22-71 :21 یپایپ ،1392 ،لوا هرامش ،مهن هرود /یکشزپماد یژولویبرکیم هیرشن

نینیتولگامه یگتفاکش هیحان هنیمآ ياهدیسا یلاوت نییعت و یلوکلوم صیخشت یلامش ناسارخ ناتسا یتشوگ رویط زا هدشادج يازناولفنآ سوریو رد

2داژن ینمهب یلع دمحم ،2يرتشوش دیمحلادبع ،*2شخبروپ یلعدیس ،1يراهب نامژپ

تاقیقحت و مولع دحاو یمالسا دازآ هاگشناد ،یکشزپماد یصصخت مولع هدکشناد ،یژولویبورکیم یصصخت یارتکد یوجشناد -1 ناریا ،نارهت ،نارهت

ناریا ،جرک ،یزار یزاس مرس و نسکاو تاقیقحت هسسوم ،رویط یاه یرامیب صیخشت و قیقحت شخب -2

7391 تشهبیدرا 4 :شریذپ خیرات 1391 رذآ 27 :تفایرد خیرات

هدیکچ هاب یا هدامع تارااسخ لااس ره و دشابیم روشک یتعنص یاهیرادغرم رد مهم یسوریو یاهیرامیب زا یکی ناگدنرپ یازناولفنآ یرامیب

هزراابم و یریگاشیپ ماهم یاهتیولوا زا یکی اهنآ تدح نییعت و ازناولفنآ سوریو عیرس صیخشت.دنک یم دراو روشک رویط شرورپ تعنص یگتفاکش لحم یلااوت یسررب زین و ازناولفنآ یاهسوریو صیخشت تهج RT-PCR شیامزآ زا .دوشیم بوسحم روشک رد یرامیب نیا هیلع نایا رد .تافرگ راراق هدافتاسا دروم ازناولفنآ یاههیوس تدح ینیبشیپ روظنم هب یلوکلوم صخاش کی ناونع هب (HA) نینیتولگامه نیئتورپ هاب کوکاشم هاک یلاماش نااسارخ ناتاسا رد یتاشوگ غرم شرورپ دحاو 12 زا یان پآوس هنومن 161 ازناولفنآ یرامیب شیاپ تهج قیقحت نیایعت یاراب نآ رد هک دیدرگ یزیرهیاپ ناریا رد عیاش یاهپیتونژ ساسارب RT-PCR یلوکلوم شیامزآ .دیدرگذخا دندوب ازناولفنآ یرامیب نژ یاصاصتخا یااهرمیارپ زا H9، H5 ، H7 یااه پایت تاحت نیایعت تاهجو(M) سکیرتاام نژ یصاصتخارمیارپ زا ازناولفنآ A هورگ پیت ،داش قایرزت هزور 9-11 (SPF) راد نینج غرم مخت هبA پیت رظن زا هدش تبثم یاههنومن ،یلاوت نییعت تهج .دش هدافتسا (HA)نینتولگامه یسوریو یRNA جارختسا و نویسانیتولگامه تست یسررب تهج و یثنخ دصرد1 نیلامرف زا هدافتسا اب کیئوتنالآ عیام زور جنپات هس زا سپ هاب یدایتوئلکون یلاوات نیایعت تاهج و رایثکت نینیتولگاامه نژ یگتفاکاش لحم هدنریگربرد 437bp لوط هب یاهعطق سپس .دیدرگ هدافتسا

یااه هانومن RT-PCR شورزا هدافتاسا اب هکداد ناشن جیاتن. دیدرگ همجرت یاهنیمآدیسا یلاوت هب تیاهنرد و دش لاسرا ناملآMWG تکرش زا و یافنم ، H5 ، H7 پایت تاحت راظن زاA پیت یاهسوریو مامت .دندوب تبثم ازناولفنآ A پیت سوریو رظن زا یتعنص یرادغرم 7 زا هدشذخا هاچرگا ،دندوب KSSR یلاوت یاراد هیوس 7ره هکداد ناشن نینیتولگامه نیئتورپ یگتفاکش لحم یسررب .دندش هداد صیخشت تبثم H9 ظاحل هاب . تاشاد تواافت داشاب یام RSSR اتدامع هاک نارایا یالبق یااههیادج یوگلا اب یلو دشابیم اههیوس ندوب داحریغ هدنهد ناشن یلاوت نیا

ار ازناوالفنآ یاه سوریو عیرس یقیرفت صیخشت ،هقطنمرد جیار یاهپیتتحت یصاصتخا یاهرمیارپزا هدافتسا اب RT-PCR شیامزآ یلکروط نیا لیدبت تهج هوقلاب رطخ کی ناونع هب ناوت یم ار H9N2 یاهسوریورد نینیتولگامه نیئتورپ تفاکش لحم رد رییغت .دزاسیمریذپ ناکما

.ددرگیم هیصوت اهسوریو نیا یکیتنژ یلاوت رمتسم شیاپ اذل. تفرگرظن رد داح یاههیوس هب اهسوریو

یلامش ناسارخ ،نینیتولگامه نیئتورپ یگتفاکش لحم ،H9 - H5- H7 پیتتحت ، RT-PCR،ناگدنرپ یازناولفنآ: يدیلک تاملک

شخبروپ یلعدیس :لوئسم هدنسیون ٭ 03114573621 :نفلت . ناریا ،جرک ،یزار یزاس مرسو نسکاو تاقیقحت هسسوم ،رویط یاه یرامیب صیخشت و قیقحت شخب :سردآ apourbakhsh@rvsri.ac.ir:کینورتکلا تسپ

21 یپایپ ،1392 ،لوا هرامش ،مهن هرود /یکشزپماد یژولویبورکیم هیرشن 22

همدقم یاه یرامیب نیرتمهم زا یکی ناگدنرپ یازناولفنآ هدش شرازگ ناهج طاقن رسارس زا هک تسا یسوریو هداوناخ یاه سوریو طسوت یرامیب نیا .تسا

یاهسوریو زا یضعب .دوش یم داجیا هدیریووسکیموترا و ناسنا نیب کرتشم لماوع ءزج ناگدنرپ یازناولفنآ تمالس ،موادم رطخ کی ناونع هب و دنشابیم ناویح .دننکیم دیدهت ار یناویح و یناسنا یاهتیعمج اب اهناسنا تنوفع هتشذگ لاس 6 یط رد هک یروطب

پیتتحت 3 زا ناگدنرپ یازنولفنآ یاه سوریو(H5,H7,H9) یرامیب نیا .(7) تسا هدش هداد صیخشت تنوفع ای ینیلاب تحت یاهمرف زا نوملقوب و نایکام رد هدنشک و داح یرامیب ات سفنت یناقوف هاگتسد فیفخ ساسا رب A پیت ازناولفنآ یاهسوریو .دشابیم ریغتم زادینیمآرون و (HA) نینیتولگامه ینعی یحطس نیئتورپ(NA) پیت تحت 61 نونکات .دنوشیم یدنب میسقت (N1-9) زادینیمآرون پیت تحت 9 و (H1-16) نینیتولگامه رد دنناوتیم اهنآ یمامت هک تساهدش ییاسانش .(2 و 12) دنوش تفای ناگدنرپ

هورگ یازناولفنآ هب قلعتم یاه سوریو مامت نونکات A ناگدنرپ رد داح یکینیلک مئالع و الاب تدحاب هک هدوب H7 وH5 یاهپیت تحت هب قلعتم تسا هدش هدید اب یاه پیت تحت ءزجH9N2 یاه سوریو .(2) تسا رد یلو دنوشیم یدنب هقبط دایز نادنچ هن ییازیرامیب

تاراسخ و تافلت زا یدایز تاشرازگریخا ههد لوط تسا هدش شرازگ ناریا روشک رد اههیوس نیا زا یشان یاهشور زا یکی تسا یهیدب .(11 ،21 ،12 و 13) هقطنم رد یرامیب راشتنا زا یریگولج و یریگشیپ

راذگریثات یکیتنژ تارییغت زا عالطا و عیرس صیخشت-هشیر تسایس ناریا رد اریز .دشاب یم سوریو تدح رب

دادخر تروص رد یدیدش یاهنیطنرق و ینک

نییعت و دوشیم هتشاذگ ارجا هب داح قوف یازناولفنآ رد اذل .ددرگیم یقلت مهم رایسب اهسوریو نیا تدح لحم رد هنیمآ یاهدیسا یکیتنژ یلاوت هعلاطم نیا

یاهدننکنییعت شقن هک نینیتولگامه نیئتورپ یگتفاکش دروم ،دراد ازناولفنآ یاهسوریو ییازیرامیب رد

فلتخم یاه شور نونکات .(1) تفرگرارق یسررب

RT-PCR یاهپیت تحت و ازناولفنآ صیخشت تهج هتفرگراکب و حرطم فلتخم نارگشهوژپ طسوت نآ

یاههیصوت ساسارب نکیل .(5 ،51 و 32) تسا هدش

تشادهب نامزاس و (WHO) یناهج تشادهب نامزاس ساسارب دیاب اهشور نیا زا کیره باختنا (OIE) ماد دشاب ییایفارغج هقطنم نآ رد بلاغ یاههیوس پیتونژ 73) دشاب رادروخرب رظن دروم تیساسح و نانیمطا زا ات لکتورپ باختنا و قوف دراوم نتفرگرظن رد اب .(91 و نییعت و ییاسانش هب مادقا ، RT-PCRشیامزآ بسانم رد عیاش ازناولفنآ یاهسوریو یکیتنژ یلاوت

یفاک تاعالطا هک یلامش ناسارخ ناتسا یتشوگرویط .دیدرگ ،تشادن دوجو اهنآ دروم رد

راک شور و داوم یتشوگرویط هلگ 12 تافلت زا ییان پآوس 161

یتعنص یاهیرادغرم زا ازناولفنآ یرامیب هب کوکشم رد اهپآوس نیا .دیدرگ ذخا یلامش ناسارخ ناتسا شخب هب خی ترواجم رد و سوریو یلاقتنا طیحم یزار یزاس مرس و نسکاو هسسوم رویط یاهیرامیب دحاو کی هب طوبرم پاوس 0 ره .دیدرگ لاسرا

یتنآ یواح PBS لولحم یس یس کی هب یرادغرم 1151 رود اب طولخم نیا دیدرگ طولخم کیتویب

RPM 112 و دش ژوفیرتناس هقیقد 11 تدم هب زین وRNA جارختسا تهج ییور لولحم زا رتیلورکیم هزور 9 (SPF) راد نینج غرم مخت لخاد هب قیرزت

.دیدرگ تشادرب

62 ...هنیمآ یاهدیسا یلاوت نییعت و یلوکلوم صیخشت

RNAجارختسا زا یان یاههنومن زا سوریو RNA یزاسادج تهج لمعلاروتسد قبط الاب صولخ ابRNA جارختسا تیک دیسا یزاسادج یارب روبزم تیک .دش هدافتسا نآ یحارط RT-PCR ماجنا روظنم هب یسوریو کیئلکون

لولحم رتیلورکیم 112 رادقم راک ماجنا یارب .تسا هدش رفاب زا تسا یبیکرت هک (Working Solution) یراک دیسا کیلیندآ یلپ و (Binding Buffer) هدننک لصتم(Poly A) یرتیل یلیم 5/1 پویت کی رد 112 رادقم سپس .تفرگ رارق ژوفیرتناسورکیم هفاضا نآ هب سوریو یواح کیئوتنالآ عیام رتیلورکیم 15 رادقم یاه نیئتورپ مضه روظنم هب سپس .دش هب پویتورکیم نیا .دش هدوزفا A زانیئتورپ رتیلورکیم سپس .دش هبوکنا دارگیتناس هجرد 24 رد هقیقد 11 نازیم هدوزفا تایوتحم هب هدننک لصتم رفاب رتیلورکیم 111 رد رادرتلیف بویت ،هنومن لاقتنا یارب .دش طولخم و هدش تایوتحم مامت و تفرگرارق هدننک عمج بویت لخاد لقتنم رادرتلیف بویت لخاد هب یرتیلورکیم 5/1 پویت

هعومجم هدننک عمج پویت هب تایوتحم روبع یارب .دش زا دعب .دش ژوفیرتناس g 1110 رد هقیقد کی تدم هب

یقاب ،هدیبسچ رادرتلیف بویت هب RNA ژوفیرتناس سپس دش جراخ هدننک عمج پویت هارمه هب تایوتحم رارق دیدج هدننک عمج پویت کی نورد رادرتلیف پویت لماوع هدننک فذح رفابرتیل ورکیم 115 و دش هداد پویت هب (Inhibtion Removal Buffer) یراهم g هقیقد 1 تدم هب هرابود و هدش هفاضا ییالاب رادرتلیف هارمه هب هدننک عمج پویت هرابود دش ژوفیرتناس 1110 پویت اددجم راب نیموس یارب و دش جراخ تایوتحم هلحرم نیا ات دیدرگ هارمه هدننک عمج پویت اب رادرتلیف یوشتش ی هدامآ مونژ و هدش عفترم اه هدننک تعنامم رادرتلیف پویت اددجم روظنم نیا یارب دوش یم رتشیب

157 راب نیا و دش هداد رارق هدننک عمج پویت نورد 1 تدم هب هعومجم و دش هفاضا وشتش رفاب رتیلورکیم هب هدننک عمج پویت و دش ژوفیرتناس g 1110 رد هقیقد رادرتلیف پویت اددجم دیدرگ جراخ تایوتحم هارمه 157 هرابود دش هداد رارق هدننک عمج پویت نورد هب و دش هفاضا رادرتلیف بویت هب وشتسش رفاب رتیلورکیم جورخ روظنم هب دش ژوفیرتناس g 1110 رد هقیقد1 تدم 11 تدم هب هعومجم نیمه اددجم وشتسش رفاب لماک بویت سپس .دش ژوفیرتناس g 11131 رد هیناث

بویت راب نیا و دش جراخ تایوتحم هارمه هب هدننک عمج یلیم 5/1 ژوفیرتناسورکیم بویت کی نورد رادرتلیف هدش صلاخ مونژ یروآ عمج یارب دش هداد رارق یرتیل

هب (Elution Buffer) هدننک قیقر رفاب رتیل ورکیم 115 g 1110 رد هقیقد 1 تدم هب و هدش هقاضا رادرتلیف بویت

و دیدرگ جراخ رادرتلیف بویت دش ژوفیرتناس دروم سوریو هدش جارختسا مونژ یواح بویتورکیم .دوب رظن

RT-PCR ماجنا یا هلحرم ودRT-PCR تیک زا روظنم نیا یارب

.دش هدافتسا (Viva two step RT-PCR Kit) اویو RT (Reverse Transecriptase) شنکاو ماجنا تهج رتیلورکیم 2 اب ار هدش جارختسا RNA رتیلورکیم جنپ طولخم pmol 11 تظلغ اب (Forward) ییولجرمیارپ 11 هب زائلکون زا یراع بآ زا هدافتسا اب ارنآ مجح و هبوکنا C ˚56 رد هقیقد 5 تدم هب و هدناسر رتیلورکیم .دیدرگ درس خی یور رد هقیقد 2 سپس و دیدرگ رتیلورکیم 11 تخاس زاین دروم تابیکرت نآ لابندب

cDNA زا رتیلورکیم کی لماشmM dNTP mix 11، M-unit سوکعم یرادرب هخسن میزنآ رتیلورکیم مین

111MuLV Reverse Transcriptase ، رتیلورکیم ود بآ رتیلورکیم 5/6 و (X Buffer M-MuLV) 11رفاب

21 یپایپ ،1392 ،لوا هرامش ،مهن هرود /یکشزپماد یژولویبورکیم هیرشن 62

12 هب ییاهن مجح ات دیدرگ هفاضا زائلکون زا یراع تعاس کی تدم هب لصاح طولخم .دیسر رتیلورکیم .دش یرادهگن دارگیتناس هجرد 27 یامد رد

یبقع و ییولج رمیارپ رتیلورکیم PCR2 شنکاو رد mMol، 5 0.4 ییاهن مجح و pmol11 تظلغ اب mM dNTP mix 11رتیلورکیم کی ،cDNA رتیلورکیم

7/1 ،زارم یلپ رفاب رتیلورکیم mM2/1 ، 5 ییاهن مجح و دحاو ود ییاهن تظلغ اب زارمیلپ Taq DNA رتیلورکیم یراع بآ زا هدافتسا اب ار ییاهن مجح و هدرک طولخم مزال ییامد همانرب .میناسر یم رتیلورکیم 15 هب زائلکون زا

هجرد 79 لماش ازناولفنآ A پیت ییاسانش تهج

79 لماش ریثکت لکیس 17 ،هیلوا تشرساو دارگیتناس 25 وگلا هب رمیارپ ندیبسچ هلحرم ،تشرساو هجرد هب H9 یارب C15˚ و H7و A، H5 پیت یارب هجرد کی تدم هب C24˚ شرتسگ هلحرم ،هقیقد کی تدم .دشاب یم هقیقد 4 تدم هب C24˚ ییاهن شرتسگ و هقیقد زا .دنشاب یم (1) لودج قباطم هدش هدافتسا یاهرمیارپ طسوت هدش یرادیرخ H7N2 و H9N2، H5N1 نژ یتنآ زا و تبثم لرتنک ناونع هب روشک یکشزپماد نامزاس هدافتسا یفنم لرتنک ناونع هب زائلکونزا یراع بآ

.دیدرگ نی توریییپ فاکیییش ریییحم یلاویییت نیییییعت نینیتولگامه A پیت رظن زا RT-PCR شنکاو رد هک ییاههنومن SPF هزور 11 راد نینج غرم مخت لخاد هب دندوب تبثم عیام زا رتیلورکیم 12 زور 5-3 زا سپ .دیدرگ قیرزت

دصرد RBC 11% اب ار کیئوتنالآ هسیک زا لصاح اب ،نویسانیتولگامه شنکاو نتشاد تروص رد و طولخم اه سوریو ات دیدرگ طولخم رازه رد کی نیلامرف دروم RNA جارختسا تهج سپس و دندرگ لاعفریغ

لوط هب نینیتولگامه مونژ زا یتمسق .تفرگرارق هدافتسا137 bp نیئتورپ تفاکش لحم هدنریگربرد هک هدافتسا اب RT-PCRشنکاو طسوت ،تسا نینیتولگامه طیارش .(1 لودج) دیدرگریثکت HA یاهرمیارپ زا

و دشاب یم H9 هیوس هباشم ییامد ی هدودحم و شنکاو تهج هک ییاهرمیارپ نامه اب هارمه PCR لوصحم هب یلاوت نییعت روظنم هب دوب هدش هتفرگ راکب ریثکت

اهتنا رد و دیدرگ لاسرا ناملآ روشک MWG تکرش Bioرازفا مرن زا هدافتسا اب هدمآ تسدب یمونژ یلاوت

edit Vertion 7 دیدرگ همجرت یاهنیمآ دیسا یلاوت هب.

جیاتن یرادغرم 12 زا هدمآ تسدب یاه پآوس 161 زا لماش یرادغرم ره) یرادغرم 7 یسفنت مئالع یاراد ظاحل زا RT-PCR شنکاو رد (پآوس هنومن تشه هدافتسا اب دعب هلحرم رد .(1) لکش دندوب تبثم A پیت H9 و H5، H7 یاهپیت تحت یصاصتخا یاهرمیارپ زا H9 رظن زا هنومن راهچ ره هک دنتفرگ رارق شیامزآ دروم

یلاوت .(2) لکش دندوب یفنم H7 و H5 ظاحل زا و تبثم ره رد نینیتولگامه نیئتورپ تفاکش لحم یاهنیمآ دیسا

.دنداد یم ناشن ار KSSR یوگلا سوریو راهچ

62 ...هنیمآ یاهدیسا یلاوت نییعت و یلوکلوم صیخشت

HA نژ یلاوت نییعت هج هدافتسادروم رمیارپ و H9,H5,H7 ياه پیت حت و A پیت يازناولفنآ صیخشت هج هدش هدافتسا ياهرمیارپ :1 -لودج عبنم یصاصتخا لوصحم هزادنا رمیارپ یلاوت

TTC TAA CCG AGG TCG AAA CG ACA AAG CGT CTA CGC TGC AG

232 M (32) TTGCACCACACAGAGCACAAT TGATGTATGCCCCACATGAA

027 H9 (12) GGG GAA TGC CCC AAA TAT GT TCT ACC ATT CCC TGC CAT CC

971 H5 (9) ATGTCCGAGATATGTTAAGCA TTTGTAATCTGCAGCAGTTC

112 H7 (31) GCATACATCATCCACCCAC TTGATCTAGCAGGCACGTTC

137 HA (11)

یتعنص رویط زا هدش ذخا ياه هنومن رد سکیرتام نژ يور رب RT-PCR جیاتن :1 -رکش

Lad: Ladder 100 bp، A:سکیرتام نژ تبثم لرتنک bp232

سکیرتام نژ یصاصتخا یاهرمیارپ زا هدافتسا اب A پیت ازناولفنآ هدش تبثم یکینیلک یاه هنومن :1 ،2 ،3 ،7

یلامش ناسارخ یتعنص رویط زا هدمآ سدب ياه هنومن نینیتولگامه نژ يوررب RT-PCR جیاتن :2رکش

Lad:Ladder 100bp؛A:Type A influenza؛

H5:(تبثم لرتنک) درادناتسا نژ یتنآ H5N1؛H7: درادناتسا نژ یتنآH7 (تبثم لرتنک)

H9:نژ یتنآ H9N2؛(تبثم لرتنک(درادناتساNeg:یفنم لرتنک نینیتولگامه نژ یصاصتخا یاهرمیارپزا هدافتسا اب H9N2 پیت تحت هدش تبثم یکینیلک یاه هنومن :7،3،2،1

21 یپایپ ،1392 ،لوا هرامش ،مهن هرود /یکشزپماد یژولویبورکیم هیرشن 22

ثحب اب RT-PCR یلوکلوم شیامزآ زا هعلاطم نیا رد رد جیار یاههیوس یصاصتخا یاهرمیارپ زا هدافتسا تهج نئمطم و عیرس شور کی ناونع هب هقطنم .دش هتفرگ هرهب نآ یاهپیت تحت و ازناولفنآ صیخشت یگتفاکش لحم هنیمآ یاهدیسا یلاوت یسررب نینچمه هب تبسن ار یتوافتم یوگلا نینیتولگامه نیئتورپ

.دندادیم ناشن ناریا یلبق تاشرازگ

صیخشت یاهکینکت زا یفلتخم عاونا نونکات -سوریو ییاسانش تهج RT-PCRساسارب یلوکلوم تالکشم زا یکی یلو .تسا هدش شرازگ ازناولفنآ یاه نیاربانب .تساهنآرابتعا نازیم نییعت تاشیامزآ نیا هدمع ساسارب ادتبا تاشیامزآ نیا هک تسا هدش هیصوت رد نآزا سپ و هدش عقاو دییات دروم OIE یاهدرادناتسا

تسا نیا مهم هتکن .(91) دنوش هتفرگراکب هعرزم حطس یکینیلک یاههنومن یور رب RT-PCR یاهکینکت هک-تحت ییاسانش و عیرس صیخشت دناوت یم یتروص رد یحیحص روط هب اهنآ رمیارپ هک دنزاس رسیم ار اه پیت

عاونا ساسا و هیاپ .(13) دشاب هدش باختنا و یحارط هیلوا روط هب RT-PCR شور اب یصیخشت یاهتفایهر عاونا نیبرد نژ نیا اریز .دشابیم سکیرتام نژ ییاسانش-یم هدش تظافح رایسب Aپیت ازناولفنآ یاهسوریو H7 و H5 یاه پیتتحت ییاسانش نآ لابندب ،دشاب

(2112) ناراکمه و نمکاپسا .(02) دریگیم تروص دنداد رارق دییات دروم ار RT-PCR تاشیامزآ یگژیو یصاصتخا یاهبورپ/رمیارپ هک دنداد رادشه یلو یاکیرمآ صتخم H7 و H5 یاههلوزیا ییاسانش تهج-تحت ریاس یارب تسا نکمم و دناهدش یحارط یلامش یط رد هک تسا نیا تیعقاو .(02) دنشابن بسانم اه پیت

رسارس رد یا هدرتسگ یکیتنژ تاریغت هتشذگ لاس51 هخاش 21 و تسا هداد خر H5N1 یاهسوریو رد ناهج

نژ کیتنژولیف زیلانآ ساسارب نآ یاههخاشریز اب هارمهHA هخاش ،مانتیو رد 1 هخاش .(6) تسا هدش شرازگ

یاه هخاش و رصم رد 2.2.1 هخاش ،یزنودنا رد 2.1.3 نیارب هوالع .دنتفای شرتسگ ایسآ رد 7 و 2.3.4 و 2.3.2

رد .(6) دنا هدش میسقت ییاههخاشریز هب اهنآ زا مادکره یروهمج رد 2.2 هخاش زا ییاهسوریو 6112 لاس دش شرازگ ناریا و رصم ،هیکرت ،قارع ،ناجیابرذآ یاهوق زا H5N1 سوریو 6112 لاس رد ناریا رد .(53) یزار هسسوم طسوت یلامش بالات ود رد یشحو یاههخاش قوف دراوم هب هجوت اب .(72) دیدرگ یزاسادج دنشابیم عیاش ناهج رد H5 یاه پیت تحت زا یفلتخم تاشیامزآ نیا یاهلکتورپ و اهرمیارپ هک تسا حضاو هقطنم نآ رد عیاش یکیتنژ یاههدر اب بسانتم دیاب زین یشور یناهج تشادهب نامزاس ساسا نیارب .(73) دشاب

H5N1 سوریو یاههدر هیلک هک تسا هدرک داهنشیپ ار ار 3 و 2،1 یاه هخاش هلمج زا ناسنا هب تیارس لباق

اهرمیارپ یحارط هک ییاجنآ زا و دنکیم ییاسانش لاحرد H5 یاه سوریو یکیتنژ تارییغت ساسارب

نیا نازیم هک تسا مزال دریگ یم تروص شدرگ و هتفرگرارق رظندم ناهج فلتخم قطانم رد تارییغت .(33) دننکرییغت زور قباطم اهرمیارپ

صیخشت تهج هعلاطم نیا رد ،قوف بلاطم هب هجوتاب نامزاس یداهنشیپ یاهرمیارپ زا A پیت یازناولفنآ نیا دش هتفگ هکروطنامه و دش هدافتسا یناهج تشادهب-هدر یازناولفنآ یاهسوریو زا یعیسو فیط اهرمیارپ هک ییاجنآ زا .(33) دیامنیم ییاسانش 3 و 2 ،1 یاه سکیرتام نژ یلاوت ساسارب ازناولفنآ A پیت صیخشت

فلتخم یاهپیت تحت رد یلاوت نیا و دریگیم تروص عون نیا رد روجان لاصتا لامتحا دشابیم هدش تظافح یحضاو و صخشم دناب و (02) دشابیم لقادح اهرمیارپ

62 ...هنیمآ یاهدیسا یلاوت نییعت و یلوکلوم صیخشت

زین هدمآ تسدب جیاتن و دوریم راظتنا زروفورتکلا رد .(1 لکش) دشابیم بلطم نیا یایوگ

هیصوت لکتورپ زا زا H5 پیتتحت صیخشتروظنم هب نیا اریز دیدرگ هدافتسا ناراکمه و نمفوه طسوت هدش هخاش ییایسآ یاهسوریو ییاسانش ساسارب شور

Qinghai-like clade 2.2 و (9) تسا هدش یحارط هیاسمه یاهروشک و ناریا رد هدشادج سوریو .(53) دناهدوب 2.2 هخاش هب قلعتم اتدمع (هنایمرواخ)

تسیل تاشیامزآ زا یکی ناونع هب شور نیا نینچمه .(91) تسا OIE دییات دروم تسرهف رد هدش

کیتنژولیف زیلانآ ساسارب H7 پیت تحت یاهسوریو هخاش دنوشیم میسقت یلصا هخاشراهچ هب یلماکت ایلارتسا هخاش ،یلامش یاکیرمآ هخاش ،یبونج یاکیرمآ مراهچ هخاش اقیرفآ اب ماوت ییایسآ اپورا یاهسوریو و یکیدزن طابترا نیا رب هوالع .(71) دنهدیم لیکشت ار یاهسوریو ییایفارغج هقطنم و یکیتنژ راتخاس نیب هک .(71) تسا هدیدرگ هدهاشم پیت تحت نیا زا هدش ادج اب H7 پیت تحت ییاسانش روظنم هب رضاح هعلاطم رد زیلانآ رد اپورا اب ایسآ یاههیوس کیدزن طابترا هب هجوت عجرم هاگشیامزآ یداهنشیپ لکتورپ و رمیارپ زا ،قوف .(31 و 52) دیدرگ هدافتسا اپورا هیداحتا

ود هب H9N2 یاهسوریو کیتنژولیف تاعلاطم ساسارب هخاش و ییاکیرمآ هخاش دنوشیم میسقت یلصا هخاش دوخ هبون هب ییایسآو ییاپورا هخاش .1ییایسآ-ییاپورا

هک G1 هخاشریز :دوشیم میسقت هخاشریز هس هب لقادح هخاشریز ،A/Quail/Hong Kong/G1/97 نآ هدنیامن

Y280 پیاتوتورپ نآ هدنیامن هک A/Duck/Hong

Kong/Y280/97 هدنیامن هک هرک هخاش ریز و دشابیم A/chicken/Korea/38349/p96323/96نآ مامت هک دهدیم ناشن کیتنژولیف تخرد یسررب .(61)

1 - Eurasian

نامدود کی یاراد ناریا زا هدش ادج H9N2 یاههیوس A/Quail/Hong سوریو هخاشریز رد و هدوب کرتشم

Kong/G1/97 باختنا اذل .(3 ،11 و 42) دنریگیم رارق هخاشریز نیا هب پیتتحت نیا صیخشت یاهرمیارپ (9991) ناراکمه و سیریپ هلمج زا ،تسا هدش فوطعم H9N2 پیت تحت ییاسانش تهج رمیارپ تفج کی

داهنشیپ ار گنک کنه روشک رد ناگدنرپ رد عیاش رد یناسنا دراوم زا هیوس نیا دعب یمک .(12) دندومن

یاههیوس اب نآ هسیاقم اب و دشادج گنک گنه نژ یلاوت رد ییاه شهج دش صخشم ناگدنرپ تهج رمیارپ رییغت هب زاین و تسا هداد خر نینیتولگامه نیا .تخاسیم یرورض ار اه هیوس نیا صیخشت رد C یاج هب T یدیتوئلکون ینیزگیاج لماش تارییغت T یاج هب C دیتوئلکون زین و ییولجرمیارپ 18 تیعقوم تیساسح یلو تفرگ ماجنا یبقعرمیارپ 17تیعقوم رد-هیوس صیخشت روظنم هب هدش هتخاس دیدج یاهرمیارپ هک یروطب ،تفای یریگمشچ شهاک رویط یاه یاهرمیارپ زارت ساسح ربارب 100 ات 3 هیلوا یاهرمیارپ

روکذم نیققحم هجیتن رد و دندش یبایزرا دیدج ناگدنرپ یاههیوس ییاسانش تهج ار هیلوا یاهرمیارپ زا نیققحم زا یضعب زین ناریا رد .دندومن باختنا هدافتسا یصیخشت تاشیامزآ تهج قوف یاهرمیارپ یاهرمیارپ زا زین رضاح هعلاطم رد .(4 و 22) دندومن شهاک اب یدودحات هکدیدرگ هدافتسا سیریپ هیلوا هب رظن .(2) لکش دوب هارمه رظن دروم یاهدناب مکارت یکیتنژ تارییغت عوقو رب ینبم یددعتم تاشرازگ هکنیا

هدش هئارا ناریا H9N2 یاههیوس نینیتولگامه نژ رد قوف رمیارپ عادبا زا یدایز تدم و (11 ،41 و 42) تسا-هیوس اب بسانتم اهرمیارپ نیا تسا نکمم ،درذگیم یرتشیب یسررب هنیمز نیا رد و دنشابن ناریا دیدج یاه .دشابیم زاین دروم

21 یپایپ ،1392 ،لوا هرامش ،مهن هرود /یکشزپماد یژولویبورکیم هیرشن 62

صتخم رظن دروم یاهدناب لیکشت هب هجوت اب یلکروط هب یزارتمه اب و H9یاهپیت تحت و A پیت یازناولفنآ نیئتورپ تفاکش لحم زا هدمآ تسدب یلاوت H9N2 روکذم یاههیوس ،نژ کناب رد نینیتولگامه

رد جیار یاهپیت تحت تخانش .دندش هداد صیخشت زا یلک هاگدید کی RT-PCR زا هدافتسا اب هقطنم ،دیامن یم میسرت ار ناگدنرپ یازناولفنآ یاهسوریو لحم رد یدیساونیمآ یلاوت یسررب یدعب تیولوا

نییعت شقن هک تسا نینیتولگامه نیئتورپ تفاکش لیدبت رطخ و اهسوریو تدح ینیب شیپ رد یاهدننک-یرامیب اب یاههیوس هب نییاپ ییازیرامیب اب یاههیوس مک یاهسوریو رد یگتفاکش لحم .(1) دراد الاب ییاز 1 یاهتیعقوم رد نینژرآ هنیمآ دیسا کی یاراد تدح طسوت طقف اهنیئتورپوکیلگ عون نیا .دشابیم 3 و دنوشیم هتفاکش اهنیسپیرت هبش لثم یصاخ یاهزائتورپ

،دنوشیم تفای نابزیم ندب زا یصاخ یاهتمسق رد هک ندب زا یدودحم طاقن هب اهسوریو نیا ییازتنوفع اذل نیا یاراد هک شراوگو سفنت هاگتسد لاثم ناونع هب HA0 نیئتورپ یلو دوش یم دودحم دنتسه اهمیزنآ عون

نیدنچ یواح الاب ییازیرامیب اب یاهسوریو رد-یم تفاکش هقطنم رد نیزیل ای نینژرآ یزاب هنیمآدیسا مامت رد دوجوم یاهزائتورپ طسوت وگلا نیا و دنشاب رداق روکذم یاهسوریو اذل ،دنوشیم هتفاکش ندب طاقن

ادیپ ریثکت ندب یتایح یاهمادنا و اهتفاب مامت رد دنتسه یازناولفنآ یاهسوریو یاهوگلا زا یکی .(1) دنیامن HA0 تفاکش لحم رد R-X-R/K-R سناکس داح قوف

دیتوئلکون کی طقف ینیزگیاج نیاربانب .(63) دشابیم C هب A ایG یاهسوریو ات تسا مزال 3 تیعقوم رد لیدبت KSSR/GLF سناکس اب هعلاطم نیا رد هدشادج یلبق دراوم اب وگلا نیا .دندرگ داح هوقلاب یاهسوریو هب

اتدمع هک ناریا یتعنص رویط زا هدش شرازگ

RSSR/GLF هک یتاعلاطم ریاس .دراد توافت دشابیم یدنرم یفصو :هلمج زا تسا هدش ماجنا ناریا رد و هداز ینایک ،(7112) ناراکمه و یمیرک ،(2112) ،(1112) ناراکمه و رهم ینویامه ،(6112) ناراکمه RSSR/GLF یوگلا ،(1112) ناراکمه و راولا یناطلس زا یخرب .(11 ،11 ،21 ،41 و 23) دناهدرک شرازگ ار یوگلا (4112) ناراکمه و یچنایلق هلمجزا نارگشهوژپ

RSSR و RSNR 4112 لاس رد ناراکمه و یداق و شورف رازاب زا ار RSNKRLFو RSNRRLF یوگلا یاههیادج لیدبت رطخ و هدومن شرازگ هدنز ناگدنرپ .(0 و 03) دندومن مالعا ار الاب تدح اب یاههیوس هب قوف زا (2112) ناراکمه و یگرزب طسوت رگید هعلاطم رد لاس رد ناریا یتعنص رویط زا هدشادج یاهسوریو ار RSSR/GLF و KSSRGLF یوگلا ود ره 9112 عوقو هک دسر یم رظن هب روط نیا .(3) دندومن شرازگ روشک رد KSSR یوگلا اب H9N2 ازناولفنآ یاهسوریو وگلا نیا هچرگا .دشاب هدش عورش 9112 لاس زا

هدش هتخانش نییاپ تدح اب سوریو ناونع هب نانچمه یموادم یکیتنژ تارییغت هک دنک یم تلالد یلو تسا

رورم هب سوریو تدح اب طبترم یمونژ هاگیاج نیا رد رد تسا نکمم و تسا هداد خر ناریا یاههیوسرد نامز

اب ییاهسوریو هب بسانم هنیمز ندش مهارف تروص .دنوش لیدبت هدنیآ رد الاب تدح عیرس شور کی ناونع هب RT-PCR شور نیاربانب

ددرگ یم بوسحم ازناولفنآ یاه سوریو صیخشت تهج نیا رد هک یا هدرتسگ یکیتنژ تارییغت هب هجوتاب یلو تاشیامزآ نیا هک تسا مزال دهد یم خر اه سوریو ار یصیخشت یاه لکتورپ و اهرمیارپ و هدش یناسرزورب هدودحم رد عیاش یاهسوریو یکیتنژ یلاوت یانبم رب

کی رد کیتنژولیف تخرد مسر ساسا رب هک ییایفارغج هب هجوتاب انمض .دومن باختنا ،دنریگیم رارق هخاش

62 ...هنیمآ یاهدیسا یلاوت نییعت و یلوکلوم صیخشت

نیئتورپ یگتفاکش لحم یاهنیمآدیسا یلاوت هکنیا هب تبسن ناتسا نیا رد H9N2 یاههیوس نینیتولگامه اذل تسا هدرکرییغت ناریا رد هدش شرازگ یلبق دراوم روظنم هب اهسوریو نیا یکیتنژ تارییغت موادم شیاپ داح یاههیوس هب اهنآ ندش لیدبت رطخ زا یهاگآ .ددرگیم داهنشیپ

ینادردق و رکشت یزاس مرس و نسکاو تاقیقحت هسسؤم زا هلیسو نیدب تسا هدومن مهارف ار هژورپ نیا مزال تالیهست هک یزار یراکمه زا نینچمه .ددرگ یم ینادردق و رکشت

یرتشا رتکد یاقآ و یدابآ ترشا مناخ راکرس هنامیمص ناگدنرپ یازناولفنآ سنارفر هاگشیامزآ ناراکمه هیلک و یرازگساپس یزار یزاس مرس و نسکاو هسسوم .ددرگ یم

عبانم1. Alexander, D.J. (2008). Avian influenza

- diagnosis. Zoonoses Public Health 55: 16-23.

2. Alexander, D.J. (2007). An overview of the epidemiology of avian influenza. Vaccine 25: 5637-44.

3. Bozorgi, A., Keyvanfar, H., Shushtari, H., Bahmaninejad, M., Eshratabadi, F. (2012). Molecular characterization and phylogenetic analysis of hemagglutinin and neuraminidase genes of H9N2 avian influenza viruses isolated in Iran in 1999 and 2009. African Journal of Microbiology Research 6: 4550-6 ,.

4. Capua, I., Alexander, D.J. (2006). The challenge of avian influenza to the veterinary community. Avian Pathology 35: 189-205.

5. Chaharaein, B., Omar, A.R., Aini, I., Yusoff, K., Hassan, S.S. (2009). Detection of H5, H7 and H9 subtypes of avian influenza viruses by multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction. Microbiol Reserch 164: 174-9.

6. Gavin, J.D.S. (2012). Continued evolution of highly pathogenic avian influenza A (H5N1): updated nomenclature, in Influenza Other Respi Viruses, WHO⁄OIE⁄FAO H5N1 Evolution Working Group: Influenza Division, Centers for Disease Control and Prevention, MS G16, Atlanta, Georgia, 1-5.

7. Ghadi, S., Bozorgmehri-Fard, M., Karimi, V., Tavassoti-Kheiri, M., Rafiei, M. (2009). Genetic analysis of hemagglutinin protein of H9N2 isolated from live bird markets in Tehran province in 2007-2008. Iranian Journal of Virology 3: 7-15.

8. Ghalyanchi, L.A., Karimi, V., tavassoti-Kheiri, M., Bozorgmehri-Fard, M.H. (2008). Nucleotide and aminoacid sequence analysis of hemagglutinin protein in cleavage site region of H9N2 isolated from broilers in Tehran province during 1998-2007. Journal of Animal and Veterinary Advances 7: 529-34.

9. Hoffmann, B., Harder, T., Starick, E., Depner, K., Werner, O., Beer, M. (2007). Rapid and highly sensitive pathotyping of avian influenza A H5N1 virus by using real-time reverse transcription-PCR. Journal of Clinical Microbiology 45: 600-3.

10. Homayounimehr, A.R., Dadras, H., Shoushtari, A., Pourbakhsh, S.A. (2010). Sequence and phylogenetic analysis of the haemagglutinin genes of H9N2 avian influenza viruses isolated from commercial chickens in Iran. Tropical Animal Health Production 42: 1291-7.

11. Karimi, V ., Bozorgmehrifard, M., shabazzadeh, D., Esmaelizad, M., Pourbakhsh, S.A. (2004). Sequence analysis and phylogenetic study of hemagglutinin gene of H9N2 subtype of avian influenza virus isolated during 1998-2002 in iran. Iranian Biomedical Journal 8: 167-72.

21 یپایپ ،1392 ،لوا هرامش ،مهن هرود /یکشزپماد یژولویبورکیم هیرشن 76

12. Kianizadeh, M., Pourbakhsh, S.A., Toroghi, R., Momayez, R. (2006). Pathogenecity and haemagglutinin gene sequence analysis of Iranian influenza H9N2 viruse isolated during1998-2001. Iranian Journal of Veterinary Research, University of Shiraz 3: 37-41.

13. Laboratory, A.I.C.R. (2007). One Step RT PCR for detection of H5 & H7avian influenza & cleavage site sequencing, in the standard operating procedure used by the avian influenza CRL at the Veterinary Laboratories Agency, 1-10.

14. Lebarbenchon, C., Stallknecht, D.E. (2011). Host shifts and molecular evolution of H7 avian influenza virus hemagglutinin. Virology Journal 8: 328-30.

15. Lee Ms Fau-Chang, P.C., Chang P.C., Fau-Shien, J.H., Shien Jh., Fau-Cheng, M.C., Cheng Mc., Fau-Shieh, H.K., Shieh, H.K. (2001). Identification and subtyping of avian influenza viruses by reverse transcription-PCR. Journal of Virological Methods 97: 13-27.

16. Matrosovich, M.N., Krauss, S., Webster, R.G. (2001). H9N2 influenza A viruses from poultry in Asia have human virus-like receptor specificity. Virology 281: 156-62.

17. Moosakhani, F., Shoshtari, A.H., Pourbakhsh, S.A., Keyvanfar, H., Ghorbani, A. (2010). Phylogenetic analysis of the hemagglutinin genes of 12 H9N2 influenza viruses isolated from chickens in Iran from 2003 to 2005. Avian Diseases 54: 870-4.

18. Nagarajan, S., Tosh, C., Smith, D.K., Peiris, J.S., Murugkar, H.V., Sridevi, R., Kumar, M., Katare, M., Jain, R., Syed, Z., Behera, P., Cheung, C.L., Khandia, R., Tripathi, S., Guan, Y., Dubey, S.C. (2012). Avian influenza (H5N1) virus of clade 2.3.2 in domestic poultry in India. PLoS One 7: 1-8.

19. OIE, (2009). Avian influenza, in OIE Terrestrial Manual, 1-20.

20. Peiris, M., Yam, W.C., CHAN, K.H., Shortridge, K. (1999). Influenza A

H9N2: Aspects of Laboratory Diagnosis. Journal of Clinical Microbiology 37: 3426-7.

21. Pourbakhsh, S.A., Khodashenas, M., Kianizadeh, M., Goodarzi, H. (2000). Isolation and identification of avian influenza virus H9N2 subtype. Archive Razi Institute 51: 27-34.

22. Saberfar, E., Najafi, A., Goodarzi, Z., Lashini, H. (2009). Multiplex Reverse Transcription-PCR assay for detection of type A influenza virus plus differentiation of avian H7 and H9 hemagglutinin subtypes in Iran. Iranian Journal of Public Health 38: 29-34.

23. Saberfar, E., Najafi, A., Lashini, H. (2008). A Reverse transcription-PCR assay for detection of type A influenza virus and differentiation of avian H7 subtype. Iranian Journal of Virology 2: 23-6.

24. Shoushtari, A., Hablolvarid, M.H., Vascellari, M., Hedayati, A. (2007). Mortality of wild swans associated with naturally infection with highly pathogenic H5N1 avian influenza virus in Iran. Archives of Razi Institute 62: 207-13.

25. Slomka, M.J., Coward, V.J., Banks, J., Londt, B.Z., Brown, I.H., Voermans, J., Koch, G., Handberg, K.J., Jorgensen, P.H., Cherbonnel-Pansart, M., Jestin, V., Cattoli, G., Capua, I., Ejdersund, A., Thoren, P., Czifra, G. (2007). Identification of sensitive and specific avian influenza polymerase chain reaction methods through blind ring trials organized in the European Union. Avian Diseases 51: 227-34.

26. Slomka, M.J., Pavlidis, T., Banks, J., Shell, W., McNally, A., Essen, S., Brown, I.H. (2007). Validated H5 Eurasian real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction and its application in H5N1 outbreaks in 2005-2006. Avian Diseases 51: 373-7.

27. Soltanialvar, M., Shoushtari, H., Bozorgmehrifard, M., Charkhkar, S., Eshratabadi, F. (2010). Molecular

16 ...هنیمآ یاهدیسا یلاوت نییعت و یلوکلوم صیخشت

characterization of hemagglutinin and neuramidase genes of H9N2 avian influenza viruses isolated from commerical broiler chicken in Iran. Journal of Biological Sciences 10: 145-50.

28. Spackman, E., Senne, D.A., Myers, T.J., Bulaga, L.L., Garber, L.P., Perdue, M.L., Lohman, K., Daum, L.T., Suarez, D.L. (2002). Development of a Real-Time Reverse Transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes. Journal of Clinical Microbiology 40: 3256-60.

29. Spackman, E., Suarez, D.L. (2008). Detection and identification of the H5 hemagglutinin subtype by real-time RT-PCR. Methods in Moecularl Biol 436: 27-33.

30. Starick, E., Romer-Oberdorfer, A., Werner, O. (2000). Type- and subtype-specific RT-PCR assays for avian influenza A viruses (AIV). Journal of Veterinary Medicine 47: 295-301.

31. Toroghi, R., Momayez, R., Pourbakhsh, S.A. (2003). Amino acid sequence of cleavage site of hamagglutinin protein in three avian influenza virus (H9N2). Pajouhesh and Sazandegi 60: 95-103.

32. Vasfi Marandi, M., Bozorgmehri-Fard, M.H. (2002). Isolation of H9N2 subtypes of avian influenza viruses during an outbreak in chickens in Iran. Iranian Biomed Journal 61: 13-7.

33. WHO (2007). Recommendations and laboratory procedures for detection of avian influenza A(H5N1) virus in specimens from suspected human cases: Geneva, 1-28.

34. WHO (2011). The use of PCR in the surveillance and diagnosis of influenza, in Report of the 4th meeting of the WHO working group on polymerase chain reaction protocols for detecting subtype influenza A viruses,Geneva,Switzerland, 1-10.

35. WHO (2011). Programmes and projects, influenza, Updated unified nomenclature system for the highly pathogenic H5N1 avian influenza viruses, Technical Resources and Current Trees/Alignments, H5 full tree pdf.

36. Wood, G.W., McCauley, J.W., Bashiruddin, J.B., Alexander, D.J. (1993). Deduced amino acid sequences at the haemagglutinin cleavage site of avian influenza A viruses of H5 and H7 subtypes. Archive of Virology 130: 209-17.

Journal of Veterinary Microbiology, Volume 9, Issue 1, 2013

Molecular Diagnosis and Determination of Amino Acid Sequence of Hemagglutinin Cleavage Site of Avian Influenza Viruses Isolated from

Broilers in North Khorasan Province

Bahari, P.1, Pourbakhsh, S.A.2*, Shoushtari, H.2, Bahmaninejad, M.A.2

1- Department of Microbiology, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran 2- Department of Research and Diagnosis of Poultry Diseases, Razi Vaccine and Serum Research

Institute, Karaj, Iran

Received Date: 17 December 2012 Accepted Date: 24 April 2013

Abstract Avian influenza virus has been recognized as one of the most important pathogen in poultry that caused economic losses to the poultry industry of Iran. Rapid detection and pathotyping is the important priority in order to prevent extension of disease in Iran. RT-PCR method was used for the rapid detection of influenza viruses. The amino acid sequence of cleavage site of hemagglutinin was considered as a molecular determinant for the prediction of pathogenicity influenza viruses. In this study, 160 tracheal swabs samples were taken from 20 poultry farm to monitor influenza infection in North Khorasan province. RT-PCR assay was developed based on the most common genotype in Iran detecting type A and H9, H5 and H7 subtypes by specific primers targeting Matrix (M) and Hemagglutinin(HA) genes, respectively. The samples which were positive as type A influenza inoculated to embryonated eggs of 9-10 days. After 3-5 days, the allantoic fluids were tested with Hemagglutinin assay. The samples that contained HA activity were inactivated with formalin 0.1%. These fluids were used for RNA extraction. A segment of 432bp was amplified by RT-PCR and nucleotide sequencing. The results showed that four poultry farms were positive for type A of influenza virus. All of them were negative for H5 or H7 but positive for H9 virus. The sequence analysis of hemagglutinin revealed that four isolates shared a KSSR motif at the cleavage site of HA. Although this motif represented low pathogenicity in poultry, it was different from previous Iranian isolates. As a result RT-PCR assay based on common genotype in region was considered as a rapid test for the detection of influenza viruses. The cleavage site sequence analyses indicated that these viruses have the potential for emerging highly pathogen influenza viruses. Therefore, continuous monitoring of viruses is being recommended. Keywords: Avian influenza, RT-PCR, H9-H7-H5 subtype, Cleavage site of hemagglutinin, North Khorasan

*Corresponding author: Pourbakhsh, S.A. Address: Department of Research and Diagnosis of Poultry Diseases, Razi Vaccine and Serum Research Institute, Karaj, Iran. Tel: 02634570038 Email: apourbakhsh@rvsri.ac.ir