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©2019 Waters Corporation 1COMPANY CONFIDENTIAL
生物样本方法开发策略
Waters CG Marketing
孙 超
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生物分析方法开发的挑战
©2019 Waters Corporation 3COMPANY CONFIDENTIAL
生物分析挑战罪魁祸首-磷脂
ü 血中产生基质效应的最主要成分;
ü 含有亲水基团容易离子化;
ü 含有亲脂基团容易在色谱柱上富集;
ü 分子量不定难以监测;
ü 蛋白沉淀无法去除
常见误区
n 监测磷脂,并未发现背景很高
R:亲脂性的磷脂在柱上富集,进
样几针或几十针背景逐渐升高或突
然流出,并无规律可循
n 方法验证“通过了”
R: 方法验证通常采用混合血,实
际分析中样本磷脂组成差异更大
n 同位素内标可消除基质效应
R:研究表明,氘代内标和原型受
基质效应干扰程度不同
我们的目标完全去除磷脂,让方法开发更简单
©2019 Waters Corporation 4COMPANY CONFIDENTIAL
磷脂的堆积会导致基质效应以及不可预测的结果
使用蛋白沉淀法,磷脂会堆积在色谱
柱中(一批50个样品)
右图显示蛋白沉淀后第一针进样和最
后一针进样的磷脂色谱图和分析物色
谱图。可以看到磷脂的堆积以及和目
标物的共流出,这会造成基质效应,
并影响定量准确性。
Application Note: Rapid, Reliable Metabolite Ratio Evaluation for MIST Assessments in Drug Discovery and Preclinical Studies, 720004453enApplication Note: Rapid, Reliable Metabolite Ratio Evaluation for MIST Assessments in Drug Discovery and Preclinical Studies, 720004453en
Danaceau et al. 2014 Bioanalysis 6(6) 761-771
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磷脂的监测方法1:监测单独的MRM离子通道
We monitor MRM transitions 496 > 184 (C16) and 524 > 184 (C18)
We monitor MRM transitions 704 > 184, 758 > 184, and 806 > 184 (C30-38)
Typical lysophospholipid
Typical Phosphatidylcholine
Utilizing a triple quadrupole mass spectrometer, we monitor individual MRM transitions to quantify levels of specific lipids.
184
184
©2019 Waters Corporation 6COMPANY CONFIDENTIAL
磷脂的监测方法2:监控所有磷脂*
Monitoring 184 > 184 shows all phosphatidylcholines in the sample and is a good measure of overall cleanliness.
Monitoring 1 MRM transition rather than 5 is a more efficient use of duty cycle.
Polar Head GroupFragment Hydrophobic Chains
*Little, J., Wempe, M. and Buchanan, C. Journal of Chromatography B, 833 (2006) 219-230.
184
©2019 Waters Corporation 7COMPANY CONFIDENTIAL
全扫描 (100~1000)方式下的MS谱图
直接注入标样与经不同净化方式所得鼠血清基质的混合物 (未经色谱分离)
消除样品基质中的干扰物可大大减少对样品离子化的干扰。
标样溶液
固相萃取 (<10%离子抑制)
液液萃取 (40-60%离子抑制)
蛋白质沉淀 (80-90% 离子抑制)
Scan ES+6.00 e7
Scan ES+6.00 e7
Scan ES+6.00 e7
Scan ES+6.00 e7
心得安Propranolol
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¡ 我到底用哪种前处理方法最好?
¡ 我不知道怎么做SPE 的方法开发?
¡ 我没有SPE 操作经验?
前处理技术的挑战
©2019 Waters Corporation 9COMPANY CONFIDENTIAL
生物样本前处理方法决策树
样品是否需要浓缩?
否 是
OStro 板 .通过式SPE.无需方法开发.去除磷脂/蛋白
OASIS PRiME HLB. 三步法. 流速更快.去除磷脂/色素/盐
OASIS MCX/MAX/WAX/WCX.2*4方法学.高选择性.进一步提升灵敏度
OASIS PRiME MCX (pKa>=4.5). 三步法/四步法. 流速更快. 去除磷脂
©2019 Waters Corporation 10COMPANY CONFIDENTIAL
生物样本前处理方法决策树
第一步:Ostro 96孔板/升级版PPT法
将Ostro 放置到收集板上,加入 50-200µL 血浆到孔内
用力加入3倍体积的 2% 甲酸乙腈溶液, (不推荐使用甲醇),用排枪抽吸三次以混匀
利用正压或真空装置过滤样本,滤液分析
©2019 Waters Corporation 11COMPANY CONFIDENTIAL
Ostro 96孔板-回收率&除磷脂效果
为各种分析物获得最佳回收率为各种分析物获得最佳回收率
(6 replicates in data set)
残留磷脂水平残留磷脂水平
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Ostro应用于:药物及其代谢物研究
Ostro+XP=快速色谱分析,快速柱平衡,降低基质效应,提高方法稳定性
关键词:
n 通过去除血浆中蛋白和磷脂,不会吸附样品中的待测物
n 可检测到更多的代谢物,掌握全局
©2019 Waters Corporation 13COMPANY CONFIDENTIAL
Ostro应用于:磷脂组学—Ostro+BEH Hilic
¡ Ostro下接2ml 收集板
¡ 取100ul 血浆上样到Ostro板
¡ 加入800ul 乙醇,并用枪混匀10X
¡ 负压装置加压到-15Hg,收集洗脱液
¡ 重复第三、第四步,合并流通液
¡ 加入800ul 4.5:4.5:1 氯仿:甲醇:TEA混合溶液
¡ 负压装置加压到-15Hg,收集洗脱液
¡ 重复第六、第七步,合并洗脱液
¡ 分别将流通液和洗脱液挥干,
用200ul 氯仿:甲醇 1:1复溶、进样
到BEH Hilic色谱柱分析
©2019 Waters Corporation 14COMPANY CONFIDENTIAL
生物样本前处理方法决策树
样品是否需要浓缩?
否 是
OStro 板 .通过式SPE.无需方法开发.去除磷脂/蛋白
OASIS PRiME HLB. 三步法. 流速更快.去除磷脂/色素/盐
OASIS MCX/MAX/WAX/WCX.2*4方法学.高选择性.进一步提升灵敏度
OASIS PRiME MCX (pKa>=4.5). 三步法/四步法. 流速更快. 去除磷脂
©2019 Waters Corporation 15COMPANY CONFIDENTIAL
PROCESS
ROBUSTNESS
improvements in…
MATRIX EFFECTS
EASE of USE
Oasis PRiME……
©2019 Waters Corporation 16COMPANY CONFIDENTIAL
Oasis PRiME HLB :更简单的方法流程
活化
平衡
清洗
5% 甲醇水
洗脱
90:10 乙腈/甲醇
上样上样
100% 甲醇
100% 水
5% 甲醇水
100% 甲醇
上样
传统的流程 简化的
不怕流干
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微孔湿润
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微孔去湿
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去湿现象/干涸效应对SPE的影响
步骤 正相 反相
活化 不需要 始终需要
平衡 建议进行 始终需要
¡ 对于反相SPE而言,活化和平衡步骤至关重要
如果在活化和平衡步骤操作不谨慎,特别是当使用真空萃取装置时,有些柱芯的吸附剂孔可能会不到润湿,从而导致化合物的保留能力差和样品回收率变差。
©2019 Waters Corporation 20COMPANY CONFIDENTIAL
Oasis® HLB固相萃取吸附(1996):现代固相萃取技术的划时代进步
l “亲脂性结构”l 提供反相保留特性
亲水性
单体
亲脂性
单体
NO
v无硅醇基活性vpH 应用范围 0-14v吸附剂干涸后对回收率和分析重现性全无影响v亲水性结构如同‘极性抓钩’,有助于保留亲水性物质 v极高的比表面积, 比硅胶吸附剂用量减少2/3
l“亲水性结构”提供优良的浸润性即使吸附剂干涸也无需担心回收率降低或分析结果重现性不佳的问题
‘HLB’= Hydrophilic Lipophilic Balance
N-乙烯吡咯烷酮 二乙烯基苯
©2019 Waters Corporation 21COMPANY CONFIDENTIAL
血浆样品净化效果比较
Oasis PRiME HLB 3-Step Protocol vs. Competitor 5-Step Protocol
CLEANER samples in fewer steps with Oasis PRiME HLB
Phospholipids Remaining in Final Eluate
Oasis PRiME HLB Competitor SX Competitor SOPPT 1:3 Plasma:ACN
Area
Cou
nts
n=5
Comparative separations may not be representative of all applications.
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更快的流速
¡ 更快速不管是对于小柱还是96孔板,更不容于出现堵柱情况
Loading compared to Oasis HLB with 4 inch Hg, N=4
FASTER flows across multiple devices and sample matrices
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Oasis PRiME HLB3步法流程示例:回收率和基质效应
回收率 基质效应
3-Step Protocol CONCLUSIONHIGH analyte recoveries (>80%) and
LOW (<15%) matrix effects
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Oasis PRiME HLB : 血浆中内源性类固醇
Oasis PRiME HLB µElution plate, N=4
流程
¡ 150 μL 血浆 (10 ng/mL)
¡ 300 μL 4:1 MeOH:ZnSO4 (89g/L) 蛋白沉淀
¡ 3220 rcf离心10min
¡ 上清液用900 μL 4% H3PO4
处理后的样品上样(2次)
2 x 200 μL of 25% MeOH清洗
2 x 25 μL 90:10 ACN:MeOH洗脱
50 μL 25% MeOH 稀释
进样7.5 μL
ModifiedOasis PRiME Protocol
©2019 Waters Corporation 25COMPANY CONFIDENTIAL
Cortisol Adione 17-OHP
0%
20%
40%
60%
80%
-20%
-40%
RecoveryMatrix Effects
Recovery Matrix Effects
Mean S.D. %RSD Mean S.D.
皮质醇 72.7% 3.1% 4.2% -19.0% 3.1%
雄烯二酮 72.5% 1.9% 2.7% -6.9% 2.2%
17-羟孕酮 71.5% 1.9% 2.6% -4.5% 1.3%
Mean -10.1%
Oasis PRiME HLB 回收率和基质效应
较低的标准偏差(3.1% or less)证明 Oasis PRiME HLB
的提取和净化效果的一致性
血浆中内源性类固醇
平均基质效应10%
©2019 Waters Corporation 26COMPANY CONFIDENTIAL
磷脂峰面积
PPT 22152370
PRiME HLB 690579
Oasis PRiME HLB 表现优异:去除97%磷脂 vs. PPT
Oasis PRiME HLB vs. PPT 磷脂去除
PPT
Oasis PRiME HLB
PPT 流程:
150 μL 血浆 (10 ng/mL)
加入300 μL 4:1 MeOH:ZnSO4 3220 rcf 离心10min
血浆中内源性类固醇
©2019 Waters Corporation 27COMPANY CONFIDENTIAL
生物样本前处理方法决策树
样品是否需要浓缩?
否 是
OStro 板 .通过式SPE.无需方法开发.去除磷脂/蛋白
OASIS PRiME HLB. 三步法. 流速更快.去除磷脂/色素/盐
OASIS MCX/MAX/WAX/WCX.2*4方法学.高选择性.进一步提升灵敏度
OASIS PRiME MCX (pKa>=4.5). 三步法/四步法. 流速更快. 去除磷脂
©2019 Waters Corporation 28COMPANY CONFIDENTIAL
混合模式的吸附剂
©2019 Waters Corporation 29COMPANY CONFIDENTIAL
Oasis® 2x4 方法
酸
样品制备
上样
清洗:5% 氨水
洗脱 1:100% 甲醇
洗脱 2:含2% 甲酸的甲醇
中性化合物
对于碱:pKa 2-10使用Oasis® MCX
对于强酸pKa <1.0使用 Oasis® WAX
对于强碱pKa >10使用 Oasis® WCX
对于酸pKa 2-8使用 Oasis® MAX
提取流程 2样品制备
上样
清洗:2% 甲酸
洗脱1:100% 甲醇
洗脱2:含5% 氨水 的甲醇
提取流程 1
碱 强酸 强碱
酸性化合物 碱性化合物
©2019 Waters Corporation 30COMPANY CONFIDENTIAL
碱 (质子接受体)
B BH+ + OH-
(未离子化) (离子化)
50% @ pKb* 50% 0% Low pH 100%100% High pH 0%
* pKa of conjugate acid
碱性化合物离子化:离子交换机理的关键
pKa = pH at which 50% of the analyte molecules in solution are charged (ionized) and 50% are un-ionized
©2019 Waters Corporation 31COMPANY CONFIDENTIAL
酸(质子供给体)
HA H+ + A-
(未离子化) (离子化)
50% @ pKa 50%100% Low pH 0% 0% High pH 100%
酸性化合物离子化:离子交换机理的关键
pKa = pH at which 50% of the analyte molecules in solution are charged (ionized) and 50% are un-ionized
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方法开发依据:OASIS 2×4方法学
¡ 氟尼酸是一种 非甾体抗炎免疫药 (NSAID)
¡ 治疗风湿性关节炎
¡ 两性离子 (羧酸 与 氨基)
氟尼酸M.W. 282.2pKa’s* = 4.44 and 2.26
*Takacs-Novak, K.; Avdeef, A.; Box, K. J.; Podanyi, B.; Szasz, G. J. Pharm. Biomed. Anal. 1994 (12) pp. 1369-1377.
©2019 Waters Corporation 33COMPANY CONFIDENTIAL
4种吸附剂上的回收率: 氟尼酸
氟尼酸的结果
0
20
40
60
80
100
Oasis® WAXElute 2
% 回
收率
Oasis® MCXElute 2*
Oasis® WCXElute 1
Oasis® MAXElute 2
*In addition, 18% is found in Elute 1
Chambers所有吸附剂的回收率都是可接受的
©2019 Waters Corporation 34COMPANY CONFIDENTIAL
评估洗脱液的基质效应
-30
-20
-10
0
10
20
% 基
质效应
Oasis® WAXElute 2
Oasis® MCXElute 2
Oasis® WCXElute 1
Oasis® MAXElute 2
Chambers
Oasis® WCX 被排除.
增强效应
抑制效应
©2019 Waters Corporation 35COMPANY CONFIDENTIAL
监控残留的磷脂
3 Phospholipid Channels
Time0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40
%
0
100
0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40
%
0
100
0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40
%
0
100
0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40
%
0
100MAX_e2_010406_003 1: MRM of 5 Channels ES+
TIC8.00e4
WAX_e2_010406_003 1: MRM of 5 Channels ES+ TIC
8.00e4
MCX_e2_010406_003 1: MRM of 5 Channels ES+ TIC
8.00e4
2.49
2.422.402.53
2.95
WCX_e1_010406_003 1: MRM of 5 Channels ES+ TIC
8.00e42.53
2.48
2.42
2.352.33
2.952.892.69
Oasis® MCX
Oasis® WCX
Oasis® MAX
Oasis® WAX
查看流动相的兼容性 Chambers
©2019 Waters Corporation 36COMPANY CONFIDENTIAL
洗脱液与流动相的兼容性
¡流动相 pH 10¡每种吸附剂的最终洗脱溶剂:
– Oasis® MCX Elute 2: 5% NH4OH in MeOH– Oasis® WAX Elute 2: 5% NH4OH in MeOH– Oasis® WCX Elute 1: 100% MeOH– Oasis® MAX Elute 2: 2% HCOOH in MeOH
¡结论:– Oasis® MAX 不兼容– Oasis® WAX 兼容性好
o基于上述3个因素,最终确定 Oasis® WAX。
©2019 Waters Corporation 37COMPANY CONFIDENTIAL
介绍 Oasis PRiME MCX: Oasis PRiME 家族新成员
• 样品预处理• 典型的酸化 使用 4% H3PO4,
1:1 稀释
• 100 mM 甲酸胺含 2% 甲酸
上样
• 100% 甲醇
清洗 1
• 5% 氨化甲醇
清洗 2
洗脱
简单 洁净:
•简单通用的方法即可让碱性化合物获得高的,可重复的回收率 √
•去除掉提取液中 99% 磷脂干扰√
• 该产品是经过PRIEM MCX产品QC检验,以确保性能 √
快速:
•无需活化平衡步骤√
•优化生产工艺以确保流速稳定 √
Oasis PRiME MCX 4 Step Method技术专利申报中
Not Validated for In Vitro Diagnostic Use
©2019 Waters Corporation 38COMPANY CONFIDENTIAL
Oasis PRiME MCX: Certificate of Analysis
©2019 Waters Corporation 39COMPANY CONFIDENTIAL
Mor
phine
Oxym
orph
one
Hydr
omor
phon
edih
ydro
code
ineNa
loxon
eCo
deine
preg
abali
nga
bape
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hylon
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beta
Nalt
rexo
lNo
roxy
codo
neAm
phet
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Naltr
exon
eOx
ycod
one
6-ac
etyl
mor
phine
MDA
Norh
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codo
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dron
eHy
droc
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inoclo
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N-de
smet
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hylph
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adol
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P
7-am
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nitra
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Norm
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PVP
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Prop
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hene
Met
hado
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α-Hy
drox
yalpr
azola
mAl
praz
olam
120%
100%
80%
60%
40%
20%
0%
Oasis MCX Recovery
Oasis PRiME MCX 4-Step
Recovery with Oasis PRiME MCX and Oasis MCX (N=4)
Recoveries are equivalent to Oasis MCX. What about phospholipids?
Not Validated for In Vitro Diagnostic Use
©2019 Waters Corporation 40COMPANY CONFIDENTIAL
在洗脱步骤降低了磷脂含量
Oasis PRiME MCX 4-Step
Oasis PRiME MCX 3-Step
MCX PRiME HLB 90:10 PRiME HLB 80:20 PRiME HLB 50:500
20000000
40000000
60000000
80000000
100000000
120000000
140000000
PC/LPC Concentration in Sample Eluate
58X decrease in phospholipid concentration compared to Oasis MCX Protocol 1
Oasis PRiME HLB with 90/10 ACN:MeOH
Oasis MCX with Protocol 1Oasis PRiME MCX with 4 Step Method
Not Validated for In Vitro Diagnostic Use
©2019 Waters Corporation 41COMPANY CONFIDENTIAL
可以更简单一点么?
• 样品预处理***• 200 mM 甲酸胺含有 4%
H3PO4 ,进行 1:1 稀释
• 100% MeOH
Load
• 5% 氨化甲醇
清洗 1
洗脱
Oasis PRiME MCX 3 Step Method专利技术申请中
***Note: The ammonium formate is
being added to the load solution, 200 mM with 4%
H3PO4(not 4% FA) for a final
concentration of 100 mM Ammonium formate and 2%
H3PO4
YES!!!Eliminate a wash step
to save even more time
Not Validated for In Vitro Diagnostic Use
©2019 Waters Corporation 42COMPANY CONFIDENTIAL
Mor
phine
Oxym
orph
one
Hydr
omor
phon
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ydro
code
ineNa
loxon
eCo
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abali
nga
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beta
Nalt
rexo
lNo
roxy
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phet
amine
Naltr
exon
eOx
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6-ac
etyl
mor
phine
MDA
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ydro
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droc
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one
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dron
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MDE
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alinic
acid
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Benz
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Zopic
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adol
N-de
smet
hyltr
amad
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hylph
enida
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pent
adol
α-PV
P
7-am
inoflu
nitra
zepa
mCo
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Norm
eper
idine
Mep
eridi
neZo
lpide
mα-
PVP
met
Norb
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trazo
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clidin
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α-Hy
drox
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zolam
Mida
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DPve
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Prop
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Met
hado
ne
α-Hy
drox
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azola
mAl
praz
olam
120%
100%
80%
60%
40%
20%
0%
Oasis PRiME MCX 4-Step
Oasis PRiME MCX 3-Step
Recovery with Oasis PRiME MCX:3 Step and 4 Step Methods (N=4)
Recoveries are comparable between the methods. What about phospholipids?
Not Validated for In Vitro Diagnostic Use
©2019 Waters Corporation 43COMPANY CONFIDENTIAL
在洗脱步骤降低了磷脂含量
Oasis PRiME MCX 4-Step
Oasis PRiME MCX 3-Step
MCX PRiME HLB 90:10 PRiME HLB 80:20 PRiME HLB 50:500
20000000
40000000
60000000
80000000
100000000
120000000
140000000
PC/LPC Concentration in Sample Eluate
3X increase in phospholipid concentration compared to Oasis PRiME MCX 4 Step
Method
Oasis PRiME HLB with 90/10 ACN:MeOH
Oasis MCX with Protocol 1
Oasis PRiME MCX with 4 Step
Method
Oasis PRiME MCX with 3 Step
Method
Not Validated for In Vitro Diagnostic Use
©2019 Waters Corporation 44COMPANY CONFIDENTIAL
生物样本前处理方法决策树
样品是否需要浓缩?
否 是
OStro 板 .通过式SPE.无需方法开发.去除磷脂/蛋白
OASIS PRiME HLB. 三步法. 流速更快.去除磷脂/色素/盐
OASIS MCX/MAX/WAX/WCX.2*4方法学.高选择性.进一步提升灵敏度
OASIS PRiME MCX (pKa>=4.5). 三步法/四步法. 流速更快. 去除磷脂
©2019 Waters Corporation 45COMPANY CONFIDENTIAL
Oasis 产品规格的选择
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小工具
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