ISSN 1859-4581

T¹p chÝ

Science and Technology Journal of Agriculture & Rural Development

MINISTRY OF AGRICULTURE AND RURAL DEVELOPMENT, VIETNAM

NÔNG NGHIỆP &

PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN

T¹p chÝ Khoa häc vµ C«ng nghÖ

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN

15 2016

môc lôc

� Ph¹m thu dung, trÇn vò h¶I, ph¹m ngäc tó, trÇn nh− ngäc, zhanyuan zhang. Nghiªn cøu ®ång biÓu hiÖn cña 3 gien crtB, At – VTE3 vµ VTE4 ë ®Ëu t−¬ng

3-10

� Hå thÞ lam trµ, lª v¨n h¶I, cao tr−êng s¬n. X©y dùng c¬ së d÷ liÖu qu¶n lý chÊt l−îng ®Êt n«ng nghiÖp huyÖn LËp Th¹ch tØnh VÜnh Phóc

11-18

� NguyÔn minh kú. §¸nh gi¸ nhËn thøc cña céng ®ång vÒ vÊn ®Ò tµi nguyªn vµ m«i tr−êng t¹i Khu Dù tr÷ Sinh quyÓn §ång Nai

� NguyÔn minh ®«ng, nguyÔn v¨n quÝ, trÇn huúnh khanh, th¸I thÞ loan, ch©u minh kh«i. ¶nh h−ëng cña c¸c biÖn ph¸p röa mÆn ®Õn chÊt l−îng ®Êt, n−íc vµ n¨ng suÊt lóa trªn ®Êt canh t¸c t«m – lóa ë huyÖn Ph−íc Long, tØnh B¹c Liªu

19-24

25-31

� NguyÔn ®ç ch©u giang, nguyÔn minh ®«ng. §¸nh gi¸ sù bèc tho¸t NH3 cña c¸c d¹ng ph©n urª cã bæ sung chÕ phÈm nBTPT, Hua, Neb trong phßng thÝ nghiÖm

32-38

� Lª ph−íc toµn, lª v¨n khoa, trÇn v¨n hïng, trÇn v¨n dòng, ng« ngäc h−ng. §Æc tÝnh h×nh th¸i, lý hãa häc vµ sö dông ®Êt phÌn ë vïng b¸n ®¶o Cµ Mau

39-48

� Hå viÖt c−êng. X¸c ®Þnh nguyªn nh©n, c¬ chÕ g©y ®ôc n−íc ë vïng ven biÓn §å S¬n – H¶i Phßng vµ ®Ò xuÊt gi¶i ph¸p kh¾c phôc

49-57

� NguyÔn ngäc anh, ®ç ®øc dòng. C©n b»ng n−íc hÖ thèng s«ng §ång Nai trong ®iÒu kiÖn biÕn ®æi khÝ hËu

58-67

� D−¬ng v¨n c−êng, lª thÞ quúnh hoa. Sinh tæng hîp vanilin tõ axit ferulic sö dông E.coli t¸i tæ hîp

68-75

� Hoµng thÞ lÖ th−¬ng, trÇn thÞ thóy, nguyÔn quang hµo. Nghiªn cøu kÕt hîp ph−¬ng ph¸p hãa häc vµ ch−ng cÊt ph©n ®o¹n trong n©ng cao chÊt l−îng r−îu thãc vµ r−îu ng« ñ men l¸ truyÒn thèng cña tØnh Tuyªn Quang

76-80

� Lª trung thiªn, trÞnh thÞ mü trang, l−¬ng hång quang, Katleen raes. ¶nh h−ëng cña mét vµi yÕu tè ®Õn hiÖu suÊt trÝch ly vitamin C vµ c¸c hîp chÊt polyphenol tõ tr¸i s¬ ri

81-84

� Lª hoµi thanh, nguyÔn huy hoµng, nguyÔn hång s¬n. ¶nh h−ëng cña viÖc th¶ vÞt, c¸ ®Õn sinh tr−ëng, ph¸t triÓn, n¨ng suÊt vµ hiÖu qu¶ kinh tÕ cña lóa ë m« h×nh lóa – c¸ - vÞt

85-90

� TrÇn thÞ lª trang. ¶nh h−ëng cña c−êng ®é ¸nh s¸ng lªn sinh tr−ëng, hµm l−îng protein vµ lipit cña t¶o Thalassiosira pseudonana (Hasle & Heimdal, 1970)

91-95

� NguyÔn phan nh©n, bïi thÞ nga, ph¹m v¨n toµn. Thµnh phÇn loµi ®éng vËt kh«ng x−¬ng sèng ®¸y vµ mèi quan hÖ víi d− l−îng thuèc b¶o vÖ thùc vËt – Nghiªn cøu ®iÓn h×nh: HÖ thèng kªnh néi ®ång vµ s«ng r¹ch tØnh HËu Giang

96-103

� TrÇn thÞ thanh hiÒn, lª h÷u nghÞ, ph¹m minh ®øc. §¸nh gi¸ t¨ng tr−ëng vµ kh¶ n¨ng ®¸p øng miÔn dÞch cña c¸ lãc ( Channa striata) b»ng thøc ¨n bét ®Ëu nµnh cã bæ sung mannan oligosaccharides

104-111

� NguyÔn thÞ xuyÕn, nguyÔn tuÊn ®iÖp, ng« anh s¬n. ¶nh h−ëng cña m«i tr−êng nu«i cÊy vµ chÊt ®iÒu hßa sinh tr−ëng ®Õn hµm l−îng Triterpenoit trong nu«i cÊy tÕ bµo huyÒn phï c©y thanh tiÒn liÔu

112-117

� TrÇn huy m¹nh. Chi tr¶ dÞch vô m«i tr−êng rõng tØnh B×nh Ph−íc 118-125

� NguyÔn thanh t©n, trÇn ®×nh thÕ. C«ng t¸c giao rõng vµ thùc tr¹ng qu¶n lý rõng tù nhiªn giao cho céng ®ång ë c¸c tØnh T©y Nguyªn

126-133

� Lª thµnh c«ng, t¹ thÞ ph−¬ng hoa. ¶nh h−ëng cña xö lý mDMDHEU ®Õn kh¶ n¨ng chèng chÞu thêi tiÕt trong ®iÒu kiÖn ph¬i tù nhiªn cña gç g¸o tr¾ng

134-140

� TrÇn v¨n chø, phan duy h−ng. Nghiªn cøu ¶nh h−ëng cña tû lÖ chÊt chèng ch¸y, nhiÖt ®é Ðp, thêi gian Ðp ®Õn chÊt l−îng v¸n LVL

141-149

� Vò thÞ thanh h−¬ng. Thµnh phÇn loµi thùc vËt trong c¸c tr¹ng th¸i th¶m thùc vËt tho¸i hãa ë CÈm Ph¶, tØnh Qu¶ng Ninh

150-154

T¹p chÝ

NÔNG NGHI�P & PHÁT TRI N NÔNG THÔN

ISSN 1859 - 4581

N¨m thø m−êi S¸U

Sè 294 n¨m 2016

XuÊt b¶n 1 th¸ng 2 kú

Tæng biªn tËp Ts. Bïi huy hiÒn §T: 04.38345457

Phã tæng biªn tËp Ph¹m Hµ Th¸i

§T: 04.37711070Th.s d−¬ng thanh h¶i

§T: 04.37716634

Toµ so¹n - TrÞ sù Sè 10 NguyÔn C«ng Hoan

QuËn Ba §×nh - Hµ Néi §T: 04.37711072Fax: 04.37711073

E-mail: tapchinongnghiep@vnn.vnWebsite:www.tapchikhoahocnongnghiep.vn

Bé phËn th−êng trùc 135 Pasteur

QuËn 3 - TP. Hå ChÝ Minh §T/Fax: 08.38274089

GiÊy phÐp sè: 290/GP - BTTTT

Bé Th«ng tin vµ TruyÒn th«ng cÊp ngµy 03 th¸ng 6 n¨m 2016

C«ng ty cæ phÇn Khoa häc vµ c«ng nghÖ Hoµng Quèc ViÖt

§Þa chØ: Sè 18 Hoµng Quèc ViÖt,NghÜa §«, CÇu GiÊy, Hµ Néi

Gi¸: 20.000®

CONTENTS

� Pham thu dung, tran vu haI, pham ngoc tu, tran nhu ngoc, zhanyuan zhang. C0 – ordinated expression of crtB, At – VTE3 and VTE4 in soybean

3-10

� Ho thi lam tra, le van haI, cao truong son. Building database for managing agricultural land quality in Lap Thach district of Vinh Phuc province

11-18

� Nguyen minh ky. Assessment of community awareness on environment and resources issues at Dong Nai biosphere reserve

� Nguyen minh dong, nguyen van qui, tran huynh khanh, thaI thi loan, chau minh khoi. Effect of soil salinity leaching methods on the quality of soil, water and rice yields in shrim – rice cultivation system at Phuoc Long district, Bac Lieu province

19-24

25-31

� Nguyen do chau giang, nguyen minh dong. Evaluation of NH3 volatilization from urea – containing fertilizers plus nBTPT, Hua, Neb in laboratory experiment

32-38

� Le phuoc toan, le van khoa, tran van hung, tran van dung, ngo ngoc hung. The morphological, physiochemical properties and use of acid sulphate soil in Ca Mau peninsula

39-48

� Ho viet cuong. Identify the cause, mechanism in water turbidity in Do Son – Hai Phong coasta area and solutions recommendation

49-57

� Nguyen ngoc anh, do duc dung. Water balance in the Dong Nai river basin under the context of climate changes

58-67

� Duong van cuong, le thi quynh hoa. Biosynfthesis of vanillin from ferulic acid using recombinant E.coli

68-75

� Hoang thi le thuong, tran thi thuy, nguyen quang hao. Study combination chemical methods and fractionation in quality enhancement for traditional distilled spirits “ Ruou ngo” and “ Ruou thoc” brewed by yeast leaf of Tuyen Quang province

76-80

� Le trung thien, trinh thi my trang, luong hong quang, Katleen raes. Effects of several parameters (Factors) on extraction efficiency of vitamin C and polyphenolic compounds from acerola

81-84

� Le hoai thanh, nguyen huy hoang, nguyen hong son. Effects of ducks and fish to the growth, development, productivity and economic efficiency in the experimental rice fish – duck model

85-90

� Tran thi le trang. Effect of light intensity on growth, protein and lipid contents of Thalassiosira pseudonana (Hasle & Heimdal, 1970)

91-95

� Nguyen phan nhan, bui thi nga, pham van toan. The composition of benthic macroinvertebrates related with insecticide residues: A case study at irrigation canals and rivers in Hau Giang province, Viet Nam

96-103

� Tran thi thanh hien, le huu nghi, pham minh duc. Growth performance and immune reponses of snakehead (Channa striata) by feeding soybean meal supplemented with mannan oligosaccharides

104-111

� Nguyen thi xuyen, nguyen tuan diep, ngo anh son. Effects of culture mediums and plant hormones on triterpenoid production in the cell suspension culture of Cyclocarya paliurus

112-117

� Tran huy manh. Payment for forest environment services in Binh Phuoc province

118-125

� Nguyen thanh tan, tran dinh the. Forest allocation and actual status of natural forest management allocated to community in provinces of the Central Highlands

126-133

� Le thanh cong, ta thi phuong hoa. Natural weathering resistance of modified wood Neolamarckia cadamba by mDMDHEU

134-140

� Tran van chu, phan duy hung. Study on the effect of fire – retardant ratio, hot pressing temperature and time on quality of laminated veneer lumber (LVL)

141-149

� Vu thi thanh huong. Composition of species in the degraded vegetation types in Cam Pha city, Quang Ninh province

150-154

VIETNAM JOURNAL OF

AGRICULTURE AND RURAL

DEVELOPMENT ISSN 1859 - 4581

THE sixteensixteensixteensixteen YEAR No. 294 - 2016

Editor-in-Chief Dr. bui huy hien Tel: 04.38345457

Deputy Editor-in-Chief Bs. Pham Ha Thai Tel: 04.37711070

M.sc Duong thanh hai Tel: 04.37716634

Head-office No 10 Nguyenconghoan Badinh - Hanoi - Vietnam

Tel: 04.37711072 Fax: 04.37711073

E-mail: tapchinongnghiep@vnn.vnWebsite: ww.tapchikhoahocnongnghiep.vn

Representative Office 135 Pasteur

Dist 3 - Hochiminh City Tel/Fax: 08.38274089

Printing in Hoang Quoc Viet

technology and science joint stock company

KHOA H�C CÔNG NGH�

N¤NG NGHIÖP Vµ PH¸T TRIÓN N¤NG TH¤N - KỲ 1 - Th¸ng 8/2016 68

SINH TBNG H,P VANILIN TP AXIT FERULIC S: DING E. COLI TÁI TB H,P

D�#ng V8n C�D�#ng V8n C�D�#ng V8n C�D�#ng V8n C�ttttngngngng1,21,21,21,2, Lê Th, Lê Th, Lê Th, Lê Thrrrr Qu Qu Qu Qu����nh Hoanh Hoanh Hoanh Hoa1111

TÓM TTÓM TTÓM TTÓM T����T T T T Vanilin là m_t ch3t th#m ?�.c s| d5ng r_ng rãi trong công nghiGp thUc phLm, m� phLm, d�.c phLm. Hàng n8m, s�n l�.ng tiêu th5 vanilin trên thC gi-i �-c tính kho�ng 12.000 t3n. NhAm ?áp 7ng nhu c�u vanilin tU nhiên ?ang thiCu h5t tr�m tr�ng, k� thu!t di truy:n ?�.c áp d5ng ?H c�i biCn hG gien m_t s[ loài vi sinh v!t nhAm t�o ra các ch6ng tái tD h.p có kh� n8ng s�n xu3t ra h.p ch3t này. Con ?�tng sinh tDng h.p vanilin tJ axit ferulic ?�.c thUc hiGn b>i 2 enzym feruloyl-CoA synthetaza (fcs) chru trách nhiGm xúc tác ph�n 7ng chuyHn hoá axit ferulic thành feruloyl-CoA và enzym enoyl-CoA hydrataza/aldolaza (ech) xúc tác ph�n 7ng chuyHn hoá feruloyl-CoA thành vanilin. Nghiên c7u này ?ã tách dòng và gi�i trình tU gien fcs (1476 bp) tJ Amycolatopsis sp HR104 và gien ech (831 bp) tJ Pseudomonas fluorescens VTCC-B-668. Trình tU hai gien tách dòng t�#ng ?&ng 99% v-i các trình tU t�#ng 7ng trên NCBI và ?ã ?�.c drch mã in silico ?�m b�o mã hóa các trình tU axit amin hoàn chlnh. Ba gien ech, fcs và gltA tách dòng tJ nghiên c7u tr�-c ?�.c ?�a vào vector pET22b(+) t�o ra vector tái tD h.p pET22-GEF. Vector này cùng v-i pRSET-GEF ?�.c biCn n�p vào E. coli BL21 và c�m 7ng sinh tDng h.p vanilin tJ axit ferulic l�n l�.t ?�t m7c 1,44 g/L và 1,07 g/L. KCt qu� này là ti:n ?: cho nghiên c7u lên men sinh tDng h.p vanilin.

TTTTJJJJ kh kh kh khóa:óa:óa:óa: Vanilin, feruloyl-CoA synthetaza, enoyl-CoA hydrataza/aldolaza.

1. ��T V�N � 9

Vanilin (3-methoxy-4-hydroxybenzandehyt) là m_t ch3t th#m quan tr�ng ?�.c s| d5ng phD biCn trên thC gi-i trong công nghiGp thUc phLm, ?& u[ng, n�-c hoa, d�.c phLm, dinh d�(ng [1]. M7c ?_ tiêu th5 hàng n8m trên thC gi-i vào kho�ng h#n 12.000 t3n [2]. Vanilin có các ?�c tính ch[ng khuLn và ch[ng oxy hóa, ch[ng ?_t biCn và ung th� [3].

Vanilin ?�.c s�n xu3t ch6 yCu tJ ngu&n tách chiCt vs qu� c6a loài lan Vanilla planifolia và tDng h.p nhân t�o tJ eugenol, linhin…Trong ?ó, vanilin ?�.c tách chiCt tJ thUc v!t chl ?áp 7ng 1% nhu c�u thr tr�tng, còn l�i là tDng h.p hóa h�c. Giá trr kinh tC c6a vanilin tU nhiên tJ V. planifolia có giá lên t-i 4.000 ?ôla m_t kilogam, trái l�i vanilin nhân t�o chl vào kho�ng 15 ?ôla trên m_t kilogam [4]. Tuy nhiên, vanilin nhân t�o không ?�.c ?ánh giá t�#ng ?�#ng nh� vanilin tU nhiên theo quy ?rnh c6a M� và châu Âu do thiCu h¬n các h�#ng vr thu�n khiCt c6a vanilin tU nhiên và quá trình tDng h.p gây �nh h�>ng x3u t-i môi tr�tng [5].

SU khác biGt l-n giqa giá trr c6a vanilin tU nhiên v-i vanilin tDng h.p ?ã t�o ?_ng lUc ?H các nhóm

1 Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm,Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên 2 Bộ môn Sinh học phân tử, Viện Khoa học Sự sống, Đại học Thái Nguyên

nghiên c7u h�-ng vào m5c tiêu sinh tDng h.p vanilin tU nhiên thông qua các chuyHn hóa sinh h�c nht vi sinh v!t s| d5ng các ngu&n c# ch3t nh� axit ferulic, eugenol, isogenol, linhin. Trong s[ này, axit ferulic nh!n ?�.c sU quan tâm ?áng kH do ?ây là ngu&n c# ch3t d&i dào và r� ti:n. Axit ferulic có nhi:u trong thành tC bào c6a thUc v!t hai lá m�m nên có thH thu tJ các phC ph5 phLm nông nghiGp. M_t s[ vi sinh v!t có kh� n8ng phân h6y axit ferulic ?H t�o ra vanilin nh� Amycolatopsis sp. strain HR167 [6], Delftia axitovorans [7], Pseudomonas putida [8], Streptomyces setonii [9], Pseudomonas fluorescens [10].

Ferulic Acid

OH

OCH3

COS-CoA COOH

OH

OCH3

ATP

AMP +PPi

fcs

H O

OH

OCH3

COS-CoA

OH

CoA OH

OCH3

ech ech

CHO

Feruloyl-CoA Vanillin

fcs: Feruloyl-CoAsynthetase

ech: Enoyl-CoAhydratase/aldolase

gltA: Citrate synthase

Acetyl-CoA

gltA

Hình 1. Con Hình 1. Con Hình 1. Con Hình 1. Con ?�?�?�?�ttttng sing sing sing sinh tnh tnh tnh tDDDDng hng hng hng h....p vanilin tp vanilin tp vanilin tp vanilin tJJJJ axit axit axit axit

ferulicferulicferulicferulic

KHOA H�C CÔNG NGH�

N¤NG NGHIÖP Vµ PH¸T TRIÓN N¤NG TH¤N - KỲ 1 - Th¸ng 8/2016 69

Con ?�tng sinh tDng h.p vanilin tU nhiên trong các sinh v!t ?�.c minh h�a > hình 1. M> ?�u, axit ferulic br chuyHn hóa thành feruloyl-CoA d�-i sU xúc tác c6a enzym feruloyl-CoA (mã hóa b>i gien fcs) s| d5ng ATP và CoA, sau ?ó feruloyl-CoA c_ng n�-c t�o thành 4-hydroxy-3-methoxyphenyl-hydroxypropionyl-CoA và phân tách t�o ra vanilin và axetyl-CoA d�-i sU xúc tác c6a enzym enoyl-CoA hydrataza/aldolaza mã hóa b>i gien ech [4]. Vanilin m�c dù s�n xu3t tJ axit ferulic b>i các vi sinh v!t, song dY br phân h6y nhanh chóng sau khi ?�.c t�o thành, ?&ng thti quá trình lên men c6a m_t s[ x� khuLn th�tng g�p khó kh8n do có ?_ nh-t cao b>i sU sinh tr�>ng c6a s.i n3m và sU hình thành b�o t|. Do v!y, E. coli ?�.c ?ánh giá là v!t ch6 ti:m n8ng trong s�n xu3t vanilin do có quá trình lên men ?ã ?�.c tìm hiHu rõ [11], là m_t hG th[ng công c5 di truy:n hqu hiGu cho k� thu!t ?i:u h�-ng trao ?Di ch3t [12, 13], ?&ng thti không có con ?�tng phân h6y vanilin t�o thành. Bên c�nh ?ó, trong quá trình chuyHn hóa tJ axit ferulic t-i vanilin có gây ra sU tích l�y axetyl Coa vJa làm gi�m n&ng ?_ vanilin t�o ra ?&ng thti gây thiCu CoA cho ph�n 7ng chuyHn hóa axit ferulic thành feruloyl-CoA d�n ?Cn d� thJa c# ch3t gây 7c chC ph�n 7ng. H t!n d5ng t[i ?a ngu&n axety CoA tích l�y nhAm chuyHn

hóa thành nguyên liGu ?�u vào CoA, c�n có sU tham gia c6a enzym xitrat synthaza ?�.c mã hóa b>i gien gltA [14].

Trong nghiên c7u này, tiCn hành tách dòng hai gien fcs và ech tJ m_t s[ ch6ng vi sinh v!t cho hiGu su3t tDng h.p vanilin cao dUa vào các tài liGu ?ã báo cáo tr�-c ?ó, trong ?ó ?iHn hình là Amycolatopsis sp. và P. fluorescens. Hai gien này, cùng v-i gien gltA ?ã ?�.c tách dòng trong nghiên c7u tr�-c c6a nhóm [15], ?�.c ?�a vào vector biHu hiGn pET22b(+) và pRSET-A ?H c�m 7ng sinh tDng h.p vanilin tJ c# ch3t axit ferulic.

2. V�T LI�U VÀ PH��NG PHÁP NGHIÊN C$U

2.12.12.12.1. V. V. V. V!!!!t lit lit lit liGGGGuuuu

Ch6ng vi khuLn Amycolatopsis sp. HR104 (DSM 9991) ?�.c cung c3p b>i B�o tàng gi[ng vi sinh v!t DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) — C_ng hoà Liên bang 7c. Ch6ng vi khuLn P. fluorescens VTCC-B-668 ?�.c cung c3p b>i phòng B�o tàng gi[ng chuLn vi sinh v!t — ViGn Vi sinh v!t và Công nghG Sinh h�c, �i h�c Qu[c gia Hà N_i.

Các c�p m&i khuCch ?�i các gien ech và fcs v-i trình tU nh� trong b�ng 1.

BBBB����ng 1. Trình tng 1. Trình tng 1. Trình tng 1. Trình tUUUU các c các c các c các c����p mp mp mp m&&&&i i i i nhân gien nhân gien nhân gien nhân gien ech ech ech ech vàvàvàvà fcs fcs fcs fcs Tên mTên mTên mTên m&&&&iiii Trình tTrình tTrình tTrình tUUUU m m m m&&&&iiii

ech-F 5'AGAATTCAGGAGGGCATCGCCATGAGCAACTACGA3' ech-R 5'GCGAGCTCTCAGCGTTTATACGCCTGCAG3' fcs-F 5'TAATGCGCAACCAGGGTCTG3' fcs-R 5'ACCGTCACAGAGTAGCCGCA3'

Vector pTZ57R/T ?H t�o dòng các gien ech và fcs và các enzym (BamHI, SacI, EcoRI, HindIII, NcoI, T4 DNA ligaza và các dung drch ?Gm t�#ng 7ng ?�.c cung c3p b>i hãng Thermo Scientific. Vanilin và axit ferulic ?�.c cung c3p b>i Sigma Aldrich. Các hoá ch3t ph5c v5 cho viGc tách chiCt ADN và tách dòng gien ?�.c cung c3p b>i các hãng Thermo Scientific, Invitrogen, NewEngland Biolabs và m_t s[ công ty khác.

2222.2.2.2.2. Ph�#ng pháp nghiên c. Ph�#ng pháp nghiên c. Ph�#ng pháp nghiên c. Ph�#ng pháp nghiên c7777uuuu

2.2.1. Tách dòng và xác ?rnh trình tU gien ech và fcs: ADN tDng s[ c6a P. fluorescens VTCC-B-668 và Amycolatopsis sp. HR104 (DSM 9991) ?�.c tách chiCt bAng ph�#ng pháp s| d5ng CTAB và s| d5ng làm khuôn cho ph�n 7ng PCR nhân gien ech và fcs nht c�p m&i ?�c hiGu (B�ng 1). Quy trình thUc hiGn chi

tiCt t�#ng tU nh� ?ã mô t� > nghiên c7u tr�-c c6a nhóm [15]. Gien ech, fcs sau khi gi�i trình tU ?�.c so sánh v-i các trình tU t�#ng 7ng ?ã ?�.c công b[ trên ngân hàng dq liGu NCBI thông qua ch�#ng trình BLAST. Trình tU gien ?�.c drch mã bAng công c5 trUc tuyCn Translate Tool t�i ?ra chl http://web.expasy.org/translate/.

2.2.2. ThiCt kC vector biHu hiGn pET22-GEF: Vector biHu hiGn pET22-GEF ?�.c thiCt kC v-i m5c ?ích ?�a c� 3 gien gltA, ech và fcs vào trong cùng m_t vector biHu hiGn, biCn n�p vào tC bào ch6 thích h.p ?H trong ?i:u kiGn môi tr�tng ch7a axit ferulic và các ch3t c�n thiCt cho sU sinh tr�>ng c6a tC bào su diYn ra quá trình tDng h.p vanilin. Vector pET22-GE ?ã ?�.c thiCt kC trong nghiên c7u tr�-c c6a nhóm [15] ?�.c dùng làm vector n:n t�ng ?H thiCt kC vector pET-GEF. S| d5ng 2 enzym gi-i h�n là EcoRI

KHOA H�C CÔNG NGH�

N¤NG NGHIÖP Vµ PH¸T TRIÓN N¤NG TH¤N - KỲ 1 - Th¸ng 8/2016 70

và BamHI ?H c�t v8ng gien fcs tJ vector tách dòng pTZ57R/T-F và ?&ng thti c�t m> vòng vector pET22-GE c�ng bAng hai enzym này. Quy trình thUc hiGn t�#ng tU nh� ?ã mô t� > nghiên c7u tr�-c [15].

2.2.3. Xác ?rnh hàm l�.ng vanilin: Axit ferulic và vanilin ?�.c xác ?rnh ?rnh tính và ?rnh l�.ng bAng ph�#ng pháp HPLC ?�o pha theo quy trình c6a Sinha và cs có c�i tiCn [16]. HG th[ng phân tích HPLC 1260 Agilent ?�.c trang br c_t RP C18 Zorbax (250 mm x 4.6 mm id, 5 µm, Agilent, USA). Dung môi A bao g&m ACN/methanol (v/v = 1: 1) và dung môi B bao g&m n�-c kh| ion/axetic axit (v/v = 99,8: 0,2, pH 2,88). B�-c sóng phát hiGn 280 nm. NhiGt ?_ duy trì trong bu&ng l�u giq c_t là 250C, thH tích tiêm m�u là 20 µL. T[c ?_ dòng: 1 mL/phút. Ch�#ng trình ch�y 23 phút ?�.c thiCt l!p nh� trong b�ng 2.

BBBB����ng 2. Ch�#ng trng 2. Ch�#ng trng 2. Ch�#ng trng 2. Ch�#ng trình chình chình chình ch����y HPLC phân tích axit y HPLC phân tích axit y HPLC phân tích axit y HPLC phân tích axit ferulic và vanilinferulic và vanilinferulic và vanilinferulic và vanilin

Thti gian (phút)

Dung môi A (%)

Dung môi B (%)

0.01 5 95 5 25 75 15 50 50 20 75 25 23 90 10

3. K�T QU� VÀ TH�O LU�N

3.1. T3.1. T3.1. T3.1. Tách dòng và xác ách dòng và xác ách dòng và xác ách dòng và xác ????rrrrnh trình tnh trình tnh trình tnh trình tUUUU gien gien gien gien

3.1.1. Tách dòng và xác ?rnh trình tU gien ech ADN tDng s[ tách chiCt tJ P. fluorescens VTCC-

B-668 (?�tng ch�y 1 hình 2A) ?�.c pha loãng theo các n&ng ?_ ?H lUa ch�n khuôn thích h.p nh3t. � ?_ pha loãng 1/100 (?�tng ch�y hình 2A) cho b8ng sáng và g�n ?�.c lUa ch�n làm khuôn cho PCR. �tng ch�y 1 > hình 2B cho m_t b8ng sáng, rõ có kích th�-c kho�ng 860 bp là s�n phLm PCR gien ech. � hình 2C, ?�tng ch�y 1 => 9 là plasmit c6a các dòng khuLn l�c tr�ng. Các dòng 1, 2, 4, 6, 7, 8, 9 cho vr trí b8ng cao h#n khuLn l�c xanh (?�tng ch�y s[ 10) nên chúng có thH là nhqng dòng mang vector tái tD h.p. Dòng 7, 8, 9 ?�.c lUa ch�n ?H kiHm tra sU có

m�t c6a gien ech trong vector tách dòng bAng c�t enzym gi-i h�n HindIII và SacI do > 2 ?�u c6a gien ech ?�.c thiCt kC ch7a vr trí nh!n biCt c6a hai enzym này. Theo lý thuyCt, nCu gien ech ?�.c g�n vào vector tách dòng thì s�n phLm ph�n 7ng c�t su t�o ra 2 b8ng, m_t b8ng kho�ng 860 bp t�#ng 7ng v-i kích th�-c c6a gien ech và b8ng còn l�i g�n 2,9 kb là vector pTZ57R/T m> vòng (2886 bp). KCt qu� trên hình 2D cho th3y c� 3 dòng 7, 8, 9 ?:u có thH mang gien ech g�n vào vector tách dòng pTZ57R/T.

Hình Hình Hình Hình 2222. . . . ADN tADN tADN tADN tDDDDng sng sng sng s[[[[ c c c c6666a a a a P. fluorescensP. fluorescensP. fluorescensP. fluorescens VTCC VTCC VTCC VTCC----BBBB----668 668 668 668 (A) (A) (A) (A) gien gien gien gien ech ech ech ech ?�?�?�?�....c khuc khuc khuc khuCCCCch ?ch ?ch ?ch ?����iiii ((((BBBB) A) A) A) ADN plasmiDN plasmiDN plasmiDN plasmitttt c c c c6666a a a a các dòng các dòng các dòng các dòng khukhukhukhuLLLLn ln ln ln l����c (C) Pc (C) Pc (C) Pc (C) Plasmilasmilasmilasmitttt tái t tái t tái t tái tDDDD h h h h....p p p p cccc����t t t t bbbbAAAAng ng ng ng

enzym gienzym gienzym gienzym gi----i hi hi hi h����n (C)n (C)n (C)n (C)

(A) �tng ch�y tJ 1-4: T�#ng 7ng v-i các n&ng ?_ pha loãng 1, 1/10, 1/100, 1/1000. (B) M: Thang ADN chuLn 1 kb; ?�tng ch�y : s�n phLm khuCch ?�i gien ech. (C) �tng ch�y 1-9: plasmit c6a các dòng khuLn l�c tr�ng; 10: plasmit c6a dòng khuLn l�c xanh. (D) M : thang ADN chuLn 1 kb ; ?�tng ch�y 1, 2, 3: s�n phLm c�t t�#ng 7ng c6a các dòng 7, 8, 9; ?�tng ch�y 4: plasmit c6a dòng 7 không c�t; ?�tng ch�y 5: s�n phLm PCR gien ech.

Các dòng 7, 8 và 9 ?�.c lUa ch�n ?H xác ?rnh trình tU nucleotit. KCt qu� xác ?rnh trình tU gien ech ?�.c thH hiGn > hình 3.

AGAATTCAGGAGGGCATCGCCAGAATTCAGGAGGGCATCGCCAGAATTCAGGAGGGCATCGCCAGAATTCAGGAGGGCATCGCCATGATGATGATGAGCAACTACGAAGCAACTACGAAGCAACTACGAAGCAACTACGAAGGCCGTTGGACCACAGTCAAGGTTGAGATCGAAGAAGGCATCGCCTGGGTCATTCTCAATCGTCCGGAAAAACGCAACGCCATGAGCCCGACCCTGAACCGGGAAATGATCGACGTCCTGGGAACCCTCGAGCAGGATCCTGCCGCCGGCGTGCTGGTCCTCACCGGTGCGGGCGAAGCCTGGACGGCGGGCATGGACCTCAAGGAATACTTTCGCGAAGTGGATGCCGGCCCGGAAATCCTCCAGGAGAAAATCCGCCGCGAAGCCTCGCAATGGCAATGGAAACTGCTGCGCATGTACGCCAAGCCGACCATCGCCATGGTCAATGGCTGGTGCTTCGGCGGTGGCTTCAGCCCGCTGGTGGCGTGCGACCTGGCGATCTGCGCCGACGAAGCGACCTTCGGCCTTTCGGAAATCAACTGGGGCATCCCGCCGGGTAACCT

KHOA H�C CÔNG NGH�

N¤NG NGHIÖP Vµ PH¸T TRIÓN N¤NG TH¤N - KỲ 1 - Th¸ng 8/2016 71

GGTGAGCAAGGCCATGGCCGACACCGTGGGCCATCGTCAATCGCTGTACTACATCATGACCGGCAAGACCTTTGGCGGGCAGAAAGCCGCCGAAATGGGCCTTGTCAACGAAAGCGTGCCGCTGGCGCAACTGCGCGAAGTGACCATCGAACTGGCGCGTAACCTGCTCGAGAAAACCCCGGTGGTGCTGCGTGCCGCCAAGCATGGCTTCAAGCGCTGCCGCGAACTGACCTGGGAGCAGAACGAGGATTACCTCTACGCCAAGCTCGATCAGTCGCGTCTGCTCGACACCGAAGGCGGTCGCGAGCAGGGCATGAAACAGTTCCTCGACGACAAGAGCATCAAGCCTGGCCTGCAGGCGTATAAACGCCTGCAGGCGTATAAACGCCTGCAGGCGTATAAACGCCTGCAGGCGTATAAACGCTGATGATGATGAGAGCTCGCGAGCTCGCGAGCTCGCGAGCTCGC

Hình Hình Hình Hình 3333.... K K K KCCCCt qut qut qut qu���� xác ? xác ? xác ? xác ?rrrrnh trình tnh trình tnh trình tnh trình tUUUU gien gien gien gien echechechech

Gien ech tách dòng tJ P. fluorescens VTCC-B-668 có kích th�-c 831 bp, > ?�u 5’ có b_ ba mã m> ?�u ATG (g�ch chân) và trình tU m&i xuôi ech-F (in ?!m) và > ?�u 3’ có b_ ba mã kCt thúc TGA (g�ch chân) và trình tU m&i ng�.c ech-R (in ?!m). Phân tích bAng công c5 NCBI BLAST cho th3y trình tU gien ech ?�.c tách dòng có ?_ t�#ng ?&ng 99% v-i trình tU gien ech c6a P. fluorescens JCM5963 (mã s[ DQ119298). Trình tU ech ?�.c drch mã in silico cho th3y gien ?�.c drch mã thành công, không xu3t hiGn stop codon không mong mu[n, ?�m b�o sU biHu hiGn c6a gien này trong tC bào v!t ch6.

3.1.2. Tách dòng và xác ?rnh trình tU gien fcs

Hình 4A cho th3y trong 4 m�u ?�.c tách chiCt, ADN tDng s[ c6a m�u s[ 3 và 4 cho b8ng g�n, sáng, ít ?7t gãy, do ?ó ?�.c lUa ch�n ?H thUc hiGn ph�n 7ng khuCch ?�i gien fcs. Hình 4B ?�tng ch�y s[ 1 có m_t b8ng duy nh3t v-i kích th�-c kho�ng 1580 bp ?úng v-i dU kiCn c6a gien fcs. S�n phLm PCR ?�.c n[i vào vector tách dòng và kCt qu� sàng l�c dòng tái tD h.p thH hiGn trên hình 4C. Chl có plasmit > ?�tng ch�y s[ 1 là có kích th�-c cao h#n kích th�-c c6a khuLn l�c xanh > ?�tng ch�y X. KCt qu� c�t plasmit bAng EcoRI và BamHI > hình 4D cho th3y > vector dòng 1 (?�tng ch�y 2) cho 2 b8ng: m_t b8ng có kích th�-c s�n phLm PCR c6a gien fcs (1580 bp) và m_t b8ng có kích th�-c 2847 bp c6a vector pTZ57R/T, ?i:u ?ó ch7ng ts plasmit dòng 1 là vector pTZ57R/T ?ã g�n ?�.c gien fcs. Dòng 1 ?�.c tiCp t5c xác ?rnh trình tU nucleotit, kCt qu� > hình 5.

Hình Hình Hình Hình 4. ADN t4. ADN t4. ADN t4. ADN tDDDDng sng sng sng s[[[[ t t t tJJJJ AmycolatopsisAmycolatopsisAmycolatopsisAmycolatopsis sp. HR104 sp. HR104 sp. HR104 sp. HR104 (DSM 9991) (A) S(DSM 9991) (A) S(DSM 9991) (A) S(DSM 9991) (A) S����n phn phn phn phLLLLm PCR gien m PCR gien m PCR gien m PCR gien fcs fcs fcs fcs (B), plasmit (B), plasmit (B), plasmit (B), plasmit các dòng nghi ngcác dòng nghi ngcác dòng nghi ngcác dòng nghi ngtttt mang gien mang gien mang gien mang gien fcsfcsfcsfcs (C), c (C), c (C), c (C), c����t plasmit tái t plasmit tái t plasmit tái t plasmit tái

ttttDDDD h h h h....p bp bp bp bAAAAng ng ng ng EcoEcoEcoEcoRI và RI và RI và RI và BamBamBamBamHI (D)HI (D)HI (D)HI (D)

(A) �tng ch�y tJ 1-4: ADN tDng s[ tách tJ b[n [ng c�n x� khuLn. (B) L: Thang ADN chuLn 1 kb; ?�tng ch�y 1: s�n phLm PCR gien fcs. (C) X: plasmit c6a khuLn l�c xanh. �tng ch�y tJ 1->9: plasmit c6a các dòng khuLn l�c tr�ng. (D) L: thang ADN chuLn 1 kb; 1: plasmit dòng 1 không c�t; 2: plasmit dòng 1 c�t bAng EcoRI và BamHI; 3: plasmit khuLn l�c xanh c�t bAng EcoRI và BamHI; 4: plasmit khuLn l�c xanh không c�t

TATATATAATGATGATGATGCGCAACCAGGGTCTCGCAACCAGGGTCTCGCAACCAGGGTCTCGCAACCAGGGTCTGGGGGGCTCCTGGCCGGTGCGCCGCGCCAGGATGAGCCCGCACGCGACAGCCGTCCGGCACGGCGGGACGGCGCTGACCTACGCCGAGCTGTCCCGCCGCGTCGCGCGGCTCGCCAACGGGCTGCGGGCCGCCGGGGTCCGCCCCGGCGACCGGGTGGCCTACCTCGGGCCGAACCACCCGGCCTACCTGGAGACCCTGTTCGCGTGCGGGCAGGCCGGCGCGGTGTTCGTGCCGCTGAACTTCCGGCTGGGCGTCCCGGAACTGGACCACGCGCTGGCCGACTCCGGCGCGTCGGTCCTTATCCACACCCCGGAGCACGCGGAGACGGTCGCGGCGCTCGCCGCCGGCCGGCTGCTGCGCGTGCCCGCGGGCGAGCTGGACGCCGCGGACGACGAGCCGCCCGACCTGCCCGTCGGCCTCGACGACGTGTGCCTGCTGATGTACACCTCGGGCAGCACCGGACGCCCCAAGGGCGCGATGCTCACCCACGGCAACCTCACCTGGAACTGCGTCAACGTCCTGGTGGAGACCGACCTGGCGAGCGACGAGCGGGCACTGGTCGCCGCGCCGCTGTTCCACGCCGCCGCGCTCGGCATGGTGTGCCTGCCCACCCTGCTCAAGGGCGGCACGGTGATCCTGCACTCCGCGTTCGACCCCGGCGCCGTGCTGTCCGCGGTGGAACAGGAGCGGGTCACGCTCGTGTTCGGCGTGCCCACGATGTACC

KHOA H�C CÔNG NGH�

N¤NG NGHIÖP Vµ PH¸T TRIÓN N¤NG TH¤N - KỲ 1 - Th¸ng 8/2016 72

AGGCGATCGCCGCGCACCCGCGGTGGCGCAGCGCCGACCTGTCCAGCCTGCGGACCCTGCTGTGCGGCGGCGCGCCGGTGCCCGCCGACCTCGCCAGCCGCTACCTCGACCGCGGGCTCGCGTTCGTGCAGGGCTACGGCATGACCGAGGCCGCGCCGGGCGTGCTGGTCCTCGACCGCGCGCACGTCGCGGAGAAGATCGGCTCCGCCGGGGTGCCCTCGTTCTTCACCGACGTGCGGCTGGCCGGCCCGTCCGGCGAGCCGGTGCCGCCGGGGGAGAAGGGCGAGATCGTGGTCAGCGGGCCCAACGTGATGAAGGGCTACTGGGGCAGGCCGGAGGCGACCGCCGAGGTGCTGCGCGACGGGTGGTTCCACTCCGGCGACGTGGCCACCGTGGGCGGCGACGGGTACTTCCACGTCGTCGACCGGCTCAAGGACATGATCATCTCCGGCGGCGAGAACATCTACCCGGCCGAGGTGGAGAACGAGCTGTACGGCTACCCGGGTGTGGAGGCGTGCGCCGTGATCGGCGTGCCGGACCCGCGCTGGGGCGAGGTGGGCAAGGCGGTCGTCGTGCCCGCCGACGGGAGCCGCATCGACGGCGACGAGCTGCTGGCCTGGCTGCGCACCCGGCTGGCCGGGTACAAGGTGCCCAAGTCGGTCGAGTTCACCGACCGGCTGCCCACGACCGGCTCCGGCAAGATCCTCAAGGGCGAGGTCCGCCGCCGCTTCGGCTGATGATGATGACCAGGGGCCGATGAACCCCGCTCATGCGGCCCTGCCGGCCCGCTGCGGCTACTCTGTGACGGTTGCGGCTACTCTGTGACGGTTGCGGCTACTCTGTGACGGTTGCGGCTACTCTGTGACGGT

Hình Hình Hình Hình 5555.... K K K KCCCCt qut qut qut qu���� xác ? xác ? xác ? xác ?rrrrnh trình tnh trình tnh trình tnh trình tUUUU gien gien gien gien fcs fcs fcs fcs KCt q6a gi�i trình tU gien fcs cho th3y gien có ?_

dài 1476 bp có b_ ba mã m> ?�u (ATG) và mã kCt thúc (TGA) ?�.c b�o toàn. Gien fcs tách dòng tJ Amycolatopsissp. HR104 có trình tU t�#ng ?&ng 99% v-i ch6ng Amycolatopsis sp. HR167 trên NCBI (mã s[ AJ290449.1) ?�.c dùng ?H thiCt kC m&i. Drch mã in silico gien fcs tách dòng không xu3t hiGn mã kCt thúc không mong mu[n. V!y, ?ã tách dòng thành công gien fcs có thH s| d5ng ?H thiCt kC vector biHu hiGn.

3.23.23.23.2. . . . TTTThihihihiCCCCt kt kt kt kCCCC ve ve ve vecccctor bitor bitor bitor biHHHHu hiu hiu hiu hiGGGGn pET22n pET22n pET22n pET22----GEFGEFGEFGEF

Vector biHu hiGn pET22-GE ?ã ?�.c thiCt kC thành công tJ nghiên c7u tr�-c c6a nhóm [15] ?�.c s| d5ng làm n:n t�ng ?H thiCt kC vector mang c� 3 gien gltA, ech và fcs. Gien fcs ?�.c c�t ra tJ vector tách dòng bAng 2 enzym EcoRI và BamHI và n[i vào pET22-GE.

pET22-GEF

9420 bp

gltA

ech

fcs

lacI

T7 promoter

pBR322 origin

T7 terminator

EcoRI (2331)

BamHI (4121)

HindIII (174)

AAAA BBBB

Hình 6. CHình 6. CHình 6. CHình 6. C3333u trúc theo lý thuyu trúc theo lý thuyu trúc theo lý thuyu trúc theo lý thuyCCCCt ct ct ct c6666a vector pET22a vector pET22a vector pET22a vector pET22----GEF (A), cGEF (A), cGEF (A), cGEF (A), c����t plasmit bt plasmit bt plasmit bt plasmit bAAAAng các tng các tng các tng các tDDDD h h h h....p enzym khác p enzym khác p enzym khác p enzym khác

nhau (B)nhau (B)nhau (B)nhau (B). . . . ����ttttng chng chng chng ch����y L: thang chuy L: thang chuy L: thang chuy L: thang chuLLLLn 1n 1n 1n 1 kb; ?�kb; ?�kb; ?�kb; ?�ttttng ng ng ng chchchch����y Hy Hy Hy H----B: sB: sB: sB: s����n phn phn phn phLLLLm cm cm cm c����t plasmit bt plasmit bt plasmit bt plasmit bAAAAng enzym ng enzym ng enzym ng enzym HinHinHinHindIII dIII dIII dIII

và và và và BamBamBamBamHI; ?�HI; ?�HI; ?�HI; ?�ttttng chng chng chng ch����y Ey Ey Ey E----B: sB: sB: sB: s����n phn phn phn phLLLLm plasmit cm plasmit cm plasmit cm plasmit c����t t t t bbbbAAAAng enzym ging enzym ging enzym ging enzym gi----i hi hi hi h����n n n n EcoEcoEcoEcoRI và RI và RI và RI và BamBamBamBamHIHIHIHI

Hình 6B cho th3y s�n phLm c�t bAng các c�p enzym gi-i h�n cho kCt qu� ?úng nh� tính toán lý thuyCt. Khi c�t plasmit tái tD h.p bAng HindIII và BamHI thu ?�.c hai b8ng có kích th�-c l�n l�.t kho�ng 5,5 kb và 3,6 kb t�#ng 7ng v-i kích th�-c c6a vector pET22 g[c và c5m gien GEF. Khi c�t plasmit tái tD h.p bAng EcoRI và BamHI xu3t hiGn 2 b8ng có kích th�-c l�n l�.t kho�ng 7,6 kb và 1,5 kb t�#ng 7ng v-i kích th�-c c6a vector pET22-GE và gien fcs. KCt qu� này cho th3y ?ã g�n thành công gien fcs vào vector pET22-GE ?H t�o vector biHu hiGn ch7a c� 3 gien mong mu[n là pET22-GEF.

3333....3.3.3.3. K K K KCCCCt qut qut qut qu���� sinh t sinh t sinh t sinh tDDDDng hng hng hng h....p p p p vvvvanilin tanilin tanilin tanilin tJJJJ axit fefulic axit fefulic axit fefulic axit fefulic ssss|||| d d d d5555ng ng ng ng E. E. E. E. ccccolioliolioli tái ttái ttái ttái tDDDD h h h h....p làm tp làm tp làm tp làm tCCCC bào ch bào ch bào ch bào ch6666

3.3.1. ¤nh h�>ng c6a n&ng ?_ axit ferulic ?Cn sinh tr�>ng c6a E. coli

N&ng ?_ axit ferulic cao gây �nh h�>ng x3u ?Cn sinh tr�>ng c6a E. coli [4, 14]. H t[i �u hóa n8ng su3t sinh tDng h.p vanilin tJ axit ferulic tr�-c hCt ph�i xác ?rnh ?�.c n&ng ?_ axit ferulic t[i ?a bD sung vào môi tr�tng nuôi c3y mà không �nh h�>ng ?Cn sinh tr�>ng tC bào. D�i n&ng ?_ axit ferulic ban ?�u ?�.c lUa ch�n th| nghiGm nAm trong kho�ng 1 g/L ?Cn 5 g/L c8n c7 theo m_t s[ nghiên c7u tr�-c [4, 14]. Axit ferulic ?�.c bD sung vào drch nuôi c3y tJ lúc OD260nm ?�t 0,6 và nuôi tiCp 36 tiCng, là kho�ng thti gian nuôi c3y có thH sinh tDng h.p vanilin t[i ?a [14].

KCt qu� trên hình 7 cho th3y n&ng ?_ axit ferulic 3 g/L là n&ng ?_ cao nh3t có thH s| d5ng mà ít gây �nh h�>ng ?Cn sinh tr�>ng c6a tC bào E. coli. KCt qu� này phù h.p v-i công b[ tr�-c [14]. N&ng ?_ 3 g/L axit ferulic ?�.c lUa ch�n cho các b�-c t[i �u hóa tiCp theo.

KHOA H�C CÔNG NGH�

N¤NG NGHIÖP Vµ PH¸T TRIÓN N¤NG TH¤N - KỲ 1 - Th¸ng 8/2016 73

Hình 7. Hình 7. Hình 7. Hình 7. ¤¤¤¤nh h�nh h�nh h�nh h�>>>>ng cng cng cng c6666a na na na n&&&&ng ?ng ?ng ?ng ?____ axit ferulic ban ? axit ferulic ban ? axit ferulic ban ? axit ferulic ban ?����u u u u

vvvv----i sinh tr�i sinh tr�i sinh tr�i sinh tr�>>>>ng cng cng cng c6666a a a a E. coliE. coliE. coliE. coli tái t tái t tái t tái tDDDD h h h h....p mang vector p mang vector p mang vector p mang vector pET22pET22pET22pET22----GEFGEFGEFGEF

3.3.2. rnh l�.ng c# ch3t axit ferulic và vanilin ?�.c tDng h.p tJ hai hG th[ng biHu hiGn pRSET và pET22

Hai dòng E. coli tái tD h.p ch6ng BL21 mang vector pET22-GEF [15] ?�.c s| d5ng ?H sinh tDng h.p vanilin tJ axit ferulic. KCt qu� ?�.c thH hiGn trên hình 8.

Hình 8. Phân tích HPLC Hình 8. Phân tích HPLC Hình 8. Phân tích HPLC Hình 8. Phân tích HPLC ????____ng hng hng hng h����c sc sc sc sUUUU chuy chuy chuy chuyHHHHn hóa n hóa n hóa n hóa

axit ferulic thành vanilin axit ferulic thành vanilin axit ferulic thành vanilin axit ferulic thành vanilin >>>> ch ch ch ch6666ng ng ng ng E. coliE. coliE. coliE. coli BL21 tái t BL21 tái t BL21 tái t BL21 tái tDDDD hhhh....p mang vector pET22p mang vector pET22p mang vector pET22p mang vector pET22----GEF. (I) c# chGEF. (I) c# chGEF. (I) c# chGEF. (I) c# ch3333t ferulic axit t ferulic axit t ferulic axit t ferulic axit và vanilin chuvà vanilin chuvà vanilin chuvà vanilin chuLLLLn; (II) sn; (II) sn; (II) sn; (II) sUUUU chuy chuy chuy chuyHHHHn hóa axit ferulic (FA) n hóa axit ferulic (FA) n hóa axit ferulic (FA) n hóa axit ferulic (FA)

thành vanilin (VA) sau 12 githành vanilin (VA) sau 12 githành vanilin (VA) sau 12 githành vanilin (VA) sau 12 gitttt nuôi c nuôi c nuôi c nuôi c3333y; (Iy; (Iy; (Iy; (III) sII) sII) sII) sUUUU chuychuychuychuyHHHHn hóa FA thành VA sau 36 gin hóa FA thành VA sau 36 gin hóa FA thành VA sau 36 gin hóa FA thành VA sau 36 gitttt nuôi c nuôi c nuôi c nuôi c3333yyyy

DUa trên sU phân tích chuyHn hóa nh� trên > ch6ng E. coli BL21/pET-GEF, chúng tôi ?ã tiCn hành phân tích t�#ng tU v-i ch6ng E. coli BL21 tái tD h.p mang vector pRSET-GEF. HiGu qu� chuyHn hóa

axit ferulic thành vanilin giqa hai hG th[ng vector ?�.c so sánh trên hình 9.

Hình 9. So sánh hiHình 9. So sánh hiHình 9. So sánh hiHình 9. So sánh hiGGGGu suu suu suu su3333t sinh tt sinh tt sinh tt sinh tDDDDng hng hng hng h....p vanilin p vanilin p vanilin p vanilin

ttttJJJJ c# ch c# ch c# ch c# ch3333t axit ferulic st axit ferulic st axit ferulic st axit ferulic s|||| d d d d5555ng các chng các chng các chng các ch6666ng ng ng ng E. coliE. coliE. coliE. coli tái t tái t tái t tái tDDDD hhhh....p mang vector pET22p mang vector pET22p mang vector pET22p mang vector pET22----GEF và pRSETGEF và pRSETGEF và pRSETGEF và pRSET----GEFGEFGEFGEF

Hình 9 cho th3y hG th[ng biHu hiGn trên n:n t�ng vector pET22b(+) có hiGu su3t sinh tDng h.p vanilin ?�t 1,44 g/L cao h#n so v-i m7c 1,17 g/L c6a vector pRSET-A. M_t trong nhqng c# s> có thH lý gi�i hiGn t�.ng này là do > hG th[ng pET22b(+) protein tái tD h.p ?�.c dung h.p v-i trình tU tín hiGu pelB và do ?ó ?�.c ?rnh vr ra ngoài khoang chu ch3t, nht ?ó gi�m ?�.c tác d5ng phân h6y c6a các proteaza n_i bào và t8ng kh� n8ng tiCt ra môi tr�tng. M�t khác, vector pRSET-A v-i ?iHm kh>i ?�u sao chép pUC ?�.c xCp vào nhóm vector có s[ l�.ng b�n sao l-n (kho�ng 500 b�n sao/tC bào) trong khi pET22b(+) v-i ?iHm kh>i ?�u sao chép pBR322 thu_c nhóm s[ l�.ng b�n sao th3p (kho�ng 15 ?Cn 20 b�n sao/tC bào). KCt qu� so sánh 2 hG vector cho th3y s[ l�.ng b�n sao c6a vector không có �nh h�>ng ?Cn m7c ?_ sinh tDng h.p vanilin, phù h.p v-i công b[ tr�-c ?ây c6a Jones và cs [17]. HiGu su3t sinh tDng h.p vanilin trong nghiên c7u c6a chúng tôi cao h#n m7c 500 mg/L [4] khi gien gltA ch�a ?�.c s| d5ng. Dq liGu này góp ph�n kh¬ng ?rnh vai trò c6a gien gltA trong sinh tDng h.p vanilin bAng E. coli tái tD h.p vì gien này giúp tái s| d5ng axetyl-CoA theo chu trình [14].

4. K�T LU�N

Nghiên c7u này ?ã tách dòng và gi�i trình tU thành công gien ech có kích th�-c 831 bp tJ P. fluorescens VTCC-B-668 và fcs có kích th�-c 1541 bp tJ Amycolatopsis sp. HR104 (DSM 9991). Các gien ?�.c tách dòng l�n l�.t có trình tU t�#ng ?&ng 99% v-i các ech c6a P. fluorescens JCM5963 (mã s[ DQ119298) và fcs c6a Amycolatopsis sp. HR167 (mã

KHOA H�C CÔNG NGH�

N¤NG NGHIÖP Vµ PH¸T TRIÓN N¤NG TH¤N - KỲ 1 - Th¸ng 8/2016 74

s[ AJ290449.1) trên ngân hàng dq liGu NCBI. Ba gien ech, fcs và gltA [15] ?ã ?�.c ?�a vào vector pET22b(+) và pRSET-A [15] t�o ra hai vector tái tD h.p pET22-GEF và pRSET-GEF. Các ch6ng E. coli BL21 tái tD h.p mang hai vector pET22-GEF và pRSET-GEF ?ã ?�.c s| d5ng ?H sinh tDng h.p vanilin tJ c# ch3t axit ferulic ?�t m7c l�n l�.t là 1,44 g/L và 1,17 g/L.

TÀI LI�U THAM KH�O

1. Ranadive, A. (1994). Vanilla: cultivation, curing, chemistry, technology and commercial products. Amsterdam: Elsevier Science BV.

2. Lomascolo, A., C. Stentelaire, M. Asther and L. Lesage-Meessen (1999). Basidiomycetes as new biotechnological tools to genrate natural aromatic flavours for the food industry. Trends Biotechnol. 17171717(7): 282-289.

3. Sinha, A. K., U. K. Sharma, and N. Sharma (2009). A comprehensive review on vanilla flavor: extraction, isolation and quantification of vanillin and others constituents. International journal of food sciences and nutrition.

4. Yoon, S.-H., C. Li, Y.-M. Lee, S.-H. Lee, S.-H. Kim, M.-S. Choi, W.-T. Seo, J.-K. Yang, J.-Y. Kim and S.-W. Kim (2005). Production of vanillin from ferulic acid using recombinant strains of Escherichia coli. Biotechnology and Bioprocess Engineering 10(4): 378-384.

5. Muheim, A. and K. Lerch (1999). Towards a high-yield bioconversion of ferulic acid to vanillin. Applied Microbiology and Biotechnology, 51(4): p. 456-461.

6. Achterholt, S., H. Priefert, and A. Steinbüchel (2000) Identification of Amycolatopsis sp. strain HR167 gens, involved in the bioconversion of ferulic acid to vanillin. Applied microbiology and biotechnology. 54(6): p. 799-807.

7. Plaggenborg, R., A. Steinbüchel, and H. Priefert (2001). The coenzym A-dependent, non-β-oxidation pathway and not direct deacetylation is the major route for ferulic acid degradation in Delftia acidovorans. FEMS microbiology letters. 205(1): p. 9-16.

8. Plaggenborg, R., J. Overhage, A. Steinbüchel and H. Priefert (2003). Functional analyses of gens involved in the metabolism of ferulic acid in

Pseudomonas putida KT2440. Applied microbiology and biotechnology 61(5-6): 528-535.

9. Sutherland, J. B., D. L. Crawford, and A. L. Pometto III (1983). Metabolism of cinnamic, p-coumaric, and ferulic acids by Streptomyces setonii. Canadian journal of microbiology. 29(10): p. 1253-1257.

10. Narbad, A. and M. J. Gasson (1998). Metabolism of ferulic acid via vanillin using a novel CoA-dependent pathway in a newly-isolated strain of Pseudomonas fluorescens. Microbiology. 144(5): p. 1397-1405.

11. Choi, J.-I., S. Y. Lee, K. Shin, W. G. Lee, S. J. Park, H. N. Chang and Y. K. Chang (2002). Pilot scale production of poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxy-valerate) by fed-batch culture of recombinant Escherichia coli. Biotechnology and Bioprocess Engineering 7(6): 371-374.

12. Choi, J. -I. and S. Y. Lee (2004). High level production of supra molecular weight poly (3-hydroxybutyrate) by metabolically engineered Escherichia coli. Biotechnology and Bioprocess Engineering. 9(3): p. 196-200.

13. Kim, J. -Y. and D. D. Y. Ryu (1999). Physiological and environmental effects on metabolic flux change caused by heterologous gien expression in Escherichia coli. Biotechnology and Bioprocess Engineering. 4(3): p. 170-175.

14. Lee, E. G., S. H. Yoon, A. Das, S. H. Lee, C. Li, J. Y. Kim, M. S. Choi, D. K. Oh and S. W. Kim (2009). Directing vanillin production from ferulic acid by increased acetyl-CoA consumption in recombinant Escherichia coli. Biotechnol. Bioeng. 102(1): 200-208.

15. Ma Thr Trang, L�#ng Thr Thu H�tng, Lê Qu�nh Hoa, D�#ng V8n C�tng (2015). Tách dòng, gi�i trình tU và thiCt kC vector biHu hiGn các gien mã hóa các enzym tDng h.p vanilin tJ axit ferulic. T�p chí Nông nghiGp và Phát triHn nông thôn. Chuyên ?: Phát triHn b:n vqng nông nghiGp, nông thôn trung du, mi:n núi phía B�c. Tr. 274-283.

16. Sinha A. K. 1, Verma S. C., Sharma U. K. Development and validation of an RP-HPLC method for quantitative determination of vanillin and related phenolic compounds in Vanilla planifolia. J. Sep. Sci. 2007 30(1):15-20.

KHOA H�C CÔNG NGH�

N¤NG NGHIÖP Vµ PH¸T TRIÓN N¤NG TH¤N - KỲ 1 - Th¸ng 8/2016 75

17. Jones, K. L., Kim, S. W., Keasling, J. D. Low-copy plasmits can perform as well as or better than

high-copy plasmits for metabolic engineering of bacteria. Metabolic engineering. 2000 4(2):328-38.

BIOSYNTHESIS OF VANILLIN FROM FERULIC ACID USING RECOMBINANT BIOSYNTHESIS OF VANILLIN FROM FERULIC ACID USING RECOMBINANT BIOSYNTHESIS OF VANILLIN FROM FERULIC ACID USING RECOMBINANT BIOSYNTHESIS OF VANILLIN FROM FERULIC ACID USING RECOMBINANT E. coliE. coliE. coliE. coli

Duong Van CuongDuong Van CuongDuong Van CuongDuong Van Cuong1,21,21,21,2, Le Thi Quynh Hoa, Le Thi Quynh Hoa, Le Thi Quynh Hoa, Le Thi Quynh Hoa1111 1 Faculty of Biotechnology and Food Technology, Thai Nguyen University of Agriculture and Forestry

2 Division of Molecular Biology, Institute of Life Sciences, Thai Nguyen University

SummarySummarySummarySummary Vanillin is used in a wide range of the fields such as food industry, cosmetics and pharmaceuticals. It is estimated about 12,000 ton vanillin are consumed all over the world every years. The capacity of worldwide natural vanillin production is about 50 ton, which responds only for about 1% commerical demand and the rest generated from artificial synthesis. According to the USA and Europe regulations, artificial vanillin is not considered as equivalent as natural vanillin. The price of 1 kg of natural vanillin oscillates in a range from 1200 to 4000 $, while that of artificial vanillin is only about 15$. To fill the demands of natural vanillin which is being deficient critically, it is necessary to apply gientic engineering to improve genome of some organisms for constructing recombinant strains which are able to produce this compound. Biosynthesis pathway of vanillin from ferulic acid is carried out by two enzymes: feruloyl-CoA synthetase and enoyl-CoA hydratase/aldolase which are responsible for catalysis of conversion of ferulic acid to feruloyl-CoA and feruloyl-CoA to vanilin, respectively. In this study, fcs (1476 bp) and ech (831 bp) giens were cloned from Amycolatopsis sp HR104 and Pseudomonas fluorescens VTCC-B-668, respectively. The sequences of cloned gens are 99% homologous to previously published sequences on NCBI. In silico translation of cloned gens resulted in translatable sequences without critical error of unexpected stop codon. Three gens including ech, fcs and gltA from our previous work were contructed into pET22b(+) and pRSET-A vector resulted in pET22-GEF and pRSET-GEF recombinant vectors. The amount of vanillin synthesized by recombinant E. coli BL21 harborring pET22-GEF and pRSET-GEF, fed by 3% ferulic acid, were 1.44 g/L and 1.17 g/L, respectively. This study enables fermentation work to synthesize vanillin from ferulic acid.

Keywords:Keywords:Keywords:Keywords: Vanillin, feruloyl-CoA synthetase, enoyl-CoA hydratase/aldolse.

Ng�Ng�Ng�Ng�tttti phi phi phi ph����n bin bin bin biGGGGn: PGS.TS. Nguyn: PGS.TS. Nguyn: PGS.TS. Nguyn: PGS.TS. NguyYYYYn V8n n V8n n V8n n V8n &&&&ngngngng

Ngày nhNgày nhNgày nhNgày nh!!!!n bài:n bài:n bài:n bài: 4/02/2016

Ngày thông qua phNgày thông qua phNgày thông qua phNgày thông qua ph����n bin bin bin biGGGGn:n:n:n: 4/3/2016

Ngày duyNgày duyNgày duyNgày duyGGGGt ?8ng:t ?8ng:t ?8ng:t ?8ng: 11/3/2016