o a ografi lapis Tipis Preparatif pada Pelat Silika

o a ografi lapis Tipis Preparatif pada Pelat Silikaomatografi Cairan Kinerja Tinggi pad a Kolom C18

a . Senyawa-Senyawa Hasil Biokonversi Solasodine

PENDAHULUAN

J. Kantasubrata'], T.Y. Fitrl**), V.A. Halomoan**>,Buchori**>, dan A.T.Karossl*)

*) Puslitbang Kimia Terapan - L1PI, Jalan Cisitu, Bandung 40135

**) Departernen Kimia - ITB, Jalan Ganesha 10, Bandung 40132

INTISARI

Pemisahan campuran hasil biokonversi solasodin olehMycobacterium phlei DSM 43286 telah dilakukan pada kroma-tografi preparatif lapis tipis (KLT preparatij) di atas pelat silika;menggunakan campuran kloroform-etanol (48:1) sebagai eluen.Pemerlksaan kembali secara kromatogrofi telah pula dilakukanterhadap senyawa-senyawa yang berhasil dipisahkan denganKLT preparatif ini. Selain menggunakan fasa diam silika, telahdijajagi pula pemisahan campuran hasil biokonversi mengguna-kan fasa diam CiS' Standar solanesol dan enam macam derivatandrostan atau androsten -dapat dipisahkan dengan baik padapelat CiS menggunakan eluen metanol-kloroform (4:1). Untukpemisahan Kromatografi Cairan Kinerja Tinggi (KCKT) pada. kolom Cup - telah digunakan campuran pelarut metanol-air,karena dengan campuran pelarut metanol-kloroform seperti ter-sebut diatas, senyawa yang akan dipisahkan keluar bersamaandengan puncak pelarut. Resolusi pemisahan yang optimal darihasil biokonversi solasodin baru dapat dicapai apabila digunakanteknik elusi gradien menggunakan campuran pelarut metanol-air.

ABSTRACT

The separation of solasodine bioconversion products -afterfermentation with Mycobacterium phlei DSM 43286 has beencarried out, using preparative thin layer chromatography onsilica plate with chloroform-ethanol (48:1) mixture as an eluent.Chromatographic cross check of the compound being separatedhas also been done. In addition to the silica stationary phase, theseparation of bioconversion products using CIS has also beenexplored. Solanesol and six derivatives of androstane or andros-tene standards could be well separated on Ci8 plate usingmethanol-chloroform (4:1). For the High Performance LiquidChromatography (HPLC) separation on Ci8 column, the mixtureof methanol-water was used instead of methanol-chloroform,since with the latter eluent, compounds being separated wereeluted together with the solvent peak. The optimum resolution ofsolasodine bioconversion products could only be attained whenthe gradient elution technique using the mixture of methanol-water was used.

JKTI, VOL. 4 - No.2, Desember, 1994

Proses biokonversi solasodin oleh Mycobacterium phleiDSM 43286 dilakukan dalam upaya mendapatkan senyawaantara seperti AD (4-androstene-3,17-dione) dan ADD(1,4-androsta-diene-3,17-dione) yang merupakan prekursorpada pembuatan obat antifertiIitas (1). Untuk dapat me-mantau terbentuknya senyawa hasil biokonversi, dibutuh-kan suatu metoda yang dapat memisahkan dan mendeteksisubstrat dari senyawa yang terbentuk pada proses tersebut.Dalam hal ini metoda kromatografi merupakan pilihanyang paling tepat.

Dari hasil tinjauan pustaka yang telah dilakukan se-belumnya, tidak ditemukan adanya metoda pemisahan KLTdan KCKT untuk senyawa solasodin, AP dan ADD. Olehsebab itu pada penelitian ini dicoba yntuk mengembangkansuatu metoda pemisahan tersebut menggunakan kroma-.tografi fasa normal (KFN) dan kromatografi fasaterbalik(KFT) (2,3).

Pad a penelitian tahap pertama, telah dilaporkan hasilpemisahan pada KFN (4,5), menggunakan fasa diam silikadalam kombinasinya dengan beberapa jenis campuranpelarut sebagai fasa gerak, diantaranya campuran pelarutheksana-isopropanol (85:15) dan kloroform-etanol (48:1).Karena campuran pelarut diatas dianggap dapat memberi-kan hasil yang paling optimal, ditinjau dari segi resolusipemisahan, waktu analisa dan nilai UV-Cut-OJf pelarut (2),maka kedua campuran pelarut tersebut pcrnah digunakanuntuk memantau terbentuknya senyawa AD dan ADD darisatu sericontoh campuran hasil biokonversi.

Pada kromatogram contoh campuran hasil biokonvcrsidari studi terdahulu (2), terlihat adanya puncak yang mem-punyai waktu retensi sarna dcngan standar AD. Dalamusaha mcngkonfirmasikan puncak tersebut, tclah digunakandetektor diodearray. Tetapi ternyata hasil konfirmasi pun-cak masih menunjukkan adanya perbcdaan antara spektrumserapan puncak yang diduga AD dengan spektrum serapanstandar AD. Dengan demikian besar kemungkinan bahwasenyawa hasil biokonversi yang scmula diduga AD adalahsenyawa antara (intermediate) yang dapat berupa salah satuderivat AD atau suatu senyawa lain yang sarna sekali bukansenyawa AD atau derivatnya.

13

Untuk dapat menjawab kemungkinan ini, telah diusaha-kan suatu pendekatan dengan jalan melakukan pemisahandari 8 macam derivat senyawa solasodin, androstan danandrosten, menggunakan eampuran pelarut yang umumdipakai untuk pemisahan steroid (5-11). Pada penelitiantahap kedua, telah dilaporkan hasil pemisahan KFN darike-S campuran senyawa standar tersebut (3), sedangkandalam penelitian ini akan dibahas basil pemisahannya padaKFT.

Sama halnya seperti pada KFN, pada KFT pemisahanmula-mula dilakukan di atas pelat kromatografi lapis tipis(KLT). Kondisi pemisahan KLT yang memberikan hasilcukup baik ditransposisikan pada kromatografi cairankinerja tinggi (KCKT) dan selanjutnya dapat dipakai untukmenganalisa eampuran hasil biokonversi guna mendeteksiterbentuknya senyawa yang kemungkinan mempunyairetensi sama dengan salah satu dari ke-8 standar di atas.

Selain itu agar senyawa-senyawa hasil biokonversi yangterbentuk. dapat diidentifikasi secara tepat, dilakukan kro-matografi preparatif dari eampuran hasil biokonversi.Senyawa tersebut dapat dipisahkan melalui KLT preparatifatau KCKT dalam skala semi preparatif. Untuk dapatbekerja dalam skala preparatif atau semi preparatif, perludicari terlebih dahulu kondisi pemisahan campuran se-nyawa hasil biokonversi dalam skala analitik. Kondisi yangdiperoleh dapat diaplikasikan kemudian untuk pemisahandalam skala yang lebih besar.

Dari hasil-hasil pemisahan sebelumnya, diperoleh databahwa pola pemisahan dari eampuran hasil biokonversieukup menyebar karena kepolaran dari senyawa-senyawayang terbentuk dalam eampuran tersebut sangat bervariasi.Di atas suatu pelat KLT, hal ini tidak akan menimbulkanmasalah yang eukup berarti, tetapi tidak demikian halnyauntuk KCKT. Pada kolom KCKT, perbedaan kepolaranyang relatif besar dari senyawa yang akan dipisahkan me-nyebabkan proses elusi harus dilakukan secara gradien.

BAHAN DAN METODA

Bahan yang digunakanStandar Sola sod in, Solanesol, 4-androsten-3,17-dion

(AD), 1,4-androsta-dien-3,17-dion (ADD), 1,4,9,(11)-androstatrien-3,17-dion, So-androstan-Sfl.Ll.Bd Zll-triol,5a-androstan-3,17-dion, dan 5-androsten-3B,17B-diol dibelidari SIGMA. Pelat/kolom analitik yang dipakai adalahpelat Silika GF254 (EM 5554), pel at RP-18F254 (EM 5553),kolom Liehrosorb Si60 (Sum) (EM 50388) dan kolom IA-Bondapak C18, WATERS. Pelarut yang digunakan sebagaikomposisi eluen diperoleh dari E.MERCK dan larutanbufer tris dibuat dengan melarutkan sejumlah tris (hidrok-simetil) aminometana (SIGMA T-1503) dalam air hinggakonsentrasi 1 M. Sejumlah volume larutan 1 Mini di-eneerkan hingga mencapai konsentrasi yang diinginkan dan

14

pH diatur dengan larutan HCI 0,1 M hingga meneapai nilaipH7 ± 0,1.

PeralatanPeralatan KLT terdiri dari alat pembuat lapisan tipis

(spreader), pipa kapiler, templet, bejana kromatografi, alatpenyemprot, lampu UV dengan panjang gelombang 254 nmdan 366 nm. Satu unit peralatan KCKT WATERS ALC/GPC 244 terdiri dari: Pompa, Pengatur Elusi Gradien,Detektor UV dan Rekorder. Satu unit peralatan KCKTSHIMADZU LC 6A lengkap dengan detektor spectro-diode-array SPD M6A, Komputer IBM dan Printer P 5300.

Persiapan Contoh

Contoh eampuran hasil fermentasi mula-mula dipisah-kan dari biomassa/selnya dengan sentrifugasi, kemudianfiltratnya diekstraksi dengan kloroform sebanyak 3 kali,setiap kali dengan setengah volum cairan media. Lapisankloroform dikumpulkan, dicuci dengan larutan asam oksa-lat 2%. Kelebihan asam oksalat dieuci dengan air. Ekstrakkloroform yang diperoleh dikeringkan dengan Na2S04anhidrat, kemudian dievaporasi hingga kering dan dilarut-kan kembali dalam metanol atau kloroform, disesuaikandengan eluen yang digunakan.

Pemisahan Campuran Hasil Biokonversi menggunakanKromatografi PreparatifLapis Tipis

Untukkeperluan kromatografi preparatif, disiapkanpelat berukuran 20 x 20 em dengan eara sebagai berikut:ditimbang 50 gr silika gel 60 yang mengandung indikatorfluoresensi dan dilarutkan dalam 110 ml aquadest. Cam-puran yang terbentuk dituangkan ke dalam alat pembuatlapisan tipis dan ditebarkan di atas beberapa pelat gel asberukuran 20 x 20 em, dengan ketebalan 0,5 mm. Untukmelihat unjuk kerja pelat preparatif buatan laboratorium,maka kondisi pemisahan senyawa-senyawa standar yangdiperoleh pada pelat analitik (3) dicobakan terlebih dahuludi atas pelat preparatif.

Pelat hasil elusi mula-mula dilihat di bawah lampu UVpada panjang gelombang 254 nm. Senyawa AD, ADD dan1,4,9,(11)-androstatriene-3,17-dione akan tampak sebagainoda berwama ungu. Senyawa lainnya tidak dapat ter-deteksi dengan eara ini sehingga untuk mendeteksinya,pel at disemprot dengan pereaksi asam sulfat 50% dalametanol, yang disiapkan dengan menambahkan 5 ml H2S04pekat tetes demi tetes kedalam 5 ml etano\. Campuran inikemudian didinginkan dan disemprotkan pada pelat yang

okemudian dipanaskan dalam oven 80 C selama 10 menit.Seluruh senyawa akan tampak sebagai noda denganberbagai maeam wama.

Sebelum dilakukan pemisahan di atas pelat preparatif,beberapa eontoh campuran hasil biokonversi dari waktufermentasi yang berbeda-beda ditotolkan berdampingandalam suatu pelat analitik. Contoh hasil biokonversi denganpola pemisaban bampir sama dikumpulkan menjadi satu.

JKTJ, VOL. 4 - No.2, Desember, 1994

Kemudian dengan menggunakan kondisi pemisahan yangsarna, eampuran contoh di atas dicoba dipisahkan di ataspelat preparatif. Sebagai eluen digunakan 2 maeam eam-puran peIarut yaitu campuran kloroform-etanol (48:1) dancampuran CCl4-butanol (15:2). Campuran pelarut yang per-tama dipilih karena merupakan eluen yang dapat memisah-kan cukup baik solasodin, solanesol dan 6 macam derivatandrostan atau androsten di atas pelat analitik, sedangkaneampuran peIarut yang kedua dipilih karena merupakaneIuen yang dapat memberikan resolusi pemisahan palingbaik untuk contoh hasil biokonversi. Noda yang terdeteksicukup jelas di bawah lampu UV 254 nm, dikumpulkanseeara terpisah, diekstraksi menggunakan pelarut kloro-form, disaring dan pelarutnya diuapkan kembali mengguna-kan rotary evaporator.

Senyawa yang berhasil dipisahkan dicoba ditotolkankembali di atas pelat analitik untuk mengkonfinnasikanbahwa memang senyawa hasil pemisahan tersebut hanyaterdiri dari satu noda. Untuk itu dicobakan beberapa jeniseluen dengan kepolaran yang berbeda. Jenis eluen dipilihdari kumpulan sebelas macam eluen yang pemah dilapor-kan dapat memisahkan solasodin, AD dan ADD denganbaik (2).

Pemisahan Solasodin, Solanesol dan Derivat SenyawaAndrostan atau Androsten pada Pel at dan Kolom CIS.

Pada pemisahan ini digunakan pelat RP-18F254 yangmengandung indikator fluoresensi. Penotolan dilakukan diatas pelat menggunakan pipa kapiler.

Komposisi pelarut yang optimal, dieari dengan jalanmemodifikasi eampuran pelarut yang dapat memisahkancukup baik solasodin, AD dan ADD, yang pemah diperolehpad a pekerjaan terdahulu (1). Apabila harga hRc yangdiperoleh belum cukup memadai, maka dilakukan modi-fikasi jenis dan komposisi pelarut, didasarkan pada dereteluotropik pelarut. Elusi dilakukan dalam bejana kromato-grafi dengan jarak elusi 7 em.

Kondisi pemisahan yang diperoleh pada pelat KLTkemudian dipakai untuk kolom KCKT. Pada pemisahanKCKT kecepatan aliran eIuen diatur 1 mL/menit, deteksidilakukan dengan detektor UV pada panjang gelombang254 nm dan kecepatan kertas pada rekorder 1 cm/menit,Dengan menggunakan detektor diodearray dibuat spektrumsera pan dari senyawa standar di atas, agar apabila diper-lukan dapat dibandingkan dengan spektrum dari satu ataulebih puncak pada kromatogram larutan contoh, yangmempunyai waktu retensi sarna dengan senyawa standartersebut.

Pemisahan Campuran Basil Biokonversi pada KolomCI8 menggunakan Elusi Gradien.

Dalam upaya mencari kondisi elusi yang optimal untukkolom KCKT, dicoba melakukan elusi gradien meng-gunakan campuran pelarut metanol dan air. Pada elusi


gradien ini, kecepatan aliran eluen diatur 1 mL/menit dandeteksi dilakukan dengan detektor UV pada panjanggelombang 254 nm. Kondisi elusi yang optimal ditetapkanberdasarkan pola pemisahan puncak-puncak hasil bio-konversi yang paling ideal dan kondisi tersebut diaplikasi-kan kemudian pada beberapa contoh hasil biokonversidengan waktu fennentasi yang berbeda.

HASIL DAN DISKUSIPemisahan Campuran Basil Biokonversi menggunakanKromatografi Preparatif Lapis Tipis

Dari hasil percobaan sebelumnya, telah dilaporkanbahwa delapan senyawa derivat solasodin dan derivatandrostan atau androsten dapat dipisahkan dengan baikpada pelat silika skala analitik menggunakan eampuranklorofonh-etanol (48:1) sebagai eIuen (3). Pelat preparatifbuatan laboratorium telah diuji unjuk-kerjanya terhadappemisahan delapan maeam standar ini, Resolusi pemisahanyang diperoleh temyata cukup baik, hampir menyamai hasilpemisahan di atas pelat analitik seperti ditunjukkan padaTabeI 1.

Tabel1: Perbandingan Nilai hRf dari Solasodin, Solanesol danDerivat Senyawa Androstan atau Androsten padaPelat Analitik Siap Pakai (MERCK 5554) dan PelatPreparatifBuatan Laboratorium

No-da

Nama Senyawa hRf noda pada pelat

Analitik Preparatif

1 5a-androstan-3~, 11~, 17~-triol 10 7

2 Solasodin 29 203 5-androsten-3~, 17~-diol 37 26

4 1,4-androsta-dien-3, 17 -dion (ADD) 46 38

5 1,4,9, (1l)-androstatrien-3, 17-dion 60 45

6 4-androsten-3, 17-dion (AD) 66 547 5a-androstan-3,17-dion 80 75

8 Solanesol 94 84

Data ini memberikan dukungan bahwasanya apabilamemang akan dilakukan kromatografi preparatif, pelatyang disiapkan di laboratorium ini akan dapat digunakandalam kombinasinya dengan jenis eluen yang memberikanresolusi pemisaban cukup baik pada pelat analitik.

Untuk melihat kesamaan dan perbedaan basil yangdiperoleb dari contoh-contoh dengan waktu fennentasiyang berbeda, maka sebelum dilakukan kromatografipreparatif, contoh eampuran hasil biokonversi ditotolkanterlebih dabulu di atas pelat analitik.

15

Dengan membandingkan pola pemisaban yang diper-oleh dari satu contoh hasil fermentasi yang sama, dapatterlihat bahwa campuran kloroform-etanol (48:1) dapatmemberikan pemisahan yang relatif lebih baik dari cam-puran CCl4-butanol (15:2) (Gambar 1).

A

00 0 0 00 a000 0 0 0 0

B

0 0 000 00

0 00 o a OCl0 o a o 000

oxoYoz

96 120 144 168 'Q2 216 21lJ 96 120 144 168 192 216 2IlJ

Gambar 1:Pemisahan contoh campuran hasilbiokonversi pada pelat silika. Deteksi Dadadilakukan di bawah lampu UV 254 nm.A: menggunakan CCI. - Butanol (15:2)B: menggunakan kloroform - etanol (48:1)

Gambar 2: Pemisah-an contoh 'campuranhasil biokonversipada pelat prepara-tif.

Untuk itu campuran kloroform-etanol (48:1) Ill) yangselanjutnya digunakan pada pengerjaan preparatif. Di ataspelat preparatif buatan laboratorium, pola pemisahan yangdiberikan menjadi sedikit berbeda seperti tampak padaGambar2.

Karena jumlah senyawa Y dan Z (Gambar 2) relatifkecil, maka hanya noda X yang diidentifikasi lebih lanjut.Kemurnian senyawa diperiksa pada pelat silika KLT;menggunakan 4 komposisi pelarut yang berbeda sebagaie1uen. Keempat komposisi pelarut tersebut terdiri dari eluenyang digunakan sebeiumnya untuk mengelusi pelat prepa-ratif dan tiga lainnya dipilih dari kumpulan sebelas pelarutyang memisahkan dengan baik solasodin, AD dan ADD(1,2), yang diperkirakan dapat memberikan nilai hRr kecil,sedang dan relatif besar. Hasil pemisahan yang diperolehditunjukkan pada Tabel 2 dan dari hasil pemeriksaan inimemang hanya diperoleh satu noda.

Tabel 2. Pemeriksaan Kemurnian Senyawa X Hasil Kroma-tografi Preparatif (pada pelat preparatif dengan eluenkloroform-etanol = 48:1, hRf noda senyawa X ini =22).

Jenis dan Komposisi Pelarut hRfA. CCl4-Butanol 16

15 : 2B. CCI4-Etilasetat-Metanol 36

10 : 2 : 1C. CCI4-2-Propanol 33

7 : 1D. n-Heksana-Aseton 83

47 : 53

16

Spektrum sera pan UV dari senyawa X diberikan padaGambar 3 dan apabila spektrum tersebut dibandingkan dengaaspektrum serapan crude solasodin yang digunakan sebagaisubstrat (Gambar 4), terlihat adanya perbedaan. Senyawa Xmemberikan serapan yang relatif besar pada daerah panjaoggelombang antara 231,7-248,5 nm, 'sedangkan crude solasodinmemberikan sera pan yang relatif besar pada daerah panjanggelombang antara 220 - 238,5 nm.

4,50

264 282 300210 228PANJANG GElC).1BANG(nm)

Gambar 3: Spektrum Serapan Senyawa X hasil kromatografi preparatif

z

~c::w(j')

. 210 288 '314 340236 262PANJANG GELOMBANG (nrn)

Gambar 4: Spektrum Serapan crude solasodin;

Hasil pemeriksaan menggunakan KCKT, menunjukkanadanya satu puncak (X) yang relatif besar, meskipuntampak juga 4 puncak lainnya (yang ditunjukkan dengantanda panah) yang relatif kecil, sebagai ketidakmumianyang masih mengotori senyawa X (Gambar 5).

Apabila dibandingkan dengan hasil penelitian yangpernah dilaporkan sebe1umnya (1,2), dapat disimpulkanbabwa senyawa X ini adalah solasodin yang sudabmengalami perubaban, karena data retensi (tr) maupunbentuk puncak kromatogram dari senyawa X pada kolomC18 jaub berbeda dengan 1r/bentuk puncak solasodin.


x

Gambar 5: Kromatogram senyawa X (Ir 9,2 men it) pada KCKTKolom: C1SEhlen: Asetonitril-larutan bufer tris 0,03 M (80:20).Kecepatan aliran eluen: 1,5 mllmenitDetektor: UV 254 nm

Se1anjutnya dari hasil yang pernah dilaporkan sebelumnya(2), apabila digunakan campuran asetonitril-larutan bufertris 0,03 M (80:20) dengan kecepatan aliran eluen 4mL/menit, solasodin akan keluar sebagai puncak yangberekor derigan waktu retensi 10,275 menit, sedangkansenyawa X sudah dapat terelusi keluar dengan wakturetensi 9,2 menit, sekalipun hanya digunakan kecepatanaliran e1uen 1,5 mL/menit. Bentuk puncak senyawa X padakromatogram jauh 1ebih baik dibandingkan dengan bentukpuncak solasodin.

Pemisahan Solanesol dan Derivat Senyawa Androstanatau Androsten pada Pelat dan Kolom C18•

Solanesol dan 6 macam derivat androstan atau andros-ten dapat dipisahkan dengan baik pada pelat C1S m.eng-

3~1,,<ii5786

2

08

-

Gambar6:Pemisahan solanesol dan derivat androstanatau androsten pada pelat RP-18.Eluen: metanol-kloroform (4:1).1 = So-androstan-Sp, ll~, 17~-trio!.2 = solasodin. 3 = 5-androsten-3~, 17~-dio!.4 = 1,4-androsta-dien-3,17-dion (ADD).5 = 1,4,9, (1l)-androstatrien-3, 17-dion.6 = 4-androsten-3, 17-dion (AD)7 = 5a-androsten-~,17-dion.8 = Solanesol HRf noda 1 = 77; 3 = 74;

4 = 68; 5 = 71; 6 = 64; 7 = 60; 8 = 26.


gunakan campuran metanol-kloroform (4:1) sebagai eluen.Resolusi pemisahan dapat dilihat pada Gambar 6 di bawahini. Noda 4,5 dan 6 dapat dideteksi di bawah lampu UV254 nm, sedangkan noda lainnya baru tampak apabila pel atdisemprot dengan larutan 50% H2S04 dalam etanoI. Wamanoda 1: violet, noda 3: abu-abu, nod a 4: jingga, noda 5:merah, noda 6: hijau, noda 7: kuning dan noda 8: merahmuda. Dengan kondisi pemisahan di atas, solasodin(senyawa 2) tidak berhasil dipisahkan dengan baik karenabentuk nodanya yang memanjang dan berekor. Hal inimemberikan indikasi bahwa sclasodin ditahan relatif kuatoleh fasa diam dan seharusnya untuk mengelusi solasodinhingga diperoleh bentuk noda yang ideal dibutuhkan eluendengan kepolaran yang relatif lebih rendah dari campuranmetanol-kloroform (4:1). Meskipun tentunya pelarut yangrelatif non-polar akan memberikan dampak resolusi yang1ebih buruk untuk :senyawa-senyawa yang sudah dapatterpisah dengan baik.

Pada saat campuran pelarut metanol-kloroform (4:1)digunakan sebagai eluen untuk pemisahan KCKT, timbulpermasalahan yang lain. Temyata dengan campuran pelarutini senyawa yang dipisahkan keluar bersamaan denganpuncak pelarut. Untuk itu kemudian dicari komposisipelarut yang justru relatif lebih polar agar senyawa yangdipisahkan dapat lebih ditahan oleh kolom. Berdasarkanalasan ini dipilih kemudian campuran metanol-air (80:20)sebagai eluen.

Selain itu, pada saat kondisi pemisahan KLT dipakaiuntuk pemisahan KCKT ditemui adanya kendala untukmendeteksi beberapa senyawa. Hal ini disebabkan karenatidak semua senyawa memberikan penyerapan di daerahUV, sedangkan untuk keperluan deteksi di atas pelat,kendala tersebut dapat teratasi dengan jalan menyemprotpelat menggunakan pereaksi pewama noda yang spesifikuntuk steroid. Oleh karena itu pemisahan KCKT hanyadapat dilakukan untuk senyawa-senyawa yang menyerapbaik pada panjang gelombang 254 nm, seperti tampak padaGambar7.

6

4Gambar 7:Pemisahan KCKT dari 5a-androstan-3, 17-dion, AD danADD. Kolom: u-BondapakC1S WATERS. Eluen: Meta-nol-air (80:20). Kecepatanaliran eluen: 1 mUmenit.Detektor: UV pada panjanggelombang 254 nm. Puncak4: ADD Ir = 3,96 menit. Pun-

cak 6: AD tr = 4,56 men it.Puncak 7: 5a-androslane-3,17-dione Ir = 5,54 menit to =2,88 men it, ditentukan denganjalan menginjeksikan 20 fll-pelarut metano!'

7

17

Solanesol sebenamya dapat terdeteksi pada panjanggelombang 254 nm, akan tetapi dengan kondisi kroma-tografi di atas, solanesol belum berhasil dielusi. Tampak-nya untuk dapat mengelusi secara optimal semua senyawa,diperlukan teknik elusi gradien. Dengan demikian resolusipemisahan yang sudah relatif baik dari sebagian campuransenyawa akan dapat tetap dipertahankan, sedangkan per-masalahan elusi yang masih harus diselesaikan untuksenyawa yang tertahan relatif kuat dalam kolom akan dapatpula di atasi.

Dengan detektor diodearray dapat dibuat spektrumserapan dari ketiga senyawa di atas (Gambar 8). Bentukdari spektrum serapan ini dapat digunakan untuk meng-konfirmasikan puncak kromatogram yang mempunyaiwaktu retensi sama dengan salah satu dari waktu retensiketiga senyawa tersebut

240 260 320280 300At\N..Ll\NG GEL().18ANG (nm)

Gambar 8: Spektrum Serapan dad 5a-androstan-3, 17-dion (0), AD (.•.)dan ADD '(.).

Pemisahan Campuran Basil Biokonversi pada KolomCISMenggunakan Teknik Elusi Gradien

Dari percobaan pendahuluan dapat diketahui bahwacampuran hasil biokonversi lebih cocok untuk dipisahkandengan mekanisme kromatografi fasa terbalik (KFT),karena pada kromatografi fasa normal (KFN) sebagianbesar komponen masih tertahan total di dalam kolom silika.Dapat diamati bahwa setelah beberapa kali injeksi, tekananbalik pada kolom silika mengalami kenaikan dan apabilakolom dibuka akan terlihat bagian atas kolom berubahwarna menjadi coklat. Hal ini merupakan indikasi adanyasebagian komponen yang tinggal pada kolom. Selain itudengan membandingkan Gambar 9A dan B dapat dilibatdengan jelas bahwa untuk suatu campuran hasil biokon-versi yang sama, tidak tampak ban yak senyawa yang dapatterelusi dari kolom silika, sedangkan sebaliknya padakromatografi fasa terbalik menggunakan kolom CIS terlibatban yak puncak senyawa dari campuran hasil biokonversi

18

A B

Gambar 9: Pemisaban Campuran Hasil Biokonversi pada KromatografiFasa Normal dan Kromatografi Fasa Terbalik.Kromatogram A: Kolom Lichrosorb Si 60 (EM 50388)

Eluen: Kloroform-Etanol (48:1)Kromatogram B: Kolom: u-Bondapak CIs,WATERS

Eluen:Metanol-Air (70 : 30)

A y

/HASI L 'FERM::NTASI

x

Gambar 10: Pemisahan Campuran Hasil Biokonversi pada KrornatografiFasa Terbalik menggunakan Teknik Elusi Gradien.Kolom: u-Bondapak C1S' WATERS. Eluen: Metanol-Air

Elusi: Gradien. Program: Linier dari 50% hingga 100'%metanol dalam waktu 60 menit.Kromatogram A; Campuran Hasil Biokonversi pada hr.;kelima (HS)'Kromalogra~ B: Campuran Hasil Biokonversi pada harinol (H~.

Kromatogram C: Standar AD dan ADD.

JKTI, VOL.4 - No.2, Desember, 19~

AG

B

A

B DE

I J

F G

A

E

o

HS

I J

FG

Gambar 11: Pemisahan Campuran basil biokonversi bari pertama, kedua, keempat dan kelima pada KCKT, menggunakan teknik elusi gradien.Kondisi kromatografi sama dengan kondisi yang digunakan pada Gambar 10.

yang dapat terelusi. Meskipun demikian, untuk KIT, padakondisi elusi isokratik, menggunakan pelarut metanol-air =70:30, resolusi pemisahan hasilbiokonversi yang diperolehmasih kurang baik seperti tampak pada Gambar 9B. Darigambar tersebut dapat dilihat bahwa untuk memisahkanlebih sempuma puncak-puncak pada bagian muka kroma-togram, dibutuhkan eluen yang relatif lebih lemah daricampuran pelarut di atas. Karena model pemisahan di sinimenyangkut mekanisme kromatografi fasa terbalik, makaeluen yang relatif lemah adalah campuran pelarut dengankomposisi air yang lebih banyak. Sebaliknya puncak-puncak pada bagian belakang kromatogram terlihat agakmelebar. Untuk memperbaiki bentuk puncak ini, diperlukaneluen yang relatif lebih kuat sehingga mampu menarikpuncak senyawa keluar lebih cepat dari kolom. Jikademikian masalahnya, maka diusahakan pada saat mulaproses elusi, dialirkan terlebih dahulu eluen yang relatiflemah, sedangkan pada akbir pemisahan dialirkan eluen

JKTI, VOL. 4 - NO.2, Desember, 1994

yang relatif kuat, Atas dasar pertimbangan ini dipilihkemudian kondisi elusi gradien.

Dengan memperhatikan semua data tersebut di atas,ditetapkan kondisi elusi mulai dengan komposisi pelarutmetanol-air = 50:50 dan selama proses elusi, komposisimetanol dinaikkan hingga akhimya setelah 1 jam kompo-sisi pelarut berubah menjadi metanol 100%. Beberapaperbaikan terhadap unjuk kerja hasil pemisahan dapatditunjukkan pada Gambar 10 dan Gambar 11.

Pada Gambar lOA, tampak jelas perubahan resolusipemisahan yang dapat dicapai apabila elusi dilakukansecara gradien. Campuran.hasil biokonversi yang diguna-kan pada Gambar lOA ini sama dengan campuran yangdipakai untuk pemisahan pada Gambar 9A dan B.

Dengan kondisi elusi yang sama, ADD dapat terelusidalam waktu 11,9 menit, AD dalam waktu 14,75 menitseperti tampak pacta Gambar lOC, sedangka n solasodinbaru dapat terelusi setelah 30,7 menit

19

Dengan membandingkan kromatogram pada GambarIDA dengan kromatogram campuran hasil biokonversi harike nol (Ho) pada Gambar lOB, dapat terdeteksi terbentuk-nya beberapa puncak baru (X,Y, dan puncak-puncak kecillainnya) sebagai puncak senyawayang dihasilkan dalamproses biokonversi. Penelaahan lebih lanjut terhadappuncak-puncak ini akan dapat dilakukan apabila prosesbiokonversi yang sama dibuat dalam skala yang lebih besar(± 10 liter). Pada saat kondisi elusi ini diaplikasikan untukmemantau proses biokonversi dari batch pengerjaan yanglain, dapat terdeteksi perubahan pembentukan senyawamulai hari fermentasi pertama (HI) hingga kelima (Hs).Seperti tampak pada Gambar 11, perbedaan antara kroma-togram campuran hasil biokonversi hari pertama (HI),kedua (H2), keempat (H4) dan kelima (Hs) dapat terlihatdengan jelas. Sejalan dengan waktu fermentasi, tinggipuncak yang diberi notasi A, C, D, dan E terlihat makinbertambah, sedangkan tinggi puncak B justru makinberkurang. Perbandingan tinggi puncak F dan G terhadaptinggi puncak I dan J tidak tetap. Pada hari fermentasipertama, puncak-puncak G lebih tinggi dari puncak I dan J,sedangkan pada hari fermentasi kedua, tinggi puncak I danJ dapatjauh melampaui tinggi puncak F dan G danakhimyatinggi keempat puncak ini terlihat hampir berimbang padahari fermentasi yang keempat dan kelima. Berdasarkan dataini, besar kemungkinan senyawa F, G, I dan J termasuksenyawa antara dalam proses biokonversi tersebut. Puncaksenyawa K baru dapat terdeteksi setelah hari fermentasikelima. Perubahan pembentukan senyawa yang terlihatdengan cukup jelas ini selanjutnya dapat digunakan sebagaialat untuk memantau dan memahami perubahan yangterjadi selama proses biokonversi. Selain itu kondisi elusigradien yang diperoleh diharapkan dapat diaplikasikanpada proses elusi kolom semi preparatif, dalam upayamengumpulkan setiap s~nyawa yang terpisah untuk ke-perl uan penelitian lebih lanjut.

KESIMPULANKondisi pemisahan yang optimal dari campuranhasil

bi~konversi solasodin dalam skala analitik pada pelat KLTmenggunakan silika sebagai fasa diam temyata mempunyaiprospek yang cukup baik untuk digunakan pada pemisahanpreparatif campuran hasil biokonversi tersebut.

Dapat dibuktikan melalui pemeriksaan kembali secarakromatografi bahwa senyawa X, yang berhasil dipisahkandari campuran hasil biokonversi, adalah solasodin yangsudah mengalami perubahan, meskipun belum membentuksenyawa AD atau ADD. Untuk pemisahan KromatografiCairan Kinerja Tinggi (KCKT), temyata lebih baik diguna-kan mekanisme kromatografi fasa terbalik, karena padakromatografi fasa normal, sebagian besar senyawa hasilbiokonversi masih tertahan total di dalam kolom silika.

Usaha untuk memperbaiki resolusi pemisahan daricampuran hasil biokonversi pada KCKT dapat ditempuhdengan jalan melakukan teknik elusi gradien pada kolom

20

analitik CI8 dengan campuran metanol-air sebagai eluen,menggunakan program 'linier mulai dari 50% metanolhingga 100 % metanol dalam kurun waktu 60 menit. Perluditeliti lebih lanjut, apakah kondisi elusi gradien yangdiperoleh untuk kolom analitik ini dapat juga digunakanuntuk kolom semi preparatif atau preparatif.

UCAPAN TERlMA KASIHPenelitian yang diinisiasi dalam Projek Bioteknologi

AAECP phase II, tahun 1990-1992 ini, dapat dilanjutkandengan adanya dana penelitian yang diperoleh dari ProjekDIP tahun anggaran 1992/1993 dan 1993/1994.

PUSTAKA1. S. Pujiraharti, TA. Budiwati, J. Kantasubrata, A.T Karossi,

Solasodine Steroid Bioconversion by Mycobacterium PhleiDSM 43286, lurnal Kimia Terapan Indonesia, 2: 75-79(1992).

2. J. Kantasubrata, Loyniwati, Jamilah, A.T. Karossi,Kromatografi Lapisan Tipis (KLT) dan KromatografiCairan Tekanan Tinggi (KCKT) dari Solasodine, AD danADD, lurnalKimia Terapan Indonesia, 3: 61-68 (1993).

3. J. Kantasubrata, T.Y. Fitri, V.A. Halomoan, P. Lotulung,Buchori, A.T. Karossi, Analytical Methods forDetermination of Solasodine and its BioconversionProducts,Annales Bogorienses, 2: 12-15 (1993).

4. H.S. Kim, C.K. Choi, Y.H. Park, Determination ofCholesterol and Its Fermentation Products by HighPerformance Liquid Chromatography, 1. Chromatogr.,398: 372-374 (1987).

5. Lin, Jiann-Tsyh, E. Heftmann, Comparison of Adsorptionand Reversed-Phase Partition High Performance LiquidChromatography for the Separation of Androgens, 1.Chromatogr., 237: 215-224 (1982).

6. H. Singh, D. Paul, T.R. Bhardwaj, K.K. Bhutani, J. Ram,Thin-layer Chromatography of Some Steroidal Ketones,Oximes and Lactams, 1. Chromatogr., 137: 202-205(1977).

7. H. Singh, D. Paul, T.R. Bhardwaj, A. Kumar, Chaudhary,S. Kapoor, R. Kumar, K.K. Bhutani, Thin-layerChromatography of Some Steroidal Ketones, Oximes,Amides, Lactams, and Tetrazoles, 1. Chromatogr., 176:255-259 (1979).

8. H. Singh, D. Paul, T.R. Bhardwaj, A. Kumar, Chaudhary,R.K. Gupta, Thin-layer Chromatography of SomeAzasteroids,l. Chromatogr., 240: 264-267 (1982).

9. E. Heftmann, LR. Hunter, High-Pressure Liquid Chro-matography of Steroids, 1. Chromatogr., 165: 283-299(1979).

10. R. Jellema, E.T.Elema, Th.M. Malingre, OpticalBrighteners as Thin-layer Chromatography DetectionReagents for Glycoalkaloids and Steroids Alkaloids inSolanum Species, 1. Chromatogr., 176: 435-439 (1979).

11. LR. Hunter, M.K. Walden, E. Heftmann, HighPerformance of Solanum and Veratrum Alkaloids, 1.Chromatogr., 198: 363-366 (1980).


Documents

o a ografi lapis Tipis Preparatif pada Pelat Silika