8/3/2019 Osnovni principi ELISA testa; Zagadjivaci hrane
1/3
Osnovni principi ELISA testa
Sve imunoloke metode koriste visoko specifinu reakciju vezivanja
izmeu antitela i
antigena,
pa je tako ova interakcija klju i za ELISA test. Antitela su
odbrambeni proteini koja se
stvaraju
u telu toplokrvnih ivotinja kao odgovor organizma na infekciju
stranim molekulima ilimikroorganizmima. Antitela se pripajaju za
antigene, supstance (obino protein) na stranom
telu
koje izazivaju stvaranje ovih odbrambenih jedinjenja.
Antigen-antitelo pripajanje je visoko
specifino i imunoloki testovi koriste ovaj fenomen da detektuju
specifini mikroorganizam,
protein ili toksin. U ELISA testu mogu da se koriste dva tipa
antitela: monoklonska ili
poliklonska. Antitela koja se pojavljuju u ivotinjama kao
odgovor na pojedine sloene
antigenejesu heterogena zato to ih proizvodi vie razliitih
klonova elija, od kojih je svaki
sposoban da
proizvede antitelo koje reaguje sa razliitom antigenskom
determinantom kompleksnog
antigena.
Ovakva antitela se nazivaju poliklonska. Ukoliko je strano telo
koje inficira veliki molekul,kao
to su to proteini ili mikroorganizmi, na njima se mogu nalaziti
razliita antigena mesta i
poliklonska antitela se stvaraju za vreme imunog odgovora
domaina. Antitela koja nastaju od
jednog klona elija su homogena, to znai da su monoklonska.
Da bi se ustanovilo da li dolazi do vezivanja izmeu antitela i
antigena, mora postojati sistem
koji omoguava vizualizaciju odnosno merenje ove interakcije, to
se postie vezivanjem
oznake ili markera za antitelo. Markeri mogu biti razliiti:
fluorescentni agensi,
luminiscentna hemijska jedinjenja, radioizotopi ili enzimi. U
ELISA testu termin
enzymelinked
ukazuje da je sistem oznaen enzimom, kao i kod veine drugih
sistema kod kojih enzim
katalie konverziju bezbojnog supstrata u obojeni produkt. Prema
tome, princip ove metode je
konjugacija enzima sa antitelom ili antigenom. Enzim se zatim
detektuje dodavanjem
supstrata i
merenjem enzimske aktivnosti. Da bi se izmerila koliina
antitela, poznati antigen se nalazi u
vrstoj fazi (zid plastine mikroploe) i inkubira se sa
razblaenjima uzorka koji se ispituje,
zatim se pere i ponovo inkubira sa anti-imunoglobulin antitelom
obeleenim enzimom (na
primer, peroksidaza rena). Enzimska aktivnost, koja se odreuje
nakon dodatka supstrata na
osnovu intenziteta boje merene kolorimetrijski, direktno je
proporcionalna sadraju
specifinih
antitela u ispitivanom materijalu. Krajnji rezultat testa se moe
lako videti okom ili
spektrofotometrijski, u zavisnosti od vrste testa. Tipian
enzim-supstrat kompleks koji sekoristi
u ELISA testu ukljuuje alkalnu fosfatazu (enzim) sa
para-nitrofenol fosfatom (supstrat) i
peroksidazom rena (enzim) sa tetrametilbenzidinom (supstart),
pri emu oba kompleksa
stvaraju
uto obojeni produkt.
Reakcija koja se odvija u toku ELISA testa zahteva neku formu
fizikog, vrstog nosaa. U
akronimu ELISA termin immnosorbant upuuje da se antitela vezuju
na povrinu, najee
mikrotitarskih ploa koje se veoma iroko primenjuju zato to su
podesne, jeftine za
proizvodnju
i omoguavaju visok broj testova po jednoj analizi (96 mesta po
ploi). Mogu se koristiti i
drugi
8/3/2019 Osnovni principi ELISA testa; Zagadjivaci hrane
2/3
vrsti nosai kao to su papirne membrane i polistirenske lopatice
ili izdueni tapii. Prvi
korak
ELISA testa predstavlja prekrivanje nosaa sa specifinim
antitelima ili antigenima. Ukoliko
se
koristi statini nosa, na pr. mikrotitarska ploa, uzorak i
razliiti reagensi se dodaju u
bunarietokom serije razliitih faza pri izvoenju procedure.
Sendvi ELISA test
Sendvi ELISA test ima najjednostavniji format i najee se
korisiti u komercijalnim
kitovima.
Re sendvi oznaava da se koriste dva antitela koji hvataju u
klopku ili sendvi ciljni
antigen.
Za vreme procedure, antigen se prvo hvata a potom detektuje.
Specifino antitelo koje hvata
ciljni antigen, vezuje se za povrinu vrstog nosaa, na pr. bunara
mikrotitarske ploe.
Obogaeni uzorak hrane se dodaje u bunari i ukoliko je ciljni
antigen prisutan, on e se
vezati
za antitela. Nakon procedure pranja kojom se otklanjaju ostaci
hrane i nevezanog materijala,druga detekciona antitela koja imaju
enzim vezan kao marker se dodaju u bunari. Ponovo
e
se antitela vezati za ciljni antigen obrazujui antitelo sendivi.
Sledi pranje kojim se
otklanjaju
nevezana antitela, a nakon toga dodavanje bezbojnog supstarata
koji e enzim prevesti u
obojeni
produkt. Na kraju se dodaje stop rastvor da sprei dalju enzimsku
aktivnost i promenu u boji
kojase meri. Ukupono vreme koje je potrebno za ivoenje sendvi
ELISA testa je obinoizmeu dva
i tri sata. Mogue je koristiti ovaj oblik u kvantitativnim
testovima tako to se vri kalibracija
koncentracije antigena u odnosu na intenzitet boje. Meutim, pri
detekciji patogena u hrani
sendvi ELISA se obino koristi u kvalitativne svrhe, ukazujui na
prisustvo odnosno
odsustvo
patogena. Svi ELISA sendvi testovi zahtevaju za poetak obogaen
uzorak hrane. Procedura
obogaivanja zavisi od vrste hrane i patogena koji se detektuje.
Osnovne faze koje se odvijaju
tokom sendvi ELISA su prikazane na sl. 1.
