Nina Salamah, MSc., Apt

PendahuluanPenggunaan bahan alam khususnya

tanaman dalam pengobatan sudah berlangsung lama

Trend “back to nature” : produk herbal meningkat

Metode Farmakope: Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

suatu teknik pemisahan campuran menjadi komponennya berdasarkan perbedaan migrasi masing-masing komponennya dalam fase diam akibat pengaruh dari fase gerak

Separate

• Analyze

• Identify

• Purify

• QuantifyComponentsMixture

Components

Affinity to Stationary Phase

Affinity to Mobile Phase

Blue ---------------- Insoluble in Mobile Phase

Black

Red

Yellow

Mixture Components

Separation

Stationary Phase

Mobile Phase

Kromatografi Lapis TipisKromatografi padat-cairKromatografi planarFase diam berupa lapisan tipis pada

permukaan datar di atas pendukung yang sesuai

Keunggulan dibanding KCKT: mudah, sederhana, murah, cepat

Kekurangan dibanding KCKT: daya pemisahan dan sensitivitas lebih rendah, terpengaruh lingkungan

Komponen penting pada analisis dengan KLT

Peralatan (chamber)Fase DiamFase gerakAplikasi sampelPengembanganDeteksi bercak

Fase DiamFase diam pada KLT berupa fase yang polar (fase normal) maupun fese non polar (fase terbalik).

Fase normal1. Silica gelMerupakan silica yang dibebaskan dari air, bersifat sedikit asam, fase ini lebih banyak digunakan. Untuk memperkuat pelapisannya pada pendukung, silika gel ditambah gips (Kalsium sulfat) sehingga dikenal dengan silica gel G.Sebagai pendukung lapisan tipis digunakan kaca, dengan ukuran 20 x 20 cm, 10 x 20, atau 5 x 10 cm. Pendukung yang lain berupa lembaran aluminium, atau plastik dengan ukuran scperti diatas, yang umumnya dibuat oleh pabrik.

Silica gel kadang-kadang ditambah senyawa flouresens, agar bila disinari dengan sinar UV berflourosensi atau berpendar, sebingga dikenal dengan silica gel GF254, yang berarti silica gel dengan flouresen yang berpendar pada 254 nm

2.Alumina, (aluminium oksida)Fase diam ini bersifat sedikit basa, lebih

jarang digunakan, bila akan digunakan diaktifkan kembali dengan pemanasan. Alumina yang digunakan sebagai fase diam untuk KLT umumnya yang bebas air, schingga mempunyai aktivitas penjerapan lebih tinggi.

3. KiselguhrSebenarnya merupakan asam silica yang amorf,

berasal dari kerangka diatomeae, maka lebih dikenal dengan nama tanah diatome, kurang bersifat adsorptif dibanding silica.

4. Magnesium silicatNama lain dalam perdagangan dikenal dengan

floresil, hanya digunakan bila adsor ben atau penjerab lain tidak dapat digunakan.

 5 SelulosePolaritasnya tinggi dapat digunakan sebagai

pemisah sccara partisi, baik dengan bentuk kertas maupun bentuk Icmpeng. Keduanya masih sering dipakai misalnya untuk pemi sahan flavanoid.

Fase diamUmumnya digunakan silikaDapat ditambahkan pengikat dan indikator

fluoresensiMekanisme dominan: adsorbsi kadang partisi

Fase gerak/eluen/pelarut Berdasarkan polaritas Biasanya campuran Studi pustaka dan coba-coba

Prinsip: like dissolves likeSenyawa polar lebih tertahan oleh fase diamSenyawapolar lebih mudah larut dalm fase gerak

yang polar

Simbol-simbol Pelat KLTSi atau Sil Mengandung silika60 Ukuran poriF atau UV Mengandung indikator fluoresensi254 atau 366 Setelah simbol F atau UV untuk

menunjukkan panjang gelombang eksitasi indikator fluoresensi

G Pengikat gipsum (kalsium sulfat)H atau N Tanpa pengikatRP Reversed Phase, silika yang dimodifikasi

dengan hidrokarbon2, 8, 18 Panjang rantai karbon yang diikatkan

pada silikaP Untuk preparativ

Kekuatan elusi pelarut pada silika dan polaritas pelarut

Aplikasi sampelTotolan bercak sekecil mungkinBiasanya 1- 2 mm, totolan besar: bercak

menyebar dan bertumpukDigunakan pelarut sampel yang bisa

melarutkan sampel dengan baik, tetapi mudah menguap dan daya elusinya kecil

Secara manual/otomatisDapat digunakan pipa kapiler,

mikropipet, mikrosiring

Rf = jarak yang ditempuh oleh komponen jarak yang ditempuh oleh pelarut

Deteksi BercakBerwarna atau tidakDengan lampu UV 254/366 nmJika menggunakan pelat KLT F: bercak yang

tidak berfluoresensi terlihat sebagai pemadaman (gelap) pada latar belakang hijau/biru

Dengan penampak bercakDisemprot/dicelup/diuapiDestruktif/tidakUmum/selektif

Visualization (Detection of spots):A- Universal methods:

1- Destructive methods:

The plated are sprayed with corrosive reagents and then heated in oven where organic compounds will give charred spots. After this treatment the materials can not be recovered.

e.g. Anisaldehyde / H2SO4

Vanillin / H2SO4

2- Non – Destructive methods: In these methods the materials can be recovered.

Day light for colour compounds. UV light for fluorescent compounds

(conjugated double bonds). I2 vapour for any compounds contain at least

one double bond Spray with water where organic compounds

appear as white opaque spots.

B- Specific Methods:

These reagents are used for the detection of certain classes of compounds. They are usually destructive.

Dragendorff΄s reagent for Alkaloids.

Ferric Chloride (FeCl3) for phenolic compounds.

Aniline phthalate for sugars.

Ninhydrine for nitrogenous compounds as Amines, Amino acids.

Tabel Beberapa penggunaan pelacak bercak pada kromatografi kertas

Sebyawa fiuoresen Amin ter/kuater. Turunan karbamat HeterosikUk amin kanabinol, sulfonamida Alkaloid/Amin kuar Ter.Heksa(penta klorfenol) Ikatan rangkap, seny.organik

222222

Nama pereaksi

Analit Nama pereaksi

Analit

l.Sinar UV254 nm

2 lodoplatinat

3.Pereaksi furfural

4.Pereaksi Simon

5.DABdlm etanol

6.Dragendorff

7. Uap iodium8. UapNO2

Senyawa flouresenSeny.Amin ter/kuaternerTurunan Karbamat

Heterosiklik amin

Karbinol/SulfonamidaAlkaloid/amin kuater,Ter.Heksa/penta klorfenolIkatan rangkap/ senyawa organik

9. Pereaksi Marquis

10. Peraksi Millon11 .KMn04 + as.sulfet12 .Ninhidrin13. Nitroso-naftol

14. Pereaksi Mandelin

15. Vanilinas. Sulfat

Tur. morfin

Fenol, aril amin Ikatan tak jenuh

As. amino primer Ergot alkaloid Turunan ajmalin Barbiturat fenetoin,

S

Rate of flow (Rf Value): Distance traveled by the spots

Rf = ----------------------------------------- Distance traveled by the solvent

The Rf of any compound must be less than one.

Start line

Solvent front

Distance travelled by the spot

Distance travelled by the solvent

Tailing in Paper Chromatography: In some cases instead of getting round spots a Tailed or comet like spots are obtained leading to overlapping of the spots and poor resolution.

Tailed or comet like spot

Reasons and solution for tailing problem:

1-Ionic characters of acids and bases when they are chromatographed under neutral conditions.

Solution: add acids or bases to the developing system.

2-Application of large amounts of material.

Solution: decrease conc. of material.

3-Unproper choice of solvent system.Solution: change the solvent system.

Application: 1- Qualitative:Identification through comparison of the Rf value

with that of Reference material.Determination of Complexity of mixtures. That will

be indicated from number of spots.Determination the purity of materials.Monitoring the progress of Chemical reactions.Monitoring of column chromatography.Development of finger print TLC for extracts,

volatile oils or pharmaceutical preparation for future identification and comparison.

In this application plates 5×5, 5×10 cm with thin film of coating material are usually used.

2- Quantitative:In this case an accurate volume of samples are applied using syringes. The dimensions of plates range from 5x10 to 20x20 according to the number pf spots used. The plates are developed as usual in the chromatographic tanks. After development the concentration of material can be determined by:

Spot area measurement: Which is directly proportional to the conc. of materials.

Photodensitometry: Measure transmittance, reflection or fluorescence of spots.

Radioactivity: For radioactive material.

These measurements are done using TLC Scanner connected to computer that perform all calculations.

28

29