11

ĐĐịịnh lưnh lượợng vng vàà đ đáánh ginh giáá đ độộ tinh tinh ssạạch cch củủa cha chếế phphẩẩm protein m protein

22

CCáác phương phc phương phááp xp xáác đc địịnh nh hhààm lưm lượợng proteinng protein

Protein sau khi đã đưProtein sau khi đã đượợc tc táách chich chiếết vt vàà llààm sm sạạch cch cóóththểể đ địịnh lưnh lượợng đưng đượợc. Nc. Nếếu protein nghiên cu protein nghiên cứứu lu lààenzyme thenzyme thìì viviệệc đc địịnh lưnh lượợng thông qua xng thông qua xáác đc địịnh nh hohoạạt đt độộ ccủủa enzyme a enzyme (theo (theo quy ưquy ướớc quc quốốc tc tếế: : 1 1 đơn vđơn vịị hohoạạt đt độộ enzyme lenzyme làà lưlượợng enzyme lng enzyme lààm chuym chuyểển hon hoáá 1 1 mol cơ chmol cơ chấất t trong 1 phtrong 1 phúút t ởở ccáác đic điềều kiu kiệện tiêu chun tiêu chuẩẩnn). ).

33

CCáác phương phc phương phááp xp xáác đc địịnh nh hhààm lưm lượợng proteinng protein

Như vNhư vậậy cy cứứ sau csau cáác bưc bướớc tc táách chich chiếết vt vàà llààm sm sạạch ch protein ngưprotein ngườời ta thi ta thấấy ty tổổng lưng lượợng protein ging protein giảảm m nhưng honhưng hoạạt đt độộ enzyme tăng ngh enzyme tăng nghĩĩa la làà hohoạạt đt độộ riêng riêng tăng rtăng rấất cao.t cao. Protein đưProtein đượợc coi lc coi làà ssạạch nch nếếu nhu nhữững bưng bướớc tc táách chich chiếết t vvàà llààm sm sạạch sau ch sau không lkhông lààm tăngm tăng hohoạạt đt độộ riêng criêng củủa a chchúúng nng nữữa, va, vàà chchỉỉ khi đ khi đóó ta mta mớới hoi hoààn thn thàành vinh việệc c ttáách chich chiếết vt vàà llààm sm sạạch protein ch protein

44

CCáác phương phc phương phááp xp xáác đc địịnh nh hhààm lưm lượợng proteinng protein

NNếếu protein không phu protein không phảải li làà enzyme thenzyme thìì ta cta cóó ththểể đ địịnh nh lưlượợng chng chúúng bng bằằng cng cáác phương phc phương phááp khp kháác. c. NNếếu protein ta nghiên cu protein ta nghiên cứứu lu làà hormon hohormon hoặặc cc cáác đc độộc tc tốốththìì chchúúng đưng đượợc xc xáác đc địịnh qua hinh qua hiệệu u ứứng sinh hng sinh họọc mc mààchchúúng gây ra; vng gây ra; víí ddụụ như hormon sinh trư như hormon sinh trưởởng (growth ng (growth hormone) shormone) sẽẽ kkíích thch thíích sch sựự sinh trư sinh trưởởng cng củủa ca cáác tc tếế bbàào o đđíích nuôi cch nuôi cấấy. y. NNếếu lu làà protein vprotein vậận chuyn chuyểển thn thìì ccóó ththểể xxáác đc địịnh chnh chúúng ng thông qua nthông qua nồồng đng độộ chchấất mt màà chchúúng vng vậận chuyn chuyểển n

55

ĐĐịịnh lưnh lượợng nitrogen theo ng nitrogen theo phương phphương phááp Kjeldahlp Kjeldahl

PhPhầần ln lớớn cn cáác phương phc phương phááp gip giáán tin tiếếp xp xáác đc địịnh protein nh protein đđềều du dựựa trên cơ sa trên cơ sởở xxáác đc địịnh lưnh lượợng nitrogen. ng nitrogen. LưLượợng nitrogen cng nitrogen cóó trong ctrong cáác protein lc protein làà ggầần gin giốống ng nhau không phnhau không phụụ thuthuộộc vc vàào cho chấất lưt lượợng vng vàà ngunguồồn n protein.protein. Đương nhiên trên cơ s Đương nhiên trên cơ sởở lư lượợng nitrogen cng nitrogen cóó ththểểxxáác đc địịnh chnh chỉỉ ccáác protein đã đưc protein đã đượợc tinh sc tinh sạạch hoch hoặặc lưc lượợng ng protein cprotein củủa ca cáác mc mẫẫu nghiên cu nghiên cứứu mu màà ngongoàài protein ra i protein ra không chkhông chứứa nha nhữững chng chấất cht chứứa nitrogen kha nitrogen kháác. c.

66

ĐĐịịnh lưnh lượợng nitrogen theo ng nitrogen theo phương phphương phááp Kjeldahlp Kjeldahl

Trong nông nghiTrong nông nghiệệp vp vàà công nghicông nghiệệp thp thựực phc phẩẩm, m, protein thô đưprotein thô đượợc đc địịnh lưnh lượợng bng bằằng cng cáách xch xáác c đđịịnh lưnh lượợng nitrogen tong nitrogen toààn phn phầần vn vàà kkếết qut quảả nhân nhân vvớới i 6,256,25, , nghnghĩĩa la làà coi protein luôn luôn chcoi protein luôn luôn chứứa a 16% nitrgen.16% nitrgen.

77

ĐĐịịnh lưnh lượợng nitrogen theo ng nitrogen theo phương phphương phááp Kjeldahlp Kjeldahl

ThThựực tc tếế, trong th, trong thựực phc phẩẩm, bên cm, bên cạạnh protein nh protein còn ccòn cóó nhnhữững chng chấất ht hữữu cơ khu cơ kháác cc cóó chchứứa a nitrogen như amidnitrogen như amid, alcaloid, ammonia (v, alcaloid, ammonia (víí ddụụ như trong thnhư trong thựực phc phẩẩm lên men)m lên men) acid nitric acid nitric... do... do đđóó hhààm lưm lượợng nitrogen tong nitrogen toààn phn phầần chn chíính thnh thứức c cao hơn cao hơn 16% (1616% (16--17%)17%) nhưng nhưng ởở protein thprotein thựực c vvậật tht thìì hhààm lưm lượợng nng nàày ly lạại thi thấấp hơn p hơn 16%. H16%. Hệệ ssốố6,25 l6,25 làà hhệệ ssốố trung btrung bìình thô. nh thô.

88

ĐĐịịnh lưnh lượợng nitrogen theo ng nitrogen theo phương phphương phááp Kjeldahlp Kjeldahl

Nguyên lý cNguyên lý củủa phương pha phương phááp np nàày ly làà vô cơ ho vô cơ hoáámmẫẫu bu bằằng Hng H22SOSO44 đ đậậm đm đặặc vc vàà chchấất xt xúúc tc táác. c. DDùùng mng mộột kit kiềềm mm mạạnh (NaOH honh (NaOH hoặặc KOH)c KOH) đ đẩẩy y NHNH33 ttừừ mumuốối (NHi (NH44))22SOSO44. S. Sau đau đóó hhứứng NHng NH33vvàào dung do dung dịịch acid cch acid cóó nnồồng đng độộ xxáác đc địịnh. Snh. Sau au đđóó ddùùng king kiềềm cm cóó nnồồng đng độộ xxáác đc địịnh đnh đểể chuchuẩẩn đn độộ acid dưacid dư. T. Từừ đ đóó ttíính đưnh đượợc lưc lượợng nitrogen cng nitrogen cóótrong nguyên litrong nguyên liệệu u

99

ĐĐịịnh lưnh lượợng protein theo ng protein theo phương phphương phááp Lowryp Lowry

Phương phPhương phááp np nàày dy dựựa trên cơ sa trên cơ sởở ddùùng mng mááy đo my đo mààu đu đểểxxáác đc địịnh mnh mààu su sảản phn phẩẩm khm khửử ccủủa phosphomolipden a phosphomolipden --phosphowolframate (phosphowolframate (thuthuốốc thc thửử Folin Folin -- CiocalteauCiocalteau) ) vvớới phi phứức hc hợợp đp đồồng ng -- protein. Phprotein. Phứức mc mààu xanh tu xanh tạạo tho thàành nh ccóó ththểể đo đo ởở bư bướớc sc sóóng 67ng 675nm. 5nm. CưCườờng đng độộ mmààu cu củủa ha hỗỗn n hhợợp php phảản n ứứng tng tỷỷ llệệ thuthuậận vn vớới ni nồồng đng độộ protein. Dprotein. Dựựa va vàào o đđồồ ththịị chuchuẩẩn protein (n protein (thông thưthông thườờng dng dùùng tinh thng tinh thểểalbumin huyalbumin huyếết thanh bò) ta ct thanh bò) ta cóó ththểể ttíính đưnh đượợc hc hààm lưm lượợng ng protein trong mprotein trong mẫẫu nghiên cu nghiên cứứu.u.

1010

ĐĐịịnh lưnh lượợng protein theo ng protein theo phương phphương phááp Lowryp Lowry

Phương phPhương phááp Lowry đưp Lowry đượợc dc dùùng rng rộộng rãi đng rãi đểể xxáác đc địịnh nhinh nhiềều lou loạại i protein khprotein kháác nhau.c nhau. Phương ph Phương phááp np nàày cy cóó đ độộ nhnhạạy cao, cho phy cao, cho phéép p phpháát hit hiệện đưn đượợc protein trong dung dc protein trong dung dịịch ch ởở nnồồng đng độộ 1 1 g/ml. g/ml. Tuy Tuy nhiên cưnhiên cườờng đng độộ mmààu còn tuu còn tuỳỳ thuthuộộc nhic nhiềều vu vàào loo loạại protein. i protein. VVíí ddụụ, , ởở ccùùng mng mộột nt nồồng đng độộ, dung d, dung dịịch trypsin cho cưch trypsin cho cườờng đng độộ mmààu u cao gcao gấấp 3 lp 3 lầần gelatin,n gelatin, hemoglobin cho cư hemoglobin cho cườờng đng độộ mmààu thu thấấp hơn p hơn trypsin nhưng cao hơn gelatintrypsin nhưng cao hơn gelatin..NgoNgoàài ra, nhii ra, nhiềều chu chấất kht kháác cc cóó ththểể llààm tăng hay gim tăng hay giảảm cưm cườờng đng độộ mmààu u phphảản n ứứng, vng, vìì vvậậy phương phy phương phááp np nàày cho ky cho kếết qut quảả chchíính xnh xáác khi xc khi xáác c đđịịnh protein đã đưnh protein đã đượợc tinh sc tinh sạạch.ch.

1111

ĐĐịịnh lưnh lượợng protein bng protein bằằng ng phương phphương phááp quang php quang phổổ

Phương phPhương phááp đơn gip đơn giảản nhn nhấất đt đểể đo n đo nồồng đng độộprotein trong dung dprotein trong dung dịịch lch làà đ độộ hhấấp thp thụụ tia ctia cựực tc tíím m ccủủa na nóó. . NNếếu protein tinh su protein tinh sạạch thch thìì nnồồng đng độộ tuytuyệệt đt đốối ci củủa a nnóó đư đượợc tc tíính theo ginh theo giáá trtrịị đo đư đo đượợc. c. NNếếu protein không tinh su protein không tinh sạạch (vch (víí ddụụ, d, dịịch chich chiếết tt từừmmộột st sắắc ký) thc ký) thìì nnồồng đng độộ ccủủa protein ta protein tổổng đưng đượợc c ttíính tương đnh tương đốối ti từừ đ độộ hhấấp thp thụụ

1212

ĐĐịịnh lưnh lượợng protein bng protein bằằng ng phương phphương phááp quang php quang phổổ

Nguyên tNguyên tắắc cc củủa phương pha phương phááp np nàày ly làà ccáác protein c protein hhấấp thp thụụ tia ctia cựực tc tíím cm cựực đc đạại i ởở bư bướớc sc sóóng ng 280nm do c280nm do cáác acid amin thơm như c acid amin thơm như tryptophan, tyrosine vtryptophan, tyrosine vàà phenylalanine phenylalanine. . ĐĐộộ hhấấp p ththụụ ởở 280 280nm thay đnm thay đổổi tui tuỳỳ loloạại protein nhưng hi protein nhưng hệệssốố ttắắt đo đưt đo đượợc (nghc (nghĩĩa la làà đ độộ hhấấp thp thụụ ccủủa dung da dung dịịch ch protein 1% vprotein 1% vớới đưi đườờng sng sóóng truyng truyềền qua 1cm) cho n qua 1cm) cho mmỗỗi protein cho phi protein cho phéép tp tíính nnh nồồng đng độộ ccủủa protein a protein tinh stinh sạạch. ch.

1313

ĐĐịịnh lưnh lượợng protein bng protein bằằng ng phương phphương phááp quang php quang phổổ

VVớới mi mộột ht hỗỗn hn hợợp cp cáác protein hoc protein hoặặc vc vớới bi bấất ct cứứ mmộột t loai protein nloai protein nàào mo màà không bikhông biếết ht hệệ ssốố ttắắt tht thìì nnồồng ng đđộộ protein đư protein đượợc tc tíính như saunh như sau::NNồồng đng độộ protein protein (mg/ml)=1,55xA280(mg/ml)=1,55xA280--0,77xA2600,77xA260Trong đTrong đóó: A: A280:280: đ độộ hhấấp thp thụụ ởở bư bướớc sc sóóng 28ng 280nm0nm

A260:A260: đ độộ hhấấp thp thụụ ởở bư bướớc sc sóóng 260nmng 260nm

1414

ĐĐịịnh lưnh lượợng protein bng protein bằằng ng phương phphương phááp quang php quang phổổ

Phương phPhương phááp np nàày y không dkhông dùùngng đư đượợc cho cc cho cáác dung dc dung dịịch ch ccóó nnồồng đng độộ protein thprotein thấấp hơn p hơn 0,1mg/ml0,1mg/ml hohoặặc khi cc khi cóó mmặặt t nhinhiềều chu chấất kht kháác mc màà hhấấp thp thụụ ccùùng mng mộột vt vùùng cng cựực tc tíím (vm (vííddụụ, , đđệệm, acid nucleic vm, acid nucleic vàà mmộột st sốố chchấất bt bééo), hoo), hoặặc khi c khi protein protein ởở trong dtrong dịịch truych truyềền phn phùù chchứứ không phkhông phảải trong i trong dung ddung dịịch. (Vch. (Víí ddụụ, trong m, trong mààng hong hoặặc cc cáác phc phứức hc hợợp cp cóótrtrọọng lưng lượợng phân tng phân tửử llớớn). Cn). Cũũng cng cầần chn chúú ý lý làà nnếếu tu tỷỷ llệệA280/A260 thA280/A260 thấấp hơn p hơn 0,60,6 nghnghĩĩa la làà dung ddung dịịch protein ch protein chưa schưa sạạch, bch, bịị llẫẫn cn cáác chc chấất kht kháác,c, đ đặặc bic biệệt vt vớới acid nucleic i acid nucleic ththìì nên snên sửử ddụụng phương phng phương phááp Lowry đp Lowry đểể đo n đo nồồng đng độộprotein.protein.

1515

ĐĐáánh ginh giáá ttíính đnh đồồng thng thểể ccủủa proteina proteinKhi đã nhKhi đã nhậận đưn đượợc mc mộột protein enzyme t protein enzyme ởở trtrạạng thng tháái ki kếết t tinh, ntinh, ngưgườời ta phi ta phảải thi thửử llạại mi mứức đc độộ tinh khitinh khiếết hay tt hay tíính nh đđồồng thng thểể ccủủa na nóó. . ĐĐộộ đ đồồng thng thểể ccủủa cha chếế phphẩẩm protein m protein enzyme phenzyme phảải đưi đượợc kic kiểểm tra bm tra bằằng mng mộột st sốố phương ph phương phááp p ddựựa trên nha trên nhữững nguyên lý khng nguyên lý kháác nhau. Trong mc nhau. Trong mộột st sốố trưtrườờng hng hợợp protein enzyme đưp protein enzyme đượợc coi lc coi làà đ đồồng thng thểể khi ly khi ly tâm, ntâm, nhưng lhưng lạại ci cóó ththểể phân chia thphân chia thàành mnh mộột st sốố isoenzyme isoenzyme bbằằng phương phng phương phááp đip điệện di trên gel. Chn di trên gel. Chíính vnh vìì vvậậy, ny, nếếu u ddùùng nhing nhiềều lou loạại phương phi phương phááp khp kháác nhau đc nhau đểể kikiểểm tra đm tra độộssạạch cch củủa protein ma protein màà kkếết qut quảả đ đềều cho lu cho làà đ đồồng thng thểể ththìì protein đprotein đóó ccóó ththểể đư đượợc công nhc công nhậận ln làà tinh khitinh khiếết. Nht. Nhữững ng phương phphương phááp đp đểể kikiểểm tra tm tra tíính đnh đồồng thng thểể hay dhay dùùng lng làà xây xây ddựựng đng đồồ ththịị vvềề đ độộ hohoàà tan tan, , điđiệện di vn di vàà siêu ly tâm.siêu ly tâm.