất nghiên cứu.

Bắt đầu từ dùng hỗn hợp acetonitril và methanol có thêm acid formic 0,1%

với các tỷ lệ khác nhau ở chế độ đẳng dòng đều không cho khả năng tách cả 7 chất

nghiên cứu hoặc thời gian phân tích quá dài. Do vậy, chúng tôi phải sử dụng chế độ

gradient dung môi với kênh A là acid formic 0,1% trong acetonitril và kênh B là

acid formic 0,1% trong methanol.

Sau khi thử nghiệm với một số chương trình dung môi khác nhau, tốc độ

dòng và thể tích tiêm mẫu khác nhau, chúng tôi chọn lựa được một chương trình

tương đối phù hợp đủ tách các chất nghiên cứu cũng như các pic khác trong mẫu

nghiên cứu được chuẩn bị từ lá cây Gạo. Mặt khác thời gian phân tích không quá

kéo dài, là 30 phút cho một lần tiêm mẫu. Điều kiện sắc ký chúng tôi xác định được

với điều kiện cột sẵn có ở trên như sau:

Sử dụng chế độ gradient dung môi với kênh A là acid formic 0,1% trong

acetonitril và kênh B là acid formic 0,1% trong methanol. Tỷ lệ kênh A-B ban đầu

là (30:70), thay đổi tuyến tính đạt đến A–B (35:65) ở phút thứ 10, rồi thay đổi tuyến

tính đạt tới A–B (40:60) ở phút thứ 15, tiếp tục thay đổi tuyến tính tới A–B (45:55)

ở phút thứ 25, thay đổi tuyến tính trở về pha động A–B (40:60) ở phút thứ 27 và

thay đổi tuyến tính về lại tỷ lệ A–B (30:70) ban đầu ở phút thứ 30.

Tốc độ dòng là 1,0ml/phút và thể tích tiêm mẫu là 10 μL.

Các SKĐ thu được như ở hình 3.1 và hình 3.2.

- 26 -

Hình 3.1. SKĐ của hỗn hợp 7 chất nghiên cứu

Hình 3.2. SKĐ của dịch chiết toàn phần lá cây Gạo.

Tiến hành sắc ký với từng hợp chất nghiên cứu (hình 3.3 đến hình 3.9) và so

sánh với SKĐ thu được của hỗn hợp 7 hợp chất mangiferin, daucosterol, 7-

hydroxysitosterol, lupeol, taraxeryl acetat, stigmasterol và taraxerol xác định được

thời gian lưu của các chất lần lượt là 4,418; 7,121; 9,509; 12,136; 15,174; 18,025 và

25,046 phút.

Như vậy, qua quá trình khảo sát, chúng tôi đã lựa chọn được điều kiện sắc ký

như sau để định lượng 7 chất: mangiferin, daucosterol, 7-hydroxysitosterol,

lupeol, taraxeryl acetat, stigmasterol và taraxerol:

- Cột: Zorbax C18 (250mm × 4,6 mm; 5 µm) kết hợp cột bảo vệ

Phenomenex C18 (ODS, Octadecyl; cartridge 15x30mm ID), nhiệt độ 25º.

- 27 -

- Pha động: Sử dụng chế độ gradient dung môi với kênh A là acid formic

0,1% trong acetonitril và kênh B là acid formic 0,1% trong methanol. Tỷ lệ kênh A-

B ban đầu là (30:70), thay đổi tuyến tính đạt đến A–B (35:65) ở phút thứ 10, rồi

thay đổi tuyến tính đạt tới A–B (40:60) ở phút thứ 15, tiếp tục thay đổi tuyến tính

tới A–B (45:55) ở phút thứ 25. Thay đổi tuyến tính trở về pha động A–B (40:60) ở

phút thứ 27 và thay đổi tuyến tính về lại tỷ lệ A–B (30:70) ban đầu ở phút thứ 30.

- Detector SPD-20A với λ = 280 nm.

- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút.

- Thể tích tiêm: 10 μL.

3.3. XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT CỦA CÁC HỢP CHẤT NGHIÊN CỨU

Các chất nghiên cứu được cân chính xác và hòa tan thành các dung dịch

trong methanol và tiêm vào hệ thống sắc ký.

Thực hiện chương trình sắc ký như mục 3.2, thu được SKĐ của 7 hợp chất

như ở hình 3.3 đến hình 3.9.

Hình 3.3. SKĐ của hợp chất mangiferin phân lập được từ lá Gạo

- 28 -

Hình 3.4. SKĐ của hợp chất daucosterol phân lập được từ lá Gạo

Hình 3.5. SKĐ của hợp chất 7-hydroxysitosterol phân lập được từ lá Gạo

Hình 3.6. SKĐ của hợp chất lupeol phân lập được từ lá Gạo

- 29 -

Hình 3.7. SKĐ của hợp chất taraxeryl acetat phân lập được từ lá Gạo

Hình 3.8. SKĐ của hợp chất stigmasterol phân lập được từ lá Gạo

Hình 3.9. SKĐ của hợp chất taraxerol phân lập được từ lá Gạo

Các SKĐ ở các hình 3.3 đến hình 3.9 cho thấy cả 7 hợp chất đều không xuất

hiện pic tạp chất (trong thời gian sắc ký là 30 phút) nên có thể sử dụng các hợp chất

- 30 -

này làm nguyên liệu để thiết lập chất đối chiếu. Tuy nhiên do lượng các hợp chất

phân lập được còn ít và chưa đủ thời gian cho phép thiết lập chất chuẩn, chúng tôi

tạm dùng chúng như chất đối chiếu để khảo sát phương pháp định lượng chúng

trong lá cây Gạo.

3.4. ĐỊNH TÍNH CÁC HỢP CHẤT TRÊN SẮC KÝ ĐỒ

Định tính được tiến hành bằng so sánh phổ khối lượng của các pic cùng thời

gian lưu trên SKĐ của mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu.

Phổ khối lượng để nhận dạng các pic được đo với chế độ: ESI+ với tốc độ

khí phun là 3l/phút, tốc độ khí làm khô là 15l/phút, nhiệt độ CDL là 250oC, nhiệt độ

của heat block là 400oC, vùng quét m/z là 100-1000. Thế phá mảnh +4,5 kV.

Phổ khối lượng của các pic tương ứng thu được như ở các hình 3.10-3.16.

Hình 3.10. Phổ khối lượng ứng với pic của mangiferin trên SKĐ của mẫu thử và

hỗn hợp chất đối chiếu.

Hình 3.11. Phổ khối lượng ứng với pic của daucosterol trên SKĐ của mẫu thử và


- 31 -

Hình 3.12. Phổ khối lượng ứng với pic của 7-hydroxysitosterol trên SKĐ của mẫu

thử và hỗn hợp chất đối chiếu.

Hình 3.13. Phổ khối lượng ứng với pic của lupeol trên SKĐ của mẫu thử và hỗn

hợp chất đối chiếu.

Hình 3.14. Phổ khối lượng ứng với pic của taraxeryl acetat trên SKĐ của mẫu thử

và hỗn hợp chất đối chiếu.

- 32 -

Hình 3.15. Phổ khối lượng ứng với pic của stigmasterol trên SKĐ của mẫu thử và


Hình 3.16. Phổ khối lượng ứng với pic của taraxerol trên SKĐ của mẫu thử và hỗn

hợp chất đối chiếu.

Kết quả hoàn toàn phù hợp giữa phổ khối lượng của các pic tương ứng với

từng chất trên SKĐ hỗn hợp 7 chất nghiên cứu và mẫu thử là dịch chiết toàn phần

chuẩn bị từ lá cây Gạo. Ngoài pic của 7 hợp chất nghiên cứu, trên SKĐ của mẫu thử

chuẩn bị từ lá cây Gạo còn xuất hiện thêm 2 pic khác ở khoảng 20,0 phút và 22,8

phút (hình 3.2).

3.5. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CÁC CHẤT TRONG LÁ

CÂY GẠO BẰNG HPLC

3.5.1. Kiểm tra sự phù hợp của hệ thống sắc ký

Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn đã chuẩn bị ở trên, ghi lại các

- 33 -

giá trị về thời gian lưu. Độ lặp lại của hệ thống được biểu thị bằng độ lệch chuẩn

tương đối RSD của thời gian lưu. Kết quả được trình bày ở bảng 3.2.

Nhận xét: Các điều kiện sắc ký đã lựa chọn và hệ thống HPLC sử dụng phù

hợp và đảm bảo ổn định của phép phân tích định lượng các hợp chất trên.

Tính đặc hiệu được kiểm tra bằng cách tiêm lần lượt dung môi pha mẫu,

dung dịch thử và dung dịch đối chiếu vào hệ thống sắc ký, kết quả cho thấy dung

dịch chuẩn và dung dịch thử tương ứng cho pic có thời gian lưu tương ứng (hình 3.1

và hình 3.2), còn dung môi pha mẫu không cho pic ở các thời gian lưu tương ứng

(hình 3.17).

Bảng 3.2. Một số thông số thể hiện sự phù hợp của hệ HPLC đã lựa chọn

Hợp chất Mangiferin Daucosterol 7-hydroxy

sitosterol Lupeol

Taraxeryl

acetat Stigmasterol Taraxerol

Thời

gian

lưu

(phút)

1 4,420 7,124 9,501 12,110 15,190 18,001 25,091

2 4,424 7,110 9,490 12,154 15,174 17,980 25,060

3 4,426 7,112 9,523 12,145 15,170 18,030 25,051

4 4,418 7,125 9,513 12,124 15,165 18,032 25,035

5 4,409 7,120 9,505 12,131 15,204 18,050 25,016

6 4,412 7,133 9,524 12,151 15,142 18,055 25,025

Trung

bình 4,418 7,121 9,509 12,136 15,174 18,025 25,046

RSD

(%) 0,15 0,12 0,14 0,14 0,13 0,16 0,11

Số đĩa lý

thuyết 32340 24550 43260 34660 23230 35140 22320

Hệ số bất đối 1,12 1,10 1,07 1,07 1,05 1,04 1,11

Hình 3.17. SKĐ của mẫu trắng (dung môi pha mẫu)

- 34 -

3.5.2. Độ lặp lại

Tiêm lặp lại 6 lần với một dung dịch ở nồng độ khảo sát đối với mỗi chất

nghiên cứu vào hệ thống sắc ký để khảo sát độ lặp lại, kết quả thu được ở Bảng 3.3.

Bảng 3.3. Kết quả khảo sát độ lặp lại với các chất nghiên cứu

Hợp chất Diện tích pic (mAU.s) RSD

(%) 1 2 3 4 5 6 Tr.bình

Mangiferin 102310 102218 102105 102387 102089 102434 102257,2 0,14

Daucosterol 42630 42549 42545 42673 42694 42698 42631,5 0,16

7-hydroxysitosterol 17236 17234 17255 17256 17278 17224 17247,2 0,11

Lupeol 57270 57078 57397 57345 57363 57391 57307,3 0,21

Taraxeryl acetat 33400 33397 33349 33456 33321 33367 33381,7 0,14

Stigmasterol 21002 21010 21032 20956 21045 21086 21021,8 0,21

Taraxerol 35301 35328 35335 35278 35254 35225 35286,8 0,12

Nhận xét:

Kết quả khảo sát cho thấy phương pháp HPLC đã chọn có độ chính xác cao

với độ lệch chuẩn tương đối nhỏ.

3.5.3. Khoảng nồng độ tuyến tính

Tiêm dung dịch chuẩn trong khoảng nồng độ khảo sát vào hệ thống sắc ký để

khảo sát độ tuyến tính, kết quả được ghi trong các bảng 3.4-3.10.

Bảng 3.4. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của mangiferin

STT 1 2 3 4 5 6

Nồng độ C (µg/ml) 4,0 8,0 16,1 24,1 32,2 48,2

Diện tích pic (mAU.s) 17064 34100 68010 102310 136010 210217

- 35 -

Phương trình hồi quy xác định được là: S = 4347,28.C – 1456,28

Phương trình đường chuẩn tuyến tính trong khoảng nồng độ khảo sát 4,0 -

48,2µg/ml với hệ số tương quan r là 0,9997.

Bảng 3.5. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của daucosterol

STT 1 2 3 4 5 6

Nồng độ C (µg/ml) 1,7 5,1 13,6 20,4 27,2 34,0


Phương trình hồi quy xác định được là: S=2093,72.C-232,08.

Phương trình đường chuẩn tuyến tính trong khoảng nồng độ khảo sát 1,7 –


S = 4347,28.C - 1456,28

R² = 0,9994

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Diệ

n t

ích

pic

(m

AU

.s)

Nồng độ chất đối chiếu Mangiferin (mcg/ml)

S = 2093,72.C - 232,08

R² = 0,9998

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Diệ

n t

ích

pic

(m

AU

.s)

Nồng độ chất đối chiếu 7α-hydroxysitosterol (mcg/ml)

- 36 -

Bảng 3.6. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của 7-hydroxysitosterol

STT 1 2 3 4 5 6

Nồng độ C (µg/ml) 1,7 5,2 13,8 20,6 27,5 34,4



Phương trình đường chuẩn tuyến tính trong khoảng nồng độ khảo sát 1,7-


Bảng 3.7. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của lupeol

STT 1 2 3 4 5 6

Nồng độ C (µg/ml) 4,5 9,0 17,9 26,9 35,8 44,8


S = 836,28.C - 25,24

R² = 1,0000

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Diệ

n t

ích

pic

(m

AU

.s)

Nồng độ chất đối chiếu 7α-hydroxysitosterol (mcg/ml)

S = 2129,05.C - 31,34

R² = 1,0000

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Diệ

n t

ích

pic

(m

AU

.s)

Nồng độ chất đối chiếu Lupeol (mcg/ml)

- 37 -




Bảng 3.8. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của taraxeryl acetat

STT 1 2 3 4 5 6

Nồng độ C (µg/ml) 6,4 9,5 19,1 25,4 38,2 50,9


Phương trình hồi quy xác định được là: S=1286,10.C+853,84.



Bảng 3.9. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của stigmasterol

STT 1 2 3 4 5 6

Nồng độ C (µg/ml) 3,6 10,9 14,6 21,8 29,1 36,4


S = 1286,10.C + 853,84

R² = 0,9991

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

0 10 20 30 40 50 60

Diệ

n t

ích

pic

S (

mA

U.s

)

Nồng độ chất đối chiếu Taraxeryl acetat (mcg/ml)

- 38 -

Phương trình hồi quy xác định được là: S = 959,80.C+17,58.



Bảng 3.10. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của taraxerol

STT 1 2 3 4 5 6

Nồng độ C (µg/ml) 5,5 8,3 11,0 22,1 33,1 55,2





S = 959,80.C + 17,58

R² = 1,0000

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Diệ

n t

ích

pic

(m

AU

.s)

Nồng độ chất đối chiếu Stigmasterol (mcg/ml)

S = 1602,88.C - 27,29

R² = 1,0000

0

20000

40000

60000

80000

100000

0 10 20 30 40 50 60

Diệ

n t

ích

pic

(m

AU

.s)

Nồng độ chất đối chiếu Taraxerol (mcg/ml)

- 39 -

Nhận xét: Kết quả khảo sát cho thấy có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ

giữa nồng độ chất phân tích và diện tích pic đáp ứng trong khoảng nồng độ khảo sát

đối với các hợp chất nghiên cứu. Kết quả này được sử dụng làm cơ sở để lựa chọn

nồng độ định lượng của các hợp chất nghiên cứu tương ứng.

3.5.4. Độ đúng

Thêm một lượng chính xác dung dịch chuẩn vào dung dịch thử, sao cho tổng

nồng độ sau khi thêm vẫn nằm trong khoảng tuyến tính của phương pháp. Tiến hành

phân tích kết quả sắc ký để khảo sát độ đúng. Kết quả được tổng hợp trong bảng

3.11, chi tiết cho từng chất được thể hiện ở các bảng 3.12 đến bảng 3.18.

Bảng 3.11. Tổng hợp kết quả khảo sát độ đúng của 7 hợp chất

Hợp chất Nồng độ thêm vào

mẫu (μg/ml)

Tỷ lệ thu hồi (%)

Trung bình (min-max)

Mangiferin 6,43 100,69 98,34-102,04

Daucosterol 2,72 101,42 100,58-102,19

7-hydroxy sitosterol 2,75 100,75 100,02-101,76

Lupeol 7,17 100,22 99,54-101,48

Taraxeryl acetat 5,09 100,25 98,85-102,61

Stigmasterol 1,92 101,22 100,28-102,27

Taraxerol 4,42 100,10 99,00-101,84

Bảng 3.12. Kết quả khảo sát độ đúng với mangiferin

TT Smẫu

(mAU.s)

S thêm

(mAU.s)

C cũ

(µg/ml)

C mới

(µg/ml)

C tìm lại

(µg/ml) % tìm lại

1 169480 196595 40,00 46,39 6,39 99,48

2 168431 196245 39,75 46,31 6,56 102,04

3 169540 196346 40,01 46,34 6,33 98,34

4 168650 196355 39,80 46,34 6,54 101,64

5 168896 196546 39,86 46,38 6,52 101,44

6 168565 196145 39,78 46,29 6,51 101,18

C thêm

(µg/ml) 6,43

Trung

bình 100,69

- 40 -

Bảng 3.13. Kết quả khảo sát độ đúng với daucosterol

TT Smẫu

(mAU.s)

S thêm

(mAU.s)

C cũ

(µg/ml)

C mới

(µg/ml)

C tìm lại


1 6194 9070 3,07 4,44 1,37 101,02

2 6170 9034 3,06 4,43 1,37 100,58

3 6125 9012 3,04 4,42 1,38 101,40

4 6156 9045 3,05 4,43 1,38 101,46

5 6243 9153 3,09 4,48 1,39 102,19

6 6162 9062 3,05 4,44 1,39 101,85

C thêm

(µg/ml) 1,36

Trung

bình 101,42

Bảng 3.14. Kết quả khảo sát độ đúng với 7-hydroxysitosterol

TT Smẫu

(mAU.s)

S thêm

(mAU.s)

C cũ

(µg/ml)

C mới

(µg/ml)

C tìm lại


1 3568 5871 4,29 7,04 2,76 100,17

2 3510 5850 4,22 7,02 2,80 101,76

3 3534 5872 4,25 7,04 2,80 101,68

4 3556 5865 4,27 7,04 2,76 100,41

5 3543 5853 4,26 7,02 2,76 100,44

6 3562 5862 4,28 7,03 2,75 100,02

C thêm

(µg/ml) 2,75

Trung

bình 100,75

Bảng 3.15. Kết quả khảo sát độ đúng với lupeol

TT Smẫu

(mAU.s)

S thêm

(mAU.s)

C cũ

(µg/ml)

C mới

(µg/ml)

C tìm lại


1 50552 65841 23,76 30,95 7,19 100,29

2 50367 65542 23,67 30,80 7,14 99,54

3 50454 65672 23,71 30,87 7,16 99,82

4 50356 65665 23,66 30,86 7,20 100,42

5 50243 65453 23,61 30,76 7,15 99,77

6 50562 66032 23,76 31,04 7,27 101,48

C thêm

(µg/ml) 7,17

Trung

bình 100,22

- 41 -

Bảng 3.16. Kết quả khảo sát độ đúng với taraxeryl acetat

TT Smẫu

(mAU.s)

S thêm

(mAU.s)

C cũ

(µg/ml)

C mới

(µg/ml)

C tìm lại


1 24501 31100 18,38 23,51 5,13 100,80

2 24470 30942 18,36 23,39 5,03 98,85

3 24454 31172 18,35 23,57 5,22 102,61

4 24356 30865 18,27 23,33 5,06 99,42

5 24243 30753 18,18 23,24 5,06 99,43

6 24562 31132 18,43 23,54 5,11 100,35

C thêm

(µg/ml) 5,09

Trung

bình 100,25

Bảng 3.17. Kết quả khảo sát độ đúng với stigmasterol

TT Smẫu

(mAU.s)

S thêm

(mAU.s)

C cũ

(µg/ml)

C mới

(µg/ml)

C tìm lại


1 5370 8210 3,69 5,64 1,95 101,59

2 5340 8144 3,67 5,59 1,93 100,28

3 5325 8152 3,66 5,60 1,94 101,11

4 5456 8265 3,75 5,68 1,93 100,46

5 5343 8203 3,67 5,64 1,96 102,27

6 5362 8202 3,68 5,63 1,95 101,58

C thêm

(µg/ml) 1,92

Trung

bình 101,22

Bảng 3.18. Kết quả khảo sát độ đúng với taraxerol

TT Smẫu

(mAU.s)

S thêm

(mAU.s)

C cũ

(µg/ml)

C mới

(µg/ml)

C tìm lại


1 32055 39084 20,02 24,41 4,39 99,30

2 32367 39442 20,22 24,63 4,41 99,94

3 32345 39372 20,20 24,59 4,38 99,26

4 32356 39365 20,21 24,58 4,37 99,00

5 32243 39453 20,14 24,64 4,50 101,84

6 32562 39732 20,34 24,81 4,47 101,28

C thêm

(µg/ml) 4,42

Trung

bình 100,10

Nhận xét: Kết quả khảo sát cho thấy phương pháp phân tích đã lựa chọn cho

tỷ lệ thu hồi cao, có độ đúng tốt.

- 42 -

3.5.5. Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ

Xác định LOD dựa vào tỷ lệ đáp ứng so với nhiễu đường nền (S/N). Việc xác

định tỉ lệ S/N được tiến hành bằng cách so sánh đáp ứng của mẫu trắng từ đó tính

được nồng độ tối thiểu của chất phân tích có thể phát hiện được. Tỷ lệ S/N nằm

giữa 3:1 hoặc 2:1 thường được chấp nhận để thiết lập giới hạn phát hiện. Tỷ lệ S/N

khoảng 10:1 thường được chấp nhận để thiết lập giới hạn định lượng. Kết quả được

ghi trong bảng 3.19.

Bảng 3.19. Kết quả khảo sát LOD và LOQ (µg/ml)

Mangiferin Daucosterol 7-hydroxy

sitosterol Lupeol

Taraxeryl

acetat Stigmasterol Taraxerol

LOD 1,67 0,34 0,33 0,61 1,80 0,32 0,83

LOQ 3,35 0,8 0,96 1,43 4,07 0,91 2,94

Nhận xét:

Kết quả khảo sát cho thấy phương pháp HPLC có độ nhạy cao, giới hạn định

lượng LOQ thấp hơn nồng độ định lượng nhiều lần. Việc xác định LOQ chủ yếu

giúp cho việc phân tích tạp chất.

Nhận xét chung:

Từ những kết quả thẩm định về tính đặc hiệu, khoảng nồng độ tuyến tính, độ

đúng, độ lặp lại của phương pháp định lượng các thành phần trong lá cây Gạo

bằng HPLC thu được ở trên, chúng tôi cho rằng phương pháp này hoàn toàn phù

hợp để xác định hàm lượng của từng thành phần trong lá cây Gạo, phục vụ cho

mục tiêu khai thác nguyên liệu lá Gạo.

- 43 -

3.6. ỨNG DỤNG ĐỊNH LƯỢNG CÁC CHẤT TRONG LÁ CÂY GẠO

Bảng 3.20. Kết quả xác định hàm lượng từng chất trong mẫu dược liệu nghiên cứu

Hợp chất

Khối lượng hợp chất (mg)

Hàm lượng (mg/100g dl)

Có trong cắn đem định

lượng Tương đương trong 0,5 g cắn

Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 Tr.bình

Mangiferin 0,953 0,949 0,944 0,941 0,943 0,939 0,941 8,145

Daucosterol 0,132 0,132 0,131 0,130 0,131 0,131 0,131 1,130

7α-hydroxy

sitosterol 0,108 0,108 0,111 0,106 0,107 0,111 0,108 0,937

Lupeol 0,650 0,667 0,661 0,642 0,662 0,658 0,654 5,660

Taraxeryl

acetat 0,473 0,474 0,477 0,467 0,471 0,475 0,471 4,077

Stigmasterol 0,103 0,106 0,104 0,102 0,105 0,103 0,103 0,895

Taraxerol 0,598 0,595 0,599 0,591 0,592 0,596 0,593 5,133

Lượng cắn cân cho các lần định lượng lần lượt là: 0,5064g; 0,5032g và

0,5022g. Tiến hành song song mẫu thử với mẫu hỗn hợp các chất đối chiếu. Tính

toán lượng từng chất có mẫu thử tương đương với 0,5000g cắn. Tính giá trị trung

bình của 3 lần thử. Từ lượng dược liệu đem chiết và hàm ẩm của nó cùng tổng

lượng cắn thu được tính ra hàm lượng từng chất có trong 100g dược liệu khô. Kết

quả thu được như ở bảng 3.20.

3.7. BÀN LUẬN

3.7.1. Về phương pháp xử lý mẫu

Để định lượng các chất trong cây Gạo đạt kết quả tốt, trước hết cần phải chiết

kiệt hoạt chất và làm sạch dịch chiết. Qua tham khảo các tài liệu, tôi chọn phương

pháp ngâm lạnh với dung môi là methanol. Đây là phương pháp dễ thực hiện trong

điều kiện phòng thí nghiệm, không đòi hỏi trang thiết bị đặc biệt mà lại cho hiệu

suất cao.

3.7.2. Về khảo sát điều kiện sắc ký HPLC

Dựa trên các nghiên cứu trước đây và các tài liệu đã công bố, kết hợp với các

điều kiện có sẵn tôi tiến hành khảo sát các điều kiện sắc ký như đã mô tả ở mục 3.2

- 44 -

và đã xây dựng được chương trình sắc ký trên máy sắc ký lỏng hiệu năng cao. Việc

đánh giá thông qua xác định tính phù hợp của hệ thống sắc ký, khả năng tách pic ra

khỏi chất khác, hình ảnh của pic trên SKĐ và thời gian lưu. Kết quả là các chất

trong HPLC tách hoàn toàn, pic cân đối, thời gian lưu không quá dài. Điều đó

chứng tỏ, các chương trình sắc ký sử dụng trong đề tài là phù hợp để định lượng các

thành phần trong lá cây Gạo.

3.7.3. Về kết quả định lượng các chất trong lá cây Gạo

Từ mẫu lá cây Gạo dùng nghiên cứu chúng tôi xác định được hàm lượng của

7 chất nghiên cứu có trong 100 g lá Gạo khô như sau mangiferin là 8,15mg,

daucosterol là 1,13mg, 7-hydroxysitosterol là 0,94mg, lupeol là 5,66mg, taraxeryl

acetat là 4,08mg, stigmasterol là 0,90mg và taraxerol là 5,13mg.

Cần làm thêm trên số lượng mẫu đủ lớn để có số liệu chính xác hơn về hàm

lượng 7 chất trên có trong lá cây Gạo.

3.7.4. Về thẩm định phương pháp định lượng

Sau khi xây dựng một quy trình phân tích, để áp dụng quy trình vào phân

tích trong thực tế một cách chính xác, cho kết quả tin cậy, cần thẩm định lại phương

pháp theo quy định chung về phân tích định lượng.

Độ chọn lọc: Nhờ có phần mềm xử lý thô, chúng tôi đã ghi lại các pic sắc ký

và chỉ ra là pic các chất thu được trên SKĐ là tinh khiết. Chứng tỏ phương pháp có

độ chọn lọc rất cao.

Khoảng nồng độ tuyến tính: Tiến hành khảo sát các khoảng nồng độ tuyến

tính như trong các bảng 3.4 – 3.10 cho thấy các chất đều có đường hồi quy trong

khoảng nồng độ khảo sát có đường thẳng, phương trình hồi quy có hệ số tương quan

>0,99 chứng tỏ sự tương quan tuyến tính nồng độ của chất và diện tích pic trong

khoảng nồng độ khảo sát.

Độ đúng, độ lặp lại của phương pháp: Đều cho kết quả phù hợp với yêu cầu

thực tế cần phân tích.

- 45 -

Giới hạn định lượng: Với cách chuẩn bị các dung dịch thử trên thì giới hạn

định lượng (LOQ) và giới hạn phát hiện (LOD) đã được trình bày trong bảng 3.19

mục 3.5.5.

Như vậy, chương trình định lượng các chất trong lá cây Gạo bằng phương

pháp HPLC mà tôi xây dựng hoàn toàn đáng tin cậy. Đồng thời phương pháp có ưu

điểm là đơn giản, nhanh chóng, dễ thực hiện, có thể tiết kiệm được thời gian và chi

phí kiểm nghiệm. Hiện nay đa số các Trung tâm kiểm nghiệm dược phẩm, mỹ phẩm

đến các cơ sở sản xuất thuốc đều được trang bị máy HPLC. Vì vậy, kết quả nghiên

cứu của đề tài có thể triển khai và ứng dụng vào thực tế.

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

KẾT LUẬN

Qua thời gian làm khóa luận tốt nghiệp, chúng tôi đã triển khai thực nghiệm

và đã thu được các các kết quả sau:

(1) Đã xây dựng được một phương pháp cho phép định lượng đồng thời 7 hợp

chất trong lá cây Gạo bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với các điều kiện sắc ký cụ

thể như sau:

- Cột: Zorbax C18 (250mm × 4,6 mm; 5 µm), nhiệt độ 25º.

- Pha động: Sử dụng chế độ gradient dung môi với kênh A là acid formic

0,1% trong acetonitril và kênh B là acid formic 0,1% trong methanol. Tốc độ dòng:

1,0 ml/phút.

- Detector PDA bước sóng làm việc 280 nm.

- Thể tích tiêm: 10 μL.

(2) Phương pháp xây dựng đã được thẩm định, kết quả cho thấy các chỉ tiêu

đều đạt yêu cầu, đảm bảo phương pháp có thể áp dụng vào định lượng các chất có

trong lá cây Gạo.

(3) Đã áp dụng phương pháp và xác định đồng thời được hàm lượng của 7 hợp

chất nghiên cứu có trong 100g của 01 mẫu lá Gạo khô cụ thể như sau: mangiferin là

8,15mg, daucosterol là 1,13mg, 7-hydroxysitosterol là 0,94mg, lupeol là 5,66mg,

taraxeryl acetat là 4,08mg, stigmasterol là 0,90mg và taraxerol là 5,13mg.

ĐỀ XUẤT

- Tiếp tục phân lập và tinh chế thêm các hợp chất có trong lá cây Gạo để có

thể tiến hành thiết lập các chất đối chiếu. Đây là công việc rất quan trọng để có thể

- 46 -

cho kết quả xác định hàm lượng các chất trong lá Gạo được chính xác và ổn định

hơn.

- Vì thời gian có hạn, chúng tôi mới chỉ tiến hành phân tích, so sánh trên 01

mẫu lá cây Gạo nên chưa có tính đại diện cao. Do đó, cần mở rộng nghiên cứu,

phân tích ở nhưng mẫu lá cây Gạo khác ở Việt Nam để có số liệu chính xác về hàm

lượng các hợp chất có trong lá cây Gạo.

- Hoàn thiện phương pháp, để có thể góp phần tiêu chuẩn hóa dược liệu cây

Gạo (Bombax malabaricum DC.).

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Trần Tử An (2007), Hóa phân tích II, NXB Y học Hà Nội.

2. Trần Tử An (2007), Kiểm nghiệm dược phẩm, NXB Y học, Hà Nội.

3. Trần Thị Điểm Anh, (2001), Nghiên cứu thành phần hóa học và thử tác dụng

chống viêm của phân đoạn Ethylacetat chiết xuất từ vỏ thân cây Gạo

(Bombax malabaricum DC.), họ Gạo, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại

học, Trường Đại học Dược Hà Nội.

4. Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, NXB Y học, Hà Nội.

5. Đỗ Huy Bích và cs (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập 1,

NXB Khoa học và kỹ thuật Hà Nội, 852.

6. Võ Văn Chi (1996), Từ điển cây thuốc ở Việt Nam, NXB Y học.

7. Võ Văn Chi (2003), Từ điển thực vật thông dụng, NXB Khoa học kỹ thuật, 464-

465.

8. Nguyễn Hoàng Hạt, Nguyễn Công Hào, Nguyễn Cửu Khoa (2010), “Nghiên

cứu thành phần hóa học của cây Mộc ký ngũ hùng Dendrophtoe Pentadra

(L.) MIQ., họ Chùm gửi (Loranthaceae) ký sinh trên cây mít (Artocarpus

Integrifolia) và cây na (Annona Aquamosa)”, Tạp chí hóa học, (4), 48.

9. Bùi Thị Hằng (1991), “Định lượng mangiferin bằng phương pháp sắc ký lỏng

cao áp”, Tạp chí Dược học, (5), 28-29.

10. Phạm Văn Hiền (2007), Bệnh học ngoài da do virus, NXB Y học, Hà Nội

11. Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, quyển II, NXB Trẻ, 513.

12. Hồ Thị Thanh Huyền, Thái Nguyễn Hùng Thu, Nguyễn Thái An (2012), “Phân

lập catechin và momor-cerebrosid I từ vỏ thân cây gạo (Bombax

malabaricum DC.)”, Tạp chí Dược học, 12/2012 (440), 49-52.

13. Hồ Thị Thanh Huyền, Thái Nguyễn Hùng Thu, Nguyễn Thái An (2013), “Phân

lập lupeol và stigmasterol từ vỏ thân cây gạo (Bombax malabaricum DC.)”,

Tạp chí Dược học, 3/2013 (443), 14-18.

14. Đoàn Thị Mai Hương, Phạm Văn Cường, Nguyễn Văn Hùng, Marc Litaudon

(2009), “Nghiên cứu thành phần hóa học thân cây Thàn mát thùy dày

(Millettia Pachylobadrake – Leguminosae)”, Tạp chí Hóa học, 47(6B),

209-212.

15. Đỗ Tất Lợi (2004), Cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, 545.

16. Phạm Luận, (2000), Cơ sở lý thuyết sắc ký lỏng hiệu năng cao, Khoa Hóa Học,

Trường ĐHKHTN Hà Nội.

17. Nguyễn Hải Ngọc (2012), Chiết xuất, phân lập một số thành phần từ lá cây

Gạo, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học, Trường Đại học Dược Hà Nội.

18. Nguyễn Thị Thúy (2011), Nghiên cứu đặc điểm vi học và thành phần hoá học

của lá cây gạo (Bombax malabaricum DC.), họ gạo (Bombacaceae), Khóa

luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học, Trường Đại học Dược Hà Nội.

19. Viện Dược liệu – Bộ Y tế (2009), Cây thuốc Nghệ An, NXB Sở thông tin và

truyền thông Nghệ An, 354.

20. Viện Dược liệu (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Quyển I,

NXB Khoa học kỹ thuật, 852-853.

Tiếng Anh

21. Agrawal GD, Rizvi SA, Gupta PC, Tewari JD (1972), “Study of a

polysaccharide from the stamens of Bombax malabaricum flowers”, Planta

Med, 21(3), 293-303.

22. Chelvan PT. (1998), “Traditional phytotherapy among the migrant Tamilian

settlers in South Gujarat”, Biojournal, 10, 9-14

23. Dar A, Faizi S, Naqvi S, Roome T, Zikr-ur-Rehman S, Ali M, Firdous S, Moin

ST (2005), “Analgestic and antioxidant activity of Mangiferin and its

derivatives: the structure activity relationship”, Biol Pharm Bull, 28(4),

596-600.

24. David R. Lide (2007), CRC Handbook of Chemistry and Physics 8th

Edition

2007-2008, CRC Press, Taylor & Francis, Boca Raton.

25. Dhar DN, Munjal RC. (1976), “Chemical examination of the seeds of Bombax

malabaricum”, Planta Med, 29(2), 148-150.

26. Dong Sheng Ming, Emma S. Guns, Andy Eberding, G.H. Neil Towers (2004),

“Isolation and Characterization of Compounds with Anti-prostate Cancer

Activity from Arctium lappa L. Using Bioactivity-guided Fractionation”,

Pharmaceutical Biology, Vol 42(1), 44–48.

27. En-Ji Cui, Ji-Hae Park, Hee-Jung Park, In-Sik Chung, Ji-Young Kim, Seung-

Woo Yeon, and Nam-In Baek (2011), “Isolation of Sterols from Cowpea

(Vigna sinensis) Seeds and Their Promotion Activity on HO-1”, J. Korean

Soc. Appl. Biol. Chem., 54(3), 362-366.

28. Faizi S. et al (1999), “Shamimin: a new flavonol C-glycoside from leaves of

Bombax ceiba”, Planta Med, 65(4), 383-385.

29. Hossain E. et al (2011), “Larvicidal activity of Dregea volubilis and Bombax

malabaricum leaf extracts against the filarial vector Culex

quinquefasciatus”, Asian Pac J Trop Med, 4(6), 436-441.

30. Ignacio Hernández-Chávez, Luis W. Torres-Tapia, Paulino Simá-Polanco,

Roberto Cedillo-Rivera, Rosa Moo-Puc and Sergio R. Peraza-Sánchez

(2012), “Antigiardial Activity of Cupania dentata Bark and its

Constituents”, J. Mex. Chem. Soc., 56(2), 105-108.

31. Jain V. et al (2009), “Myths, traditional and fate of multipose Bombax ceiba L.

– An appraisal”, Indian Journal of traditional knowledge, Vol. 8(4), 638-

644.

32. Jain V. et al (2012), Pharmacology of Bombax ceiba Linn., Springer.

33. Jin-Hee Lee, Dong-Hyun Kim, Myun-Ho Bang, Hye-Joung Yang, Sung-Hoon

Bang (2005), “Isolation of Sterols from the Methanol Extracts of

Cymbidium goeringii REICHB. Fil”, J. Korean Soc. Appl. Biol. Chem.,

48(3), 263-266.

34. Jue-Hee Lee, Ju Young Lee, Ji Hye Park, Hye Sil Jung, Ju Sun Kim, Sam Sik

Kang, Yeong Shik Kim, Yongmoon Han (2007), “Immunoregulatory

activity by daucosterol, a β-sitosterol glycoside, induces protective Th1

immune response against disseminated Candidiasis in mice”, Vaccine, (25),

3834–3840.

35. M Careri, L Elviri, A Mangia (2001), “Liquid chromatography–UV

determination and liquid chromatography–atmospheric pressure chemical

ionization mass spectrometric characterization of sitosterol and stigmasterol

in soybean oil”, Journal of Chromatography A, 935(1–2), 249–257.

36. Margareth B. C. Gallo, Miranda J. Sarachine (2009), “Biological Activities of

Lupeol”, International Journal of Biomedical and Pharmaceutical

Sciences, 3(1), 46-66.

37. Mark Sacchetti, Ph.D., Anne C. Schuelke, Edmund J. Elder, Jr., Ph.D., R.Ph.,

Karen J. Jones, M.S., Jeremy J. Johnson, Pharm.D., Ph.D. (2011),

Physicochemical Characterization of Lupeol and Development of a

Preclinical Formulation for Oral Administration, Lenor Zeeh

Pharmaceutical Experiment Station, School of Pharmacy, University of

Wisconsin – Madison, Chicago.

38. Mohammed Rahmatullah, Md. Rezwanul Haque., Sarder Kamrul Islam,

Farhana Jarnal, A.B.M. Anwarul Bashar, Rasheda Ahmed, Ishtiaq Ahmed,

Rownak Jahan, Shamima Absan, Maieedul H. Chowdhury (2010), “A

survey of the Use of Medicinal Plants by Folk Medicinal Practitioners in

Three Areas of Pirojpur District, Bangladesh”, American-Eurasian Journal

of Sustainable Agriculture, 4(2), 247-259.

39. Mohammad Saleem (2009), “Lupeol, A Novel Anti-inflammatory and Anti-

cancer Dietary Triterpene”, Cancer Lett., 285(2), 109–115.

40. Moreau R.A. (2002), “Phytosterols, phytostanols, and their conjugates in foods:

structural diversity, quantitative analysis, and health-promoting uses”, Prog

Lipid Res, 41(6), 457-500.

41. Nasim Sultana, A. J. Afolayan (2007), “A novel daucosterol derivative and

antibacterial activity of compounds from Arctotis arctotoides”, Natural

Product Research: Formerly Natural Product Letters, Vol 21(10), 889-896.

42. Padmanabhan P Nair, NabilaTurjman, GeorgeKessie, BeverlyCalkins, Gordon

T Goodman, Helene Davidovitz, and Geetha Nimmagadd (1984), “Diet,

nutrition intake, and metabolismin,Populations at high and low risk for

colon cancer Dietary cholesterol,f3-sitosterol,and stigmasterol”, The

American Journal of Clinical Nutrition, 40(4), 927-930.

43. Richard E. Ostlund Jr (2007), “Phytosterols, Cholesterol Absorption and

HealthyDiets”, Lipids, 42(1), 41-45.

44. Saleem R. et al (1999), “Hypotensive, hypoglycaemic and toxicological studies

on the flavonol C-glycoside shamimin from Bombax ceiba”, Planta Med,

65(4), 331-334.

45. Shaahat AA, Hassan RA, Nazif NM, Van Miert S, Pueters L, Hammuda FM,

Vlietinck AJ (2003), “Isolation of mangiferin from Bombax malabaricum

and structure revision of shamimin”, Planta Med, 69(11), 1068-1070.

46. Sundararaman P, Djerassi C. (1977), "A convenient synthesis of progesterone

from stigmasterol", J Org Chem., 42(22), 3633–3634.

47. Toshihiro Miura, Hiroyuki Ichiki, Itsuko Hashimoto, Naoki Iwamoto, Motoshi

Kato, Masayoshi Kubo, Eriko Ishihara, Yasuhiro Komatsu, Minoru Okada,

Torao Ishida and Tanigawa (2001), “Antidiabetic activity of a xanthone

compound, mangiferin”, Phytomedicine, Vol. 8(2), 85–87.

48. Vartika Jain, Surendra K. Verma (2012), Pharmacology of Bombax ceiba

Linn., SpringerBriefs in Pharmacology and Toxicology.

49. Venkata Sai Prakash Chaturvedula, Indra Prakash (2012), “Isolation of

Stigmasterol and β-Sitosterol from the dichloromethane extract of Rubus

suavissimus”, Chaturvedula and Prakash, International Current

Pharmaceutical Journal, 1(9), 239-242.

50. Young-Jae You, Nguyen Hai Nam, Yong Kim, Ki-Hwan Bae and Byung-Zun

Ahn(2003), “Antiangiogenic Activitiy of Lupeol from Bombax ceiba”,

Phytother Res., 17(4), 341-344.

51. Zheng MS, Lu ZY (1990), “Antiviral effect of mangiferin and isomangiferin on

herpes simplex virus”, Chinese Medical Journal, 103(2), 160.

52. Zhong Xi Yi Jie He Xue Bao (2011), “Effects of taraxerol and taraxeryl acetate

on cell cycle and apoptosis of human gastric epithelial cell line AGS”,

Journal of Chinese Integrative Medicine, 9(6), 638.

53. ZUO Xu, DAI Xian-zhi, ZHANG Ji-zhong, LIU Yuan (2012), “Content

determination of Daucosterol in roots, stems and leaves of wild Plumbago

zeylanica L. by RP-HPLC-ELSD”, Medicinal Plant 2012, 3(6), 14-15, 18.

Tài liệu khác

54. http://www.drugfuture.com/chemdata/taraxerol.html

http://www.drugfuture.com/chemdata/taraxerol.html

PHỤ LỤC

Sắc ký đồ của mẫu thử và 7 hợp chất nghiên cứu

(1) Mẫu thử

(2) Mangiferin

(3) Daucosterol

(4) 7α-hydroxysitosterol

(5) Lupeol

(6) Taraxeryl acetat

(7) Stigmasterol

(8) Taraxerol

Documents

Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng một số chất phân lập được từ lá cây gạo.pdf