B GIÁO DC VÀ ÀO TO VIN HÀN LÂM KHOA HC VÀ CÔNG NGH VIT NAM
HC VIN KHOA HC VÀ CÔNG NGH -----------------------------
Hoàng Th Ngc Ánh
THIÊN NHIÊN T CÂY I HOÀNG
LUN VN THC S: HÓA HC
Hà Ni, 2021
Li cam oan
Lun vn này là công trình nghiên cu ca tôi di s hng dn khoa hc
ca TS.DS. Phm Ngc Khanh và TS. Ng Trng Nhân.
Các s liu và kt qu trong lun vn là trung thc.
Tác gi lun vn
Hoàng Th Ngc Ánh
Li cm n
u tiên, tôi xin bày t lòng bit n chân thành và sâu sc ti TS.DS. Phm
Ngc Khanh và TS. Ng Trng Nhân, ngi cô, ngi thy bng c tâm huyt
ca mình ã hng dn và giúp tôi trong sut quá trình hoàn thin lun vn.
Tôi xin gi li cm n chân thành ti Ban lãnh o Vin Hóa hc các Hp
cht thiên nhiên (VAST), GS.TS. Nguyn Mnh Cng và các anh ch - phòng
Hot cht sinh hc- Vin Hóa hc các hp cht thiên nhiên ã giúp tôi v c s
vt cht, trang thit b, dng c thí nghim, các kin thc thc nghim… tôi
hoàn thành tt lun vn ca mình.
Tôi xin chân thành cm n Ban lãnh o và các thy cô trong Hc Vin
Khoa hc và Công ngh và Khoa Hóa hc ã ging dy, h tr, to mi iu kin
thun li cho tôi trong sut quá trình hc tp và thc hin lun vn.
Tôi xin gi li tri ân ca mình ti gia ình, bn bè, nhng ngi thân luôn
ng viên tôi có ng lc trong công vic và hoàn thành tt lun vn này.
Xin chân thành cm n!
iii
Kí hiu Ting anh Ting vit
TLC Thin-Layer Chromatography Sc ký lp mng
CC Column Chromatography Sc ký ct di trng lc
dung môi
proton
Resonance
cacbon 13
NO Nitric oxide inhibition
TNF- tumor necrosis factor
IL-6 interleukin-6
IC50 Inhibitory concentration 50% Nng c ch ti thiu 50%
iv
Danh mc bng
Bng 1.1. Các hp cht anthraquinon phân lp t chi i hoàng ........................ 5
Bng 1.2: Các hp cht anthron phân lp t chi i hoàng .................................. 9
Bng 1.3: Các hp cht stilben phân lp t chi i hoàng................................. 12
Bng 1.4: Các flavonoid phân lp t chi i hoàng ........................................... 18
Bng 1.5: Các hp cht acylglucoside phân lp t chi i hoàng ..................... 22
Bng 2.1: Các amino axit trong vùng hot ng ca protein ............................. 36
Bng 3.2: D kin ph ca hp cht MC566 so sánh vi tài liu tham kho .... 43
Bng 3.4: ánh giá tiêu chí ging thuc ca các hp cht nghiên cu .............. 48
Bng 3.5: Tính toán nng lng liên kt t do ca 3 hp cht vi hai protein
1ALU và 2AZ5 .................................................................................................... 50
Bng 3.6: Các amino axit tham gia tng tác ca 3 hp cht phân lp c vi
hai protein 1ALU và 2AZ5 ................................................................................. 51
Bng 3.7: Kh nng c ch sn sinh NO ca các cht phân lp c ............... 53
v
Danh mc hình
Hình 1.1: Mt s hình nh ca chi i hoàng – Rheum L ................................... 4
Hình 1.2: Cu trúc các anthraquinon phân lp t chi i hoàng ......................... 5
Hình 1.3: Cu trúc các anthron phân lp t chi i hoàng .................................. 8
Hình 1.4. Cu trúc các stilben phân lp t chi i hoàng .................................. 10
Hình 1.5 Cu trúc các flavonoid phân lp t chi i hoàng .............................. 15
Hình 1.6. Cu trúc các acylglucoside phân lp c t chi i hoàng ............. 21
Hình 2.1: Mu tiêu bn ca thân r cây i hoàng ............................................ 30
Hình 2.2: S chit tách mu i hoàng ......................................................... 38
Hình 3.1: Cu trúc các phi t ã c ti u ca các cht nghiên cu ........... 46
Hình 3.2: Cu trúc hai protein ã c ti u hóa ............................................. 49
vi
Danh mc bng ................................................................................................... iv
Danh mc hình .................................................................................................... v
1.1. GII THIU V CHI I HOÀNG – RHEUM L. ...................................... 3
1.1.1. Phân loi ...................................................................................................... 3
1.1.3. Phân b và thu hái ....................................................................................... 4
1.1.4. Thành phn hóa hc .................................................................................... 4
1.1.4.1. Anthraquinon ............................................................................................ 5
1.1.4.2. Anthron ..................................................................................................... 8
1.1.4.3. Stilben ..................................................................................................... 10
1.1.4.4. Flavonoid ................................................................................................ 15
1.1.4.5. Acylglucoside ......................................................................................... 21
1.1.5. Các nghiên cu v hot tính sinh hc ....................................................... 22
1.1.5.1. Tác dng nhun tràng ............................................................................. 22
1.1.5.2. Tác dng kháng ung th ........................................................................ 23
1.1.5.3. Tác dng kháng viêm và gim au ........................................................ 23
1.1.5.4. Tác dng bo v gan............................................................................... 24
1.2. GII THIU V LOÀI RHEUM OFFICINALE BAILL. ........................... 24
vii
1.2.2. Phân b ...................................................................................................... 25
1.3. GII THIU V LNH VC DOCKING PHÂN T ................................ 26
1.3.1. Docking phân t ........................................................................................ 26
1.3.2. Các ích nghiên cu tác dng kháng viêm ............................................... 27
1.3.3. Các tiêu chí ging thuc ca các hp cht ................................................ 29
CHNG 2. NGUYÊN LIU, PHNG PHÁP NGHIÊN CU VÀ THC
NGHIM ............................................................................................................ 30
2.2.2. Nghiên cu thành phn hóa hc ............................................................... 31
2.2.3. Nghiên cu v kh nng kháng viêm ........................................................ 31
2.2.4. Phng pháp docking phân t ................................................................... 34
2.2.5. Mô t tin trình thí nghim docking ......................................................... 35
2.2.5.1. X lý cu trúc phi t............................................................................. 35
2.2.5.3. Xác nh vùng hat ng ca protein .................................................... 35
2.2.5.4. Mô phng tng tác phân t bng Autodock 4.2.6 ............................... 36
2.3. THC NGHIM .......................................................................................... 36
2.3.2. X lý mu thc vt và chit tách ............................................................... 36
2.3.3. Tính cht vt lý và d liu ph ca các hp cht phân lp c .............. 38
viii
CHNG 3: KT QU VÀ THO LUN ................................................... 40
3.1. KT QU XÁC NH CU TRÚC CÁC HP CHT SCH T CÂY I
HOÀNG ............................................................................................................... 40
3.1.2. Cu trúc ca hp cht MC566 .................................................................. 42
3.1.3. Cu trúc ca hp cht MC567 ................................................................... 44
3.2. ÁNH GIÁ TIM NNG KHÁNG VIÊM CA CÁC HP CHT S
DNG PHNG PHÁP DOCKING PHÂN T .............................................. 46
3.2.1. Ti u hóa cu trúc hp cht nghiên cu .................................................. 46
3.2.2. ánh giá các tiêu chí ging thuc ca các hp cht nghiên cu .............. 48
3.2.3. X lý ti u hóa cu trúc protein nghiên cu ........................................... 49
3.3.4. Kt qu mô phng tng tác ..................................................................... 50
3.3. HOT TÍNH C CH S SN SINH NO CA CÁC HP CHT C
PHÂN LP .......................................................................................................... 52
TÀI LIU THAM KHO ................................................................................ 56
1
M U
Viêm là mt áp ng sinh hc phc tp ca c th khi có các tác nhân gây
bnh xâm nhp nh vi khun, vi rút hoc các yu t kích thích nh vt lý, hóa
hc. V bn cht viêm là mt phn ng t bo v ca c th tuy nhiên nu quá
trình viêm din ra trng k, theo chiu hng mt kim soát s dn n nhiu
bnh lý mn tính nh viêm khp, bnh tim mch, huyt áp, ung th, tiu ng,
ri lon hot ng thn kinh nh bnh Parkinson, Alzheimer’s. Các phát hin trên
da trên các th nghim c ch các cht trung gian gây viêm nh là các cytokine
(IL-1α, IL-6, IL-12), TNF -α, yu t phiên mã NF-kB và các enzym COX-1,
COX-2, COX-3, NOS).
Gn ây virut SARS-CoV-2 gây ra i dch toàn cu có tên là COVID-19.
Các nghiên cu dch t trên ngi nhim virus ã ch ra mi liên h quan trng
gia s tin trin ca bnh viêm phi cp tính vi du hiu c th b cn bão viêm,
dn n các phn ng min dch quá mn ca c th và cui cùng là gây t vong.
Vì vy, vic nghiên cu tác dng kháng viêm ca các hot cht, các cây thuc
ang là mt trong nhng hng nghiên cu c y mnh c trong nc và trên
th gii nhm tìm kim nhng bin pháp hu hiu phòng và iu tr bnh virut
COVID-19.
T thi xa xa, ngi ta ã phát hin rt nhiu các cây thuc và bài thuc
iu tr các bnh viêm nhim ã c s dng nhiu trong nn y hc c truyn
trên th gii. Nhiu dng hp cht thiên nhiên khác nhau ã c phát hin có tác
dng kháng viêm, ví d nh các hp cht phenolic, flavonoid và c bit là các
hp cht khung anthraquinon nh rubiadin-3-methyl ether, aloe-emodin,
morindone và nhiu hp cht khác.
Trong s các cây thuc ca Vit Nam, cây i hoàng là mt trong cây ã
c s dng iu tr các bnh viêm nhim trong dân gian và có thành phn hóa
hc chính là các hp cht anthraquinon. Vì vy, chúng tôi la chn tài “Nghiên
cu, xác nh cu trúc và ánh giá hot tính kháng viêm ca mt s hp cht thiên
nhiên t cây i hoàng” vi mc ích tìm kim các hp cht kháng viêm tim
nng t cây i hoàng, nh hng trong phát trin phòng bnh COVID-19 trong
tng lai.
2
tài t ra mc tiêu nghiên cu là nghiên cu thành phn hóa hc và tác
dng kháng viêm ca cây i Hoàng, vi các ni dung nghiên cu c th là:
- Phân lp các cht tinh khit t cây i hoàng (Rheum officinale Baill.).
- Xác nh cu trúc các cht phân lp c.
- ánh giá kh nng kháng viêm ca các cht phân lp bng in silico.
- ánh giá tác dng kháng viêm qua phép th c ch sn sinh NO in vitro ca các
cht phân lp c.
1.1.1. Phân loi
Các loài thuc chi Rheum L. (i hoàng) là nhng cây thân tho lâu nm,
phân b các vùng ôn i và cn nhit i. Theo c s d liu The Plant List
(plantlist.com) chi i hoàng có n 121 tên gi trong ó có 44 tên c chp
nhn. Trung Quc là nc có s lng loài i hoàng phân b nhiu chim
khong 3/4 s chi. Chi i hoàng ch yu c tìm thy các khu vc Tây Bc
và Tây Nam ca Trung Quc [1].
V thuc i hoàng (Rhubarb) n bao gm các loài là R. emodi và R.
webbianum, R. moorcroftianum và R. spiciforme [2]. Trong khi ó Nht Bn
ch yu gm Rheum tangutium Max., R. coreanum Nakai, R. palmatum L., và R.
officinale Baill. hoc các loài lai gia chúng [3].
Theo tác gi Phm Hoàng H mô t trong quyn Cây c Vit Nam, i
Hoàng có 4 loài gm: R. palmatum L., R. tanguticum Maxim. ex Regel., R.
officinale Baill. và R. rhaponticum [4]. Theo tác gi Võ Vn Chi trong quyn t
in cây thuc Vit Nam, i hoàng gm R. officinale Baill. và R. palmatum L.
[5].
1.1.2. c im hình thái
Chi i hoàng gm các loài thân tho sng lâu nm, r dài thng phình to dng
c, thân thng rng, có rãnh, nhn hoc có lông, lá n, có mép lá dng ln
sóng, rng ca hay x thùy chân vt. Nhng lá phía di tha, dày, hoc xp hình
hoa th, ln hn nhng lá phía trên, b lá thng ln; dng màng mép thng
nguyên. Hoa mc thành chùm n hoc chùm kép, thng hình chùy, hình cu
hoc hình bông, cung hoa có t, hoa lng tính hoc n tính cùng gc. Bao
hoa sng dai, lá ài 6. Nh thng 9 (6 + 3), him khi 7 hoc 8. Nhy ngn, 3 ô
nm ngang; u nhy phình to, mép un ngc xung. Qu b ba cnh, có cánh
[6].
4
Hình 1.1: Mt s hình nh ca chi i hoàng – Rheum L
R. officinale R. palmatum L R. tanguticum
1.1.3. Phân b và thu hái
Cây có ngun gc Trung Quc c dùng t lâu i và dn dn thâm
nhp vào châu Âu. Trung Quc cây mc hoang hoc trng Cam Túc, Thanh
Hi, T Xuyên. i hoàng mc tnh T xuyên c chung và c gi là
Xuyên i hoàng. Hin nay i hoàng cng ã c di nhp trng nhiu nc
nh: Hà Lan, Pháp, M, Nht, Nga, Vit Nam.
Cây a mc khí hu mát, m, cao trên 1000m. Ngi ta thu hoch
thân r ca nhmg cây ã mc trên 3-4 nm ( nhng vùng có cây mc hoang thì
có th 6 – 10 nm) vào mùa thu, khi cây bt u li. Thân r ti to có th có
chiu dài 20-30cm, rng 8-10cm, có nhiu nhánh r hình tr ng kính 2-3cm.
Sau khi ào v thì ct b r, còn thân r em gt b v ngoài, b nh (dc hoc
ngang) ri phi hoc sy khô. Ct gi sau mt nm mi dùng [7].
1.1.4. Thành phn hóa hc
Trên th gii, các nhà khoa hc ã phân lp và xác nh cu trúc nhiu hp
cht t cây i hoàng. Cho n nm 2013, có khong 200 hp cht ch yu thuc
sáu b khung (anthraquinon, anthrone, stilben, flavonoid, acylglucosid và pyrone)
ã c phân lp t mi tám loài thuc chi Rheum L. [8].
5
1.1.4.1. Anthraquinon
Anthraquinon là mt thành phn quan trng trong cây i hoàng. Các
anthraquinon nh rhein, emodin, physcion, và chrysophanol, có mt trong gn
nh tt c các loài Rheum L.[8]. ã có 31 hp cht anthraquinon c phân lp
t chi Rheum L. và hu ht trong s ó cho thy tác dng dc lý tt.
Hình 1.2: Cu trúc các anthraquinon phân lp t chi i hoàng
1 R1R8OH R2R4R5R7H R3CH3 16 R1OGlc R2R4R5R7H R3CH3 R6R8OH
2 R1R8OH R2R4R5R7H R3CH3 R6OCH3 17 R1R8OH R2R4R5R7H R3CH3 R6OGlc
3 R1R6R8OH R2R4R5R7H R3CH3 18 R1OH R2R4R5R6R7H R3CH3 R8OGlc
4 R1R8OH R2R4R5R6R7H R3CH2OH 19 R1OH R2R4R5R7H R3CH3 R6OSO3H R8
OGlc
5 R1R8OH R2R4R5R7H R3COOH 20 R1R6OH R2R4R5R7H R3CH3 R8OGlc-Glc
6 R1R2R5R8H R3R4R6OH R7CH3 21 R1R8OH R2R4R5R7H R3CH2OH R6CH3
7 R1CH3 R2COOH R3R6R8OH R4R5R7H 22 R1OGlc R2R4R5R6R7H R3CH2OH R8OH
8 R1R3R8OH R2R4R5R7H R6CH2OH 23 R1OH R2R4R5R6R7H R3CH2OH R8OGlc
9 R1R8OH R2R4R5R7H R3CH3 R6OH 24 R1R8OH R2R4R5R6R7H R3CH2OGlc
10 R1OH R2R4R5R6R7H R3CH3 R8OCH3 25 R1R8OH R2R4R5R7H R3COOH R6CH33
11 R1OGlc R2R4R5R7H R3CH3 R8OH 26 R1OH R2R4R5R6R7H R3COOH R8OGlc
12 R1OH R2R4R5R6R7H R3CH3 R8OGlc 27 R1OGlc R2R4R5R7H R3CH3 R6OCH3 R8OH
13 R1OH R2R4R5R6R7H R3CH3 R8OGlc-G 28 R1OH R2R4R5R7H R3CH3 R6OCH3 R8OGlc
14 R1OH R2R4R5R6R7H R3CH3 R8OGlc-B 29 R1OH R2R4R5R7H R3CH3 R6OCH3 R8
OGlc-Glc
15 R1OH R2R4R5R6R7H R3CH3 R8OGlc-A 30 R1OH R2R4R5R6R7H R3COOH R8OA
31 R1CH3 R2COOH R3OB R4R5R6R7H R8OH
Bng 1.1. Các hp cht anthraquinon phân lp t chi i hoàng
STT Tên hp cht Ngun thc vt
6
1 Chrysophanol a, b, c, d, e, g, h, i, j, k,
l, m, n, o
2 Physcion a, b, c, d, e, f, g, i, k, l,
m, n, o
3 Emodin a, b, c, d, e, f g, h, i, j,
k, l, m, n, o
4 Aloe-emodin a, b, c, f, h, k, l, m, n,
o
6 Chrysaron q
9 Revandchinone-3 d
10 Chrysophanol-8-Metylether l
11 Chrysophanol-1-O-β-D-Glccopyranoside a, c, h, j
12 Chrysophanol-8-O-β-D-glucopyranoside a, b, c, d, e, g, h, l, k, n
13 Chrysophanol-8-O-β-D-(6′-O-galloyl)-
19 Emodin-8-O-β-D-glucopyranosyl-6-O-sulfate d
20 Emodin-gentiobioside e
21 6-methyl-aloe-emodin d
22 Aloe-emodin-1-O-β-D-glucopyranoside n
24 Aloe-emodin-3-(hydroxymethyl)-O-β-D
29 Physcion-8-O-β-D-gentiobioside c
glucopyranoside
a
a
Chú ý: a: R. palmatum; b: R. tanguticum; c: R. officinale; d: R. emodi; e: R. nanum; f: R.
qinjingense; g: R. wittrochii; h: R. hotaoense; i: R. sublanceolatum; j: R. rhizastachyum; k: R.
uninrrre; l: R. glabrucaule; m: R. franzenbachil; n: R. undulatum; o: R. Spiciforme; q: R.
rhaponticum; r: Shin-Shu Daio (loài cha xác nh gia R. coreanum và R. palmatum)
8
1.1.4.2. Anthron
Cho n nay có khong 26 Anthron ã c phân lp t chi i hoàng
(Hp cht 32-57).
Hình 1.3: Cu trúc các anthron phân lp t chi i hoàng
32. R1 = R2 = Glc R3= OH R4 = H
33. R1 = R3 = Glc R2= OH R4 = H
34. R1 = R2= H R3= R4 = Glc
35. R1 = R2= Glc R3= R4 = H
36. R1 = R3= Glc R2= R4 = H
37. R1 = R4= H R2= OH R3 = Glc
38. R1 = R2= Glc R2= OH R4 = H
39. R1 = R3= Glc R2= OH R4 = H
40. R1 = R3= Glc R2= R4 = H
41. R1 = R3= Glc R2= R4 = H
42. R1=COOH R2=H 10-10’ trans
43. R1=COOH R2=H 10-10’ meso
44. R1=CH2OH R2=H 10-10’ trans
45. R1=CH2OH R2=H 10-10’ meso
46. R1=COOH R2 =Oxalyl 10-10’ trans
47. R1=COOH R2 =Oxalyl 10-10’ meso
48. R1=CH3 R2=CH2OH R3=OH
49. R1=CH3 R2=CH2OH R3=H
50. R1=CH3 R2=CH3 R3=OH
51. R1=CH3 R2=COOH R3=OH
55. R1=OCH3 R2=H R3=CH3 R4=OCO(CH2)7CH3
56. R1=R2=H R3=CH3 R4= OCO(CH2)26CH3
57. R1=R2=OH R3=CH2OH R4= OCO(CH2)16CH3
9
Bng 1.2: Các hp cht anthron phân lp t chi i hoàng
STT Tên hp cht Ngun thc vt
32 10-hydroxycascaroside C d
33 10-hydroxycascaroside D d
34 10R-chrysaloin 1-O-β-D-glucopyranoside d
35 Cascaroside C d
36 Cascaroside D d
10
1.1.4.3. Stilben
Có 35 hp cht stilben ã c phân lp t chi i hoàng (Hp cht 54-92).
Hình 1.4. Cu trúc các stilben phân lp t chi i hoàng
58 R1= CH3 R2= OH
59 R1= H R2= OH
65 R1 = R2 = R3= R4=H
66 R1=G R2=H R3=CH3 R4=OH
11
63 R1= Glc-G R2-H
68 R1= G R2=H R3 = CH3 R4=OH
69 R1= H R2=G R3=CH3 R4 = OH
70 R1=H R2= p- coum R3 = CH3 R4=OH
71 R1 =R2=R4=H R3=CH3
72 R1= R2=R3 = H, R4=OCH3
73 R1 =R2=R4=H R3=CH3
74 R1=G R2=R4=H R3=CH3
75 R1=R2=H R3=Glc R4=O
76 R1= OCH3 R2-H
79
83 R1=OH R2=G R3= H
84 R1=R3=H R2=p-coum
85 R1=R2=H R3=G
86 R1=OH R2= R3=H
87 R1=OH R2=G R3=H
88 R1=R2=R3=H
89 R1=OH R2=H R3=G
90
91
92
Bng 1.3: Các hp cht stilben phân lp t chi i hoàng
STT Tên hp cht Ngun
13
n, y
61 Resveratrol g, k
63 Resveratrol 4′-O-β-D-(6′′-O-galloyl)-glucopyranoside b
64 5-[(Z)-2-(3-Hydroxy-4-methoxyphenyl)ethenyl]benzene-1,3-
70 Rhaponticin 2′′-p-coumarate y
71 Desoxyrhaponticin c, d, g,
m, n, y
72 Isorhapontin n
14
77 Piceatannol 3′-O-β-D-glucopyranoside h, m, n,
y
79 Piceatannol 3′-O-β-D-xylopyranoside y
80 3,4′,5-trihydroxystlbene-4′-O-β-D-glucopyranoside a, b, c
81 3,4′,5-trihydroxystlbene-4′-O-β-D-(6′′-O-galloyl)
glucopyranoside a, b, c, y
82 Piceatannol 4′-O-β-D-glucopyranoside d, h, o
83 Piceatannol 4′-O-(6′′-O-galloyl) β-D-glucopyranoside o
84 Piceatannol 4′-O-(6′′-p-coumaroyl) β-D-glucopyranoside d
85 3,4′,5-trihydroxystlbene-4′-O-β-D-(2′′-O-galloyl)
glucopyranoside o
glucopyranoside y
glucopyranoside y
89 3,3′,5-trihydroxy-4′-methoxystilbene 3-O-β-D-(2′′-O-galloyl)
glucopyranoside y
15
Chú ý: a: R. palmatum; b: R. tanguticum; c: R. officinale; d: R. emodi; e: R.
nanum; g: R. wittrochii; h: R. hotaoense; m: R. franzenbachil; n: R. undulatum;
o: R. Spiciforme; x: R. palaestinum; y: commercial rhubarbs (Rheum
rhabarbarum)
1.1.4.4. Flavonoid
Các hp cht flavonoid (Hp cht 93-137) phân lp c t chi i hoàng
c trình bày trong hình 1.5.
Hình 1.5 Cu trúc các flavonoid phân lp t chi i hoàng
93. R1R2R3R4R6OH R5R7H
94. R1R2R3R6OH R4O-Glc R5R7H
95. R1R2R3R4OH R5R7H R6O-Glc
96. R1O-Glc R2R3R4R6OH R5R7H
97. R1R3R4R6OH R2O-Glc R5R7H
98. R1R6O-Glc R2R3R4OH R5R7H
99. R1R4O-Glc R2R3R6OH R5R7H
100. R1R3R6OH R2R4O-Glc R5R7H
101. R1R2O-Glc R3R4R6OH R5R7H
102. R1R2R3R6OH R5H R7-Glc
103. R1R2R3R4R6OH R5Glc R7H
106. R1R3OH R2R4R6H R5β-OH R7Glc R8α-OH
107. R1R3OH R2R4R7H R5β-OH R6Glc R8α-OH
108. R1OH R2R4R6H R3OH R5R7α-OH R8Glc
109. R1R3OH R2R4R7H R5R8α-OH R6Glc
110. R1R3R6R7H R2R4OH R5β-OH R8α-OH
111. R1R3R6R7H R2R4OH R5R8α-OH
112. R1R3R6R7H R2R4OH R5R8α-OH
113. R1R3R6R7H R2R4OH R5R8α-OH
114. R1R3R6R7H R2R4OH R5R8α-OG
16
G:
104. R=H
105. R=OH
115. R1R3OH R2R4H R=5β-OH R6Glc
116. R1R3R6H R2R4OH R5β-OH
117. R1R3R6H R2R4OH R5α-OH
118. R1R3R6H R2R4OH R5α-OG
119. R1OH R2β-OH
120. R1OG R2β-OH
121. R1OG R2α-OG
122. R1OH R2α-OH
17
128. R=H
129. R=G
130. R=H
131. R=G
Bng 1.4: Các flavonoid phân lp t chi i hoàng
STT Tên hp cht Ngun thc
vt
135
136
137
19
102 (+)-catechin-8-C-β-D-glucopyranoside w
103 (+)-catechin-6-C-β-D-glucopyranoside w
105 (−)epigallocatechin-3-O-gallate c
20
119 Procyanidin B-7 w
120 Procyanidin B-7-3-O-gallate w
122 Procyanidin B-5 w
125 Procyanidin C-1-3,3′,3″-tri-O-gallate w
126 3-O-galloylepicatechin-(4β→8)-3-O-galloylepicatechin-
129 3-O-galloylepicatechin-(4β→6)-3-O-galloylepicatechin-
131 3-O-galloylepicatechin-(4β→6)-3-O-galloylepicatechin-
133 3-O-galloylepicatechin-(4β→8)-3-O-galloylepicatechin-
137 Gallic acid a, j, m, r
Chú ý: a: R. palmatum; b: R. tanguticum; c: R. officinale; j: R. rhizastachyum; m
R. franzenbachil; r: Shin- Shu Daio (loài cha xác nh gia R. coreanum và R.
palmatum); w: Choukichio
1.1.4.5. Acylglucoside
Các acylglucoside ã c phân lp t chi i hoàng (138-172) c trình
bày trong hình 1.6.
Hình 1.6. Cu trúc các acylglucoside phân lp c t chi i hoàng
138
139
143. R1=R2=R3=R4=R5=H
144. R1=R4=H R2=R3=R5 =G
145. R1= G R2=R3=R4 = R5 =G
22
Bng 1.5: Các hp cht acylglucoside phân lp t chi i hoàng
STT Tên hp cht Ngun thc
vt
140 Lindleyin a, d
141 4-(4′-hydtoxyphenyl)-2-butanone-4′-O-β-D-
145 2-O-galloylsucrose b
Chú ý: a: R. tanguticum; b: R. coreanum; c: R. palmatum; d: commercial rhubarbs
1.1.4.6. Các hp cht khác
Ngoài trong cây i hoàng còn có tinh du vi mùi c trng, mt s
pyrone, các loi axit hu c, anthocianin và dn xut ca chúng mt lng ln
các hp cht polyphenol và nhiu loi hp cht khác [8]
1.1.5. Các nghiên cu v hot tính sinh hc
Các th nghim in vitro cho thy i hoàng có tác dng nhun tràng, phòng
chng ung th, bo v gan, chng viêm, gim au, kháng khun, chng oxy hóa,
tác dng chng t bin gen, iu tr bnh tiu ng [8], [9].
1.1.5.1. Tác dng nhun tràng
Theo ông y i hoàng c s dng giúp nhun tràng hoc iu tr kit
l, tiêu chy. Nhng nghiên cu gn ây cho thy có s liên h gia tác dng
23
nhun tràng và li tiu vi các hp cht anthraquinon (rhein, emodin,
chrysophanol) [10].
1.1.5.2. Tác dng kháng ung th
Các th nghim cho thy dch chit metanol và nc ca thân và r
i hoàng có hiu qu trong iu tr ung th vú (MDA MB-435S) và ung th gan
(Hep3B) [11]. Nghiên cu sâu hn ngi ta ã phát hin ra nhiu hp cht
anthraquinon nh emodin, aloe- emodin, rhein, physcion và chrysophanol có c
tính n nhiu dòng t bào ung th nh phi, gan, bung trng, bnh bch
cu,.. Nm 2005 Dong Ung Lee và cng s ã chng minh c chrysophanol
có tác dng kháng các dòng t bào ung th phi ngi (A549), ung th bung
trng (SK-OV-3), u ác tính (SK-MEL-2), t bào thn kinh trung ng (XF498)
và t bào rut kt (HCT-15) vi các giá tr IC50 ln lt là 24,76; 7,28; 5,83; 30;
30 µg/ml. Nm 2007, Bingxiu Xiao phát hin aloe- emodin có tác dng hot hóa
phosphatas kim trong t bào KB ung th ming [12].
1.1.5.3. Tác dng kháng viêm và gim au
Trong dch chit EtOH ca thân r cây i hoàng có cha nhiu hp cht
nh tanin, phenolic và flavonoid. Nm 2016, Farouk K. El-Baz và cng s ã ch
ra rng hp cht phenolic trong dch chit EtOH ca cây i hoàng có tim nng
chng viêm và chng oxi hóa tt [13]. Nghiên cu sâu hn v lp cht phenolic
ngi ta ã chng minh rng các hp cht anthraquinon có kh tác dng kháng
viêm cao vi hàng lot các th nghim in vitro, in vivo. Nm 2012, Xuming Deng
cùng cng s ã th nghim hot tính kháng viêm ca hp cht emodin trên mô
hình chut b nhim bnh hen suyn. Kt qu cho thy rng, emodin c ch áng
k s tng ca bch cu ái toan trong mô phi và s tng tit cht nhy trong
ng th và giúp làm ngn chn quá trình viêm ng hô hp mt cách hiu qu
[14]. Nm 2017, bng th nghim in vitro, Kim và cng s ã chng minh emodin
c ch áng k s tng các yu t viêm nh oxit nitric, IL-1α, IL-6, GM-CSF, G-
CSF, M-CSF, MCP-1, MIP-1α [15].
Ngoài ra, hp cht stilben cng c ánh giá là có tác dng kháng viêm.
Chng hn nh hp cht rhapontigenin ã c Fan cùng cng s chng minh có
24
tác dng c ch áng k s tng các yu t viêm (TNF-α, IL-6, MD, SOD, p38,
and iNOS) [16].
1.1.5.4. Tác dng bo v gan
Dch chit etanol ca i hoàng có th ngn chn và iu tr tng lipid máu
và gan nhim m th qua gim lipid máu [17]. Ngoài ra, dch chit etanol và
dch chit nc ca thân và r i hoàng giúp gim tn thng gan gây bi CCl4
hoc paracetamol chut Swiss và chut bch tng [18] [19] Th nghim vi cao
nc ca cây i hoàng liu cao (40 g/kg) cho thy cao nc ca cây có tác
dng phc hi áng k các ch s sinh hóa và mô bnh hc trên gan tn thng
bi CCl4 [20].
1.1.5.5. Tác dng kháng vi-rut
Emodin là mt hp cht anthraquinon c nghiên cu ánh giá nhiu v
tác dng kháng các dòng virut khác nhau nh virut HSV (Herpes simplex virus)
viêm gan B, Emodin có tác dng kháng virut HSV c trên mô hình in vitro và in
vivo. Trên mô hình in vivo th nghiêm trên chut qua ng ung, emodin c ch
mnh s sao chép ca HSV-1 và HSV-2 nng 50 g/ml vi ch s kháng virut
là 2,07 và 3,53, tng ng. iu tr vi emodin làm tng t l sng ca chut b
nhim HSV, kéo dài thi gian sng và có hiu qu cao trong vic loi tr virut
HSV nhiu b phn ca c th ngi b nhim nh não, tim, gan và hch so vi
i chng. Hn na các tác gi ã ch ra emodin có tác dng kháng virut HSV in
vivo tng ng vi acyclovir thng mi. Emodin là mt tác nhân y ha hn
trong iu tr lâm sàng nhim virut HSV [21].
1.2. GII THIU V LOÀI RHEUM OFFICINALE BAILL.
1.2.1. c im thc vt
Rheum officinale Baill (i hoàng dc dng, Rhuarb): Cây tho sng lâu
nm. Thân rng, có rãnh mnh, ph lông t ngn, màu trng, áy thân phù thành
c tròn tròn. R to, ngn, rut màu vàng. Lá rt to, phin dài 40-70 cm, áy hình
tim, không lông, bìa có thùy sâu 1/4 phin, mt di có lông t màu xám. Cung
lá dng trc tròn, dài bng phin lá hoc ngn hn. B chìa to, dài ti 15 cm. Cm
hoa chùy to, phân cành tri ra, mc nh cành hoc các nách lá phía trên. Hoa
25
nhiu, 4-10 hoa mc tm trên cành hoa. Hoa t ln hình viên chùy màu xanh nht
hoc màu trng, cung dài 3-3,5mm [6].
1.2.2. Phân b
Cây mc t nhiên vùng núi cao khong 1200-4000 m, di tán rng. Phn
ln là cây c trng Trung Quc nh H Bc, Vân Nam, Hà Nam, Phúc Kin,
Quý Châu, T Xuyên. vit Nam cây ch yu c trng ni có khí hu vùng
núi cao nh Lào Cai.
1.2.3. Thành phn hóa hc
Trong và ngoài nc ã có nhiu nghiên cu v thành phn hóa hc ca
loài Rhuem officinale Baill. trong ó có mt s lp cht tiêu biu nh:
1.2.3.1. Anthraquinone
Mt s hp cht anthraquinon c phân lp trong loài R. officinale nh
Chrysophanol, physcion, emodin, aloe-emodin, rhein, chrysophanol-1-O-β-D-
glucopyranoside, chrysophanol-8-O-β-D-glucopyranoside, emodin-1-O-β-D-
glucopyranoside, physcion-8-O-β-D-glucopyranoside, physcion-8-O-β-D-
1.2.3.2. Stilben
Hp cht stilben c phân lp t loài R. officinale nh Rhapontigenin,
rhaponticin, desoxyrhaponticin, 3,4′,5-trihydroxystlbene-4′-O-β-D-
glucopyranoside, 3,4′,5-trihydroxystlbene-4′-O-β-D-(6′′-O-galloyl)
glucopyranoside (Bng 1.3 và Hình 1.4).
1.2.3.3. Mt s hp cht khác
Ngoài trong loài rheum officinale còn có mt s hp cht flavonoid,
acylglucoside nh: (−)epicatechin-3-O-gallate, (−)epigallocatechin-3-O-gallate,
1.2.4. Hot tính sinh hc
R. officinale là mt trong nhng dc liu truyn thng nht, ã c s
dng trong hàng nghìn nm. Hn na, R. officinale ã c a vào dc in
Trung Quc, dc in Anh, dc in Châu Âu, dc in Hàn Quc và dc
26
in Nht Bn do tác dng chng kích ng và kháng khun rng rãi ca nó [22].
Emodin (1,3,8-trihydroxy-6-methylanthraquinone) là thành phn hot tính sinh
hc chính ca R. officinale. Qua nhiu cuc iu tra, các nhà nghiên cu ã chng
minh tác dng dc lý ph rng ca emodin, bao gm chng ung th [23], chng
di cn [24], chng oxi hóa [25], chng vi rút [26], chng vi khun [27-28], v.v.
Hn na, các dn xut thu c bng cách thay i cu trúc ca emodin cng ã
c quan sát là có tác dng hot tính sinh hc có li [29-30]. Ngoài ra, các hp
cht chit xut t r loài R. officinale nh các phenolic và axit gallic có tác dng
áng k kh nng quét gc t do chng oxy hóa [31].
1.3. GII THIU V LNH VC DOCKING PHÂN T
1.3.1. Docking phân t
Trong lnh vc hóa sinh tính toán, docking là mt phng pháp d oán
nh hng u tiên gn kt (binding site/active site) ca mt hay nhiu c cht
(ligand) vào i tng c nghiên cu nh protein, enzyme, DNA,.. trong không
gian ba chiu [32]. Protein thng có kích thc ln và mm do nên rt khó
kho sát ht tt c các kh nng tng tác gia protein và c cht. Phân t protein
thng c a vào di dng cu trúc cng, c cht có th chuyn ng tng
i so vi protein và dch chuyn trong không gian bao quanh ca hp kho sát
vùng hot ng ca protein. Khi c cht gn kt lên mt phân t protein mc tiêu,
hai yu t cn chú ý là s phù hp v hình dng, kích thc và nng lng tng
tác gia c cht vi protein. Ngoài ra còn có nhng tng tác khác nh tng tác
Van der Waals, tng tác tnh in, t ó d oán tâm hot ng và v trí, cu
hình thun li ca c cht tham gia gn kt vi protein.[33]. Docking có ý ngha
quan trng trong vic d oán ái lc gn kt cng nh c ch hot ng ca các
c cht, t ó d oán kh nng hot hóa hoc c ch ca c cht lên protein chc
nng.
Nhng nm gn ây, vic s dng mô hình docking ánh giá mi liên
quan gia cu trúc và tác dng sinh hc ang ngày càng c quan tâm. Trong
nc và trên th gii có nhiu công trình nghiên cu s dng mô hình docking
phân t thc hin nghiên cu d oán cu trúc và dn xut ca có hot tính
sinh hc.
27
Mc dù phng pháp sàng lc o in silico vn cn phi c xác thc li
bng các th nghim in vitro và in vivo, tuy nhiên các phng pháp tính toán này
ã ngày càng tr nên ph bin trong lnh vc thit k thuc thông qua nhng bng
chng rt thuyt phc trong vic phù hp gia các tính toán in silico vi th
nghim in vitro và in vivo. Mt s loi thuc hin ang lu hành trên th trng
dùng iu tr các bnh khác nhau ã c phát trin da trên phng pháp in
silico. Ví d: Zanamivir các tác dng iu tr cúm c phát trin bng thit k
di s tr giúp ca máy tính. Thông qua các nghiên cu này Zanamivir c
xác nh là cht c ch có tng tác thun li nht vi influenza neuraminidase.
Kt q t nghiên cu docking ca Zanamir ã thuyt phc tin ti th
nghim in vivo; kt qu nghiên cu in vivo sau ó ã khng nh li kt qu ca
các th nghim in silico. Nelfinavir và Saquinavar c s dng trong iu tr
HIV và cng là sn phm phát trin bng phng pháp tính toán. Các nghiên cu
docking cng tit l c ch làm th nào HIV protease phát trin kháng vi
Nelfinavir và Saquinavar, iu này giúp ích cho vic ci thin hiu lc ca thuc
trong tng lai. Nhng ví d thành công này ã chng minh tính kh dng ca
các phng pháp tính toán có kh nng phát trin dc phm mi, vi nhng ích
hot tính sinh hc khác nh ung th, kháng viêm, kháng oxi hóa và cung cp bng
chng cho các nhà nghiên cu rng ây là mt k thut áng tin cy và hiu qu
trong phát hin thuc mi trong tng lai.
1.3.2. Các ích nghiên cu tác dng kháng viêm
Viêm là phn ng ti ch ca c th chng li các yu t gây bnh nh
vi khun, virus, các phân t l (các cht c vô c, hu c) và các mô c quan
cy ghép. Viêm (cp tính, mn tính) là mt quá trình bnh lý phc tp c trng
bi các hin tng: sng, nóng , au, t bào tng sinh. Viêm c ánh giá qua
các ích nh kh nng c ch NO, TNFα, NF-kβ, COX-2, các cytokin nh
interleukin-1β (IL1-β)., interleukin 2 (IL-2), interleukin 6 (IL-6), IL-8, IL-10.
Trên th gii, cho n nay mô hình in silico cho các ích kháng viêm ã
c nghiên cu khá nhiu. Nm 2017, Bhimapaka China Raju và cng s ã tin
hành docking phân t gn kt gia hp cht (1-((1-(3,4-Dimethylphenyl)-3-
phenyl-1H-pyrazol-4-yl) methyl)-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methanol vi 2 ích
28
protein 1ALU và 2AZ5 tng ng. Kt qu phân tích gn kt hp cht này có kh
nng c ch cytokin IL-6 (PDB: 1ALU) và TNF- (PDB: 2AZ5) do hin th nng
lng liên kt âm nhiu hn so vi các cht chun. ng thi, các nhà nghiên cu
ã tin hành th nghim hot ng chng viêm in vitro và in vivo trên cytokin IL-
6 và TNF- ca hp cht (1-((1-(3,4-Dimethylphenyl)-3-phenyl-1H-pyrazol-4-
yl) methyl)-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methanol cho thy rng hp cht này có hiu
qu th nghim chng li IL-6 (IC50 6.23 lM). chng minh hp cht (1-((1-
(3,4-Dimethylphenyl)-3-phenyl-1H-pyrazol-4-yl) methyl)-1H-1,2,3-triazol-4-
yl)methanol có hot ng kháng viêm, các nhà nghiên cu ã thc hin th
nghim in vivo ca hp cht i vi mô hình chut gây ra LPS ch ra rng hp
cht trên làm gim áng k yu t viêm TNF-[34].
c bit trong u nm 2020, s bùng phát ca i dch mang tên COVID-
19 ã làm thit hi ln v ngi và ca. Trc tình hình ó, các nhà khoa hc
nhanh chóng thc hin các phng pháp sàng lc trên các loi thuc kháng HIV,
st rét, virut, mt s hp cht thiên nhiên trên các ích khác nhau vi hi vng tìm
ra loi thuc có hiu qu trong iu tr, hn ch bnh nhân t vong do SARS -
CoV-2 [35]. Các nghiên cu gn ây cho thy, trên nhng ngi nhim virus
SARS-CoV-2 có mi liên h gia s tin trin ca bnh viêm phi cp tính gây
t vong vi du hiu c th b cn bão viêm dn n các phn ng min dch quá
mn ca c th, nó th hin qua s thay i áng k các ch s viêm/min dch
trong huyt tng ngi bnh. Trong ó, các yu t TNFα và các cytokin (IL1-β,
IL-6, IL-8, IL-10) tng lên. c bit, ch s interleukin 6 (IL-6) có s khác bit rõ
ràng bnh nhân nhim virus SARS-CoV-2 th nh, nng, rt nng, phi th máy
vi nng IL-6 (pg/mL) là <7, 7-30, 31-100 và > 100, tng ng. Theo nghiên
cu ca Zhou và cng s [36] ã ch ra nng IL-6 trong máu nhng bnh
nhân t vong so vi bnh nhân sng sót trong sut quá trình iu tr lâm sàng ca
bnh COVID-19. Mt thí nghim khác ti Trung Quc ã th nghiêm lâm sàng
dòng kháng th nhm mc tiêu n th th IL-6, và ã có báo cáo ci thin chc
nng hô hp và kim soát st nhanh 21 bnh nhân mc COVID-19. Chính vì
vy, iu trc mt là tìm nhng hp cht tách c t cây i hoàng có kh
29
nng c ch IL-6, TNF-α bng phng pháp in silico ánh giá s b hot tính
kháng viêm.
1.3.3. Các tiêu chí ging thuc ca các hp cht
Trong lnh vc nghiên cu phát trin thuc mi, quy tc 5 tiêu chí (Rule of
Five) ca Lipinski c s dng ánh giá các c tính ging thuc ca mt
hp cht hoc xác nh xem mt hp cht hóa hc có th có hot tính dc lý nào
hay không hoc vi mt hot tính sinh hc nht nh thì hp cht có tính cht hóa
hc và tính cht vt lý nào giúp cho nó tr thành mt thuc ung an toàn vi con
ngi. Quy tc này c Christopher A. Lipinski a ra vào nm 1997, da trên
quan sát rng hu ht các loi thuc ung u có khi lng phân t tng i
nh và kh nng tan trong lipid mc trung bình. Quy tc này mô t các c tính
phân t quan trng i vi dc ng hc ca thuc trong c th ngi, bao gm
s hp th (Absorption), phân phi (Distribution), chuyn hóa (Metabolism) và
bài tit (excretion) (ADME). Tuy nhiên, quy tc này không d oán vic mt hp
cht có hot tính dc lý hay không.
Quy tc này óng vai trò quan trng và c s dng xuyên sut trong quá
trình phát trin thuc khi mt hp cht có hot tính dc lý c ti u hóa theo
tng bc vi mc tiêu tng hot tính và tính chn lc ca hp cht nhng vn
cn m bo các c tính hóa lý ca hp cht phù hp vi tiêu chí tr thành thuc.
Các hp cht phù hp vi quy tc Lipinski có xu hng ít phi th nghim lâm
sàng hn và do ó c hi tr thành thuc thng mi cao hn.
B quy tc Lipinski bao gm nm tiêu chí nh sau:
- Khi lng phân t nh hn 500 Dalton
- Kh nng a cht béo cao (c biu th bng ch s LogP nh hn 5)
- Có ít hn 5 liên kt hydrogen cho
- Có ít hn 10 liên kt hydrogen nhn
- Ch s phân cc ca phân t (Molar refractivity) nm trong khong 40-130
30
CHNG 2. NGUYÊN LIU, PHNG PHÁP NGHIÊN CU VÀ THC
NGHIM
2.1. NGUYÊN LIU
Mu i Hoàng – thân r (Rheum officinale Baill) (Code: MC 664) c
thu mua ti ph Lãn Ông – Hà Ni. Mu nghiên cu c xác nh bi TS.
Nguyn Quc Bình – Bo tàng thiên nhiên Vit Nam và c lu ti phòng Hot
cht sinh hc, Vin Hóa hc các Hp cht thiên nhiên.
Hình 2.1: Mu tiêu bn ca thân r cây i hoàng
2.2. PHNG PHÁP
thc hin các ni dung nghiên cu và t c mc tiêu nghiên cu nh
trên, các bc thc hin tài nh sau:
2.2.1. Thu thp mu thc vt
Phng pháp thu thp mu thc vt tuân th theo các phng pháp, tiêu
chun và yêu cu v thc vt hc tin cho lu tr, phân loi và giám nh thc
vt.
Mu thu có các thông tin v a im, tên mu, b phn thu, nh mu…
31
To tiêu bn mu. Các tiêu bn c lu tr trong kho bo qun m
bo mu không b hng và mt tiêu bn, tin cho vic tra cu và tìm thông tin sau
này. Xác nh c im hình thái ca mu.
Tin hành làm vi phu vi các b phn mu.
2.2.2. Nghiên cu thành phn hóa hc
Phng pháp x lý mu: Mu thc vt c làm sch, thái nh, phi khô,
sau ó gn ký hiu và bo qun trong kho có hút m.
To dch chit và phân on: Mu thc vt c chit vi methanol
(MeOH) nhit thích hp, có s dng siêu âm. Sau khi cô quay ui dung môi
di áp sut gim, cn chit thu c c chit phân b ln lt vi các dung
môi có phân cc tng dn t n-hexane, diclomethan (CH2Cl2), ethylacetate
(EtOAc) và butanol (BuOH). Các dch chit phân on cng c cô quay ui
dung môi di áp sut gim thu c các cao chit tng ng.
Phng pháp phân lp các hp cht: các cao chit c phân tích bng
phng pháp sc ký lp mng (TLC), phân lp s dng sc ký ct (CC) vi các
cht hp ph khác nhau: silicagel pha thun, pha o C-18, diaion HP-20,
sephadex LH-20, sc ký lng trung áp (MPLC), và sc ký lng hiu nng cao
(HPLC)…ngoài ra s dng kt hp các phng pháp k thut chit và kt tinh
tinh ch các hp cht.
Phng pháp xác nh cu trúc hóa hc: Cu trúc hóa hc ca các hp cht
phân lp c xác nh bng vic s dng các phng pháp vt lý và hóa lý (IR,
UV, [α]D, CD…), kt hp s dng các phng pháp ph NMR (1 chiu và 2
chiu), ph khi lng (MS),…
2.2.3. Nghiên cu v kh nng kháng viêm
- Vt liu
+ Lipopolysaccharides (LPS) t Escherichia- coli ca Sigma Chemical Co. (St.
Louis, MO, USA). Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), fetal bovine
serum (FBS) were from Life Technologies, Inc., (Gaithersburg, MD, USA).
Sodium nitrite, sulfanilamide, N-1-napthylethylenediamine dihydrochloride and
32
dimethyl sulphoxide (DMSO) ca Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA).
các hóa cht cn thit khác ca các hãng Sigma, GIBCO, Invitrogen, Promega
v.v.
- Phng pháp nuôi cy in vitro
+ Th nghim tác dng c ch sn sinh NO c thc hin theo phng pháp ã
công b [37]. Trong ó i thc bào RAW 264.7 (do GS. TS. Domenico Delfino,
i hc Perugia, Italia cung cp) c nuôi cy trong môi trng DMEM vi
thành phn kèm theo gm 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES, và 1,0 mM sodium
pyruvate, ngoài ra b sung 10% fetal bovine serum – FBS (GIBCO).
+ T bào c cy chuyn sau 3-5 ngày vi t l (1:3) và nuôi trong t m CO2
iu kin 37oC, 5% CO2 và thu hoch pha tng trng log và gieo trên các a
ging 96-well plate (105 t bào / ging).
- ánh giá sng sót ca t bào RAW 264.7 vi các hp cht th nghim bng
phng pháp MTT [38]
+ T bào i thc bào chut RAW 264.7 c nuôi cy trong môi trng RPMI
1640 có b sung 10% heat-inactivated FBS, 100 U/ mL penicillin và 100 mg/ mL
streptomycin vi mt 5×105 t bào/ ging.
+ Cht th (20 L) c a vào các ging ca khay 96 ging có nng
tng t nng ca thí nghim NO.
+ Sau khi iu chnh có mt t bào phù hp, hút 180 l t bào vào các ging
ca khay 96 ging ã có cht th. Trên cùng mt a th, b trí mt s ging
làm i chng không có mu th, ch có dung môi pha mu là DMSO 10%.
+ a nuôi cy vào trong t m CO2 iu kin 37oC, 5% CO2, nuôi trong thi
gian 72 gi.
+ Sau 72 gi, 10 µL thuc th MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl
tetrazolium bromid) (nng cui cùng là 5 mg/mL) c cho vào mi ging.
+ Sau 4h, loi b môi trng, tinh th formazan c hòa tan bng 50 µL (DMSO)
100%.
33
+ Giá tr OD o bc sóng 540 nm bng máy quang ph.
+ Lng t bào sng sót s c tính theo công thc:
OD (cht th) - OD (i chng trng)
% t bào sng sót = x 100%
OD (DMSO) - OD (i chng trng)
- Phng pháp xác nh kh nng c ch sn sinh NO ca t bào macrophage
RAW 264.7 [39]
+ T bào RAW 274.7 c a vào a 96 ging nng 2 x 105 tb/ging và
nuôi trong t m 37oC và 5% CO2 trong 24h.
+ Tip theo, môi trng nuôi cy c loi b, thay bng môi trng DMEM
không có FBS trong 3h.
+ T bào sau ó c mu nghiên cu các nng khác nhau trong 2h trc
khi c kích thích sn sinh yu t NO bng LPS (1 μg/mL) trong 24h.
+ Mt s ging không c mu mà ch s dng dung dch pha mu c coi
là i chng âm. Trong khi i chng dng c s dng là NG-Methyl-L-
arginine acetate (L-NMMA) (Sigma) các nng 100; 20; 4 và 0.8 μg/mL.
+ Nitrite (NO2 -), c xem là ch th cho vic to NO, s c xác nh nh b
Griess Reagent System (Promega Cooperation, WI, USA). C th là, 100 μL môi
trng nuôi t bào ( mu) c chuyn sang a 96 mi và c thêm vào 100
μL Griess reagent: 50 μL of 1% (w/v) sulfanilamide trong 5% (v/v) phosphoric
acid và 50 μL 0.1% (w/v) N-1-naphthylethylenediamine dihydrochloride pha
trong nc.
+ Hn hp này c tip nhit phòng trong 10 phút và hàm lng nitrite
s c o bng máy microplate reader bc sóng 540 nm. Môi trng DMEM
không FBS c s dng làm mu trng (blank).
+ Hàm lng nitrite ca tng mu thí nghim c xác nh nh vào ng cong
hàm lng chun NaNO2 và c so sánh % vi mu chng âm (LPS). Th
nghim luôn c tin hành vi chng dng là N-1-napthylethylenediamine
dihydrochloride (L-NMMA) vi nng khác nhau.
34
+ Kh nng c ch sn sinh NO ca mu c xác nh nh công thc :
% c ch =100%- [hàm lng NOsample/hàm lng NOLPS]x100
+ Phép th c lp li 3 ln m bo tính chính xác. Giá tr IC50 (nng c
ch 50% s hình thành NO) s c xác nh nh vào phn mm máy tính
TableCurve 2Dv4.
2.2.4. Phng pháp docking phân t
- Cu hình ca h thng máy tính c s dng cho mô phng nh sau:
+ Intel®CoreTM i7-9700K CPU @ 3.60 GHz, 32 GB DDR4 RAM.
+ h iu hành - Ubuntu-Linux 14.04.6 LTS.
- Phn mm:
+ Nghiên cu thc hin trên phn mm AutoDock 4.2.6 (http://scripps.edu) và
AutoDockTools
Diego: Dassault Systèmes, 2016).
Inc., USA)
+ Gaussian 09 (Gaussian 09, Revision A.02, M. J. Frisch và cng s).
+ Pymol, LigPlus, Maestro
- Cu trúc protein / cytokine và cht nghiên cu:
+ Cu trúc tinh th ca cytokin IL-6, IL1-β, TNF-α, c ti v t c s d liu
Protein Data Bank (www.rcsb.org/pdb).
+ Cu trúc ca các hp cht th nghim (ligand) c chun b bng phn mm
ChemBioDraw Ultra 12.0 và ti u hóa nng lng c thc hin trên Gaussian
09.
+ Tp cu trúc cho docking phân t c ghi li di dng *.pdbqt nh công c
AutoDockTools. ánh giá tim nng c ch ích sinh hc c xác nh nh so
35
sánh ái lc liên kt và kiu tng tác liên kt (binding mode of interaction). Các
kt qu thu c ca quá trình mô phng và phân tích các v trí liên kt c thc
hin trên phn mm Discovery Studio Visualizer.
2.2.5. Mô t tin trình thí nghim docking
2.2.5.1. X lý cu trúc phi t
Các cu trúc hp cht ban u c v bng các phn mm hóa hc nh
ChemBioDraw Ultra 12.0 và c lu dng 3D (mol.2). S dng phn mm
GaussView c file 3D và lu di dng file uôi .gjf. Sau ó cu trúc s c
ti u hóa tng phn và tng th v nng lng. Bng phn mm Gauusian 09 vi
mc ích chn ra mt cu trúc có mc nng lng thp nht và có các c trng
v dài liên kt, góc liên kt. Chng trình ti u hóa nng lng và cu trúc
s dng phng pháp tính toán phim hàm mt (DFT) [40] vi mc lý thuyt
b hàm c s B3LYP/6-311G(d,p).
2.2.5.2. X lý cu trúc protein
Cu trúc tinh th protease chính ca IL-6, TNF-α có PDB ID ln lt là
(1ALU, 2AZ5). Các thông tin này c thu thp t ngân hàng c s d liu
Protein (PDB). Phn mm AutoDock Tools (MGL Tools) c s dng chun
b cu trúc protein cho mô phng. khin protein tr thành ích tác dng t do,
các phân t nc ã c loi b. Phân t protein c b sung các nguyên t
hydro phân cc, tham s solvat hóa và tính nng lng Kollman. Thông tin ta
ca các nguyên t trong protein c trích xut di nh dng PDBQT và
c dùng chy AutoGrid và AutoDock.
2.2.5.3. Xác nh vùng hat ng ca protein
Trc khi tin hành mô phng tng tác phân t, cn xác nh c vùng
hot ng ca protein [34][41]. Theo ó, vùng hot ng ca các protein nghiên
cu c cu thành bi các amino axit nh sau:
36
Bng 2.1: Các amino axit trong vùng hot ng ca protein
STT Protein PDB ID Các amino axit trong vùng hot ng
1 IL-6 1ALU Lys66, Glu172, Lys171, Gln175, Arg179,
Arg182
2.2.5.4. Mô phng tng tác phân t bng Autodock 4.2.6
Kt qu ti u thu c s dùng thc hin quá trình gn kt gia protein
(1ALU và 2AZ5) và ligand. S dng phn mm Pymol, Discovery phân tích
kt qu mô phng, biu din dài liên kt hydro gia phi t và protei. Hp li
c xây dng bao gm các amino axit cu thành vùng hot ng protease ca
1ALU và 2AZ5 có kích thc (x, y, z) ln lt là (54, 64, 50) và (60 ,60, 60) vi
khong cách im li là 0,375 Å (Ph lc 3). AutoGrid và AutoDock c s
dng tính toán ái lc liên kt gia phi t và protein. Các tham s ca thut
toán di truyn Lamarckian Genetic Algorithm (LGA) [42] c thit lp vi 50
ln mô phng cho mi phi t. Các thông s i kèm cho chy mô phng hiu nng
cao c thit lp bao gm: population size 300, maximum number of energy
evaluations 25,000,000, maximum number of top individuals 1, mutation rate
0,02, crossover rate 0,8, root-mean-square cluster tolerance 2,0 Å. Theo ý ngha
ca thut toán phn mm AutDock 4.2.6 cu hình liên kt có im nng lng giá
tr âm nhiu nht c tính là cu hình kh d nht và c la chn phân tích
tip theo.
2.3.1. Hóa cht và dng c
Hóa cht: Methanol, hexan, diclomethan, ethyl acetate, nc ct, ht silica gel
Dng c: Máy cô quay chân không, máy hng phân on, ct sc ký, bn mng
silica gel, phu chit, cc thy tinh, bình thy tinh, ng nghim.
2.3.2. X lý mu thc vt và chit tách
37
Mu i hoàng thu mua dng khô và c nghin nh. Sau ó, mu c
ngâm chit vi methanol nhit phòng (2 lít x 3 ln), mi ln 2 ngày. Lc ly
dch chit và loi b dung môi bng cách cô quay vi thit b cô quay chân không
thu c cao chit tng. Cao chit methanol tng thu c thêm nc ct và chit
phân b bng các dung môi hu c có tính phân cc tng dn ln lt: n_hexan
4,6 g), diclomethan (6,9 g), ethyl acetate (50 g), và nc (70 gam).
T 6.9 gam cao chit diclometan s dng sc ký ct pha thng vi silica
gel (40-63 µm) và h dung môi hexan: ethyl acetat (6:1, 4:1, 2:1, 1:1) thu c 3
phân on C1, C2, C3. Tin hành sc ký ct pha thng silica gel vi phân on
C1 (400 mg) trong h dung môi hexan: ethyl acetat (50:1, 40:1, 30:1, 20:1, 10:1,
1:1) thu c hp cht MC565 (13mg). Tin hành chy sc ký ct pha thng
vi silica gel vi phân on C2 (700 mg) trong h dung môi hexan: ethyl acetate
(8:1, 6:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1) thu c hp cht MC567 (10 mg).
T 50 gam cao chit etyl acetat ly ra 35 gam chy sc ký thng vi silica
gel (40-63 µm) và h dung môi hexan: ethyl acetate (3:1, 2:1, 1:1) thu c 5
phân on E1 –E5. Tip tc chy sc ký ct pha thng silica gel vi phân on E3
(900mg) trong h dung môi hexan: ethyl acetate (3:1, 2:1, 1:1) thu c hai phân
don E3.1 và E3.2. Kt tinh li E3.1 thu c MC566 (12mg)
38
Hình 2.2: S chit tách mu i hoàng
2.3.3. Tính cht vt lý và d liu ph ca các hp cht phân lp c
2.3.3.1. Hp cht MC565
Tính cht vt lý: Cht rn màu vàng nht, tan trong dung môi hu c (MeOH,
CH2Cl2, …)
C15H10O4(M = 254.24); 1H-NMR (CDCl3,500 MHz, δ ppm): 12,10 (1H, s,
1-OH); 1,99 (1H, s, 8-OH); 7,81 (1H, dd, J=1,0 &7,5 Hz, H-5); 7,64 -7,66 (2H,
m, H-6 & H-4);7,28 (1H, dd, J=1,0 & 8,5 Hz, H-7); 7,09 (1H, dd, J=1,0 & 1,5 Hz,
H-2); 2,46 (3H, s, 3-CH3).
13C-NMR (CDCl3,125 MHz, δ ppm): 192,58 (s, C-9); 182,01 (s, C-9);
162,76 (s, C-1); 162,46 (C-8); 149,36 (d, C-3); 136,96 (s, C-6); 133,33 (s, C-4a);
39
124,57 (d, C-7); 124,38 (s, C-2); 121,37 (d, C-4); 115,91 (s, C-8a); 121,37 (d, C-
4); 133,96 (s, C-10a); 113,78 (s, C-9a); 22,27 (q, 3-CH3).
2.3.3.2. Hp cht MC566
Tính cht vt lý: Cht rn, kt tinh màu trng ngà, tan trong các dung môi hu c
D liu ph:
C15H14O4(M = 258.27): 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz ,δ ppm): 7,02 (1H, d,
J=2,0Hz, H-2); 6,94 (3H, m, H-8, H-5 và H-6);6,81 (1H, d, J=2,0, H-7); 6,47
(2H, d, J=2Hz, H-2 & H-6); 6,19 (1H, t, J=2,5Hz, H-4 ); 3,87 (3H, s, 4- OCH3);
13C-NMR (CD3OD, 125 MHz ,δ ppm): 159,66 (s, C-5 & C-3); 147,72 (s, C-4);
148,99 (s, C-3); 141,12 (s, C-1); 132,25 (s, C-1); 129,37 (d, C-7); 127,88 (s, C-
8); 120,02 (s, C-2); 113,62 (s, C-6); 112,78 (d, C-5); 105,88 (d, C-2 & C-6);
102,83 (d, C-4); 56,44 ( 4-OCH3).
2.3.3.3. Hp cht MC567
Tính cht vt lý: tinh th rn màu cam, tan trong dung môi hu c (MeOH,
CH2Cl2)
C15H10O5(M = 254.24); 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz ,δ ppm): 12,04 (1H,
s, 1-OH); 11,96 (1H, s, 8-OH); 7,43( t, 1H, H-5); 7,11 (1H, dd,J=1.0 & 1.5 Hz,
H-7); 7,07 (d, 1H, J=2Hz, H-4); 6,55 (d, J = 2,5Hz); 2,38 (s, 3H, 6-CH3).
13C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz, ,δ ppm): 189,56 (s, C-9); 181,22 (s, C-10); 165,55
(s, C-3); 164,38 (s, C-1); 161.34 (s, C-8); 148,12 (s, C-6); 134,6 (s, C-4a); 132,7
(s, C-10a); 124,0 (d, C-7); 120.35 ( d, C-5); 113,25 (s, C-8a); 108,82 (s, C-9a);
108.73 (d, C-2); 107,83 (d, C-4); 21,42 (q, 6-CH3).
40
CHNG 3: KT QU VÀ THO LUN
3.1. KT QU XÁC NH CU TRÚC CÁC HP CHT SCH T CÂY I
HOÀNG
3.1.1. Cu trúc hp cht MC565
Cu trúc ca hp cht MC565
Ph 13C-NMR ca MC565 cho tín hiu ca 15 carbon, kt hp vi ph
DEPT cho thy hp cht có 5 nhóm –CH thm, 1 nhóm -CH3 và có 9 carbon
không có liên kt hidro. Tín hiu δC 192,58 (C-9, s) và 182,01 (C-10, s) c
trng cho 2 carbon carbonyl (quinon) và hai tín hiu δC 162,46 (C-8) và 162,76
(C-1) c trng cho carbon thm có liên kt vi oxy. Và mt tín hiu δC 22,27
c trng ca nhóm CH3
Ph 1H-NMR ca hp cht MC565 cho thy có 5 tín hiu proton thm δH
(7,09 – 7,81 ppm) và mt nhóm CH3 singlet, tng ng vi d kin ph DEPT
trên. Hai proton δ 7,09 (dd, J=1 Hz & J=1,5 Hz, H-2) và δH 7,64 (d, J=1,5 Hz,
H-4) có tng tác meta vi nhau. Các tín hiu δH 7,81 (dd; J=1,5 &7,5 Hz H-5),
δH 7,64 (t, J=8 Hz, H-6), δ 7,28 (dd; J=1,0 & 8,5 Hz, H-7) cho thy phân t có
nhóm vòng phenyl th 1,2,3-. Ngoài ra MC565 có 1 nhóm CH3 singlet δH 2,46.
So sánh vi t liu [43] hp cht MC565 c xác nh là Chrysophanol.
Hp cht này ã c phân lp t nhiu loài t chi i hoàng nh R. palmatum;
R. tanguticum; R. officinale và có tác dng kháng ung th.
41
Bng 3.1: D kin ph ca hp cht MC565 so sánh vi tài liu tham kho
Position δH, ppm
Hz & 1,5Hz 7,09; s 124,38 124,4
3-CH3 2,46; s 2,46; s 22,27 22,3
3 - 149,36 149,3
4a - 133,33 133,7
5 7,81; dd;
J=1,5 &7,5 Hz 7,82; d; J=9 Hz 119,94 119,9
6 7,66; t; J=8 Hz 7,68; m 136,96 136,9
7 7,28; dd;
Cu trúc ca hp cht MC566
Ph 1H-NMR ca MC566 cho bit có 14 tín hiu proton cho thy có 14 loi
nguyên t hydro trong cu trúc ca cht cn xác nh. Các tín hiu cho bit có th
cu trúc ca hot cht có 2 vòng thm c lp và có mt ca 1 nhóm methoxy –
OCH3, v trí δ = 3,83 ppm có ng cong tích phân là 3, singlet là tín hiu ca
nhóm - CH3 có gn vi nguyên t có âm in ln và ây chính là nhóm
methoxy. Tín hiu v trí có δ = 6,93ppm (1H; d; J =16,5 Hz, H-7) và 6,81 ppm
(1H; d; J = 16,5 Hz; H-8) cho bit trong cu trúc có nhóm proton ni ôi và có
cu hình trans. Các tín hiu còn li thuc v proton ca hai vòng thm, hng s
tng tác J= 2 & 2,5 Hz cho bit tín hiu b th v trí meta.
Ph 13C-NMR có 13 tín hiu cho thy 13 loi Carbon trong cu trúc, và
trong ó có 2 tín hiu có du hiu cng hng v trí δC 159,66 ppm và 105,83
ppm. . Trên ph DEPT cho thy 7 tín hiu ca nhóm –CH và 1 nhóm CH3 còn li
là tín hiu ca cacbon bc 4. Ti v trí δC 56,44 ppm là tín hiu ca nhóm –OCH3.
43
Hai tín hiu cacbon δC 129,37 ppm và 127,88 ppm thuc v C ca nhóm olefin
(tran-olefin). Các tín hiu còn li là C ca hai vòng thm.
Các d kin ph thu c cho thy ây là cht có khung stilben và so sánh
vi tài liu tham kho [44] kt lun ây là hp cht Rhapontigenin.
Bng 3.2: D kin ph ca hp cht MC566 so sánh vi tài liu tham kho
Position δH, ppm
Hz 105,88 104,5
3 - - 159,66 158,3
Hz
J=2,0Hz 105,88 104,5
Hz
Hz
Hz 120,02 118,7
3 - - 147,72 146,3
4 - - 148,99 147,6
5 6,94; m 6,93; m 112,78 112,2
6 6,94; m 6,93; m 113,62 111,3
3.1.3. Cu trúc ca hp cht MC567
Hình 3: Cu trúc ca hp cht MC 567
Ph 13C-NMR ca MC 567 cho tín hiu ca 15 carbon, kt hp vi ph
DEPT cho thy có 4 tín hiu ca nhóm –CH và 1 tín hiu ca nhóm –CH3, các tín
hiu còn li là ca carbon không liên kt vi hidro. Tín hiu δC 189,56 (C-9) và
181,22 (C-10) c trng cho 2 carbon carbonyl (quinon) và ba tín hiu δC 165,55
(C-3); δC 161,34 (C-8) và 164,38 (C-1) c trng ca carbon trên nhân thm mang
nhóm th có oxy. chuyn dch hóa hc vùng trng cao δC 21,42 là c trng
ca nhóm methyl b th vào vòng thm, cu trúc này b gn vào cacbon s 6.
Ph 1H-NMR ca hp cht MC 567 cho thy có 5 tín hiu proton trong ó
có 4 proton thm trong vùng chuyn dch δH (6,55 – 7,43) và mt nhóm CH3
singlet, tng ng vi d kin ph DEPT trên. Hai proton δH 6,55 (d, J=2,5
Hz, H-2) và δH 7,07 (d, J=2 Hz, H-4) có tng tác meta vi nhau. Hai protton
δH 7,43 (t; J=1 Hz) và δH 7,11 (d; J=1 Hz) có tng tác meta vi nhau. Và có 1
nhóm CH3 singlet δH 2,46.
T các s liu ph trên và tài liu tham kho [45,46,47] khng nh ây là
hp cht có tên là Emodin. c phân lp nhiu t các loài R. palmatum; R.
tanguticum; R. officinale và có nhiu hot tính sinh hc nh kháng khun, kháng
viêm, chng ng th.
45
Bng 3.3: D kin ph ca hp cht MC567 so sánh vi tài liu tham kho
Positio
n
Hz
4a - - 134,6 135,21
6 - - 148,12 148,35
7 7,11; d; J=1 Hz 7,16 124,0 124,23
8 - - 161,34 161,51
9 - - 189,56 189,83
9a - - 108,82 109,06
10 - - 181,22 181,48
10a - - 132,7 132,91
Trong ni dung nghiên cu v thành phn hóa hc ca thân r cây i
hoàng ã tách c hp cht thuc lp cht anthraquinon và sillben. Hp cht
anthraquinon là lp cht có nhiu hot tính thú v nh: hot tính kháng nm; hot
tính kháng ung th và hot tính kháng viêm.
3.2. ÁNH GIÁ TIM NNG KHÁNG VIÊM CA CÁC HP CHT S
DNG PHNG PHÁP DOCKING PHÂN T
3.2.1. Ti u hóa cu trúc hp cht nghiên cu
S dng các phn mm ChemDraw; Gaussview; Gaussian 09 cu trúc ca
ba hp cht chrysophanol; emodin; rhapontigenin ã c ti u và c mô t
hình 3.2. Các cu trúc ti u này s c s dng docking ánh giá tác dng
kháng viêm vi các ích protein khác nhau. Kt qu ti u cu trúc c biu th
trong hình 3.1
Hình 3.1: Cu trúc các phi t ã c ti u ca các cht nghiên cu
Tên cht Cu trúc 2D Cu trúc 3D ti u
Chrysophanol
47
Rhapontigenin
Emodin
Rolipram
Indomethacin
48
Celecoxib
3.2.2. ánh giá các tiêu chí ging thuc ca các hp cht nghiên cu
S dng phn mm free Lipinski, c tính theo 5 tiêu chí Lipinski ca ba
hp cht chrysophanol, emodin, rhapontigenin, ã c trình bày bng 3.4.
Bng 3.4: ánh giá tiêu chí ging thuc ca các hp cht nghiên cu
STT Tên cht Thng s theo tiêu chí Lipinski
1 Chrysophanol
Mass: 250
Molar Refractivity: 90,319389
Kt qu ánh giá các tiêu chí ging thuc theo quy tc Lipinski cho thy ba
cht chrysophanol, emodin và rhapontigenin u có kh nng phát trin thành
thuc bit dc.
3.2.3. X lý ti u hóa cu trúc protein nghiên cu
S dng phn mm Disscovery chun b các phân t tinh th protease
chính ca IL-6 và TNF-α có PDB ID tng ng là (1ALU và 2AZ5). Các bc
chun b bao gm: loi b phân t nc liên kt vi protein, b sung các nguyên
t hydro phân cc, thit lp ta (3 chiu) vùng ánh giá tng tác gia protein
và hot cht (Ph lc 3). Hình 3.3 mô t cu trúc ca hai protein 1ALU và 2AZ5
ã c ti u hóa.
Hình 3.2: Cu trúc hai protein ã c ti u hóa
IL-6 (1ALU) TNF- (2AZ5)
3.3.4. Kt qu mô phng tng tác
Tin hành mô phng tng tác gia 3 hp cht sch tinh ch c ca cây
i Hoàng vi protein 1ALU và 2AZ5 bng phn mm Autodock4.2.6 s dng
thut toán Lamarckian Genetic Algorithm [48]. V trí ca vùng mô phng c
nh v là vùng không gian xung quanh tâm hot ng ca protein 1ALU và 2AZ5.
Trong quá trình docking phân t, thut toán to ra 50 mô phng tng tác khác
nhau vi protein cho mi hp cht.
Qua nghiên cu các tài liu, hp cht rolipram và celecoxib ã c chng
minh qua thc nghim là có tác dng kháng viêm[49][50]. Vì vy, chúng tôi ã
s dng rolipram và celecoxib làm cht i chng.
Bng 3.6 cho thy nng lng liên kt ca cht i chng rolipram và
celecoxib vi hai protein 1ALU và 2AZ5 ln lt là (– 6,77; -5,56 kcal/mol) và
(-5,76; -6,04 kcal/mol), tng ng. Hp cht nào có nng lng liên kt gn hoc
âm nhiu hn c coi là tim nng tng tác tt vi ích th th.
Bng 3.5: Tính toán nng lng liên kt t do ca 3 hp cht vi hai protein
1ALU và 2AZ5
51
Rolipram -6,77 0,34 -5,76 0,29
Celecoxib -5,56 0,21 -6,04 0,23
Bng 3.6: Các amino axit tham gia tng tác ca 3 hp cht phân lp c vi
hai protein 1ALU và 2AZ5
Tên cht Amino axit tham gia tng tác
1ALU 2AZ5
Rhapontigenin Met67, Lys66, Arg179 Ser95, Lys98, Pro117,
Gly121
Ser176 Ser95, Gly121
Celecoxib Lys 171, Gln175 Ser60, Tyr151
Docking vi protein 1ALU cho thy rhapontigenin có nng lng liên kt
t do (ái lc liên kt) vi giá tr âm nhiu nht -7,26 kcal/mol so vi hai cht
chun là rolipram và celecoxib. ng thi rhapontigenin hình thành liên kt
hydrogen vi 1ALU thông qua các amino axit là Met67, Lys66, Arg179 trong ó
có 2 amino axit quan trng ti tâm hot ng nh Lys66, Arg179 (Bng 3.7). Hp
cht chrysolphanol hình thành 3 liên kt hydro vi các amino axit là Lys66,
Glu172, Ser176, trong ó có 2 amino axit thit yu trong v trí hot ng. Emodin
hình thành 5 liên kt hidro vi các amino axit là Pro65, Lys66, Ser169, Glu172,
Ser176 trong ó có 2 amino axit thit yu trong v trí hot ng. Chrysophanol và
emodin có nng lng liên kt ln lt là (-6,24; -6,36 kcal/mol) âm nhiu hn
celecoxib nhng ln hn rolipram. Ngoài ra, h s linh ng ca rhapontigenin,
chrysophanol, emodin có giá tr ln lt là 0,38; 0,33; 0,32, tng ng. Các h s
linh ng này nm trong biên chp nhn c cho phép la chn tim nng
52
cho phát trin thuc. Nhng thông s trên cho thy rhapontigenin, chysophanol
và emodin u có tim nng tng tác tt vi protein 1ALU.
Docking vi protein 2AZ5 cho thy rhapontigenin có nng lng liên kt t
do là -6,58 kcal/mol âm nhiu hn hai cht chun và có 2 amino axit trong vùng
hot ng ca protein 2AZ5 ó là Lys98 và Gly121. Emodin có nng lng t do
là -5,79 âm nhiu hn rolipram và hình thành 2 amino axit Ser95, Gly121 trong
ó có mt amino axit thit yu trong vùng hot ng. ng thi h s linh ng
ca rhapontigenin và emodin ln lt bng 0,35 và 0,29, tng ng. Nm trong
khong chp nhn cho phép tim nng phát trin làm thuc. Chrysophanol có nng
lng lin kt t do là -4,87 kcal/mol cao hn so vi c hai cht chun. iu này
chng t rng hp cht rhapontigenin và emodin có tim nng tng tác vi
protein 2AZ5 còn chrysophanol thì không có tim nng c tng tác vi protein
2AZ5.
Nh vy, ba hp cht chrysophanol, emodin, rhapontigenein phân lp t cây
i hoàng ã c ánh giá in silico tác dng kháng viêm trên hai ích 1ALU
(IL-6) và 2AZ5 (TNF-). Kt qu tính toán cho thy hp cht emodin và
rhapontigenin có kh nng tng tác tt vi 2 protein 1ALU (IL-6) và 2AZ5
(TNF-) tng ng vi kh nng c ch sn sinh cytokin IL-6 và TNF-. Hp
chrysophanol có có kh nng c ch cytokin IL-6.
Qua tìm hiu các th nghim in vitro, in vivo các nhà nghiên cu ã chng
minh emodin c ch áng k s tng các yu t viêm trong t bào RAW 246.7
[15] và óng vai trò nh mt cht gim au mnh iu tr và ngn nga bnh
tiu ng (DNP) thông qua vic làm gim các yu viêm nh IL-6, TNF- IL-
1β [51]. Hp cht rhapontigenin ã c Fan cùng cng s chng minh có tác
dng bo v tim mch c ch thông qua c ch áng k s tng các yu t viêm
(TNF-α, IL-6, MD, SOD, p38, and iNOs) [16]. Nh vy, vic ánh giá kh nng
kháng viêm ca hp cht emodin và rhapontigenin bng in silico là có phù hp
vi các nghiên cu trc ây.
3.3. HOT TÍNH C CH S SN SINH NO CA CÁC HP CHT C
PHÂN LP
53
Ba hp cht chrysophanol, emodin và rhapontigenin em ánh giá tác dng
kháng viêm qua phép th c ch sn sinh NO in vitro. Kt qu thí nghim c
trình bày hình 3.3 và bng 3.7. nng th nghim ca ba hp cht này s
lng t bào còn sng trên 80%.
Hình 3.3: ng chun NaNO2
Bng 3.7: Kh nng c ch sn sinh NO ca các cht phân lp c
Nng

(µg/mL)
MC565
Chrysophanol
MC566
Emodin
MC567
Rhapontigenin
L-NMMA
% c ch NO % c ch NO % c ch NO % c ch NO
100 32,06 97,98 91,26 96,83
20 27,35 34,75 87,22 70,76
4 13,90 28,03 50,26 34,64
0.8 -2,24 7,85 6,16 12,03
IC50 >100 32,26±1,05 5,65±0,43 7,78±0,33
nng 4 µg/mL các hp cht MC565; MC566; MC567 th hin hot tính
c ch NO vi giá tr ln lt là 13;90; 28;03; 50;26% (Bng 3.8). Vi giá tr ln
hn 50% là hp cht ó có kh nng c ch sn sinh NO. iu này cho thy; hp
cht MC567 có kh nng kháng viêm ngay nng 4 µg/mL. Chng t; emodin
có hot tính kháng viêm mnh.
y = 0.0091x + 0.046 R² = 0.9998
0
0.5
1
1.5
ng chun NO
54
nng 20 µg/mL các hp cht MC565; MC566; MC567 th hin hot tính
c ch NO vi giá tr ln lt là 27;35; 34;75; 87;22%. Thy rng MC567 c ch
tt s sn sinh NO vi giá tr 87;22%.
nng 100 µg/mL hp cht MC565; MC566; MC567 th hin hot tính
c ch NO vi giá tr ln lt là 32;06; 97;98; 91;26%. Hp cht MC567 th hin
hot tính kháng viêm tt khi tng nng . Hp cht MC566 có kh nng c ch
sn sinh NO khi c th nghim vi nng cao.
T kt qu trên; cho thy emodin (MC567) có kh nng c ch sn sinh NO
tt nht trên c 3 nng th nghim vi giá tr IC50 = 5.65±0.43 µg/mL.
Rhapontigenin (MC566) có kh nng c ch sn sinh NO nng (100 µg/mL)
vi giá tr IC50 = 32;26±1;05 µg/mL.
Kt hp gia in silico và in vitro cho thy hai hp cht emodin và
rhapontigenin u có kh nng kháng viêm. Hai hp cht emodin và chrysophanol
u cùng mt khung anthraquinon nhng hp cht emodin li có hot tính sinh
hc khác so vi chrysophanol. Chng t rng vic có thêm mt nhóm OH v trí
C-3 ca emodin chính là tác nhân gây ra s khác bit v hot tính sinh hc ca
hai hp cht.
CHNG 4: KT LUN VÀ KIN NGH
tài ã t c mc tiêu là phân lp mt s hp cht t cây i hoàng
(Rheum officinale Baill.) và xác nh hot tính kháng viêm in silico và in vitro ca
các hp cht. C th nh sau:
V thành phn hóa hc:
T thân cây i hoàng ã phân lp c 3 cht sch. Trong ó có 2 cht
thuc lp anthraqunon là chrysophanol (MC565); emodin (MC567). Và 1 hp
cht stilben là rhapontigenin (MC566).
Vê docking phân t (in silico):
Ba hp cht thu c ã s dng mô hình docking phân t nghiên cu
v kh nng kháng viêm t ó bc u a ra mt s nhn xét lý thú v hot tính
sinh hc ca hp cht. Các thông s trong mô hình này có th c tip tc tinh
chnh có th có ng dng tt hn trong nghiên cu phát trin các hot cht sinh
hc t thiên nhiên.
Vi ích cytokin IL-6 c ba hp cht chrysophanol; rhapontigenin và
emodin u có ái lc liên kt cao và th hin kh nng kháng viêm.
Vi ích cytokin TNF- hai hp cht rhapontigenin và emodin u th hin
kh nng tng tác tt vi protein 2AZ5 và th hin hot tính kháng viêm.
V hot tính c ch sn sinh NO:
Trong 3 hp cht sch phân lp c có: Hp cht chrysophanol cha th
hin hot tính các nng nghiên cu. Hai hp cht còn li là emodin và
rhapontigenin ã th hin hot tính c ch sinh NO vi giá tr IC50 t 5.65 – 32.26
µg/mL.
KIN NGH
- Tip tc phân lp và ánh giá tác dng kháng viêm in vitro ca các hp cht t
cây i hoàng trên vi các yu t tin viêm khác nh IL-6; TNF-; COX-2.
- Tip tc tìm hiu v vùng tng tác và các aminoaxit liên quan n enzyme
COX-2 trong docking phân t.
56
TÀI LIU THAM KHO
1. Zheng Qing-xia, Wu Hai-feng, Guo Jian, Nan Hai-jiang, Chen Shi-lin, Yang
Jun-shan, Xu Xu-dong (2013), “Review of Rhubarbs: Chemistry and
Pharmacology”, Chinese Herbal Medicines, 5(1): 9-32.
2. Misra, D. P., Agarwal, V., & Negi, V. S. 2016. Rheumatology in India: A
Bird’s Eye View on Organization, Epidemiology, Training Programs and
Publications. Journal of Korean Medical Science, 31(7), 1013–1019.
https://doi.org/10.3346/jkms.2016.31.7.1013
3. Takitani, Shoji, et al, 1992, The pharmacopoeia of Japan XII, The Society of
Japanese Pharmacopoeia, Tokyo.
4. Phm Hoàng H, 2000, Cây thuc và v thuc Vit Nam, Nhà xut bn tr,
tp I, 743.
5. Võ Vn Chi, 2012, T in cây thuc Vit Nam, Nhà xut bn y hc, Tp I,
865- 866
6. Li Anjen, Bao Bojian, Alisa E. Grabovskaya-Borodina, Suk-pyo Hong, John
McNeill, Sergei L. Mosyakin, Hideaki Ohba, Chong-wook Park, 2003,
Polygonaceae, Flora of China 5, 277-350.
7. B môn dc liu 2004, Bài ging dc liu tp I, Nhà xut bn i hc
dc Hà Ni.
8. Zheng Qing-xia, Wu Hai-feng, Guo Jian, Nan Hai-jiang, Chen Shi-lin, Yang
Jun-shan, Xu Xu-dong, 2013, Review of Rhubarbs: Chemistry and
Pharmacology, Chinese Herbal Medicines, 5(1): 9-32.
9. Agarwal, Santosh K Singh, Sudhir S Lakshmi, Vijai Verma, Sushma Kumar,
Sushil (2001 Jan), “Chemistry and Pharmacology of Rhubarb (Rheum
species), Journal of Scientific & Industrial Research, 60 (1), 1-9.
10. Li F, Wang SC, Wang X, Ren QY, Wang W, Shang GW, Zhang L, Zhang
SH, 2008, Novel exploration of cathartic pharmacology induced by rhubarb,
China J Chin Mater Med, 33(4): 481-484.
11. Rokaya, M.B., Münzbergová, Z., Timsina, B. & Bhattarai, K.R., 2012,
Rheum australe D. Don: A review of its botany, ethnobotany, phytochemistry
and pharmacology, Journal of Ethnopharmacology, 141(3), 761–774.
57
12. Xiao. B., Guo. J., Liu. D., Zhang. S., 2007, Aloe-emodin induces in vitro
G2/M arrest and alkaline phosphatase activation in human oral cancer KB
cells, Oral Oncology, 43(9), 905–910.
13. Eman A. Ibrahim, Doha H. Abou Baker, Farouk K. El-Baz1, 2016, Anti-
Inflammatory and Antioxidant Activities of Rhubarb Roots Extract, Int. J.
Pharm. Sci. Rev. Res., 39(2), 93-99.
14. Chu. X., Wei. M., Yang. X., Cao. Q., Xie. X., Guan. M., Wang. D. &., Deng.
X., 2012, Effects of an anthraquinone derivative from Rheum officinale
Baill, emodin, on airway responses in a murine model of asthma, Food and
Chemical Toxicology, 50(7), 2368–2375.
15. Young-Jin Kim, Ji Young Lee, Hyun-Ju Kim, Do-Hoon Kim, Tae Hee Lee,
Mi Suk Kang, You-Kyung Choi, Hye Lim Lee, Jaieun Kim, Hyo-Jin An, and
Wansu Park, 2017, inhibitory effect of emodin on raw 264.7 activated with
double stranded rna analogue poly i:c, Afr J Tradit Complement Altern Med.,
14 (3), 157-166.
Induced Myocardial Infarction in a Rat Mode, Pharmacology, 103,291–302,
DOI: 10.1159/000496800.
17. Akhtar MS, Amin M, Ahmad M, Alamgeer, 2009, Hepatoprotective Effect
of Rheum emodi Roots Revandchini and Akseer-e-Jigar Against Par
acetamol-induced Hepatotoxicity in Rats, Ethnobotanical Leaflets, 13, 310-
315.
18. Xing XY, Z