ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

Nguyễn Anh Lƣơng

XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐO TƢƠNG TÁC THỤ THỂ VÀ

PHỐI TỬ ĐẶC HIỆU KHÔNG SỬ DỤNG PHÓNG XẠ PHỤC VỤ

ĐỊNH HƢỚNG PHÁT TRIỂN THUỐC Ở VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2011

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

Nguyễn Anh Lƣơng

XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐO TƢƠNG TÁC THỤ THỂ VÀ

PHỐI TỬ ĐẶC HIỆU KHÔNG SỬ DỤNG PHÓNG XẠ PHỤC VỤ

ĐỊNH HƢỚNG PHÁT TRIỂN THUỐC Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 60 42 70

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. ĐINH ĐOÀN LONG

Hà Nội – 2011

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc của mình tới PGS.TS. Đinh Đoàn

Long, Bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học tự

nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tận tình hƣớng dẫn và tạo mọi điều kiện

cho tôi trong quá trình thực tập và hoàn thành luận văn này.

Tôi cũng xin đƣợc gửi lời cảm ơn tới TS. Trinh Tất Cƣờng, ThS. Trần

Thị Thùy Anh, đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong công việc nghiên cứu và hỗ trợ

giải quyết những khó khăn gặp phải trong thời gian tôi thực hiện đề tài này.

Đồng thời tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới các thầy cô

Khoa Sinh học trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên Đại học Quốc gia Hà Nội

và đặc biệt là các thầy cô và các cán bộ giảng dạy, công tác tại bộ môn Di

truyền, những ngƣời đã luôn dạy bảo hƣớng dẫn động viên, giúp đỡ tôi trong

suốt quá trình học tập nghiên cứu tại trƣờng.

Và tôi cũng muốn gửi lời cảm ơn đến các thành viên trong phòng thí

nghiệm Sinh học thụ thể và Phát triển thuốc, cảm ơn các bạn đã chia sẻ những

niềm vui những khó khăn và cùng thực hiện những nghiên cứu khoa học.

Chúc các bạn học tập, làm việc tốt, luôn vui vẻ và có nhiều thành công trên

con đƣờng đã chọn.

Cuối cùng, tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình và các bạn bè

đã luôn góp ý, động viên và tạo điều kiện cho tôi trong suốt những năm qua.

Tôi xin chân thành cảm ơn.

Hà Nội, tháng 12 năm 2011

Học viên

Nguyễn Anh Lƣơng

KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

AT I Angiotensin I

AT II Angiotensin II

BSA Bovine serum albumin

ELISA Phản ứng miễn dịch hấp thụ liên kết enzym

F-AT II Fluorescein – angiotensin II (angiotensin II đánh dấu fluorescein

F-BSA Fluorescein – BSA (BSA đánh dấu fluorescein)

GPCR G protein - coupled receptor

IC50 Nồng độ ức chế 50%

Kd Hằng số phân ly cân bằng

Ki Nồng độ chất gắn cạnh tranh mà liên kết với một nửa số vị trí

liên kết ở trạng thái cân bằng

YHCT Y học cổ truyền

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1. Khái quát về lƣợc lý phân tử 3

1.2. Các đích tác dụng của thuốc 3

1.3. Về thụ thể kết cặp G protein (GPCR) 8

1.4. Thụ thể angiotensin II 12

1.5. Các phƣơng pháp nghiên cứu xác định tƣơng tác thụ thể và phối tử 20

1.6. Y học cổ truyền và tài nguyên dƣợc liệu 26

Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 36

2.1. Vật liệu 35

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 37

2.2.1. Quy trình chiết xuất dịch chiết methanol 37

2.2.2. Thu thụ thể màng 37

2.2.3. Xác định nồng độ protein sử dụng phƣơng pháp Bradford 38

2.2.4. Phƣơng pháp elisa để xác định lƣợng phối tử gắn fluorescein 39

2.2.5. Quy trình thí nghiệm liên kết (binding assay) 39

2.2.6. Phản ứng tƣơng tác giữa các phối tử đã biết và dịch chiết với thụ thể đích 40

2.2.7. Phƣơng pháp xử lý kết quả 40

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41

3.1. Xác định nồng độ protein thu đƣợc từ gan chuột 41

3.2. Tối ƣu phản ứng ELISA 43

3.3. Tối ƣu nồng độ protein thụ thể trong phản ứng liên kết 45

3.4. Thí nghiệm liên kết thụ thể - phối tử đặc hiệu (thí nghiệm bão hòa) 46

3.5. Phả ứng cạnh tranh của F-AT II với các phối tử đã biết 47

3.6. Nghiên cứu sàng lọc một số dịch chiết thực vật 48

Chƣơng 4. KẾT LUẬN 53

KIẾN NGHỊ 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

MỞ ĐẦU

Việt Nam là một trong những nƣớc có nguồn tài nguyên sinh vật đa dạng và

phong phú trên thế giới với hơn 13.200 loài thực vật và khoảng 10.000 loài động vật

đã đƣợc xác định, với nhiều nhóm loài sinh vật có tính tính đặc hữu cao, có giá trị

khoa học và thực tiễn lớn.

Xuất phát từ nền văn hóa đa dạng bản sắc với rất nhiều dân tộc sống trải dài

trên khắp lãnh thổ với các điều kiện tự nhiên và lịch sử riêng đã hình thành nên một

nền Y học cổ truyền với lịch sử lâu đời hàng nghìn năm, với rất nhiều kinh nghiệm

trong sử dụng thuốc trong đời sống. Việc dùng thuốc trong nhân dân đã có từ rất lâu

đời, tích lũy dƣới dạng kinh nghiệm, thƣờng chỉ đƣợc truyền miệng qua nhiều thế

hệ. Hơn 3800 bài thuốc đã đƣợc sƣu tầm lại, cùng với hàng nghìn bài thuốc lƣu

truyền trong dân gian, đặc biệt là trong cộng đồng các dân tộc thiểu số. Tuy nhiên,

rất nhiều các bài thuốc và các nguyên liệu làm thuốc nhƣ vậy vẫn chƣa đƣợc nghiên

cứu cơ chế tác động cũng nhƣ cơ sở khoa học vẫn chƣa đƣợc xác định.

Có nhiều phƣơng pháp nghiên cứu sàng lọc các hợp chất có hoạt tính sinh

học trong phát triển thuốc trên thế giới, trong đó phổ biến là phƣơng pháp sử dụng

đồng vị phóng xạ (nhƣ 3H,

125I) để nghiên cứu trên các đích phân tử của thuốc. Tuy

nhiên, những phƣơng pháp này chƣa đƣợc áp dụng trong điều kiện Việt Nam với

nguyên nhân chính là hầu hết các phòng thí nghiệm sinh dƣợc học của ta thiếu trang

thiết bị nghiên cứu, bảo quản và loại thải các chất phóng xạ.

Vì vậy lý do đó, chúng tôi tiến hành đề tài “Xây dựng phƣơng pháp đo

tƣơng tác thụ thể và phối tử đặc hiệu không dùng đồng vị phóng xạ phục vụ

định hƣớng phát triển thuốc ở Việt Nam” nhằm tiến tới ứng dụng mô hình này

nhằm sàng lọc các hợp chất có hoạt tính sinh học trên đích phân tử có nguồn gốc từ

các cây thuốc, bài thuốc đƣợc sử dụng hiệu quả trong y học cổ truyền với các tác

dụng chữa bệnh tƣơng ứng.

Trong Luận văn này, chúng tôi tập trung vào đích phân tử là thụ thể

angiotensin II, đây là đích tác dụng đã đƣợc biết của nhiều thuốc có tác dụng hạ

huyết áp với cơ chế phân tử đã đƣợc nghiên cứu tƣơng đối rõ, đồng thời bƣớc đầu

tiến hành thử nghiệm với một số dịch chiết từ một số cây thuốc Việt Nam đã đƣợc

biết trong y học cổ truyền với tác dụng trong điều hòa huyết áp và điều trị các

chứng bệnh liên quan đến tim, mạch và hệ tuần hoàn .

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Khái quát về dƣợc lý phân tử

Dƣợc lý phân tử (molecular pharmacology) là môn khoa học nghiên cứu về

tƣơng tác của thuốc lên cơ thể sống ở cấp độ phân tử và tế bào, và gồm hai phân

môn chính là dƣợc động học (pharmacokinetics) và dƣợc lực học

(pharmacodynamics).

Dƣợc lý phân tử bao gồm nhiều lĩnh vực nghiên cứu về tác dụng của phân tử

thuốc đến toàn bộ cơ thể. Dựa vào những hiểu biết về hóa sinh, sinh lý, bệnh học,

sinh học phân tử và hóa hữu cơ để thấy rõ tác dụng của thuốc ở mức độ phân tử đƣa

đến áp dụng trong điều trị. Qua dƣợc lý phân tử, chúng ta có thể hiểu sâu sắc cơ chế

phân tử tác dụng của thuốc, phát hiện thuốc mới, đề xuất những hƣớng dẫn sử dụng

thuốc an toàn, hiệu quả trong điều trị hoặc ngăn chặn những phản ứng có hại của

thuốc khi sử dụng. Nội dung chủ yếu của dƣợc lý phân tử là dƣợc lý học về tác

dụng của thuốc ở mức dƣới tế bào [2].

Dƣợc lý phân tử thể hiện ở nhiều giai đoạn của phân tử thuốc trong cơ thể,

hiện nay dƣợc lý phân tử đƣợc nghiên cứu với các hƣớng chính đó là:

1) Nghiên cứu tác dụng thuốc lên màng tế bào

2) Nghiên cứu hóa sinh dƣợc lý phân tử đối với thụ thể màng tế bào

3) Nghiên cứu hóa sinh dƣợc lý phân tử đối với enzym tế bào

4) Nghiên cứu hóa sinh dƣợc lý phân tử trên gen

1.2. Các đích tác dụng của thuốc

Theo phân tích của Overington và cộng sự [38] hơn 21.000 sản phẩm thuốc

lƣu hành trên thị trƣờng Mỹ, có nguồn gốc từ 1357 thuốc dƣới các dạng thành phần,

các dạng muối, vitamin. Trong đó có 1204 các thuốc phân tử nhỏ, và 166 thuốc sinh

học. Khoảng 27% các thuốc này liên quan tới thụ thể kết cặp G protein, 13% tới thụ

thể nhân, 7,9% tới các thụ thể liên kết với kênh ion (hình 1.1) [38].

Hình 1.1. Phân bố các họ gen với đích tác dụng của các thuốc hiện nay. ( Nguồn:

Overington, 2006).

Hầu hết các thuốc tác dụng lên cơ thể, tế bào thông qua một số cơ chế phân tử

khác nhau. Mỗi cơ chế đƣợc thích ứng thông qua sự tiến hóa của các họ protein

riêng, giúp truyền đƣợc nhiều loại tín hiệu. Các họ protein này bao gồm các thụ thể

trên bề mặt và bên trong tế bào cùng với các enzym và thành phần khác giúp tạo ra,

khuếch đại, phối hợp và kết thúc các tín hiệu từ phân tử tác động là thuốc và các

chất nội sinh.

Có 5 cơ chế truyền tín hiệu qua màng tế bào cơ bản (hình 1.2) [28]. Mỗi loại

sử dụng một chiến lƣợc khác nhau để vƣợt qua các rào cản là lớp kép phospholipid

của màng tế bào. Các chiến lƣợc đƣợc sử dụng là (1) phối tử (ligand) tan trong lipid

vƣợt qua màng sinh chất và tác động lên một thụ thể nội bào; (2) protein thụ thể

xuyên màng có hoạt tính enzym nội bào đƣợc điều khiển dị lập thể bởi một phối tử

liên kết vào một vị trí trên miền ngoại bào của protein này; (3) thụ thể xuyên màng

liên kết và kích thích một protein kinase; (4) kênh ion liên kết với tƣơng tác với

phối tử ( điều khiển hoạt động của kênh bằng liên kết với phối tử); hoặc (5) protein

Các thụ thể GPCR

Các thụ thể nhân

Các kênh ion liên kết phối tử

Các kênh ion điện thế

Protein liên kết penicillin

Enzyme giống nhƣ myeloperoxidase

Protein vận chuyển chất dẫn truyền thần kinh

DNA topoisomerase typ II

Fibronectin typ III

Cytochrome P450

thụ thể xuyên màng kích thích G protein, từ đó điều khiển một chất truyền tin thứ 2

trong tế bào.

Hình 1.2. Các cơ chế truyền tín hiệu cơ bản. Cơ chế thứ nhất (1) Một phân tử

tín hiệu (phối tử) hóa học hòa tan trong lipid đi qua màng sinh chất và tác động lên

các thụ thể nội bào (mà có thể là một enzym hoặc một yếu tố điều hòa sự phiên mã

của gen). (2) Phân tử tín hiệu liên kết với miền ngoại bào của một protein xuyên

màng, qua đó kích hoạt hoạt tính enzym của miền nội bào của protein này. (3) Phân

tử tín hiệu liên kết với miền ngoại bào của một thụ thể liên kết xuyên màng với một

protein kinase, làm kích hoạt protein kinase này. (4) Phân tử tín hiệu liên kết và trực

tiếp điều khiển việc mở một kênh ion. (5) phân tử tín hiệu liên kết với một thụ thể

bề mặt tế bào mà liên kết với một enzym tác động bởi một G protein. (A, C: cơ

chất; B, D: sản phẩm; R: thụ thể; G: G protein; E: tác động (enzym hoặc kênh ion);

Y: tyrosine; P: phosphate). (Nguồn: Katzung, 2007)

Các đích phân tử chính của phần lớn các dƣợc phẩm hiện nay bao gồm các

nhóm đƣợc nêu ở các mục dƣới đây [48]:

1.2.1. Thụ thể kết cặp G protein (GPCR)

Hơn 26% các thuốc đƣợc bán trên thị trƣờng có liên quan tới nhóm thụ thể

này; đây là nhóm thụ thể phổ biến đƣợc biểu hiện trên bề mặt của nhiều loại tế bào.

Protein liên kết vào màng tế bào thông qua 7 lần xuyên màng, do đó còn đƣợc gọi

với tên khác là thụ thể 7 lần xuyên màng (hay 7TM). Các G protein là các phân tử

kết cặp với loại thụ thể này để truyền tín hiệu đƣợc sinh ra sau khi phối tử (hay chất

gắn đặc hiệu) liên kết vào thụ thể rồi truyền tín hiệu vào trong tế bào. Hệ gen ngƣời

có hơn 1000 gen mã hóa cho các GPCR, trong đó ƣớc tính có khoảng 400 GPCR có

tiềm năng là các đích tác dụng của các loại thuốc. Các nghiên cứu về vai trò, chức

năng của các thụ thể GPCR vẫn đang tiếp tục đƣợc triển khai và phát triển.

1.2.2. Các thụ thể nhân (NR)

Các thụ thể này liên kết với các phối tử bên trong tế bào và về số lƣợng có lẽ ít

hơn nhiều so với các thụ thể trên màng tế bào. Sau khi phối tử liên kết, một phức

hợp đƣợc hình thành giữa thụ thể và phối tử đi vào trong nhân tế bào để “đóng”

hoặc “mở” các gen đặc trƣng. Các thụ thể nhân liên kết với các phân tử ƣa lipid nhƣ

các dẫn xuất của steroid, retinoid (nhƣ các hoocmon giới tính và vitamin A) có ảnh

hƣởng sâu sắc tới sinh lý con ngƣời. Hệ gen ngƣời mã hóa cho khoảng 50 thụ thể

nhân, một nửa số đó là các thụ thể độc thân (orphan receptor), nghĩa là các thụ thể

chƣa xác định đƣợc phối tử đặc hiệu.

1.2.3. Thụ thể cytokine

Một họ các protein có nhiều hơn 1 chuỗi protein đƣợc nhúng vào màng tế bào.

Các phối tử cytokine là các protein nhƣ interleukin, interferon và các yếu tố tăng

trƣởng. Vì các phân tử nhỏ không thể phá vỡ liên kết của cytokine liên kết với thụ

thể của nó, nên các thuốc đƣợc sử dụng thƣờng là các protein lớn hơn. Đó là các

kháng thể hoặc các dạng tái tổ hợp của thụ thể mà hoạt động nhƣ những cái bẫy để

ngăn cản sự liên kết của phối tử vào thụ thể.

1.2.4. Các protease

Đó là những enzym cắt protein ở những điểm xác định bởi các trình tự axit

amin đặc hiệu. Các protease có nhiều vai trò trong cơ thể, nhƣ tham gia phản ứng

đông máu, sản xuất các hoocmon peptit và cần cho chu kỳ sống của các virut nhƣ

HIV. Mặc dù các thuốc ức chế protease hiện vẫn là một thách thức lớn trong nghiên

cứu thuốc, nhƣng đã có một số thuốc đã đƣợc thƣơng mại hóa có đích tác dụng là

lớp enzym này.

1.2.5. Các protein kinase

Đây là một họ enzym lớn giúp gắn nhóm photphat (-PO3) vào một phân tử

protein để họa hóa nó trong tế bào. Quá trình photphoryl hóa đƣợc dùng để chuyển

tín hiệu từ ngoài tế bào qua các thụ thể trên màng để đi vào nhân tế bào, ở đó chúng

khởi động sự biểu hiện của gen. Kinase có vai trò đặc biệt trong sự phát sinh ung

thƣ bởi vì các tế bào sinh trƣởng phụ thuộc vào các yếu tố tăng trƣởng bên ngoài là

một kết quả của các enzym kinase đặc hiệu trở nên hoạt hóa thƣờng xuyên. Việc ức

chế protein kinase hiện nay là một hƣớng lớn trong tìm kiếm thuốc phân tử nhỏ.

1.2.6. Các protein phosphatase

Đây là những enzym có vai trò xúc tác các phản ứng ngƣợc chiều so với các

enzym kinase, chúng loại bỏ nhóm photphat của protein. Đây cũng là một cơ chế

quan trọng để truyền tín hiệu tế bào, vì nó hoạt động nhƣ một “công tắc đóng” để

điều khiển các quá trình quá mức trong tế bào.

1.2.7. Các enzym khác

Các họ protein và enzym đƣợc liệt kê trên tạo nên phần lớn các đích tác dụng

của thuốc hiện nay. Ngoài ra còn các enzym khác, có thể kể đến các chất ức chế

HMG-CoA reductase (đƣợc biết nhƣ là các statin) làm giảm cholesterol và các chất

ức chế phosphodiesterase (PDE), trong đó Viagra là một ví dụ đƣợc biết nhiều nhất.

1.2.8. Các kênh ion

Các ion là những nguyên tử hay phân tử tích điện. Các ion kim loại, nhƣ Ca2+

,

Na+ và K

+ , đóng vai trò thiết yếu trong nhiều quá trình sinh lý của cơ thể. Các ion

đi qua các lỗ trên màng tế bào còn đƣợc gọi là các kênh ion. Hai loại kênh ion chính

đƣợc biết là các kênh ion đƣợc đóng mở bởi phối tử và kênh ion đƣợc đóng mở bởi

điện thế (ligand-gated and voltage-gated ion channels.). Mỗi kênh có tính chọn lọc

cho một ion đặc trƣng và cho phép các ion qua màng từ ngoài vào trong hoặc ngƣợc

lại. Sự di chuyển của ion trong hoạt động của các tế bào thần kinh và liên quan tới

các điều kiện nhƣ động kinh, đau và rối loạn nhịp tim. Đó là những điều đáng quan

tâm nhất của các kênh ion là đích của thuốc, với một số các thuốc quan trọng đƣợc

lƣu hành trên thị trƣờng.

1.2.9. Các protein vận chuyển

Các protein vận chuyển làm nhiệm vụ vận chuyển các phân tử bên trong cơ

thể, đặc biệt là vận chuyển qua màng tế bào trong khi bình thƣờng các phân tử đó sẽ

bị ngăn chặn bởi màng tế bào. Chẳng hạn nhƣ các phân tử chất dinh dƣỡng đƣợc

vận chuyển qua dạ dày bởi các protein vận chuyển. Protein vận chuyển là mục tiêu

phân tử của thuốc điều trị một số bệnh, chẳng hạn nhƣ một số chứng bệnh trầm cảm

liên quan đến sự thiểu năng serotonin trong não. Các chất vận chuyển monoamine

loại bỏ serotonin từ tế bào thần kinh, nhƣng chất dẫn truyền thần kinh này có thể

đƣợc duy trì ở mức cao hơn bằng cách ức chế vận chuyển bởi các loại thuốc nhƣ

fluoxetine (Prozac®), do đó làm giảm các triệu chứng trầm cảm. Các đích protein

vận chuyển khác đƣợc quan tâm nhƣ các chất vận chuyển glucose, khi bị ức chế có

thể có tác dụng tích cực trong điều trị bệnh tiểu đƣờng.

1.3. Về thụ thể kết cặp G protein

Thụ thể là các phân tử kích hoạt điều hòa một loạt các quá trình trao đổi chất

và sinh lý trong tế bào cũng nhƣ ở các tổ chức phức tạp hơn. Trong dƣợc lý giác

quan, thụ thể là các protein chuyển đổi một chiều và có chọn lọc của một phân tử

truyền tín hiệu nội sinh hoặc các chất tổng hợp tƣơng tự của chúng, trải qua biến đổi

thông tin, và sửa đổi một đáp ứng tế bào nhƣ một hệ quả. Nhóm thứ nhất là các thụ

thể nội bào của các siêu họ thụ thể nhân và các thụ thể hoocmon steroid, retinoid và

thyroid. Nhóm thứ hai là các thụ thể liên kết với màng tế bào, nhóm này rất đa

dạng. Các thụ thể này giúp chuyển đổi tín hiệu từ bên ngoài vào trong tế bào đáp

ứng. Siêu họ này gồm có các thụ thể kết cặp kênh ion, thụ thể kết cặp kinase và họ

lớn các thụ thể kết cặp G protein.

1.3.1. Cấu trúc của các thụ thể kết cặp G protein

Các thụ thể kết cặp G protein (GPCR) là các protein xuyên màng với đặc điểm

đặc trƣng chung là xoắn 7 lần xuyên màng (cấu trúc bậc 2 xoắn ). Các phối tử nội

sinh của chúng có thể là các chất tín hiệu monoamine (epinephrine, acetylcholine,

serotonin, histamine, dopamine), lipid (các prostaglandin, các lipid nội sinh) các

peptid thần kinh (neuropeptide Y, cơ chất P, cholecystokinin, các opioid và các

hoócmôn peptide (glucagon, angiotensin, bradykinin) cũng nhƣ các protein nhỏ (các

chemokine) và các protein lớn (các hoocmon glycoprotein, thrombin). Tất cả các

GPCR chuyển các tín hiệu của chúng vào bên trong tế bào thông qua sự tƣơng tác

với các G protein dị hình. Thêm vào đó, các protein giác quan quan trọng nhƣ thụ

thể rhodopsin và các thụ thể khứu giác cũng thuộc họ này. Kích thƣớc của các loại

GPCR rất khác nhau, từ ít hơn 300 axit amin nhƣ thụ thể adrenocorticotropin, tới

hơn 1100 axit amin đối với các thụ thể metabotropic glutamate. Các thụ thể với các

biến đổi sau dịch mã khác nhau nhƣ glycosyl hóa, thƣờng dẫn đến khối lƣợng phân

tử cao hơn so với các trình tự axit amin ban đầu. Các biến đổi khác bao gồm cầu

disulfide và palmitoyl hóa ở các vị trí đặc biệt. Đa số các GPCR đƣợc phân loại

bằng các trình tự tƣơng đồng ban đầu và các họ phụ đƣợc đặt tên bằng những đặc

điểm đặc trƣng nhất của các thành viên. Trong khi mức độ tƣơng đồng thấp chỉ

đƣợc tìm thấy ở các đoạn vòng, thì các đoạn xoắn xuyên màng 7 lần có 20 - 25 axit

amin kỵ nƣớc ở mức độ bảo thủ cao [6].

Cơ chế kinh điển hoạt động chức năng của GPCR đƣợc xác định bởi sự kết

cặp của chúng với các protein liên kết với nucleotide guanine (G protein) [9].

Thông thƣờng, một GPCR ở trạng thái nghỉ ngơi hay ái lực thấp khi thiếu các

chất chủ vận (agonist). Sự liên kết của một chất chủ vận tới một thụ thể kích thích

một sự biến đổi trong cấu trúc của thụ thể và hình thành một phức hệ với các G

protein nội bào (hình 1.3). G protein dị hình có chứa một tiểu phần liên kết với

màng là Gα và các tiểu phần di động là Gβ và Gγ. Phân tích di truyền học hiện đại có

thể xác định đƣợc một số tiểu đơn vị G protein tạo thành 16 Gα, 5 Gβ và 12 Gγ nhƣ

hiện nay đã đƣợc nhân dòng và xác định trình tự [39]. Tiểu phần Gα liên kết GTP và

GDP và nó gây ra thủy phân GTP. Các tiểu phần Gβ và Gγ hình thành một phức hệ

theo tỉ lệ 1:1.

Hình 1.3. GPCR tuyền tín hiện thông qua các G protein. Sự tƣơng tác với chất chủ

vận dẫn đến thay đổi cấu hình của thụ thể và tới sự kết cặp với các G protein. Kết

quả là sự hoạt hóa của chuỗi truyền tín hiệu thông qua tiểu đơn vị Gα. Gβ và Gγ cũng

có thể gây ra các đáp ứng tế bào. A: chất chủ vận (agonist) hoặc đối vận

(antagonist). DAG: diacylglycerol. PI3Kγ: phosphoinositide 3-kinase-γ. PLCβ:

phospholipase Cβ. PKA, PKC: protein kinase A và C. (Nguồn: Birnbaumer, 1990).

Sau khi GPCR và G protein tƣơng tác (kết cặp), GDP đƣợc giải phóng và

đƣợc thay thế bởi GTP, sau đó tiểu phần Gα đƣợc phân ly từ phức Gβγ. Cả hai tiểu

phần Gα và phức kép Gβγ có thể hoạt hóa các phân tử gây ra đáp ứng nội bào. Ví dụ

Gα có thể hoạt hóa enzym adenyl cyclase, dẫn đến làm tăng lƣợng cAMP; phân tử

Các chất truyền tin thứ 2

PLCβ, DAG, Ca2+, PKA, PKC

Các đáp ứng tế bào

Angiogenesis, ung thƣ, phát triển,

biệt hóa

Các chất truyền tin thứ 2

PLCβ, DAG, Ca2+, PKA, PKC

Các đáp ứng tế bào

Angiogenesis, ung thƣ, phát triển,

biệt hóa

này đến lƣợt nó làm giảm hoạt tính protein kinase A (PKA). PKA là một enzym

serine-threonine kinase có chức năng photphoryl hóa, qua đó hoạt hóa nhiều yếu tố

phiên mã, các kinase và các thụ thể GPCR khác.

Bảng 1.1. Các G protein và chức năng trong sự truyền tin của tế bào

G protein Chức năng trong truyền tin tế bào

Gαq, Gα11

Hoạt hóa phospholipase C; điều hòa hoạt động của phospholipase C

đặc hiệu phosphoinositide

Gα14, Gα15, Gα16 Hoạt hóa Rho GEF

Gαs Hoạt hóa adenylyl cyclase; RGS-PX1 hoạt động nhƣ một protein

hoạt hóa GTPase cho Gαs

Gαo1f Tƣơng tác kênh Ca2+

; kích hoạt c-Src tyrosine kinase

Gαi Ức chế adenylyl cyclase; kích hoạt c-Src tyrosine kinase

Gαo Hoạt hóa kênh K+; tăng K

+ dẫn đến phân cực quá mức

Gαz Giao tiếp tế bào thông qua Rap1GAP1

Gα12 Hoạt hóa yếu tố Rho

Gα13 E-Cadherin; giải phóng β-catenin

GαT Tăng cGMP phosphodiesterase

Gαgust G protein chuyên biệt tế bào vị giác

Gβγ Hoạt hóa các kênh K+ GIRK

GIRKs Hoạt hóa adenylyl cyclase; hoạt hóa phospholipase C

(Nguồn: Lundstrom, 2006),

Các loại tiểu phần Gα khác nhau đóng vai trò quyết định đến truyền tín hiệu và

có thể đƣợc chia thành bốn nhóm. Tiểu phần Gαs kích thích adenylyl cyclase, trong

khi đó tiểu phần Gαi ức chế adenylyl cyclase và hoạt hóa kênh điều chỉnh ion K+

liên kết G protein (GIRK). Gαq gây ra hoạt hóa phospholipase C và Ga12 hoạt hóa

các yếu tố trao đổi guanidine nucleotide của Rho (Rho GEFs). Phức kép Gβγ có thể

độc lập hoạt hoá các kênh GIRK, adenylyl cyclase và các phospholipase. Các chức

năng khác của các tiểu phần G protein đƣợc nêu trên bảng 1.1 [32].

1.3.2. Thụ thể kết cặp G protein là đích của tìm kiếm thuốc

Khoảng 25% tổng số thuốc tân dƣợc đang đƣợc sử dụng rộng rãi trong điều trị

hiện nay có đích tác động là các GPCR; điều này làm cho GPCR trở thành các đích

phổ biến nhất trong việc tìm thuốc trong công nghiệp dƣợc dẫn đến sự phát triển

của các loại thuốc bán chạy trên thị trƣờng hiện nay bao gồm salmeterol,

olanzapine, clopidrogel, losartan và risperidone. Chúng và các thuốc khác nhắm vào

đích là các GPCR đƣợc dùng để điều trị nhiều trạng thái bệnh khác nhau tác động

lên hệ tim mạch và hệ thần kinh trung ƣơng, hệ tiêu hóa và các chức năng tiêu hóa

cũng nhƣ ung thƣ, đau, và dị ứng.

Rất lâu trƣớc khi chúng ta hiểu về các hoạt tính hóa học và phân tử của các

GPCR, con ngƣời đã sử dụng các sản phẩm tự nhiên của cà độc dƣợc, của lúa mạch

và thuốc phiện từ các nguồn khác nhau của thực vật để tìm ra các tác động dƣợc lý

ở các đích chƣa biết để điều trị một số bệnh tật. Cho đến đầu thế kỷ 20, ý tƣởng về

thụ thể đƣợc đặt ra khi Paul Ehrlich chỉ ra rằng các cơ chất thuốc có thể tƣơng tác

với thụ thể hóa học (chemoreceptor) đơn lẻ và tạo ra các tác động dƣợc lý. Các nhà

dƣợc lý học hàng đầu khác bao gồm Henry Dale, Otto Loewi, R.P. Ahlquist, và

James Black đã có công trong việc miêu tả hoạt động của các hợp chất ở các thụ thể

về sau này đƣợc xác định là các GPCR, đặt nền móng cho việc thiết kế thuốc dựa

trên sự tƣơng tác của chúng với các đích phân tử.

1.4. Thụ thể angiotensin

Angiotensin là một hoocmon peptide có vai trò quan trọng trọng cơ thể, gây co

thắt mạch và tăng huyết áp. Angiotensin là một phần của hệ renin-angiotensin, đây

là một đích chủ yếu của các thuốc điều hòa huyết áp. Angiotensin cũng kích thích

sự giải phóng aldosterone - một hoocmon khác từ vỏ tuyến thƣợng thận.

Aldosterone tăng cƣờng sự lƣu giữ natri trong ống sinh niệu ngoại biên ở thận, làm

huyết áp tăng.

Angiotensin có nguồn gốc từ phân tử angiotensinogen, một globulin huyết

thanh dài 452 axit amin, đƣợc sản xuất trong gan và có vai trò quan trọng trong hệ

renin - angiotensin. Angiotensin đƣợc phân lập một cách độc lập ở Indianapolis

(thuộc tiểu bang Indiana – Hoa kỳ) và Argentina vào cuối những năm 1930 (với tên

gọi tƣơng ứng là „Angiotonin‟ và „Hypertensin‟).

Angiotensin I (AT I) đƣợc tạo thành bởi hoạt động của renin trên

angiotensinogen. Renin cắt liên kết peptide giữa leucine (Leu) và valine (Val) trên

angiotensinogen tạo ra chuỗi peptide gồm mƣời axit amin là angiotensin I.

Angiotensin I dƣờng nhƣ không có hoạt tính sinh học và tồn tại chỉ nhƣ chất tiền

thân của angiotensin II (AT II). Angiotensin I đƣợc chuyển thành angiotensin II qua

việc loại bỏ 2 axit amin đầu C bởi enzym chuyển hóa angiotensin (ACE; đung cũng

là một kinase) mà chủ yếu thông qua ACE trong thận.

Angiotensin II hoạt động nhƣ một nội tiết tố hay hoocmon nội bào.

Angiotensin II làm tăng huyết áp bằng cách kích thích các protein Gq trong các tế

bào cơ trơn mạch máu (lần lƣợt kích hoạt co bởi một cơ chế phụ thuộc vào IP3).

Angiotensin II tác động trực tiếp trên tiểu cầu (zona glomerulosa) của vỏ thƣợng

thận để kích thích sinh tổng hợp aldosterone. Ở nồng độ cao hơn, angiotensin II

cũng kích thích sự sinh tổng hợp glucocorticoid. Angiotensin II hoạt động trên thận

gây co mạch thận, tăng tái hấp thu natri ở ống lƣợn gần, và ức chế tiết renin.

Angiotensin II còn là yếu tố phân chia tế bào cho các tế bào cơ tim mạch và tim và

có thể đóng góp vào sự phát triển của phì đại tim mạch. Nó cũng tạo nên một loạt

các hiệu ứng quan trọng về nội mô mạch máu [28].

Angiotensin II bị suy biến thành angiotensin III bởi các enzym angiotensinase

có trong các tế bào hồng cầu và các mạch máu ở hầu hết các mô. Nó có thời gian

bán hủy ngắn trong khoảng 30 giây, trong khi đó, trong mô, nó có thể dài 15-30

phút.

Hình 1.4. Hệ renin – angiotensin – aldosterone.

(Nguồn http://en.wikipedia.org/wiki/Angiotensin_II_receptor)

1.4.1. Thụ thể angiotensin II

Thụ thể angiotensin II làm trung gian tác động của hệ thống renin –

angiotensin, đóng vai trò quan trọng trong sinh lý (bệnh) tim mạch. Có 4 loại thụ

thể angiotensin II đã biết, trong đó thụ thể AT1 và AT2 là quan trọng nhất. Sự kích

thích của các thụ thể AT1 dẫn đến một loạt các con đƣờng tín hiệu trong một số loại

tế bào, mà cuối cùng dẫn đến quá trình nhƣ co mạch, viêm và phát bệnh. Các quá

trình này rất quan trọng trong nhiều bệnh liên quan tim mạch khác nhau, bao gồm

cao huyết áp, xơ vữa động mạnh và phì đại tâm thất.

Các thụ thể AT2 chủ yếu đƣợc biểu hiện trong giai đoạn bào thai. Ở cá thể

trƣởng thành, thụ thể AT2 đƣợc biểu hiện tối thiểu trong những hoàn cảnh bình

thƣờng. Vai trò của chúng đối với hệ thống tim mạch ngƣời trƣởng thành vẫn chƣa

đƣợc xác định rõ ràng, nhƣng nó có tác động đối lập với thụ thể AT1.

1.4.1.1. Thụ thể AT1 (the AT1 receptor)

Gen mã hóa thụ thể AT1 của ngƣời nằm ở băng số 22 ở vai dài của nst số 3 và

đƣợc nhân dòng lần đầu tiên vào năm 1992 [7,13]. Bao gồm 359 axit amin, là một

thành viên của siêu họ thụ thể kết cặp g protein đặc trƣng bởi đặc điểm 7 lần xuyên

màng. Thụ thể AT1 ở ngƣời không có các subtype, trong khi đó ở các loài gặm

nhấm, đƣợc chia thành các subtype là AT1a và AT1b.

Sơ đồ tổng quát truyền tín hiệu sau khi kích thích của thụ thể AT1 đƣợc biểu

diễn trong hình 1.5. Khi chất chủ vận angiotensin II liên kết với thụ thể AT1, dẫn

đến sự thay đổi cấu hình của thụ thể AT1, điều này dẫn đến không kết cặp Gq-

protein [35]. Điều này tăng cƣờng sự hoạt động của phospholipase C (PLC) tạo ra

sự sản sinh của 1,4,5-inosioltriphosphate (IP3) và diacylglycerol (DAG). Cả IP3 và

DAG đều có thể làm tăng nồng độ canxi nội bào. IP3 giải phóng canxi từ các

khoang nội bào và DAG dẫn đến sự đi vào trong tế bào của canxi ngoại bào, bằng

sự kích thích protein kinase C (PKC). Canxi nội bào tăng lên sẽ làm co của các tế

bào cơ trơn thành mạch.

Thụ thể AT1 cũng điều khiển các tyrosine kinase mà cần thiết cho các tác động

tăng trƣởng của angiotensin II [8]. Các tyrosine kinase có thể là nguyên nhân của

phosphryl hóa của một số phân tử tín hiệu, dẫn đến hoạt hóa của các enzym kinase

của protein hoạt hóa phân chia (MAP-mitogen-activated protein). Các MAP kinase,

cũng nhƣ PKC và canxi nội bào mức độ cao, khởi động các yếu tố phiên mã gen,

nhƣ c-fos, c-myc và c-jun, dẫn đến tăng trƣởng và phát triển tế bào.

Con đƣờng thứ 3 đƣợc hoạt hóa bởi thụ thể AT1 là sự cảm ứng của yếu tố

phiên mã nhân kappa-B (NF-κB), mà đƣợc trung gian thông qua Janus kinase

(JAK)/yếu tố cơ quan chuyển tín hiệu và yếu tố phiên mã (STAT factor), protein

hoạt hóa (AP-1), và phosphotyrosine kinase (PTK). Hoạt tính của NF-κB tăng lên

có liên quan đến sự thâm nhập của đại thực bào, sự biểu hiện của monocyte

chemoattractant protein-1 (MCP-1) [42].

Hình 1.5. Sơ đồ tổng hợp sự truyền tín hiệu của thụ thể AT1.

AP-1: Protein hoạt hóa – 1; AT1r: Thụ thể Angiotensin II typ 1; DAG:

Diacylglycerol; IP3 : 1,4,5-inositoltriphosphate; JAK: Janus kinase; MAP: protein

hoạt hóa phân bào; NADH: Nicotinamide-adenine dinucleotide; NADPH:

Nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate; NF-κB: yếu tố nhân κB; NO: Nitric

oxide; OxLDL: Các lipoprotein mật độ thấp bị oxi hóa (Oxidized low-density

lipoprotein); ROS: các gốc oxi phản ứng; STAT: yếu tổ truyền tín hiệu và hoạt hóa

phiên mã; PKC: Protein kinase C; PLC: Phospholipase C; PTK: Phosphotyrosine

kinase. (Nguồn : Ruiz-Ortega, 2000).

Thụ thể AT1 đóng vai trò quan trọng sinh lý bệnh tim mạch. Sự kích thích thụ

thể AT1 dẫn đến sự hoạt động một loạt các enzym truyền tín hiệu, dẫn đến sự giảm

nitric oxide và tăng oxidized LDL, NF-κB, các yếu tố phiên mã gen và canxi nội

↑ Ca2+

nội bào

↑ các yếu tố phiên mã

gen (c-fos, c-myc, c-jun)

Co mạch, viêm,

gây đông máu,

tăng sinh

Tăng vữa

động mạch

Viêm và phân chia Co mạch Sinh trƣởng các phân

chia

bào. Tùy thuộc vào các điều kiện vị trí, điều này dẫn đến co mạch, tăng tính

atherogenicity (xơ vữa), viêm. Những quá trình này quyết định đến các trạng thái

khác nhau của chứng xơ vữa động mạch và cũng quan trọng trong cao huyết áp, phì

đại tâm thất trái, suy tim mãn tính.

1.4.1.2. Thụ thể AT2

Thụ thể AT2 đƣợc tìm hiểu ít hơn so với AT1. Sự kích thích của thụ thể này

dẫn đến làm giảm các kinase MAP, và gây ra tăng cGMP, làm cho sự sinh trƣởng tế

bào bị giảm đi và gây ra chết theo chƣơng trình và giãn mạch. Do đó, thụ thể AT2

thể hiện các quá trình ngƣợc lại với thụ thể AT1.

Hình 1.6 biểu diễn quá trình dẫn truyền tín hiệu sau khi bị kích thích của AT2.

Angiotensin II liên kết với thụ thể AT2 dẫn đến tách cặp (uncoupling) của Gi

protein. Gi protein không kết cặp hoạt hóa serine/threonine phosphatase 2A (PP2A)

và phosphotyrosine phosphatase (PTP), tƣơng ứng ức chế sự phosphoryl hóa

protein serine/threonine và protein tyrosine. Thông qua các con đƣờng này, kích

hoạt các tác động của thụ thể AT2 trong việc ngăn chặn hoạt động của MAP kinase

sau khi đƣợc kích thích bởi thụ thể AT1. Do đó, ức chế tác dụng của thụ thể AT1

trong sinh trƣởng tế bào [34]. Thụ thể AT2 cũng có khả năng cảm ứng NF-κB,

thông qua việc sản xuất nội bào ceramide và ROS [24]. Các tác động của thụ thể

AT2 trong sản xuất cGMP vẫn còn gây tranh cãi.

Hình 1.6. Sơ đồ tổng hợp con đƣờng truyền tín hiệu của thụ thể AT2.

AT2r : Thụ thể Angiotensin II type 2; BK : Bradykinin một trong những kinin

huyết tƣơng là trung gian hóa học, có vai trò trong phản ứng viêm (gây giãn mạch,

tăng tính thấm mao mạch, và gây đau); cGMP : GMP vòng; MAP : Protein hoạt hóa

phân bào; NF-kB : Yếu tố nhân κB; NO : Nitric oxide; PP2A : Serin/threonin

phosphatase 2A; PTP : Phosphotyrosine phosphatase; ROS : Các các gốc oxi phản

ứng. (Nguồn : Ruiz-Ortega, 2000).

Một số nghiên cứu trên các động vật mô hình đã chỉ ra rằng AT2 có khả năng kích

thích con đƣờng bradykinin/NO-cGMP, dẫn đến gây giãn mạch [12]. Tuy nhiên,

cho đến nay con đƣờng này vẫn chƣa đƣợc chứng minh trong hệ mạch của ngƣời.

Viêm Giảm sinh trƣởng tế bào

Tăng chết theo chƣơng trình

Giãn mạch

Đƣa ra những đặc điểm này, các angiotensin II type 1 receptor blocker (ARBs-

các thuốc chẹn thụ thể) có thể điều trị hiệu quả các bệnh đã đƣợc chỉ ra ở trên.

ARBs không chỉ làm việc bằng các làm giảm những tác động có hại của thụ thể

AT1, mà còn làm tăng nồng độ angiotensin II bằng vòng phản hồi âm tính (phản hồi

tiêu cực). Khi có mặt một ARB, sự tăng của angiotensin II sẽ hoạt động nhƣ là 1

chất chủ vận của thụ thể AT2, do đó đối chọi với các tác động của AT1. Đây là một

lợi thế lý thuyết của ARBs khi so sánh với các chất ức chế ACE.

Các ARB đã đƣợc chứng minh là có hiệu quả trong cao huyết áp. Cũng nhƣ

trong trụy tim và các trƣờng hợp lắp van tim, các nghiên cứu đang đƣợc thực hiện,

nhƣng chƣa đƣợc kết luận. Để đánh giá giá trị của các ARB trong trụy tim, và ngăn

ngừa thứ phát ở các bệnh nhân mắc bệnh thiếu máu tim mạch cục bộ, nhiều thử

nghiệm ngẫu nhiên đã đƣợc thực hiên. Hơn nữa, tại thời điểm hiện tại thì vẫn chƣa

đủ những hiểu biết về tác động của sự kích thích của thụ thể AT2.

Hệ renin – angiotensin – aldosterone đóng vai trò chủ đạo trong điều hòa cân

bằng máu và các chất điện giải và huyết áp. Có 2 nhóm thuốc tác động đặc hiệu trên

hệ renin – angiotensin, đó là nhóm các thuốc ức chế enzym chuyển hóa angiotensin

(ACE) và các thuốc ức chế cạnh tranh với angiotensin ở thụ thể của nó (losartan và

các chất đối vận không có bản chất peptid khác [28].

Các thuốc ACE ngăn cản hoạt tính của men chuyển qua đó ngăn angiotensin I

chuyển hóa thành angiotensin II. Trong khi đó các thuốc chẹn thụ thể angiotensin II

(ARB) cạnh tranh vị trí liên kết của angiotensin II tại thụ thể của nó. Các thuốc ức

chế men chuyển có các tác dụng phụ đó là: tăng kali máu, qua đặc tính giảm tiết

aldosterone của ức chế men chuyển. Hạ đƣờng huyết do đặc tính nhạy cảm với

insulin của ức chế men chuyển. Tƣơng tác với erythropoietin, ức chế men chuyển

có thể ngăn cản một phần hoạt tính của erythropoietin, do đó làm thiếu máu. Suy

giảm chức năng thận. Ho và co phế quản, đặc điểm là ho khan, từng cơn thƣờng vào

buổi tối kèm cảm giác ngứa ở cổ họng.

Thuốc chẹn thụ thể angiotensin II đẩy angiotensin II ra khỏi thụ thể AT1 do đó

làm mất tác dụng của angiotensin II làm hạ huyết áp, đồng thời trong khi nồng độ

angiotensin II tăng cao trong tuần hoàn làm chúng tác động lên đích thụ thể AT2,

gây ra tác dụng hạ huyết áp theo con đƣờng thụ thể này. Do nguyên nhân là ngoài

còn đƣờng men chuyển, angiotensin I còn có thể chuyển thành angiotensin II qua

đƣờng men chymase và vài đƣờng khác; do đó thuốc chẹn thụ thể angiotensin II sẽ

ngăn chặn angiotensin II hoàn toàn hơn so với ức chế men chuyển. Đồng thời có ít

các tác dụng phụ hơn [4].

1.5. Các phƣơng pháp nghiên cứu tƣơng tác thụ thể và phối tử

1.5.1. Tương tác phân tử thụ thể và phối tử

Nhiều quá trình sinh hóa, thiết yếu cho hoạt động chức năng và tồn tại của tế

bào và cơ thể, đƣợc điều khiển bởi hormone, các chất dẫn truyền thần kinh,

cytokine và các phân tử truyền tin khác. Sự điều hòa bắt nguồn bởi sự tƣơng tác của

các phân tử đƣợc tìm thấy trong tự nhiên với các thụ thể có trên màng tế bào hoặc

có ở trong tế bào chất hoặc nhân tế bào.

Trong các thí nghiệm in-vitro, thụ thể đƣợc sử dụng với các mục đích khác

nhau, liên quan tới sàng lọc các thành phần hóa học mới hoặc để xác định và định

lƣợng các thuốc trong mẫu sinh phẩm. Kỹ thuật này đƣợc gọi là receptor assay

(phép thử thụ thể- hay thí nghiệm thụ thể). Các thụ thể trong các phân tích này có

thể dễ dàng thu đƣợc từ các nguồn động vật khác nhau. Trong phép thử thụ thể, một

phối tử đƣợc đánh dấu và chất phân tích sẽ cạnh tranh liên kết với thụ thể. Sau khi

cân bằng, các phần liên kết và không liên kết của phối tử đánh dấu phải đƣợc phân

tách. Có thể là bằng cách lọc hoặc bằng ly tâm, sau đó các phần đã liên kết và/hoặc

phần không liên kết sẽ đƣợc định lƣợng. Với các nồng độ tăng dần của chất cần

phân tích, lƣợng phối tử đánh dấu liên kết với thụ thể sẽ giảm. Đồ thị biểu diễn

phần đã liên kết của phối tử đánh dấu với các nồng độ chất cần phân tích tƣơng ứng

tạo nên đƣờng đồ thị ức chế, từ đó ái lực của chất phân tích với thụ thể có thể xác

định đƣợc cũng nhƣ các nồng độ chƣa biết của chất phân tích đó cũng có thể xác

định đƣợc.

Một thông số định lƣợng cho thấy mối quan hệ về ái lực của các phối tử đánh

dấu với một thụ thể đặc trƣng là hằng số phân ly cân bằng (Kd). Kd, cũng nhƣ số vị

trí liên kết có ở trong vật liệu thụ thể - Bmax có thể đƣợc xác định bằng các thí

nghiệm bão hòa (saturation experiment). Trong các thí nghiệm đó, nồng độ của phối

tử đánh dấu tăng dần đƣợc ủ với một lƣợng protein xác định.

Tƣơng tác của một phối tử đánh dấu với thụ thể đƣợc mô tả bằng phƣơng trình

sau:

L* + R ⇄ L

* R (phƣơng trình 1.1)

Trong đó L* là lƣợng phối tử đánh dấu, R là lƣợng thụ thể và L*R là lƣợng

phức hợp đƣợc hình thành của phối tử đánh dấu với thụ thể.

Từ đồ thị bão hòa, có thể tính đƣợc Bmax và nồng độ phối tử ở trạng thái bão

hòa 50% của các vị trí liên kết của thụ thể là Kd. Bmax và Kd có thể tính đƣợc theo

phƣơng trình:

(phƣơng trình 1.2)

Khi có một phối tử thứ 2, ví dụ nhƣ một chất phân tích, đƣợc thêm vào, tƣơng

tác có thể đƣợc mô tả bằng phƣơng trình sau đây:

A + L* + R ⇄ AR + L

*R (phƣơng trình 1.3)

Trong đó, A là lƣợng chất phân tích, và AR là lƣợng phức hợp đƣợc tạo thành

của chất phân tích với thụ thể.

Với các nồng độ khác nhau của chất phân tích (A), đồ thị tính toán đƣợc xác

định. Lƣợng chất phân tích mà thay thế 50% phối tử liên kết với thụ thể thì đƣợc gọi

là giá trị IC50. Giá trị này tỉ lệ nghịch với ái lực của chất phân tích với thụ thể. Hằng

số ái lực của chất phân tích (Ki) có thể tính từ giá trị IC50 với phƣơng trình Cheng-

Prusoff [15]:

(phƣơng trình 1.4)

1.5.2. Các phương pháp nghiên cứu tương tác thụ thể - phối tử

Receptor-ligand binding assays có thể đƣợc phân loại dựa theo sự cần hay

không cần sự phân tách của các phối tử liên kết với các phối tử tự do hoặc dựa theo

kỹ thuật xác định phối tử liên kết. Dựa theo tiêu chí đầu, có các loại phép thử đồng

nhất và không đồng nhất. Các phép thử không đồng nhất (heterogeneous assays) đòi

hỏi sự phân tách các phối tử tự do ra khỏi phần liên kết bằng cách lọc, ly tâm hoặc

thẩm tách trƣớc khi đo. Trong khi đó các phép thử đồng nhất (homogeneous assays)

không cần phân tách hoặc các bƣớc rửa trƣớc khi đo. Cách phân loại thứ 2, đƣợc

chia thành kỹ thuật đo dựa vào đồng vị phóng xạ hay không sử dụng phóng xạ.

Các kỹ thuật liên kết thụ thể-phối tử hoạt tính phóng xạ

Các phép thử liên kết thụ thể - phối tử phổ biến nhất là dạng không đồng nhất

và đã đƣợc phát triển sử dụng các phối tử đƣợc đánh dấu phóng xạ để liên kết với

thụ thể màng. Phƣơng pháp định lƣợng sử dụng phóng xạ đầu tiêu đƣợc phát triển

bởi Lefkowitz và cộng sự [29]. Nguyên lý là dựa trên tƣơng tác cạnh tranh giữa một

phối tử đƣợc đánh dấu phóng xạ và chất phân tích với cùng một vị trí liên kết với

thụ thể.

Một thuận lợi chính của các phép thử liên kết thụ thể sử dụng phóng xạ là độ

nhạy cao, tính đặc hiệu và dễ thực hiện. Phép thử chỉ đòi hỏi một bƣớc đánh dấu

phóng xạ cho phối tử đặc hiệu, thƣờng không làm giảm ái lực với thụ thể. Các phối

tử có ái lực cao với thụ thể có sẵn trên thị trƣờng cho phép xây dựng một phép thử

một cách nhanh chóng. Tuy vậy, hạn chế chính của những phép thử này là sử dụng

đồng vị phóng xạ và cần tách phối tử tự do ra khỏi phần đã liên kết, điều này làm

cho những thí nghiệm này tốn công sức và khá chậm. Hơn nữa, chúng đòi hỏi rằng

sự phân ly của phối tử diễn ra chậm hơn nhiều so với thời gian thực hiện bƣớc phân

tách (nhƣ lọc). Để không phải thực hiện bƣớc phân tách phối tử tự do, hiên nay đã

phát triển đƣợc kỹ thuật đồng nhất (homogeneous assay) dựa trên scintillation

proximity [16]. Tuy vậy, việc sử dụng phối tử đánh dấu phóng xạ có những nhƣợc

điểm cố hữu, đó là chi phí cao, có hại đến sức khỏe, vấn đề về chất thải phóng xạ

đòi hỏi yêu cầu giấy phép đặc biệt, và đặc biệt là ở các nƣớc đang phát triển nhƣ

Việt Nam, các vấn đề đó càng trở nên rõ nét. Vì vậy, các nhà nghiên cứu đã cố gắng

để phát triển các phép thử thụ thể đánh dấu không sử dụng đông vị phóng xạ.

1.5.3. Các phép thử thụ thể - phối tử không sử dụng phóng xạ

Nhiều phƣơng pháp khác nhau đã đƣợc sử dụng để phát triển các phép thử

không sử dụng đồng vị phóng xạ, bao gồm các các phép thử không đồng nhất cho

đến các phép thử đồng nhất. Nhƣ dựa trên chuyển năng lƣợng cộng hƣởng huỳnh

quang (fluorescence resonance energy transfer - FRET), phân cực huỳnh quang

(fluorescence polarization - FP) và đếm tế bào theo dòng (flow cytometry). Hầu hết

các phép thử này đều đòi hỏi một số loại phân tử đánh dấu, gắn vào để đo liên kết

phối tử - thụ thể. Do vậy điều mấu chốt là tìm đƣợc các điều kiện gắn nhãn (đánh

dấu) mà không làm ảnh hƣởng đến sự tƣơng tác phân tử. Trong trƣờng hợp phối tử

đƣợc gắn nhãn không có hoạt tính phóng xạ, phối tử phải đƣợc chứng minh là có

các đặc tính liên kết tƣơng tự (về tính đặc hiệu với thụ thể, và ái lực) là tƣơng tự

hoặc đƣợc cải tiến về độ nhạy nhƣ là các phối tử đƣợc đánh dấu phóng xạ.

Các phép thử không đồng nhất. Một trong những phép thử đầu tiên sử dụng

chất đánh dấu huỳnh quang đƣợc mô tả bởi McCabe, Takeuchi và Janssen [26, 44]

đã sử dụng RP-HPLC (sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo) với đầu dò huỳnh quang.

Phƣơng pháp của Takeuchi đo phân đoạn tự do của phối tử với RP-HPLC ngay sau

khi ly tâm. Điều này cần một lƣợng lớn thụ thể để đạt đƣợc mức liên kết đặc hiệu

cho phép có thể đo đƣợc sự thay đổi trong tín hiệu huỳnh quang. Phƣơng pháp của

Janssen và cộng sự thực hiện đo phần phối tử đã liên kết với thụ thể, do đó cần thêm

bƣớc phá vỡ liên kết thụ thể và phối tử sau khi ly tâm để thu đƣợc phối tử gắn

huỳnh quang từ thụ thể trƣớc khi đo bằng RP-HPLC. Việc đo trực tiếp phần phối tử

liên kết thì đem lại kết quả chính xác hơn, và không đòi hỏi lƣợng lớn thụ thể và

phối tử.

Cách khác để giảm tín hiệu nền đƣợc trình bày bởi Takeuchi [44], ngƣời đã sử

dụng time-resolved fluorescence (TRF), bằng cách gắn nhãn europium chelate cho

phối tử benzodiazepine. Sau khi ly tâm, dịch nổi đƣợc chuyển tới 1 vi phiến và

fluorescence đƣợc tăng cƣờng và ổn định, trƣớc khi đo, bằng cách bổ sung phối tử

huỳnh quang tăng cƣờng.

Các ví dụ khác của phƣơng pháp không sử dụng phóng xạ dựa trên gắn nhãn

enzym và đo tƣơng tác của thụ thể-phối tử thông qua hoạt tính của enzym liên kết

với phối tử. Mahoney [33] đã gắn biotin vào thụ thể yếu tố tăng trƣởng có nguồn

gốc tiểu cầu (PDGF-R platelet-derived growth factor receptor), thụ thể này đƣợc

gắn vào đáy đĩa, và đƣợc xác định thông qua sự bổ sung neutravidin-HRP vào đĩa,

thực hiện phản ứng kháng nguyên – kháng thể và phản ứng màu enzym để thu kết

quả.

Hiện nay, phƣơng pháp sử dụng phối tử đƣợc đánh dấu huỳnh quang trong các

nghiên cứu liên kết thụ thể ngày càng đƣợc sử dụng phổ biến. Bên cạnh các phối tử

đặc hiệu đánh dấu huỳnh quang còn các chất đánh dấu khác nhƣ biotin. Các phối tử

này đã đƣợc sử dụng rất thành công trong các nghiên cứu về tƣơng tác thụ thể - phối

tử nói chung và trong các nghiên cứu sàng lọc thuốc nói riêng.

1.5.4. Sử dụng phối tử đánh dấu fluorescein

Fluorescein là một chất hữu cơ tổng hợp, đƣợc sử dụng rộng rãi trong sinh học

để làm chất đánh dấu cho các phân tử trong nhiều ứng dụng. Fluorescein cũng đƣợc

gắn vào các phân tử có hoạt tính sinh học (nhƣ kháng thể), cho phép các nhà nghiên

cứu có thể nghiên cứu đƣợc các protein đích đặc hiệu hoặc nghiên cứu các cấu trúc

trong tế bào. Fluorescein cũng có thể đƣợc gắn với các nucleotide triphosphate để

tạo thành probe trong lai tại chỗ. Các ứng dụng khác có thể kể tên là mốc hiệu phân

tử (molecular beacon), hoặc làm đích của các kháng thể sử dụng hóa miễn dịch [36].

Trong miễn dịch, các phân tử kháng nguyên đánh dấu fuorescein cũng đƣợc sử

dụng, và cho kết quả tốt. Hệ thống kháng nguyên – kháng thể kháng fluorescein và

các dẫn xuất của fluorescein (nhƣ FITC) đƣợc sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu

sinh học, với rất nhiều ứng dụng nhƣ trong kết tủa miễn dịch

(Immunoprecipitation), lai Western Blotting [27, 41] cùng các kỹ thuật trong miễn

dịch huỳnh quang. Fluorescein đƣợc đánh giá là một phân tử đánh dấu không có

hoạt tính phóng xạ mới, có thể sử dụng trực tiếp hoặc gián tiếp giúp thay thế cho

các chất đánh dấu có hoạt tính phóng xạ truyền thống [31]. Hệ thống kháng nguyên

kháng thể này đã đƣợc công nhận là có độ nhạy cao và thay thế cho các phƣơng

pháp sử dụng biotin-streptavidin sử dụng cho các phân tích miễn dịch hấp thụ liên

kết enzym (ELISA - enzym-linked immunosorbent assays) [23].

Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu thực hiện phép thử

không sử dụng phối tử đánh dấu phóng xạ. Angiotensin II gắn thêm gốc fluorescein

(F-AT II) (hợp chất này đƣợc cung cấp bởi nhiều công ty hóa chất trên thế giới)

đƣợc chúng tôi sử dụng để thực hiện nghiên cứu này để thay thế cho phối tử đánh

dấu phóng xạ đƣợc sử dụng trong các nghiên cứu trƣớc đó. Đầu N của phân tử

angiotensin II đƣợc đánh dấu (gắn thêm) gốc huỳnh quang fluorescein (fluorescein-

angiotensin II hay viết tắt là F-AT II). Đây là một hợp chất là công cụ hữu ích ứng

dụng trong nghiên cứu sinh học, giúp hiển thị sự phân bố của các thụ thể

angiotensin II [30] cũng nhƣ trong phân tích đếm tế bào theo dòng (flow

cytometric) của quá trình nhập bào (endocytosis) của angiotensin II [21]. Các

nghiên cứu trên cũng chỉ ra rằng tƣơng tác tác của phối tử đƣợc gắn thêm gốc

fluorescein cho kết quả không khác biệt nhiều về mặt ái lực của phối tử với đích thụ

thể.

Phƣơng pháp để xác định F-AT II đã liên kết với thụ thể trong các thí nghiệm

là phƣơng pháp ELISA cạnh tranh, với kháng thể là kháng thể kháng fluorescein.

Trong đó, kháng nguyên fluorescein-BSA (F-BSA) đƣợc cố định trên bề mặt đĩa 96

giếng, và sự cạnh tranh giữa F-AT II với F-BSA với kháng thể kháng fluorescein sẽ

giúp xác định đƣợc lƣợng F-AT II trong các phản ứng liên kết thụ thể angiotensin II

và phối tử của nó (F-AT II). Sơ đồ thí nghiệm ELISA cạnh tranh đƣợc mô tả trong

hình 1.7 [14].

Hình 1.7. Minh họa phản ứng ELISA cạnh tranh. (Ag: kháng nguyên, Ab:

kháng thể, E: enzym). (Nguồn: Current Protocols in Molecular Biology).

1.6. Y học cổ truyền và tài nguyên dƣợc liệu

Những hóa thạch ghi lại thời gian con ngƣời sử dụng thực vật làm thuốc ít

nhất là ở giữa thời kỳ Đồ đá cũ (Middle Paleolithic) khoảng 60.000 năm trƣớc [43].

Theo WHO, 65% dân số thế giới sử dụng phƣơng thức chăm sóc sức khỏe chính là

sử dụng thuốc có nguồn gốc tự nhiên, đƣợc sử dụng trong đời sống hằng ngày, trải

qua lịch sử lâu đời và đƣợc truyền lại qua các thế hệ với nền văn hóa riêng; đƣợc

gọi là y học cổ truyền. Vậy y học cổ truyền là gì?

1.6.1. Vài nét về y học cổ truyền

Có kháng nguyên

cạnh tranh

Không có kháng

nguyên cạnh tranh

Phủ đĩa với kháng

nguyên (F-BSA)

Ủ kháng thể gắn

enzyme, có hoặc không

có kháng nguyên cạnh

tranh (F-AT II)

Bổ sung cơ chất và đo

tín hiệu màu

Kháng nguyên cần đo

(F-AT II)

Kháng nguyên phủ đĩa

(F-BSA)

Ag

Theo WHO [48], Y học cổ truyền là tổng hợp của kiến thức, kỹ năng và thực

hành dựa trên các lý thuyết, niềm tin và kinh nghiệm bản địa với các nền văn hóa

khác nhau đƣợc sử dụng để duy trì sức khỏe, cũng nhƣ để ngăn ngừa, chẩn đoán, cải

thiện hoặc điều trị các bệnh về thể chất và tinh thần. Y học cổ truyền đƣợc sử dụng

bởi những quần thể khác nhau (bên cạnh văn hóa bản địa) sử dụng sản phẩm thảo

dƣợc gồm có các thảo dƣợc, các vật liệu thảo dƣợc, dƣợc thảo và các sản phẩm

thành phẩm có chứa các bộ phận của thực vật hay các vật liệu thực vật khác làm

thành phần hoạt tính.

Nền y học cổ truyền là một thuật ngữ đƣợc dùng để chỉ nền y học truyền thống

nhƣ y học cổ truyền Trung Quốc, Ấn Độ, Ả rập và các hình thức khác nhau của y

học bản địa. Các liệu pháp y học cổ truyền bao gồm các liệu pháp y dƣợc nếu chúng

sử dụng thuốc có nguồn gốc thực vật, các bộ phận của động vật hoặc chất khoáng –

và các liệu pháp không sử dụng thuốc – nhƣ châm cứu, các liệu pháp bằng tay, và

tâm linh. Ở nhiều nƣớc có hệ thống chăm sóc sức khỏe phát triển mạnh dựa trên

thuốc tân dƣợc hoặc nơi mà y học cổ truyền không đƣợc hợp thành vào hệ thống

chăm sóc sức khỏe quốc gia, y học cổ truyền thƣờng đƣợc gọi là thuốc bổ trợ, thay

thế hoặc không phổ biến (CAM – complementary and alternative medicine).

Ở một số quốc gia châu Á và châu Phi, 80% dân số phụ thuộc vào y học cổ

truyền để chăm sóc sức khỏe ban đầu. Ở châu Á và Mỹ La tinh, ngƣời dân tiếp tục

sử dụng YHCT nhƣ là kết quả của lịch sử và tín ngƣỡng văn hóa. Ở Trung Quốc,

YHCT chiếm khoảng 40% tổng số các hoạt động chăm sóc sức khỏe. Trong khi đó,

ở nhiều nƣớc phát triển, CAM đang trở nên ngày càng phổ biến. Tỉ lệ phần trăm

trong dân số sử dụng CAM ít nhất một lần là 48% ở Úc, 70% ở Canada, 42% ở Mỹ,

38% ở Bỉ và 75% ở Pháp.

Phƣơng pháp điều trị thảo dƣợc là những hình thức phổ biến nhất của y học cổ

truyền, và sinh lợi cao trên thị trƣờng quốc tế. Doanh thu hàng năm ở Tây Âu đạt 5

tỷ USD trong năm 2003-2004. Ở Trung Quốc doanh số bán hàng của các sản phẩm

đạt 14 tỷ USD vào năm 2005. Doanh thu thuốc thảo dƣợc ở Brazil là 160 triệu USD

trong năm 2007 [18].

1.6.2. Y học cổ truyền và nguồn tài nguyên thiên nhiên trong nền y học

hiện đại

Số lƣợng các loài thực vật bậc cao trên hành tinh này đƣợc ƣớc tính khoảng

250.000 loài [5]. Mới chỉ khoảng 6% đƣợc sàng lọc hoạt tính sinh học, và khoảng

15% đã đƣợc đánh giá về mặt hóa học thực vật. Thực vật có 1 lợi thế to lớn trong

lĩnh vực này dựa trên việc sử dụng lâu dài của chúng trong lịch sử loài ngƣời, với

nền y học cổ truyền hàng nghìn năm.

Trong lịch sử, thực vật là nguồn cung cấp cho các chất làm thuốc mới, vì

thuốc có nguồn gốc thực vật có những đóng góp lớn tới chăm sóc sức khỏe và làm

cho cuộc sống tốt đẹp lên. Vai trò của chúng trong việc phát triển thuốc mới có thể

bằng cách cung cấp các hợp chất tự nhiên, hoặc là các thuốc thực vật đƣợc sử dụng

để điều trị bệnh tật. Ngƣời ta ƣớc tính rằng, các nguyên liệu thực vật đã cung cấp

mô hình cho 50% các thuốc tây. Nhiều loại thuốc đã đƣợc chứng minh thƣơng mại

đƣợc sử dụng trong y học hiện đại đã bƣớc đầu đƣợc sử dụng ở dạng thô trong thực

tế chữa bệnh truyền thống hoặc dân gian.

Từ đầu thế kỷ 19, một số lƣợng lớn các chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính

sinh học có nguồn gốc thực vật đã đƣợc tìm thấy để có ứng dụng thƣơng mại làm

thuốc. Gần đây, đã có một sự bùng nổ quan tâm trong việc sử dụng thực vật đƣợc sử

dụng dân gian nhƣ là nguồn của các hợp chất có khả năng hữu ích.

Một số phân tử nhỏ mới của các thuốc có nguồn gốc tự nhiên đã đƣợc đƣa vào

điều trị ở các nƣớc phƣơng Tây trong những năm gần đây, bao gồm acarbose,

artemether, capsaicin, docetaxel, dronabinol, galanthamine, irinotecan, paclitaxel,

tacrolimus, and topotecan. Xu hƣớng này tiếp tục đƣợc quan tâm trong tƣơng lai, ít

nhất trong điều trị các bệnh nhƣ ung thƣ, bệnh truyền nhiễm. Trong một thống kê

gần đây, chỉ ra là nguồn gốc của hơn 30000 các sản phẩn tự nhiên có hoạt tính sinh

học có thể đƣợc phân loại giữa các động vật (31%), vi khuẩn (13%), nấm (33%) và

thực vật bậc cao (27%) [17]. Các bằng chứng về tầm quan trọng của cá sản phẩm tự

nhiên đƣợc cung cấp bởi thực tế rằng, một nửa trong số các dƣợc phẩm bán chạy

nhất vào năm 1999 là các sản phẩm từ tự nhiên hoặc dẫn xuất của chúng.

Hiện nay, chiến lƣợc sàng lọc thuốc mới dựa trên nguồn tài nguyên thiên

nhiên đang là hƣớng đi thành công nhất, thực vật chính là nguồn quan trọng nhất

giúp cho các nhà khoa học nghiên cứu tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học

mới. Tìm kiếm thuốc mới từ thực vật đòi hỏi sự phối hợp giữa các nhà thực vật học,

dƣợc học thực vật và các khoa học khác, đƣợc bổ sung những lợi thế của các quan

sát về thực vật bản địa (ethonobotanical), vì nhiều loài thực vật đã đƣợc sử dụng

trong nền YHCT. Đó là sự kết hợp của chọn lọc tự nhiên trải qua hàng triệu năm

tồn tại cùng với lịch sử kinh nghiệm sàng lọc, thử nghiệm của con ngƣời trong

tƣơng tác với tự nhiên thể hiện qua y học cổ truyền.

1.6.3. Y học cổ truyền Việt Nam và nguồn tài nguyên thiên nhiên

Việt Nam là một quốc gia với nguồn tài nguyên thiên nhiên phong phú và đa

dạng, Việt Nam xếp thứ 16 trong 25 quốc gia có mức độ đa dạng sinh học cao nhất

thế giới, chiếm 6,5% số loài thực vật trên toàn thế giới, với nhiều nhóm sinh vật có

tính đặc hữu cao, có giá trị khoa học và thực tiễn lớn. Theo thống kê, hơn 13.200

loài thực vật và khoảng 10.000 loài động vật đã đƣợc xác định [20]. Đó là nguồn tài

nguyên vô tận, có tiềm năng rất lớn nếu chúng ta biết sử dụng hợp lý chúng. Theo

điều tra của Viện dƣợc liệu (NIMM), giai đoạn 1961-2005, Việt Nam có 3.948 loài

thực vật, 408 loài động vật, 75 khoáng vật và 52 loài tảo đã đƣợc sử dụng là nguồn

nguyên liệu làm thuốc. Những nguyên liệu làm thuốc đã đƣợc sử dụng rộng rãi

trong nền y học cổ truyền tại Việt Nam, với hơn 3800 bài thuốc đã biết, và còn hàng

nghìn bài thuốc lƣu truyền trong dân gian, đặc biệt là trong cộng đồng các dân tộc

thiểu số.

Hiện nay, 75% ngƣời Việt Nam sử dụng y học cổ truyền nhƣ là nguồn điều trị

chính cho vấn đề sức khỏe thông thƣờng [37]. Tuy nhiên, gần nhƣ tất cả các loại

thuốc truyền thống chƣa đƣợc đánh giá chính xác về mặt khoa học, và các thành

phần cũng nhƣ cơ chế hoạt động của chúng đã không đƣợc phát hiện rõ ràng. Đây

cũng là một tiềm năng để đi sâu nghiên cứu sàng lọc và xác định các chất hoạt động

sinh học, qua đó tạo ra các loại thuốc mới có tác dụng điều trị tốt.

Với lịch sử lâu dài trong sử dụng thuốc YHCT, sự đa dạng rất lớn nguồn thực

vật, động vật và khoáng vật làm thuốc cùng với các hợp chất có hoạt tính sinh học

có thể có ý nghĩa vô cùng quan trọng, là nguồn tài nguyên vô giá trong nghiên cứu

phát triển thuốc trong tƣơng lai.

1.6.4. Bệnh cao huyết áp trong YHCT, và một số loài cây thuốc được sử

dụng

Trong YHCT, tăng huyết áp là một chứng bệnh thuộc phạm vi chứng huyễn

vựng, đầu thống, can dƣợng vƣợng [3]. Nguyên nhân và cơ chế sinh bệnh: là do các

yếu tố chính sau:

- Yếu tố tình chí: do tình chí căng thẳng lâu ngày, tình chí không thƣ thái, lo

nghĩ tức giận khiến can khí nội uất, uất hóa hỏa làm hoa tổn can âm. Am

không liễm đƣợc dƣơng, can dƣơng nhiễu loạn lên trên làm đau đầu, mắt đỏ,

xuất hiện những cơn bốc hỏa. Can và thận có quan hệ mật thiết với nhan, hỏa

nung đốt phần âm của can thận dẫn đến can thận âm hƣ, can dƣơng vƣợng.

- Yếu tố về ăn uống: do ăn uống nhiều chất các chất ngọt béo làm tổn thƣơng

tì vị khiến chức năng vận hóa của tì suy giảm dẫn tới đàm thấp nội sinh nên

phát bệnh, hoặc uống nhiều rƣợu làm thấp trọc sinh ra lâu ngày hóa nhiệt,

nhiệt nung nấu tân dịch thành đàm, đàm lại làm rối loạn chức năng kiện vận

của tì vị… làm thanh dƣơng bất thăng, trọc âm bất giáng mà gây nên chứng

huyễn vựng.

Phƣơng pháp chữa tăng huyết áp dựa vào các nguyên nhân bệnh gây ra: hạ

hƣng phấn (bình can tiềm dƣơng, an thần), giãn mạch (hoạt huyết), lợi niệu.

Các bài thuốc, cây thuốc chữa cao huyết áp trong YHCT trích từ “Cây thuốc

và động vật làm thuốc ở Việt Nam” của Đỗ Huy Bích và cộng sự [1].

1.6.4.1. Cỏ mần trầu

Cỏ mần trầu có tên khoa học là Eleusine indica (L.) Gaerth., các tên gọi khác

của cỏ mần trầu là màng trầu, thanh tâm thảo, cỏ chỉ tía, … Là cây thân thảo nhỏ,

sống hằng năm, mọc sum suê thành cụm. Thân phân nhánh, mọc bò dài sau thẳng

đứng, cao 30 – 50 cm. Lá mọc so le, hình dải hẹp, xếp thành hai dãy cách nhau, đầu

thuôn nhọn. Cụm hoa mọc trên một cán dài ở ngọn thân, gồm 5 -7 bông xếp toả tròn

và 1 – 2 bông khác tách rời, mọc thấp hơn; bông mảnh phẳng, mang hai dãy bong

nhỏ xếp đều đặn, bông nhỏ không có cuống, nhẵn, có 3 – 5 hoa.

Hình 1.8. Cỏ mần trầu - Eleusine indica (L.) Gaerth. (Nguồn: Internet).

Phân bố rộng, từ vùng đồng bằng, trung du đến vùng núi cao hơn 1600 m. Là

loại cây ƣa ẩm, ƣa sáng và có thể hơi chịu bóng, thƣờng mọc thành đám trong các

bãi đất thấp ở thung lũng, ruộng ngô và quanh làng bản.

Thành phần hóa học: có chứa 3 – 0 – β – D – glucopy ranosyl - β – sitosterol

và dẫn chất 6‟ – 0 – palmitoyl ( CA 123: 76.639y). Cành, lá tƣơi có flavonoid

(TDTH, I, 1073).

Cỏ mần trầu đƣợc dùng theo kinh nghiệm dân gian chữa cao huyết áp, cảm

nắng, nổi mẩn, đái són, lợi tiểu.

1.6.4.2. Hạ khô thảo

Tên khoa học là Prunella vulgaris L., thuộc họ bạc hà. Là cây thân thảo, sống

nhiều năm, cao 20 – 30 cm. Thân đứng hình vuông, màu đỏ tím. Lá mọc đối, hình

trứng hoặc mác, gốc thuôn, đầu nhọn hoặc hơi tù dài 4 – 5 cm, rộng 1,2 – 1,5 cm, có

ít lông, mép nguyên hoặc hơi có răng cƣa. Cụm hoa mọc ở đầu cành thành bông

xim co, hình trụ dài 2 - 3 cm, lá bắc có màu tím đỏ ở mép; hoa nhỏ mọc thành nhiều

vòng sít nhau; đài hình chuông chia hai môi, môi trên rộng, có 3 răng, môi dƣới xẻ

sâu thành hai thùy; tràng màu tím cũng có 2 môi, môi trên nhƣ cái mũ, môi dƣới xẻ

3 thùy, thùy giữa lớn hơn hơi có răng; nhị 4, 2 dài, 2 ngắn mọc thò ra ngoài tràng.

Quả nhỏ, cứng, mùa hoa quả tháng 4 – 6.

Chỉ gặp ở một số nơi thuộc vùng núi cao, từ 1000 m trở lên nhƣ Tam Đảo

(Vĩnh Phúc); Sa Pa, Mƣờng Khƣơng, Bát Sát, Bắc Hà (Lào Cai); Đồng Văn, Mèo

Vạc, Quản Bạ (Hà Giang).

Hình 1.9. Hạ khô thảo - Prunella vulgaris L. (Nguồn : internet).

Hạ khô thảo là cây ƣa ẩm và ƣa sáng, thƣờng mọc thành đám trên đất ẩm

nhiều mùn gần bờ suối, trong thung lũng. Cây thích nghi với điều kiện khí hậu ẩm

mát quanh năm, ở vùng nhiệt đới núi cao có nhiệt đới trung bình dƣới 200C. Mùa

đông, phần thân cành trên mặt đất tàn lụi, phần thân rễ nằm sát mặt đất có thể chịu

đựng đƣợc nhiệt độ tới 00C, đến thàng 3 -4 năm sau tái sinh chồi trở lại. Hạ khô

thảo ra hoa quả hàng năm.

Hạ khô thảo có tác dụng hạ huyết áp khá mạnh trên động vật bình thƣờng hoặc

đã đƣợc gây cao huyết áp thực nghiệm, đồng thời có tác dụng co mạch. Các muối

vô cơ trong nƣớc sắc hạ khô thảo tiêm tĩnh mạch cho thỏ, gây hạ huyết áp, kích

thích hô hấp và lợi tiểu. Các chất tan trong nƣớc của hạ khô thảo có tác dụng hạ

huyết áp lâu dài trên bệnh nhân và làm hết các triệu chứng của bệnh cao huyết áp.

1.6.4.3. Hòe – tên khoa học Sophora japonica L.

Còn có tên gọi khác là hòe hoa, hòe mễ, lài luồng (Tày), thuộc họ Đậu

(Fabaceae). Cây nhỡ, thƣờng xanh cao 5 – 7 m. có khi đến 10 m. Thân có vỏ hơi

nứt nẻ và cành nằm ngang. Cành hình trụ, nhẵn, màu lục nhạt, có những chấm

trắng. Lá kép lông chim lẻ, mọc so le, 11 – 17 lá chét mọc đối, hình bầu dục –

thuôn, gốc tròn, đầu hơi nhọn, dài 3 – 4,5 cm, rộng 1,2 - 2 cm. Màu lục nhạt, nhất là

ở mặt dƣới, hơi có lông.

Hình 1.10. Hòe - Sophora japonica L. (Nguồn : internet).

Cụm hoa mọc ở đầu cành thành chùm dài 20 cm, phân nhánh nhiều ; hoa nhỏ

màu trắng hoặc màu vàng nhạt ; đài hình chuông, gần nhƣ nhẵn, cánh hoa có mồng

ngắn, cánh cờ rộng, hình tim cụt ở gốc, mép cong lên ; nhị 10 rời nhau ; bao phấn

hình bầu dục. Quả đậu, hình tràng hạt, thắt lại không đều, quả không mở, đầu có

mũi nhọn ngắn ; hạt 2 – 5, hình bầu dục hơi dẹt và màu đen bóng. Ra hoa tháng 5 –

8, màu quả từ tháng 9 – 11.

Hòe đƣợc trồng rộng rãi ở các tỉnh phía bắc hiện nay vốn là cây nhập nội,

chƣa rõ nguồn gốc. Từ sau 1978, cây đƣợc đƣa vào Tây Nguyên sau lan ra các tỉnh

khác. Hòe là cây gỗ trung sinh, ƣa sáng.

Bộ phận dùng làm thuốc chủ yếu là nụ hoa hòe, ngoài ra các bộ phận khác

cũng đƣợc dùng làm thuốc nhƣ hoa hòe đã nở, quả và lá.

Dịch chiết từ nụ hòe, bằng đƣờng tiêm tĩnh mạch chó đã gây mê, có tác dụng

hạ huyết áp rõ rệt. Trên chuột cống trắng cao huyết áp di truyền, rutin tiêm tĩnh

mạch với liều 1 mg/kg cũng có tác dụng hạ huyết áp.

1.6.4.4. Tầm gửi

Hình 1.11. Tầm gửi - Taxillus philippensis (Cham.&Schl.) Ban. (Nguồn :

internet).

Tên Khoa học: Taxillus philippensis (Cham.&Schl.) Ban. Tên đồng danh:

Loranthus philippensis Cham.&Schl.; Scurrula philippensis (Cham.&Schl.) G.

Tên Việt Nam: Mộc vệ Philippin. Thuộc họ Loranthaceae

Cây mọc bán ký sinh trên cây khác. Lá mọc đối, phiến lá bầu dục to 8x3-4cm,

có lông trăng trắng, gân phụ 4 cặp; cuống lá 3-5mm có lông trắng. Chùm hoa ở

nách lá, đầy lông sét; đài có lông; vành đài 17-25mm, tai 4 cao đến 5-8mm, tiểu

nhụy 4, gắn bó ở miệng hoa.

Phân bố: Trên thế giới có thấy ở Trung Quốc, Philippin, Thái Lan, Indonexia,

Malaixia. Ở Việt Nam có thấy ở Lâm Đồng, Lào Cai… Cây sống bám trên cây khác

trong rừng thƣa, độ cao 600-2000m.

Công dụng: Đƣợc dùng để thay thế Taxillus parasitica ( Taxillus parasitica:

có tác dụng bổ thận, mạnh gân cốt, lợi sữa, chữa viêm khớp, đau dạ dầy, cao huyết

áp, trẻ em bị di chứng bại liệt.) ngoài ra T. philippensis còn có trong thuốc tắm của

đồng bào Dao đỏ.

Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

2.1. Vật liệu

Vật liệu

Chuột nhắt trắng chủng Swiss, khối lƣợng 30 -40g do viện Vệ sinh dịch tễ

trung ƣơng (NIHE) cung cấp.

Mẫu thực vật do Khoa tài nguyên Dƣợc liệu, viện

Dƣợc liệu cung cấp, với danh sách mẫu, địa điểm, cùng

với ký hiệu mẫu kèm theo (bảng 2.1).

Bảng 2.1 Các mẫu thực vật trong nghiên cứu

Tên loài (họ) Tên thƣờng gọi Bộ phận lấy Địa điểm lấy mẫu Ký hiệu mẫu

Eleusine indica Gaerth.

(Poaceae)

Cỏ mần trầu

Cả cây

Hƣng Yên PEI081101

Hà Nội PEI081102

Hà Nội PEI081103

Prunella vulgaris L.

(Lamiaceae)

Hạ khô thảo

Cả cây

Sa Pa LPV081101

Hà Giang LPV081102

Hà Giang LPV081103

Sophora japonica L.

(Fabaceae)

Hòe

Nụ hoa

Hƣng Yên FSJ081101

Thái Bình FSJ081102

Hà Nội FSJ081103

Taxillus philippensis

(Cham.&Schl.) Ban

(Loranthaceae)

Tầm gửi Cả cây

Lào Cai LTP081101

Lai Châu LTP081102

Lào Cai LTP081103

Hóa chất và thiết bị

Bovine serum albumin (BSA) của hãng Biobasic. Fluorescein-BSA (F-BSA),

fluorescein-angiotensin II (F-AT II) Invitrogen (Carlsbad, USA). Angiotensin II

(AT II), Tween 20 (Sigma-Aldrich St. Louise, USA), kháng thể kháng fluorescein

đƣợc gắn enzym horseradish peroxidase, ABTS của invitrogen, methanol của

Merch (Germany).

Các hóa chất khác đƣợc mua từ các hãng hóa chất uy tín khác.

Đĩa 96 giếng của Corning (Lowell, MA, USA).

Thiết bị: máy nghiền đồng thể, máy ly tâm lạnh, máy cô quay chân không,

máy đo đĩa 96 giếng (Bio-rad), máy lắc và các thiết bị cần thiết khác tại phòng thí

nghiệm Sinh học thụ thể và phát triển thuốc, thuộc Phòng thí nghiệm trọng điểm

quốc gia protein & enzym, Trƣờng đại học Khoa học Tự nhiên, đại học Quốc gia

Hà Nội.

2.2. Phƣơng pháp

2.2.1. Quy trình chiết xuất dịch chiết methanol

Các mẫu cây thuốc trong nghiên cứu đƣợc cung cấp bởi Khoa Tài nguyên

Dƣợc liệu, Viện Dƣợc liệu.

Mỗi loài cây thuốc đƣợc lấy ở 3 địa điểm phân bố ngẫu nhiên (bảng 2.1). Các

mẫu đƣợc phơi, sấy khô, cắt thành mảnh nhỏ và đƣợc nghiền thành dạng bột, đƣợc

rây qua rây lọc có kích thƣớc 1 mm. 2,5 g bột khô đƣợc chiết 3 lần với methanol

trong thời gian 30 phút trong bể rửa siêu âm.

Dịch chiết đƣợc lọc qua giấy lọc Whatman no.1. Sau đó dịch chiết đƣợc cô

quay chân không bằng máy cô quay chân không của Buchi.

Sau đó hòa tan trong 10 ml methanol để thu đƣợc dịch chiết methanol của các

mẫu ở nồng độ 250 mg/ml. Dịch chiết sẽ đƣợc pha loãng thành các nồng độ phù

hợp để thực hiện các phản ứng liên kết.

2.2.2. Thu thụ thể màng

Quy trình thu protein từ gan chuột đƣợc tham khảo từ các nghiên cứu đƣợc

công bố trƣớc đây [46].

4 g mô gan chuột Swiss trắng, đã để lạnh ở -200C qua đêm, đƣợc cắt thành

mảnh nhỏ, bổ sung 8 ml đệm nghiền (Tris 50 mM, EDTA 5 mM, pH 7,4).

Hỗn hợp đƣợc nghiền bằng máy nghiền đồng thể Ultra-Turrax T25 Basic

(IKA, Germany) cho đến khi thu đƣợc dịch đồng nhất, sau đó chuyển dịch nghiền

vào các ống falcon có dung tích phù hợp.

Ly tâm ống 1.000 g ở 40C trong 10 phút, thu dịch pha trên. Dịch pha trên đƣợc

ly tâm ở 36.000 g ở 40C trong 15 phút, thu tủa và rửa tủa thu đƣợc 2 lần với đệm

nghiền.

Tủa thu đƣợc sau khi ly tâm đƣợc hòa trong đệm ủ (Tris 50 mM, MgCl2 5

mM, pH 7,4).

Chú ý: các thao tác đƣợc thực hiện nhanh, trên đá để hạn chế sự biến tính mẫu.

Xác định nồng độ protein thu đƣợc từ mô gan sau khi nghiền đồng thể bằng

phƣơng pháp Bradford [11]. Bảo quản ở protein ở -800C cho đến khi dùng trong các

phản ứng liên kết.

2.2.3. Xác định nồng độ protein sử dụng phương pháp Bradford

Nồng độ protein thu đƣợc từ mô gan đƣợc đo bằng phƣơng pháp Bradford với

protein chuẩn là BSA.

Đƣờng chuẩn đƣợc thiết lập với các nồng độ lần lƣợt là 200, 400, 600, 800 và

1000 µg/ml dung dịch BSA, với chất màu là dung dịch coomassie blue G250.

Mẫu protein cần xác định nồng độ đƣợc pha loãng với các nồng độ 1, 1/10,

1/100 và 1/1000 so với nồng độ gốc.

Từ đƣờng chuẩn và giá trị OD595 của các nồng độ pha loãng của mẫu protein

cần đo ta xác định đƣơc nồng độ chính xác của mẫu. Giá trị nồng độ này đƣợc dùng

để thực hiện các thí nghiệm liên kết tiếp theo.

2.2.4. Phương pháp elisa để xác định lượng phối tử gắn fluorescein

100 µl fluorescein-BSA ở nồng độ thích hợp pha với đệm PBS 1X, pH 7,2

đƣợc phủ lên bề mặt mỗi giếng phản ứng trên đĩa 96 giếng.

Đĩa đƣợc ủ qua đêm ở 40C, sau đó rửa đĩa bằng đệm rửa (PBS 1X pH 7,4 có

bổ sung Tween 20 (0,05%)) 3 lần.

Bổ sung 200 µl dung dịch blocking buffer (BSA 5%, PBS 1X pH 7,4) để khóa

các vị trí trống trong giếng hạn chế sự hấp phụ của các thành phần thí nghiệm khác

lên bề mặt đĩa (nhƣ kháng thể có gắn enzym) gây ra sai số thí nghiệm, ủ 1h ở nhiệt

độ phòng (240C). Sau đó rửa đĩa bằng đệm rửa 3 lần.

Hút 100 µl kháng thể kháng fluorescein, cho vào mỗi giếng, ủ đĩa trong 2h 30

phút ở nhiệt độ phòng, lắc nhẹ đĩa. Sau khi đã ủ xong, rửa đĩa 5 lần bằng đệm ủ.

Bổ sung 100 µl dung dịch phát triển màu (ABTS 1X, H2O2 0,03%, trong đệm

citrate 0,1 M pH 4,2). Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.

Dừng phản ứng bằng cách cho 100 µl dung dịch SDS 1% và đo OD405 để thu

đƣợc kết quả.

2.2.5. Quy trình thí nghiệm liên kết (binding assay)

Để xác định sự tƣơng tác của thụ thể angiotensin trên màng tế bào với các chất

chuẩn là fluorescein-angiotensin II (pha trong blocking buffer), 500 µl thụ thể đƣợc

ủ với 100 µl phối tử (fluorescein-angiotensin II) để tổng thể tích là 600 ul.

Ủ và lắc ở nhiệt độ phòng trong thời gian tối ƣu, sau đó ly tâm 10.000 g trong

1 phút ở 40C, loại bỏ dịch nổi. Phối tử liên kết đặc hiệu sẽ đƣợc phá vỡ liên kết bằng

cách bổ sung 100 µl dung dịch angiotensin II (phối tử đặc hiệu, không gắn

fluorescein) ở nồng độ cao (10-4

M).

Ly tâm 20.000 g ở 40C trong 15 phút. Dịch nổi có chứa fluorescein-

angiotensin II sẽ đƣợc chuyển sang đĩa elisa để xác định lƣợng đã liên kết với thụ

thể angiotensin II.

2.2.6. Phản ứng tương tác giữa các phối tử đã biết và dịch chiết với thụ thể

đích

Sự tƣơng tác giữa phối tử đặc hiệu đã biết và các dịch chiết thông qua thụ thể

đích đƣợc xác định gián tiếp qua phản ứng cạnh tranh giữa các phối tử hay dịch

chiết này với phối tử gắn fluorescein (fluorescein-angiotensin II).

Ở các thí nghiệm này, nồng độ thụ thể và nồng độ phối tử đánh dấu đƣợc giữ

cố định còn phối tử đã biết (angiotensin II không đánh dấu fluorescein và losartan)

và dịch chiết thực vật đƣợc đƣa vào phản ứng với các nồng độ khác nhau.

Nồng độ phối tử đã biết trong dãy từ 10-3

M đến 10-10

M; còn đối dịch chiết

thực vật dải nồng độ dịch chiết đƣa vào là từ 0,01µg/ml, 0,1µg/ml, 1µg/ml, đến

1000µg/ml. Thể tích dịch chiết đƣa vào mỗi thí nghiệm không quá 5% (thể tích/thể

tích), trong nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện với thể tích dịch chiết methanol đƣa

vào là 6µl trên tổng thể tích phản ứng là 600µl. Mỗi thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần.

2.2.7. Phương pháp xử lý kết quả.

Các kết quả thí nghiệm đƣợc xử lý và phân tích sử dụng phần mềm GraphPad Prism

5.04 (GraphPad Software Inc., USA).

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Xác định nồng độ protein thu đƣợc từ gan

Ở chuột và thỏ, có hai nhóm phụ thụ thể angiotensin II khác nhau, là thụ thể

Agtr1 (hay Agtr1a, hoặc AT1A) và Agtr1b (hay AT1B). Hai loại thụ thể này do các

gen khác nhau quy định có trình tự tƣơng đồng quan trọng trong vùng mã hóa. Các

thụ thể này tƣơng đồng về ái lực với với angiotensin II và các chất đối vận không

peptide và không thể phân biệt về mặt dƣợc lý mặc dù chúng có sự phân bố khác

nhau và đƣợc điều hòa khác nhau [25]. So sánh trình tự gen mã hóa thụ thể AT1 ở

ngƣời và chuột, có tới hơn 95% trình tự axit amin tƣơng đồng [22], và có ái lực

tƣơng đồng với chất chủ vận tự nhiên là angiotensin II [25].

Gan chuột là mô có sự phân bố của thụ thể angiotensin II cao thứ hai, chỉ sau

tuyến thƣợng thận [40].

Hình 3.1. Sự phân bố của thụ thể Agtr1a ở chuột. (Nguồn: Regard, 2008).

Hình 3.2. Sự phân bố của thụ thể Agtr1b ở chuột. (Nguồn: Regard, 2008).

Trong nghiên cứu này chúng tôi chọn mô gan để thu protein thụ thể này do mô

gan lớn hơn và thu mẫu cũng dễ dàng hơn.

Sau khi mẫu mô thu đƣợc đƣợc nghiền đồng thể, tiến hành đo nồng độ protein

thu đƣợc theo phƣơng pháp của Bradford. Với BSA là protein chuẩn, đƣờng chuẩn

đƣợc xây dựng, với phƣơng trình y = ax + b; trong đó y là giá trị OD ở bƣớc sóng

595nm, còn x là giá trị nồng độ protein (mg/ml). Với các mẫu pha loãng từ mẫu

protein gốc thu đƣợc sau khi nghiền đồng thể, sau khi đo OD595 ta tìm đƣợc giá trị

OD của mẫu pha loãng trong giới hạn của đƣờng chuẩn đã xây dựng, từ đó tính

đƣợc nồng độ của mẫu pha loãng này rồi từ số lần pha loãng suy ngƣợc ra nồng độ

của mẫu protein gốc ban đầu. Trong thí nghiệm này, chúng tôi xác định đƣợc giá trị

của nồng độ protein thu đƣợc từ gan chuột, nồng độ thu đƣợc là 50 mg/ml.

Hình 3.3. Đồ thị đƣờng chuẩn BSA trong phản ứng Bradford

3.2. Tối ƣu phản ứng ELISA

Để tối ƣu phản ứng ELISA cho các phản ứng giúp xác định đƣợc lƣợng phối

tử đặc hiệu F-AT II từ phản ứng liên kết, chúng tôi tiến hành thí nghiệm xác định

nồng độ thích hợp của phản ứng ELISA có thể xác định đƣợc.

Hình 3.4. Tối ƣu nồng độ pha loãng kháng thể với F-BSA.

Thí nghiệm đƣợc tiến hành với các nồng độ kháng nguyên (fluorescein-BSA)

ở các nồng độ 0,1; 0,5; và 1 µg/ml. Với mỗi nồng độ kháng nguyên nhƣ trên, chúng

y = 0,08x - 0,009

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2

OD 595nm

Nồng độ BSA (mg/ml)

tối tiến hành với các nồng độ kháng thể có gắn enzym horseradish peroxidase lần

lƣợt ở các nồng độ pha loãng là từ 250 đến 8000 lần (theo giới hạn đƣợc khuyến cáo

của nhà cung cấp). Kết quả thí nghiệm đƣợc trình bày trên hình 3.4. Từ kết quả này,

chúng tôi xác định đƣợc một số nồng độ cho kết quả thí nghiệm đảm bảo các tiêu

chí đó là cho kết quả OD ổn định, và giá trị OD405 ở trong khoảng giá trị đủ lớn (nếu

giá trị OD nhỏ, sẽ cho sai số lớn khi kết quả có sự sai số). Tiếp theo, chúng tôi tiến

hành các thí nghiệm để tìm ra khoảng giới hạn về nồng độ của phối tử đặc hiệu

trong phản ứng liên kết với thụ thể, đó là angiotensin II đƣợc đánh dấu fluorescein

(fluorescein-angiotensin II, ký hiệu F-AT II). Nhờ phản ứng ELISA cạnh tranh giữa

F-AT II với kháng nguyên phủ trên đĩa trƣớc đó (F-BSA), chúng ta có thể xác định

đƣợc khả năng của phƣơng pháp trong việc đo lƣợng phối tử liên kết thụ thể.

Hình 3.5 biểu diễn kết quả xác định đƣờng chuẩn F-AT II đƣợc thiết lập với

phản ứng elisa với nồng độ kháng nguyên phủ đĩa là 1 µg/ml và nồng độ kháng thể

kháng fluorescein là pha loãng 3000 lần.

Hình 3.5. Đƣờng chuẩn nồng độ F-AT II.

Nhƣ vậy, chúng tôi đã tối ƣu hóa thành công phản ứng ELISA giúp đo đƣợc

nồng độ của phối tử đặc hiệu trong phản ứng liên kết với thụ thể đích-thụ thể

angiotensin II. Và dải nồng độ của phối tử đặc hiệu cũng đƣợc xác định trong

khoảng từ 10-11

M - 10-8

M. Đây là khoảng nồng độ rất phù hợp cho việc xác định

nồng độ của phối tử trong phản ứng liên kết thụ thể - phối tử, vì các phản ứng này

thƣờng đo đƣợc trong khoảng nM (10-9

M).

3.3. Tối ƣu nồng độ protein thụ thể trong phản ứng liên kết

Để thực hiện đƣợc các thí nghiệm liên kết giữa thụ thể và phối tử chúng tôi

tiến hành thí nghiệm xác định nồng độ protein thụ thể phù hợp cho thí nghiệm. Thí

nghiệm đƣợc thực hiện với dải nồng độ protein thụ thể từ 2,5 mg/ml đến 80 mg/ml.

Nồng độ của phối tử đặc hiệu F-AT II trong các phản ứng này là 10-8

M, đây là

nồng độ đƣợc tham khảo từ những nghiên cứu trƣớc đây trên thụ thể này với phối tử

đặc hiệu là AT II đánh dấu phóng xạ [47].

Hình 3.6. Ảnh hƣởng của nồng độ protein với phối tử.

Kết quả đƣợc trình bày trong hình 3.6, cho thấy ở nồng độ lƣợng phối tử liên

kết đặc hiệu với thụ thể đích tăng dần cho đến nồng độ protein là 10 mg/ml, ở đó

phản ứng bắt đầu đạt đƣợc giá trị tối đa. Từ kết quả này, giá trị nồng độ protein

thích hợp cho các phản ứng liên kết thụ thể - phối tử đƣợc chúng tôi thực hiện trong

các thí nghiệm tiếp theo là 10 mg/ml.

Cùng với thí nghiệm này, thời gian ủ cho phản ứng liên kết thụ thể - phối tử

cũng đƣợc thực hiện. Giá trị thời gian ủ phù hợp nhất là 40 phút.

3.4. Thí nghiệm liên kết thụ thể - phối tử đặc hiệu (thí nghiệm bão

hòa)

Với các điều kiện thí nghiệm đã tối ƣu, đó là thời gian ủ 40 phút, và nồng độ

protein thụ thể 10 mg/ml đã đƣợc xác định thông qua các thí nghiệm trƣớc đó,

chúng tôi tiến hành thí nghiệm tiếp theo để xác định đƣợc các giá trị Kd và Bmax đặc

trƣng cho phối tử đặc hiệu F-AT II. Thí nghiệm đƣợc thực hiện với phản ứng liên

kết với dải nồng độ phối tử đặc hiệu từ 10-7

M đến 10-9

M.

Hình 3.7. Phản ứng bão hòa thụ thể angiotensin II với F-AT II.

Sử dụng phần mềm Prism 5.04, với mô hình một vị trí liên kết (one site

binding model), giá trị Kd đƣợc tính toán là 11,38 nM, kết quả này tƣơng đồng với

các nghiên cứu đã đƣợc công bố trƣớc đó với phối tử đánh dấu phóng xạ [10, 47].

Nhƣ vậy, angiotensin II đánh dấu fluorescein trong nghiên cứu này của chúng tôi đã

cho kết quả rất khả quan khi so sánh với các phƣơng pháp đã công bố, và sự ảnh

hƣởng của việc gắn thêm gốc fluorescein nếu có thì cũng không làm ảnh hƣởng

nhiều đến kết quả của phƣơng pháp này.

3.5. Phản ứng cạnh tranh của F-AT II với các phối tử đã biết

Để xác định sự chính xác và khả năng thay thế của phƣơng pháp sử dụng

angiotensin II đánh dấu fluorecein so với phƣơng pháp truyền thống (sử dụng phối

tử đánh dấu phóng xạ), chúng tôi thực hiện các thí nghiệm liên kết cạnh tranh giữa

F-AT II với các phối tử đã biết của thụ thể đích. Các phối tử cạnh tranh đƣợc chọn

là angiotensin II không đánh dấu, và một chất đối vận của angiotensin II đƣợc dùng

làm thuốc rất phổ biến hiện nay là losartan (là một trong những thuốc bán chạy nhất

hiện nay). Giá trị Ki thu đƣợc đƣợc so sánh với các giá trị Ki đã công bố của các

phƣơng pháp khác.

a b

Hình 3.8. Sự cạnh tranh angiotensin II (a) và losartan (b) với F-AT II trong liên kết

với thụ thể angiotensin II.

Sự ức chế của các phối tử với F-AT II trên thụ thể thu đƣợc từ gan chuột với

AT II (dải nồng độ từ 10-12

– 10-4

M) và losartan (dải nồng độ từ 10-10

– 10-2

M).

Kết quả thu đƣợc đƣợc xử lý, biểu diễn trên hình 3.8. Giá trị Ki của AT II và

losartan lần lƣợt là 13x10-9

M và 3,6x10-7

M. Giá trị Ki của AT II trong nghiên cứu

này là khá tƣơng đồng với các nghiên cứu đã công bố trƣớc đây [7, 48], và so sánh

với giá trị Kd của F-AT II trong nghiên cứu này ta thấy có sự tƣơng đồng cao, cho

thấy phối tử đánh dấu F-AT II và phối tử không đánh dấu AT II không có nhiều

khác biệt về ái lực. Điều này cũng củng cố thêm những đánh giá về sự ổn định và ái

lực của phối tử đƣợc đánh dấu fluorescein sử dụng trong các nghiên cứu trong các

lĩnh vực khác trên thụ thể angiotensin II nhƣ trong các nghiên cứu đã đƣợc đề cập

trong phần tổng quan tài liệu.

Giá trị Ki của losartan đƣợc xác định cao hơn trong các nghiên cứu khác đƣợc

xác định trong nghiên cứu này của chúng tôi, có thể lý giải điều này là do đây là

thuốc đƣợc mua từ các nhà thuốc, vì vậy có thêm các chất khác bổ sung và độ tinh

khiết không cao, nhƣ đƣợc dùng trong các nghiên cứu khác. Mặc dù vậy, việc sử

dụng các phối tử cạnh tranh với phối tử đánh dấu đã cho thấy phƣơng pháp này cho

kết quả chính xác khá cao, và có thể áp dụng đƣợc ở Việt Nam để thay cho việc sử

dụng các phƣơng pháp đánh dấu phóng xạ mà khó áp dụng ở các nƣớc đang phát

triển. Hơn nữa, phù hợp với các nghiên cứu đánh giá bƣớc đầu để sàng lọc các dịch

chiết có tác dụng hoạt động trên thụ thể đích.

3.6. Nghiên cứu sàng lọc một số dịch chiết thực vật

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã kiểm tra khả năng cạnh tranh của 12 dịch

chiết methanol của 4 loài cây thuốc đƣợc sử dụng trong y học cổ truyền với tác

dụng hạ huyết áp, và các tác dụng liên quan nhƣ giãn mạch. Các loài này bao gồm

cỏ mần trầu (Eleusine indica Gaertn.), hạ khô thảo (Prunella vulgaris L.), hòe

(Sophora japonica Linn.), tầm gửi (Taxillus philippensis Cham. & Schl. Ban.). Đây

là các cây thuốc đƣợc sử dụng lâu đời trong các bài thuốc y học cổ truyền, hiện nay

vẫn đƣợc sử dụng rộng rãi, đƣợc chúng tôi tham khảo trong tài liệu “cây thuốc và

động vật làm thuốc ở Việt Nam” do viện Dƣợc liệu biên soạn. Cây tầm gửi

(Taxillus philippensis Cham. & Schl. Ban.) là một cây đang đƣợc chú ý với một số

công bố mới hiện nay.

Các thí nghiệm liên kết đƣợc tiến hành với thể tích mẫu dịch chiết methanol

đƣa vào các phép thử dƣới 5% theo tổng thể tích phản ứng (trong thí nghiệm của

mình, chúng tôi thử với thể tích dịch chiết chiếm 1% thể tích phản ứng để hạn chế

ảnh hƣởng của dung môi chiết đến thí nghiệm. Dịch chiết của các mẫu đƣợc kiểm

tra với dải nồng độ từ 0,01 µg/ ml cho đến 1000 µg/ml.

Với các mẫu dịch chiết cỏ mần trầu (các mẫu PEI081101, PEI081102 và

PEI081101). Giá trị IC50 thu đƣợc lần lƣợt là 1,6 ± 0,3; 1,1 ± 0,5 và 0,7 ± 0,6. Kết

quả này cho thấy các mẫu dịch chiết cỏ mần trầu có tiềm lực ức chế phản ứng giữa

F-AT II với thụ thể angiotensin II cao. Dựa vào phƣơng trình Cheng-Prusoff, giá trị

Ki của các mẫu đƣợc tính toán là 1,2; 0,8 và 0,5 µg/ml.

Hình 3.9. Ức chế liên kết F-AT II với thụ thể angiotensin II bởi dịch chiết cỏ mần

trầu. Liên kết đặc hiệu và giá trị IC50 (trong ngoặc) đƣợc xác định với các mẫu

PEI081101 (a); PEI081102 (b); ▼ PEI081103 (c).

Với các mẫu dịch chiết hạ khô thảo (LPV081101, LPV081102, LPV081103),

giá trị IC50 thu đƣợc đạt giá trị xoay quanh 0,8 µg/ml (lần lƣợt với các mẫu là 1,1 ±

0,4; 0,8 ± 0,6 và 0,5 ± 0,3). Điều này cho thấy, các dịch chiết này có khả năng ức

chế cao phản ứng tƣơng tác giữa thụ thể angiotensin II với phối tử đặc hiệu của nó.

Giá trị Ki của các mẫu này trung bình là khoảng 0,8 µg/ml. Kết quả cho thấy, có thể

có những chất có tác dụng dƣợc lý tác dụng lên thụ thể angiotensin II trong các mẫu

dịch chiết từ cỏ mần trầu và hạ khô thảo. Đây là những cây cần đƣợc chú ý cùng

trong các nghiên cứu sâu hơn của đề tài này.

0 0,01 0,1 1 10 100 1000

Log [dịch chiết], µg/ml

Hình 3.10. Ức chế liên kết F-AT II với thụ thể angiotensin II bởi dịch chiết hạ khô

thảo. Liên kết đặc hiệu và giá trị IC50 (trong ngoặc) đƣợc xác định với các mẫu

LPV081101 (d); LPV081102 (e); ▼ LPV081103 (f).

Hình 3.11. Ức chế liên kết F-AT II với thụ thể angiotensin II bởi dịch chiết hòe.

Liên kết đặc hiệu và giá trị IC50 (trong ngoặc) đƣợc xác định với các mẫu

FSJ081101 (j); FSJ081102 (k); ▼ FSJ081103 (l).

Log [dịch chiết], µg/ml

Log [dịch chiết], µg/ml

Hình 3.12. Ức chế liên kết F-AT II với thụ thể angiotensin II bởi dịch chiết tầm gửi.

Liên kết đặc hiệu và giá trị IC50 (trong ngoặc) đƣợc xác định với các mẫu

LTP081101 (g); LTP081102 (h); ▼ LTP081103 (i).

Hình 3.11 và 3.12 biểu diễn đồ thị ức chế của các mẫu hòe và tầm gửi trong

với phản ứng thụ thể angiotensin II và F-AT II. Kết quả thu đƣợc từ các thí nghiệm

cho thấy: các mẫu dịch chiết từ nụ hòe có tiềm lực ức chế yếu hơn của cỏ mần trầu

và hạ khô thảo (hình 3.10). 3 mẫu thử của hòe cho IC50 có khả năng ức chế mạnh

nhất với mẫu FSJ081101 (IC50 = 13 ± 2 µg/ml) và yếu nhất là mẫu FSJ081102 (IC50

= 71 ± 45 µg/ml). Ki thu đƣợc của các mẫu hòe là từ 9,2 đến 93,5 µg/ml. Trong khi

đó các mẫu dịch chiết của tầm gửi thể hiện khả năng ức chế rất yếu với giá trị IC50

trên 100 µg/ml, lên tới gần 1000 µg/ml (với mẫu LTP081103).

Bảng 3.1. IC50 và Ki của các mẫu dịch chiết trong nghiên cứu

Dịch chiết Mẫu IC50 (g/mL) Ki (g/mL)

Eleusine indica – Cỏ mần trầu

PEI081101 1.6 ± 0.3 1.2

PEI081102 1.1 ± 0.5 0.8

PEI081103 0.7 ± 0.6 0.5

Prunella vulgaris – Hạ khô thảo LPV081101 1.1 ± 0.4 0.8

Log [dịch chiết], µg/ml

LPV081102 0.8 ± 0.6 0.6

LPV081103 0.5 ± 0.3 0.3

Sophora japonica – Hòe

FSJ081101 13 ± 2 9.2

FSJ081102 71 ± 45 52.7

FSJ081103 26 ± 9 19.2

Taxillus philippensis – Tầm gửi

LTP081101 126 ± 32 93.5

LTP081102 330 ± 80 243.9

LTP081103 800 ± 53 591.7

Chƣơng 4. KẾT LUẬN

Từ những kết quả nghiên cứu thu đƣợc, chúng tôi xin đƣa ra một số kết luận

sau:

1. Ngiên cứu này đã xây dựng thành công phƣơng pháp đánh giá tƣơng tác

giữa thụ thể angiotensin II thu đƣợc từ gan chuột với phối tử đặc hiệu

không đánh dấu phóng xạ (fluorescein-angiotensin II), dựa trên phƣơng

pháp ELISA. Nghiên cứu này cũng củng cố thêm việc sử dụng phối tử

đánh dấu fluorescein (F-AT II) cho kết quả thí nghiệm liên kết thụ thể

angiotensin II tƣơng đƣơng với phƣơng pháp sử dụng các phối tử đánh dấu

phóng xạ truyền thống.

2. Đã chiết xuất thành công dịch chiết methanol của 12 mẫu thực vật của 4

loài bao gồm: Cỏ mần trầu (Eleusine indica Gaerth.), Hạ khô thảo

(Prunella vulagaris L.), Hòe (Sophora japonica Linn.), và Tầm gửi

(Taxillus philippensis (Cham. & Sch.) Ban) từ các địa điểm khác nhau để

tiến hành các phép thử sinh học.

3. Các dịch chiết thực vật của các cây thuốc đƣợc sử dụng trong y học cổ

truyền với tác dụng hạ huyết áp, đƣợc thử nghiệm với phƣơng pháp này đã

cho kết quả với dịch chiết của các mẫu cỏ mần trầu và hạ khô thảo, thu

đƣợc giá trị IC50 xoay quanh 0,8 µg/ml và 1,1 µg/ml, giá trị Ki xác định

theo phƣơng trình Cheng-Prusoff tƣơng ứng là khoảng 0,6 µg/ml và 0,8

µg/ml. Nhƣ vậy, cỏ mần trầu và hạ khô thảo có khả năng ức chế khá cao

phản ứng giữa thụ thể angiotensin II và phối tử đặc hiệu fluorescein-

angiotensin II. Hòe cho kết quả IC50 thể hiện sự ức chế yếu hơn với tƣơng

tác thụ thể angiotensin II với phối tử đặc hiệu với giá trị Ki trung bình là 27

µg/ml và đối với tầm gửi, giá trị Ki trung bình của ba mẫu lên đến 309

µg/ml cho thấy các mẫu này có sự ức chế rất yếu đối với tƣơng tác phối tử

đặc hiệu với thụ thể angiotensin II.

KIẾN NGHỊ

1. Tiếp tục tiến hành các nghiên cứu với dịch chiết của các cây thuốc khác

đƣợc sử dụng trong y học cổ truyền với tác dụng hạ huyết áp với thụ thể

angiotensin II.

2. Nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học của dịch chiết cỏ mần trầu và

hạ khô thảo. Đồng thời tiến hành thu các phân đoạn hóa học của các dịch

chiết này và tiến hành các nghiên cứu để xác định phân đoạn chất nào có

tác dụng ức chế liên kết angiotensin II với phối tử đặc hiệu của nó.

3. Nghiên cứu phƣơng pháp xác định tƣơng tác thụ thể angiotensin II và phối

tử F-AT II, sử dụng phƣơng pháp đo huỳnh quang (fluorescein là gốc

huỳnh quang).

4. Tiến hành các nghiên cứu với các thụ thể GPCR khác với phƣơng pháp sử

dụng phối tử đặc hiệu có gắn fluorescein để thay thế cho phƣơng phác sử

dụng đồng vị phóng xạ truyền thống.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chƣơng, Nguyễn Thƣợng Dong

và các cộng sự (2003), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập I và II,

NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.

2. Nguyễn Xuân Thắng (2003), Hóa sinh dược lý phân tử, NXB Khoa học và kỹ

thuật, Hà Nội.

3. Tăng huyết áp và điều trị trong y học cổ truyền, giáo trình học viện Y dƣợc học

cổ truyền Việt Nam.

4. Phạm Nguyễn Vinh, Hồ Quang Trí, Hà Ngọc Bản, Phạn Nguyễn Khoa (2006),

Bệnh tăng huyết áp: cơ chế - dịch tễ - lâm sàng chẩn đoán và điều trị, Viện Tim

thành phố Hồ Chí Minh.

Tiếng Anh

5. Ayensu E.S., DeFilipps R.A. (1978), Endangered and Threatened Plants of the

United States. Washington, DC:Smithsonian Institution.

6. Beck-Sickinger, A.G. (1996), Structural characterization and binding sites of G-

protein-coupled receptors. Drug Discovery Today, 1:502–513.

7. Bergsma DJ, Ellis C, Kumar C, et al. (1992), Cloning and characterization of a

human angiotensin II type 1 receptor. Biochem Biophys Res Commun, 183:989-

995.

8. Berk BC, Corson MA. (1997), Angiotensin II signal transduction in vascular

smooth muscle: role of tyrosine kinases. Circ Res, 80:607-616.

9. Birnbaumer L, Abramowitz J, Brown AM. (1990), Receptor-effector coupling of

G proteins. Biochim Biophys Acta, 1031:163–224.

10. Bouscarel B., Blackmore P.F., Exton J.H. (1988), Characterization of the

angiotensin II receptor in primary cultures of rat hepatocytes. J Biol Chem,

263(29): 14913 – 14919.

11. Bradford M.M. (1976), Rapid and sensitive method for the quantitation of

microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding,

Anal. Biochem. 72: 248–254.

12. Carey RM, Wang ZQ, Siragy HM. (2000), Role of the angiotensin type 2

receptor in the regulation of blood pressure and renal function. Hypertension,

35:155-163.

13. Curnow KM, Pascoe L, White PC. (1992), Genetic analysis of the human type-1

angiotensin II receptor. Mol Endocrinol, 6:1113-1118.

14. Current Protocols in Molecular Biology.. John Wiley & Sons; 2003.

15. Cheng YC, Prusoff WH. (1973), Relationship between the inhibition constant

(Ki) and the concentration of inhibitor which causes 50 percent inhibition (IC50)

of an enzymatic reaction. J Biochem Pharmacol, 22: 3099 –3103.

16. de Jong L.A., Uges D.R., Franke J.P., Bischoff R., (2005), Receptor-ligand

binding assays: technologies and applications. J Chromatogr B Analyt Technol

Biomed Life Sci, 829: 1–25.

17. Ernst, E. (1999), Efficacy of Herbal Medicine: Do they Work and Are they

Safe?, Pharmaceutical News, Focus on Contemporary Medicine, Special Issue,

p. 17.

18. Fabricant D.S., Farnsworth N.R. (2011), The value of plants used in traditional

medicine for drug discovery. Environ Health Perspect, 109:69–75.

19. Farnsworth N.R., Akerele O., Bingel A.S., Soejarto D.D., Guo Z. (1985),

Medicinal plants in therapy. Bull WHO 63:965–981.

20. Fourth Country Report: Vietnam’s Implementation of the Biodiversity

Convention, ASEAN Biodiversity Magazine.

21. Gonzalez-Villalobos R, Klassen RB, Allen PL, Navar LG, Hammond TG.

((2005)), Megalin binds and internalizes angiotensin II. Am J Physiol Renal

Physiol, 288:F420-F427.

22. Guo D.F., Sun Y.L., Hamet P., Inagami T. (2001), The angiotensin II type 1

receptor and receptor-associated proteins. Cell Research, 11, 165–180.

23. Harmer, I.J. and Samuel, D. (1989), The FITC-anti-FITC system is a sensitive

alternative to biotin- streptavidin in ELISA. J. Immunol. Methods, 122. 115-122.

24. Hernandez-Presa M., Bustos C., Ortego M., et al.(1997), Angiotensin-converting

enzyme inhibition prevents arterial nuclear factor-kappa B activation, monocyte

chemoattractant protein-1 expression, and macrophage infiltration in a rabbit

model of early accelerated atherosclerosis. Circulation, 95:1532-1541.

25. Hoe K.L., Saavedra J.M. (2002), Site-directed mutagenesis of the gerbil and

human angiotensin II AT(1) receptors identifies amino acid residues attributable

to the binding affinity for the nonpeptidic antagonist losartan. Mol Pharmacol.,

Jun;61(6):1404-15.

26. Janssen MJ, Ensing K, de Zeeuw RA. (2001), A fluorescent receptor assay for

benzodiazepines using coumarin-labeled desethylflumazenil as ligand. Anal

Chem. Jul 1;73(13):3168-73.

27. Jourdain E., et al. (2011), The Pattern of Influenza Virus Attachment Varies

among Wild Bird Species. PLoS One 6:e24155.

28. Katzung B.G. (2007), Basis and clinical pharmacology, 10th

ed. McGraw Hill,

LANGE.

29. Lefkowitz R.J., Roth J., Pastan I. (1970), Radioreceptor Assay of

Adrenocorticotropic Hormone: New Approach to Assay of Polypeptide

Hormones in Plasma. Science 170: 633.

30. Li XC, Carretero OA, Navar LG, Zhuo JL. (2006), AT1 receptor-mediated

accumulation of extracellular angiotensin II in proximal tubule cells: role of

cytoskeleton microtubules and tyrosine phosphatases. Am J Physiol Renal

Physiol, 291:F375-F383.

31. Lloyd R.V. ( 2001), Morphology methods: cell and molecular biology

techniques. Humana Press.

32. Lundstrom K.H. and Chiu M.L. (2006), G Protein-Coupled Receptors in Drug

Discovery, CRC Press Taylor & Francis Group,.

33. Mahoney CW. (1999), High-throughput nonradioisotopic determination of

binding of platelet-derived growth factor to platelet-derived growth factor

receptor beta-extracellular domain using biotinylated ligand with enzyme-linked

immunosorbent assay. Anal Biochem., 276(1):106-8.

34. Nakajima M., Hutchinson H.G., Fujinaga M., et al. (1995), The angiotensin II

type 2 (AT2) receptor antagonizes the growth effects of the AT1 receptor: gain-

of-function study using gene transfer. Proc Natl Acad Sci USA, 92:10663-10667.

35. Noda K, Feng YH, Liu XP, et al. (1996), The active state of the AT1 angiotensin

receptor is generated by angiotensin II induction. Biochemistry, 35:16435-

16442.

36. Noga E.J., Udomkusonsri P.(2002), Fluorescein: A rapid, sensitive, nonlethal

method for detecting skin ulceration in fish. Vet Pathol 39:726–731.

37. Nguyen Dao Ngọc Van and Nguyen Tap (2008), An overview of the use of

plants and animals in traditional medicine systems in Vietnam:A Traffic

Southeast Asia report, Published by TRAFFIC.

38. Overington J.P., Al-Lazikani B., Hopkins A.L. (2006), How many drug targets

are there? Nature Rev. Drug Discov. 5: 993–996.

39. Pierce KL, Premont RT, Lefkowitz RJ. (2002), Seven-transmembrane receptors.

Nature Rev, 3:639–650.

40. Regard JB, Sato IT and Coughlin SR.. (2008), Anatomical profiling of G

protein-coupled receptor expression. Cell, Volume 135, Issue 3, 561-571.

41. Rong Y.P., et al. (2009), The BH4 domain of Bcl-2 inhibits ER calcium release

and apoptosis by binding the regulatory and coupling domain of the IP3

receptor. Proc Natl Acad Sci USA, 106:14397-402.

42. Ruiz-Ortega M, Lorenzo O, Ruperez M, et al. (2000), Angiotensin II activates

nuclear transcription factor kappaB through AT(1) and AT(2) in vascular

smooth muscle cells: molecular mechanisms. Circ, 86:1266-1272.

43. Solecki R., Shanidar I.V. (1975), A Neanderthal flower burial in northern Iraq.

Science 190:880–881.

44. Takeuchi T, Tanaka S, Rechnitz GA. (1992), Biotinylated 1012-S conjugate as a

probe ligand for benzodiazepine receptors: characterization of receptor binding

sites and receptor assay for benzodiazepine drugs. Anal Biochem., 203(1):158-

62.

45. Trevor A.J, Katzung B.G, Maters S.B. (2010), Pharmacology examination and

board review, 9th

ed. McGraw Hill, LANGE; 2010.

46. Vogle H.G. (2002), Drug discovery and evaluation: pharmacology assays. 2nd

ed. Springer.

47. Widdowson P.S., Renouard A., Vilaine J.P. (1993), Binding of [3H]angiotensin II

and [3H]DuP753 (losartan) to rat liver homogenates reveals multiple sites.

Relationship of AT1a and AT1b-type angiotensin receptors and novel

nonangiotensin binding sites. Peptides, 14(4): 829 – 837.

48. World Health Organization (2002), Traditional Medicine Strategy 2002–2005,

Geneva.

49. Zander E.D. (2011), The Science and Business of Drug Discovery. Springer.