Nghiên cứu phương pháp định lượng vài Phtalat trong thực phẩm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

Nguyễn Thị Cúc

NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG MỘT SỐ PHTALAT

TRONG THỰC PHẨM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2013

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

Nguyễn Thị Cúc

NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG MỘT SỐ PHTALAT

TRONG THỰC PHẨM

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 60.44.29

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS TẠ THỊ THẢO

Hà Nội, năm 2013

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ........................................................................................................................................................... 1

TỔNG QUAN ................................................................................................................................................... 3

1.1Tên gọi, cấu trúc của một số phtalat ......................................................................................................... 3

1.1.1 Công thức và tên gọi các phtalat. .......................................................................................................... 3

1.1.2 Tính chất lý hóa của các este phtalat. ................................................................................................... 4

1.1.3 Ứng dụng của các este phtalat và nguồn gốc phát tán vào thực phẩm. ................................................ 5

1.1.4 Độc tính của các phtalat. ...................................................................................................................... 7

1.2 Mục tiêu nghiên cứu. ................................................................................................................................. 9

1.3 Các phƣơng pháp xác định phtalat. ......................................................................................................... 9

1.3.1 Các phương pháp HPLC xác định phtalat. ........................................................................................... 9

1.3.2 Các phương pháp khác xác định các phtalat. ..................................................................................... 12

1.3.3 Phương pháp chiết tách các phtalat ra khỏi nền mẫu thực phẩm. ...................................................... 14

THỰC NGHIỆM ........................................................................................................................................... 16

2.1 Đối tƣợng nghiên cứu. ............................................................................................................................. 16

2.2 Các loại phtalat thƣờng có trong thực phẩm. ........................................................................................ 16

2.3 Chất chuẩn, hóa chất, thiết bị. ................................................................................................................ 17

2.3.1 Chất chuẩn. ......................................................................................................................................... 17

2.3.2 Hóa chất sử dụng ................................................................................................................................ 17

2.3.3 Thiết bị, dụng cụ .................................................................................................................................. 18

2.4 Phƣơng pháp phân tích. .......................................................................................................................... 18

2.4.1 Phương pháp xử lý mẫu. ..................................................................................................................... 18

2.4.2 Phương pháp phân tích. ...................................................................................................................... 19

2.5 Nghiên cứu điều kiện tối ƣu và đánh giá phƣơng pháp phân tích. ...................................................... 20

2.5.1 Phương pháp nghiên cứu điều kiện tối ưu. .......................................................................................... 20

2.5.2 Đánh giá phương pháp phân tích. ....................................................................................................... 20

2.5.3 Phương pháp đối chiếu. ...................................................................................................................... 21

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................................................................................... 24

3.1 Tối ƣu hóa các điều kiện chạy sắc ký. .................................................................................................... 24

3.1.1 Van bơm mẫu. ..................................................................................................................................... 24

3.1.2 Cột tách. .............................................................................................................................................. 24

3.1.3 Detector. .............................................................................................................................................. 25

3.1.4 Bước sóng hấp thụ cực đại của các este phtalat. ................................................................................ 25

3.1.5 Khảo sát và chọn thành phần pha động phù hợp. ............................................................................... 26

3.1.6 Khảo sát độ lặp lại của thiết bị. .......................................................................................................... 40

3.1.7 Điều kiện tối ưu hóa cho quá trình tách các phtalat. .......................................................................... 42

3.2 Đƣờng chuẩn hỗn hợp xác định 08 phtalat. ........................................................................................... 42

3.2.1 Dựng đường chuẩn. ............................................................................................................................. 42

3.2.2 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng. ........................................................................................ 45

3.2.3 Kiểm tra sự khác nhau có nghĩa giữa hệ số a và giá trị 0. .................................................................. 47

3.2.4 Kiểm tra sự sai khác giữa b và b’........................................................................................................ 49

3.3 Đánh giá phƣơng pháp phân tích. .......................................................................................................... 50

3.3.1 Đánh giá độ lặp lại của phương pháp xử lý mẫu. ............................................................................... 50

3.3.2 Đánh giá hiệu suất thu hồi của phương pháp. .................................................................................... 51

3.4 Phân tích mẫu thực tế. ............................................................................................................................. 53

3.5 Đối chiếu kết quả phân tích.................................................................................................................... 53

3.5.1 Kết quả phân tích hàm lượng phtalat trên hệ GC-MS. ........................................................................ 53

3.5.2 So sánh hai kết quả thu được. ............................................................................................................. 54

3.5.3 Hàm lượng cho phép của các phtalat trong thực phẩm. ..................................................................... 55

KẾT LUẬN .................................................................................................................................................... 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................................................. 58

PHỤ LỤC ....................................................................................................................................................... 61

Phụ lục 1: Định tính các phtalat khi chạy hệ dung môi pha động MeOH-nƣớc. .......................................... 61

Phụ lục 2: Định tính các phtalat khi chạy hệ dung môi pha động ACN-Nƣớc ............................................. 62

Phụ lục 3: Các gradient khảo sát với pha động ACN-nƣớc. ......................................................................... 63

Phụ lục 4: Khảo sát tỷ lệ pha động với pha động ACN-trietylamin 0,04%, pH 2,8 ..................................... 64

Phụ lục 5: Các gradient tốc độ dòng đƣợc khảo sát với pha động ACN-trietylamin.................................... 65

Phụ lục 6: Khảo sát nồng độ trietylamin trong pha động. ............................................................................ 66

Phụ lục 7: Khảo sát ảnh hƣởng của pH pha động......................................................................................... 67

Phụ lục 8: Khảo sát độ lặp của hệ máy HPLC. ............................................................................................ 67

Phụ lục 9: Đƣờng chuẩn 08 phtalat. ............................................................................................................. 68

Phụ lục 10: Đánh giá hiệu suất thu hồi quá trình xử lý mẫu. ....................................................................... 70

Phụ lục 11: Độ lặp xử lý mẫu. ...................................................................................................................... 71

Phụ lục 12: Phân tích mẫu thực. ................................................................................................................... 72

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Tên gọi, cấu tạo, KLPT của một số phtalat điển hình ....................................................................... 3

Bảng 2.1: Thông tin về mẫu phân tích được chọn. .......................................................................................... 16

Bảng 3.1: Gradient định tính các phtalat với hệ MeOH-nước. ....................................................................... 27

Bảng 3.2: Thời gian lưu của các cấu tử: ......................................................................................................... 27

Bảng 3.3: Các gradient thử nghiệm với pha động MeOH-Nước ..................................................................... 28

Bảng 3.4: Chế độ chạy với pha động ACN- nước. .......................................................................................... 29

Bảng 3.5: Độ phân giải, thời gian lưu ứng với các gradient. .......................................................................... 29

Bảng 3.6: Thời gian lưu của các cấu tử ứng với hệ dung môi 3: ..................................................................... 31

Bảng 3.7: Kết quả phân tích của 2 tỷ lệ ACN: pha nước chứa trietylamin. .................................................... 31

Bảng 3.8: Các gradient tốc độ dòng. ............................................................................................................... 33

Bảng 3.9: Độ phân giải, thời gian lưu, hệ số đối xứng pic khi chạy gradient 6. ............................................. 35

Bảng 3.10: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ trietylamin 0,01%. ...................................................... 36



Bảng 3.13: Thời gian lưu, độ phân giải và hệ số đối xứng pic. ....................................................................... 39

Bảng 3.14: Độ lặp lại thời gian lưu của các phtalat. ...................................................................................... 40

Bảng 3.15: Độ lặp lại diện tích pic các phtalat. .............................................................................................. 41

Bảng 3.16: Các dung dịch dựng đường chuẩn. ............................................................................................... 43

Bảng 3.17: Diện tích pic trung bình thu được của các phtalat. ....................................................................... 43

Bảng 3.18: Đường chuẩn các phtalat. ............................................................................................................. 44

Bảng 3.19: Phương trình đường chuẩn các phtalat. ....................................................................................... 45

Bảng 3.20: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của các phtalat. ......................................................... 47

Bảng 3.21: Kết quả so sánh giữa giá trị a của phương trình đường chuẩn DCHP với giá trị 0. .................... 47

Bảng 3.22: Chuẩn F-tính của các phtalat........................................................................................................ 48

Bảng 3.23: Kết quả so sánh giữa b và b’ trong phương trình hồi quy của DCHP. ......................................... 49

Bảng 3.24: Độ lặp xử lý mẫu. .......................................................................................................................... 50

Bảng 3.25: Nồng độ các phtalat ở các mức thêm chuẩn. ................................................................................ 51

Bảng 3.26: Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi. .............................................................................................. 52

Bảng 3.27: Kết quả hiệu suất thu hồi. ............................................................................................................. 52

Bảng 3.28: Kết quả phân tích mẫu Bơ thực vật. .............................................................................................. 53

Bảng 3.29: Kết quả mẫu Bơ thực vật đối chiếu. .............................................................................................. 54

Bảng 3.30: Kết quả so sánh hàm lượng mẫu Bơ thực vật bằng chuẩn Student. .............................................. 55

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Tên viết tắt Tên đầy đủ

ACN Acetonitril

BBP Benzylbutyl phtalat

CPSC Consumer Product Safety Commissions: Ủy ban An toàn sản phẩm

tiêu dùng

CRM Certified Reference Materials: mẫu chuẩn đƣợc chứng nhận

DBP Dibutyl phtalat

DCHP Dicyclohexyl phtalat

DEHP Di(2-etylhexyl) phtalat

DGMP Dimetylglycol phtalat

DHP Dihexyl phtalat

DNOP Di-n-octyl phtalat

DPP Di-n-propyl phtalat

ECD Electron capture detector: detector bắt điện tử

FID Flame ionization detector: detector ion hóa ngọn lửa

GC-MS Gas chromatography – mass spectrometry: sắc ký khí khối phổ

HPLC High performance liquid chromatography: sắc ký lỏng hiệu năng

cao

KLPT Khối lƣợng phân tử

LOD Limit of Detection: Giới hạn phát hiện

LOQ Limit of Quantitation: Giới hạn định lƣợng

MeOH Metanol

PDA Photo-diode-array: mảng điot điện tử

ppm Part per million: phần triệu

PVC Polyvinyl clorua

RP-HPLC Reverse phase-HPLC: sắc ký lỏng pha đảo

UV-Vis Ultra-violet: tử ngoại và khả kiến

% RSD % Relative Standard Deviation:% độ lệch chuẩn tƣơng đối

THF Tetrahydro furan

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình Tên Trang

3.1 Phổ UV của các phtalat. 26

3.2 Sắc ký đồ thể hiện 3 gradient đã khảo sát. 30

3.3 Sắc đồ chạy đẳng dòng pha động ACN-nước 33

3.4 Sắc ký đồ 06 chương trình gradient đã khảo sát 35

3.5 Sắc đồ khảo sát nồng độ trietylamin trong pha nước. 38

3.6 Sắc đồ khảo sát pH pha động. 40

3.7 Sắc đồ khảo sát độ lặp lại của hệ máy. 42

Luận văn Thạc Sĩ Nguyễn Thị Cúc

Trang 1

MỞ ĐẦU

Cuộc sống ngày càng trở nên hiện đại hơn, mọi thứ đều đƣợc thiết kế sao cho

tiện dụng hơn, dễ sử dụng hơn, hiệu quả hơn và giá thành rẻ. Thực phẩm hầu hết

đƣợc đóng hộp, bảo quản trong những chất liệu nhƣ nhựa PVC hoặc hộp inox.

Những loại bao bì đó lại chƣa đƣợc quản lý chất lƣợng một cách chặt chẽ nên rất dễ

dẫn đến việc nhiễm một số chất ảnh hƣởng tới sức khỏe con ngƣời. Hơn nữa, tình

trạng sản xuất thực phẩm theo phƣơng thức công nghiệp công với việc các nhà sản

xuất không tuân thủ các tiêu chuẩn chất lƣợng đã có, nên nhiều chất phụ gia đƣợc

thêm vào. Chúng đƣợc thêm vào để tạo sự hấp dẫn hơn của thực phẩm đó hoặc để

thay thế một số chất trong tự nhiên vì hóa chất công nghiệp rẻ tiền và sẵn có hơn.

Vì vậy nếu không đƣợc quản lý một cách chặt chẽ, những thực phẩm mà chúng ta

sử dụng rất dễ nhiễm các chất độc hại vào thực phẩm và đi vào cơ thể con ngƣời…

Các chất đó không những ảnh hƣởng tới sức khỏe mà còn ảnh hƣởng lâu dài tới

cuộc sống.

Các phtalat hiện nay đƣợc sử dụng rất phổ biến trên hầu hết các lĩnh vực của

cuộc sống. Từ trong những sản phẩm hàng ngày làm bằng nhựa PVC nhƣ thau,

chậu, hộp đựng thức ăn, bàn ghế, chai lọ... Hầu hết các sản phẩm từ nhựa PVC đều

có các phtalat vì nhóm các chất này đƣợc thêm vào nhựa để làm tăng độ dẻo, đàn

hồi của nhựa, thậm chí nhóm này còn đƣợc gọi là “plasticizers” nghĩa là các chất

dẻo giống nhựa. Thành phần nhựa có thể chiếm từ 0,1-40% những chất này, thậm

chí có thể lên tới 60% hay 80%[25]. Hơn nữa, những chất này không tạo liên kết

trong mạng lƣới của nhựa mà chỉ đƣợc thêm vào nhựa nhƣ một chất phụ gia vì vậy

rất dễ thôi nhiễm ra ngoài môi trƣờng (nhất là môi trƣờng nhiều chất béo nhƣ dầu,

mỡ...). Chúng còn đƣợc sử dụng trong ngành công nghiệp xây dựng nhƣ trong một

số mặt hàng sơn tƣởng, sơn gỗ lát nền nhà... và thậm chí trong cả đồ chơi trẻ em và

sản phẩm chăm sóc cho trẻ[21]. Các phtalat còn đƣợc sử dụng trong mỹ phẩm nhƣ

các loại sơn móng tay, gel vuốt tóc, kem dƣỡng da, nƣớc hoa... Thêm chúng vào mỹ

phẩm sẽ làm cho sơn móng tay có độ bóng và bám bề mặt tốt hơn, trong gel vuốt


Trang 2

tóc và kem dƣỡng da làm cho bề mặt kem trông tƣơi mịn và hấp dẫn hơn, trong

nƣớc hoa chúng đƣợc dùng nhƣ chất định hƣơng để giữ cho mùi thơm nƣớc hoa lâu

phai hơn...[13]. Tất cả các phtalat ở trong các sản phẩm kể trên đều có khả năng

thôi nhiễm ra ngoài môi trƣờng không khí hay thức ăn một cách dễ dàng. Chúng có

thể hấp thụ qua da do tiếp xúc, qua đƣờng hô hấp do hít phải và qua đƣờng tiêu hóa

nhƣ ăn uống. Về lâu về dài chúng gây ra những tác hại to lớn đối với cơ thể con

ngƣời và môi trƣờng. Chúng gây ung thƣ ở chuột (chƣa có thử nghiệm nào trên cơ

thể ngƣời)[24], các phtalat này có thể làm xáo trộn nội tiết trong cơ thể con ngƣời, ở

bé gái có thể gây dậy thì sớm, ở bé trai thì làm teo tinh hoàn... Nếu bị tích lũy lâu

trong cơ thể, chúng sẽ lắng đọng lại ở phổi, gan và lá lách... và dần dần sẽ làm suy

giảm chức năng của các bộ phận đó[26].

Trong thực phẩm, nguyên nhân sự xuất hiện các phtalat có thể là do bị thôi

nhiễm từ bao bì sản phẩm bằng nhựa dẻo hoặc túi nilon nếu thực phẩm chứa trong

đó là các loại thực phẩm giàu chất béo. Hoặc một số loại đồ uống có cồn cũng có

thể nhiễm các phtalat do nguyên nhân này. Còn một nguyên nhân khác đáng chú ý

hơn vì mức nồng độ các phtalat này cao hơn hẳn mức nồng độ do bị thôi nhiễm. Đó

là do các nhà sản xuất sử dụng trực tiếp các phtalat, chủ yếu là DEHP, DINP để làm

chất tạo đục trong các sản phẩm chứa nƣớc, bởi vì phtalat rất kém tan trong môi

trƣờng này[7] hoặc trong các sản phẩm bơ, dầu ăn làm cho thực phẩm nhìn có vẻ tự

nhiên hơn[20]. Vì vây, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu phƣơng pháp định

lƣợng một số phtalat trong thực phẩm” để phần nào đánh giá đƣợc mức độ ô

nhiễm các phtalat trong thực phẩm.


Trang 3

Chương I:

TỔNG QUAN

1.1Tên gọi, cấu trúc của một số phtalat

1.1.1 Công thức và tên gọi các phtalat.

Công thức cấu tạo của các phtalat nhƣ sau:

Đây là công thức cấu tạo chung của các este o-phtalats hay còn đƣợc gọi là

đi-este của axit benzenedicarboxylic. R và R' là 2 gốc của 2 rƣợu đã tác dụng với

axit phtalic để thu đƣợc este phtalat. Hai nhóm này có thể giống nhau hoặc khác

nhau tùy thuộc rƣợu tham gia phản ứng. Cấu trúc khác nhau của 2 nhánh này sẽ tạo

ra những tính chất hóa học và vật lý rất riêng của phân tử và làm thay đổi hoạt tính

sinh học của chúng[22,25]. Bảng 1.1 chỉ ra một số phalat thông dụng, tên gọi vả cấu

tạo của một số phtalat thông dụng.

Bảng 1.1: Tên gọi, cấu tạo, KLPT của một số phtalat điển hình [6]

STT Tên gọi Kí

hiệu

CTCT M

(g/mol)

1 Dimethyl phtalat DMP C6H4(COOCH3)2 194

2 Diethyl phtalat DEP C6H4(COOC2H5)2 222

3 Diallyl phtalat DAP C6H4(COOCH2CH=CH2)2 246

4 Di-n-propyl phtalat DPP C6H4[COO(CH2)2CH3]2 250

5 Di-n-butyl phtalat DBP C6H4[COO(CH2)3CH3]2 278

6 Diisobutyl phtalat DIBP C6H4[COOCH2CH(CH3)2]2 278

7 Butyl cyclohexyl

phtalat BCP

CH3(CH2)3OOCC6H4COOC6H11 304

http://en.wikipedia.org/wiki/Dimethyl_phthalate

http://en.wikipedia.org/wiki/Diethyl_phthalate

http://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Diallyl_phthalate&action=edit&redlink=1

http://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Di-n-propyl_phthalate&action=edit&redlink=1

http://en.wikipedia.org/wiki/Dibutyl_phthalate

http://en.wikipedia.org/wiki/Diisobutyl_phthalate

http://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Butyl_cyclohexyl_phthalate&action=edit&redlink=1

http://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Butyl_cyclohexyl_phthalate&action=edit&redlink=1


Trang 4

8 Di-n-pentyl phtalat DNPP C6H4[COO(CH2)4CH3]2 306

9 Dicyclohexyl phtalat DCHP C6H4[COOC6H11]2 330

10 Butyl benzyl phtalat BBP

CH3(CH2)3OOCC6H4COOCH2C

6H5 312

11 Di-n-hexyl phtalat DNHP C6H4[COO(CH2)5CH3]2 334

12 Diisohexyl phtalat DIHxP C6H4[COO(CH2)3CH(CH3)2]2 334

13 Diisoheptyl phtalat DIHpP C6H4[COO(CH2)4CH(CH3)2]2 362

14 Butyl decyl phtalat BDP

CH3(CH2)3OOCC6H4COO(CH2)

9CH3 362

15 Di(2-ethylhexyl)

phtalat DEHP

C6H4[COOCH2CH(C2H5)(CH2)3

CH3]2 390

16 Di(n-octyl) phtalat DNOP C6H4[COO(CH2)7CH3]2 390

17 Diisooctyl phtalat DIOP C6H4[COO(CH2)5CH(CH3)2]2 390

18 n-Octyl n-decyl

phtalat ODP

CH3(CH2)7OOCC6H4COO(CH2)

9CH3 418

19 Diisononyl phtalat DINP C6H4[COO(CH2)6CH(CH3)2]2 418

20 Diisodecyl phtalat DIDP C6H4[COO(CH2)7CH(CH3)2]2 446

21 Diundecyl phtalat DUP C6H4[COO(CH2)10CH3]2 474

22 Diisoundecyl phtalat DIUP C6H4[COO(CH2)8CH(CH3)2]2 474

23 Ditridecyl phtalat DTDP C6H4[COO(CH2)12CH3]2 530

24 Diisotridecyl phtalat DIUP C6H4[COO(CH2)10CH(CH3)2]2 530

1.1.2 Tính chất lý hóa của các este phtalat.

- Nhóm các este phtalat là những chất lỏng dạng dầu, dễ bay hơi, có mùi nhẹ,

không tan trong nƣớc và cacbon tetraclorua, nhƣng lại tan tốt trong các dung môi

hữu cơ nhƣ metanol, acetonitril, hexan, các dung dịch dầu ăn, chất béo. Chúng có

thể tan đƣợc trong máu và những chất dịch cơ thể có chứa lipoprotein.

- Khi bị phân hủy bởi nhiệt các phtalat này cho khí mùi hơi chát

http://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Di-n-pentyl_phthalate&action=edit&redlink=1

http://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Dicyclohexyl_phthalate&action=edit&redlink=1

http://en.wikipedia.org/wiki/Butyl_benzyl_phthalate

http://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Di-n-hexyl_phthalate&action=edit&redlink=1

http://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Diisohexyl_phthalate&action=edit&redlink=1

http://en.wikipedia.org/wiki/Diisoheptyl_phthalate

http://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Butyl_decyl_phthalate&action=edit&redlink=1

http://en.wikipedia.org/wiki/Di(2-ethylhexyl)_phthalate

http://en.wikipedia.org/wiki/Di(2-ethylhexyl)_phthalate

http://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Di(n-octyl)_phthalate&action=edit&redlink=1

http://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Diisooctyl_phthalate&action=edit&redlink=1

http://en.wikipedia.org/w/index.php?title=N-Octyl_n-decyl_phthalate&action=edit&redlink=1

http://en.wikipedia.org/w/index.php?title=N-Octyl_n-decyl_phthalate&action=edit&redlink=1

http://en.wikipedia.org/wiki/Diisononyl_phthalate

http://en.wikipedia.org/wiki/Diisodecyl_phthalate

http://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Diundecyl_phthalate&action=edit&redlink=1

http://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Diisoundecyl_phthalate&action=edit&redlink=1

http://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Ditridecyl_phthalate&action=edit&redlink=1

http://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Diisotridecyl_phthalate&action=edit&redlink=1


Trang 5

- Phtalat không có tƣơng tác với những muối nitrat, kiềm, axit hay những

chất oxy hóa mạnh.

1.1.3 Ứng dụng của các este phtalat và nguồn gốc phát tán vào thực phẩm.

1.1.3.1.Ứng dụng của các este phtalat.

Phtalat là một nhóm các hợp chất hóa học đƣợc phát triển vào cuối thế kỷ

trƣớc. Chất hóa học dạng dầu này không tồn tại riêng rẽ trong một sản phẩm nào mà

đƣợc thêm vào các sản phẩm khác để tăng những hoạt tính khác nhau. Hơn 87% các

lƣợng phtalat đƣợc sử dụng nhƣ một loại nhựa (làm cho nhựa linh hoạt hơn, dẻo

hơn, đàn hồi tốt hơn). Phtalat đƣợc sử dụng trong nhựa PVC dẻo nhƣ các sản phẩm

tiêu dùng hàng ngày. Nó đƣợc tìm thấy ở rất nhiều vật dụng hàng ngày nhƣ đồ chơi

trẻ em, núm vú ngậm bằng cao su, vỏ đồ hộp, áo mƣa, vòi tắm, sàn nhà, sơn tƣờng,

thau, chậu rửa, hộp đựng thức ăn, ống nƣớc, và một số công thức thuốc trừ sâu...

Một số còn đƣợc dùng trong sản xuất các chất sơn tƣờng, sơn sàn nhà, sàn nhà

vinyl, dung môi, các loại nhựa sử dụng cho xây dựng... [12]. Ngoài ra do tính chất

không tan trong nƣớc nên chúng còn đƣợc sử dụng làm chất tạo đục trong các sản

phẩm nƣớc nhƣ thạch rau câu, sữa, nƣớc ngọt... đặc trƣng nhƣ DEHP và DINP đƣợc

sử dụng trong thực phẩm nhƣ dầu cọ công nghiệp[7]. Tuy nhiên, lƣợng phtalat có

trong thực phẩm còn có một lƣợng nhỏ là do bị thôi nhiễm từ vỏ bao bì bằng nhựa

PVC[22,24,25]. Trong ngành công nghiệp mỹ phẩm, phtalat còn có mặt trong một

số loại mỹ phẩm nhƣ sơn móng tay, keo vuốt tóc, dầu gội, kem dƣỡng da, thuốc

nhuộm tóc, son môi, phấn... Những chất này đƣợc thêm vào trong mỹ phẩm để tạo

độ tƣơi mới, tạo độ mịn và hấp dẫn cho loại mỹ phẩm đó, hơn nữa trong sơn móng

tay các phtalat còn làm cho màu sơn sáng bóng hơn và bền lâu hơn, bám dính hơn.

Chất DEP còn đƣợc dùng nhƣ một chất định hƣơng trong nƣớc hoa, giúp nƣớc hoa

giữ mùi thơm đƣợc lâu hơn và mùi không bị biến mùi trong các điều kiện thời tiết

khác nhau [17,18]. Trong ngành sản xuất các loại dụng cụ, thiết bị y tế, các phtalat

thƣờng có trong những túi nhựa đựng máu, dây truyền nƣớc và hóa chất, ống thông

tiểu, ống súc dạ dày... Chúng còn đƣợc sử dụng trong ngành dƣợc nhƣ DEP đƣợc

dùng nhƣ một chất trị bệnh ghẻ vì nó có tính diệt khuẩn (hiện tại bây giờ không còn


Trang 6

sử dụng chất này để điều trị nữa). Đặc biệt, DEP đƣợc dùng làm chất hóa dẻo trong

bao phim viên thuốc, nhƣng lớp phim bao này thƣờng rất mỏng cộng với việc sử

dụng hàng ngày chỉ một lƣợng nhỏ nên coi nhƣ lƣợng vào cơ thể không đáng

kể[19].

Theo ƣớc tính sản lƣợng hàng năm của các este của axit phtalic (PAE's) năm

1998 là khoảng năm triệu tấn. Gần nhƣ các este phtalat có mặt ở hầu hết mọi nơi

trong môi trƣờng sống, cơ thể con ngƣời bị nhiễm phtalat là một điều rất dễ xảy ra.

Nhƣng khi chúng đi vào cơ thể có những tác hại gì đối với con ngƣời là điều cần

xem xét.

1.1.3.2 Nguồn gốc phát tán các phtalat vào thực phẩm.

Phtalat trong thực phẩm chủ yếu là do bị nhiễm trong quá trình sản xuất và

do thôi nhiễm[14]. Nên một số phtalat hay đƣợc dùng trong nhựa phổ biến cũng sẽ

có mặt một lƣợng nhỏ trong các mẫu thực phẩm nhƣ DBP, BBP, DINP, DNOP,

DIDP...khi dùng vỏ hộp nhựa đựng đồ ăn nóng và nhiều dầu mỡ, hoặc cho quay

nóng trong lò vi sóng. Tsumura (2001) đã chỉ ra rằng sự tăng lên của nồng độ

DEHP trong thịt gà mức từ 80 µg/kg trƣớc khi nấu đến 13.100 µg/kg sau khi rán

trong chảo đƣợc tráng Teflon, và còn cao tới 16.900 µg/kg sau khi đóng gói. Làm

nóng thực ăn trong các vỏ bọc trực tiếp của đồ ăn nhanh tạo điều kiện rất lớn cho sự

thôi nhiễm các phtalat từ vật liệu bọc vào thức ăn. Trong khi kiểm tra các bữa ăn

đƣợc chuẩn bị tại 3 bệnh viện tại Nhật cũng cho thấy việc sử dụng gang tay cao su

cũng đóng góp 600 µg mỗi ngày. Hàng ngày, các bữa ăn ở bệnh viện đó chứa trung

bình khoảng 160 µg DEHP, 12,5 µg DEHA và 4,7µg DINP, 3,4µg BBP[14].

Trên thực tế các phtalat này có trong thực phẩm không chỉ do nguyên nhân

thôi nhiễm từ các vật chứa hoặc tiếp xúc mà đôi lúc còn có mặt trong thực phẩm do

đƣợc cố tình thêm vào. Những sản phẩm giàu chất béo nhƣ bơ, phomai,

mayonaise... đều đƣợc thêm một lƣợng nhỏ các phtalat vào để làm chúng trông tƣơi

ngon và mịn hơn. Theo tài liệu [7] các phtalat còn đƣợc dùng nhƣ chất tạo đục trong

một số loại thực phẩm. Nguyên nhân của hiện tƣợng này là do sự không trộn lẫn

nhau giữa các phtalat và các dạng thức ăn ít béo, chứa nƣớc. Chúng tạo thành dạng


Trang 7

nhũ tƣơng giữa hai hay nhiều pha trong một dạng thức ăn. Vì vậy các phtalat

thƣờng đƣợc thêm vào nƣớc hoa quả hoặc đồ uống có cồn để làm tăng độ đục và tạo

cảm giác tự nhiên hơn cho các loại thực phẩm đó. Trên thực tế mặc dù các phtalat bị

cấm sử dụng trong các trƣờng hợp nhƣ vậy, tuy nhiên theo Cục quản lý Thực phẩm

và Thuốc Đài Loan, vẫn có những cơ sở sản xuất sử dụng các phtalat để làm chất

tạo đục để giảm giá thành so với các sản phẩm tự nhiên nhƣ dầu cọ, gum arabic... và

tạo đƣợc độ ổn định trong sản phẩm. Chủ yếu phtalat đƣợc dùng là DEHP và DINP

[7]. Thƣờng thì các nhà sản xuất nếu có dùng các phtalat này trong thực phẩm thì

cũng khó có thể ghi nó lên thành phần của thực phẩm đó vì nhiều lý do, cho nên

trong nghiên cứu này chúng tôi đã nghiên cứu một phƣơng pháp để xác định các

phtalat trong thực phẩm, để xem xét mức hàm lƣợng của chúng có trong mỗi loại

thực phẩm khác nhau, giúp ngƣời tiêu dùng có những cái nhìn đúng đắn hơn về

những thực phẩm chứa những chất có hại đối với cơ thể.

1.1.4 Độc tính của các phtalat.

Có rất nhiều các loại đồ dùng có chứa các phtalat xung quanh chúng ta, hơn

nữa do các tính chất của chúng khiến chúng rất dễ bị nhiễm vào cơ thể con ngƣời.

Nhƣng với mỗi một nguồn nhiễm khác nhau thì lại khác nhau về lƣợng và về tác

động trực tiếp đến cơ thể con ngƣời. Vì vậy trƣớc khi xem xét độc tính của phtalat

đối với cơ thể con ngƣời nên nhìn lại cách mà chúng xâm nhập vào cơ thể chúng ta.

1.1.4.1 Con đường lây nhiễm phtalat.

Từ các tính chất và ứng dụng của các phtalat đã nêu ở trên chúng ta có thể

biết đƣợc các phtalat xâm nhập vào cơ thể con ngƣời theo những đƣờng nào. Gần

nhƣ đến 90% các phtalat đều đƣợc sử dụng trong quá trình sản xuất nhựa PVC,

nhƣng cấu tạo phân tử của chúng thì lại cho thấy chúng không hề tham gia vào

mạng lƣới của nhựa mà chỉ đóng vai trò là chất phụ gia, chất độn vào các sản phẩm

nhựa. Nên khi nhựa bị vỡ ra hoặc bị lão hóa, các phtalat này có thể đi ra khỏi nhựa

và ra ngoài không khí xung quanh. Khi đó chúng ta sẽ hít phải các chất này và bị

nhiễm vào cơ thể. Hơn nữa, các sản phẩm nhựa này khi đƣợc chứa các loại thức ăn

có nhiều dầu mỡ, chất béo… các phtalat này cũng bị thôi nhiễm ra ngoài thức ăn và


Trang 8

đi vào cơ thể qua đƣờng ăn uống. Chƣa tính đến các phtalat này còn đƣợc sử dụng

thay một số chất trong tự nhiên vì hóa chất công nghiệp sản xuất nhiều lại có chi phí

thấp hơn. Vì chúng không tan trong nƣớc nên chúng đƣợc sử dụng để làm chất tạo

đục trong các sản phẩm chứa nƣớc nhƣ thạch sữa chua, sữa, các loại nƣớc ngọt…

nên khi ăn uống những thực phẩm đó chúng ta đã bị nhiễm các chất phtalat. Các

phtalat cũng còn đƣợc dùng trong sản xuất các loại mỹ phẩm, chủ yếu là kem bôi

da, gel xịt tóc… nên khi sử dụng chúng sẽ đƣợc hấp thụ qua da và đi vào cơ thể.

Một phần nhỏ nữa các phtalat đi vào cơ thể con ngƣời còn do các sản phẩm sơn

tƣờng, sơn gỗ sàn nhà cũng có chứa những chất này và chúng bị thôi nhiễm ra ngoài

không khí. Nhìn chung, các chất này có ở xung quanh môi trƣờng sống của chúng ta

rất nhiều và khó có thể kiểm soát đƣợc.

1.1.4.2 Độc tính.

Chƣa có nhiều thử nghiệm về tác hại của các phtalat đối với cơ thể con

ngƣời. Tuy nhiên đối với những nghiên cứu trên động vật (cụ thể là chuột ở cả hai

giới tính) đã cho ta thấy những kết quả đáng sợ về độc tính của các phtalat này.

Theo nghiên cứu [27], tác giả V. Zitko đã nêu ra độc tính của các phtalat này trên

những con chuột đƣợc tiêm vào một lƣợng phtalat nhất định. Tất cả các phtalat

kiểm tra đều có những tác hại về hệ sinh sản và một điều đáng lƣu ý ở một số thai

nhi bị biến đổi ở hầu hết các động vật đƣợc tiêm. Đặc biệt DMP và dimethoxyletyl

phtalat đã có những tác động rất linh hoạt. Khối lƣợng phân tử các phtalat càng thấp

thì càng độc hơn so với những phtalat có gốc rƣợu từ C6-C9. Các phtalat khi đƣợc

tiêm vào tĩnh mạch chuột, cơ thể chuột tích tụ các phtalat lại trong phổi, gan và lá

lách với những lƣợng khác nhau các phtalat và dần dần làm mất chức năng của các

bộ phận đó. Phtalat còn gây xáo trộn nội tiết và các trung tâm hormonally hoạt động

bởi vì khả năng can thiệp vào hệ thống nội tiết trong cơ thể của các phtalat. Tiếp

xúc với phtalat lâu dài sẽ dẫn đến tỷ lệ mắc các bệnh bất thƣờng nhƣ hở hàm ếch,

các dị tật xƣơng tăng và tăng số thai chết trong các nghiên cứu trên động vật thí

nghiệm. Hệ thống nhạy cảm nhất của cơ thể khi tiếp xúc với các phtalat này là hệ

sinh sản chƣa phát triển hoàn toàn của nam giới, khi bị nhiễm các phtalat ở một


Trang 9

mức độ, cơ thể bị gia tăng tỷ lệ tinh hoàn không xuống, tinh hoàn giảm trọng lƣợng

hoặc giảm khoảng cách giữa hậu môn và cơ sở dƣơng vật...[26] Đối với nữ giới, khi

các phtalat tiếp xúc lâu dài với cơ thể sẽ gây ra xáo trộn nội tiết, gây tăng tiết

hormon nữ tính, làm cho trẻ nữ bị dậy thì sớm hơn và dễ gây ra hiện tƣợng dị

thƣờng thai trong quá trình mang thai nếu tiếp xúc quá nhiều với các phtalat.

1.2 Mục tiêu nghiên cứu.

Xây dựng đƣợc phƣơng pháp phân tích định lƣợng đồng thời các phtalat

trong một số mẫu thực phẩm bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng

cột tách pha ngƣợc (RP-HPLC), detector PDA và ứng dụng phân tích một số mẫu

đại diện.

1.3 Các phƣơng pháp xác định phtalat.

1.3.1 Các phương pháp HPLC xác định phtalat.

Các phtalat là những este của axit phtalic với hai hoặc một rƣợu nào đó, do

đó tính chất cũng nhƣ cấu tạo của chúng có tính tƣơng đồng cao. Phƣơng pháp phân

tích các hợp chất này phải đủ mạnh để không bị ảnh hƣởng lẫn nhau của các phtalat

khi xác định đồng thời. Và sắc ký đáp ứng tốt đƣợc điều đó. Vì là các este nên có

thể sử dụng cả sắc ký khí và sắc ký lỏng để phân tích. Tuy nhiên khi dùng sắc ký

khí phải đƣợc ghép nối với detector khối phổ mới cho hiệu quả cao, còn các

detector khác đều kém nhậy (nhƣ FID, ECD). Sắc ký lỏng thì có thuận lợi hơn là có

thể sử dụng detector UV cũng có thể định lƣợng cũng nhƣ định tính đƣợc các

phtalat. Tuy cũng có nhiều ƣu nhƣợc điểm khác nhau, khi dùng HPLC-UV thì khi

phân tích mẫu thực, kết quả phải đƣợc kiểm chứng lại bằng một phƣơng pháp mạnh

hơn nhƣ ghép nối với MS. Bởi vì dạng phổ hấp thụ của các phtalat rất giống với

nhiều chất khác có một vòng benzen, bƣớc sóng hấp thụ cũng không đặc trƣng nên

khả năng định tính thấp. Tuy nhiên trên một số đối tƣợng nhất định, nền mẫu kém

phức tạp hơn thì HPLC-UV lại ƣu việt hơn nhờ giá thành rẻ hơn và khá chính xác,

phƣơng pháp xử lý mẫu đơn giản.


Trang 10

Một số tác giả cũng đã sử dụng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao,

detector UV để xác định các phtalat trong nhiều đối tƣợng khác nhau. Tạp chí ứng

dụng của Knauer [15] cũng đã đƣa ra quy trình tách 08 phtalat là benzylbenzoat,

benzylbutyl phtalat, dibutyl phtalat, dihexyl phtalat, bis(2-etylhexyl) phtalat, din-

octyl phtalat, di-iso-nonyl phtalat, di-iso-decyl phtalat trên hệ HPLC pha đảo, cột

Eurospher II 100-3 C18 H, 250×3,0 mm ID. Hệ dung môi là ACN-Nƣớc với

gradient với hai kênh A gồm H2O/ACN là 15:85 (thể tích/thể tích), kênh B là ACN.

Gradient từ 0-3 phút từ 0% kênh B, từ 3,0-6,5 phút tăng từ 0% B đến 100% B, phút

thứ 6,5 đến 19,5 phút chạy 100% kênh B. Tốc độ dòng 0,6 ml/phút, nhiệt độ cột

300C, detector UV đặt ở bƣớc sóng 225 nm. Kết quả cho thứ tự của các chất ra khỏi

cột là BB-BBP-DBP-DHP-DEHP-DNOP-DINP-DIDP. Tổng thời gian chạy một

mẫu là 22 phút.

Nhóm các tác giả Ting Wu, Chao Wang, Xing Wang, Haiqing Xiao, Qiang

Ma, Qing Zhang [23] cũng đã tách 12 phtalat trên hai hệ UPLC và HPLC, để so

sánh hiệu quả tách của hai hệ máy trên. Các phtalat đƣợc tách: DMGP, DPP, DIBP,

DMP, DEP, DBP, BBP, DCHP, DEHP, DNOP, DAP, DHP. Dung môi sử dụng là

metanol, các dung dịch chuẩn các phtalat cũng đƣợc pha trong dung môi này,

detector sử dụng là PDA đặt ở bƣớc sóng 225 nm. Với hệ ultra-performance-liquid-

chromatography là một hệ có hiệu quả tách cao, cỡ hạt nhỏ, cột ngắn, áp suất cao,

đƣờng kính nhỏ. Cột sử dụng là cột phenyl 50 mm × 2,1 mm × 1,7 µm, nhiệt độ cột

450C, sử dụng hai dung môi kênh A là MeOH, kênh B là Nƣớc. Kênh A tăng trong

1,5 phút từ 50-78%, đƣợc giữ trong một phút, sau đó tăng đều lên 100% trong vòng

1 phút, giữ trong vòng 1 phút ở tỷ lệ 100% kênh A trƣớc khi đƣa về trạng thái ban

đầu và đƣợc giữ cân bằng ở điều kiện đó 2 phút. Tổng thời gian chạy một mẫu là

khoảng 7 phút, tốc độ pha động 0,4 ml/phút. Còn đối với hệ HPLC của Agilent

1100, ghép nối với hệ bơm, bộ phận tự động bơm mẫu và lò cột. Nhiệt độ cột đặt ở

250C, cột phenyl 250 mm × 4,6 mm × 5 µm. Pha động cũng gồm hai kênh MeOH

(kênh A) và nƣớc (kênh B). Chế độ gradient kênh A tăng trong 5 phút từ 70-85%,

sau đó tăng đều trong 4 phút tới 100%, giữ trong 4 phút trƣớc khi trở về điều kiện


Trang 11

đầu sau đó giữ cân bằng 4 phút. Tổng thời gian 18 phút một mẫu. Tốc độ dòng 1,0

ml/phút. Kết quả cho thấy đƣờng nền khi chạy trên thiết bị UPLC rất ổn định, thẳng

đều, không bị trôi hay bị dâng nền. Còn đối với thiết bị HPLC, nền bị dâng đều theo

lƣợng MeOH, tuy rằng hiệu quả tách đều tốt, độ phân giải giữa các pic đạt đƣợc tốt

nhƣng rõ ràng khi phân tích mẫu thực hệ UPLC sẽ cho kết quả phân tích chính xác

hơn, thời gian phân tích nhanh hơn.

Một phƣơng pháp sắc ký lỏng thân thiện với môi trƣờng cũng đã đƣợc sử

dụng để tách và định lƣợng các phtalat trong mẫu sơn móng tay. D. De Orsi và các

cộng sự [9] đã tách 07 phtalat: DMP, DEP, DIBP, BBP, DBP, DEHP trên hệ sắc ký

lỏng hiệu năng cao, detector UV đặt ở bƣớc sóng 254 nm. Cột Zorbax Eclipse XDB

C18 (Agilent) 150 mm × 4,6 mm × 3,5 µm. Chế độ gradient bắt đầu với tỷ lệ 50:50

% thể tích etanol/nƣớc, tăng dần đến 95% etanol trong 30 phút. Thành phần này

đƣợc giữ đến cuối cùng sau khi giữ cân bằng 10 phút, tốc độ dòng 1,0 ml/phút, van

bơm 10 µl, nhiệt độ cột 350C. Phƣơng pháp này đƣợc gọi là thân thiện với môi

trƣờng bởi vì nó sử dụng dung môi etanol trong quá trình tách, dung môi không độc

hại với con ngƣời cũng nhƣ với môi trƣờng nhƣ các dung môi thƣờng dùng khác

trong HPLC nhƣ: ACN hay MeOH... Các phtalat cũng đƣợc tách ra khỏi nhau, tổng

thời gian lƣu một mẫu chạy là 40 phút. Phtalat đƣợc chiết ra khỏi nền mẫu bằng hỗn

hợp 90/10 % thể tích Etanol/nƣớc. Phân tích mẫu thực có sử dụng chất nội chuẩn

DPP, nồng độ 50 ppm.

Thêm một nghiên cứu nữa về phƣơng pháp tách và định lƣợng các phtalat,

theo tài liệu [13], tác giả Hyun Jung Koo và cộng sự đã nghiên cứu và ứng dụng

phƣơng pháp HPLC-UV để xác định 04 phtalat (DEP, DBP, BBP, DEHP) trong các

mẫu mỹ phẩm. Sử dụng hệ máy HPLC của Hitachi (model L-700, Tokyo), bộ phận

bơm mẫu tự động, cột Supecol LC-18 5µm (250mm×4,6mm), nhiệt độ cột

200C±2

0C. Pha động tỷ lệ 88:12 (88% ACN và 12% dung dịch đệm trietylamine

0,08% pH 2,8 đƣợc điều chỉnh pH bằng axit photphoric 1mol/L). Tốc độ dòng 0,7

mL/phút, tổng thời gian chạy là 50 phút. Đƣờng chuẩn dựng từ 10-400ppm, sử dụng

chất nội chuẩn DnHP. Kết quả thu đƣợc, phát hiện 19/21 mẫu sơn móng tay và


Trang 12

11/42 mẫu nƣớc hoa chứa DBP, 24/42 mẫu nƣớc hoa chứa DEP với hàm lƣợng khá

cao. Trong nghiên cứu này còn chỉ ra mức con ngƣời nhiễm phải các phtalat khi sử

dụng mỹ phẩm hàng ngày. Ƣớc tính dựa trên lƣợng các phtalat phát hiện đƣợc trên

các đối tƣợng mẫu.

Ngoài sắc ký lỏng hiệu năng cao, detector UV còn có một số phƣơng pháp

khác để định lƣợng cũng nhƣ định tính các phtalat. Các phƣơng pháp này đƣợc trình

bày ở phần 1.2.2.

1.3.2 Các phương pháp khác xác định các phtalat.

Ngoài phƣơng pháp HPLC, một phƣơng pháp phổ biến để xác định các

phtalat là GC-MS. Có thể sử dụng sắc kí khí ghép nối với các detector khác để xác

định các phtalat nhƣ detector bắt điện tử (ECD), hay ion hóa ngọn lửa (FID).

Theo tiêu chuẩn CPSC-CH-C1001-09.3[21] của tổ chức CPSC Mỹ (United

States Consumer Product Safety Commissions), các phtalat đƣợc xác định trên đối

tƣợng là đồ chơi trẻ em, sử dụng hệ thiết bị GC-MS. Các phtalat đƣợc chiết ra khỏi

đối tƣợng bằng dung môi THF và n-hexan. Khoảng 50 mg mẫu đƣợc cân chính xác,

sau đó thêm 5ml THF, tiếp đó thêm 10ml n-hexan (tổng thể tích dung môi là 15

ml). Phần dung dịch lọc, lấy 0,1 ml sau đó thêm vào 80µl dung dịch chất nội chuẩn

benzyl benzoat 250µg/ml, sau đó cho đến thể tích 20ml bằng n-hexan. Đƣờng chuẩn

06 phtalat (DBP, BBP, DEHP, DNOP, DIDP, DINP) đƣợc dựng từ 0,5 – 10 µg/ml

với mẫu trắng là cyclohexan. Với điều kiện chạy GC-MS trên cột DB-5MS

30m×0,25mm ID×0,25µm, tốc độ dòng ban đầu 1ml/phút, dòng chảy liên tục, khí

mang He, van tiêm mẫu 1µl ở nhiệt độ 2900C, áp suất 35 psi, từ 2-5 phút giữ ở

500C, sau đó tăng 30

0C/phút tới 280

0C, sau đó tăng 15

0C/phút tới 310

0C, giữ trong

4 phút. Thu đƣợc thời gian lƣu của các chất BB (m/z=105), DBP (m/z=223) từ 5-

9,5 phút, BBP (m/z=206) và DEHP (m/z=279) từ 9,5-10,8 phút và của DNOP

(m/z=279), DINP (m/z=293) và DIDP (m/z=307) ra sau phút 10,8. Có phân tích

mẫu chuẩn CRM để xác nhận giá trị của phƣơng pháp.


Trang 13

Tác giả Hao-Yu-Shen và các cộng sự [12] đã sử dụng cả hai phƣơng pháp là

sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC, detector DAD và phƣơng pháp sắc ký khí khối

phổ để xác định đồng thời 07 phtalat và 04 paraben trong 15 loại mẫu mỹ phẩm

nhƣ: gel dƣỡng tóc, kem dƣỡng da, sữa dƣỡng thể... 07 phtalat (DEHP, DOP, DEP,

DPP, DBP, BBP) và 04 paraben (Metyl paraben, Etyl paraben, Propyl paraben và

butyl paraben) đƣợc xác định bằng HPLC-DAD và GC-MS sau khi đã đƣợc làm

sạch với cột chiết pha rắn C18, độ thu hồi 85-108%, RSD 4,2-8.8%. Điều kiện tối

ƣu khi sử dụng GC-MS: pic cơ bản (m/z=149) để định lƣợng các phtalat, còn m/z =

121 để định lƣợng các paraben. Thiết bị Agilent 6890N, bơm mẫu tự động ghép với

detector MS, cột HP-5MS 30m×0,25 ID×0,25µm, cột mao quản 5% diphenyl, 95%

dimetylpolysiloxane, khí mang He. Chạy với gradient nhiệt: 1000C giữ trong 0,5

phút tăng từ từ 50C mỗi phút cho đến 220

0C, tăng tiếp 10

0C một tới 275

0C, giữ 5

phút. Tốc độ khí mang ở 1,0 ml/min. Tiêm mẫu ở 2500C. Còn đối với hệ HPLC của

Agilent 1100 HPLC gồm bơm, bộ phận bơm mẫu tự động, bộ trộn, lò cột, tất cả

đƣợc ghép nối với detector DAD, cột C8 (150mm×4,6 mm×3µm), nhiệt độ cột giữ

ở 300C. Chế độ gradient: 0-13 phút giữ ở tỷ lệ 50:50 (MeOH:H2O), 15 phút tỷ lệ

tăng đến 70:30, phút thứ 22 là 85:15, phút thứ 30 tăng đến 100 % MeOH, tốc độ

dòng đặt 1,0ml/phút, bƣớc sóng đặt tại 230 nm. Khoảng tuyến tính của các chất

phân tích nằm từ 0,54-100mg/l. Mẫu thực đƣợc xử lí bằng cách cân chính xác

khoảng 1,0 gam mẫu mỹ phẩm cho vào ống thủy tinh, cho thêm 10 ml MeOH, rung

siêu âm 30 phút. Chuyển dung dịch trong sang một ống sạch, làm khô bằng hơi nitơ

ở nhiệt độ phòng. Dung dịch mẫu đƣợc đƣa qua cột chiết pha rắn C18 và đƣợc tối

ƣu hóa với các dung môi chiết khác nhau nhƣ diclometan, aceton, hexan, MeOH,

etyl acetat, các điều kiện khác nhƣ đồng nhất mẫu, lắc, rung ... đều đƣợc tối ƣu. Kết

quả đã phân tích đƣợc hàm lƣợng của 07 phtalat và 04 paraben có trong 15 mẫu mỹ

phẩm.

Ngoài GC ghép nối với detector MS ra thì ngƣời ta còn sử dụng các loại

detector khác nhau để phân tích các phtalat nhƣ FID, ECD. Tiến sĩ Sapna Johnson

và các cộng sự [20] đã nghiên cứu xác định 08 phtalat (DMP, DEP, DBP, BBP,


Trang 14

DEHP, DINP, DNOP, DiDP) trong đối tƣợng đồ chơi trẻ em sử dụng detector ECD.

Mẫu đƣợc cân với khối lƣợng 5g đƣợc chiết Soxhlet trong 100ml dung dịch

diclometan 16 giờ và ở 600C. 90ml dịch chiết đƣợc làm giàu ở 30

0C, và 1µl đƣợc

bơm vào cột tách. Tất cả các mẫu phân tích đều đƣợc làm lặp lại 3 lần. Cột đƣợc sử

dụng là DB-5MS 30 m x .25 mm ID x 0.25 µm, tốc độ ban đầu 1ml/phút, khí mang

He, van bơm 1µl ở nhiệt độ 2900C, áp suất 35 psi, 0,5 phút, 2-5 phút giữ ở 50

0C,

tăng 300C/phút tới 280

0C, sau tăng 15

0C/phút tới 310

0C giữ trong 4 phút. Tổng thời

gian 50 phút. Detector ECD, nhiệt độ bổ trợ 3000C, khí Nitơ 20ml/phút. Kết quả thu

đƣợc cho thấy 4 loại phtalat phổ biến là DEHP, BBP, DBP và DINP có mặt trong

tất cả 24 mẫu thí nghiệm với hàm lƣợng từ <0,1%-16,22%. Sau khi mẫu đƣợc xác

định bằng GC-ECD thì đƣợc kiểm tra để khẳng định lại bằng GC-MS.

Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC sử dụng các loại detector

mạnh hơn detector UV cũng đƣợc sử dụng để phân tích các phtalat. Theo nghiên

cứu của Bart Tienpont [5], các mẫu môi trƣờng nhƣ đất, trầm tích..., các mẫu thực

phẩm và mẫu nền sinh học cũng đã đƣợc đem ra phân tích hàm lƣợng các phtalat

trên hệ máy HPLC-MS với các chế độ ion hóa khác nhau. Các phtalat đƣợc phân

tích chủ yếu là dạng mono-este của axit phtalic nhƣ mono-2-etylhexyl phtalat..., cơ

chế phân mảnh ESI hoặc APCI. Hệ thiết bị Agilent 1100 LC, kết hợp với cột 25cm

× 4,6 mm ID × 5 µm, hệ dung môi gồm 2 kênh. Kênh A 0,5% đệm amoni axetat

trong nƣớc, kênh B là metanol, chạy đẳng dòng tỷ lệ 50%/50% B về thể tích, tốc độ

dòng 0,5 ml/phút, van bơm mẫu 50 µL. Thế phân cực 70 V, nhiệt độ 3250C, tốc độ

khí 5L/phút khí N2, các mảnh ion M+1 = 277 (DEHP), 281 (MEHP), 291 (MiNP),

305 (MiDP). Mẫu đƣợc chiết các phtalat ra khỏi nền bằng chiết Lỏng – Lỏng và làm

giàu bằng chiết pha rắn.

1.3.3 Phương pháp chiết tách các phtalat ra khỏi nền mẫu thực phẩm.

Trƣớc khi mẫu đƣợc đƣa vào hệ HPLC để phân tích cho ra hàm lƣợng

phtalat có trong mẫu thì nó phải đƣợc đồng nhất, chuyển từ các trạng thái khác nhau

về dạng lỏng, các phtalat đƣợc tan trong dung môi acetonitril hoặc metanol. Khi đƣa

vào đầu cột tách có khả năng hấp thu và rửa giải qua cột.


Trang 15

Theo tài liệu [22], mẫu phải đƣợc đồng nhất trƣớc khi đem xử lý hoặc chiết.

Với mẫu lỏng có thể dùng biện pháp lắc, trộn lẫn, hay khuấy. Đối với mẫu rắn

thƣờng sử dụng máy trộn để làm đều hoặc có thể cho thêm dung môi hữu cơ phân

cực hoặc nƣớc cất để làm đều. Các phtalat đƣợc chiết ra từ mẫu không chất béo

dạng lỏng với dung môi hữu cơ không phân cực và có thể đo mà không cần bất kỳ

sự làm sạch nào. Áp dụng với trƣờng hợp đối với nƣớc, các loại nƣớc giải khát và

đồ uống có cồn. Hầu hết các phòng thí nghiệm đều sử dụng chiết Lỏng-Lỏng để

phân tách các phtalat ra khỏi nền mẫu. Dung môi có thể dùng clorofom, n-hexan, n-

heptan, hoặc isooctan. Cũng có thể sử dụng chiết pha rắn để tách lấy các phtalat

phân tích. Đối với các loại thực phẩm không béo dạng rắn thƣờng đƣợc chiết với

ACN hoặc hỗn hợp ACN-Nƣớc. Trƣờng hợp thực phẩm giàu chất béo dạng rắn thì

các phtalat đƣợc chiết ra khỏi nền cùng với chất béo có thể sử dụng diclometan, hỗn

hợp diclometan với cyclohexan, n-hexan, và hỗn hợp n-hexan với aceton, hoặc có

thể dùng ACN để tăng độ chọn lọc của các phtalat từ thực phẩm, dựa trên khả năng

tan kém của các chất béo vào trong ACN. Kỹ thuật chiết phổ biến nhất chỉ bằng

cách lắc mẫu với hỗn hợp chiết. Tuy nhiên dùng biện pháp rung siêu âm và lò vi

sóng là 2 biện pháp đã cho hiệu quả tốt nhất.

Dựa trên điều kiện phòng thí nghiệm và các tài liệu tham khảo đã có, chúng

tôi đã lựa chọn phƣơng pháp sắc kỷ lỏng hiệu năng cao pha đảo của Shimadzu,

ghép nối với detector PDA, cột Cadenza CD-C18 250mm × 4,6mm × 3µm, hệ điều

khiển SCL 10A, lò cột CTO-10AS, bộ trộn dung môi, bơm cao áp LC-10Advp, đèn

SPD-M10A (đèn D2 và W). Vòng nạp mẫu 50µl. Các điều kiện chạy máy và xử lý

mẫu đều đƣợc khảo sát và tối ƣu hóa trƣớc khi phân tích mẫu.


Trang 16

CHƢƠNG II:

THỰC NGHIỆM

2.1 Đối tƣợng nghiên cứu.

Thực phẩm chứa phtalat có thể do hai nguyên nhân, do thôi nhiễm từ vỏ bao

bì đƣợc làm bằng các loại nhựa hoặc do chúng đƣợc thêm vào trong quá trình sản

xuất. Khả năng các phtalat bị thôi nhiễm từ bao bì thƣờng cho lƣợng phtalat nhỏ, và

có thể phát hiện các phtalat khác ngoài DEHP và DINP, trong khi đó lƣợng phtalat

có mặt trong thực phẩm do sự thêm vào thì thƣờng có 2 phtalat trên với lƣợng khá

lớn (cỡ vài %). Thôi nhiễm phtalat từ bao bì thực phẩm có thể nhiều hoặc ít tùy

thuộc loại thức ăn đƣợc chứa hoặc cách bảo quản, chế biến thức ăn trong bao bì đó.

Vì vậy trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn một số mẫu phân tích chứa nhiều

chất béo, bảo quản trong hộp nhựa hoặc bọc bằng giấy bạc. Mẫu đại diện là Bơ

Tƣờng An của Công ty Cổ phần Dầu Thực Vật Tƣờng An, đƣợc đựng trong hộp

nhựa, khối lƣợng tịnh cỡ 80g và mẫu Phomai Con Bò Cƣời, đƣợc bọc trong giấy

bạc, hộp 8 miếng của Công ty TNHH Bel Việt Nam. Mẫu đƣợc xử lý và dùng để

định tính, định lƣợng 08 phtalat đã khảo sát.

2.2 Các loại phtalat thƣờng có trong thực phẩm.

Phtalat đƣợc dùng phổ biến nhất trong tất cả các lĩnh vực là DEHP. Trong

thực phẩm nó đƣợc sử dụng thay thế cho dầu cọ vì hóa chất công nghiệp rẻ tiền hơn

dầu cọ tự nhiên... Hơn nữa vì nó chiếm thành phần khá lớn trong một số loại nhựa

dẻo nên khả năng nó bị thôi nhiễm vào thực phẩm cũng lớn hơn các phtalat khác.

Dựa trên đặc tính của các phtalat và sự nhiễm của các phtalat vào các loại

thực phẩm nên chúng tôi lựa chọn 2 loại mẫu thực, đó là dạng thực phẩm chứa

nhiều chất béo nhƣ mẫu bơ và mẫu Phomai Con bò cƣời. Thông tin về các loại mẫu

đƣợc chọn đƣa trong bảng 1.2.

Bảng 2.1: Thông tin về mẫu phân tích được chọn.

STT Loại mẫu Nhà sản xuất Thông tin

1 Mẫu bơ thực vật (hộp Công ty Cổ phần Dầu Thực vật NSX:16/11/12


Trang 17

80g) Tƣờng An. HSD:16/5/13

2 Mẫu phomai Con bò

cƣời (hộp 250g)

Công ty TNHH Bel Việt Nam NSX: 17/9/12

HSD: 17/5/13

2.3 Chất chuẩn, hóa chất, thiết bị.

2.3.1 Chất chuẩn.

Các chất chuẩn phtalat đƣợc mua của hãng Dr.Ehrenstorfer dạng lỏng, với độ

tinh khiết >99%. Các dung dịch chuẩn gốc đƣợc cân khối lƣợng và pha với các

nồng độ trong bảng 2.2.

Bảng 2.2: Nồng độ các dung dịch chuẩn este phtalat.

STT Tên viết tắt Khối lƣợng cân (g) Nồng độ (ppm) Cách pha

Ph1 DMGP 0,0080 8000

Định mức đến

1ml bằng

Metanol

Ph2 DPP 0,0120 12000

Ph3 DHP 0,0040 4000

Ph4 DCHP 0,0040 4000

Ph5 DNOP 0,0185 18500

Ph6 DEHP 0,0115 11500

Ph7 DBP 0,0115 11500

Ph8 BBP 0,0084 8400

Các dung dịch chuẩn gốc đƣợc bảo quản trong tủ lạnh, nhiệt độ dƣới 40C.

Các dung dịch chuẩn làm việc đƣợc pha từ dung dịch gốc hàng ngày, tùy theo mức

nồng độ sử dụng.

2.3.2 Hóa chất sử dụng

Các dung môi cho sắc ký lỏng hiệu năng cao: MeOH, ACN (Merck – Đức)

N-hexan

Trietylamin Merck – Đức.


Trang 18

Axit photphoric Merck – Đức

Nƣớc cất đƣợc sử dụng là nƣớc cất 2 lần đã đƣợc deion hóa.

2.3.3 Thiết bị, dụng cụ

Thiết bị:

- Hệ thống HPLC Shimadzu 10Avp với detector PDA Shimadzu SPD –

M10Avp.

- Cột pha đảo Cadenza CD-C18 250mm × 4,6mm × 3µm.

- Cân phân tích Scientech SA 210, độ chính xác 0,0001 g.

- Máy ly tâm, tốc độ 4000 vòng/phút.

- Máy đo pH Metrohm 961 với điện cực thủy tinh và điện cực calomen bão

hòa và các dung dịch pH chuẩn để hiệu chỉnh điểm chuẩn của máy đo pH

(Merck)

- Máy lắc.

- Máy rung siêu âm, có gia nhiệt.

Dụng cụ:

- Ống ly tâm 10 ml.

- Bình định mức: 5,10, 25, 50 mL, cùng hãng.

- Pipetman các loại từ 0 – 1000µL.

- Bình nón 100ml, cốc 100, 50, 25 mL, cốc cân...

Tất cả các dụng cụ thủy tinh đều phải đƣợc rửa sạch, tráng bằng nƣớc cất,

sau đó tráng bằng metanol và để khô, tráng n-hexan 3 lần sau đó sấy ở 1050C trong

vòng 1 giờ, lấy ra để nguội trƣớc khi sử dụng.

2.4 Phƣơng pháp phân tích.

2.4.1 Phương pháp xử lý mẫu.

Theo tính chất đã biết của các phtalat, chúng tan tốt hơn trong các dung môi

hữu cơ nhƣ n-hexan, acetonitril, metanol... Mẫu thực đƣợc chọn là mẫu có nhiều


Trang 19

lƣợng chất béo nhƣ mẫu bơ thực vật và mẫu phô mai Con bò cƣời. Do tính chất của

dung môi acetonitril hòa tan chọn lọc các phtalat trong môi trƣờng chất béo, vì vậy

chúng tôi đã sử dụng dung môi acetonitril để xử lý mẫu[7].

Với 2 dạng mẫu rắn này chúng tôi đƣa ra phƣơng pháp xử lý mẫu:

Mẫu đƣợc cân khối lƣợng khoảng 0,2 g chính xác tới 0,0001g trên cân phân

tích, chuyển mẫu vào ống thủy tinh 10ml. Thêm 5 ml dung môi acetonitril, lắc trên

máy lắc 30 phút, sau đó rung siêu âm 30 phút ở nhiệt độ 400C để giúp cho chất béo

trong đó bị chảy ra, các phtalat tan dễ dàng hơn. Cuối cùng quay ly tâm 30 phút để

lắng cạn và thu dịch trong sang 1 ống khác. Dung dịch này sau khi lọc qua màng lọc

0,45µm đƣợc bơm vào cột để định lƣợng các phtalat có trong mẫu. Mẫu thêm chuẩn

cũng đƣợc thực hiện với một quá trình trên để xác định hiệu suất thu hồi của quá

trình xử lý mẫu.

2.4.2 Phương pháp phân tích.

Phép phân tích các phtalat đƣợc thực hiện trên hệ sắc ký lỏng hiệu năng cao

HPLC của Shimadzu, kết nối với hệ bơm gồm 4 kênh, bộ điều khiển, lò cột, bộ trộn

dung môi và detector photo-diode-array (PDA) đặt ở bƣớc sóng 225 nm. Các điều

kiện chạy máy đƣợc tóm tắt nhƣ sau:

- Nhiệt độ cột 250C

- Van bơm mẫu 50 µL

- Hệ dung môi gồm 2 kênh. Kênh A: pha nƣớc chứa 0,04% trietylamin đƣợc

chỉnh pH tới 2,8 bằng dung dịch axit photphoric. Kênh B là ACN.

- Chế độ gradient tốc độ dòng: thời điểm ban đầu tốc độ là 0,8 ml/phút, giữ ở

tốc độ này trong vòng 12,5 phút sau đó tăng dần lên 1,0 ml/phút ở phút thứ

14. Giữ 2 phút, sau đó tăng lên 1,2 ml/phút trong vòng 2,5 phút. Giữ tốc độ

này đến khi các chất đƣợc rửa giải hết ra khỏi cột. Tổng thời gian chạy là 25

phút. Tỷ lệ giữa 2 kênh A:B là 5:95 (% về thể tích) đƣợc giữ suốt quá trình

chạy mẫu.


Trang 20

2.5 Nghiên cứu điều kiện tối ƣu và đánh giá phƣơng pháp phân tích.

2.5.1 Phương pháp nghiên cứu điều kiện tối ưu.

Các điều kiện tối ƣu trên hệ máy sử dụng cũng nhƣ quá trình xử lý mẫu đã

đƣợc khảo sát.

Thứ nhất là khảo sát để chọn hệ dung môi pha động. Chúng tôi đã khảo sát 3

hệ dung môi MeOH-Nƣớc, ACN-nƣớc và ACN-pha nƣớc chứa trietylamin 0,04%,

pH 2,8 chỉnh pH bằng axit photphoric 1 mol/L.

Sau khi chọn đƣợc hệ dung môi phù hợp chúng tôi đi khảo sát thành phần

của pha động. Tỷ lệ giữa 2 pha ACN và pha nƣớc cũng đƣợc khảo sát ở 2 tỷ lệ 88%

ACN : 12 % pha nƣớc và 95% ACN:5% pha nƣớc (% về thể tích).

Khảo sát thành phần % của trietylamin trong pha nƣớc. Nồng độ của

trietylamin cũng đƣợc khảo sát ở 3 mức: 0,01%; 0,04%; và 0,08%.

Giá trị pH pha động cũng đƣợc khảo sát, ở 3 giá trị pH: 3,31; 2,82 và 2,20.

Chế độ chạy đẳng dòng và gradient đã đƣợc khảo sát. Chế độ đẳng dòng

khảo sát ở 2 tỷ lệ pha động 88:12 (% thể tích của ACN : pha nƣớc) và 95:5 (% thể

tích của ACN:pha nƣớc). 6 chƣơng trình gradient cũng đƣợc khảo sát để chọn đƣợc

một chế độ chạy phù hợp nhất, hiệu quả tách tốt nhất. Với tốc độ dòng thay đổi theo

thời gian từ 0,6 ml/phút tới 1,2 ml/phút từ thời điểm ban đầu đến khi kết thúc quá

trình chạy khoảng 60 phút.

2.5.2 Đánh giá phương pháp phân tích.

Phƣơng pháp phân tích thể hiện tính đúng đắn trƣớc tiên phải thể hiện độ lặp

lại. Trong nghiên cứu chúng tôi đã khảo sát độ lặp lại của hệ thiết bị HPLC sau khi

chọn các điều kiện tối ƣu. Đánh giá độ lặp của hệ thiết bị dựa trên độ lặp diện tích

và thời gian lƣu của các cấu tử trong dung dịch khảo sát. Một mẫu có nồng độ xác

định nằm trong giới hạn tuyến tính của đƣờng chuẩn các phtalat đã chọn. Mẫu đƣợc

bơm vào hệ 3 lần sau đó lấy diện tích pic và thời gian lƣu trung bình của các lần và

tính đƣợc giá trị % RSD. Giá trị này đánh giá độ lặp cần khảo sát.

Sau khi có đầy đủ các điều kiện tối ƣu, tiến hành dựng đƣờng chuẩn 08

phtalat đã khảo sát và thu đƣợc 08 phƣơng trình đƣờng chuẩn. Đánh giá sai số hệ


Trang 21

thống qua các hệ số trong phƣơng trình hồi quy sử dụng các chuẩn Student và

Fisher để đánh giá và kết luận. Thu đƣợc một phƣơng trình đƣờng chuẩn mới, sau

đó mới tiến hành phân tích mẫu thực tế.

Khi phân tích mẫu thực thì độ lặp lại quá trình xử lý mẫu cũng đƣợc khảo sát

và đánh giá. Cùng một mẫu đƣợc cân khối lƣợng gần giống nhau, xử lý cùng một

điều kiện. Mỗi mẫu sau xử lý đƣợc bơm 3 lần để thu đƣợc hàm lƣợng trung bình.

Các giá trị trung bình đó đƣợc sử dụng để đánh giá độ lặp của phƣơng pháp xử lý

mẫu. Giá trị % RSD cũng đƣợc dùng làm giá trị đánh giá độ lặp của phƣơng pháp

xử lý mẫu.

Mẫu thêm chuẩn cũng đƣợc thực hiện để đánh giá độ thu hồi của phƣơng

pháp xử lý mẫu. Mẫu thực đƣợc thêm một lƣợng nhất định các phtalat chuẩn vào ở

3 mức nồng độ sao cho tổng hàm lƣợng các phtalat sau khi xử lý không bị vƣợt quá

đƣờng chuẩn. Xử lý mẫu theo quy trình đã chọn và phân tích trên hệ thu đƣợc hàm

lƣợng các chất đƣợc thêm vào và đánh giá độ thu hồi của phƣơng pháp xử lý mẫu.

Ngoài độ lặp thì độ đúng là một yếu tố để đánh giá phƣơng pháp phân tích.

Sau khi thu đƣợc kết quả thực tế khi phân tích các este phtalat trên đối tƣợng đã

chọn với hệ máy đã đƣợc tối ƣu, mẫu đƣợc đem phân tích lại trên hệ máy mạnh hơn

GC-MS theo tiêu chuẩn CPSC-CH-C1001-09.3 [21] của tổ chức CPSC Mỹ (United

States Consumer Product Safety Commissions). Các điều kiện khảo sát theo tiêu

chuẩn đã đƣợc kiểm tra lại và phƣơng pháp đã đƣợc đánh giá kết quả thu đƣợc có

độ tin cậy cao. So sánh kết quả thu đƣợc sau khi phân tích trên hai hệ máy, và cho

ra giá trị độ đúng của phƣơng pháp.

2.5.3 Phương pháp đối chiếu.

Mẫu thực sau khi đƣợc phân tích trên hệ HPLC, detector PDA thu đƣợc các

giá trị hàm lƣợng của các phtalat, sau đó các kết quả này đƣợc so sánh với kết quả

thu đƣợc khi phân tích trên hệ GC-MS theo tiêu chuẩn CPSC-CH-C1001-09.3. Hệ

thiết bị sắc ký khí khối phổ (GC/MS) của hãng Thermo với mã hiệu DSQ II với bộ

bơm mẫu tự động, cổng bơm chia dòng/không chia dòng, lò GC có thể lập trình, và

có khả năng kiểm soát ion chọn lọc, cột tách DB-5MS, 30m, 0,25 mm ID, 1,0 µm,

các điều kiện cho quá trình chạy GC đƣợc thể hiện trong bảng 2.3.


Trang 22

Bảng 2.3: Điều kiện chạy GC – MS phân tích phtalat.

Điều kiện cho GC

Cột: DB-5MS; 30m x 0.25mm x 1,0 µm

Nhiệt độ cổng bơm mẫu: 250 0C

Khí mang: khí He 1,0 ml/phút

Dạng bơm mẫu: splitless

Thể tích bơm mẫu: 1µl

Chƣơng trình nhiệt độ:

Chế độ Scan Chế độ SIM

Tốc độ

(oC/phút)

Nhiệt độ Thời gian

duy trì

nhiệt

(phút)

Tốc độ

(oC/phút)

Nhiệt độ Thời gian

duy trì

nhiệt

(phút)

50 0.5 100 0.5

30 270 2 30 270 2

15 295 1 15 295 1

15 300 5 15 300 5

10 305 1 10 305 1

10 310 6 10 310 4

Điều kiện cho MS

Trì hoãn dung môi: 6 phút

Nhiệt độ MS: 220OC

Nhiệt độ Transfer line: 310 0C

MS: EI- SIM/Scan

Dạng Scan: dải khối lƣợng (50-550 amu)

Cài đặt SIM:

Các Ion tƣơng ứng (m/z)

BB (nội chuẩn) 91.1, 105*, 194, 212

DBP 149, 167, 205, 223*

BBP 91.1, 149, 206*

DEHP 149, 167, 279*

DNOP 149, 167, 261, 279*

DPP 149*, 191, 209

*: Ion nhận diện


Trang 23

Phƣơng pháp xử lý mẫu nhƣ sau: mẫu đƣợc cân với khối lƣợng chính xác

khoảng 0,2gam mẫu vào ống thủy tinh, sau đó thêm 5mL n-hexan vào đó, lắc đều,

rung siêu âm 30 phút. Ly tâm ở tốc độ 4000 vòng/phút, thu dịch lọc sang một ống

sạch khác. Trƣớc khi bơm vào cột dung dịch đƣợc chảy qua màng lọc 0,45 µm.

Kết quả thu đƣợc, đƣợc so sánh với kết quả thu đƣợc khi phân tích trên hệ

HPLC. Sử dụng chuẩn Student để đánh giá sự khác nhau có ý nghĩa giữa hai kết

quả thu đƣợc.


Trang 24

CHƢƠNG III:

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Tối ƣu hóa các điều kiện chạy sắc ký.

3.1.1 Van bơm mẫu.

Trên thực tế một trong những khó khăn của phép tách sắc ký là: sự doãng

chân pic dẫn đến hiện tƣợng chồng pic, trong đó thể tích bơm mẫu vào cột cũng là

một nguyên nhân gây ra hiện tƣợng này; nếu vòng mẫu quá dài, lƣợng mẫu bơm

vào cột quá lớn sẽ dẫn đến hiện tƣợng doãng pic càng lớn, các pic càng chèn lên

nhau trong khi tách. Đó là do lƣợng mẫu quá lớn sẽ dẫn đến hiện tƣợng một phần

mẫu vào cột tách trƣớc, một phần ra sau dẫn đến trong quá trình tách trên cột sẽ có

một phần chất phân tích ra trƣớc và một phần ra sau gây ra hiện tƣợng doãng chân

pic. Nếu thể tích bơm mẫu là quá nhỏ thì sai số cũng sẽ rất lớn, ví dụ nếu sai số của

van bơm mẫu là 0,05l, khi bơm thể tích mẫu là 1l thì sai số sẽ là 5%, còn nếu thể

tích mẫu bơm là 50l thì sai số là 0,1%.

Ngày nay, van bơm mẫu 6 chiều rất phổ biến, do đó, chúng tôi lựa chọn loại

van này và thể tích mẫu bơm là 50L.

3.1.2 Cột tách.

Cột tách có vai trò rất quan trọng trong một phép tách sắc ký, nó quyết định

hiệu quả tách của quá trình. Để chọn đƣợc một pha tĩnh hay một cột tách phù hợp

nhất ta phải dựa trên những đặc điểm nhƣ: độ phân cực của chất phân tích, chất

phân tích đƣợc pha trong môi trƣờng nhƣ thế nào, có pH ra sao thì mới quyết định

chọn pha tĩnh phù hợp. Chất phân tích đƣợc chọn là các este phtalat, không tan

trong nƣớc, đƣợc pha trong MeOH, ACN ,chất phân tích kém phân cực nên phải sử

dụng pha tĩnh có bản chất kém phân cực giống nhƣ chất phân tích. Vì vậy, cột pha

đảo RP-HPLC là lựa chọn tối ƣu nhất. Trong điều kiện phòng thí nghiệm, chúng tôi

đã sử dụng cột tách Cadenza CD-C 18 (250 mm × 4,6 mm × 3 μm) để tách các

phtalat và định lƣợng chúng. Nhiệt độ cột 250C.


Trang 25

3.1.3 Detector.

Detector là một bộ phận có vai trò theo dõi, phát hiện các chất tan trong pha

động từ cột sắc ký chảy ra một cách liên tục, nó là một bộ phận thu nhận và phát

hiện các chất hay hợp chất dựa theo một tính chất nào đó của chất phân tích. Trên

thực tế, hầu hết các chất nghiên cứu đều hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại UV –

VIS, vì vậy detector UV – VIS thƣờng đƣợc sử dụng nhiều nhất trong các nghiên

cứu. Hiện nay mảng diot–photo–array phát triển, chúng có vai trò nhƣ một deetector

UV – VIS, nhƣng chúng có khả năng theo dõi chất ở nhiều bƣớc sóng khác nhau ở

cùng một thời điểm, và độ nhạy của nó cao hơn detector UV-VIS. Tuy nhiên, dựa

vào điều kiện phòng thí nghiệm và mục tiêu của nghiên cứu, chúng tôi quyết định

chọn detector PDA để phát hiện các chất phân tích.

3.1.4 Bước sóng hấp thụ cực đại của các este phtalat.

Trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn nghiên cứu định lƣợng 08 phtalat.

Chúng có cấu tạo rất giống nhau. Chỉ khác nhau 2 nhóm R và R’ đƣợc thay bằng

các gốc rƣợu khác nhau, vì vậy bƣớc sóng hấp thụ quang của các phtalat này đều

giống nhau, ở 225 nm. Dải phổ hấp thụ của các phtalat này đƣợc quét trên detector

PDA từ 190 nm đến 300 nm, bƣớc sóng 225 nm là đỉnh hấp thụ cực đại của các

phtalat. Hình 3.1 cho thấy dạng phổ UV của các phtalat.

200.0 225.0 250.0 275.0 nm

0

250

500

mAU 3.91/ 1.00

216

262

225

275

Hình 3.1: Phổ UV của các phtalat.


Trang 26

3.1.5 Khảo sát và chọn thành phần pha động phù hợp.

Thành phần pha động ảnh hƣởng rất lớn đến hiệu quả tách chất. Pha động có

thể ảnh hƣởng tới những vấn đề sau của sự tách sắc ký của các chất:

Độ chọn lọc của hệ pha

Thời gian lƣu giữ của chất tan

Hiệu lực cột tách (đại lƣợng Nef)

Độ phân giải của chất trong một pha tĩnh.

Độ rộng của pic sắc ký.

Pha động trong sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng tách có độ phân cực nhỏ

và trung bình thƣờng chủ yếu là nƣớc, có trộn với một số dung môi hữu cơ để thu

đƣợc dung dịch có độ phân cực từ thấp tới cao, phù hợp với quá trình tách.

Các chất phân tích là các chất kém phân cực, pha tĩnh đƣợc chọn cũng là cột

pha ngƣợc, kém phân cực, vậy pha động dùng để tách phải có độ phân cực vừa phải

thì các chất mới có thể tách các phtalat.

Chúng tôi đã nghiên cứu, thử nghiệm các hệ dung môi sau:

Hệ dung môi 1: MeOH-H2O

Hệ dung môi 2: ACN-H2O

Hệ dung môi 3: ACN-dung dịch đệm trietylamin 0,04% đƣợc chỉnh pH

2,8 bằng dung dịch H3PO4 1M.

3.1.5.1 Dung môi pha động là MeOH-H2O.

Đối với hệ dung môi này có rất nhiều chất bị trùng pic, gần nhƣ bị chập hoàn

toàn và đƣờng nền xấu. Chúng tôi đã thử một số chế độ gradient thành phần pha

động để thay đổi khả năng tách, tuy nhiên sự tách vẫn chƣa đƣợc cải thiện. Định

tính các phtalat bằng cách bơm 1 chất, sau đó thêm vào dung dịch 1 chất khác nữa

để xác định thời gian lƣu của chất đƣợc thêm dƣạ trên thời gian lƣu đã biết của chất

trƣớc. Cứ nhƣ vậy khi thêm hết 08 phtalat và xác định đƣợc thời gian lƣu của 08


Trang 27

phtalat khi sử dụng hệ dung môi này. Căn cứ theo tài liệu [15] ta có chỉ số độ phân

cực của nƣớc là 10,2 đơn vị, còn của MeOH là 5,1 đơn vị, từ đó ta tính đƣợc độ

phân cực của hệ dung môi đã chọn ứng với từng thời điểm trong quá trình chạy.

Công thức tính độ phân cực nhƣ sau:

%

100

i iV PIPI

Bảng 3.1 cho biết chế độ gradient để định tính các phtalat khảo sát và độ

phân cực ứng với tỷ lệ MeOH:nƣớc.

Bảng 3.1: Gradient định tính các phtalat với hệ MeOH-nước.

Thời gian ( phút) % MeOH Độ phân cực (PI)

0,01 70 3,57

5 90 4,59

9 100 5,10

15 100 5,10

18 70 3,57

50 Stop

Thời gian lƣu của các cấu tử ứng với chế độ gradient ở trên thể hiện trong bảng 3.2.

Bảng 3.2: Thời gian lưu của các cấu tử:

Các phtalat Thời gian lƣu (phút) Nhận xét

DMGP 6,4

BBP 18,3 Trùng với DEHP

DBP 13,3

DPP 14,5 Trùng chân, rõ đỉnh với DCHP

DCHP 14,7

DHP 15,7

DEHP 18,3


Trang 28

DNOP 19,4

Với thời gian lƣu và thứ tự ra khỏi cột của các phtalat kể trên, chúng tôi thử nghiệm

thêm một vài chế độ gradient khác, xem xét cải thiện khả năng tách. Các gradient đã

thử nghiệm với hệ dung môi MeOH-Nƣớc đƣợc trình bày ở bảng 3.3.

Bảng 3.3: Các gradient thử nghiệm với pha động MeOH-Nước

Gradient 1

PI

Gradient 2

PI T

(phút)

%

MeOH

T (phút) %

MeOH

0,01 70 6,63 0,01 70 6,63

5 90 5,61 5 90 5,61

9 100 5,10 15 90 5,61

15 100 5,10 18 70 6,63

18 70 6,63 50 Stop

50 Stop

Nhận thấy với cả 2 gradient các pic chập vẫn bị chập hoàn toàn, không rõ

đỉnh mặc dù độ phân cực của dung môi có giảm tới mức thấp nhất (tức là khi chạy

100% MeOH), vì vậy chúng tôi đã thay thế hệ dung môi khác có hiệu quả tách tốt

hơn. Hệ dung môi pha động ACN-nƣớc đƣợc chọn để khảo sát tiếp theo.

3.1.5.2 Dung môi pha động là ACN-H2O.

Với hệ dung môi này, chúng tôi cũng xác định thời gian lƣu của từng cấu tử,

bằng cách bơm từng cấu tử vào hệ để xác định thời gian lƣu ứng với từng chất.

Thứ tự ra khỏi cột của 08 phtalat khảo sát là:

DMGP – BBP – DBP – DPP – DCHP – DHP – DEHP – DNOP.

Sắc ký đồ định tính của các phtalat (thời gian lƣu) đối với hệ dung môi pha

động này đƣợc trình bày ở phụ lục 2.

Các gradient đã đƣợc khảo sát với dung dịch hỗn hợp 08 phtalat đƣợc trình

bày ở bảng 3.4.


Trang 29

Bảng 3.4: Chế độ chạy với pha động ACN- nước.

Gradient 1 PI

(đ.vị)

Gradient 2 PI

(đ.vị)

Gradient 3 PI

(đ.vị) T

(phút)

%

ACN

T

(phút)

%

ACN

T

(phút)

%

ACN

0,01 65 7,34 0,01 65 7,34 0,01 65 7,34

3 85 6,48 5 85 6,48 5 85 6,48

6,5 100 5,80 10 95 6,02 10 100 5,80

19,5 100 5,80 20 95 6,02 20 100 5,80

23 85 6,48 25 85 6,48 28 85 6,48

35 Stop 30 65 7,34 40 Stop

40 Stop

Bảng 3.5: Độ phân giải, thời gian lưu ứng với các gradient.

Độ phân giải R Gradient 1 Gradient 2 Gradient 3

R T(phút) R T(phút) R T(phút)

DMGP 0,806 7,84 1,343 7,94 1,919 7,91

BBP 0,140 12,88 0,220 14,61 0,123 14,44

DBP 1,428 13,53 1,528 15,35 1,482 15,26

DPP 0.963 15,40 0,260 18,32 0,690 17,66

DCHP 1,581 16,08 1,608 19,27 1,553 18,33

DHP 3,531 17,83 5,008 22,34 1,162 20,33

DEHP 10,120 23,89 -- -- 3,415 26,33

DNOP 2,489 25,85 -- -- 2,620 28,42

Sắc ký đồ tách 08 phtalat với hệ dung môi ACN-nƣớc ứng với gradient 1-3

đƣợc thể hiện trên hình 3.2.

gradient 1


Trang 30

0 10 20 30 min

-0.25

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

2.00mAU(x100)225nm4nm (1.00)

DMGP

BBP DBP

DPPDCHP

DHP

DEHP DNOP

gradient 2

0 10 20 30 min

-0.25

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

mAU(x100)225nm4nm (1.00)

DMGP

BBP DBP

DPPDCHP

DHP

gradient 3

0 10 20 30 min-0.25

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

mAU(x100)225nm4nm (1.00)

DMGP

BBP DBP

DPPDCHP

DHP

DEHP DNOP

Hình 3.2: Sắc ký đồ thể hiện 3 gradient đã khảo sát.

Nhận thấy khi sử dụng dung môi ACN-nƣớc, đƣờng nền rất xấu, pic của

DBP, DNOP, BBP có xu hƣớng bị kéo đuôi pic, khả năng tách kém. Tác giả Hyun

Jung Koo [17] đã thêm trietylamin vào trong pha động và điều chỉnh pH pha động

bằng dung dịch axit photphoric 1 mol/l tới pH 2,8. Các amin thƣờng đƣợc thêm vào

dung dịch pha động trong các trƣờng hợp pic bị kéo đuôi. Nguyên nhân của hiện

tƣợng này là do trên bề mặt cột vẫn còn nhiều nhóm silanol –OH chƣa bị silan hóa.

Khi có mặt các tạp chất kim loại, nhất là các kim loại nặng, chúng sẽ liên kết và tạo

những phức phối trí trên bề mặt cột, làm hoạt hóa các nhóm silanol trên bề mặt cột.

Do đó khi có chất phân tích đi qua cột, các nhóm hoạt hóa này làm cho các chất

không đƣợc rửa giải một cách dễ dàng và gây ra hiện tƣợng kéo đuôi pic[9]. Vì vậy,

chúng tôi cũng thêm một lƣợng trietylamin vào pha động, điều chỉnh pH của pha

động tới giá trị 2,8 bằng axit photphoric 1M. Nồng độ của trietylamin và pH pha

động cũng đƣợc khảo sát.

3.1.5.3 Dung môi pha động là ACN-trietylamin.


Trang 31

Trƣớc khi đi vào khảo sát cụ thể, thời gian lƣu của từng cấu tử trong hỗn hợp

cũng đƣợc khảo sát bằng cách bơm từng dung dịch chuẩn của các phtalat qua cột.

Thời gian lƣu và thứ tự ra khỏi cột các phtalat đƣợc trình bày ở bảng 3.6, với chế độ

chạy isocratic tỷ lệ %thể tích của ACN:pha nƣớc chứa trietylamin là 88:12.

Bảng 3.6: Thời gian lưu của các cấu tử ứng với hệ dung môi 3:

Các

phtalat DMGP BBP DBP DPP DCHP DHP DEHP DNOP

Thời gian

(phút)

4,07 7,50 8,48 12,62 14,31 20,76 53,25 66,11

Thứ tự DMGP – BBP – DBP – DPP – DCHP – DHP – DEHP – DNOP

Sắc ký đồ thể hiện thời gian lƣu và thứ tự ra khỏi cột của các phtalat ứng với

hệ dung môi và chế độ chạy này đƣợc trình bày ở phụ lục 2.

3.1.5.4 Khảo sát tỷ lệ thành phần ACN-trietylamin.

Chế độ chạy isocratic:

Hai tỷ lệ đẳng dòng đƣợc chọn là 88:12 và 95:5 %ACN:%pha nƣớc chứa

trieylamin (%v/v). Tốc độ dòng 1,0 ml/phút, nhiệt độ cột 250C. Kết quả nhƣ trong

bảng 3.7:

Bảng 3.7: Kết quả phân tích của 2 tỷ lệ ACN: pha nước chứa trietylamin.

Các phtalat

%ACN:%đệm = 88/12 %ACN:%đệm = 95/5

Thời gian lƣu

(phút)

Độ phân giải

R

Thời gian lƣu

(phút)

Độ phân giải

R

DMGP 3,88 7,63 3,76 3,51

BBP 7,35 17,67 5,54 2,07

DBP 8,34 27,59 6,14 2,08

DPP 12,64 21,38 8,12 6,31

DCHP 14,21 3,84 9,14 3,47

DHP 20,70 9,09 11,49 7,21

DEHP 29,11 1,14 23,49 25,37


Trang 32

DNOP 53,56 2,46 27,80 6,75

Ƣu điểm của chạy đẳng dòng là lƣợng dung môi đi vào cột ổn định, vì vậy

đƣờng nền ổn định trong suốt quá trình chạy. Với tỷ lệ là 88:12, thời gian lƣu của

các pic dài hơn nhiều, độ phân giải tốt hơn tỷ lệ 95:5. Tuy nhiên vì thời gian lƣu quá

dài dẫn đến các pic ra sau cùng nhƣ DEHP và DNOP bị tù, không nhọn và thời gian

một mẫu quá dài, vì vậy gây tốn dung môi và mất thời gian. Trong khi với tỷ lệ

95:5, độ phân giải cũng khá cao và thời gian lƣu lại ngắn hơn. Nhƣng vì nếu chỉ

chạy đẳng dòng 1,0 ml/phút suốt quá trình, các pic rất gần nhau (nhất là đoạn đầu

giữa các cặp DBP-BBP, DPP-DCHP), trong khi phân tích thực nghiệm nếu có lẫn

tạp chất sẽ rất khó phân tích chính xác đƣợc. Vì vậy, chúng tôi nghiên cứu thêm

một số quá trình chạy máy gradient để tối ƣu quá điều kiện trên. Hình 3.3 là sắc đồ

sự tách các phtalat khi thay đổi tỷ lệ 2 kênh của pha động.

Tỷ lệ 88:12

0.0 25.0 50.0 min

-0.25

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

2.00

2.25mAU(x100)225nm4nm (1.00)

DMGP

BBPDBP

DPPDCH

P DHP

DEHP DNO

P

Tỷ lệ 95:5

0 10 20 min

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

mAU(x100)225nm4nm (1.00)

DMGP

BBPDBP

DPPDCHP

DHP

DEHP DNOP

Hình 3.3: Sắc đồ chạy đẳng dòng pha động ACN-nước.

Chế độ chạy gradient:

Pha động gồm 2 kênh, 1 kênh là ACN, 1 kênh là pha nƣớc chứa trietylamin

0,04% đƣợc điều chỉnh pH xuống 2,8 bằng dung dịch axit photphoric 1M. Trong đó

trietylamin rất phân cực, cột sử dụng lại là cột pha đảo, bề mặt cột kém phân cực

nên khả năng trietylamin bám trên cột hơi kém. Nên khi thay đổi gradient thành


Trang 33

phần pha động, tức là thay đổi % ACN hay % pha nƣớc thì khả năng hấp thụ kém

trên cột của trietylamin làm cho đƣờng nền bị trôi, ảnh hƣởng nhiều tới tín hiệu của

các pic phtalat. Vì vậy, chúng tôi sử dụng chế độ gradient tốc độ pha động, tức là

giữ nguyên thành phần pha động nhƣng thay đổi tốc độ dòng theo thời gian để tăng

khả năng tách các phtalat. Các gradient tốc độ đã khảo sát đƣợc trình bày ở bảng

3.8. Tỷ lệ thành phần hai pha là 88:12 của ACN và pha nƣớc chứa trietylamin

0,04%, nhiệt độ cột đặt ở 250C.

Bảng 3.8: Các gradient tốc độ dòng.

Gradient 1 Gradient 2 Gradient 3 Gradient 4

T (phút) ml/phút T (phút) ml/phút T (phút) ml/phút T (phút) ml/phút

0,01 0,8 0,01 0,8 0,01 0,5 0,01 0,6

25 0,8 15 0,8 5 0,5 10 0,6

26 1,2 18 1,0 7 0,8 12 1,0

40 1,2 25 1,0 10 0,8 15 1,0

70 Stop 30 1,2 12 1,0 17 88%

ACN

40 1,2 15 1,0 17 1,2

70 Stop 17 1,2 19 95%

40 1,2 40 1,2

60 Stop 70 Stop

Gradient 5 Gradient 6

T (phút) ml/phút T (phút) ml/phút

0,01 0,6 0,01 0,8

10 0,6 12,5 0,8

12 0,8 14 1,0

15 0,8 16 1,0

17 1,0 18 1,2

20 1,0 20 1,2

22 1,2 40 Stop

40 1,2


Trang 34

70 Stop

Nhận thấy: Ở chế độ gradient 1, đƣờng nền xấu, có pic âm và thời gian lƣu

các cấu tử rất dài, thậm chí DNOP còn chƣa ra khỏi cột. Ở chế độ gradient 2, các

chất đã đi ra khỏi cột hết, độ phân giải tốt, tổng thời gian chạy là 52 phút. Thời gian

lƣu quá dài, các pic ở khá xa nhau. Với chƣơng trình gradient 3, thời gian lƣu cũng

rất dài, nhƣng ở gradient 4,5,6 thời gian lƣu của các cấu tử đƣợc cải thiện rất nhiều

so với các gradient trƣớc, giảm khoảng 20 phút. Với tổng thời gian chạy 23 phút,

đƣờng nền ổn định, độ phân giải giữa các pic tốt, pic nhọn và đối xứng. Vì vậy,

chúng tôi lƣạ chọn gradient 6 cho các khảo sát tiếp theo. Hình 3.4 thể hiện sắc ký đồ

6 chƣơng trình gradient đã khảo sát.

Gradient 1:

0.0 25.0 min

-0.25

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

mAU(x100)225nm4nm (1.00)

DMGP

BBPDBP

DPPDCH

P DHP DEHP

Gradient 2:

0.0 25.0 min

-0.25

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

mAU(x100)225nm,4nm (1.00)

DMGP

BBPDIBP

DPPDCHP

DHP

DINP DEHP DNOP

Gradient 3

0.0 25.0 min

-0.25

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

2.00

mAU(x100)225nm4nm (1.00)

DMGP

BBPDBP

DPPDCHP

DHP

DEHP

Gradient 4


Trang 35

0 10 20 30 min

-0.25

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

2.00

mAU(x100)225nm4nm (1.00)

DMGP

BBPDBP

DPPDCHP

DHP DEHP DNOP

Gradient 5

0 10 20 30 min

-0.25

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

2.00

mAU(x100)225nm4nm (1.00)

DMGP

BBPDBP

DPPDCHP

DHP DEHP DNOP

Gradient 6

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 min

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

mAU(x100)225nm4nm (1.00)

DMGP

BBPDBP

DPPDCHP

DHP

DEHP DNOP

Hình 3.4: Sắc ký đồ 06 chương trình gradient đã khảo sát.

Bảng 3.9: Độ phân giải, thời gian lưu, hệ số đối xứng pic khi chạy gradient 6.

Các phtalat Thời gian lƣu (phút) Độ phân giải (R) Hệ số đối xứng pic (10%)

DMGP 3,76 2,57 0,984

BBP 5,54 4,19 1,143

DBP 6,15 2,06 0,999

DPP 8,13 6,26 1,160

DCHP 9,16 3,44 1,128

DHP 11,53 7,16 1,075

DEHP 20,36 25,37 0,989

DNOP 22,71 6,09 0,991

3.1.5.5 Khảo sát nồng độ của trietylamin trong pha nước.


Trang 36

Theo một số nghiên cứu, nồng độ trietylamin trong pha nƣớc trong những

trƣờng hợp tƣơng tự có thể lên tới cỡ hàng nghìn ppm, nhƣng tuy nhiên trong

nghiên cứu này, lƣợng trietylamin là 0,04% khá ổn định nên chúng tôi chỉ khảo sát

những nồng độ cách không xa mức nồng độ đã thử nghiệm. Vì vậy, chúng tôi lựa

chọn khảo sát 3 mức nồng độ trietylamin:

0,01% trietylamin.

0,04% trietylamin.

0,08% trietylamin.

Các điều kiện khác: nhiệt độ cột 250C, chế độ chạy đẳng dòng tỷ lệ 95/5

ACN và pha nƣớc chứa trietylamin.

Kết quả độ phân giải, thời gian lƣu và hệ số đối xứng pic ứng với 3 nồng độ

trên của trietylamin đƣợc trình bày trong bảng 3.10.

Bảng 3.10: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ trietylamin 0,01%.

Các phtalat Thời gian lƣu (phút) Độ phân giải Hệ số đối xứng pic(10%)

DMGP 3,73 1,64 1,068

BBP 5,69 5,62 1,155

DBP 6,30 2,03 1,007

DPP 8,33 6,27 1,130

DCHP 9,35 3,34 1,083

DHP 11,76 7,18 1,041

DEHP 20,52 24,86 0,957

DNOP 22,93 6,10 0,963


Các phtalat Thời gian lƣu (phút) Độ phân giải Hệ số đối xứng pic(10%)

DMGP 3,78 1,85 0,939

BBP 5,57 4,96 1,111

DBP 6,17 1,95 1,017


Trang 37

DPP 8,17 6,02 1,118

DCHP 9,20 3,29 1,081

DHP 11,6 6,86 1,043

DEHP 20,7 24,2 0,959

DNOP 24,2 6,44 0,965


Các phtalat Thời gian lƣu (phút) Độ phân giải Hệ số đối xứng (10%)

DMGP 3,86 2,31 0,994

BBP 5,62 5,08 1,063

DBP 6,28 2,13 1,055

DPP 8,34 6,05 1,175

DCHP 9,41 2,88 1,005

DHP 12,0 6,26 1,082

DEHP 21,2 21,7 1,026

DNOP 23,9 5,78 1,024

Nhận thấy ở cả 3 nồng độ của trietylamin, thời gian lƣu, độ phân giải và hệ

số đối xứng (10%) của các phtalat không khác nhau nhiều, các pic đều đƣợc tách

khỏi nhau hoàn toàn, và gần nhƣ đối xứng. Thấy ở nồng độ 0,04% trietylamin, hệ số

đối xứng gần với giá trị 1,0 hơn nên chúng tôi quyết định lựa chọn nồng độ này của

trietylamin cho các nghiên cứu tiếp theo. Hình 3.5 thể hiện sắc đồ tách các phtalat

khi sử dụng 3 hệ dung môi với nồng độ trietylamin khác nhau.

Nồng độ 0,01%

0 10 20 min

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

mAU(x10)225nm,4nm (1.00)

DMGP BBPDBP DPP

DCHP DHP

DEHP DNOP

Nồng độ 0,04%


Trang 38

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 min

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

mAU(x100)225nm4nm (1.00)

DMGP

BBPDBP

DPPDCHP

DHP

DEHP DNOP

Nồng độ 0,08%

0 10 20 min

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0mAU(x100)225nm4nm (1.00)

DMGP

BBPDBP

DPPDCHP

DHP

DEHP DNOP

Hình 3.5: Sắc đồ khảo sát nồng độ trietylamin trong pha nước.

3.1.5.6 Khảo sát ảnh hưởng của pH pha động tới quá trình tách.

Pha động gồm 2 pha, một là ACN và pha nƣớc chứa trietylamin. Pha nƣớc

có chứa trietylamin là một bazơ vì vậy pH của dung dịch sẽ làm pH kiềm, ở nồng

độ 0,04% pH là khoảng 11 đơn vị. Vì vậy, dung dịch cần đƣợc điều chỉnh xuống pH

phù hợp cho sự tách cũng nhƣ sự an toàn của cột. Hơn nữa, trong sắc ký lỏng pha

đảo RP-HPLC, pH còn có vai trò quan trọng. Nó ảnh hƣởng tới dạng tồn tại của các

chất phân tích, dạng tồn tại thay đổi thì khả năng lƣu giữ chất đó trên cột cũng thay

đổi. Đối với nghiên cứu này, pH còn có một vai trò quan trọng hơn. Nghiên cứu có

sử dụng trietylamin nhƣ một tác nhân chống kéo dài đuôi pic, vì vậy nếu ở pH kiềm

amin sẽ không thể tách thành điện tích (+) rõ rệt. Khi ở pH axit, trietylamin bị tách

thành ion (+), ion này sẽ bao phủ bề mặt Si chƣa bị silan hóa tạo thành một bề mặt

không phân cực thuần túy. Vì vậy pic sẽ đi ra ngoài cột mà không bị kéo đuôi [10].

Do đó pH đóng vai trò quan trọng trong sắc ký lỏng hiệu năng cao và những trƣờng

hợp tƣơng tự nghiên cứu này. Theo một số tác giả [13], pH 2,80 đƣợc chọn để tách

cùng đối tƣợng các phtalat. Vì vậy chúng tôi đã khảo sát những giá trị pH xung

quanh giá trị 2,8 để xem xét ảnh hƣởng pH trong một khoảng nhỏ.

Chúng tôi đã khảo sát 3 giá trị pH của pha động:


Trang 39

pH= 2,20

pH= 2,82

pH= 3,31

Kết quả khảo sát 3 giá trị pH đƣợc trình bày trong bảng 3.13.

Bảng 3.13: Thời gian lưu, độ phân giải và hệ số đối xứng pic.

Tên pH = 2,20 pH = 2,82 pH = 3,31

T(phút) R h/s đx T(phút) R h/s đx T(phút) R h/s đx

DMGP 3,72 1,78 1,071 3,68 1,83 1,082 3,70 1,86 1,044

BBP 5,86 5,26 1,061 5,53 4,46 1,034 5,71 5,05 1,051

DBP 6,52 1,93 1,027 6,13 1,94 1,043 6,31 1,93 1,026

DPP 8,89 6,43 1,093 8,18 6,19 1,086 8,35 6,21 1,097

DCHP 9,98 3,26 1,061 9,21 3,17 1,057 9,36 3,31 1,062

DHP 12,92 7,84 1,015 11,61 7,62 1,032 11,77 7,10 1,038

DEHP 22,57 22,97 0,979 20,48 23,21 0,972 20,55 24,48 0,975

DNOP 25,67 6,46 0,976 22,95 5,66 0,984 22,97 5,97 0,987

Nhận thấy giữa 3 giá trị pH, thì giá trị pH 2,82 và 3,31 ổn định hơn, các

thông số so sánh gần giống nhau hơn mặc dù không có sự khác nhau nhiều khi thay

đổi các giá trị pH ở trên. Hệ số đối xứng pic (10%), độ phân giải và thời gian lƣu

khá ổn, ngoại trừ ở pH 2,20 thời gian lƣu dài hơn khoảng 3 phút. Tuy nhiên chúng

tôi vẫn chọn giá trị pH 2,8 là giá trị pH tối ƣu cho các khảo sát tiếp theo. Hình 3.6

thể hiện sắc đồ khi thay đổi pH pha động.

pH= 2,20

0 10 20 min

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5mAU(x100)225nm4nm (1.00)

DMGP

BBPDBP

DPPDCH

P

DHP

DEHP DNO

P

pH= 2,82


Trang 40

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 min

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

mAU(x100)225nm4nm (1.00)

DMGP

BBPDBP

DPPDCH

P

DHP

DEHP DNO

P

pH= 3,31

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 min

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

mAU(x100)225nm4nm (1.00)

DMGP

BBPDBP

DPPDCH

P

DHP

DEHP DNO

P

Hình 3.6: Sắc đồ khảo sát pH pha động.

3.1.6 Khảo sát độ lặp lại của thiết bị.

Với một hệ máy có độ nhạy cao thì sự ổn định và lặp lại đóng vai trò quan

trọng trong phân tích. Lặp lại tốt mới có thể cho độ chính xác tốt, trong một phạm

vi cho phép. Đối với hệ máy sắc ký, khi đã lựa chọn đƣợc điều kiện tối ƣu cho quá

trình tách, thì một yếu tố quan trọng quyết định hiệu quả phân tích đó là độ lặp của

thiết bị, bao gồm cả độ lặp diện tích pic và thời gian lƣu. Bảng 3.14 và 3.15 chỉ ra

độ lặp lại của hệ sắc ký đã chọn về diện tích pic và thời gian lƣu. Dung dịch chuẩn

để khảo sát độ lặp có nồng độ sấp xỉ 10 ppm mỗi phtalat, chạy gradient tốc độ dòng

6, tỷ lệ 2 pha là ACN: pha nƣớc chứa trietylamin 0,04% là 95:5, pH pha động lựa

chọn 2,8, nhiệt độ cột 250C, thể tích van bơm mẫu là 50 µl. Mỗi dung dịch đƣợc

bơm 3 lần vào cột để xác định độ lặp diện tích pic và thời gian lƣu.

Bảng 3.14: Độ lặp lại thời gian lưu của các phtalat.

Các phtalat Bơm lần 1

(phút)

Lần 2

(phút)

Lần 3

(phút)

Trung bình % RSD

DMGP 3,867 3,867 3,887 3,873 0,30

BBP 5,619 5,615 5,630 5,621 0,14

DBP 6,283 6,275 6,291 6,283 0,13

DPP 8,344 8,328 8,346 8,339 0,12


Trang 41

DCHP 9,405 9,383 9,401 9,396 0,12

DHP 11,95 11,92 11,94 11,94 0,14

DEHP 21,12 21,10 21,58 21,27 1,29

DNOP 23,86 23,84 23,85 23,85 0,04

Bảng 3.15: Độ lặp lại diện tích pic các phtalat.

Các phtalat Bơm lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình % RSD

DMGP 632964 629290 629626 630627 0,32

BBP 303349 308047 310641 307346 1,20

DBP 639656 651491 650346 647164 1,01

DPP 999418 1013907 1008514 1007280 0,73

DCHP 407766 412693 413668 411376 0,77

DHP 130801 133454 134033 132763 1,30

DEHP 355198 340800 374086 256695 4,68

DNOP 511389 531070 520967 521142 1,89

Nhận thấy % RSD của các diện tích pic trung bình và thời gian lƣu trung

bình của các lần lặp lại đều dƣới 5%. Vì vậy, kết luận đƣợc hệ sắc ký đã chọn có độ

lặp lại tốt, phù hợp phép phân tích. Hình 3.7 thể hiện sắc đồ khảo sát độ lặp lại của

hệ máy.

Bơm lần 1:

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 min

-1.0

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

mAU(x10)225nm4nm (1.00)

DMGP

BBPDBP

DPPDCH

P

DHP

DEHP DNO

P

Bơm lần 2:

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 min

-1.0

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

mAU(x10)225nm4nm (1.00)

DMGP

BBPDBP

DPPDCH

P

DHP

DEHP DNO

P


Trang 42

Bơm lần 3:

0 10 20 min

-1.0

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

mAU(x10)225nm4nm (1.00)

DMGP

BBPDBP

DPPDCH

P

DHP

DEHP DNO

P

Hình 3.7: Sắc đồ khảo sát độ lặp lại của hệ máy.

3.1.7 Điều kiện tối ưu hóa cho quá trình tách các phtalat.

Cột tách: cột Cadenza CD-C18 250mm × 4,6mm × 3µm.

Detector :PDA

Bƣớc sóng hấp thụ cực đại: 225 nm.

Nhiệt độ cột 250C.

Tỷ lệ 2 pha dung môi ACN:pha nƣớc chứa trietylamin = 95:5

Gradient pha động : gradient tốc độ dòng 6.

T(phút) 0,01 12,5 14,0 16,0 18 20 40

U(mL/phút) 0,8 0,8 1,0 1,0 1,2 1,2 Stop

Nồng độ trietylamin : 0,04%.

pH pha động: 2,8.

Thể tích van bơm mẫu: 50µL.

3.2 Đƣờng chuẩn hỗn hợp xác định 08 phtalat.

3.2.1 Dựng đường chuẩn.

Dung dịch dựng đƣờng chuẩn đƣợc pha từ các dung dịch chuẩn gốc trình bày

ở bảng 2.2. Các dung dịch đƣợc pha loãng sử dụng pipetman, định mức 10 ml bằng

MeOH. Từ dung dịch gốc, các dung dịch làm việc đƣờng chuẩn đƣợc pha nhƣ bảng

3.16.


Trang 43

Bảng 3.16: Các dung dịch dựng đường chuẩn.

C

(ppm) DMGP BBP DBP DPP DCHP DHP DEHP DNOP

Dd1 0,80 0,80 1,2 1,2 0,80 0,80 1,1 1,9

Dd 2 1,6 1,7 2,3 2,4 1,6 1,6 2,3 3,7

Dd 3 4,0 4,2 5,8 6,0 4,0 4,0 5,7 9,3

Dd 4 8,0 8,4 12 12 8,0 8,0 12 19

Dd 5 16 17 23 24 16 16 23 37

Dd 6 24 25 35 36 24 24 34 56

Dd 7 32 34 46 48 32 32 46 74

Mỗi dung dịch đƣợc bơm trên hệ sắc ký 3 lần, diện tích pic trung bình thu đƣợc sẽ

là số liệu để dựng đƣờng chuẩn sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ.

Bảng 3.17: Diện tích pic trung bình thu được của các phtalat.

STT DMGP BBP DBP DPP DCHP DHP DEHP DNOP

1 85196 29440 60214 74496 37728 10802 37656 48955

2 172345 55242 115218 164327 67477 21335 67373 102421

3 356914 146729 316354 473989 196108 62038 180530 244581

4 616993 303345 647164 927280 411382 132793 330028 501142

5 1127055 601151 1250754 1731694 548928 178054 638741 918257

6 1622629 1157069 1862067 2421098 1146401 386628 891895 1268875

7 2216267 1631383 2518475 3038929 1519661 538253 1213629 1762926


Trang 44

Bảng 3.18: Đường chuẩn các phtalat.

DMGP

0 5 10 15 20 25 30 35

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

Y = A + B * X

Parameter Value Error

------------------------------------------------------------

A 48232.75143 17046.64476

B 67263.15959 1094.89533

------------------------------------------------------------

R SD N P

------------------------------------------------------------

0.99921 34728.72673 8 <0.0001

------------------------------------------------------------

Y A

xis

Title

X Axis Title

DBP

0 10 20 30 40 50

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

Y = A + B * X


------------------------------------------------------------

A -1739.69629 7999.18249

B 54564.95474 334.3011

------------------------------------------------------------

R SD N P

------------------------------------------------------------

0.99991 14185.78345 7 <0.0001

------------------------------------------------------------

AR

EA

DBP (ppm)

DCHP

0 5 10 15 20 25 30 35

0

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

Y = A + B * X


------------------------------------------------------------

A 2086.08991 9725.46322

B 47488.86372 601.95811

------------------------------------------------------------

R SD N P

------------------------------------------------------------

0.9996 17624.4689 7 <0.0001

------------------------------------------------------------

AR

EA

DCHP(ppm)

DHP

0 5 10 15 20 25 30 35

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

Y = A + B * X


------------------------------------------------------------

A -6904.56709 5342.65924

B 16726.15254 330.68421

------------------------------------------------------------

R SD N P

------------------------------------------------------------

0.99902 9681.95853 7 <0.0001

------------------------------------------------------------

AR

EA

DHP(ppm)

DEHP

0 10 20 30 40 50

0

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

Y = A + B * X


------------------------------------------------------------

A 20622.20736 9726.61024

B 26015.34424 408.4391

------------------------------------------------------------

R SD N P

------------------------------------------------------------

0.99938 17267.63991 7 <0.0001

------------------------------------------------------------

AR

EA

DEHP(ppm)

DNOP

0 10 20 30 40 50 60 70 80

0

500000

1000000

1500000

2000000

Y = A + B * X


------------------------------------------------------------

A -4553.82965 11552.6516

B 26365.25268 320.56644

------------------------------------------------------------

R SD N P

------------------------------------------------------------

0.99956 23491.24376 8 <0.0001

------------------------------------------------------------

AR

EA

DNOP (ppm)


Trang 45

DPP

0 10 20 30 40 50

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

Y = A + B * X


------------------------------------------------------------

A 19740.74796 18722.12378

B 71710.11392 749.89692

------------------------------------------------------------

R SD N P

------------------------------------------------------------

0.99973 33231.08436 7 <0.0001

------------------------------------------------------------

AR

EA

DPP (ppm)

BBP

0 10 20 30 40 50

0

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

1800000

Y = A + B * X


------------------------------------------------------------

A 7926.1872 6109.86112

B 32432.06807 254.22816

------------------------------------------------------------

R SD N P

------------------------------------------------------------

0.99985 11716.9044 7 <0.0001

------------------------------------------------------------

AR

EA

BBP(ppm)

Các phƣơng trình đƣờng chuẩn thu đƣợc trong bảng 3.19.

Bảng 3.19: Phương trình đường chuẩn các phtalat.

Các phtalat Phƣơng trình đƣờng chuẩn Hệ số R

DMGP Y=(48232±17046)+(67263±1094)X 0,9994

BBP Y=(7296±6109)+(32432±254)X 0,9999

DBP Y=(-1739±7999)+(54564±334)X 0,9999

DPP Y=(19740±18722)+(71710±749)X 0,9994

DCHP Y=(2086±9725)+(47488±601)X 0,9996

DHP Y=(-6904±5342)+(16726±330)X 0,9990

DEHP Y=(20622±9726)+(26015±408)X 0,9994

DNOP Y=(-4553±11552)+(26365±320)X 0,9996

3.2.2 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng.

LOD đƣợc xem là nồng độ thấp nhất (xL) của chất phân tích mà hệ thống

phân tích cho tín hiệu phân tích (yL) khác có nghĩa với tín hiệu của mẫu trắng hay

tín hiệu nền.

Tức là: yL = by + k.Sb


Trang 46

Với by là tín hiệu trung bình của mẫu trắng sau nb thí nghiệm (lớn hơn 20 thí

nghiệm). Sb là độ lệch chuẩn tín hiệu của mẫu trắng, k là đại lƣợng số học đƣợc

chọn theo độ tin cậy mong muốn.

1

1 bn

bjb

jb

y yn

bn

i

bbi

b

b xxn

S1

22 )(1

1

Nhƣ vậy :

. bL b

k Sy y

b

Mẫu trắng đƣợc pha với nồng độ chất phân tích xb = 0.

Do đó giới hạn phát hiện: . bk S

LODb

Trong trƣờng hợp không phân tích mẫu trắng thì có thể xem độ lệch chuẩn

của mẫu trắng SB đúng bằng sai số của phƣơng trình hồi quy, tức là Sb = Sy và tín

hiệu khi phân tích mẫu nền yb = a. Khi đo tín hiệu thu đƣợc ứng với nồng độ phát

hiện YLOD = a + 3.Sy. Từ phƣơng trình hồi quy tìm đƣợc a và Sy.

Giới hạn định lượng LOQ: [4]

LOQ đƣợc xem là nồng độ thấp nhất (xQ) của chất phân tích mà hệ thống

phân tích định lƣợng đƣợc với tín hiệu phân tích (yQ) khác có ý nghĩa định lƣợng

với tín hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu nền.

YQ = by + K. Sb

Thông thƣờng LOQ đƣợc tính với K = 10 tức là CQ = 10.SB/b.

Hay S/N = 10 nên suy ra LOQ = 3,33 LOD.

Từ sự phụ thuộc của diện tích pic các phtalat vào nồng độ ta tính đƣợc LOD,

LOQ của các vitamin trong bảng 3.20.


Trang 47

Bảng 3.20: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của các phtalat.

Các phtalat LOD (ppm) LOQ (ppm)

DMGP 0,044 0,15

BBP 0,019 0,063

DBP 0,018 0,061

DPP 0,045 0,15

DCHP 0,037 0,13

DHP 0,059 0,20

DEHP 0,047 0,16

DNOP 0,049 0,16

Với các giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng tính đƣợc ở trên, khi xử lý

mẫu thực cần pha loãng cho phù hợp để thu đƣợc kết quả đúng đắn nhất.

3.2.3 Kiểm tra sự khác nhau có nghĩa giữa hệ số a và giá trị 0.

Trong phƣơng trình hồi qui y = a + bx, trƣờng hợp lý tƣởng xảy ra khi a=0.

Tuy nhiên, trong thực tế các số liệu phân tích thƣờng mắc sai số ngẫu nhiên luôn

làm cho a0. Nếu giá trị a khác không có nghĩa thống kê thì phƣơng pháp phân tích

sẽ mắc sai số hệ thống. Vì vậy, trƣớc khi sử dụng đƣờng chuẩn cho phân tích công

cụ cần kiểm tra xem sự khác nhau giữa giá trị a và giá trị 0 không có ý nghĩa thống

kê không.

Nếu xem a0 thì phƣơng trình y=a+bx đƣợc viết thành phƣơng trình y=b'x.

Kết quả tính toán cụ thể với số liệu từ đƣờng chuẩn của DMGP ở bảng 3.21.

Bảng 3.21: Kết quả so sánh giữa giá trị a của phương trình đường chuẩn DCHP

với giá trị 0.

DCHP 0,8 1,6 4 8 16 24 32 SS×1010

S2 ×10

9

Y 37728 67477 196108 411382 548928 1146401 1519661

B’ 47160 42173 49027 51423 34308 47767 47489 1,48 2,96

B 44553 40869 48506 51162 34178 47680 47424 1,43 2,86

Phƣơng sai của 2 phƣơng trình đƣợc tính nhƣ sau:


Trang 48

2

)(

2

)ˆ( 22

2

n

bxay

n

yyS

iiii

y =2,96

3

)(

3

)ˆ( 2'2'

2'

n

xby

n

yyS

iiiiy =2,86

Tính đƣợc chuẩn F:

2

2'

y

y

tinhS

SF =1,03

So sánh F-tính với giá trị F tra bảng F(P,f1, f2) với P=0,95 và f1 = n-3, f2 = n-2.

Có F(P,f1, f2)= 5,19

Ta thấy F-tính<F-tra bảng. Vì vậy có thể kết luận đƣợc giá trị a và 0 khác

nhau không có ý nghĩa thống kê, hay phƣơng pháp xác định DCHP không mắc sai

số hệ thống.

Tƣơng tự cũng tính toán đƣợc chuẩn F với các phtalat khác. Kết quả tính

toán với các phtalat còn lại đƣợc chỉ ra ở bảng 3.22.

Bảng 3.22: Chuẩn F-tính của các phtalat.

Phtalat SS.E+10 SS’. E+10 S2. E+10 S’

2. E+10 Ftính Ftra bảng

DMGP 5,15 2,86 0,74 0,72 1,03 5,19

BBP 1,07 0,82 0,21 0,21 1,00 5,19

DBP 2,00 2,03 0,40 0,51 1,28 5,19

DPP 3,45 2,79 0,69 0,69 1,00 5,19

DHP 0,16 0,21 0,032 0,052 1,63 5,19

DEHP 0,61 0,42 0,12 0,105 1,14 5,19

DNOP 0,46 0,40 0,092 0,10 1,09 5,19

Nhận thấy tất cả các giá trị F-tính đều nhỏ hơn F-tra bảng, vì vậy có thể kết

luận phƣơng pháp xác định các phtalat này không mắc sai số hệ thống.


Trang 49

3.2.4 Kiểm tra sự sai khác giữa b và b’.

Khi không có sai số hệ thống thì phƣơng trình y = a + bx trở thành phƣơng

trình y = b’x, tức là sự khác nhau giữa b và b’ không có ý nghĩa thống kê. Do đó có

thể dùng chuẩn t để kiểm tra sự khác nhau của 2 giá trị trung bình.

Trƣớc tiên kiểm tra xem 2 phƣơng sai của chúng có đồng nhất không, nếu

chúng đồng nhất thì ta kết luận luôn 2 giá trị b và b’ là khác nhau không có nghĩa

thống kê, hay chúng giống nhau.

Dựa vào phần mềm Minitab 16, so sánh 2 giá trị trung bình b và b’. Kiểm tra

xem chúng có phƣơng sai tƣơng đồng nhau không. Kết quả so sánh giữa b và b’

trong phƣơng trình hồi quy của DCHP đƣợc chỉ ra ở bảng 3.23.

Bảng 3.23: Kết quả so sánh giữa b và b’ trong phương trình hồi quy của DCHP.

N = 7 Trung bình Độ lệch chuẩn Độ sai chuẩn

b 44910 5739 2169

b’ 45621 5710 2158

Sự sai khác = mu(b) – mu(b’)

Ƣớc đoán sự sai khác:

Sự sai khác với độ tin cậy 95%: (-161, 1583)

T-Test = 0 ; T-Value = 2,00 ; P-Value = 0,093 ;

Nhận thấy P – value = 0,093 > 0,05 nên kết luận đƣợc rằng 2 phƣơng sai của b và b’

là khác nhau không có nghĩa hay chúng giống nhau. Sử dụng chuẩn t để xem xét

tiếp. Tính độ lệch hợp nhất của 2 phƣơng sai trên Spooled của 2 giá trị trên.

1

2 2

2 2

1 ¹ 1

( ) ( )( 1) ( 1)

2 2

A B

A B

n n

Ai A Bi B

i A A B Bpooledx x

A B A B

x x x xn S n S

S Sn n n n

= 75,7

Với số thí nghiệm nhỏ hơn 30 dùng chuẩn t 2 phía để so sánh.

.A BA B

thucnghiem

pooled A B

x x n nt

S n n

= 0,72

So sánh giá trị t tính đƣợc từ thực nghiệm và t tra bảng


Trang 50

t(P,f = n1+n2-2) = t (0,95;12) = 2,189

Suy ra tthực nghiệm < tbảng => kết luận đƣợc rằng 2 giá trị trung bình của hệ số b, b’

của đƣờng chuẩn của vitamin B1 khác nhau không có nghĩa. Hay phƣơng pháp xác

định DCHP không mắc sai số hệ thống (cả sai số hệ thống biến đổi và không đổi).

Tƣơng tự cũng so sánh đƣợc giá trị b và b’ của các đƣờng chuẩn các phtalat khác.

Kết quả cho thấy chúng đều khác nhau không có nghĩa, vì vậy có thể kết luận

phƣơng pháp HPLC xác định các phtalat không mắc sai số hệ thống.

3.3 Đánh giá phƣơng pháp phân tích.

Mẫu đƣợc xử lý theo quy trình đã đƣợc trình bày ở 2.5.1, phần Thực

Nghiệm. Đem phân tích trên hệ HPLC với những thông số tối ƣu của quá trình tách

và định lƣợng đã chọn đƣợc. Sau đó đánh giá phƣơng pháp phân tích dựa trên

những kết quả thu đƣợc.

3.3.1 Đánh giá độ lặp lại của phương pháp xử lý mẫu.

Độ lặp lại của quá trình xử lý mẫu đƣợc thực hiện bằng cách cân cùng một

khối lƣợng 0,2g một mẫu, ở đây mẫu đƣợc chọn là mẫu bơ thực vật của công ty

TNHH Tƣờng An. Mẫu đƣợc cân vào 3 bình 10 ml, thêm 5ml ACN và tiến hành xử

lý nhƣ quy trình đã đƣa ra ở trên. Kết quả độ lặp lại đƣợc thể hiện ở bảng 3.24.

Bảng 3.24: Độ lặp xử lý mẫu.

Các

phtalat

Lần 1(ppm)

m = 0,1912g

Lần 2(ppm)

m = 0,2214g

Lần 3(ppm)

m = 0,1819g

Trung bình

(mg/kg)

%RSD

DMGP KPH KPH KPH --

BBP KPH KPH KPH --

DBP KPH KPH KPH --

DPP 1,30 1,28 1,22 30,1 3,52

DCHP KPH KPH KPH --

DHP KPH KPH KPH --

DEHP 1,60 1,72 1,58 41,0 4,66

DNOP KPH KPH KPH --


Trang 51

Nhận thấy % RSD giữa các hàm lƣợng các phtalat trong các lần xử lý mẫu

khá tốt, đều nhỏ hơn 5%, do đó kết luận phƣơng pháp xử lý mẫu có độ lặp lại tin

cậy đƣợc.

3.3.2 Đánh giá hiệu suất thu hồi của phương pháp.

Hiệu suất thu hồi của phƣơng pháp phá mẫu là một trong những đại lƣợng

quan trọng để đánh giá hiệu quả của phƣơng pháp. Nó cho biết lƣợng chất bị mất đi

trong quá trình phá mẫu. Đánh giá hiệu suất thu hồi là đánh giá độ tin cậy của

phƣơng pháp xử lý mẫu đã chọn.

Để đánh giá hiệu suất thu hồi của phƣơng pháp, chúng tôi đã lựa chọn một

loại mẫu không phát hiện các phtalat, thêm chuẩn vào mẫu đó và xử lý. Mẫu đƣợc

chọn là mẫu phomai Con bò cƣời của công ty TNHH Bel Việt Nam.

Mẫu đƣợc cân khối lƣợng khoảng 0,2-0,3g trên cân phân tích, chuyển vào

bình 10 ml. Nồng độ đƣợc thêm vào tính theo sau khi định mức.

Bình 0: mẫu trắng, chỉ chứa 5 ml acetonitril.

Bình 1 và 2: chỉ chứa lƣợng mẫu đã cân.

Bình 3 và 4: mẫu đƣợc thêm chuẩn mức 1.

Bình 5 và 6: mẫu và lƣợng phtalat thêm chuẩn mức 2

Bình 7 và 8: mẫu và lƣợng phtalat thêm chuẩn mức 3.

Tất cả các bình sau đó đƣợc thêm ACN đến 5ml.

Các mức thêm chuẩn đƣợc trình bày ở bảng 3.25.

Bảng 3.25: Nồng độ các phtalat ở các mức thêm chuẩn.

Các phtalat Mức 1 (ppm) Mức 2 Mức 3

DMGP 0,8 3,2 6,4

BBP 0,8 3,2 6,7

DBP 1,2 4,8 9,2

DPP 1,2 4,8 9,6

DCHP 0,8 3,2 6,4

DHP 0,8 3,2 6,4


Trang 52

DEHP 1,1 4,6 9,2

DNOP 1,9 7,6 14,8

Các mẫu đều đƣợc lắc, rung siêu âm và xử lý cùng nhau. Sau đó đƣợc bơm

vào cột, trƣớc khi bơm lọc qua màng lọc 0,45µm. Kết quả thu đƣợc trong bảng

3.26.

Bảng 3.26: Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi.

Các phtalat Diện tích pic trung bình (mAu)

Mẫu Mẫu thêm 1 Mẫu thêm 2 Mẫu thêm 3

DMGP KPH 62096 203264 407569

BBP KPH 30505 102747 250679

DBP KPH 62670 230260 507522

DPP KPH 83542 340156 587758

DCHP KPH 40127 129393 290221

DHP KPH 11503 52399 103371

DEHP KPH 30906 130271 235876

DNOP KPH 45659 165694 311990

KPH: không phát hiện.

Diện tích pic trên đƣợc áp vào đƣờng chuẩn cho ra nồng độ các phtalat thu

hồi lại đƣợc sau quá trinh xử lý mẫu. Kết quả đƣợc chỉ ra trong bảng 3.27.

Bảng 3.27: Kết quả hiệu suất thu hồi.

Các

phtalat

Nồng độ phtalat thu hồi đƣợc (ppm) Hiệu suất thu hồi (%)

Mẫu thêm 1 Mẫu thêm 2 Mẫu thêm 3

DMGP 0,93 3,05 6,12 102,4 ± 6,93

BBP 0,93 3,14 6,74 105,0 ± 5,67

DBP 1,15 4,22 9,30 94,9 ± 3,83

DPP 1,27 5,04 8,96 101,4 ± 4,03

DCHP 0,84 2,76 6,11 95,6 ± 5,41

DHP 0,69 3,13 6,18 93,5 ± 3,66


Trang 53

DEHP 1,08 5,00 9,07 101,8 ± 3,44

DNOP 1,96 7,10 13,38 95,7 ± 3,85

Kết quả đô thu hồi của các phtalat khá cao, từ 93% - 105%. Vì vậy có thể kết

luận phƣơng pháp xử lý mẫu này đáng tin cậy.

3.4 Phân tích mẫu thực tế.

Áp dụng các điều kiện tối ƣu đã đƣợc khảo sát, chúng tôi tiến hành phân tích

một vài mẫu thực. Mẫu phomai con bò cƣời không phát hiện thấy các phtalat. Kết

quả mẫu Bơ Thực vật cho kết quả nhƣ trong bảng 3.28.

Bảng 3.28: Kết quả phân tích mẫu Bơ thực vật.

Các phtalat Lần 1(ppm) Lần 2(ppm) Lần 3(ppm) Hàm lƣợng

m = 0,1912g m = 0,2214g m = 0,1819g (mg/kg)

DMGP KPH KPH KPH --

BBP KPH KPH KPH --

DBP KPH KPH KPH --

DPP 1,30 1,28 1,22 30,1 ± 1,08

DCHP KPH KPH KPH --

DHP KPH KPH KPH --

DEHP 1,60 1,72 1,58 41,0 ± 1,34

DNOP KPH KPH KPH --

3.5 Đối chiếu kết quả phân tích

3.5.1 Kết quả phân tích hàm lượng phtalat trên hệ GC-MS.

Các mẫu thực đƣợc phân tích kiểm tra trên thiết bị GC-MS của hãng Thermo

với mã hiệu DSQ, các thông số hệ thống và quá trình tách đƣợc áp dụng tiêu chuẩn

CPSC-CH-C1001-09.3 [20] của tổ chức CPSC (Consumer Product Safety

Commissions), mẫu đƣợc xử lý theo quy trình nêu ở chƣơng II. Thu đƣợc kết quả

hàm lƣợng các phtalat trong các mẫu thực phẩm nhƣ sau:

Mẫu 1: Mẫu phô mai - Không phát hiện các phtalat.

Mẫu 2: Mẫu Bơ thực vật. Kết quả đƣợc thể hiện trên bảng 3.29.


Trang 54

Bảng 3.29: Kết quả mẫu Bơ thực vật đối chiếu.

Các phtalat Lần 1(ppm) Lần 2(ppm) Lần 3(ppm) Hàm lƣợng

m = 0,1976g m = 0,2606g m = 0,2310g (mg/kg)

DMGP KPH KPH KPH --

BBP KPH KPH KPH --

DBP KPH KPH KPH --

DPP 1,23 1,45 1,36 29,4±0,954

DCHP KPH KPH KPH --

DHP KPH KPH KPH --

DEHP 1,60 1,92 1,77 37,9±0,536

DNOP KPH KPH KPH --

Với phƣơng pháp GC-MS, phƣơng pháp đƣợc thực hiện theo tiêu chuẩn của

CPSC 09.3, phƣơng pháp đã đƣợc khảo sát và đánh giá lại cho phù hợp điều kiện

phòng thí nghiệm. Vì vậy, coi kết quả phân tích mẫu thực phẩm bằng phƣơng pháp

này là kết quả sát với giá trị thực, để kiểm tra kết quả phân tích trên hệ HPLC.

3.5.2 So sánh hai kết quả thu được.

Sự sai khác giữa hàm lƣợng các phtalat phân tích bằng HPLC so với giá trị

hàm lƣợng thu đƣợc khi phân tích trên hệ GC-MS đƣợc xác định đƣợc theo phƣơng

pháp thống kê đƣợc đánh giá theo phƣơng pháp thống kê dựa vào chuẩn student t

với độ tin cậy P= 95%.

Ta có: ttính = x

NS

X

Trong đó x : kết quả trung bình

X : giá trị hàm lƣợng thu đƣợc từ phƣơng pháp chuẩn

S: độ lệch chuẩn

N: số thí nghiệm tiến hành


Trang 55

Và so sánh với giá trị tbảng = t(P;f) = 4,303 với bậc tự do f= 3-2=1, P = 95%

Kết quả so sánh giữa hàm lƣợng phtalat phân tích trên hệ HPLC và GC-MS

đƣợc thể hiện trong bảng 3.30.

Bảng 3.30: Kết quả so sánh hàm lượng mẫu Bơ thực vật bằng chuẩn Student.

Các phtalat Giá trị ttính Giá tri ttra bảng

DMGP --

BBP --

DBP --

DPP 1,16 4,303

DCHP --

DHP --

DEHP 2,02 4,303

DNOP --

Các giá trị ttính từ thí nghiệm trên đều nhỏ hơn ttra bảng(P=0,95; f = 2) = 4,303.

Hay nói cách khác kết quả đo hàm lƣợng các phtalat bằng phƣơng pháp HPLC là

đồng nhất với lƣợng phtalat thu đƣợc khi phân tích trên thiết bị GC-MS.

3.5.3 Hàm lượng cho phép của các phtalat trong thực phẩm.

Theo Quyết định số 2204/QÐ-BYT [1] của bộ Y tế quy định về mức tối đa của

DEHP trong thực phẩm, thì mức tối đa cho phép DEHP có trong thực phẩm không bao

gồm nƣớc đóng chai trong và ngoài nƣớc là 1,5 mg/kg. So sánh mức DEHP phát hiện đƣợc

trên hai hệ máy HPLC và GC-MS và Quyết định đƣa ra là khác nhau. Có thể dự đoán

lƣợng phtalat này có trong mẫu thực phẩm phân tích là do thôi nhiễm từ hộp chứa bằng

nhựa, vì mẫu phô mai không có bao bì nhựa thì không phát hiện phtalat, trong khi mẫu Bơ

đƣợc chứa trong hộp nhựa thì lại phát hiện có phtalat. Tuy nhiên nguyên nhân cụ thể chúng

tôi xin đƣợc nghiên cứu và trình bày trong những công trình tiếp sau.


Trang 56

KẾT LUẬN

Kết quả nghiên cứu và khảo sát các điều kiện tối ƣu và quy trình phân tích

một số phtalat trong thực phẩm chúng tôi thu đƣợc nhƣ sau:

1. Đã tối ƣu hóa đƣợc các điều kiện tách 08 phtalat bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng

hiệu năng cao, có sử dụng detector PDA. Các điều kiện tối ƣu bao gồm:

- Chọn đƣợc hệ dung môi phù hợp nhất và cho hiệu quả tách tốt nhất 08

phtalat đã lựa chọn trên hệ sắc ký lỏng hiệu năng cao, detector phôt-diot-

array. Khảo sát ba hệ là Metanol – Nƣớc, Acetonitril – Nƣớc, và hệ

acetonitril – pha nƣớc chứa trietylamin 0,04%. Chọn đƣợc hệ hệ acetonitril –

pha nƣớc chứa trietylamin 0,04% cho khả năng tách tốt nhất.

- Khảo sát và tối ƣu đƣợc nồng độ trietylamin trong pha nƣớc, tỷ lệ thành phần

giữa hai pha, và pH dung dịch pha nƣớc.

- Khảo sát các chế độ chạy máy là chạy gradient và chạy đẳng dòng. Kết quả

thu đƣợc chế độ gradient tốc độ dòng 6 là chế dộ chạy phù hợp nhất.

- Đánh giá đƣợc độ lặp lại của thiết bị phân tích và kết luận hệ máy đã chọn có

độ lặp lại tốt, dƣới 5%.

2. Dựa trên những điều kiện tối ƣu đã khảo sát, lựa chọn đƣợc một chế độ chạy

phù hợp nhất để tách các phtalat. Sau đó áp dụng điều kiện đó để dựng đƣờng chuẩn

08 phtalat đã chọn. Và ứng dụng đƣờng chuẩn này để phân tích các phtalat đó trong

một số mẫu thực phẩm.

3. Phân tích đƣợc một số mẫu thực phẩm nhƣ mẫu phomai, mẫu thạch rau câu và

mẫu bơ thực vật. Kết quả cho thấy mẫu mayonaise không phát hiện các phtalat, còn

mẫu bơ phát hiện đƣợc 03 trên tổng số 08 phtalat đã khảo sát. Chúng tôi cũng đã

đánh giá đƣợc độ đúng của phƣơng pháp phân tích:

- Đánh giá độ lặp lại của phƣơng pháp xử lý mẫu: dƣới 5%


Trang 57

- Đánh giá độ thu hồi của phƣơng pháp: từ 93-105%

- So sánh kết quả thu đƣợc với kết quả phân tích của cùng hai mẫu đó trên hệ

sắc kí khí khối phổ và cho kết luận hai kết quả đó khác nhau không có ý

nghĩa thống kê.

- Ứng dụng phƣơng pháp trên để phân tích một số mẫu thực phẩm khác nhƣ

phô mai con bò cƣời, ...

4. Kết quả thu đƣợc đƣợc so sánh với hàm lƣợng cho phép theo tiêu chuẩn của Bộ

Y Tế, thấy rằng hàm lƣợng các phtalat đã vƣợt quá tiêu chuẩn cho phép. Do đó, cần

có những biện pháp đánh giá phát tán cụ thể, xác định nguyên nhân phát hiện các

phtalat trong thực phẩm.


Trang 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt.

1. Bộ Y Tế (ngày 29 tháng 6 năm 2011), Quyết định: “Về việc ban hành quy định

tạm thời mức giới hạn nhiễm chéo Bis-(2-ethylhexyl) phthalate trong thực phẩm”,

số 2204/QÐ-BYT.

2. Phạm Luận(2000). Cơ sở lý thuyết sắc ký lỏng hiệu năng cao, NXB ĐH QGHN.

3. Nguyễn Văn Ri(2006).Chuyên đề các phương pháp tách chất, NXB ĐH QGHN.

4. Tạ Thị Thảo (2006). Bài giảng Thống kê trong Hóa phân tích, Trƣờng ĐH Khoa

học Tự nhiên.

Tiếng Anh.

5. Bart Tienpont, Prof. Dr. Pat Sandra (2004), “Determination of Phthalates in

Environmental, Food, and Biomatrices – An Analytical Challenge”, Department of

Organic Chemistry, Ghent University.

6. Cameron Goerge, Harry Prest (March 2011), “A new approach to the analysis of

phthalate este by GC/MS”, Agilent Application.

7. Centre of Food Safety(2010). “Phthalates in food”, The goverment of the Hong

Kong special Administrative Region.

8. “Chemicals families Phthalates”, Environmental working Group, the Power of

Information.

9. D. De Orsi, L. Gagliardi, R. Porrà, S. Berri, P. Chimenti, A. Granese, I. Carpani

and D. Tonelli (2005), “A environmentally friendly reversed-phase liquid

chromatography method for phthalates determination in nail cosmetics”,

Dipartimento del Farmaco, Istituto Superiore di Sanità, Rome, Italy.

10. Elena Katz, Roy Eksteen, Peter Choen makters và Neil Miller (1998).

“Handbook of HPLC.” Taylor and Fracis CRC Ebook Account.

11. Fall Semester (2003), “PubH 5103: Exposure to Environmental Hazards”,

Phthalates.


Trang 59

12. Hao-Yu-Shen, Hai-Liang-Jiang, Hong-Li Mao (2007), “Simultanious

determination of seven phthalates and four parabens in cosmetic products using

HPLC-DAD and GC-MS methods”, Analysis and testing centre; Ningbo institute

of Technology. J. Sci.,30,48-54 pages.

13. Hyun Jung Koo and Byung Mu Lee, “Estimated exposure to phthalates in

cosmetics and risk assestment”, Journal of Toxicology and Environmental Health,

Part A, 67:1901–1914, 2004.

14. Karen Chou PhD., “Phthalates in food and medical devices”, American College

of Medical Toxicology, www.acmt.net

15. Knauer (2011), “Determination of Phthalates”, Applications Journal, page 32.

16. Murov’s Orgsoltab (1988), “Organic Solvents Table of Properties”.

17. Opinion of the Panel on Food Additives, Flavourings, Processing Aids,

Materials in contact with Food and Cosmetics of the Norwegian Scientific

Committee for Food Safety (20 December 2005), Risk assessment of diethyl

phthalate (DEP) in cosmetics.

18. Opinion of The Scientific Committee on Cosmetic Products and Non-Food

Products Intended for Consumers (4 June 2002), “Diethyl phthalate”,

SCCNFP/0411/01.

19. Public health statement Di(2-ethylhexyl)phthalate (DEHP) CAS#:117-81-7

20. Dr. Sapna Johnson, etc. (January 2010), “Phthalates in Toys.

21. Test Method: CPSC-CH-C1001-09.3 (April 1st, 2010), “Standard Operating

Produce for Determination of Phthalates”, Consumer Product Safety Commission

Directorate For Laboratory Sciences Division of Chemistry 10901 Darnestowm RD

Gaithersburg, MD 20878.

22. Thomas Wenzl (2009), “Methods for the determination of phthalates in food”,

Outcome of a survey conducted among European food control laboratories.

http://www.acmt.net/


Trang 60

23. Ting Wu, Chao Wang, Xing Wang, Haiqing Xiao, Qiang Ma, Qing Zhang

(2008), “Comparison of UPLC and HPLC for Analysis of 12 phthalates”, Institute

of industrial Product Inspection, Chinese Academy of Inspection and Quarantine,

100123 Beijing, China, 68, pp. 806-809.

24. Twelfth Edition (2011), “Report on Carcinogens”, U.S. Department of Health

and Human Services, Public Health Service, National Toxicology Program,

http://ntp.niehs.nih.gov/go/roc12

25. Ursel Heudorf, Volker Mersch-Sundermann, Jürgen Angerer (2007), “Phthalates:

Toxicology and exposure”, International Journal of Hygiene and Environmental Health,

Volume 210, Issue 5, Pages 623-634.

26. U.S. EPA, Toxicity and Exposure Assessment for Children’s Health.

“Phthalates” TEACH Chemical Summary.

27. V. Zitko(1972), “Determine, toxicity, and environmental levels of phthalate

plasticizers”, Fisheries Research Board of Canada, Technical Repor,t No. 344,

page 5-6.

http://ntp.niehs.nih.gov/go/roc12


Trang 61

PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Định tính các phtalat khi chạy hệ dung môi pha động MeOH-nƣớc.

Định tính các phtalat với pha động MeOH-Nƣớc

0.0 5.0 10.0 15.0 min

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

mAU(x100)225nm4nm (1.00) DBP

BBP

0.0 5.0 10.0 15.0 min-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

mAU(x100)225nm,4nm (1.00) DBP

DPP

BBP

0.0 5.0 10.0 15.0 min-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

mAU(x100)225nm4nm (1.00)

DMGP

DBP

DPP

BBP

0.0 5.0 10.0 15.0 min-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

mAU(x100)225nm4nm (1.00)

DMGP

DBP

DPP

BBP

0.0 5.0 10.0 15.0 min

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

mAU(x100)225nm4nm (1.00)

DMGP

DBP

DPPDCH

P

DHP

BBP


Trang 62

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 min

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

mAU(x100)225nm4nm (1.00)

DMGP

DBP

DPPDCH

P

DHP

DEHP

BBP

0 10 20 min

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

mAU(x100)225nm,4nm (1.00)

DMGP

DBP

DPPDCH

PDHP

DEHP

BBPDNO

P

Phụ lục 2: Định tính các phtalat khi chạy hệ dung môi pha động ACN-Nƣớc

(Tỷ lệ 2 kênh là ACN: nƣớc = 88:12)

Hình P2.1: DMGP

0.0 2.5 5.0 min

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

mAU(x100)225nm4nm (1.00)

DMGP

Hình P2.2: BBP

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 min-2.5

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

mAU(x100)225nm,4nm (1.00)

BBP

Hình P2.3: DBP

0.0 2.5 5.0 7.5 min

-1.0

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

mAU(x100)225nm4nm (1.00)

DBP


Trang 63

Hình P2.4: DPP

0.0 5.0 10.0 15.0 min

-1.0

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0mAU(x100)225nm4nm (1.00)

DPP

Hình P2.5: DCHP

0.0 5.0 10.0 15.0 min

-3.0

-2.0

-1.0

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

mAU(x100)225nm,4nm (1.00)

DCHP

Hình P2.6: DHP

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 min

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0mAU(x100)225nm4nm (1.00)

DHP

Hình P2.7: DEHP

0.0 25.0 min

-1.0

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

mAU(x100)225nm4nm (1.00)

Hình P2.8: DNOP

0.0 25.0 50.0 min

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

mAU(x100)225nm4nm (1.00)

DNOP

Phụ lục 3: Các gradient khảo sát với pha động ACN-nƣớc.

Hình P3.1: Gradient 1: ACN-Nƣớc


Trang 64

0 10 20 30 min

-0.25

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

2.00mAU(x100)225nm4nm (1.00)

DMGP

BBP DBP

DPPDCH

P DHP

DEHP DNO

P


0 10 20 30 min

-0.25

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

mAU(x100)225nm4nm (1.00)

DMGP

BBP DBP

DPPDCH

P DHP


0 10 20 30 min-0.25

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

mAU(x100)225nm4nm (1.00)

DMGP

BBP DBP

DPPDCH

P DHP

DEHP DNO

P

Phụ lục 4: Khảo sát tỷ lệ pha động với pha động ACN-trietylamin 0,04%, pH

2,8

Hình P4.1:Tỷ lệ ACN:pha nƣớc chứa trietylamin = 88/12 (% thể tích)

0.0 25.0 50.0 min

-0.25

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

2.00

2.25mAU(x100)225nm4nm (1.00)

DMGP

BBPDBP

DPPDCHP

DHP

DEHP DNOP

Hình P4.2:Tỷ lệ ACN:pha nƣớc chứa trietylamin = 95/5 (% thể tích)

0 10 20 min

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

mAU(x100)225nm4nm (1.00)

DMGP

BBPDBP

DPPDCH

P

DHP

DEHP DNO

P


Trang 65

Phụ lục 5: Các gradient tốc độ dòng đƣợc khảo sát với pha động ACN-

trietylamin

Hình P5.1: Gradient tốc độ dòng 1.

0.0 25.0 min

-0.25

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

mAU(x100)225nm4nm (1.00)

DMGP

BBPDBP

DPPDCHP

DHP DEHP


0.0 25.0 min

-0.25

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

mAU(x100)225nm,4nm (1.00)

DMGP

BBPDIBP

DPPDCHP

DHP

DINP DEHP DNOP


0.0 25.0 min

-0.25

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

2.00

mAU(x100)225nm4nm (1.00)

DMGP

BBPDBP

DPPDCHP

DHP

DEHP


0 10 20 30 min

-0.25

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

2.00

mAU(x100)225nm4nm (1.00)

DMGP

BBPDBP

DPPDCH

P DHP DEHP DNO

P



Trang 66

0 10 20 30 min

-0.25

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

2.00

mAU(x100)225nm4nm (1.00)

DMGP

BBPDBP

DPPDCHP

DHP DEHP DNOP


0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 min

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

mAU(x100)225nm4nm (1.00)

DMGP

BBPDBP

DPPDCH

P

DHP

DEHP DNO

P

Phụ lục 6: Khảo sát nồng độ trietylamin trong pha động.

Hình P6.1: Nồng độ 0,01%

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 min

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

mAU(x100)225nm4nm (1.00)

DMGP

BBPDBP

DPPDCHP

DHP

DEHP DNOP


0 10 20 min

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

mAU(x10)225nm,4nm (1.00)

DMGP BBPDBP DPP

DCHP DHP

DEHP DNOP


0 10 20 min

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0mAU(x100)225nm4nm (1.00)

DMGP

BBPDBP

DPPDCHP

DHP

DEHP DNOP


Trang 67

Phụ lục 7: Khảo sát ảnh hƣởng của pH pha động

Hình P7.1: pH = 2,20

0 10 20 min

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5mAU(x100)225nm4nm (1.00)

DMGP

BBPDBP

DPPDCHP

DHP

DEHP DNOP

Hình P7.1: pH = 2,82

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 min

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

mAU(x100)225nm4nm (1.00)

DMGP

BBPDBP

DPPDCHP

DHP

DEHP DNOP

Hình P7.1: pH = 3,31

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 min

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

mAU(x100)225nm4nm (1.00)

DMGP

BBPDBP

DPPDCH

P

DHP

DEHP DNO

P

Phụ lục 8: Khảo sát độ lặp của hệ máy HPLC.

Hình P8.1: Mẫu bơm lần 1.

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 min

-1.0

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

mAU(x10)225nm4nm (1.00)

DMGP

BBPDBP

DPPDCH

P

DHP

DEHP DNO

P



Trang 68

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 min

-1.0

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

mAU(x10)225nm4nm (1.00)

DMGP

BBPDBP

DPPDCH

P

DHP

DEHP DNO

P


0 10 20 min

-1.0

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

mAU(x10)225nm4nm (1.00)

DMGP

BBPDBP

DPPDCHP

DHP

DEHP DNOP

Phụ lục 9: Đƣờng chuẩn 08 phtalat.

Hình P9.1: Dung dịch 1.

0 10 20 min

-1.0

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

mAU225nm4nm (1.00)

DMGP

BBPDBP DPP

DCHP

DHP

DEHP

DNOP


0 10 20 min

-0.003

0.000

0.003

0.005

0.007

0.010

mAU(x1,000)225nm4nm (1.00)

DMGP

BBPDBP DPP

DCHP

DHP

DEHP DNO

P



Trang 69

0 10 20 min

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0mAU(x10)225nm4nm (1.00)

DMGP

BBPDBP DPP

DCHP

DHP

DEHP DNOP


0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 min

-1.0

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

mAU(x10)225nm4nm (1.00)

DMGP

BBPDBP

DPPDCH

P

DHP

DEHP DNO

P


0 10 20 30 min

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

mAU(x100)225nm4nm (1.00)

DMGP

BBPDBP

DPPDCHP

DHP

DEHP DNOP


0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 min-0.25

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

mAU(x100)225nm4nm (1.00)

DMGP BBP

DBP DPPDCH

P

DHP

DEHP DNO

P


0 10 20 min

-0.25

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

2.00

2.25

mAU(x100)225nm4nm (1.00)

DMGP

BBP

DPPDCHP

DHP

DEHP DNOP


Trang 70

Phụ lục 10: Đánh giá hiệu suất thu hồi quá trình xử lý mẫu.

Hình P10.1: Mẫu trắng thiết bị.

0 10 20 min

-0.003

0.000

0.003

0.005

0.007

0.010

0.013

0.015

mAU(x100)225nm4nm (1.00)

Hình P10.2: Mẫu thực không chứa các phtalat.

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 min

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

mAU(x10)225nm,4nm (1.00)

Hình P10.3: Mức thêm 1

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 min

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

mAU(x10)225nm4nm (1.00)

DMGP

BBP DBP DPP DCHP DHP DEHP DNOP


0 10 20 min

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

mAU(x10)225nm4nm (1.00)

DMGP

BBPDBP

DPPDCH

P

DHP

DEHP

DNOP



Trang 71

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 min

-1.0

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

mAU(x10)225nm4nm (1.00)

DMGP

BBPDBP DPP

DCHP

DHP

DEHP

DNOP

Phụ lục 11: Độ lặp xử lý mẫu.

Hình P11.1: Mẫu trắng thiết bị

Hình P11.2: Mẫu lặp 1

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 min

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

mAU(x10)225nm4nm (1.00)

DPP

DEHP


0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 min

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

mAU(x10)225nm4nm (1.00)

DPP

DEHP


0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 min

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

mAU(x10)225nm4nm (1.00)

DPP

DEHP


Trang 72

Phụ lục 12: Phân tích mẫu thực.

Hình P12.1: Mẫu Phomai Con Bò Cƣời – Công ty TNHH Bel Việt Nam.

Blank

0 10 20 min

-0.003

0.000

0.003

0.005

0.007

0.010

0.013

0.015

mAU(x100)225nm4nm (1.00)

Mẫu thực

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 min

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

mAU(x10)225nm,4nm (1.00)

Hình P12.2: Mẫu Bơ thực vật – Công ty TNHH Tƣờng An.

Blank

Mẫu thực

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 min

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

mAU(x10)225nm4nm (1.00)

DPP

DEHP


Trang 73

Documents

Nghiên cứu phương pháp định lượng vài Phtalat trong thực phẩm