LA GENMICA Y SU APLICACIN A LA EXPLOTACIN DE LA VARIABILIDAD NATURAL

En los ltimos aos se han completado las secuencias genticas de organismos modelo, como la planta Arabidopsis thaliana y el nematodo C. elegans, y otras plantas de inters agrcola. por ejemplo, ya disponemos de los genomas completos o parciales de avena, soja, cebada, tomate, arroz, trigo y maz.

El conocimiento de la secuencia gentica completa o genoma representa el primer paso para el conocimiento de las funciones y mecanismos de actuacin de los genes. De esta manera se revela las interacciones entre genes, que en ltimo trmino pueden ser las responsables de la caracterstica deseada.

La genmica se divide en dos grandes reas:

1. Genmica estructural, que se ocupa de la caracterizacin fsica de genomas enteros.

2. GENMICA FUNCIONAL, que intenta averiguar el momento (desarrollo embrionario, infancia, madurez o senescencia) y el lugar (tejido, rgano) de expresin de un determinado gen y ms tarde la funcin del mismo, estudiando las consecuencias de la alteracin de ese gen (anulndolo o exaltando su funcin) en un organismo mutado.

La Genmica funcional, caracteriza EL TRANSCRIPTOMA, que est constitudo por el conjunto completo de transcriptos, producidos por un organismo, EL PROTEOMA o conjunto de protenas codificadas por un genoma, y EL METABOLOMA o conjunto total de metabolitos de una clula, consecuencia de la funcin de los RNA y protenas.

La estrategia de aplicacin de las herramientas genmicas en Biotecnologa agrcola, se aproxima cada da ms a aquella utilizada en los procedimientos de descubrimiento y desarrollo de nuevos frmacos de la industria farmacutica.

Dichos procedimientos consisten en:

Identificar el gen o genes precursores de una protena o de un metabolito de inters o responsables de la virulencia de un patgeno.

Validar el gen o genes en modelos biolgicos y citolgicos.

Caracterizar las protenas resultantes de la expresin del gen o genes, incluida la estructura y las interacciones de la misma.

Conocer los mecanismos de la produccin y acmulo de los metabolitos de inters.

En ltimo trmino, desarrollar estrategias para la obtencin de nuevos productos, nuevas variedades o especies comestibles.

El objetivo de la genmica es la dilucidacin completa y exacta de la secuencia de ADN de un genoma haploide representativo de una especie.

La genmica permitir explotar la variabilidad natural presente en todos los genomas, tanto vegetales como animales. Dicha variabilidad permitir tanto gestionar los recursos almacenados en los bancos de germoplasma, como la bsqueda de genes de inters tiles en la mejora gentica.

MEJORA GENTICA

Una de las tcnicas mas importantes en la mejora gentica es la PCR, la aplicacin mas importante es la amplificacin y posterior deteccin de secuencias de DNA que caracterizan una especie o variedad. Dichas secuencias de DNA se denominan marcadores moleculares y son altamente especficas, permitiendo incluso la diferenciacin entre individuos de una misma especie en base a su lnea germinal.

En el genoma existen regiones de mayor variabilidad, es decir, zonas donde se encuentran un mayor nmero de variaciones entre especies o incluso entre individuos de una misma especie. Estas secuencias o regiones variables dentro de un cromosoma se denominan polimorfismos.

Las inserciones dirigidas son sin duda, una de las principales panaceas perseguidas por los ingenieros genticos, que a fecha de hoy no han sido resueltas. La insercin especfica de un gen en un lugar del genoma, puede lograrse a travs de la recombinacin homloga, asi como la extraccin especfica de ciertos genes que no interesan.

La transformacin gnica en el futuro se proyectarn mucho ms lejos que las actuales conocidas sobre resistencia a ciertas plagas o herbicidas. Es previsible que en los prximos aos se cultiven plantas transformadas tanto a gusto del consumidor como de la industria, incluyendo usos alimentarios y no alimentarios. As, por ejemplo, actualmente est bajo estudio comparativo la produccin industrial de ciertos frmacos como anticuerpos en distintos sistemas productivos.

Esta aplicacin de la Biotecnologa nos introduce de lleno en las bio-fabricas: microorganismos, plantas y animales transformados genticamente para producir metabolitos y/o protenas de inters.

OBTENCION DE PLANTAS TRANSGENICAS

El mejoramiento gentico vegetal se origin cuando el hombre se hizo agricultor y comenz la domesticacin de las plantas.

Con la incorporacin de los cruzamientos sexuales, el conocimiento de la biologa floral de las especies, los avances de la gentica se desarrollaron los mtodos de mejoramiento convencional utilizados actualmente.

El mejoramiento gentico convencional se basa en la existencia de variabilidad gentica para los caracteres que se desea mejorar y la reproduccin sexual para la incorporacin de esos caracteres. Este hecho hace que el aprovechamiento de la variabilidad est restringido por barreras de cruzabilidad.

Estas limitaciones ya han sido superadas actualmente con la tecnologia del ADN recombinante

para lograr una planta transgnica deben ocurrir tres procesos en la misma clula:

El transgen debe ser transferido al interior de la clula

b) El transgen debe integrarse al ADN celular

c) Se debe regenerar una planta completa a partir de la clula transgnica en la que se verificaron los procesos a y b.

Construccin del vector

Para introducir un transgen es necesario que sea incorporado previamente en un vector (por ejemplo un plsmido). Para ello:

Se digiere el ADN extrado de un organismo, cualquiera que sea su origen, con enzimas de restriccin.

Los fragmentos de restriccin as obtenidos pueden ser ligados enzimticamente a vectores de clonado, obtenindose, de este modo, clones de ADN recombinante

Pasos bsicos en la clonacin de un fragmento de ADN.

En primer lugar el ADN a clonar y el vector (plsmido) se cortan con la misma enzima de restriccin. Luego se ponen en contacto en presencia de una ligasa para obtener una molcula de ADN recombinante que se introduce en bacterias que multiplicarn el plsmido junto con el fragmento de inters

VECTORES DE TRANSFORMACIN

Un vector es una molcula de DNA que acta a modo de vehculo y permite que un gen o fragmento gnico se introduzca en el organismo diana y se integre en el genoma de manera estable. Ello permitir que dicho material gentico, as como la informacin gentica en l contenida, sea heredado por la descendencia como si de un gen propio se tratara.

En ocasiones, el carcter expresado por el gen introducido en el organismo, es importante que se exprese en un determinado rgano o tejido vegetal o simplemente en todas las clulas de la planta pero solamente en un momento determinado, etc. Dichos patrones de expresin espacio-temporales van a depender de la regin promotora que dirija la expresin del transgn y son a priori seleccionados por el investigador en funcin del uso que se quiera hacer de dicho transgn y forman parte del vector de expresin y transformacin en el que se inserta el gen de inters que se desea expresar.

Un transgen est compuesto por

una secuencia codificante (regin comprendida entre los codones de iniciacin y terminacin de la traduccin)

secuencias regulatorias que determinan el tejido, el momento del desarrollo y el nivel de expresin del transgen en la planta.

Por ejemplo, si el gen provienen de bacterias usualmente no pueden expresarse eficientemente en clulas eucariotas.

para optimizar la expresin del transgen es necesario reemplazar las secuencias regulatorias bacterianas por otras aptas para su expresin en clulas vegetales.

SECUENCIAS REGULATORIAS

La secuencia ms importante es el promotor

se distinguen:

Promotores constitutivos, que permiten la expresin del gen en toda la planta en forma continua.

Promotores inducibles, que responden a factores ambientales

Promotores especficos de tejido, que permitirn la transcripcin en determinados rganos y tejidos

Al momento de elegir el promotor debe tenerse en cuenta tambin la planta a transformar ya que algunos de ellos son menos activos en monocotiledneas, como el 35S; por otraparte el promotor de ubiquitina 1 (ubi1) de maz es uno de los ms efectivos en gramneas.

Seales de terminacin

Es indispensable una regin no traducida en el extremo 3, que incluya la seal de corte y poliadenilacin (terminador), necesaria para el correcto procesamiento del transcripto correspondiente.

El nivel y patrn de expresin del gen tambin puede estar afectado por la posicin del mismo en el genoma de la planta transformada (efecto de posicin). Esto puede deberse a la presencia de otras secuencias regulatorias cercanas, a la estructura de la cromatina, al patrn de metilacin, etc.

Dirigir la secuencia de inters a sitios especficos del genoma vegetal, elegidos por su patrn de expresin adecuado y estable. Esto se puede lograr usando sistemas de recombinacin sitio-especficos o mediante reemplazo gnico por recombinacin homloga.

METODOS TRANSFORMACION GENETICA

El primer mtodo de transformacin gentica de plantas fue la infeccin por Agrobacterium tumefaciens, bacteria que de manera natural infecta a las clulas de plantas dicotiledneas, transfiriendo parte de su dotacin gentica al husped. Si sustituimos los genes que se transfieren de esta bacteria por los que queremos insertar, se construye un vector eficaz de transformacin de plantas.

Para las plantas monocotiledneas se ha venido utilizando otro mtodo, llamado biolstico, consistente en el bombardeo, con microproyectiles cubiertos de DNA, de tejidos, embriones inmaduros o clulas a transformar. Debido a que este mtodo presenta limitaciones importantes como la baja eficiencia de transformacin, se est avanzando para optimizar mtodos de transformacin en plantas.

SISTEMAS DE TRANSFERENCIA GENICA EN PLANTAS

Pueden dividirse en:

SISTEMAS BIOLOGICOS: Transformacin mediada por Agrobacterium, virus del tipo Geminuvirus vectores biolgico que permiten la transferencia gnica.

SISTEMAS DE TRANSFORMACIN GENTICA DIRECTA, tambin llamados fsicos, por distintos mecanismos fsicos, se introduce el ADN en la clula.

Biobalstica, electroporacin, microinyeccin, transformacin con cationes divalentes, polietilenglicol y liposomas, y fusin de protoplastos.

La gran mayora de estos mtodos involucra la obtencin de protoplastos de las clulas vegetales y un protocolo de regeneracin de plantas a partir de estos.

CLONACION DE ADN FORANEO

Implica:

El conocimiento y aislamiento de secuencias de ADN (genes) que confieren una caracterstica deseada.

El uso de vectores de clonado (plsmidos, virus) y varias enzimas (de restriccion, nucleasas, ligasas)

ETAPAS DEL PROCESO DE OBTENCIN DE PLANTAS TRANSGENICAS

Clonado y expresin de los genes de inters.

Regeneracin y seleccin de plantas que hayan incorporado el gen.

Para efectos de plantas transgnicas que actan como biorreactores, se realiza una extraccin y purificacin de la protena y una caracterizacin del producto final.

TRANSFORMACIN MEDIADA POR AGROBACTERIUM

El gnero comprende cuatro especies fitopatognicas, dos de ellas ampliamente estudiadas (A. tumefaciens y A. rhizogenes). Ambas capaces de infectar una amplia variedad de dicotiledneas y tienen como blanco de infeccin las heridas, atacando clulas individuales y provocando su proliferacin.

A. tumefaciens causa tumores, enfermedad que se conoce como agalla de la corona y A. rhizogenes induce la proliferacin de races dando lugar a la enfermedad denominada raz en cabellera.

La capacidad patognica de estas bacterias esta asociada a la presencia de megaplsmidos (150-200 Kb) llamados plsmido Ti. inductor de tumores o Ri inductor de races

Durante la patognesis un fragmentode estos plsmidos llamado T-DNA (por transfer-DNA), es transferido a la clula vegetal, donde se integra al ADN cromosmico de la planta y su expresin causa proliferacin de clulas de la planta a travs de la sntesis y alteracin de la respuesta a hormonas vegetales.

El T-DNA contiene genes que se expresan eficientemente en la clula vegetal infectada y producen sntesis de hormonas vegetales (llamados oncogenes porque son los responsables de la proliferacin anormal del tejido) y genes que provocan la sntesis de opinas (fuente de carbono y nitrgeno para la bacteria).

El T-DNA est delimitado por dos repeticiones directas imperfectas de 25 pares de bases (bp) que lo flanquean, llamadas bordes derecho e izquierdo. Estos bordes son los nicos elementos en cis necesarios para dirigir el procesamiento del T-DNA. Cualquier fragmento de ADN ubicado entre estos bordes puede ser transferido a la clula vegetal.

ESTRUCTURA DEL T-DNA

Un aspecto destacable de AGROBACTERIUM es que usa la respuesta de la planta a las heridas (cicatrizacin y defensa) como quimioatractivo y activador del proceso de patognesis (adhesin). En eta etapa estn involucrados los genes cromosmicos (chv A, chv B, chv E, cel, psc A y att)

Luego de la adhesin de la bacteria a la clula vegetal, se produce el procesado y la transferencia del T-DNA, mediados por los genes vir (virulencia) que son inducidos por azcares y compuestos fenlicos, como la acetosiringona, producidos por clulas vegetales heridas.

operones esenciales para la transferencia del T-DNA (vir A, vir B, vir D, vir G)

Operones que permiten incrementar la eficiencia de la transformacin (vir C, vir E).

Este mecanismo de ingeniera gentica natural es aprovechado para la transferencia de genes de inters a las plantas, para lo cual, los oncogenes y genes de sntesis de opinas, son reemplazados por un marcador seleccionable y el gen a transferir.

La bacteria se pone en contacto con el explante durante un cierto tiempo, en l se produce la transferencia del T-DNA que contiene un gen marcador seleccionable y el o los transgenes de inters. Posteriormente se transfieren los explantes a un medio de cultivo que contiene un antibitico (que acta como bacteriosttico) y el agente selectivo correspondiente al gen marcador seleccionable utilizado.

Comparacin de tcnicas de transformacin directa e indirecta.

Los plsmidos Ti sin oncogenes se denominan desarmados,

Resulta difcil introducir genes en un plasmido desarmado usando tcnicas habituales de ADN recombinante.

Se han desarrollado dos sistemas de vectores para introducir genes en Agrobacterium: los vectores cointegrados, que deben formar estructuras cointegradas para replicarse en A. tumefaciens y los vectores binarios, que son capaces de replicarse en forma autnoma en esta bacteria.

En los vectores cointegrados, la insercin del ADN que contiene los transgenes dentro del T-DNA de un plsmido Ti desarmado se logra por recombinacin homloga.

PLASMIDO COINTEGRADO

Los vectores binarios (dos plasmidos), un plsmido pequeo con un origen de replicacin de amplio espectro de hospedantes, caractersticas que permiten su fcil manipulacin gentica usando E. coli como husped, contienen un T-DNA no oncognico. La introduccin de este plsmido a una cepa de Agrobacterium que contenga un plsmido llamado helper de virulencia (con la regin vir intacta y sin TDNA) la hace apta para la transferencia del T-DNA a las clulas vegetales.

VECTORES BINARIOSTransformacin

TRANSFORMACIN DIRECTA O POR MTODOS FSICOS

Transformacin de protoplastos

La introduccin y expresin de ADN forneo en protoplastos fue el primer mtodo de transferencia directa claramente demostrado en plantas

Los protoplastos pueden ser aislados en forma mecnica o por un proceso enzimtico que digiere la pared.

Los protoplastos pueden ser transformados utilizando polietilenglicol (PEG), electroporacin, microinyeccin o liposomas.

Tanto el PEG como la electroporacin producen poros en la membrana plasmtica por alteracin de la polaridad de la misma y por ellos penetra el ADN forneo.

La microinyeccin es otro mtodo utilizado en la transformacin de plantas, pero es difcil y laborioso; consiste en la introduccin de ADN dentro de protoplastos individuales mediante el uso de capilares de inyeccin y micro-manipulador

Cabe anotar que el cultivo de protoplastos es la metodologa ms sofisticada de cultivo in vitro de plantas, por lo cual representa gran complejidad experimental y no est disponible ms que para algunas especies y dentro de ellas particularmente en genotipos modelo.

Por ello se desarrollaron metodologas alternativas de transformacin directa como la electroporacin de tejidos, el uso de fibras de carburo de silicio para facilitar la entrada del ADN en las clulas en cultivo y el bombardeocon microproyectiles o micropartculas.

BOMBARDEO DE MICROPARTCULAS

Es este proceso micropartculas de oro o tungsteno cubiertas con ADN son aceleradas por un gas comprimido e introducidas en clulas vegetales. Estas particulas al ser disparados a grandes velocidades pueden atravesar la pared y la membranas de la clula vegetal bombardeada sin causarle daos letales.

Para el bombardeo se puede emplear cualquier tipo de explante vegetal, desde clulas o protoplastos hasta plntulas completas, pasando por tejidos organizados en embriones y meristemas.

El explante es sometido a un tratamiento osmtico pre y posbom-bardeo, que produce plasm- isis celular, evitando que el impacto y la penetracin de las partculas daen las clulas

Los vectores plasmdicos que se usan en este tipo de procedimiento slo requieren un origen de replicacin que permita un alto nmero de copias de los mismos en E. coli, aspecto que facilita en la prctica la preparacin del ADN necesario en grandes cantidades para la transformacin gentica por este mtodo.

TRANSFORMACIN DIRECTA VS. INDIRECTA

Integracin del transgen al ADN cromosmico. A. tumefaciens posee un mecanismo natural muy eficiente para transferir, al ncleo celular, el T-DNA que contiene el transgen y producir una integracin aleatoria en regiones cromosmicas con actividad transcripcional.

el T-DNA, acompaado de protenas que lo protejen de la accin de nucleasas. Por el contrario, en el mtodo biolstico el ADN transferido no est asociado a protenas, por lo que al ser parcialmente degradado, slo parte del mismo llega al ncleo donde se produce, con baja eficiencia, la integracin al azar en el ADN cromosmico.

La construccin de vectores es mucho ms sencilla en el caso del mtodo biolstico.

en ambos mtodos la integracin del transgen en el genoma se produce al azar. Como consecuenciade ello, diferentes plantas transgnicas provenientes de un mismo experimento, presentan inserciones en distintos sitios del genoma receptor. Expresion del trangen de forma diferente.

GENES MARCADORES

El gen marcador seleccionable otorga a las clulas transgnicas que lo expresan una importante ventaja, con respecto a las clulas no transgnicas, al permitirles crecer en un medio de cultivo que contiene el agente selectivo correspondiente.

el gen man A de E. coli permite a las clulas vegetales que lo expresan utilizar la manosa como fuente de carbono, lo cual no es posible para las clulas no transgnicas

El gen gus A proveniente de E. coli codifica para la enzima -glucuronidasa. Esta protena puede ser detectada cualitativamente por tincin histoqumica, en presencia de un sustrato especfico, por la produccin de un precipitadoazul-ndigo de fcil visualizacin.

Recientemente, el gen de la protena fluorescente verde, gfp (green fluorescent protein), aislado de una medusa, se ha convertido en un gen marcador visualizable in vivo muy utilizado. Cuando se ilumina con luz ultravioleta o luz azul, tejidos que contienen clulas que expresan este gen, se observa un brillo verde fluorescente.

TCNICAS DE DETECCIN DEL TRANSGEN Y SUS PRODUCTOS

Para ello se emplean tcnicas como:

Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), un resultado positivo indica solamente que en la muestra existe una secuencia que amplifica con los primers utilizados pero no indica si el transgen se encuentra incorporado al genoma de la planta.

Hibridacin southern o Southern blotting, Adems de indicar la presencia o no de la secuencia de inters, da informacin acerca de la integracin de la misma en el genoma de la clula husped (nmero de copias integradas y nmero de loci en los cuales se produjo la integracin).

Anlisis de ARN: Las tcnicas de RTPCR (transcripcin reversa seguida de PCR) con la hidridacin de ARN o Northern blotting pueden resultar valiosas herramientas para detectar los transcriptos de inters presentes en la muestra. La RT-PCR presenta algunas ventajas frente al Northern blotting: se requiere poca cantidad de material, posee una alta sensibilidad y la muestra es de fcil preparacin.

ELISA y Western blotting: aquellas plantas que poseen la secuencia de inters y la expresan como transcripto, pueden ser analizadas con estas tcnicas inmunolgicas a fin de determinar la presencia de la protena codificada por el transgen.

APORTE DE LA TRANSFORMACIN GENTICA A LA VARIABILIDAD GENTICA

La expresin de secuencias codificantes no existentes en la especie (ejemplo: protenas insecticidas de origen bacteriano).

b) La expresin de nuevas formas allicas de genes que ya estn presentes en el genoma (ejemplo: tolerancia al glifosato en soja).

c) La expresin de secuencias codificantes presentes en el genoma pero bajo el control de nuevas secuencias regulatorias que modifican su nivel o patrn de expresin (ejemplo: protenas relacionadas a la patognesis).

d) La inhibicin de la expresin de genes residentes en el genoma

La inhibicin de la expresin gnica se puede lograr usando diferentes tcnicas como: cosupresin, antisentido y la denominada interferencia del ARN. Todas ellas se basan en un proceso denominado silenciamiento gnico post- ranscripcional.

La cosupresin consiste en la obtencin de plantas transgnicas que expresan un transgen homlogo del gen residente que se desea silenciar.

La tcnica del ARN antisentido involucra la sntesis de molculas de ARN que son complementarias al ARNm producido por la transcripcin del gen que se quiere silenciar.

La interferencia del ARN es parte de un mecanismo regulatorio natural de la expresin gnica, por ello es la ms utilizada, para silenciar genes en plantas. La tcnica se basa en la construccin de transgenes cuyo producto final es un ARN. Este contiene parte de la secuencia transcripta del gen a silenciar en forma de repeticin invertida. Como consecuencia de esta estructura , cuando este tipo de transgen se transcribe en la planta se genera un ARN de doble cadena que dispara el mecanismo de degradacin dependiente de la secuencia antes mencionado

OBTENCIN DE PLANTAS TRANSPLASTMICAS

La obtencin de plantas transplastmicas ha recibido notable atencin, el genoma de los plstidos (plastoma) se ha convertido en un blanco atractivo para la ingeniera gentica ya que esta tecnologa ofrece una serie de ventajas sobre la transformacin del genoma nuclear

Se pueden obtener altos niveles de expresin de los transgenes y elevados niveles de acumulacin de las protenas codificadas por ellos (hasta el 47% de las protenas solubles totales).

Es posible expresar un transgen opern con varias secuencias codificantes bajo el control de un mismo promotor.

No se observa efecto de posicin debido a que la integracin del transgen est dirigida a un sitio particular del plastoma.

No se observa silenciamiento de transgenes.

Para las especies que tienen transmisin materna de los plstidos (la mayora). Se minimiza la dispersin de los transgenes por el polen debido a la ausencia de transmisin de los plstidos por el mismo.

A pesar de la naturaleza eminentemente procariota del sistema gentico de los plstidos, se ha demostrado que estas organelas pueden procesar protenas eucariotas permitiendo su correcto plegamiento y la formacin de puentes disulfuro.

La existencia de secuencias altamente conservadas en el plastoma de varias especies es explotada para el diseo de vectores universales, potencialmente tiles en la transformacin de los cloroplastos de numerosas especies.

IMPORTANCIA Y APLICACIONES DE LAS PLANTAS TRANSGNICAS

Aumento de la productividad de los cultivosLa reduccin en el uso de agroqumicosLa conservacin de la tierra arable, el agua y la energaLa reduccin de la contaminacin del ambiente y los beneficios para la salud humana derivados de estos aspectos

Mejoramiento de la calidad nutricional (protenas, aceite, vitaminas y minerales)

La eliminacin de alergenos

La fitoremediacin (es decir la recuperacin de ambientes contaminados mediante el uso de plantas)

La utilizacin de plantas como bioreactores para la expresin de protenas recombinantes con fines tales como la produccin de vacunas comestibles, anticuerpos y otras protenas de uso teraputico o industrial.