KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS PREPARATIFBAB IPENDAHULUANA. Latar BelakangPada zaman sekarang ini orang kembali lagi menggeluti bahan alam sebagai bahan penting dalam membuat obat. Para ahli sekarang ini telah memulai meneliti kembali tanaman obat untuk mengetahui khasiat yang lebih mendalam dari tanaman tersebut.Didaerah-daerah pedalaman, banyak masyarakat yang masih menggunakan tumbuh-tumbuhan yang mereka anggap mempunyai khasiat untuk pengobatan untuk beberapa penyakit tertentu, tanpa pengetahuan dasar. Ada beberapa kasus, dimana masyarakat menggunakan suatu obat, yang ternyata setelah diketahui zat aktifnya melalui ekstraksi dan identifikasi komponen kimia, ternyata memberikan efek yang berlawanan, hal ini tentunya membahayakan bagi jiwa manusia.Dari alasan tersebut di atas, maka dianggap perlu pengetahuan yang cukup untuk mengenal berbagai macam tumbuhan yang berkhasiat obat, mulai dari morfologi, kegunaan, prinsip-prinsip ekstraksi, isolasi dan identifikasi komponen kimia yang terdapat dalam suatu simplisia, khususnya bagi seorang farmasis.Pisang ambon (Musa acuminata Colla) merupakan contoh dari tanaman yang digunakan oleh masyarakat untuk melancarkan pencernaan, dapat mengurangi rasa nyeri pada persendian, mencegah terjadinya osteoporosis, dan menjaga kesehatan kulit. hal inilah yang melatar belakangi Pisang ambon (Musa acuminata Colla) diambilnya sebagai salah satu sampel karena memiliki kandungan senyawa antioksidan sehingga kita mau mengisolasinya.Dalam uji fitokimia ini, kita akan melakukan isolasi sampel dengan menggunakan metode kromatografi lapis tipis preparatif, dimana fraksi-fraksi yang didapat dari kromatografi kolom konvensional ditotolkan pada lempeng, dengan fase diamnya adalah silica gel kasar dan fase geraknya adalah eluen klorofrom : methanol yang akan dilihat nilai Rf dan nodanya pada sinar UV 254 dan sinar UV 366.B. Rumusan MasalahAdapun rumusan masalahnya yaitu bagaimana cara mengisolasi ekstrak pisang ambon (Musa acuminata Colla) dengan menggunakan metode kromatografi lapis tipis preparatifC. Maksud dan Tujuan Praktikum1. Maksud PraktikumAdapun maksud dilakukannya praktikum ini adalah untuk mengisolasi senyawa aktif antioksidan daro ekstrak kulit pisang ambon (Musa acuminata Colla) dengan menggunakan metode kromatografi lapis tipis preparatif.2. Tujuan PraktikumAdapun tujuan percobaan ini yaitu untuk mendapatkan isolate yang aktif sebagai antioksidan dari ekstrak kulit pisang ambon (Musa acuminata Colla) menggunakan kromatografi kolom preparatif berdasarkan warna dan tingkat kepolaran.3. Manfaat PraktikumAdapun mamfaat dari praktikum ini adalah praktikan dapat memisahkan komponen kimia dari fraksi klorofrom Pisang ambon (Musa paradisiaca) dengan menggunakan metode kromatografi lapis tipis preparatif.

BAB IITINJAUAN PUSTAKAA. Uraian Tanaman1. Klasifikasi tanaman (Integrated Taxonomic Information System, 2014).Regnum: PlantaeSubregnum: ViridaeplantaeInfraregnum: StreptophytaDevisi : TracheophytaSub devisi : Spermatophytina Class : Magnoliopsida Superorder: Lilianae Order : Zingiberales Family: Musaceae Genus : Musa LSpecies : Musa acuminata Colla.1. Morfologi pisang ambonSeperti tanaman yang lainnya, tanaman pisang mempunyai bagian-bagian tanaman seperti akar, batang, daun, bunga, buah dan biji. Menurut (Tjahjadi, 1991) akar pohon pisang merupakan akar serabut yang berpangkal dari umbi batang yang sebagian letaknya berada di bawah tanah. Rata-rata panjangnya adalah 4-5 meter untuk yang menjalar kesamping dan hanya 75-150 cm untuk yang tumbuh ke dalam tanah. Batang pisang menurut (Nakasone, 1998) merupakan batang semu yang terbentuk dari pelepah daun yang membesar di pangkalnya dan mengumpul membentuk struktur berselangseling yang terlihat kompak sehingga tampak sebagai batang (pseudo stem). Secara fisiologi daun pisang menurut (Nur et al., 2006) berwarna hijau tua untuk daun yang dewasa dan hijau muda untuk daun yang masih muda kecuali untuk beberapa spesies, terdapat bercak merah pada lembaran daunnya atau pada ibu tulangnya. Daun pisang memiliki pelepah daun yang yang membesar dan mengumpul berselang seling membentuk suatu struktur seperti batang yang disebut psudo stem. Bunga terdiri dari kumpulan dua baris bunga pertama dan disusul bunga jantan. Braktea membuka secara sekuen sekitar satu per hari. Tangkai bunga terus memanjang sampai 1,5 m. Buah kemungkinan berkembang dari ovari interior dan eksokarp disusan pada lapisan epidermis dan paerenkim, dengan daging menjadi mesokarp. Endokarp terdiri atas lapisan hampir rongga ovar.ian. Masing-masing node memiliki dua baris pada bunga yang membentuk tandan pada buah dan secara umum disebut sisir dengan buah individual yang disebut finger (Nakasone, 1998).1. Kandungan kimia Menurut Atun et al., 2007 menyebutkan bahwa kulit buah pisang ambon (Musa acuminata Colla) kaya akan senyawa flavonoid, maupun senyawa fenolik yang lainnya, disamping banyak mengandung karbohidrat, mineral seperti kalium dan natrium, serta selulosa. Hasil penapisan fitokimia ekstrak menunjukkan hasil positif untuk senyawa tannin, kuinon, flavonoid dan polifenolat (Fitrianingsih et al., 2012). Menurut Kanazawa dan Sakakibara (2000) jenis flavonoid yang teridentifikasi adalah narigenin dan rutin, serta menurut Someya (2002), terdapat katekin, galokatekin dan epikatekin.1. Manfaat tanamanPisang ambon merupakan buah yang banyak dikonsumsi oleh masyarakat karena mengandung senyawa yang disebut asam lemak rantai pendek, yang memelihara lapisan sel jaringan dari usus kecil dan meningkatkan kemampuan tubuh untuk menyerap nutrisi. Menurut penelitian yang telah dilakukan buah pisang ambon matang sangat efektif dalam mengurangi keparahan klinis dari penyakit diare dan banyak mengandung vitamin, mineral, protein dan karbohidrat yang baik untuk dikonsumsi tubuh (Amrullah dan Elly, 1985).B. Metode Kromatografi Lapis Tipis PreparatifIstilah kromatografi mula-mula ditemukan oleh Michael Tswett (1908), seorang ahli botani Rusia. Nama kromatografi diambil dari bahasa Yunani (chromato= penulisan dangrafe= warna). Kromatografi berarti penulisan dengan warna. Kromatografi adalah cara pemisahan campuran yang didasarkan atas perbedaan distribusi dari komponen campuran tersebut diantara dua fase, yaitu fase diam (stationary) dan fasa bergerak (mobile). Fasa diam dapat berupa zat padat atau zat cair, sedangkan fasa bergerak dapat berupa zat cair atau gas (Yazid, 2005). Kromatografi adalah proses melewatkan sampel melalui suatu kolom, perbedaan kemampuan adsorpsi terhadap zat-zat yang sangat mirip mempengaruhi resolusi zat terlarut dan menghasilkan apa yang disebut kromatogram (Khopkar, 2008).Pada kromatografi lapis tipis preparatif, cuplikan yang akan dipisahkan ditotolkan berupa garis pada salah satu sisi pelat lapisan besar dan dikembangkan secara tegak lurus pada garis cuplikan sehingga campuran akan terpisah menjadi beberapa pita. Pita ditampakkan dengan cara yang tidak merusak jika senyawa itu tanwarna, dan penyerap yang mengandung senyawa pita dikerok dari pelat kaca. Kemudian cuplikan dielusi dari penyerap dengan pelarut polar. Cara ini berguna untuk memisahkan campuran reaksi sehingga diperoleh senyawa murni untuk telaah pendahuluan, untuk menyiapkan cuplikan analisis, untuk meneliti bahan alam yang lazimnya berjumlah kecil dan campurannya rumit dan untuk memperoleh cuplikan yang murni untuk mengkalibrasi kromatografi lapis tipis kuantitatif (Gritter, 1991).Pengembangan plat KLTP biasanya dilakukan dalam bejana kaca yang dapat menampung beberapa plat. Keefisienan pemisahan dapat ditingkatkan dengan cara pengembangan berulang. Harus diperhatikan bahwa semakin lama senyawa berkontak dengan penyerap maka semakin besar kemungkinan penguraian (Hostettman, 1995). Pendeteksian bercak hasil pemisahan dapat dilakukan dengan beberapa cara. Untuk senyawa tak berwarna cara yang paling sederhana adalah dilakukan pengamatan dengan sinar ultraviolet. Beberapa senyawa organik bersinar atau berfluorosensi jika disinari dengan sinar ultraviolet gelombang pendek (254 nm) atau gelombang panjang (366 nm). Jika dengan cara itu senyawa tidak dapat dideteksi maka harus dicoba disemprot dengan pereaksi yang membuat bercak tersebut tampak yaitu pertama tanpa pemanasan, kemudian bila perlu dengan pemanasan (Gritter,1991).Pada kromatografi lapis tipis, fase diam berupa lapisan tipis yang terdiri atas bahan padat yang dilapiskan pada permukaan penyangga datar yang biasanya terbuat dari kaca, dapat pula terbuat dari plat polimer atau logam. Lapisan melekat pada permukaan dengan bantuan bahan pengikat, biasanya kalsium sulfat atau amilum (pati). Penjerap yang umum dipakai untuk kromatografi lapis tipis adalah silika gel, alumina, kieselgur, dan selulosa (Gritter, 1991). Dua sifat yang penting dari fase diam adalah ukuran partikel dan homogenitasnya, karena adhesi terhadap penyokong sangat tergantung pada kedua sifat tersebut. Ukuran partikel yang biasa digunakan adalah 1-25 mikron. Partikel yang butirannya sangat kasar tidak akan memberikan hasil yang memuaskan dan salah satu cara untuk memperbaiki hasil pemisahan adalah dengan menggunakan fase diam yang butirannya lebih halus. Butiran yang halus memberikan aliran pelarut yang lebih lambat dan resolusi yang lebih baik (Sastrohamidjojo, 1985).Fase gerak ialah medium angkut yang terdiri atas satu atau beberapa pelarut. Jika diperlukan sistem pelarut multi komponen, harus berupa suatu campuran sesederhana mungkin yang terdiri atas maksimum tiga komponen (Stahl, 1985). Dalam pemisahan senyawa organik selalu menggunakan pelarut campur. Tujuan menggunakan pelarut campur adalah untuk memperoleh pemisahan senyawa yang baik. Kombinasi pelarut adalah berdasarkan atas polaritas masing-masing pelarut, sehingga dengan demikian akan diperoleh sistem pengembang yang cocok. Pelarut pengembang yang digunakan dalam kromatografi lapis tipis antara lain: n-heksana, karbontetraklorida, benzena, kloroform, eter, etilasetat, piridian, aseton, etanol, metanol dan air (Gritter, 1991).Dalam mengidentifikasi noda-noda dalam kromatografi sangat lazim menggunakan harga Rf (Retordation Factor) yang didefinisikan sebagai: Rf = Harga Rf beragam mulai dari 0 sampai 1. Faktor-faktor yang mempengaruhi harga Rf (Sastrohamidjojo, 1985): a. Struktur kimia dari senyawa yang sedang dipisahkan b. Sifat Penjerap c. Tebal dan kerataan dari lapisan Penjerap d. Pelarut dan derajat kemurniannya e. Derajat kejenuhan uap pengembang dalam bejana f. Teknik percobaang. Jumlah cuplikan yang digunakan h. Suhu i. Kesetimbangan

BAB IIIMETODE PRAKTIKUMA. Alat dan Bahan1. AlatAdapun alat yang digunakan pada praktikum ini adalah batang pengaduk, botol coklat, cawan porselin, gelas kimia, kolom kaca, pipa kapiler, pipet volume, sendok tanduk besi, statif, timbangan analitik dan vial.2. BahanAdapun bahan yang digunakan yaitu aluminium foil, aquadest, etil asetat, ekstrak kulit pisang ambon, kapas, kertas saring, kloroform, methanol, silika gel kasar, dan tissue.B. Cara Kerja0. Penyiapan Sampel1. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan 1. Diambil fraksi dari hasil Kromatografi kolom dengan perbandingan eluen methanol : kloroform (7 : 3)1. Ditotolkan pada lempeng kaca ukuran 20x 20 cm secara berhimpitan0. Penyiapan Eluen1. Dibuat perbandingan eluen methanol : kloroform (7 : 3) dan dihomogenkan1. Dimasukkan dalam chamber dan dijenuhkan terlebih dahulu0. Penyiapan fase diam1. Disiapkan lempeng dengan ukuran 20 x 20 cm 1. Digaris lempeng dengan batas atas 0,5 cm dan batas bawah 1 cm dengan menggunakan pensil0. Cara kerja1. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan1. Dimasukkan lempeng yang telah ditotol dalam chamber yang berisi eluen1. Diamati noda yang terelusi yang naik sampai tanda batas1. Diamati pada lampu UV 254 nm dan 366 nm0. Pengelompokan Fraksi1. Ditandai noda yang terbentuk berwarna terang pada lempeng preparatif dengan menggunakan pensil1. Disemprot dengan pereaksi DPPH agar melihat aktivitas antioksidannya.1. Dikeruk noda yang dihasilkan pada lempeng1. Pita-pita yang telah dikeruk dimasukkan dalam vial lalu diberi label

BAB IVHASIL & PEMBAHASANA. Hasil PraktikumNoPitaRfKeterangan

1.2.Pita 1Pita 2

Aktif sebagai antioksidan

Aktif sebagai antioksidan

Keterangan :Tumbuhan sampel : Kulit pisang ambonFase diam : Silika gelFase gerak : Eluen klorofrom : methanol (7:3)Ukuran lempeng : 20 x 20 cm

B. PembahasanKromatografi adalah proses melewatkan sampel melalui suatu kolom, perbedaan kemampuan adsorpsi terhadap zat-zat yang sangat mirip mempengaruhi resolusi zat terlarut dan menghasilkan apa yang disebut kromatogram.Pada kromatografi lapis tipis preparatif, cuplikan yang akan dipisahkan ditotolkan berupa garis pada salah satu sisi pelat lapisan besar dan dikembangkan secara tegak lurus pada garis cuplikan sehingga campuran akan terpisah menjadi beberapa pita. Pita ditampakkan dengan cara yang tidak merusak jika senyawa itu tanwarna, dan penyerap yang mengandung senyawa pita dikerok dari pelat kaca. Kemudian cuplikan dielusi dari penyerap dengan pelarut polar. Cara ini berguna untuk memisahkan campuran reaksi sehingga diperoleh senyawa murni untuk telaah pendahuluan, untuk menyiapkan cuplikan analisis, untuk meneliti bahan alam yang lazimnya berjumlah kecil dan campurannya rumit dan untuk memperoleh cuplikan yang murni untuk mengkalibrasi kromatografi lapis tipis kuantitatif.Sampel yang digunakan dalam praktikum ini adalah ekstrak kulit pisang ambon Kulit pisang ambon (Musa acuminata Colla) Menurut Atun et al., 2007 menyebutkan bahwa kulit buah pisang ambon (Musa acuminata Colla) kaya akan senyawa flavonoid, maupun senyawa fenolik yang lainnya, disamping banyak mengandung karbohidrat, mineral seperti kalium dan natrium, serta selulosa. Hasil penapisan fitokimia ekstrak menunjukkan hasil positif untuk senyawa tannin, kuinon, flavonoid dan polifenolat (Fitrianingsih et al., 2012). Menurut Kanazawa dan Sakakibara (2000) jenis flavonoid yang teridentifikasi adalah narigenin dan rutin, serta menurut Someya (2002), terdapat katekin, galokatekin dan epikatekin. Dimana Pisang ambon merupakan buah yang banyak dikonsumsi oleh masyarakat karena mengandung senyawa yang disebut asam lemak rantai pendek, yang memelihara lapisan sel jaringan dari usus kecil dan meningkatkan kemampuan tubuh untuk menyerap nutrisi. Menurut penelitian yang telah dilakukan buah pisang ambon matang sangat efektif dalam mengurangi keparahan klinis dari penyakit diare dan banyak mengandung vitamin, mineral, protein dan karbohidrat yang baik untuk dikonsumsi tubuh (Amrullah dan Elly, 1985).Dalam fitokimia dilakukan suatu proses isolasi dari suatu komponen kimia dari tumbuhan yang banyak digunakan dalam pengobatan tradisional yang berkembang menjadi obat modern. Menggunakan cara yang bervariasi tergantung dari sifat fisika dan kimia komponen tersebut. Kemudian dilanjutkan dengan proses pemurnian dengan kristalisasi dengan tujuan mendapatkan senyawa kimia yang penampakannya bagus dan kelihatan lebih banyak. Metode fitokimia sangat penting artinya dalam bidang farmasi sebagai salah satu cara meneliti senyawa aktif yang terdapat dalam tumbuhan.Prinsip dari kromatografi Lapis Tipis Preparatif yaitu adsorpsi dan partisi, adsorpsi yaitu penyerapan pada permukaan oleh adanya fase diam (silica) sedangkan partisi yaitu pemisahan oleh adanya fase gerak (eluen).Tujuan dilakukannya praktikum ini yaitu untuk mendapatkan isolat aktif dari sampel pisang ambon (Musa acuminata Colla) dengan metode kromatografi lapis tipis preparatif.Dalam praktikum ini, yang dilakukan yaitu kromatografi lapis tipis preparatif. Dimana faksi terbaik dari percobaan KKK dan KCV diambil kemudian dibuat eluen sesuai dengan fraksi yang dipilih. Lalu fraksi ditotol pada lempeng KLT dengan penotolan yang berkesinambungan. setelah itu lempeng di elusi di dalam chamber dengan menggunakan eluen kloroforom : metanol (7:3), setelah nodanya naik dilihat pada UV 254 dan 366 kemudian tandai noda yang tampak seperti pita, didapatkan dua pita yang masing-masing memiliki nilai Rf, yaitu pada pita pertama didapat nilai Rf 0,81 cm dan pada pita kedua didapatkan nilai Rf 0,77 cm. Kemudian, noda yang nampak dikeruk dan dimasukkan ke dalam botol sentrifug kemudian disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 800 rpm. Setelah terbentuk endapan haslilnya disaring dan dimasukkan ke dalam vial.

BAB VPENUTUPA. KesimpulanDari hasil percobaan menggunakan metode kromatografi lapis tipis preparative diperoleh dua pita yang aktif sebagai antioksidan dengan nilai Rf 1 = 0,81 cm dan Rf 2 = 0,77 cm.B. SaranSebaiknya praktikum dapat dilakukan dengan metode berbeda agar lebih banyak lagi di tahu cara mengekstraksi dengan metode-motode lain.

DAFTAR PUSTAKAAnonim. 2015. Penuntun dan Buku Kerja Fitokimia II. Universitas Muslim Indonesia; Makassar.Bamidele,O, Akinnuga, AM, Anyakudo, MMC, Ojo, OA, Olorunfemi, JO &Dalimartha., Setiawan. 2009. Atlas Tumbuhan Obat Indonesia Jilid 6. Jakarta: Pustaka Bunda.Gritter J.R, dkk., 1991., Pengantar Kromatografi., Penerbit ITB, Bandung.Halawane, J. E., N. Hanif.,dan J. Kinho. 2011.Masa Depan.Buku.Balai Penelitian Kehutanan Manado :Manado.Hendayana, Sumar, dkk. 1994. KIMIA ANALITIK INSTRUMENTASI IKIP Semarang Press: Semarang.

Integrated Taxonomic Information System, 2015 (online). Diakses tanggal 3 Mei 2015 (http://www.itis.gov/servlet/SingleRpt/SingleRpt?search_topic=TSN&search_value=36481)J. B. Harbone. 1987. Metode Fitokimia : Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan. Penerbit ITB. Bandung.Kamboj, A &Saluja, AK 2011, Isolation of Stigmasterol and -sitosterol from Petroleum Ether Extract of Aerial Parts of Ageratum conyzoides (Asteraceae), Int J Pharm Pharm Sci, vol.3, no. 1,p.94. Kartesz, JT 2012,Khopkar., S.M., 2008, Dasar-dasar Kimia Analitik, Jakarta, Erlangga.Ndip, RN, Ajonglefac, AN, Wirna, T, Luma, HN, Wirmum, C & Efange,SMN2009, In-Vitro Antimicrobial Activity of Ageratum conyzoides (Linn) on Clinical Isolates of Helicobacter pylori, Afr J Pharm Pharmacol, vol. 3, no. 11, pp. 586, 590. Prasad, KB 2011, Evaluation of Wound Healing Activity of Leaves of Ageratum Conyzoides, Int J of Pharm Pract Drug Res, vol. 1, no. 1 , pp.8, 9, 12.Rohman, Abdul. 2009. Kromatografi untuk Analisis Obat. Graha Ilmu : Jakarta.Sachin, J, Neetesh, J, Tiwari, A, Balekar, N & Jain, DK2009,Sample Evaluation of Wound Healing Activity of Polyherbal Formulation of Roots of Ageratum conyzoides Linn, Asian J Res Chem, vol. 2,no. 2, p. 137.Sastrohamidjojo., 1985, Kromatografi, Penerbit Liberty, Yogyakarta.Stahl, Egon. 1991. Analisis Obat secara Kromatografi dan Mikroskopi. Penerbit ITB: Bandung.

Lampiran 1. Skema kerja isolasi senyawa aktif antioksidan dari ekstrak kulit pisang ambon dengan metode kromatografi lapis tipis preparatif

Alat dan bahan

Pilih fraksi pada KKK dan KCV

Ditotolkan pada lempeng KLT ( ukuran 20x20 cm)

Dielusi dengan eluen yang sesuai

Dan akan terbentuk pita

Diamati di lampu UV

Lempeng hasil KLT disemprot dengan pereaksi tertentu

Fraksi aktif dikeruk

Disimpan dalam vial

Dilanjutkan uji kemurnian

Lampiran 2. Gambar hasil praktikum Pita 1 dan Pita 2 (a)

(b)

( c )Keterangan :Tumbuhan sampel : Kulit pisang ambonFase diam : Silika gelFase gerak : Eluen klorofrom : methanol (7:3)3. UV 2543. UV 3663. Semprotan DPPHPutri Atthohiriyah B M Syawaliah Purnama S.farm 150 2012 0247