ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

NGUYỄN BÍCH HẠNH

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM

ACETYLCHOLINESTERASE IN VITRO CỦA

CÁC PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT HOÀNG LIÊN

(COPTIS CHINENSIS FRANCH)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

HÀ NỘI - 2017

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

NGUYỄN BÍCH HẠNH

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM

ACETYLCHOLINESTERASE IN VITRO CỦA

CÁC PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT HOÀNG LIÊN

(COPTIS CHINENSIS FRANCH)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

(NGÀNH DƯỢC HỌC)

Khóa: QH.2012.Y

Người hướng dẫn: TS. BÙI THANH TÙNG

HÀ NỘI - 2017

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình

của các thầy cô và các bạn. Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin

trân trọng cảm ơn TS. Bùi Thanh Tùng – giảng viên bộ môn Dược lý –

Dược lâm sàng Khoa Y Dược - Trường Đại học Quốc gia Hà Nội đã tận

tình chỉ bảo, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và

hoàn thành nghiên cứu.

Trong quá trình thực hiện khóa luận, tôi nhận được rất nhiều sự giúp đỡ

từ các thầy cô phụ trách trong các phòng thí nghiệm của Khoa. Tôi xin chân

thành cảm ơn Khoa Y dược đã tạo mọi điều kiện tốt nhất về cơ sở vật chất,

các dụng cụ phòng thí nghiệm cho tôi có thể thực hiện tốt đề tài nghiên cứu.

Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới toàn bộ thầy cô trong bộ môn

Dược lý – Dược lâm sàng cùng toàn thể các thầy cô Khoa Y Dược đã giúp đỡ,

trang bị cho tôi nhiều điều bổ ích và thực sự đó là những hành trang quý báu

giúp tôi thêm vững bước trên con đường đi sắp tới của mình.

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt và ý nghĩa nhất tới ông bà,

bố mẹ, người thân và bạn bè đã luôn chỉ bảo, động viên, chia sẻ, sát cánh bên

tôi để tôi vượt qua những khó khăn trong quá trình học tập và nghiên cứu.

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 5 năm 2017

Sinh viên

Nguyễn Bích Hạnh

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

A Độ hấp thụ (Absorbance)

ACh Acetylcholin

AChE Enzym actylcholinesterase

ACTI Acetylthiocholine iodid

BuOH Butanol

CV Hệ số biến thiên (Coefficient of Variation)

DTNB Acid 5-5’-dithiobis-2-nitrobenzoic

EtOAc Ethyl acetat

EtOH Ethanol

HCl Acid hydro clorid

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid

Chromatography)

IC50 Nồng độ ức chế 50% (Inhibitory Concentration 50%)

IU Đơn vị quốc tế (International Unit)

MeOH Methanol

NXB Nhà xuất bản

pH Chỉ số đo hoạt động của ion hidro (Hydrogen power)

RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)

SD Độ lệch chuẩn (Standard Deviation)

STT Số thứ tự

TCL Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography)

Giá trị trung bình

UV Tia tử ngoại (Ultraviolet)

DANH MỤC CÁC BẢNG

STT Tên bảng Trang

Bảng 3.1 Thành phần hỗn hợp phản ứng

27

Bảng 3.2 Giá trị IC50 của các phân đoạn dịch chiết từ Hoàng liên

chân gà và Berberin clorid

28

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1. Hoàng liên chân gà (Coptis chinensis Franch) ................................... .4

Hình 1.2. Công thức cấu tạo một số chất trong thân rễ Hoàng liên .................... .7

Hình 1.3. Các vị trí hoạt động của enzym AChE ................................................ 14

Hình 2.1. Sơ đồ chiết xuất phân đoạn dược liệu Hoàng liên .............................. 20

Hình 2.2. Quá trình phản ứng diễn ra trong phương pháp đo quang sử dụng

thuốc thử Ellman ................................................................................................. 21

Hình 2.3. Sơ đồ quy trình thử nghiệm tác dụng ức chế AChE in vitro .............. 23

Hình 2.4. Sơ đồ quy trình đánh giá đặc điểm động học ức chế AChE in vitro .. 25

Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế hoạt độ enzym AChE của các

phân đoạn dịch chiết cây Hoàng liên chân gà ..................................................... 29

Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế hoạt độ enzym AChE của

Berberin clorid..................................................................................................... 29

Hình 3.3. Đồ thị Lineweaver-Burk cho phân đoạn dịch chiết n-BuOH. ............ 31

Hình 3.4. Đồ thị Dixon cho phân đoạn dịch chiết n-BuOH để xác định hằng

số ức chế Ki. ........................................................................................................ 31

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN .......................................................................... 3

1.1. Tổng quan về Hoàng liên chân gà (Coptis chinensis Franch) – Họ

Hoàng liên (Ranunculaceae)........................................................................... 3

1.1.1. Đặc điểm thực vật ................................................................................... 3

1.1.2. Phân bố, trồng trọt và thu hái ............................................................... 4

1.1.3. Thành phần hóa học .............................................................................. 5

1.1.4. Bộ phận dùng ......................................................................................... 8

1.1.5. Tác dụng dược lý .................................................................................... 8

1.2. Tổng quan về nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế enzym

Acetylcholinesterase in vitro .......................................................................... 13

1.2.1. Acetylcholin, enzym Acetylcholinesterase và giả thuyết về vai trò của

hệ cholinergic đối với bệnh Alzheimer .......................................................... 13

1.2.2. Một số phương pháp thường dùng trong nghiên cứu sàng lọc tác

dụng ức chế enzym Acetylcholinesterase in vitro ......................................... 15

CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....... 19

2.1. Nguyên vật liệu ........................................................................................ 19

2.1.1. Mẫu nghiên cứu ................................................................................... 19

2.1.2. Hóa chất, dung môi .............................................................................. 19

2.1.3. Máy móc, thiết bị và dụng cụ ............................................................... 19

2.2. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 19

2.2.1. Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE ...................... 19

2.2.2. Phương pháp đánh giá đặc điểm động học ức chế enzym AChE...... 24

2.3. Phương pháp xử lý số liệu ...................................................................... 25

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................................. 27

3.1. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế AChE ............................................... 27

3.2. Kết quả đánh giá đặc điểm động học ức chế AChE .............................. 30

3.3. Bàn luận .................................................................................................. 32

3.3.1. Về kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym Acetylcholinesterase in

vitro của các phân đoạn dịch chiết Hoàng liên (Coptis chinensis Franch) 32

3.3.2. Về kết quả đánh giá đặc điểm động học ức chế enzym

Acetylcholinesterase của phân đoạn dịch chiết Hoàng liên. ............................ 33

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .......................................................................... 35

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1

MỞ ĐẦU

Cuộc sống hiện đại ngày càng phát triển cùng với đó cũng là sự gia

tăng của bệnh suy giảm trí nhớ - đặc biệt là Alzheimer không chỉ ở người cao

tuổi mà thậm chí người trẻ tuổi cũng mắc phải. Năm 2012, Tổ chức y tế thế

giới đã cảnh báo về mối lo ngại do bệnh này gây ra và đưa bệnh Alzheimer

vào vấn đề sức khỏe cộng đồng cần được ưu tiên [11]. Nghiên cứu cho thấy

có khoảng 35 triệu người mắc bệnh Alzheimer, thống kê tại châu Á có khoảng

gần 13 triệu người mắc bệnh Alzheimer, dự đoán đến năm 2050 con số này có

thể tăng lên đến 62,8 triệu người. Việt Nam có khoảng hơn 9 triệu người bị sa

sút trí tuệ mà dạng điển hình là Alzheimer. Đây được coi là căn bệnh nặng

nhất trong các nhóm bệnh sa sút trí tuệ, hiện nay là mối quan tâm hàng đầu

của những nhà lão khoa trên toàn thế giới cũng như ở nước ta khi tuổi thọ

trung bình ngày càng cao, số người mắc bệnh ngày càng nhiều [6].

Bệnh nhân bị Alzheimer sẽ bị giảm khả năng xét đoán, định hướng

không gian và thời gian, ngôn ngữ, tư duy nhận thức và hành động... ảnh

hưởng nặng nề đến chức năng và chất lượng cuộc sống, gây nhiều khó khăn

cho người bệnh, cho gia đình và xã hội.

Các thuốc điều trị Alzheimer chủ yếu gồm các thuốc ức chế

cholinesterase, thuốc kháng thụ thể N-methyl – D – Aspartat, thuốc tăng

cường hoạt tính serotonin. Ba nhóm thuốc này đa số là các thuốc tân dược, giá

thành còn tương đối cao và có nhiều tác dụng phụ không mong muốn. Do đó

nhu cầu nghiên cứu phát triển thuốc mới có nguồn gốc từ dược liệu để hỗ trợ

và điều trị Alzheimer là rất cần thiết.

Acetylcholinesterase (AChE) là enzym có mặt ở khe synap của hệ thần

kinh trung ương và có vai trò duy trì sự ổn định nồng độ của chất dẫn truyền

thần kinh Acetylcholin [8]. Với việc Whitehouse lần đầu tiên đưa ra giả

thuyết về vai trò của hệ cholinergic đối với bệnh Alzheimer vào năm 1982,

AChE cũng được xác định là một trong những đích phân tử đối với bệnh này.

Trên cơ sở đó, một vài phương pháp thử in vitro đã được xây dựng. Trong đó,

phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử Ellman được sử dụng khá phổ biến

trong các nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế AChE in vitro. Đây cũng là

một hướng quan trọng và nhận được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học

2

trên thế giới và trong nước, đặc biệt đối với các thuốc có nguồn gốc dược liệu

[27,34].

Theo Y học cổ truyền Trung Quốc, Hoàng liên là thân rễ phơi khô của

nhiều loại Hoàng liên chân gà như: Coptis chinensis Franch, Coptis teeta

Wall, Coptis teetoides C.Y Cheng, Coptis deltoidea C.Y Cheng et Hsisao,

Coptis quinquesecta… thuộc họ Hoàng liên – Ranunculaceae được biết đến

với nhiều công dụng như kháng khuẩn, chống virus, chống viêm... Ở Việt

Nam, Hoàng liên chân gà (Coptis chinensis Franch) được dùng khá phổ biến

trong các bài thuốc với nhiều tác dụng tốt. Gần đây, một số nghiên cứu cho

thấy hợp chất berberin và một số alkaloid chiết xuất từ dược liệu có tiềm năng

ức chế enzym AChE cao mở ra hướng mới trong điều trị bệnh Alzheimer.

Nhận thấy, trong dịch chiết của Hoàng liên cũng có chứa một lượng lớn các

alkaloid đặc biệt là berberin có tiềm năng lớn trong nghiên cứu phát triển

thuốc mới từ dược liệu để phòng và điều trị bệnh thần kinh, suy giảm trí nhớ -

Alzheimer.

Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Đánh giá tác dụng ức

chế enzym Acetylcholinesterase in vitro của các phân đoạn dịch chiết Hoàng

liên (Coptis chinensis Franch)” với mục tiêu:

Mục tiêu 1: Đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE của các phân đoạn

dịch chiết Hoàng liên (Coptis chinensis Franch).

Mục tiêu 2: Đánh giá đặc điểm động học ức chế enzym AChE của phân

đoạn dịch chiết.

3

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về Hoàng liên chân gà (Coptis chinensis Franch) –

Họ Hoàng liên (Ranunculaceae)

1.1.1. Đặc điểm thực vật

Hiện nay có rất nhiều loài Hoàng liên chân gà được đưa vào sử dụng và

nghiên cứu như Coptis chinensis Franch, Coptis teeta Wall, Coptis deltoidea

C.Y.Cheng et Hsiao, Coptis quinqueseeta. Họ Hoàng liên: Ranunculaceae.

Hoàng liên: Coptis chinensis Franch, là một cây thuốc thuộc loại quý

với nhiều tác dụng được dùng trong nhiều bài thuốc ở Việt Nam. Tên khác:

Hoàng liên chân gà, Xuyên liên, Phàng lình (H’Mông) [9]. Read Coptis

(Anh), Coptis savoyard (Pháp) [2,9] Gia liên (Trung Quốc) [9].

Hoàng liên: Coptis chinensis Franch là cây thân thảo, sống nhiều năm,

cao 10-25 cm. Thân rễ có màu vàng thường phân nhánh, lá có cuống dài mọc

tập trung ở gốc, lá dài và mảnh chia thành 3 thùy chính. Mép khía răng không

đều, thùy giữa gần giống tam giác cân xẻ thùy hình dạng lông chim, không

đều. Hai thùy bên giống nhau có cuống lá ngắn hơn thùy giữa. Lá có màu

xanh lục, nhẵn bóng, cụm hoa gồm 3-5 hoa mọc tụ trên 1 cuống chung dài

khoảng 25 cm. Hoa nhỏ có màu vàng, lá bắc nhỏ, bao hoa màu lục. Năm lá

đài có hình mác, 5 cánh hoa thon dài, hoa có khoảng 20 nhị. Lá noãn rời nhau

khoảng 8-12 noãn. Cây ra hoa từ tháng 10-12. Quả có màu đen từ tháng 12

đến tháng 4 năm sau, nhỏ, dài 6-7 cm, có cuống ngắn. Vào mùa xuân cây con,

chồi có thể tái sinh từ thân rễ [2,4,5,7,9].

4

Hình 1.1. Hoàng liên chân gà (Coptis chinensis Franch)

1.1.2. Phân bố, trồng trọt và thu hái

Phân bố

Hoàng liên là loại cây thân thảo mọc hoang trên các đỉnh núi cao.

Trong cuốn “Thần Nông bản thảo kinh” (Trung Quốc) có viết Hoàng

liên là cây thuốc quý cao cấp, được xếp vào loại thượng phẩm, cây mọc ở trên

núi Thái Sơn có nhiều ở vùng Tứ Xuyên, Kiến Bình, Hồ Nam, Hồ Bắc, Triết

Giang [13,14].

Ở Việt Nam, Hoàng liên là loại cây thuốc hiếm thường mọc hoang ở

vùng núi có độ cao từ 1500 – 2000 m trong các khu rừng có nhiều cây cổ thụ

rậm rạp, ở nơi nửa sáng, nửa tối.

5

Trồng trọt

Ở Lào Cai, Hoàng liên mọc tại dãy Hoàng Liên Sơn (xã Tả Van, San

Sả Hồ, Lao Chải), Quảng Bạ (Hà Giang) [2,9]. Hoàng liên là cây ưa chỗ ẩm

mát, nhiệt độ thấp khoảng 20-250C. Muốn trồng Hoàng liên, chọn các quả già

nhưng chưa nứt vỏ. Đem quả về phơi cho nứt vỏ, chọn các hạt mập chắc rồi

reo ngay tránh để lâu làm mất khả năng mọc của hạt. Nếu chưa gieo ngay cần

trộn ủ hạt với đất lẫn cát ẩm. Trong vòng 1 tháng phải đem trồng nếu để lâu

hạt sẽ không nảy mầm.

Thu hái

Thu hái Hoàng liên thường vào cuối thu đầu đông tháng 9-10, để chất

lượng dược liệu đạt cao nhất, để sang xuân chất lượng sẽ kém. Cây mọc từ 4-

5 năm có thể được thu hoạch. Hoàng liên thu hái mang về rửa sạch, phơi hay

sấy khô là được [7].

1.1.3. Thành phần hóa học

Thân rễ Hoàng liên chứa hầu hết là các alkaloid (5 – 8%), trong đó chủ

yếu là berberin, worenin, jatrorrhizin, palmatin, coptisin, columbamin. Ngoài

ra còn có các alkaloid có nhân phenol, cũng như các alkaloid không có nhân

phenol.

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao và phương pháp quang phổ tử

ngoại đã được dùng để xác định berberin hydrochlorid, palmatin clorid,

jatrorrhizin hydrochlorid, epiberberin, coptisin, columbamin và magnoflorin

trong các mô khác nhau (như phloem (libe), xylem (chất gỗ) và medulla (lõi))

và rizhome (thân rễ) của Coptis Chinensis Franch. Kết quả cho thấy khác biệt

đáng kể trong việc phân bố của 7 alkaloid trong các mô được kiểm tra, tổng

hàm lượng alkaloid trong xylem tương đối thấp so với hàm lượng trong

phloem, medulla và rhizome của Hoàng liên [47,48].

Berberin tinh khiết là dạng tinh thể kết tinh màu vàng, điểm nóng chảy

1450C, tan nhiều trong nước ở 20

0C, tan trong ethanol, ít tan trong clorofom,

benzen, không tan trong ether ethylic. UVmax 265, 243nm, pk = 2,47 [2-4].

Hàm lượng berberin trong Hoàng liên đạt 5-6% có khi tới 9% [9].

Theo quy định của Dược điển Việt Nam IV, Dược liệu phải chứa ít

nhất 3,5 % beberin (C20H18NO4. HCl) và 0,5% (C21H22NO4. HCl) palmatin

tính theo dược liệu khô kiệt [3].

6

Trong cây, berberin tồn tại dưới dạng clohydrat. Hàm lượng alkaloid

thay đổi tùy theo vùng và thời kỳ sinh trưởng của cây. Ở Tứ Xuyên (Trung

Quốc), hàm lượng berberin cao nhất vào tháng 9 và 10, thấp nhất vào thời kỳ

cây ra hoa. Ngoài thân rễ, lá cũng chứa berberin, hàm lượng cao nhất ở lá già.

Ở Nhã Liên (Trung Quốc), hàm lượng berberin chứa 5% vào tháng 9-10. Lá

già chứa 2,5 – 2,8% berberin vào tháng 7-10 [4,7,9].

Ngoài ra, trong dịch chiết EtOH của Hoàng liên còn phân lập được 13 hợp

chất non-alkaloid như 7 hợp chất lignan, 3 phenylpropanoid đơn giản, 2 hợp chất

flavon và 1 hợp chất phenolic acid. Đó là các hợp chất: erythro-guaiacylglycerol-

8-O-4'-(coniferyl alcohol) ether, threo-guaiacylglycerol-8-O-4'-(coniferyl

alcohol) ether, (+)-pinoresinol, (+)-medioresinol, (+)-lariciresinol, (+)-5'-

methoxylariciresinol, (+)-isolariciresinol, chlorogenic acid, ferulic acid, Z-

octadecyl caffeat, rhamnetin, wogonin, and vanillic acid [12].

7

Công thức cấu tạo của một số alkaloid phân lập từ thân rễ Hoàng Liên

thể hiện ở hình 1.2.

Hình 1.2. Công thức cấu tạo một số chất trong thân rễ Hoàng liên

8

1.1.4. Bộ phận dùng

Thân rễ (Rhizoma Coptidis) là những mẩu cong queo dài 3-5 cm, rộng

0,2 - 0,5 cm. Có nhiều đốt khúc khuỷu và phân nhánh, trông giống hình chân

gà nên được gọi là Hoàng liên chân gà. Mặt ngoài màu nâu mang vết tích của

rễ phụ và cuống lá. Thể chất cứng rắn, vết bẻ ngang không phẳng. Phần gỗ

màu vàng tươi, vị rất đắng lưu vị lâu trong miệng [2,7,9].

1.1.5. Tác dụng dược lý

Tác dụng kháng khuẩn

Dịch chiết Hoàng liên và hoạt chất berberin đều có phổ kháng khuẩn rất

rộng. Nước sắc thể hiện tác dụng ức chế vi khuẩn ở các nồng độ pha loãng

sau: Nồng độ 1:5120 có tác dụng với Shigella shiga; nồng độ 1: 2560 có tác

dụng với Shigella dysenteriae; nồng độ 1: 1640 có tác dụng với

Staphylococcus aureus [4,9].

Dung dịch berberin clohydrat được pha loãng tiến hành phản ứng in

vitro cho thấy: nồng độ 1:32000 có tác dụng ức chế đối với Vibrio cholerae;

nồng độ 1:16000 có tác dụng với Staphylococcus aureus; nồng độ 1:8000 có

tác dụng ức chế vi khuẩn đối với Shigella dysenteriae, Streptococcus viridans

[1,4,9].

Tiêm tĩnh mạch trên chó với berberin clohydrat liều lượng 19mg/kg đã

cứu sống được con vật bị nhiễm trùng huyết thực nghiệm gây ra bởi

Staphylococcus aureus [1,9].

Dịch chiết thô Hoàng liên có tác dụng ức chế ký sinh đường ruột

Blastocystis hominis rất mạnh với nồng độ 100 µg/ml [1].

Về cơ chế tác dụng kháng khuẩn: berberin có khả năng ức chế quá trình

phiên mã và dịch mã tạo ARN và protein ở vi khuẩn. Các chất vitamin B6,

nicotinamid, acid p – aminobenzoic đều có tác dụng đối kháng với berberin.

Có hiện tượng kháng thuốc xảy ra khi dùng dài ngày berberin sulfat trên các

bệnh liên quan đến các chủng tụ cầu vàng, liên cầu khuẩn tán huyết, trực

trùng lỵ, nhưng đối với bài thuốc có Hoàng liên như bài “Hoàng liên giải độc

thang” thì không có hiện tượng kháng thuốc, ngược lại tác dụng kháng khuẩn

lại mạnh hơn [7,9].

Dịch chiết nước Hoàng liên có khả năng ổn định phức hợp không bền

với enzym ADN topoisomerase I ở động vật có vú. Nghiên cứu cho thấy rằng

9

hai tiền chất epiberberin và gloenlandicin của berberin là những tiểu phân

hoạt động có hoạt tính phân tách ADN qua trung gian topoisomerase I; song 2

alkaloid này lại không phân tách AND qua trung gian topoisomerase II. Chỉ

có tiền chất berberrubin (alkaloid loại protoberberin) là chất đặc hiệu phân

tách ADN qua trung gian topoisomerase II in vitro.

Những kết quả này cho thấy alkaloid gốc berberin là nhóm hợp chất có

khả năng tạo phức không bền với topoisomerase I và II [30].

Tác dụng kháng virus

Dịch chiết nước Hoàng liên thí nghiệm trên phôi gà có tác dụng ức chế

sự phát triển của virus cúm chủng PR8 [1].

Palmatine có trong Hoàng liên có khả năng ức chế không cạnh tranh

enzym protease NS2B-NS3 của virus West Nile (WNV), với IC50 là 96 µM,

không gây độc tính tế bào. Hơn nữa, palmatin cũng có thể ức chế virus

dengue và virus sốt vàng theo các liều lượng. Hợp chất này có thể được phát

triển để điều trị các nhiễm trùng do virus [21].

Tác dụng kháng nấm, đơn bào gây bệnh

Hoàng liên có tác dụng kháng một số loài nấm gây bênh ngoài da với

dịch chiết nước từ dược liệu này pha loãng 1:30 đã chứng tỏ tác dụng.

Quan sát dưới kính hiển vi berberin với nồng độ 1:5000 cho chuột nhắt

trắng đã được gây nhiễm amip uống với liều lượng 50 mg/kg có tác dụng ức

chế sinh trưởng của amip gây bệnh.

Dịch chiết Hoàng liên cho thấy tác dụng chống đơn bào Trypanosoma

cruzi gây bệnh Chagas với IC50 khá thấp là 1,7 µg/ml; và không gây độc cho

tế bào [36].

Tác dụng trên đường tiêu hóa

Hoàng liên có tác dụng chống loét đường tiêu hóa. Nghiên cứu cho

chuột cống trắng uống dich chiết alkaloid của Hoàng liên có tác dụng ức chế

nhẹ loét dạ dày thực nghiệm do stress. Bằng đường tiêm dưới da trên chuột

cống trắng berberin có tác dụng ức chế hình thành vết loét và hiện tượng chảy

máu dạ dày trong mô hình gây loét do thắt môn vị [9].

Dịch chiết từ Hoàng liên có tác dụng làm tăng nhẹ sự phân tiết dịch

nước bọt, dịch vị, dịch mật và tăng cường hoạt động của ruột, dạ dày từ đó

kích thích tiêu hóa, có lợi cho đường tiêu hóa [4,7].

10

Nghiên cứu cho thấy, dịch chiết nước của thân rễ Hoàng liên có tác

dụng ức chế Helicobacter pylori (H.pylori), ngăn ngừa và phòng tránh các

bệnh liên quan đến loét dạ dày- tá tràng; có so sánh với berberin và dịch

chiết Hoàng bá (Cortex Phellodendri). Tác dụng ức chế enzym urease tiết

ra bởi H.pylori và urease của đậu jack của dịch Hoàng liên cao hơn Hoàng

bá và berberin (với giá trị IC50 nhỏ hơn hẳn). Sự ức chế không cạnh tranh

của Coptis chinensis Franch có sự tương quan nồng độ và thời gian, có khả

năng giải ức chế bằng glutathion được cho là do sự tương tác của các hợp

chất trong dịch chiết với nhóm sulfhydryl của vị trí hoạt động trên enzym

urease [32,51].

Tác dụng chống viêm

Coptisin, thành phần chính của Coptis chinensis Franch, đã cho thấy

khả năng ức chế mạnh sản xuất oxit nitơ (NO) bằng cách ức chế protein và

các biểu hiện mARN của enzym tổng hợp oxi nitric (iNOS) trong

lipopolysaccharid (LPS) kích thích các đại thực bào RAW 264.7. Coptisin

cũng ức chế sản xuất các cytokin gây viêm là interleukin-1β (IL-1β) và

interleukin-6 (IL-6) bằng cách ức chế sự biểu hiện mARN của cytokin; đồng

thời ức chế sự thoái hoá của protein ức chế nhân tố nhân κBα (IκBα) và

phosphoryl hóa yếu tố điều chỉnh tín hiệu ngoại bào (ERK), c-Jun NH2-

terminal kinase (JNK), p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK), và

phosphoinositide 3-kinase/Akt (PI3K/Akt). Coptisin cũng ức chế sự xuất hiện

của TNF-α và NO trong các mô viêm ở chuột thí nghiệm.

Các kết quả này cho thấy coptisin trong Hoàng liên ức chế sự viêm LPS

bằng cách ngăn chặn sự kích hoạt yết tố nhân κB, MAPK và PI3K / Akt trong

các đại thực bào có tác dụng chống viêm đặc hiệu [19,45].

Dịch chiết thân rễ Coptis chinensis Franch kích hoạt tế bào MOLT-4,

Th1, MAPK giúp tăng cường miễn dịch trong viêm, đóng vai trò như các chất

bổ trợ, bổ sung để điều trị trong suy giảm hệ thống miễn dịch [20].

Tác dụng chống oxy hóa

Dịch chiết ethanol hoa cây Hoàng liên cho thấy khả năng làm tăng

lượng superoxid dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathion (GSH)

trong tế bào giúp trung hòa các gốc tự do có tác dụng chống oxy hóa mạnh cả

in vitro và in vivo [46].

11

Jatrorrhizin chứng tỏ khả năng chống oxy hóa do độc tính của hydrogen

peroxid gây ra ở tế bào não chuột thí nghiệm [39].

Tác dụng trên tim, hạ huyết áp

Tiêm dưới da dịch chiết nước của Hoàng liên hoặc berberin trên súc vật

thí nghiệm có tác dụng làm hạ huyết áp nhất thời; chế phẩm điều chế từ

Hoàng liên đã loại bỏ berberin cũng có tác dụng làm hạ huyết áp trên chuột

cống trắng [1].

Thành phần palmatin và coptisin trong dịch chiết Hoàng liên có tác

dụng bảo vệ và giảm tổn thương tế bào cơ tim thông qua việc làm bền vững ty

thể màng, giảm kích thước vùng bị nhồi máu, giải phóng malondialdehyd

(MDA), tăng superoxid dismutase (SOD) [28,49,52].

Tác dụng phòng xơ vữa động mạch, giảm béo phì

Trên thỏ thí nghiệm được nuôi bằng chế độ ăn uống có lượng

cholesterol cao, dịch chiết nước Hoàng liên dùng bằng đường uống có tác

dụng làm cho tỷ lệ cholesterol toàn phần/lipid trở về giá trị bình thường

[4,9,24].

Berberin trong dịch chiết Hoàng liên có khả năng làm tăng sự biểu hiện

của enzym adipose triglycerid lipase (ATGL) và hormone-sensitive lipase

(HSL) đẩy nhanh quá trình phân giải triacylglycerol (TG) ở mô mỡ, có tác

dụng đáng kể trong giảm béo phì [16,29].

Trong dịch chiết Hoàng liên chứa Jatrorrhizin hydrochlorid (JH) được

nghiên cứu có khả năng ức chế hình thành lipid và tăng cường oxy hóa lipid

trong gan chuột thí nghiệm [43].

Tác dụng hạ đường huyết

Dịch chiết Hoàng liên làm giảm khả năng kháng insullin của tế bào

trong mô hình chuột Wistar bị đái tháo đường týp II gây ra bởi chế độ ăn giàu

chất béo và tiêm streptozotocin thông qua con đường ức chế c-Jun N terminal

kinase [24,37].

Tác dụng trên hệ thần kinh

Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng Hoàng liên cũng có tác dụng an thần,

chống trầm cảm, stress, tác dụng tốt trên hệ thần kinh. Berberin, jatrorhizin và

palmatin được phân lập từ dịch chiết MetOH của Hoàng liên Coptis chinensis

12

Franch có tác dụng ức chế MAO (monoaminoxidase- enzym xúc tác quá trình

phân hủy chất dẫn truyền thần kinh monoamin).

Jatrorrhizin ức chế không cạnh tranh MAO-A và B ở ty thể của tế bào

não chuột với giá trị IC50 lần lượt là 4 và 62 µM. Berberin chỉ ức chế cạnh

tranh với giá trị IC50 là 126 µM. Trong khi palmatin không có khả năng ức

chế mặc dù nồng độ dùng là 200 µM [31,39].

Dịch chiết Hoàng liên cho thấy khả năng tăng tiết và tăng hoạt tính của

enzym tyrosin hydroxylase kích thích nơ-ron thần kinh trong mô hình in vitro

và in vivo ở bệnh Parkinson gây ra bởi MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-

tetrahydropyridin)[41].

Trong mô hình gây stress oxy hóa tế bào thần kinh bằng tert-

butylhydroperoxid (t-BOOH), dịch chiết nước Hoàng liên nồng độ 100 µg/ml

cho thấy khả năng tăng sự sống sót của tế bào, giảm tỷ lệ tế bào tự chết theo

chương trình (apoptosis) và tăng hoạt lực của ty thể trêng màng; tác dụng bảo

vệ tế bào thần kinh [40].

Hiện nay có một số nghiên cứu mới chứng minh tác dụng ức chế

enzym Acetylcholinesterase của dịch chiết toàn phần Hoàng liên in vitro cải

thiện tình trạng suy giảm trí nhớ và tiến tới điều trị bệnh Alzheimer [17,26].

Tác dụng chống ung thư

Hoạt chất berberin phân lập từ chiết xuất Hoàng liên cho thấy tác dụng

chống ung thư trên đích tác dụng ephrin-B2, ức chế tế bào khối u ZR-75-30

phát triển và dự di căn của chúng [43]. Trong nghiên cứu trên tế bào ung thư

tuyến tiền liệt in vitro, berberin cho thấy tác dụng ức chế sự ra tăng tế bào ưng

thư thông qua khả năng kích thích quá trình tế bào tự chết theo chương trình

apoptosis hoặc ngừng chu trình tế bào bằng cách ức chế tín hiệu của yếu tố

tăng trưởng biểu bì EGFR (epidermal growth factor receptor) [50].

Trong thành phần dịch chiết Hoàng liên chứa jatrorrhizin hydrochlorid

có tác dụng chống u ác tính trên da do có khả năng ức chế tăng sinh tân mạch

máu ở tế bào u ác tính di căn ở tế bào người C8161 in vitro [35].

Độc tính

Berberin ít độc. Trên người uống một lần 2 g, chưa phát hiện có triệu

chứng ngộ độc [1]. Bài tiết rất nhanh, một phần qua nước tiểu, một phần bị

13

chuyển hóa trong cơ thể [7]. Hiện chưa có nghiên cứu chứng minh độc tính

của Hoàng liên chân gà lên cơ thể người.

1.2. Tổng quan về nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế enzym

Acetylcholinesterase in vitro

1.2.1. Acetylcholin, enzym Acetylcholinesterase và giả thuyết về vai

trò của hệ cholinergic đối với bệnh Alzheimer

1.2.1.1. Acetylcholin

Acetylcholin (ACh) là chất trung gian hóa học có mặt trong phần lớn

các khe synap thần kinh trung ương, thần kinh thực vật, thần kinh-cơ.

Acetylcholin tìm thấy ở hành não, cầu não, thân não, não trung gian, thể vân

và vỏ não mới (nhiều nhất ở vùng vận động). Trong tủy sống, các hạch thần

kinh thực vật, các tận cùng thần kinh tiếp xúc với cơ quan ngoại vi đều chứa

ACh.

Acetylcholin được tổng hợp từ cholin và acetyl Coenzym A do enzym

cholin acetyl transferase xúc tác phản ứng, sau đó, được lưu giữ ở vị trí cuối

dây thần kinh, trong các túi. Các chất trong túi được giải phóng khi vị trí cuối

dây thần kinh bị khử cực và khi đó ACh được giải phóng vào khe synap và

gắn với thụ thể. ACh sau khi được giải phóng có thời gian bán thải rất ngắn vì

sự có mặt của enzym AChE. Đây là enzym thủy phân dây nối este trong phân

tử ACh tạo ra cholin và acid acetic. Cholin sau đó được thu nhận lại vào tế

bào thần kinh để tổng hợp ACh. Do đó, những chất có tác dụng ức chế AChE

sẽ kéo dài thời gian tồn tại và thời gian tác dụng của ACh [8,11].

Trong những năm gần đây, ACh được thấy có liên quan tới nhiều chức

năng khác bên cạnh chức năng dẫn truyền thần kinh. Trong đó, ACh được

xem là có liên quan đến sự tiến triển của bệnh viêm dây thần kinh và quá trình

sản sinh sợi amyloid, những đặc điểm điển hình được thấy trong tế bào não

của bệnh nhân mắc bệnh Alzheimer [33].

1.2.1.2. Enzym Acetylcholinesterase

AChE, với vai trò thủy phân ACh, là một protêin có hình elip chứa một

rãnh sâu, được gọi là hẻm. Quá trình thủy phân ACh được xúc tác bởi AChE

diễn ra ở đáy của hẻm enzym theo cơ chế khá phức tạp. Ở đáy của hẻm, nơi

xảy ra sự thủy phân cơ chất ACh, có 4 vị trí hoạt động chính là vị trí este hóa,

14

vị trí oxy-anion, vị trí anion và túi acyl [27]. Những vị trí hoạt động này của

AChE được minh họa ở hình 1.3.

Hình 1.3. Các vị trí hoạt động của enzym AChE

AChE là một trong những enzym thủy phân nhanh nhất. Hoạt tính của

nó mạnh gấp khoảng 10 lần so với serin protease hoặc butyrylcholinesterase

(enzym thủy phân ACh chủ yếu ở tế bào thần kinh đệm) ở cùng điều kiện

nhiệt độ và pH [23].

1.2.1.3. Giả thuyết về vai trò hệ cholinergic đối với bệnh Alzheimer

AChE chủ yếu có mặt trong hệ thần kinh trung ương, xúc tác thủy phân

chất dẫn truyền ACh. Quá trình này cần thiết để chuyển tế bào thần kinh hệ

cholinergic từ trạng thái hoạt động sang tình trạng nghỉ [8,27]. Ở bệnh nhân

Alzheimer thấy có sự giảm trầm trọng nồng độ chất dẫn truyền thần kinh

ACh. Tình trạng này gây suy giảm khả năng nhận thức đối với người bệnh.

Giả thuyết về vai trò của hệ cholinergic trong bệnh Alzheimer được đưa ra lần

đầu tiên vào năm 1982 bởi tác giả Whitehouse và cộng sự. Sau đó, giả thuyết

này nhanh chóng trở thành động lực cho quá trình nghiên cứu theo hướng cải

thiện chức năng hệ cholinergic trên bệnh nhân mắc bệnh Alzheimer. Theo giả

thuyết này, những chất ức chế sự hoạt động của AChE làm tăng nồng độ và

15

thời gian hoạt động của ACh ở synap thần kinh từ đó cải thiện triệu chứng

bệnh [15,33].

1.2.2. Một số phương pháp thường dùng trong nghiên cứu sàng lọc

tác dụng ức chế enzym Acetylcholinesterase in vitro

Nghiên cứu sàng lọc là giai đoạn đầu của quá trình nghiên cứu phát

triển thuốc mới. Giai đoạn này thường tiến hành đánh giá hoạt tính của một

lượng lớn các mẫu thử. Vì vậy, những phương pháp được lựa chọn để sử dụng

ở giai đoạn này phải là những phương pháp có thể tiến hành đồng thời nhiều

mẫu, lượng mẫu cần ít, cho kết quả nhanh và chi phí thấp. Phương pháp thử in

vitro đáp ứng được tất cả những yêu cầu đó. Đối với nghiên cứu sàng lọc tác

dụng ức chế AChE in vitro, có 2 phương pháp thường được sử dụng là

phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman và phương pháp sử dụng thuốc thử

muối Fast Blue B.

1.2.2.1. Phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman

Trong số những phương pháp được sử dụng để nghiên cứu sàng lọc tác

dụng ức chế AChE in vitro, phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman được xây

dựng và ứng dụng sớm nhất. Hiện nay, phương pháp này vẫn được sử dụng

khá phổ biến ở nhiều nghiên cứu cùng hướng. Trong đó, phương pháp đo

quang được sử dụng nhiều hơn phương pháp sắc ký lớp mỏng. Phương pháp

này sử dụng cơ chất là acetylthiocholin iodid (ATCI) và thuốc thử là 5,5’-

dithiobis - nitrobenzoic acid (DTNB).

Phương pháp đo quang

Phương pháp của Ellman dùng để xác định hoạt tính của enzym

cholinesterase dựa vào đo quang được tác giả này mô tả lần đầu tiên vào năm

1961[18,33]. Nguyên tắc của phương pháp: cơ chất ATCI bị thủy phân nhờ

xúc tác của cholinesterase tạo thiocholin. Thiocholin phản ứng với thuốc thử

DTNB giải phóng ra hợp chất 5-thio-2-nitrobenzoic acid màu vàng. Hợp chất

này được xác định bằng cách đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 412

nm.

Sau đó, nhiều nghiên cứu sàng lọc về tác dụng ức chế AChE in vitro

khác tiếp tục được thực hiện. Tuy nhiên, so với phương pháp gốc được công

bố bởi Ellman, phương pháp được triển khai trong các nghiên cứu sau đó đều

có một số thay đổi về: nguồn gốc và hoạt độ của enzym, loại đệm sử dụng,

16

nồng độ dung dịch cơ chất và thuốc thử… cũng như tỷ lệ phối hợp của chúng

vào hỗn hợp phản ứng.

Phương pháp sắc ký lớp mỏng

Trên cơ sở phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử Ellman, phương

pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) đã được phát triển. Ở phương pháp này, sau khi

bản mỏng được triển khai, hỗn hợp gồm dung dịch thuốc thử DTNB và cơ

chất ATCI được phun lên bản mỏng, sau đó mới phun dung dịch enzym.

Những chất gây ức chế AChE sẽ làm xuất hiện các vết màu trắng trên nền

vàng [10].

Một trong những hạn chế của phương pháp TLC là có thể gặp phải hiện

tượng dương tính giả, hiện tượng vết màu trắng xuất hiện trên bản mỏng

không phải do tác dụng ức chế AChE. Để khắc phục hạn chế này, bên cạnh

bản mỏng thử phải tiến hành làm thí nghiệm với một bản mỏng khác (bản đối

chiếu). Các bước tiến hành trên bản đối chiếu tương tự như trên bản thử chỉ

khác ở giai đoạn phun thuốc thử hiện màu. Đối với bản thử, hỗn hợp dung

dịch thuốc thử DTNB và cơ chất ATCI được phun trước, sau đó mới phun

dung dịch AChE. Với bản đối chiếu, dung dịch thuốc thử DTNB được phun

trước, sau đó hỗn hợp gồm dung dịch cơ chất ATCI và dung dịch AChE được

phun sau. Cách bố trí thử nghiệm như trên nhằm đảm bảo những vết màu

trắng xuất hiện trên cả hai bản là những vết cho phản ứng dương tính giả.

1.2.2.2. Phương pháp sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B

So với phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman, số lượng nghiên cứu sử

dụng phương pháp này để sàng lọc tác dụng ức chế AChE in vitro khá hạn

chế. Phương pháp này sử dụng cơ chất là α-naphthyl acetat và thuốc thử là

muối Fast Blue B (muối O-dianisidin bis(diazotized) zinc double).

Phương pháp đo quang

Thử nghiệm đo quang sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B được công

bố lần đầu tiên bởi tác giả Van Asperen K. vào năm 1962 [7]. Nguyên tắc của

phương pháp: cơ chất α-naphthyl acetat bị thủy phân bởi enzym esterase giải

phóng chất α-naphthol. Chất này sau đó phản ứng với thuốc thử muối Fast

Blue B tạo thành sản phẩm màu diazo. Hợp chất này được xác định bằng cách

đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 600 nm. Tuy nhiên, sau đó, không

có nhiều nghiên cứu sử dụng phương pháp này để nghiên cứu sàng lọc tác

17

dụng ức chế AChE in vitro và một trong số đó là nghiên cứu của tác giả Di

Giovanni S. [15]. Phương pháp được sử dụng trong nghiên cứu của tác giả

này có một số thay đổi so với phương pháp của tác giả Van Asperen về:

nguồn gốc và hoạt độ của enzym, hóa chất để bất hoạt enzym và nồng độ

dung dịch cơ chất.

Phương pháp sắc ký lớp mỏng

Muối Fast Blue B cũng được sử dụng như một thuốc thử trong phương

pháp TLC để nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế AChE in vitro và được phát

triển bởi Marston năm 2002. Ở phương pháp này, sau khi bản mỏng được triển

khai, dung dịch enzym được phun lên bản mỏng. Sau đó, hỗn hợp gồm dung dịch

cơ chất α-naphthyl acetat và dung dịch thuốc thử muối Fast Blue B được phun lên

bản mỏng. Những chất gây ức chế AChE sẽ làm xuất hiện các vết màu trắng trên

nền màu tím sẫm [15].

Cũng giống phương pháp BTLC sử dụng thuốc thử Ellman, phương

pháp TLC sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B cũng có thể gặp phải hiện

tượng dương tính giả. Để loại trừ các vết dương tính giả, một bản mỏng đối

chiếu tương tự với bản mỏng thử được triển khai. Sau đó, các dung dịch α-

naphthol và muối Fast Blue B được phun lên bản mỏng mà không có dung

dịch enzym. Nếu xuất hiện vết màu trắng thì vết đó là vết dương tính giả.

Bên cạnh 2 phương pháp được trình bày ở trên, phương pháp điện di

mao quản cũng đã được sử dụng để nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế

AChE in vitro trong nghiên cứu của Tang Z. M. (2007) [38]. Tuy nhiên, mới

chỉ có rất ít nghiên cứu sử dụng phương pháp này được công bố. Lý do là bởi

phương pháp này đòi hỏi phải có trang thiết bị phù hợp với thao tác thử

nghiệm tương đối phức tạp. Ngoài ra, hạn chế về số lượng mẫu thử được đánh

giá ở mỗi lần thao tác máy cũng góp phần cản trở việc ứng dụng phương pháp

điện di mao quản trong nghiên cứu sàng lọc.

Như vậy, Hoàng liên chân gà (Coptis chinensis Franch) có chứa một

lượng cao các alkaloid đặc biệt là berberin cho thấy tác dụng khả quan trên

enzym AChE để tiến tới điều trị các bênh thần kinh sa sút trí tuệ rất đáng quan

tâm. Tuy nhiên các nghiên cứu về tác dụng tiềm năng này của Hoàng liên còn

khá ít trong khi nhu cầu về thuốc điều trị và dự phòng bệnh Alzheimer càng

tăng. Đây cũng là cơ sở khoa học để hình thành ý tưởng của đề tài này.

18

Với mục tiêu nghiên cứu đánh giá tác dụng ức chế AChE in vitro của

các phân đoạn dịch chiết Hoàng liên, phương pháp đo quang sử dụng thuốc

thử Ellman được lựa chọn để áp dụng trong nghiên cứu đề tài khóa luận.

19

CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên vật liệu

2.1.1. Mẫu nghiên cứu

Thân rễ phơi khô của cây Hoàng liên chân gà thu hái vào tháng 8 năm

2016 ở Hà Giang. Mẫu nghiên cứu được giám định thực vật học bởi Bộ môn

Dược liệu – Dược cổ truyền, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội.

2.1.2. Hóa chất, dung môi

- Hóa chất: AChE (mã số EC 3.1.1.7) (Sigma, Singapore)

- Acetylthiocholine (ACTI) (Sigma, Singapore)

- Acid 5-5’-dithiobis-2-nitrobenzoic (DTNB) (Sigma, Singapore)

- Tris-HCl và berberin clorid chuẩn (Sigma, Singapore)

- HCl (Merck).

- Dung môi: n-Hexan, Ethyl acetat (EtOAc), n-Butanol, Ethanol

(EtOH) (Shouguang, Trung Quốc) và nước cất; Methanol (MeOH) (Merck).

2.1.3. Máy móc, thiết bị và dụng cụ

- Hệ thống máy cô quay

- Máy đo quang UV Aligent technologies Cary 60 UV-Vis (Mỹ).

- Máy đo pH Mettler Toledo (Thụy Sĩ).

- Cân phân tích Mettler Toledo (Thụy Sĩ) độ chính xác 0,1 mg.

- Dụng cụ thủy tinh: các loại cốc có mỏ dung tích 25-100 ml; bình cầu

dung tích 1500 ml, pipet chính xác, bình định mức và các thiết bị dụng cụ cần

thiết khác.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE

Phương pháp chiết xuất phân đoạn dịch chiết

Để đánh giá tác dụng ức chế AChE, đầu tiên, tiến hành chiết xuất

dược liệu thân rễ Hoàng liên khô thu bằng ethanol (EtOH) được dịch

EtOH chứa các thành phần alkaloid [48]. Dịch chiết này sau đó được chiết

lần lượt bằng các dung môi n-Hexan, Ethyl acetat và n-Buthanol thu được

các phân đoạn dịch chiết. Cô quay thu hồi cắn dược liệu để tiến hành thử

hoạt tính. Quá trình chiết xuất phân đoạn dịch chiết Hoàng liên (Coptis

chinensis Franch) được tóm tắt trong sơ đồ hình 2.1.

20

Hình 2.1. Sơ đồ chiết xuất phân đoạn dược liệu Hoàng liên

Cách tiếp cận

Phương pháp đo quang in vitro dùng để đánh giá tác dụng ức chế

AChE được xây dựng và sử dụng trong nghiên cứu rất phổ biến hiện nay.

Nguyên tắc của phương pháp như sau [18]:

Cơ chất acetylthiocholin iodid (ACTI) bị thủy phân nhờ xúc tác của

AChE tạo thiocholin. Sản phẩm thiocholin phản ứng với thuốc thử acid 5-5’-

dithiobis-2-nitrobenzoic (DTNB) tạo thành hợp chất acid 5-thio-2-nitro

benzoic có màu vàng. Lượng hợp chất màu được tạo thành này tỷ lệ thuận với

hoạt độ của AChE. Dựa vào xác định độ hấp thụ của mẫu thử ở 412 nm để

đánh giá hoạt tính của AChE. Phương trình phản ứng được trình bày ở hình

2.2.

21

Hình 2.2. Quá trình phản ứng diễn ra trong phương pháp đo quang sử dụng

thuốc thử Ellman

Đã có nhiều nghiên cứu sàng lọc áp dụng hướng thực hiện này tuy nhiên

mỗi nghiên cứu đều có những điều chỉnh phù hợp với điều kiện nghiên cứu về:

Nồng độ dung dịch cơ chất ACTI, nồng độ thuốc thử DTNB, hoạt độ của AChE,

thời gian ủ,…

Triển khai phương pháp đánh giá tác dụng ức chế AChE in vitro

Tiến hành pha đệm natri phosphat pH = 8, pha enzym dạng đông

khô trong đệm tris-HCl, mẫu thử, mẫu chứng được nồng độ thí nghiệm.

Quy trình thực nghiệm tiến hành như sau:

Cách pha đệm natri phosphat pH=8

- Dung dịch mononatri orthophosphat 0,2M: 27,8g NaH2PO4 trong

500ml nước cất (dung dịch a).

- Dung dịch dinatri hydropphosphat 0,2M: 53,05g Na2HPO4 .7H2O

trong 500ml nước cất (dung dịch b).

- Lấy 26,5 ml dung dịch a, 437,5 ml dung dịch b và 500ml nước cất

định mức trong bình định mức 1000ml.

- Kiểm tra lại pH của đệm bằng máy đo pH và điều chỉnh pH bằng

dung dịch chuẩn HCl hoặc NaOH 1M.

22

Cách pha enzym AChE, cơ chất, thuốc thử.

- Enzym: Cân chính xác 1mg bột AChE (mã số EC 3.1.1.7) tương

ứng với 265 đơn vị (265 IU) pha trong 53 ml dung dịch đệm tris-HCl tạo

thành dung dịch 5 IU/ml, từ dung dịch này pha loãng 20 lần thu được dung

dịch enzym nồng độ 0,25 IU/ml sử dụng cho phương pháp đo quang.

- Cơ chất: cân 0,1446g acetylthiocholin iodid (ACTI) pha trong 25ml

nước cất tạo thành dung dịch có nồng độ 20mM, từ dung dịch đó pha loãng 8

lần thu được dung dịch cơ chất có nồng độ 2,5 mM.

- Thuốc thử: Cân 0,1982g thuốc thử DTNB pha trong 25ml dung

dịch đệm phosphat tạo thành dung dịch có nồng độ 20 mM, pha loãng dung

dịch này 8 lần thu được dung dịch thuốc thử nồng độ 2,5 mM.

Cách pha các dải nồng độ dung dịch mẫu thử và mẫu đối chứng

- Dung dịch mẫu thử: Cân chính xác 10mg cắn của 4 phân đoạn dịch

chiết EtOH, n-Hexan, EtOAc và n-BuOH của Hoàng liên chân gà như đã

chuẩn bị trong mục chiết xuất (3.1), hòa tan hoàn toàn trong 10ml MeOH thu

được dung dịch có nồng độ 1 mg/ml. Từ dung dịch có nồng độ 1mg/ml pha

loãng thành các dung dịch có nồng độ 500µg/ml; 250 µg/ml; 125 µg/ml; 62,5

µg/ml; 31,25 µg/ml; 15,625 µg/ml; và 7,8125 µg/ml.

- Dung dịch đối chứng: Cân chính xác 1 mg berberin clorid hòa tan

trong 2ml dung dịch MeOH thu được dung dịch có nồng độ 500 µg/ml; từ

dung dịch này pha loãng thành các nồng độ 10 µg/ml; 2 µg/ml; 0,1 µg/ml và

0,05 µg/ml.

Cách tiến hành

Thêm lần lượt từng dung dịch gồm: dung dịch đệm natri phosphat

pH=8, dung dịch mẫu thử hoặc mẫu chứng và dung dịch enzym vào cuvet 1

cm. Hỗn hợp các dung dịch này được trộn đều và ủ ở 250C trong 15 phút. Sau

đó, dung dịch thuốc thử DTNB và dung dịch cơ chất ACTI lần lượt được

thêm vào hỗn hợp và trộn đều. Tiếp tục ủ hỗn hợp trong 10 phút ở 250C, sau

đó, dung dịch được đo độ hấp thụ ở bước sóng 412nm. Mỗi thử nghiệm được

lặp đi lặp lại 3 lần. Quy trình thử nghiệm được tóm tắt ở hình 2.3.

23

Hình 2.3. Sơ đồ quy trình thử nghiệm tác dụng ức chế AChE in vitro

Phần trăm ức chế hoạt độ enzym AChE (% I) được tính theo công thức:

%I = Ac - At

Ac - Ao × 100

Trong đó: %I: phần trăm hoạt tính AChE bị ức chế

Ac: độ hấp thu của mẫu chứng (không chứa 100µl dung

dịch thử)

At: độ hấp thu của mẫu thử

Ao: độ hấp thu của mẫu trắng (1000 µL dung dịch đệm

natri phosphat)

Từ giá trị I% xác định được, tiến hành tính giá trị IC50 (nồng độ của

mẫu ức chế 50% hoạt tính enzym) của từng mẫu thử như sau:

- Pha 1 dãy nồng độ của mẫu thử, xác định I% của từng nồng độ mẫu

thử đó.

- Với những mẫu thử có sự tương quan tuyến tính giữa giá trị I% và

nồng độ, tiến hành xây dựng đường hồi quy tuyến tính y = a.x + b, trong đó, y

là giá trị % tác dụng ức chế enzym và x là nồng độ mẫu thử.

24

- Với những mẫu không có sự tương quan tuyến tính giữa I% và

nồng độ, tiến hành xây dựng đường hồi quy tuyến tính y = a.log(x) + b.

- Thay giá trị y = 50% vào phương trình tuyến tính mới xây dựng

được từ đó tính được giá trị của nồng độ x. Giá trị tìm được này chính là giá

trị IC50.

Để có cơ sở đánh giá tác dụng ức chế AChE in vitro của mẫu nghiên

cứu, berberin clorid được sử dụng làm mẫu chứng dương. Hợp chất này đã

được nghiên cứu và chứng minh tác dụng ức chế AChE khá mạnh được sử

dụng làm mẫu chứng dương trong nhiều nghiên cứu [17,26].

2.2.2. Phương pháp đánh giá đặc điểm động học ức chế enzym AChE

Từ mẫu cắn đã được lựa chọn trên kết quả khảo sát trước về tác dụng

ức chế AChE in vtro, tiếp tục tiến hành đánh giá động học ức chế AChE với

phân đoạn dịch chiết này ở các nồng độ gần sát giá trị nồng độ ức chế IC50 để

nghiên cứu động học ức chế.

Cách pha nồng độ mẫu thử

Cân chính xác 1mg cắn n-BuOH của dịch chiết Hoàng liên chân gà hòa

tan trong 1 ml dung dịch MeOH thu được dung dịch có nồng độ 1 mg/ml.

Dung dịch này được dùng để pha loãng thành các dung dịch thử có

nồng độ 5 µg/ml; 10 µg/ml; và 15 µg/ml.

Cách pha nồng độ cơ chất

Cân chính xác 9,90 mg ACTI (M = 289,18) pha trong 1370 ml nước

cất; thu được dung dịch cơ chất nồng độ 25 mM.

Từ dung dịch này tiến hành pha loãng thành các dung dịch cơ chất có

nồng độ 5 µg/ml; 2,5 µg/ml; và 1,25 µg/ml để tiến hành nghiên cứu.

- Mẫu có nồng độ ức chế AChE IC50 thấp nhất sẽ được tiếp tục pha

thêm dải nồng độ gần với nồng độ IC50 đo được để tiếp tục đánh giá.

- Dung dịch cơ chất ACTI cũng được pha thành các nồng độ khác

nhau để khảo sát.

- Tiến hành phản ứng như trên với từng nồng độ mẫu thử và nồng độ

cơ chất ACTI đã pha. Tất cả các thí nghiệm được lặp lại 3 lần.

- Sử dụng các đồ thị 1/[ACTI] và 1/V (1/tốc độ phản ứng) (đồ thị

Lineweaver – Burk) để xác định kiểu động học ức chế enzym.

25

- Hằng số ức chế Ki được xác định là điểm giao của các đường [nồng

độ phân đoạn dịch chiết IC50 nhỏ nhất] với 1/V (1/tốc độ phản ứng) (đồ thị

Dixon - Dixon plot).

Quá trình tiến hành thí nghiệm được tóm tắt trong hình 2.4.

Hình 2.4. Sơ đồ quy trình đánh giá đặc điểm động học ức chế AChE in vitro

2.3. Phương pháp xử lý số liệu

- Số liệu thực nghiệm được tổng hợp và xử lý bằng phương pháp

thống kê thường dùng trong sinh học với sự trợ giúp của phần mềm

SigmaPlot 12 (Systat Software Inc, Mỹ).

- Kết quả nghiên cứu được biểu thị bằng giá trị trung bình cộng/trừ

độ lệch chuẩn, ký hiệu: ± SD. Trong đó, độ lệch chuẩn (SD) được tính theo

công thức:

- Độ lặp lại của thí nghiệm được đánh giá dựa trên độ lệch chuẩn

tương đối (RSD) và được tính như sau:

26

- So sánh giá trị trung bình giữa các mẫu thử sử dụng phép thử t-

student. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p<0,05.

27

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế AChE

Thân rễ khô Hoàng liên được rửa sạch, phơi và sấy khô ở 50oC, thái nhỏ. 50

gam dược liệu (hàm ẩm 10%) được chiết với 500ml dung môi EtOH 90o bằng

phương pháp siêu âm ngấm kiệt; chiết lặp lại 3 lần. Gộp dịch chiết và lọc qua giấy

lọc; tiến hành cô quay chân không dịch chiết trong bình cầu 1,5 lít và thu được 9 g

cắn ethanol.

Hòa cắn với khoảng 100 ml nước cất ấm rồi khuấy đều. Thêm khoảng

100ml dung môi n-Hexan, khuấy đều hỗn hợp trong phễu trong thời gian 20

phút. Để yên cho dung môi phân lớp. Gạn lấy lớp dung môi n-Hexan. Lớp

nước trong bình được thêm tiếp 100ml n-Hexan. Tiến hành lặp lại 3 lần. Sau

đó thu dịch chiết n-Hexan tiến hành cô quay thu cắn.

Tiếp theo, tiến hành lần lượt tương tự với dung môi Ethyl acetat

(EtOAc) và n-BuOH. Mỗi dung môi 100 ml lặp lại 3 lần.

Cắn từ dịch chiết n-Hexan 2,3 (g); EtOAc 3,2 (g); n-BuOH 3,5 (g) được

bảo quản để tiến hành các thử nghiệm tiếp theo.

Lựa chọn điều kiện thích hợp cho phương pháp đánh giá tác dụng ức

chế AChE in vitro như sau:

Thành phần hỗn hợp phản ứng được trình bày ở bảng 3.1.

Bảng 3.1. Thành phần hỗn hợp phản ứng

STT

Thành phần

Mẫu thử

(µl)

Mẫu trắng

của mẫu

thử (µl)

Mẫu

chứng

dương

(µl)

Mẫu trắng

của mẫu

chứng

dương

(µl)

1 Đệm natri phosphat

pH=8

700 800 700 800

2 Mẫu thử 100 100 0 0

3 Berberin clorid 0 0 100 100

4 AChE 0,25 IU/ml 100 0 100 0

5 DTNB 2,5 mM 50 50 50 50

6 ACTI 2,5 mM 50 50 50 50

Tổng thể tích (µl) 1000 1000 1000 1000

28

Tiến hành đo quang theo phương pháp đo quang Ellman

Hỗn hợp phản ứng bao gồm 700 µl dung dịch đệm natri phosphate (pH

= 8,0); 100 µl dung dịch thử ở các nồng độ khác nhau và 100 µl dung dịch

enzym AChE 0,25 IU/ml. Trộn đều trong cuvet 1 cm và đem ủ 15 phút tại 25 0C. Các dịch chiết được thử và chất chuẩn dương (Berberin chlorid) được hòa

tan trong methanol. Sau đó, thêm 50 µl of DTNB 2,5 mM và 50 µl ACTI 2,5

mM và trộn đều. Tiếp tục ủ hỗn hợp trong 10 phút ở 25 0C. Sau đó, dung dịch

được đo độ hấp thụ ở bước sóng 412 nm. Tất cả các thí nghiệm được lặp lại 3

lần.

Kết quả đánh giá tác dụng ức chế AChE

Kết quả tác dụng ức chế enzym AChE của các phân đoạn dịch chiết

Hoàng liên chân gà và berberin clorid được trình bày trong bảng 3.2 và hình

3.1, hình 3.2.

Bảng 3.2. Giá trị IC50 của các phân đoạn dịch chiết từ Hoàng liên chân gà và

Berberin clorid

Mẫu thử IC50 (µg/ml)

EtOH 15,62 ± 0,26

n- hexan 57,86 ± 0,86

EtOAc 105,83 ± 1,95

n-BuOH 10,44 ± 0,16

Berberin clorid 0,282 ± 0,03

29

Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế hoạt độ enzym AChE của các

phân đoạn dịch chiết cây Hoàng liên chân gà

Giá trị IC50 của các phân đoạn dịch chiết được tính dựa vào đồ thị và

chuyển từ log [µg/ml] sang µg/ml.

Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế hoạt độ enzym AChE của

Berberin clorid

Giá trị IC50 Berberin clorid được tính dựa vào đồ thị và chuyển từ log [µg/ml]

sang µg/ml.

0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5

0

20

40

60

80

100

n-hexan

EtOAc

n-BuOH

EtOH

% Ứcchế

AChE

Log (Nồngđộ) (μg/ml)

-1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0

30

40

50

60

70

80

90

100

110

% Ứ

cch

ếA

ChE

Log (Nồng độ) (µg/mL)

• Berberin clorid

30

Nhận xét:

Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy tất cả 4 mẫu cắn đều có tác dụng ức chế

AChE ở mức độ khác nhau. Tác dụng ức chế AChE của các phân đoạn dịch

chiết tăng dần theo nồng độ. Phân đoạn EtOAc có tác dụng ức chế enzym

AChE thấp nhất với IC50 là 105,83 ± 1,95 µg/ml và hoạt tính này còn yếu hơn

cả hoạt tính của mẫu căn toàn phần trong EtOH. Phân đoạn dịch chiết n-

BuOH và dịch chiết tổng EtOH cho thấy có tác dụng ức chế enzym AChE cao

nhất với IC50 là 10,44 ± 0,16 và 15,62 ± 0,26 µg/ml. Tiếp đó là phân đoạn n-

Hexan có tác dụng ức chế enzym AChE với IC50 là 57,86 ± 0,86 µg/ml. Tuy

nhiên, hoạt tính của 2 phân đoạn n-BuOH và EtOH vẫn còn yếu hơn hoạt tính

của chuẩn dương berberin clorid với giá trị IC50 là 0,282 ± 0,03 µg/ml. Với tác

dụng ức chế mạnh nhất AChE ở nồng độ thấp, phân đoạn dịch chiết n-BuOH

được lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu động học.

Hình 3.1 và 3.2 thể hiện mối tương quan giữa giá trị Log của nồng độ

mẫu thử và Berberin clorid so với phần trăm tác dụng ức chế enzym AChE.

3.2. Kết quả đánh giá đặc điểm động học ức chế AChE

Tiến hành đánh giá động học ức chế AchE

Động học ức chế enzym AChE của phân đoạn dịch chiết n-BuOH được

tiến hành theo phương pháp mô tả trước đây với một chút thay đổi cho phù

hợp với phòng thí nghiệm. Hỗn hợp phản ứng gồm 700 µl dung dịch đệm

natri phosphat (pH 8,0); 100 µl dung dịch thử ở các nồng độ phân đoạn dịch

chiết n-BuOH (0; 5 ; 10 và 15 μg/ml) và 100 µl dung dịch enzym AChE 0,25

IU/ml. Trộn đều và đem ủ 15 phút tại 25oC. Sau đó, thêm 50 µl of DTNB 2.5

mM và 50 µl với các nồng độ khác nhau của cơ chất ACTI (5; 2,5; 1,25 mM)

và trộn đều. Tiến hành đo độ hấp thụ dung dịch được ở bước sóng 412 nm

trong vòng 5 phút. Tất cả các thí nghiệm được lặp lại 3 lần.

Sử dụng các đồ thị 1/[ACTI] và 1/V (1/tốc độ phản ứng) (đồ thị

Lineweaver – Burk plot) để xác định kiểu động học ức chế enzym. Hằng số

ức chế Ki được xác định là điểm giao của các đường [nồng độ phân đoạn dịch

chiết n-BuOH] với 1/V (1/tốc độ phản ứng) (đồ thị Dixon plot).

Kết quả đánh giá đặc điểm động học ức chế AChE in vitro

Đồ thị Lineweaver–Burk mô tả động học ức chế enzym của phân đoạn

dịch chiết n-BuOH. Hình 3.3 cho thấy kiểu ức chế là kiểu ức chế hỗn hợp

31

(trong đồ thị Lineweaver–Burk thì hệ số góc =Km/Vmax, điểm giao trục Ox

= -1/Km). Hằng số Ki được xác định là giá trị tuyệt đối từ điểm giao trên trục

ox của 3 đường trên đồ thị Dixon, được vẽ theo 1/(tốc độ phản ứng) theo nồng

độ phân đoạn dịch chiết n-BuOH xác định bởi hình 3.4.

Hình 3.3. Đồ thị Lineweaver-Burk cho phân đoạn dịch chiết n-BuOH.

Kí hiệu: ●: 0; o: 5; ▼: 10; ∆: 15 µg/mL phân đoạn dịch chiết n-BuOH.

Nồng độ cơ chất ACTI được sử dụng là 5; 2,5; 1,25mM

Hình 3.4. Đồ thị Dixon cho phân đoạn dịch chiết n-BuOH để xác định hằng

số ức chế Ki.

Kí hiệu: ● : 1,25; o : 2,5; ▼: 5 mM ACTI. Nồng độ phân đoạn n-

BuOH được sử dụng là 0; 5; 10; 15 µg/ml.

2D Graph 1

X Data

-0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

Y D

ata

0

20

40

60

80

100

120

Col 1 vs Col 2

Col 1 vs Col 3

Col 1 vs Col 4

Col 1 vs Col 5

Plot 1 Regr

1/Tố

cđộ

phản

ứng

(abs

/min

)

1/[ACTI] mM-1

2D Graph 2

X Data

-10 -5 0 5 10 15 20

Y D

ata

0

20

40

60

80

100

120

140

Col 1 vs Col 2

Col 1 vs Col 3

Col 1 vs Col 4

Plot 1 Regr

1/Tốcđộ

phản

ứng

(abs

/min

)

Nồng độ phân đoạn n-BuOH (mM)

32

Hằng số Ki được xác định là giá trị tuyệt đối từ điểm giao trên trục Ox

của 3 đường.

Nhận xét:

Từ hình 3.4 cho ta thấy giá trị Ki được xác định theo đồ thị hình là 8,36

± 0,05 µg/ml. Kiểu ức chế AChE của phân đoạn n-BuOH là kiểu ức chế hỗn

hợp. Điều này được khẳng định khi quan sát trên đồ thị thấy giá trị Kmax tăng

và Vmax giảm khi nồng độ phân đoạn dịch chiết n-BuOH tăng.

3.3. Bàn luận

Bệnh Alzheimer là một bệnh thần kinh di truyền, mất trí nhớ, nguyên

nhân của bệnh chưa rõ nhưng dẫn chứng cho thấy chuyển hóa não rối loạn

dẫn đến β-amyloid protein tạo nên xốp não [22]. Enzym Acetylcholinesterase

chủ yếu có mặt trong hệ thần kinh trung ương, xúc tác thủy phân chất dẫn

truyền ACh. Ở bệnh nhân Alzheimer quan sát có sự giảm trầm trọng nồng độ

chất dẫn truyền thần kinh ACh. Tình trạng này gây suy giảm khả năng nhận

thức đối với người bệnh [22]. Giả thuyết hệ cholinergic trong bệnh Alzheimer

có vai trò quan trọng quá trình nghiên cứu điều trị bệnh Alzheimer. Theo giả

thuyết này, các chất ức chế sự hoạt động của AChE làm tăng nồng độ và thời

gian hoạt động của ACh ở synap thần kinh từ đó cải thiện triệu chứng bệnh.

Hoàng liên chân gà (Coptis chinensis Franch) là cây dược liệu quý

chứa nhiều hợp chất cấu trúc alkaloid chủ yếu là berberin, worenin, coptisin,

palmatin [47,48]...với nhiều tác dụng chống vi khuẩn, virus, chống viêm,

chống ung thư và đặc biệt tác dụng trên hệ thần kinh. Dựa trên một số nghiên

cứu sàng lọc gần đây cho thấy hợp chất berberin thể hiện tác dụng ức chế

AChE in vitro. Hơn nữa, thành phần dịch chiết Hoàng liên chân gà đã được

xác định chứa berberin và một số alkaloid khác có tiềm năng ức chế AChE

cần được nghiên cứu làm rõ.

3.3.1. Về kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym

Acetylcholinesterase in vitro của các phân đoạn dịch chiết Hoàng liên

(Coptis chinensis Franch)

Về kết quả chiết xuất phân đoạn dịch chiết Hoàng liên

Trong nghiên cứu khóa luận này, dược liệu Hoàng liên chân gà được

chiết xuất bằng dung môi EtOH rồi tiếp tục chiết phân đoạn với các dung môi

n-Hexan, EtOAc và n-BuOH. Các dịch chiết phân đoạn được cô thành cắn

33

(EtOH 9 g; n-Hexan 2,3 g; EtOAc 3,2 g và n-BuOH 3,5 g) được dùng để đánh

giá các tác dụng trên enzym AChE in vitro.

Về phương pháp đánh giá sàng lọc in vitro

Phương pháp in vitro được lựa chọn bởi ưu điểm của nó là cho kết quả

nhanh, tiến hành đồng thời được nhiều mẫu và ít tốn kém. Đồng thời, qua thu

thập tài liệu cho thấy, hầu hết các nghiên cứu liên quan ức chế AChE đều sử

dụng phương pháp đo quang của Ellman với cách tiến hành và đòi hỏi điều

kiẹn phòng thí nghiệm đơn giản, cho kết quả đáng tin cậy hơn các phương

pháp Fast Blue B. Vì vây, nghiên cứu này chúng tôi cũng sử dụng phương

pháp đo quang Ellman để đánh giá với sự thay đổi một và yếu tố để phù hợp

hơn với điều kiện nghiên cứu.

Về kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE

Đánh giá tác dụng ức chế của 4 dịch chiết phân đoạn của Hoàng liên

chân gà cho thấy tất cả các phân đoạn dịch chiết này đều thể hiện tác dụng ức

chế enzym AChE, kết quả này phù hợp với kết quả một số nghiên cứu trước

đây của Hengqiang Zhaoa và cộng sự [26]; và Dorothea Kaufmann và cộng

sự [17]. Tuy nhiên, mức độ ức chế của các phân đoạn dịch chiết rất khác nhau

với các giá trị IC50 thay đổi từ 10,44-105,83 µg/ml. So với chất đối chứng

dương là berberin clorid, tác dụng ức chế của 4 phân đoạn dịch chiết yếu hơn

khoảng từ 37-375 lần. Trong các phân đoạn dịch chiết nghiên cứu đánh giá,

phân đoạn dịch chiết n-Butanol cho thấy tác dụng ức chế mạnh nhất; phân

đoạn dịch chiết Ethyl acetat cho tác dụng ức chế yếu nhất. Phân đoạn n-

BuOH của dịch chiết Hoàng liên được sử dụng để đánh giá đặc điểm động

học ức chế tiếp theo.

3.3.2. Về kết quả đánh giá đặc điểm động học ức chế enzym

Acetylcholinesterase của phân đoạn dịch chiết Hoàng liên.

Động học ức chế enzym AChE của dịch chiết từ Hoàng liên chân gà

(Coptis chinensis Franch) chưa từng được công bố trước đây. Động học ức

chế enzym AChE thể hiện qua đồ thị Lineweaver–Burk cho thấy hệ số góc =

Km/Vmax, điểm giao trục Ox = -1/Km. Giá trị Ki được xác định theo đồ thị là

giá trị tuyệt đối từ điểm giao trên trục Ox của 3 đường trên đồ thị Dixon, được vẽ

theo 1/(tốc độ phản ứng) theo nồng độ phân đoạn dịch chiết n-BuOH xác định

được là 8,36 ± 0,05 µg/ml.

34

Từ đồ thị cho thấy, kiểu ức chế hỗn hợp là kiểu ức chế đặc trưng của

dược liệu, vì dược liệu có chứa các hợp chất có nhiều con đường tác dụng

khác nhau [25]. Cơ chế ức chế cho thấy phân đoạn dịch chiết n-BuOH có thể

cạnh tranh với ACTI để gắn vào vị trí liên kết cơ chất của AChE hoặc có thể

liên kết vào vị trí khác vị trí liên kết cơ chất của AChE. Điều này được khẳng

định khi quan sát trên đồ thị thấy giá trị Kmax tăng và Vmax giảm khi nồng

độ phân đoạn dịch chiết n-BuOH tăng.

Mặc dù kết quả nghiên cứu của khóa luận không tìm ra được hợp chất

nào sở hữu tác dụng ức chế AChE của từng phân đoạn dịch chiết, tuy nhiên,

đây là nghiên cứu đầu tiên tiến hành đánh giá tác dụng ức chế AChE của cả 4

phân đoạn dịch chiết EtOH; n-Hexan; EtOAC và n-BuOH của Hoàng liên

chân gà. Đồng thời, đặc điểm động học ức chế AChE cũng được nghiên cứu

chỉ ra kiểu ức chế hỗn hợp của phân đoạn dịch chiết Hoàng liên. Vì vậy, kết

quả của khóa luận cũng đã góp phần bổ sung những thông tin cho cơ sở dữ

liệu về những loại cây có tác dụng ức chế AChE nói chung. Cơ sở dữ liệu này

là căn cứ cho những nghiên cứu tìm kiếm các hợp chất tinh khiết có tác dụng

đặc hiệu ức chế AChE của Hoàng liên chân gà (Coptis chinensis Franch) ứng

dụng trong hỗ trợ phòng và điều trị các bệnh về thần kinh trong tương lai.

35

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

KẾT LUẬN

Nghiên cứu này đã thu được những kết quả như sau:

- Đã chiết xuất phân lập được các phân đoạn dịch chiết Hoàng liên

chân gà (Coptis chinensis Franch): EtOH, n-Hexan, EtOAc và n-BuOH.

- Đã đánh giá được tác dụng ức chế AChE của các phân đoạn dịch

chiết Hoàng liên:

+ Phương pháp đo quang Ellman được sử dụng

+ Các phân đoạn dịch chiết được khảo sát ở các nồng độ 1000 µg/ml;

500µg/ml; 250 µg/ml; 125 µg/ml; 62,5 µg/ml; 31,25 µg/ml; 15,625 µg/ml; và

7,8125 µg/ml có so sánh đối chứng với mẫu berberin clorid chuẩn.

+ Phân đoạn dịch chiết n-BuOH cho tác dụng ức chế mạnh nhất với

IC50 là 10,44 ± 0,16 µg/ml.

- Đã đánh giá được đặc điểm động học ức chế AChE của phân đoạn

dịch chiết n-BuOH của Hoàng liên chân gà.

+ Kiểu ức chế enzym của phân đoạn dịch chiết Hoàng liên là kiểu ức

chế hỗn hợp với hằng số Ki tìm được là 8,36 ± 0,05 µg/ml.

ĐỀ XUẤT

- Tiếp tục nghiên cứu tinh chế các hợp chất tinh khiết trong các phân

đoạn dịch chiết của Hoàng liên chân gà (Coptis chinensis Franch).

- Thử tác dụng ức chế AChE của các chất phân lập được.

- Tiếp tục đánh giá tác dụng ức chế AChE của Hoàng liên in vivo và

nghiên cứu lâm sàng.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TIẾNG VIỆT

1. Phạm Thị Phương Anh (2001), “Nghiên cứu ảnh hưởng của phương

pháp chế biến vị thuốc Hoàng liên (Coptis chinensis Franch) đến thành

phần hóa học và tác dụng sinh học”, Luận văn Thạc sĩ Dược học,

Trường Đại học Dược Hà Nội.

2. Bộ Khoa học và Công nghệ (1996), Sách Đỏ Việt Nam. Phần thực vật

(Red data book of Việt Nam volum 2 plants), NXB Khoa Học Kĩ

Thuật,100.

3. Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam, NXB Hà Nội.

4. Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học,565.

5. Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam tập 1, NXB Trẻ,325.

6. Phạm Khuê (2002), Bệnh Alzheimer, Nhà xuất bản Y học.

7. Đỗ Tất Lợi (1999), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y

học,189.

8. Đào Văn Phan, Nguyễn Trần Giáng Hương, Nguyễn Trọng Thông

(2011), Dược lý học, NXB Giáo dục Việt Nam,(1):69-71.

9. Viện Dược liệu (1993), Tài nguyên cây thuốc Việt Nam, NXB Khoa Học

Kĩ Thuật,497.

TIẾNG ANH

10. Adsersen A., Gauguin B. và Gudiksen L. et al (2006), “Screening of

plants used in Danish folk medicine to treat memory dysfunction for

Acetylcholinesterase inhibitory activity”, Journal of

ethnopharmacology, 104:418-422.

11. Alzheimer's A. (2012), "2012 Alzheimer’s disease facts and figures",

Alzheimer's & Dementia, 8(2): 131-168.

12. Chen L, Wang L, Zhang Q, Zhang S, Ye W (2012), “Non-alkaloid

chemical constituents from Coptis chinensis”, Zhongguo Zhong Yao Za

Zhi, May;37(9):1241-4.

13. Cullar Mj, Giner R.M et al (2001), “Topical anti inflammatory activity

of some Asian medical plants used in dermatological disorders”,

Fitoterapia (Milano),72(3):221-229.

14. Department of pharmacy, National University of Singapore (1993),

“Displacement of bilirubin from albumin by berberin”, Biol-Neonate,

63(4):201-8.

15. Di Giovanni S., Borloz A. và Urbain A. et al (2008), “In vitro screening

assays to identify natural or synthetic Acetylcholinesterase inhibitors:

thin layer chromatography versus microplate methods”, European

journal of pharmaceutical sciences, 33:109-119.

16. Dongqing Jiang, Dianhui Wang, Xianghua Zhuang, Zhanqing Wang,

Yihong Ni, Shihong Chen, Fudun Sun (2016), “Berberine increases

adipose triglyceride lipase in 3T3-L1 adipocytes through the AMPK

pathway”, Lipids in Health and Disease, Dec 9;15(1):214.

17. Dorothea Kaufmann, Anudeep Kaur Dogra, Ahmad Tahrani, Florian

Herrmann, Michael Wink (2016), “Extracts from Traditional Chinese

Medicinal Plants Inhibit Acetylcholinesterase, A Known Alzheimer’s

Disease Target”, Molecules, Aug 31;21(9).

18. Ellman G. L., Courtney K. D., Andres V. et al (1961), “A new and rapid

colorimetric determination of Acetylcholinesterase activity”,

Biochemical pharmacology,(7):88-95.

19. Enhui Cui, Xiaoyan Zhi, Ying Chen, Yuanyuan Gao, Yunpeng Fan,

Weimin Zhang, Wuren Ma, Weifeng Hou, Chao Guo, and Xiaoping

Song (2014), “Coptis chinensis and Myrobalan (Terminalia chebula)

Can Synergistically Inhibit Inflammatory Response In Vitro and In

Vivo”, Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine,

2014:510157.

20. Eunhee Kim, Sejin Ahn, Hae-ik Rhee, Deug-chan Lee (2016), “Coptis

chinensis Franch. extract up-regulate type I helper T-cell cytokine

through MAPK activation in MOLT-4 T cell”, Journal of

Ethnopharmacology, Aug 2;189:126-31.

21. Fan Jia, Gang Zou, Jingjing Fan, Zhiming Yuan (2010), “Indentification

of palmatine as an inhibitor of West Nile virus”, Archives of Virology,

Aug; 155(8):1325-9.

22. Francis PT, Palmer AM, Snape M, Wilcock GK. (1999), "The

cholinergic hypothesis of Alzheimer’s disease: a review of progress",

Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry, 66(2): 137-147.

23. George T Grossberg (2003), “Cholinesterase Inhibitors for the Treatment

of Alzheimer’s Disease: Getting On and Staying On”, Current

Therapeutic Research, 64:216-235.

24. Hang Ma, Yinran Hu, Zongyao Zou, Min Feng, Xiaoli Ye, Xuegang Li

(2016), “Antihyperglycemia and Antihyperlipidemia Effect of

Protoberberine Alkaloids From Rhizoma Coptidis in HepG2 Cell and

Diabetic KK-Ay Mice”, Drug Development Research, Jun;77(4):163-70.

25. Hawkins, K.I. and C.E. Knittle (1972), "Comparison of

Acetylcholinesterase determinations by the Michel and Ellman

methods". Analytical chemistry 44(2): p. 416-417.

26. Hengqiang Zhaoa, , Siduo Zhoua, Minmin Zhang, Jinhong Feng,

Shanshan Wang, Daijie Wang, Yanling Geng, Xiao Wang (2016), “An

in vitro AChE inhibition assay combined with UF-HPLC-ESI-Q-

TOF/MS approach for screening and characterizing of AChE inhibitors

from roots of Coptis chinensis Franch”, Journal of Pharmaceutical and

Biomedical Analysis, Feb 20;120:235-40.

27. H. P. J., Ren Y. và Howes M. J. (2005,) “Acetylcholinesterase inhibitors

from plants and fungi” Natural product report.

28. Hui-Li Tan, Kok-Gan Chan, Priyia Pusparajah, Acharaporn Duangjai et

al (2016), “Rhizoma Coptidis: A Potential Cardiovascular Protective

Agent”, Frontiers on Pharmacology, Oct 7;7:362.

29. Jae Sue Choi, Ji-Hye Kim, Md. Yousof Ali, Hee Jin Jung, Byung-Sun

Min, Ran Joo Choi, Gun-Do Kim, Hyun Ah Jun (2015), “Anti-

adipogenic effect of epiberberine is mediated by regulation of the

Raf/MEK1/2/ERK1/2 and AMPKα/Akt pathways”, Archives of

Pharmacal Research, Dec;38(12):2153-62.

30. Kobayashi Y, Yamashita Y et al (1995), “Inhibitors of DNA

topoisomerase I and II isolated from the Coptis rhizome”, Planta Med.,

Oct; 61(5):414-8.

31. Kong LD, Cheng CH, Tan RX (2001), “Monoamine oxidase inhibitors

from rhizoma of Coptis chinensis”, Planta Med., Feb;67(1):74-6.

32. Li C, Xie J et al (2016), “Comparison of Helicobacter pylori Urease

Inhibition by Rhizoma Coptidis, Cortex Phellodendri and Berberin:

Mechanisms of Interaction with the Sulfhydyl Group”, Planta Med.,

Mar;82(4):305-11.

33. Liang Peng, Zhengxing Rong, Hao Wang, Biyun Shao, Lei Kang, Hong

Qi, Hongzhuan Chen (2017), “A novel assay to determine

Acetylcholinesterase activity: The application potential for screening of

drugs against Alzheimer's disease”, Biomedical Chromatography, Mar

10.

34. Ma X., Tan C. và Zhu D. et al (2007), “Huperzine A from Huperzia

species - An ethnopharmacological review”, Journal of

ethnopharmacology, 113.

35. Ruifang Liu, Zhifei Cao et al (2013), “Jatrorrhizine hydrochloride

inhibits the proliferation and neovascularization of C8161 metastatic

melanoma cells”, Anticancer Drugs, Aug;24(7):667-76.

36. Schinella GR et al (2002), “Inhibition of Trypanosoma cruzi growth by

medical plant extracts”, Dec;73(7-8):569-75.

37. Shuang Jiang, Yahong Wang, Dayong Ren et al (2015), “Antidiabetic

mechanism of Coptis chinensis polysaccharide through its antioxidant

property involving the JNK pathway”, Pharmaceutical Biology,

Jun;53(7):1022-9.

38. Tang Z. M., Wang Z. Y, Kang J. W. (2007), “Screening of

Acetylcholinesterase inhibitors in natural extracts by CE with

electrophortically mediated microanalysis techique”, Electrophoresis,

(28):360-365.

39. Tao Luo, Xiuyin Shen, Sheng Li, Ting Ouyang, Huaqiao Wang (2016),

“The Protective Effect of Jatrorrhizine against Oxidative Stress in

Primary Rat Cortical Neurons”, CNS & Neurological Disorders - Drug

Targets, Jun 10.

40. Thomas Friedmann, Bejamin Otto et al (2014), “Coptis chinensis

Franch. exhibits neuroprotective properties against oxidative stress in

human neuroblastoma cells”, Journal of Ethnopharmacology, Aug

8;155(1):607-15.

41. Thomas Friedmann, Yue Ying, Weigang Wang (2016), “Neuroprotective

Effect of Coptis chinensis in MPP+ and MPTP-Induced Parkison’s

Disease Models”,The American Journal of Chinese Medicine, 44(5):907-

25.

42. Van Asperen K. (1962), “A study of housefly esterase by means of a

sensitive colorimetric method”. J. Ins. Physiol, 8, 401-416.

43. Weina Ma, Man Zhu, Dongdong Zhang, Liu Yang, Tianfeng Yang, Xin

Li, Yanmin Zhang (2017), “Berberine inhibits the proliferation and

migration of breast cancer ZR-75-30 cells by targeting Ephrin-B2”,

Phytomedicine, Feb 15; 25:45-51.

44. Weiwei Yang, Liping She, Kun Yu, Shan Yan, Xuefeng Zhang, Xiaoyi

Tian, Shuren Ma, Xiwen Zhang (2016), “Jatrorrhizine hydrochloride

attenuates hyperlipidemia in a high-fat diet-induced obesity mouse

model”, Molecular Medicine Reports, Oct;14(4):3277-84.

45. Wu J, Zhang H, Hu B et al (2016), “Coptisine from Coptis chinensis

inhibits production of inflammatory mediators in lipolysaccharide-

stimulated RAW 264.7 murine macrophage cells”, European Journal of

Pharmacology, Jun 5;780:106-14.

46. Xiaoquan Ban, Bo Huang, Jingsheng He et al (2011), “In vitro and In

vivo Antioxidant Properties of Extracts from Coptis chinensis

Inflorescence”, Plant Foods of Human Nutrition, Jun;66(2):175-80.

47. Xiumei Lv, Yan Li, Ce Tang, Yi Zhang, Jing Zhang & Gang Fan (2016),

“Integration of HPLC-based fingerprint and quantitative analyses for

differentiating botanical species and geographical growing origins of

Rhizoma Coptidis”, Pharmaceutical Biology, Dec;54(12):3264-3271.

48. Yanfang Yang, Jingling Peng et al (2017), “Determination of Alkaloid

Contents in Various Tissues of Coptis Chinensis Franch. By Reversed

Phase-High Performance Lipuid Chromatography and Ultraviolet

Spectrophotometry”, Journal of Chromatographic Science, 55(5):556-

563.

49. Yuan Yue, Lili Dou, Xin Wang, Hui Xue, Yanhong Song, Xiaoni Li

(2015), “Screening β1AR inhibitors by cell membrane chromatography

and offline UPLC/MS method for protecting myocardial ischemia”,

Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Nov 10;115:339-

44.

50. Zheng‑ Hua Huang, Hong‑ Fang Zheng, Wei‑ Lu Wang, Yong Wang,

Long‑ Fei Zhong, Jiu‑ Long Wu, Qiao‑ Xing Li (2014), “Berberine

targets epidermal growth factor receptor signaling to suppress prostate

cancer proliferation in vitro”, Molecular Medicine Reports,

Mar;11(3):2125-8.

51. Zhou JT, Li CL, Tan LH, Xu YF, Liu YH, Mo ZZ, Dou YX, Su R, Su

ZR, Huang P, Xie JH (2017), “Inhibition of Helicobacter pylori and Its

Associated Urease by Palmatine: Investigation on the Potential

Mechanism”, PloS One, Jan 3;12(1):0168944.

52. Zhu Qin-Wei, Li Yong-Guang (2016), “Berberine attenuates myocardial

ischemia reperfusion injury by suppressing the activation of PI3K/AKT

signaling”, Experimental and Therapeutic Medicine, Mar;11(3):978-984.