ΤΙ ΕΙΝΑΙΤΙ ΕΙΝΑΙΤΙ ΕΙΝΑΙΤΙ ΕΙΝΑΙ

"ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ""ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ"

ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ• Η χρήση ζωντανών οργανισμών ή/και βιολογικών

δ ά ή ό ϊό ήαντιδράσεων για την παραγωγή ενός προϊόντος ή την ολοκλήρωση μιας διεργασίας

• Η χρήση μεθόδων γενετικής μηχανικής για την• Η χρήση μεθόδων γενετικής μηχανικής για την παραγωγή προϊόντων ή γενετικά τροποποιημένων οργανισμώνρο ο ο ημέ ω οργα σμώ

• Εφαρμογές: Γεωργία, Ιατρική, ΒιομηχανίαΕφαρμογές: Γεωργία, Ιατρική, Βιομηχανία Τροφίμων, Βιομηχανική Παραγωγή, Βιοκαθαρισμός του Περιβάλλοντος

ΒΒιολογία

Βιο-χημεία Χημεία

Βιοτεχνο-λογία

Βιο-μηχανική

Χημικέςδιεργασίες

Μηχανική

Εισαγωγή νέων γονιδίων σε

ζωικούς οργανισμούς ΚαλλιέργειαΑντικαρκινικά

φάρμακα

Εισαγωγή νέων γονιδίων σε

ζ ύ ύ Κ λλ έΑντικαρκινικά

φάρμακαζωικούς οργανισμούς Καλλιέργεια φυτών από

ένα μόνο κύτταρο ∆ιαγνωστική

φάρμακαζωικούς οργανισμούς Καλλιέργεια φυτών από

ένα μόνο κύτταρο ∆ιαγνωστική

φάρμακα

Καλλιέργειεςκυττάρων

Μονοκλωνικάαντισώματα

Καλλιέργειεςκυττάρων

Μονοκλωνικάαντισώματα

Μοριακή ΒιολογίαΕγκληματολογία

Ι θέ

Μοριακή ΒιολογίαΕγκληματολογία

Τεχνολογία DNA Γενετική Μηχανική

Ιχνοθέτες

Τράπεζες DNA,RNA και

ΣύνθεσησυγκεκριμένωνΚλωνοποίηση

Τεχνολογία DNA Γενετική Μηχανική

Ιχνηλάτες

Τράπεζες DNA, ΣύνθεσησυγκεκριμένωνRNA και

πρωτεϊνών

Πλήρης

συγκεκριμένωνανιχνευτών DNA

Εντοπισμόςώ

ΚλωνοποίησηΣύνθεσηνέων πρωτεϊνών

Μαζική παραγωγήανθρώπινων

RNA και πρωτεϊνών

Πλήρης

συγκεκριμένωνανιχνευτών DNA

Εντοπισμός

ΚλωνοποίησηΣύνθεσηνέων πρωτεϊνών

Μαζική παραγωγή

χαρτογράφησηανθρώπινουγονιδιώματος

γενετικώνδιαταραχών

Νέοι τύποιφυτών και ζώων

Νέα είδη

ανθρώπινωνπρωτεϊνών

Τράπεζασ ά

Πλήρηςχαρτογράφησηανθρώπινουγονιδιώματος

γενετικώνδιαταραχών

Νέοι τύποιφυτών και ζώων

Νέα είδη

ανθρώπινωνπρωτεϊνών

ΤράπεζαΓονιδιακήθεραπεία

Νέα είδητροφίμων

Νέα αντιβιοτικά

σπάνιωνανθρώπινωνχημικών

Γονιδιακήθεραπεία

Νέα είδητροφίμων

Νέα αντιβιοτικά

σπάνιωνανθρώπινωνχημικών

Ο Ο Ο ΟΑΓΡΟΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΕΣ

ΠΟΛΛΑΠΛΑΣΙΑΣΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟΤ

Ο

ΒΙΟ∆ΙΑΓΝΩΣΤΙΚΕΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΕΣΜ

ΕΪ

Ε

Ι ΤΡΟΦΙΜΑ-ΠΟΤΑ, ΦΑΡΜΑΚΑ, ΠΡΟΪΟΝΤΑ ΥΨΗΛΗΣ ΠΡΟΣΤΙΘΕΜΕΝΗΣ ΑΞΙΑΣ

Ι

ΣΣ

ΠΟΛΛΑΠΛΑΣΙΑΣΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ

Μικρο-πολλαπλασιασμός in vitro1 Μικρο πολλαπλασιασμός in vitro

Χ ή ώ δ ώΧρήση μοριακών δεικτών στη Μοριακή Βελτίωση, εκτίμηση Βιοποικιλότητας κ α

2Βιοποικιλότητας, κ.α.

Γενετική Μηχανική3 Γενετική Μηχανική3

1 2 3

• Εκτίμηση Βιοποικιλότητας

• Υγεία υλικού

• Εκτίμηση

• Πιστοποίηση γενετικής η ς

• Αναγνώριση πολύτιμων γονιδίων

Εκτίμηση σωμακλωνικής παραλλακτικότητας

τροποποίησης

πολύτιμων γονιδίων

• Genotyping

• Γενετικοί χάρτες

• Μοριακή επιλογή

ΒΙΟ∆ΙΑΓΝΩΣΤΙΚΕΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΕΣΒΙΟ∆ΙΑΓΝΩΣΤΙΚΕΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΕΣ

ΜΟΡΙΑΚΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗ (MOLECULAR BREEDING)

Ανάπτυξη και χρήση μοριακών δεικτώνδ δ έ λ ό θ ώσυνδεδεμένων με την κληρονόμηση επιθυμητών

χαρακτηριστικών σε προγράμματα βελτίωσηςοργανισμών γεωργικού περιβαλλοντικούοργανισμών γεωργικού, περιβαλλοντικού,βιομηχανικού ή ιατρικού ενδιαφέροντος.

ΒΙΟ∆ΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ - ΜΟΡΙΑΚΗ ∆ΙΑΓΝΩΣΗ(BIODIAGNOSTICS MOLECULAR DIAGNOSTICS)

Νέα διαγνωστικά μέσα και

(BIODIAGNOSTICS - MOLECULAR DIAGNOSTICS)

Νέα διαγνωστικά μέσα και αντιδραστήρια που βασίζονται στο μοριακό χαρακτηρισμό τουμοριακό χαρακτηρισμό του γενετικού υλικού και των πρωτεϊνών των οργανισμών για την πιο ακριβή, ταχύτερη και αυτοματοποιημένη ανίχνευση, ταυτοποίηση ή διάγνωσηταυτοποίηση ή διάγνωσηδιάφορων χαρακτήρων όπως παρουσία ΓΤΟ, παθογόνα, ρ , γ ,ασθένειες των φυτών ή προδιαθέσεων του ανθρώπινου οργανισμού σε κληρονομικά νοσήματα.

Βιοπληροφορική ηρ φ ρ ή(Bioinformatics)

Η ανάπτυξη νέων μεθόδων μαζικής κατάθεσης,διαχείρισης και επεξεργασίας γενωμικών δεδομένωνμε τρόπο που να τα καθιστά προσβάσιμα και χρήσιμαστους ερευνητές και το ευρύτερο κοινό.

ΓΕΝΩΜΙΚΕΣ ΚΑΙ ΜΕΤΑΓΕΝΩΜΙΚΕΣ ΕΠΙΣΤΗΜΕΣ (GENOMICS, POSTGENOMICS, PROTEOMICS,

METABOLOMICS)

Systems Biology Βιολογία Συστημάτων

METABOLOMICS)

Systems Biology – Βιολογία Συστημάτων

Η ολοκληρωμένη μελέτη των γονιδίωνΗ ολοκληρωμένη μελέτη των γονιδίων,πρωτεϊνών και μεταβολισμού των οργανισμών.

ΓΕΝΩΜΙΚΕΣ ΚΑΙ ΜΕΤΑΓΕΝΩΜΙΚΕΣ ΕΠΙΣΤΗΜΕΣΓΕΝΩΜΙΚΕΣ ΚΑΙ ΜΕΤΑΓΕΝΩΜΙΚΕΣ ΕΠΙΣΤΗΜΕΣ (GENOMICS, POSTGENOMICS, PROTEOMICS,

METABOLOMICS))

ΜΕΤΑΓΕΝΩΜΙΚΕΣ ΕΠΙΣΤΗΜΕΣ

Typical metabolomics pipeline anddetected metabolites. (a) Plant tissuesare channeled into multiple parallelpipelines for metabolome analyses. Inthe case of phenotyping of rice grainmetabolites using four pipelines, gaschromatography-mass spectrometrychromatography mass spectrometry[GC-MS, 75 peaks were annotated (i.e.,structurally elucidated or identified) in80 detected signals (detected from theraw chromatogram data)], liquidchromatography (LC)-MS (22

t t d/406 d t t d) illannotated/406 detected), capillaryelectrophoresis (CE)-MS (61/269), andLC-MS for lipid analysis (23/57) wereemployed. Pipelines of nuclear magneticresonance (NMR), LC-photodiode array(PDA), Fourier transform-infrared( ),spectrometry (FT-IR), and widelytargeted metabolomics (i.e., methods fordetermining many preselectedmetabolites) are used depending on thepurpose of the analysis. The detectedmetabolites from rice dehulled grainsmetabolites from rice dehulled grains(cv. Sasanishiki and Habataki;highlighted in yellow) are shown in thesummarized metabolic pathway (F.Matsuda, K. Saito, et al., unpublisheddata). (b) Metabolites were colored

Annual Reviews

according to the detecting pipeline (blue,GC-MS; red, CE-MS; yellow, lipid; green,LC-MS; purple, GC and CE-MS).

Flow chart of metabolome quantitative trait loci (QTL) analysis A set of experimental lines generated byFlow chart of metabolome quantitative trait loci (QTL) analysis. A set of experimental lines generated bythe cross of two parents with distinctive natural variations are analyzed using metabolomics techniquesto produce metabolic traits data. Following a mapping of metabolome QTLs (mQTLs), candidate causalgenes of each of the mQTLs can be identified by considering other information, e.g., a gene ontologyderived from genome sequencing and its annotation, single nucleotide polymorphisms (SNP) produced by

Annual Reviews

next-generation sequencing technology, and expression QTL (eQTL) data obtained by transcriptomeanalysis. Metabolic traits data can also be investigated to evaluate a relationship with other importantagronomic and biological traits, such as yield, taste, and biomass

Tools used for plant improvement

1980s Marker assisted selection19901990s Genomics2000s Bioinformatics,

Transcriptomics RNAseqTranscriptomics, RNAseq

ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΜΕΤΑΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΥΦ Ο Ο Ο

• Εξέταση λειτουργίας γονιδίων ή γονιδιακών τμημάτων

• Τροποποίηση έκφρασης ενδογενών γονιδίων−Σίγηση γονιδίωνΣίγηση γονιδίων−Αύξηση έκφρασης−Τροποποίηση έκφρασηςΤροποποίηση έκφρασης

• Μετακίνηση γονιδίων από άλλους οργανισμούςΜετακίνηση γονιδίων από άλλους οργανισμούς

Αντιμετώπιση θεμάτων διαγονιδιακών φυτών• Αντιμετώπιση θεμάτων διαγονιδιακών φυτών

ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗ ΦΥΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝΓΕΝΕΤΙΚΗ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗ ΦΥΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΕΡΓΑΛΕΙΟ ΓΙΑ ΤΗ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΦΥΤΩΝ: ΕΞΕΡΕΥΝΗΣΗ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ ΦΥΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ

• Ρόλος ενζύμων και ορμονών σε διάφορες β έ δ ί ά ξβιοχημικές διεργασίες και στην ανάπτυξη των φυτικών ιστών και οργάνων

−Αιθυλένιο (οξειδάση του ACC)−Πολυγαλακτουρονάσηγ ρ η−Οξειδάση του ασκορβικού οξέως

• Εξερεύνηση της γονιδιακής έκφρασης σε ί δ ά ώ άεπίπεδο κυττάρων ιστών και οργάνων

ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗ ΦΥΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΠΡΑΚΤΙΚΟ ΕΡΓΑΛΕΙΟ ΓΙΑ ΤΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗ ΤΩΝ ΦΥΤΩΝΠΡΑΚΤΙΚΟ ΕΡΓΑΛΕΙΟ ΓΙΑ ΤΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗ ΤΩΝ ΦΥΤΩΝ

• Παραγωγή φυτών με χρήσιμους φαινοτύπους πουΠαραγωγή φυτών με χρήσιμους φαινοτύπους που δύσκολα μπορούν να παραχθούν με κλασική γενετική

– Αντοχή σε ιούς, έντομα, ζιζανιοκτόνα– Ποιοτικά χαρακτηριστικάΠοιοτικά χαρακτηριστικά– Συσσώρευση τροποποιημένων ουσιών σε αποθηκευτικά όργανα

– ∆υνατότητα για παραγωγή φαρμακευτικών ουσιών και βιοδιασπώμενων πλαστικών

– Αποτελεσματικότερη διόρθωση μειονεκτημάτων σεΑποτελεσματικότερη διόρθωση μειονεκτημάτων σε ποικιλίες από ότι η κλασική γενετική

– Αποτελεσματικότερες και περισσότερο κερδοφόρες δύεπενδύσεις

Προϋποθέσεις για το μετασχηματισμό φυτώνΠροϋποθέσεις για το μετασχηματισμό φυτώνρ ς γ μ χημ μ φρ ς γ μ χημ μ φ

Α. Κυτταροκαλλιέργεια και σύστημα αναγέννησης φυτών

Β Κλ έ DNA ήΒ. Κλωνοποιημένο DNA προς εισαγωγή1. γονίδιο επιλογής2 υποκινητής (συνεχής ή επαγώγιμος)2. υποκινητής (συνεχής ή επαγώγιμος), περιοχή κωδίκευσης, τοποθεσία πολυαδενυλίωσηςπολυαδενυλίωσης

Γ Μέθοδος εισαγωγής του DNA στο κύτταροΓ. Μέθοδος εισαγωγής του DNA στο κύτταρο

∆. Απόδειξη της γενετικής τροποποίησης του όδε ξη ης γε ε ής ρο ο ο ησης ουφυτού

Προϋποθέσεις για το μετασχηματισμό φυτώνΠροϋποθέσεις για το μετασχηματισμό φυτών

Τ ή ή DNA έ ί

Προϋποθέσεις για το μετασχηματισμό φυτώνΠροϋποθέσεις για το μετασχηματισμό φυτών

Τα συστήματα εισαγωγής DNA πρέπει να είναι- απλά- αποτελεσματικάαποτελεσματικά- κατά προτίμηση όχι ακριβά

Η μέθοδος που θα επιλέξουμε θα πρέπει - να μην απαιτεί άδεια χρήσης, ή

ό ί ύ- εφόσον απαιτεί να μπορούμε να την αποκτήσουμε

Το σύστημα που θα επιλέξουμε εξαρτάται από- το φυτό που μελετούμε- το σύστημα αναγέννησης αυτού του φυτού

ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗ: ΒΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΠΡΟΫΠΟΘΕΣΕΙΣ

(1) Ύπαρξη φυτικών ιστών και κυττάρων ικανών να αναγεννηθούνγ η

(2) Μέθοδοι εισαγωγής DNA σε κύτταρα που μπορούν να αναγεννηθούνμ ρ γ η

(3) ∆ δ ί λ ή(3) ∆ιαδικασία για επιλογή καιαναγέννηση γενετικά τροποποιημένων φυτών με ικανοποιητική συχνότητα

ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗΓΕΝΕΤΙΚΗ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗ: ΒΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΠΡΟΫΠΟΘΕΣΕΙΣ

(1) Ύπαρξη φυτικών ιστών και κυττάρων ικανών να αναγεννηθούν

−Totipotency: Μοναδική ικανότητα απομονωμένων φυτικών κυττάρων γιαμ μ φ ρ γ

−ανάπτυξη,−διαίρεση καιδιαίρεση, και−τελική αναγέννηση σε φυτό

ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗ: ΒΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΠΡΟΫΠΟΘΕΣΕΙΣΒΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΠΡΟΫΠΟΘΕΣΕΙΣ

• Μέθοδοι εισαγωγής DNA σε κύτταρα που μπορούν να αναγεννηθούν

– Κύτταρα Arabidopsis thaliana– Εμβάπτιση υπό κενό

– Φυτικά κύτταρα– Agrobacterium tumefaciens (κυρίως δικοτυλήδονα)

– Particle gun (ειδικά σχεδιασμένος εκτοξευτήρας μεταλλικών μικροσωματιδίων) (κυρίως μονοκοτυλήδονα)

– Φυτοπαθογόνοι ιοί - μόνο υπό αυστηρά ελεγχόμενες συνθήκες θερμοκηπίου (έλεγχος έκφρασης γονιδίων,

ή λή ξί ώ δίπαραγωγή υψηλής αξίας φαρμακευτικών πεπτιδίων σε «φυτά-βιοαντιδραστήρες»)Μειονεκτήματα:» Μη μόνιμη ενσωμάτωση εισαγόμενου DNA στο φυτικό» Μη μόνιμη ενσωμάτωση εισαγόμενου DNA στο φυτικό γένωμα.

» Μολυσματικότητα των ιών

ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗΓΕΝΕΤΙΚΗ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗ: ΒΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΠΡΟΫΠΟΘΕΣΕΙΣ

• ∆ιαδικασία για επιλογή και αναγέννηση γενετικά τροποποιημένων φυτών με ικανοποιητική συχνότητα

– Γονίδια επιλογήςΓο ίδ α ο ροσφέρο α θε ό η α σε ορ σ έ αΓονίδια που προσφέρουν ανθεκτικότητα σε ορισμένα πρόσφορα αντιβιοτικά, (π.χ. καναμυκίνη), σε ορισμένα ζιζανιοκτόνα ή σε άλλες ουσίες που παρεμποδίζουν την ανάπτυξη των μη μετασχηματισμένων φυτικών κυττάρων.

Συνθήκες αναγέννησης– Συνθήκες αναγέννησηςΕφαρμογή συνθηκών αναγέννησης που θα επιτρέψουν την απόκτηση ακέραιων φυτών που προέρχονται από ένα μοναδικό μετασχηματισμένο κύτταρο.

ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗΓΕΝΕΤΙΚΗ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗ: ΣΤΡΑΤΗΓΙΚΕΣ ΕΠΙΤΥΧΙΑΣ

• ΙΣΤΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ

• ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΓΟΝΙ∆ΙΩΝΜΕΤΑΦΟΡΑ ΓΟΝΙ∆ΙΩΝ

• ΕΠΙΛΟΓΗ

• ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΩΝ ∆ΙΑΓΟΝΙ∆ΙΩΝ

ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗΓΕΝΕΤΙΚΗ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗ: ΣΤΡΑΤΗΓΙΚΕΣ ΕΠΙΤΥΧΙΑΣ

• ΙΣΤΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ– Μεγάλος αριθμός κυττάρων– Προσιτά σε επεξεργασία με μεθόδουςΠροσιτά σε επεξεργασία με μεθόδους μεταφοράς γονιδίωνΑναγεννήσιμα– Αναγεννήσιμα

– ∆ιατηρούν την ικανότητα αναγέννησης θόλ δ ά έκαθόλη τη διάρκεια της αναγέννησης

(πολλαπλασιασμός κυττάρων, κλπ) και ης ε λο ήςτης επιλογής

ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗ: ΣΤΡΑΤΗΓΙΚΕΣ ΕΠΙΤΥΧΙΑΣΣΤΡΑΤΗΓΙΚΕΣ ΕΠΙΤΥΧΙΑΣ

ΙΣΤΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ• ΙΣΤΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ

–Άμεση διαθεσιμότητα εκφύτων

–Ελάχιστο χρόνο σε ιστοκαλλιέργειαΕλάχιστο χρόνο σε ιστοκαλλιέργεια

–Σωμα-κλονική παραλλακτικότητα

ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗ:ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗ: ΣΤΡΑΤΗΓΙΚΕΣ ΕΠΙΤΥΧΙΑΣ

ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΓΟΝΙ∆ΙΩΝ• ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΓΟΝΙ∆ΙΩΝ

Ε ή DNA ά ύΕισαγωγή DNA σε φυτικά κύτταρα με τη βοήθεια του Agrobacterium tumefaciens

– Συνθήκες για μεταφορά γονιδίων

– Συνθήκες για αναγέννησηή ς γ γ η η

– Φορείς γενετικού υλικούΦορείς γενετικού υλικού

Περιληπτική διαγραμματική απεικόνιση των διαφορετικών χειρισμών καλλιέργειας in vitro για την παραγωγή αναγεννημένωνχειρισμών καλλιέργειας in vitro για την παραγωγή αναγεννημένων φυταρίων

∆ ή έ ά ξ δ ί δ δ ώ ώ∆ιαγραμματική προσέγγιση ανάπτυξης και δημιουργίας διαγονιδιακών φυτών μέσα από τις γενικές στρατηγικές της ιστοκαλλιέργειας και της αναγέννησης των φυτών.

OECMOECM 1η μέρα1η μέρα OECMOECM 2 εβδομ2 εβδομ OECMOECM 3 εβδομ3 εβδομOECM, OECM, 1η μέρα1η μέρα OECM, OECM, 2 εβδομ2 εβδομ.. OECMOECM, 3 εβδομ., 3 εβδομ.

OLCM 1OLCM 1 OLCM 1OLCM 1 OLCM 2OLCM 2

∆ημιουργία υγρών καλλιεργειών ∆ημιουργία υγρών καλλιεργειών κάλλων ελιάς κορωνέϊκης (κάλλων ελιάς κορωνέϊκης (Olea europaeaOlea europaea))κάλλων ελιάς κορωνέϊκης (κάλλων ελιάς κορωνέϊκης (Olea europaeaOlea europaea))

ΒA Γ

ΈναρξηΈναρξηκαλογένεσηςκαλογένεσης

από ριζ έκφυτααπό ριζ έκφυτα

∆ιαφοροποίηση ∆ιαφοροποίηση σε μεριστωσε μεριστω--ματικές μάζεςματικές μάζες ΒλαστογένεσηΒλαστογένεση

Δ Ε

από ριζ. έκφυτααπό ριζ. έκφυτα ματικές μάζεςματικές μάζες ΒλαστογένεσηΒλαστογένεση

Ανάπυξη βλαστώνΑνάπυξη βλαστών Σε θρεπτικό μέσο: Σε θρεπτικό μέσο: επαγωγή ρίζας, ωρίμανση φυτούεπαγωγή ρίζας, ωρίμανση φυτού

Εικ. 4.4 Εικ. 4.4 –– Αναγέννηση ώριμου φυτού Αναγέννηση ώριμου φυτού Arabidopsis thalianaArabidopsis thaliana. .

Α Β Γ

OECM, OECM, OESMOESM, ,

Δ Ε Ζ

,,2 εβδομ.2 εβδομ.

,,επαγωγή βλαστογένεσηςεπαγωγή βλαστογένεσης

[Ζ], [Η][Ζ], [Η]ΚαλλιέργειαΚαλλιέργεια

Η

αναγεννημένων αναγεννημένων φυτών ελιάς σε φυτών ελιάς σε αποστειρωμένα αποστειρωμένα

δ ίδ ίδοχεία με δοχεία με θρεπτικό μέσο θρεπτικό μέσο MSMS, ,

απουσία απουσία φυτοαυξητικώνφυτοαυξητικών

έ ώ ά έϊέ ώ ά έϊ

OERM, OERM, επαγωγή ριζοβολίαςεπαγωγή ριζοβολίαςφυτοαυξητικώνφυτοαυξητικώνρυθμιστών.ρυθμιστών.

Αναγέννηση φυτών ελιάς κορωνέϊκηςΑναγέννηση φυτών ελιάς κορωνέϊκηςαπό έκφυτα κοτυληδόνων εμβρύων.από έκφυτα κοτυληδόνων εμβρύων.

Τα ριζωμένα φυτάρια μεταφέρονται έπειτα σε κουτιά με χώμαΤα ριζωμένα φυτάρια μεταφέρονται έπειτα σε κουτιά με χώμα

ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΣΕ ΧΩΜΑΜΕΤΑΦΟΡΑ ΣΕ ΧΩΜΑ

ρ ζ μ φ ρ μ φ ρ μ χ μρ ζ μ φ ρ μ φ ρ μ χ μ

Τα φυτά πρέπει να εγκλιματιστούν στον αέραΤα φυτά πρέπει να εγκλιματιστούν στον αέρα

Η διαδικασία αυτή διαρκεί 4Η διαδικασία αυτή διαρκεί 4--5 μέρες5 μέρεςΗ διαδικασία αυτή διαρκεί 4Η διαδικασία αυτή διαρκεί 4 5 μέρες5 μέρες

Time point: Time point: 13 εβδομάδες13 εβδομάδες

ΣΤΟΣΤΟ ΘΕΡΜΟΚΗΠΙΟΘΕΡΜΟΚΗΠΙΟ

ΤαΤα διαγονιδιακάδιαγονιδιακά αυτάαυτά φυτάφυτά είναιείναι έτοιμαέτοιμα γιαγια μεταφοράμεταφορά στοστοθερμοκήπιοθερμοκήπιο ΒλέπουμεΒλέπουμε δύοδύο καλλιεργήματακαλλιεργήματα τομάταςτομάτας:: τοτο

ΣΤΟΣΤΟ ΘΕΡΜΟΚΗΠΙΟΘΕΡΜΟΚΗΠΙΟ

θερμοκήπιοθερμοκήπιο.. ΒλέπουμεΒλέπουμε δύοδύο καλλιεργήματακαλλιεργήματα τομάταςτομάτας:: τοτοMoneymakerMoneymaker (αριστερά)(αριστερά) καικαι τοτο MotelleMotelle (δεξιά)(δεξιά).. ΚαιΚαι τατα δύοδύοπεριέχουνπεριέχουν γονίδιαγονίδια πουπου είναιείναι προϊόνπροϊόν γενετικήςγενετικής μηχανικήςμηχανικής..

Time point: Time point: 15 εβδομάδες15 εβδομάδες

Γενετική τροποποίηση (Genetic transformation)- Εισαγωγή ετερόλογων ή/και τροποποίηση ενδογενών

γονιδίων που μπορούν να προσδώσουν χρήσιμα χαρακτηριστικά.

- Αφαίρεση ή καταστολή γονιδίων που προσδίδουν θύ ά ύ ύανεπιθύμητα χαρακτηριστικά σε οργανισμούς γεωργικού,

περιβαλλοντικού, βιομηχανικού ή ιατρικού ενδιαφέροντος.

ΟΙ ΚΥΡΙΩΤΕΡΕΣ ΜΕΘΟ∆ΟΙ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΟΙ ΚΥΡΙΩΤΕΡΕΣ ΜΕΘΟ∆ΟΙ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗΣ ΣΤΑ ΦΥΤΑΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗΣ ΣΤΑ ΦΥΤΑΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗΣ ΣΤΑ ΦΥΤΑΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗΣ ΣΤΑ ΦΥΤΑ

Μέθοδος του Αγροβακτηρίου- Μέθοδος του Αγροβακτηρίου

Μέθοδος του Εκτοξευτήρα Μικροσφαιριδίων- Μέθοδος του Εκτοξευτήρα Μικροσφαιριδίων(particle gun, gene gun)

Η πρώτη πειστική απόδειξηΗ πρώτη πειστική απόδειξηΗ πρώτη πειστική απόδειξη Η πρώτη πειστική απόδειξη της γενετικής τροποποίησης φυτών της γενετικής τροποποίησης φυτών

με τις μεθόδους της μοριακήςμε τις μεθόδους της μοριακήςμε τις μεθόδους της μοριακής με τις μεθόδους της μοριακής γενετικήςγενετικής

Το 1983 στο Πανεπιστήμιο της Γάνδης στο Πανεπιστήμιο της Γάνδης Β λ ί ή Γ ήΒ λ ί ή Γ ήτου Βελγίου στο εργαστήριο Γενετικής του Βελγίου στο εργαστήριο Γενετικής

απόαπό τηντην ομάδαομάδα τωντων καθηγητώνκαθηγητώνMark Van Montagu και Jeff SchellMark Van Montagu και Jeff Schell και απόκαι απόMark Van Montagu και Jeff Schell Mark Van Montagu και Jeff Schell και από και από τον Μεξικάνο φοιτητή τον Μεξικάνο φοιτητή Luis Luis HerreraHerrera--EstrellaEstrella

HerreraHerrera--Estrella L. (1983). Transfer and expression of Estrella L. (1983). Transfer and expression of foreign genes in plants. PhD Thesis. foreign genes in plants. PhD Thesis. Laboratory of Genetics, Gent University, BelgiumLaboratory of Genetics, Gent University, Belgium

Εισαγωγή DNA σε φυτικά κύτταρα β ήθ β ίμε τη βοήθεια του βακτηρίου

Agrobacterium tumefaciensg

- Gram-αρνητικό ραβδόμορφο βακτήριοGram αρνητικό ραβδόμορφο βακτήριο εδάφουςΠ λ ί λ ί “ ό- Προκαλεί τη νεοπλασία “κορονωτός κάλλος”

- Ερευνητικό ενδιαφέρον για το σύστημα Agrobacterium- Agrobacterium

- Μεταφορά DNA μεταξύ δύο βασιλείων (βακτήρια-φυτά)

ΜΟΛΥΣΜΑΤΙΚΟ ΠΛΑΣΜΙ∆ΙΟ ΜΟΛΥΣΜΑΤΙΚΟ ΠΛΑΣΜΙ∆ΙΟ TiTi (200 kb)(200 kb)- Όγκο–επαγωγικό πλασμίδιο

( )( )

(Η τοξικότητα εξαρτάται από τη θερμοκρασία επώασης: 28οC άριστη)

- Φυτοπαθογένεια- Εισαγωγή του πλασμίδιου Ti σε συγγενή είδη οδηγεί σε ογκο-επαγωγικά στελέχη

- Εισαγωγή του πλασμίδιου Ti σε απομακρυσμένα είδη ∆ΕΝ οδηγεί σε ογκο-επαγωγικά στελέχη

- Ανταγωνιστικά μη παθογόνα στελέχη : Agrobacterium radiobacter (αγροσίνη 84)

pTiC58

vir

ΠλασμίδιοΠλασμίδιο TiTi∆ιαγραμματική απεικόνιση του πλασμιδίου∆ιαγραμματική απεικόνιση του πλασμιδίου pTiC58pTiC58 που που προέρχεται από το στέλεχοςπροέρχεται από το στέλεχος A tumefaciensA tumefaciens C58C58

Πλασμίδιο Πλασμίδιο TiTi

προέρχεται από το στέλεχοςπροέρχεται από το στέλεχος A. tumefaciensA. tumefaciens C58. C58. OriOri:: περιοχή υπεύθυνη για την αντιγραφήπεριοχή υπεύθυνη για την αντιγραφήVirVir:: περιοχή όπου εδράζουν τα γονίδια τοξικότηταςπεριοχή όπου εδράζουν τα γονίδια τοξικότητας ConCon::ρ χή ρ ζ γ ξ η ςρ χή ρ ζ γ ξ η ςπεριοχές που προσδίδουν τη συζευκτική περιοχές που προσδίδουν τη συζευκτική δραστηριότητα του πλασμιδίουδραστηριότητα του πλασμιδίου

Σχηματισμός κορονωτού κάλλου στην Σχηματισμός κορονωτού κάλλου στην χημ μ ς ρ ηχημ μ ς ρ ητριανταφυλλιάτριανταφυλλιά

Ι∆ΙΟΤΗΤΕΣ ΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΤΟΥ Ι∆ΙΟΤΗΤΕΣ ΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΤΟΥ ΚΟΡΟΝΩΤΟΥ ΚΑΛΛΟΥΚΟΡΟΝΩΤΟΥ ΚΑΛΛΟΥ

∆υο ειδών κύτταρα:

ΚΟΡΟΝΩΤΟΥ ΚΑΛΛΟΥΚΟΡΟΝΩΤΟΥ ΚΑΛΛΟΥ

- ∆υο ειδών κύτταρα: Γενετικά τροποποιημένα και μηΈ ά λ ή- Έχουν χάσει τη φυσιολογική διαφοροποίηση Τ ύ ύ άλλ- Τα κύτταρα του κορονωτού κάλλου πολλαπλασιάζονται αυτόνομα (ασηπτικός εμβολιασμός ιστού του κορονωτούεμβολιασμός ιστού του κορονωτού κάλλου σε υγιή φυτά οδηγεί στη δημιουργία κάλλου)δημιουργία κάλλου)

- Παράγουν και εκκρίνουν ασυνήθη αμινοξέα και παράγωγα σακχάρωναμινοξέα και παράγωγα σακχάρων (οκτοπίνη, νοπαλίνη κλπ)

COOHHN

COOH

NN

N

HN N

H

A

H

BA B

ΑυξίνηΑυξίνη -- ΚυτοκινίνηΚυτοκινίνηΑυξίνη Αυξίνη -- ΚυτοκινίνηΚυτοκινίνη

Χημική δομή δύο ρυθμιστών ανάπτυξης φυτών: Χημική δομή δύο ρυθμιστών ανάπτυξης φυτών: ημ ή μή ρ μ ξης φημ ή μή ρ μ ξης φ[Α] μιας αυξίνης (ινδολικό οξύ)[Α] μιας αυξίνης (ινδολικό οξύ)

[Β] μιας κυτοκινίνης (Ν[Β] μιας κυτοκινίνης (Ν66--μεθυλαμινοπουρίνη)μεθυλαμινοπουρίνη)[ ] μ ς ης ([ ] μ ς ης ( μ μ ρ η)μ μ ρ η)

CH OH2

HOCH

O

HOCH

OOPO.N

ON

N

O

O

N N

πεντόζη-Ν-POCH2

Αγροσίνη 84Αγροσίνη 84Αγροσίνη 84Αγροσίνη 84Συνοπτική δομή της αγροσίνης 84 αποτελούμενη από Συνοπτική δομή της αγροσίνης 84 αποτελούμενη από ένα νουκλεοτίδιο τύπου ψευδοένα νουκλεοτίδιο τύπου ψευδο--αδενοσίνης και δύο αδενοσίνης και δύο

παράγωγα σακχάρων: μία φωσφορική παράγωγα σακχάρων: μία φωσφορική λ ά λ ύ ό 6 ά θλ ά λ ύ ό 6 ά θγλουκοφουράνη αποτελούμενη από 6 άνθρακες και γλουκοφουράνη αποτελούμενη από 6 άνθρακες και

ένα μεθυλιωμένο πενταναμίδιο.ένα μεθυλιωμένο πενταναμίδιο.

Ε 2 6Ε 2 6Εικ. 2.6. Εικ. 2.6. Σύνθεση Σύνθεση

δ ήδ ήκαι δομή και δομή οπινώνοπινών

Οικογένειες:Οικογένειες:Α. ΟκτοπίνηςΑ. ΟκτοπίνηςΒ. ΝοπαλίνηςΒ. ΝοπαλίνηςΓ. ΑγροπίνηςΓ. Αγροπίνης

κάλλοςμόλυνση πληγωμένουφυτού από το βακτήριοA. tumefaciens

κάλλος

λλ λ ό

ανάπτυξη της μάζας των κυττάρων και η δημιουργία

πολλαπλασιασμόςβακτηρίων και καρκινικών κυττάρων

ρ η ημ ργκάλλου σε θρεπτικό μέσοχωρίς φυτορμόνες

εγκατάσταση καλλιέργειας

ανάπτυξη κορωνοτούκάλλου στο φυτό

εκτομή και απομόνωσηιστού από κορωνοτό κάλλο και εμβολιασμός θρεπτικού μέσου

γ η ργ ςκαρκινικών φυτικών κυτάρωνκαι ταυτόχρονη θανάτωσητων από καρβενικιλίνη

Agrobacterium

θρεπτικού μέσου

Ανάπτυξη καρκινικών κυττάρων σε θρεπτικόΑνάπτυξη καρκινικών κυττάρων σε θρεπτικόΑνάπτυξη καρκινικών κυττάρων σε θρεπτικό Ανάπτυξη καρκινικών κυττάρων σε θρεπτικό μέσομέσο

η

νεργοποίηση

υT-

DNAΡίζα

πλασμίδιο χρωμόσωμα

εταφορά,

ενε

ένθεση

του

A. tumefaciens

Ti περμεάσες οπινών

πρόσληψη οπινών

με και

Μόλυνση πληγωμένου φυτικού ιστού από Μόλυνση πληγωμένου φυτικού ιστού από AgrobacteriumAgrobacteriumη ηγ μ φη ηγ μ φ gg

ocs agrroi roi nos

TRTL

agr

con

shiroi

shiori V

noc

occpTiAch5

vir

pTiC58

vir v

ori V conacctzs

Λειτουργική οργάνωση των πλασμιδίων Λειτουργική οργάνωση των πλασμιδίων TiTiργ ή ργ η μργ ή ργ η μ

. . . . G C T G G T G G C A G G A T A T A T T G T G G T G T A A A C A A A T T . . . . νοπαλίνη L

. . . . G T G T T T G A C A G G A T A T A T T G G C G G G T A A A C C T A A G . . . .

. . . . A G C G G C G G C A G G A T A T A T T C A A T T G T A A A T G G C T T . . . .

. . . . C T G A C T G G C A G G A T A T A T A C C G T T G T A A T T T G A G C . . . .

νοπαλίνη R

οκτοπίνη Α

οκτοπίνη Β

. . . . A A A G G T G G C A G G A T A T A T C G A G G T G T A A A A T A T C A . . . .

. . . . A C T G A T G G C A G G A T A T A T G C G G T T G T A A T T C A T T T . . . . οκτοπίνη D

οκτοπίνη C

η

Τελικές ακολουθίες που περιστοιχίζουν το Τελικές ακολουθίες που περιστοιχίζουν το TT--DNADNAτων πλασμιδίωντων πλασμιδίων TiTi τύπου νοπαλίνης καιτύπου νοπαλίνης καιτων πλασμιδίωντων πλασμιδίων TiTi τύπου νοπαλίνης και τύπου νοπαλίνης και

οκτοπίνηςοκτοπίνης

T-DNA περιοχή του πλασμιδίου pTiC58 της νοπαλίνης

5 2 1 4 6a 6b 3

A t t t l

συνοριακά

Agroc tms tmr tml nos

T-DNA περιοχή του πλασμιδίου pTiAch5 της οκτοπίνης

TL TR

5 7 2 1 4 6a 6b 3 4’ 3’ 2’ 1’ 0’5 7 2 1 4 6a 6b 3 4 3 2 1 0

tms tmr tml ocs agsaux cyt

frs mas

Χάρτης των μηνυμάτων που κωδικοποιούνται Χάρτης των μηνυμάτων που κωδικοποιούνται από την περιοχή από την περιοχή TT--DNADNA του οκτοπινικού και του οκτοπινικού και νοπαλινικού πλασμιδίου νοπαλινικού πλασμιδίου TiTi

παραγωγή κυττοκινίνηςπαραγωγή αυξίνης

δεξιές επαναλλήψεις 24bp σύνθεση οπινώναριστερές επαναλλήψεις 24bp

T DNAσυζευκτικήμεταφορά

T-DNAπεριοχή

περιοχή τοξικότητας Ti πλασμίδιο

καταβολισμόςοπινών

ξ η ς

αρχή αρχήαντιγραφής

ή ή ό ίή ή ό ίΣυνοπτική διαγραμματική απεικόνιση του πλασμιδίου Συνοπτική διαγραμματική απεικόνιση του πλασμιδίου TiTi

περιοχή vir

H A B G C D E Fοπερόνια

2 1 11 1 2 4 2 1 σύνολογονιδίων ανά οπερόνιο

∆ιαγραμματική απεικόνιση των ∆ιαγραμματική απεικόνιση των οπερονίων και των γονιδίων πουοπερονίων και των γονιδίων πουοπερονίων και των γονιδίων που οπερονίων και των γονιδίων που βρίσκονται στην τοξική περιοχή βρίσκονται στην τοξική περιοχή virvirτου οκτοπινικού πλασμιδίουτου οκτοπινικού πλασμιδίου TiTiτου οκτοπινικού πλασμιδίουτου οκτοπινικού πλασμιδίου TiTi

R1

CH O3 OCH3

OH

O

ΕΠΑΓΩΓΗ

R1 = CO

CH3

R CHCH CO

ακετοσυριγκόνη

ό ξύ

+++++

++++R1 = CHCH CCH3

R1 =H

CO

σιναπικό οξύ

συριγκαλδεύδη

++++

+++

R1 =OH

CO

CO

H

συριγκικό οξύ ++OH

R1 = H διμεθοξυφαινόλη ++

Χημική δομή ακετοσυριγκόνηςΧημική δομή ακετοσυριγκόνης

Συνθήκες για βέλτιστη επαγωγή των Συνθήκες για βέλτιστη επαγωγή των ςςγονιδίων γονιδίων virvir

1.1. pH pH (5(5--6)6)

2.2. Θερμοκρασία (20Θερμοκρασία (20--3030οοCC))

33 Απουσία εκχυλισμάτων ζύμης στοΑπουσία εκχυλισμάτων ζύμης στο3.3. Απουσία εκχυλισμάτων ζύμης στο Απουσία εκχυλισμάτων ζύμης στο θρεπτικό μέσοθρεπτικό μέσο

4.4. Παρουσία υψηλής συγκέντρωσης Παρουσία υψηλής συγκέντρωσης σακχάρων στο θρεπτικό μέσοσακχάρων στο θρεπτικό μέσοχ ρ ρ μχ ρ ρ μ

Ενεργοποίηση των οπερονίων της περιοχής τοξικότητας Ενεργοποίηση των οπερονίων της περιοχής τοξικότητας virvir πρωτεϊνώνπρωτεϊνών VirAVirA καικαι VirGVirG

I. ενεργοποίηση της VirA από φαινολικά παράγωγα όπως

πρωτείνης

virvir πρωτεϊνών πρωτεϊνών VirA VirA και και VirGVirG

αινολικά φυτι

κά

α πληγωμ

ένου ιστού

από φαινολικά παράγωγα όπως ακετοσυριγκόνη

εξωτερική μεμβράνηφαινο

λ

παράγωγα

πλη

εσωτερική μεμβράνη

ανενεργή πρωτείνη VirG

II.ενεργοποίηση

ενεργοποιημένη ί Vi A

ργ η ητης πρωτείνης VirG οπερόνιο vir

προαγωγέας κωδική αλληλουχία

πρωτείνη VirA

ε ερ ο ο η έ ηενεργοποιημένη πρωτείνη VirG

Τοπολογία της πρωτεΐνηςΤοπολογία της πρωτεΐνης VirAVirAΤοπολογία της πρωτεΐνης Τοπολογία της πρωτεΐνης VirAVirA

περιοχή αναγνώρισης pHπρωτείνες TM1TM2

περιοχή υποδοχέαNHλιπίδια

NH2

περιοχή μετάδοσης σήματος

COOH

Μοντέλο δημιουργίας μονόκλωνης αλυσίδας του Μοντέλο δημιουργίας μονόκλωνης αλυσίδας του TT--DNADNA στοστο Agrobacterium tumefaciensAgrobacterium tumefaciens

T-DNALB RB

DNADNA στο στο Agrobacterium tumefaciensAgrobacterium tumefaciens

Eεγκοπή εγκοπή

ύ θ DNAσύνθεση του DNAμε εκτόπιση αλυσίδας

+

5’3’ ss T-DNA

Οι αλληλουχίες του πλασμιδίου Οι αλληλουχίες του πλασμιδίου Ti Ti που δρουν σε που δρουν σε κατάσταση κατάσταση ciscis και είναι σημαντικές για την και είναι σημαντικές για την

ογκογενετικότηταογκογενετικότητα

T A A

onc

LB RB E

A AG T CG CTGTGTAT

vir

L E ATGTTTGTTTG

πλασμίδιο Ti

περιοχή

v G

π

Μοντέλο νουκλεοπρωτεϊνικού Μοντέλο νουκλεοπρωτεϊνικού συμπλόκουσυμπλόκου TT--DNADNAσυμπλόκου συμπλόκου TT--DNADNA

VirE

23’ άκρο 5’ άκρο

V

VirD220nm

T DNA360nm (20 kb)

T-DNA

∆ομή του οπερονίου ∆ομή του οπερονίου virBvirB

1 kb

Sal IBamH I

ένζυμαπεριορισμού

virA orf B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11 VirG

οπερόνιο virB

Γραφική παράσταση της μεταφοράς και ένθεσης του Γραφική παράσταση της μεταφοράς και ένθεσης του TT DNADNA στο φυτό από τοστο φυτό από το Agrobacterium tumefaciensAgrobacterium tumefaciens

Ακετοσυριγκό

νη ή άλλες

φαινολικές εν

ώσεις

λα πληγής

TT--DNA DNA στο φυτό από το στο φυτό από το Agrobacterium tumefaciensAgrobacterium tumefaciens

φασινιάλ

α πληγήκυτταρόπλασμα

VirA

Τ

γενωματικό DNAPP

VirD4

NPCNPCNPCNPC

NPCNPCNPCNPC

Τ-σύμπλοκο

irD1,

VirD2

VirB11

E2 D2

ATP

επαγωγή των οπερονίων vir

NPCNPCNPCNPCοπίνες

T-D

NA

VirB

Vir

VirE2 VirD2 εάσες

ών

NPCNPCNPCNPC

πυρήνας

VirE2 VirD2

Χρωμόσωμα

Περμε

οπινώ

Φυτό

πυρήναςρ μ μ

Agrobacterium

A model for the Agrobacterium-mediated genetic transformation. The transformation process pcomprises 10 major steps and begins with recognition and attachment of the Agrobacteriumto the host cells (1) and the sensing of specific plant signals by the Agrobacterium VirA/VirG

i ltwo-component signal-transduction system (2). Following activation of the virgene region (3), a mobile copy of the T-DNA is generated by the VirD1/D2 protein complex (4) and delivered as a VirD2 DNAand delivered as a VirD2–DNA complex (immature T-complex), together with several other Vir proteins, into the host-cell cytoplasm (5). Following the association of VirE2 with the T-strand the mature T-complexstrand, the mature T complex forms, travels through the host-cell cytoplasm (6) and is actively imported into the host-cell nucleus (7). Once inside the nucleus, the T-DNA is recruited to the point of integration (8), p g ( )stripped of its escorting proteins (9) and integrated into the host genome (10). A detailed model of the host cellular mechanisms and the role of plant-specific factors in the transformation

i i Fi 2process are given in Figure 2. (This illustration was reproduced, with modifications, from [28•] with permission.).

A model for Agrobacterium-mediatated transformation

Θέσεις των ενθέσεων του Θέσεις των ενθέσεων του TT--DNA DNA σε ένα σε ένα τυπικό γονίδιο του φυτού τυπικό γονίδιο του φυτού Arabidopsis Arabidopsis thalianathaliana

5’ 3’

ΑγροβακτήριοΠλασμίδιο Ti (α)

Περιοχή vir

ΑΟ ∆Ο

(β)

( )VirD1-D2

Φυτικό κύτταρο(γ)VirD2Κλώνος Τ

T DNA πλήρους μήκους Κολοβό T DNA Πολλαπλά T DNA

(δ)(ε)

(στ)

T-DNA πλήρους μήκους Κολοβό T-DNA Πολλαπλά T-DNA

Εικόνα 1. Σχηματοποιημένη δομή του πλασμιδίου Ti και των κινητών και ενσωματωμένων μορίων T-DNA του Αγροβακτηρίου. (α) Το πλασμίδιο Ti περιέχει την περιοχή T-DNA, η οποία ορίζεται από το δεξιό (∆Ο σε μπλε) και αριστερό της όριο (ΑΟ σε βυσσινί) in trans προς την

(Από το TRENDS in Genetics)

ορίζεται από το δεξιό (∆Ο, σε μπλε) και αριστερό της όριο (ΑΟ, σε βυσσινί), in trans προς την μολυσματική περιοχή (περιοχή vir, σε πορτοκαλί). (β) Τα όρια του T-DNA είναι επαναλήψεις 25 bp και χρησιμεύουν ως στόχοι για το σύμπλοκο ενδονουκλεασών VirD2–VirD1, το οποίο τέμνει μεταξύ του τρίτου και τέταρτου νουκλεοτιδίου κάθε μιας από τις οριακές ακολουθίες. (γ) Το κινητό

θ ( )αντίγραφο του T-DNA απελευθερώνεται ως μονόκλωνο μόριο DNA (κλώνος T) με ένα μόνο μόριο VirD2 προσαρτημένο στο 5′ άκρο του. Οι υπολειπόμενες ακολουθίες των ορίων του T-DNA, οι οποίες δεν έχουν πλέον βιολογική λειτουργία, συχνά χρησιμοποιούνται ως σημεία αναφοράς για τον προσανατολισμό και την ενσωμάτωση του T-DNA στο φυτικό κύτταρο. Το T-DNA συνήθως ρ μ η μ η φ ρ ή ςενσωματώνεται στο γονιδίωμα του ξενιστή (δ) ως ένα μόνο πλήρους μήκους ή (ε) κολοβό μόριο καθώς και ως (στ) πολλαπλά μόρια συνδεδεμένα μεταξύ τους με διάφορους προσανατολισμούς.(T. Tzfira, T. J. Li, B. Lacroix and V. Citovsky. TRENDS in Genetics 20: 375-383, 2004).

Μοντέλο ένθεσης του Μοντέλο ένθεσης του TT--DNA DNA στο φυτόστο φυτό

Αομολογία5 βάσεων

Β

4 5 περιορισμένη

5’3’

3’5’

12

3

5 βάσεων

DNA φυτούY

VirD2

4 5

3’ 5’ 5’

ρ ρ μ η“μικροομολογία” 1 βάσης

αντιγραφή του

VirD2Y

VirE2T-DNA

αντιγραφή τουγενωματικού DNAμε εκκινητή τοT-DNA

αντιγραφή τουγενωματικού DNAμε εκκινητή το DNA του φυτού

Γ ∆

5’

αντιγραφή του T-DNAμε εκκινητή το DNAτου φυτού

Γ ∆

VirD2Y

VirE2

Φορείς Γενετικού Υλικού που βασίζονται σε Φορείς Γενετικού Υλικού που βασίζονται σε Agrobacterium tumefaciensAgrobacterium tumefaciens

Το Πλασμίδιο Ti ως ένας

Agrobacterium tumefaciensAgrobacterium tumefaciens

Το Πλασμίδιο Ti ως ένας φυσικός φορέας γενετικού υλικού

ή ή “ f ( ) έ ξήΠεριοχή Α ή “transferred DNA” (T-DNA) που έχει τα εξής χαρακτηριστικά:

1. Περιέχει γονίδια (ογκογονίδια) που κωδικοποιούν ένζυμα για τη βιοσύνθεση των κύριων φυτοορμονών ύξ ά ξί (t 1 t 2)αύξησης στα φυτά: αυξίνη (tms1 και tms2) και

κυτοκινίνη (tmr).

2. Περιέχει ένα ή περισσότερα γονίδια που συμμετέχουν στη βιοσύνθεση ασυνήθιστων αμινοξέων ή παράγωγα

ά ί ( i ) θά λίσακχάρων, οπίνες (opines): συνθάση της νοπαλίνης και συνθάση της οπίνης.

3. Περιέχει δύο χαρακτηριστικές αλληλουχίες Περιέχει δύο χαρακτηριστικές αλληλουχίες νουκλεοτιδίων, μήκους 25 βάσεων σε κάθε άκρο του, νουκλεοτιδίων, μήκους 25 βάσεων σε κάθε άκρο του, που ονομάζονταιπου ονομάζονται αριστερό και δεξιό συνοριακό άκροαριστερό και δεξιό συνοριακό άκρο((Left and Right border sequencesLeft and Right border sequences, , LBLB και και RBRB), που ), που λειτουργούν ως σημεία αναγνώρισης και εκτομής απόλειτουργούν ως σημεία αναγνώρισης και εκτομής απόλειτουργούν ως σημεία αναγνώρισης και εκτομής από λειτουργούν ως σημεία αναγνώρισης και εκτομής από ειδικά περιοριστικά ένζυμα που κωδικοποιεί μια άλλη ειδικά περιοριστικά ένζυμα που κωδικοποιεί μια άλλη περιοχή του ίδιου ογκογόνου πλασμιδίου, η περιοχή περιοχή του ίδιου ογκογόνου πλασμιδίου, η περιοχή ρ χή γ γ μ , η ρ χήρ χή γ γ μ , η ρ χήvirvir ((virulence regionvirulence region--περιοχή μολυσματικότητας).περιοχή μολυσματικότητας).

4.4. Τα γονίδια που βρίσκονται στο Τα γονίδια που βρίσκονται στο TT--DNADNA έχουν έχουν ευκαρυωτικάευκαρυωτικά (αντί προκαρυωτικά) (αντί προκαρυωτικά) ρυθμιστικάρυθμιστικά στοιχείαστοιχεία

έ δ άζ β ή λλάέ δ άζ β ή λλάκαι επομένως δεν εκφράζονται στο βακτήριο αλλά στο και επομένως δεν εκφράζονται στο βακτήριο αλλά στο φυτικό κύτταρο στο οποίο θα ενσωματωθούν.φυτικό κύτταρο στο οποίο θα ενσωματωθούν.

ΠεριοχήΠεριοχή ΒΒ:: OriginOrigin ofof replicationreplication (αρχή(αρχή τηςτης αντιγραφής)αντιγραφής)

ΠεριοχήΠεριοχή CC:: ΣυμμετέχειΣυμμετέχει στηστη σύζευξησύζευξη τουτου πλασμιδίουπλασμιδίου

ΠεριοχήΠεριοχή DD:: ΠεριοχήΠεριοχή πουπου προσδίδειπροσδίδει μολυσματικότηταμολυσματικότητα στοστοAgrobacteriumAgrobacterium::

−− ΗΗ περιοχήπεριοχή αυτήαυτή είναιείναι οργανωμένηοργανωμένη σεσε 66 οπερόνιαοπερόνια ((operonsoperons),),virAvirA,, BB,, CC,, DD,, EE,, καικαι GG..,, ,, ,, ,, ,,

−− ΤαΤα virAvirA,, BB,, DD,, GG προσδίδουνπροσδίδουν τητη μολυσματικήμολυσματική ικανότηταικανότητα στοστοβακτήριοβακτήριο ΤαΤα προϊόνταπροϊόντα τωντων γονιδίωνγονιδίων virAvirA καικαι virvirGGβακτήριοβακτήριο.. ΤαΤα προϊόνταπροϊόντα τωντων γονιδίωνγονιδίων virAvirA καικαι virvirGGρυθμίζουνρυθμίζουν τηντην έκφρασηέκφραση τωντων άλλωνάλλων γονιδίωνγονιδίων virvir..

−− ΤοΤο οπερόνιοοπερόνιο vivirDrD κωδικοποιείκωδικοποιεί μιαμια ενδονουκλεάσηενδονουκλεάση πουπουπροκαλείπροκαλεί τιςτις τομέςτομές αρχικάαρχικά στοστο δεξιόδεξιό καικαι μετάμετά στοστο αριστερόαριστερόσυνοριακόσυνοριακό άκροάκρο ((LeftLeft andand RightRight borderborder sequencessequences LBLB καικαισυνοριακόσυνοριακό άκροάκρο ((LeftLeft andand RightRight borderborder sequencessequences,, LBLB καικαιRBRB))..

ΗΗ ii ΕΕ22 ίί ΐΐ δέδέ•• ΗΗ virvirΕΕ22 είναιείναι μιαμια πρωτεΐνηπρωτεΐνη πουπου συνδέεταισυνδέεται μεμε τοτομονόκλωνομονόκλωνο DNADNA ((singlesingle--strandedstranded DNADNA--bindingbindingproteinprotein)) καικαι τοτο προστατεύειπροστατεύει..proteinprotein)) καικαι τοτο προστατεύειπροστατεύει..

ΑρκετέςΑρκετές απόαπό τιςτις πρωτεΐνεςπρωτεΐνες πουπου κωδικοποιούνταικωδικοποιούνται•• ΑρκετέςΑρκετές απόαπό τιςτις πρωτεΐνεςπρωτεΐνες πουπου κωδικοποιούνταικωδικοποιούνταιαπόαπό τοτο virvirΒΒ operonoperon φαίνεταιφαίνεται νανα συμμετέχουνσυμμετέχουν στηστηδιαδικασίαδιαδικασία μεταφοράςμεταφοράς τουτου TT--DNADNA απόαπό τοτο βακτήριοβακτήριοδιαδικασίαδιαδικασία μεταφοράςμεταφοράς τουτου TT DNADNA απόαπό τοτο βακτήριοβακτήριοστοστο φυτόφυτό..

ΦΟΡΕΙΣ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥΦΟΡΕΙΣ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ

Γενικά κάθε φορέας πρέπει να έχει :Γενικά κάθε φορέας πρέπει να έχει :

–– Ένα Ένα γονίδιο επιλογήςγονίδιο επιλογής (ανθεκτικότητα σε αντιβιοτικά, (ανθεκτικότητα σε αντιβιοτικά, ή σε ζιζανιοκτόνα ή σε άλλες ουσίες που ή σε ζιζανιοκτόνα ή σε άλλες ουσίες που παρεμποδίζουν την ανάπτυξη των μηπαρεμποδίζουν την ανάπτυξη των μηπαρεμποδίζουν την ανάπτυξη των μη παρεμποδίζουν την ανάπτυξη των μη μετασχηματισμένων φυτικών κυττάρων.μετασχηματισμένων φυτικών κυττάρων.

–– Γονίδια αναφοράςΓονίδια αναφοράς (β(β--γλουκουρονιδάση, γλουκουρονιδάση, λουτσιφεράσηλουτσιφεράση--luciferaseluciferase, β, β--γαλακτοσιδάση, ασετυλγαλακτοσιδάση, ασετυλ--τρανσφεράση της χλωραμφενικόλης κλπ)τρανσφεράση της χλωραμφενικόλης κλπ)τρανσφεράση της χλωραμφενικόλης κλπ).τρανσφεράση της χλωραμφενικόλης κλπ).

–– Ευκαρυωτικά ρυθμιστικά στοιχείαΕυκαρυωτικά ρυθμιστικά στοιχεία (υποκινητές, (υποκινητές, αλληλουχίες τερματισμού της μεταγραφής, ιντρόνια, αλληλουχίες τερματισμού της μεταγραφής, ιντρόνια, αλληλουχίες που κωδικοποιούν πεπτίδιααλληλουχίες που κωδικοποιούν πεπτίδια--οδηγούς οδηγούς για την εξωκυτταρική έκκριση ή τη στόχευση τουγια την εξωκυτταρική έκκριση ή τη στόχευση τουγια την εξωκυτταρική έκκριση ή τη στόχευση του για την εξωκυτταρική έκκριση ή τη στόχευση του προϊόντος μετάφρασης σε κυτταρικά οργανίδια).προϊόντος μετάφρασης σε κυτταρικά οργανίδια).

ΦΟΡΕΙΣ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥΦΟΡΕΙΣ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥΦΟΡΕΙΣ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥΦΟΡΕΙΣ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ

Γενικά κάθε φορέας πρέπει να έχει ακόμη:Γενικά κάθε φορέας πρέπει να έχει ακόμη:

–– Πολλαπλές θέσεις κλωνοποίησηςΠολλαπλές θέσεις κλωνοποίησης(Πολλαπλές θέσεις περιοριστικών ενζύμων).(Πολλαπλές θέσεις περιοριστικών ενζύμων).

–– Βακτηριακές αρχές αντιγραφήςΒακτηριακές αρχές αντιγραφής..

–– Προκαρυωτικά γονίδια επιλογήςΠροκαρυωτικά γονίδια επιλογής(Ανθεκτικότητα σε αντιβιοτικά). (Ανθεκτικότητα σε αντιβιοτικά).

∆υαδικοί φορείς “∆υαδικοί φορείς “binary vectorsbinary vectors””∆υαδικοί φορείς “∆υαδικοί φορείς “binary vectorsbinary vectors” ” Συστατικά στοιχεία συστήματος,Συστατικά στοιχεία συστήματος, Α

Μια αρχή αντιγραφής και σύζευξης που να Μια αρχή αντιγραφής και σύζευξης που να δίδ ό έδίδ ό έπροσδίδει την ικανότητα στον φορέα ναπροσδίδει την ικανότητα στον φορέα να

πολλαπλασιάζεται σε πολλαπλασιάζεται σε EE. . colicoli και και AgrobacteriumAgrobacterium..

Ένα προκαρυωτικό γονίδιο (ΑΡΗΈνα προκαρυωτικό γονίδιο (ΑΡΗ--Ι) πουΙ) πουπροσδίδει ανθεκτικότητα σε καναμυκίνη και προσδίδει ανθεκτικότητα σε καναμυκίνη και ρ η μ ηρ η μ ηχρησιμοποιείται για επιλογή στα βακτήρια.χρησιμοποιείται για επιλογή στα βακτήρια.

∆υαδικοί φορείς “∆υαδικοί φορείς “binary vectorsbinary vectors””∆υαδικοί φορείς “∆υαδικοί φορείς “binary vectorsbinary vectors” ” Συστατικά στοιχεία συστήματος,Συστατικά στοιχεία συστήματος, Β

ΤοΤο προκαρυωτικόπροκαρυωτικό γονίδιογονίδιο ““neomycinneomycin phosphorylphosphoryltransferasetransferase IIII;; nptnpt IIII”” πουπου βρίσκεταιβρίσκεται δίπλαδίπλα στοστο δεξιόδεξιόtransferasetransferase IIII;; nptnpt IIII πουπου βρίσκεταιβρίσκεται δίπλαδίπλα στοστο δεξιόδεξιόσυνοριακόσυνοριακό άκροάκρο ((RBRB)) καικαι πουπου προσδίδειπροσδίδειανθεκτικότηταανθεκτικότητα σεσε καναμυκίνηκαναμυκίνη καικαι χρησιμοποιείταιχρησιμοποιείται ωςωςα θε ό η αα θε ό η α σεσε α αμυ ηα αμυ η αα χρησ μο ο ε αχρησ μο ο ε α ωςωςγονίδιογονίδιο επιλογήςεπιλογής γιαγια διαγονιδιακάδιαγονιδιακά φυτάφυτά.. ΤοΤο γονίδιογονίδιοαυτόαυτό βρίσκεταιβρίσκεται υπόυπό τοντον έλεγχοέλεγχο τουτου υποκινητήυποκινητή καικαιτουτου πολυαδενυλιακούπολυαδενυλιακού σήματοςσήματος ((polyadenylationpolyadenylationsignalsignal)) τηςτης συνθάσηςσυνθάσης τηςτης νοπαλίνηςνοπαλίνης ((nosnos))..

∆υαδικοί φορείς “∆υαδικοί φορείς “binary vectorsbinary vectors””∆υαδικοί φορείς “∆υαδικοί φορείς “binary vectorsbinary vectors” ” Συστατικά στοιχεία συστήματος,Συστατικά στοιχεία συστήματος, Γ

ΠολύΠολύ--κλωνικέςκλωνικές θέσειςθέσεις ((multicloningmulticloning sitessites)) στοστοαριστερόαριστερό άκροάκρο τουτου TT DNADNAαριστερόαριστερό άκροάκρο τουτου TT--DNADNA..

ΕναΕνα πλασμίδιο,πλασμίδιο, “πλασμίδιο“πλασμίδιο TiTi βοηθός”βοηθός” ((helperhelper TiTiαα ασμ δ ο,ασμ δ ο, ασμ δ οασμ δ ο βοηθόςβοηθός (( e pee peplasmidplasmid)) μεμε γονίδιαγονίδια virvir πουπου παρέχουνπαρέχουν ικανότηταικανότηταμόλυνσηςμόλυνσης.. ΑπόΑπό τοτο πλασμίδιοπλασμίδιο αυτόαυτό έχουνέχουν αφαιρεθείαφαιρεθείτατα ογκογονίδιαογκογονίδια..∆ηλαδή∆ηλαδή τοτο πλασμίδιοπλασμίδιο αυτό,αυτό, τοτο ““helperhelper TiTi plasmidplasmid”,”,παρέχεταιπαρέχεται απόαπό μιαμια φυλήφυλή AgrobacteriumAgrobacterium στηνστην οποίαοποίαπαρέχεταιπαρέχεται απόαπό μιαμια φυλήφυλή AgrobacteriumAgrobacterium στηνστην οποίαοποίαέχουνέχουν αχρηστευθείαχρηστευθεί τατα ογκογονίδιαογκογονίδια..

Development of binary vectors that separate T-DNA and vir genes

T-DNA and the vir genes can be glocated on separate plasmids or

replicons, making cloning i

Agrobacterium tumefaciens

easier

Because the Ti The smallerT-DNA

Because the Ti plasmid is so large, a binary

system was developed to

The smaller plasmid is

introduced into Agrobacterium

carrying aBinary

Helper plasmid

developed to allow gene

cloning into a smaller plasmid

carrying a helper plasmid

with the virgenes

yvector

Manipulated in E.

Hoekema, A., Hirsch, P.R., Hooykaas, P.J.J. and Schilperoort, R.A. (1983). A binary plant vector strategy based on separation of vir- and T-region of the Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid. Nature. 303: 179-180.

coli

Summary – the development of a vector for plant transformationplant transformation

Introduce gene of interest into Inoculate plant withIntroduce gene of interest into T-DNA region, and introduce into Agrobacterium carrying vir genes

Inoculate plant with engineered Agrobacterium

Agrobacterium tumefaciens T-DNA

R t l t fRegenerate plant from transformed cells

A bid i fl lArabidopsis floral dip transformation

method

Photo by Peggy Greb, USDA

Η κασέτα του πλασμιδίου pΒΙ121 τουΗ κασέτα του πλασμιδίου pΒΙ121 του βασικού φορέα pBIN19

I

Hin

dIII

Sph

IP

stI

ATG

Xba

IB

amH

IS

maI

RB

Sph

I

Pnos NPT II Tnos

ATG TGAGUS Tnos35S CaMV

coR

V

LBRB290 1300 260 800 1950 260

Ec

∆ιαδικασία γενετικού ∆ιαδικασία γενετικού ύ ώύ ώμετασχηματισμού φυτώνμετασχηματισμού φυτών

ΚύτταροΦυτικό

Απομονωμένο DNA Γονίδιο

Φυτικό κύτταρο

Μετασχηματισμός

Κυτταρική διαίρεσηΔιαγονιδιακό φυτό

εμβολιασμός εκφύτωνεμβολιασμός εκφύτων ανάπτυξη κορωνοτούανάπτυξη κορωνοτούεμβολιασμός εκφύτωνεμβολιασμός εκφύτωνμεμε AgrobacteriumAgrobacterium

ανάπτυξη κορωνοτού ανάπτυξη κορωνοτού κάλλου παρουσίακάλλου παρουσίαβακτηριοστατικώνβακτηριοστατικών

κορονωτός κάλλοςκορονωτός κάλλος κάλλοςκάλλος

Εικ. 3.21 Εικ. 3.21 –– Ταυτοποίηση δεκτικών κυττάρων για το Ταυτοποίηση δεκτικών κυττάρων για το μετασχηματισμό με μετασχηματισμό με AgrobacteriumAgrobacterium με την με την αναγνώριση κορονωτού κάλλου.αναγνώριση κορονωτού κάλλου.

+Cx +Kan+Cx +Kan

Ε ώ β Α έ λ ήΕ ώ β Α έ λ ήΣυνκαλλιέργεια μικρώνεκφύτων (π.χ. φύλλων)με Agrobacterium

Επώαση με βακτηριο-στατικά-αντιβιοτικά(όπως σεφοταξίμη)

Αναγέννηση και επιλογήμετασχηματισμένων βλαστων

Συνκαλλιέργεια μικρώνεκφύτων (π.χ. φύλλων)με Agrobacterium

Επώαση με βακτηριο-στατικά-αντιβιοτικά(όπως σεφοταξίμη)

Αναγέννηση και επιλογήμετασχηματισμένων βλαστων

Εικ. 3.22 Εικ. 3.22 -- Μετασχηματισμός δισκίων φύλλου Μετασχηματισμός δισκίων φύλλου (π.χ.καπνός)(π.χ.καπνός)

Σχηματική παράσταση των βημάτων που οδηγούν στην παραγωγή “σταθερών” ΓΤΦ καπνού

Εικ. 3.24 Εικ. 3.24 –– Στάδια μετασχηματισμού εκφύτων ρίζας και Στάδια μετασχηματισμού εκφύτων ρίζας και επιλογή διαγονιδιακών φυτώνεπιλογή διαγονιδιακών φυτών ArabidopsisArabidopsis..

Εικ. 3.2Εικ. 3.266 -- Εισαγωγή DNA σε κύτταρα Εισαγωγή DNA σε κύτταρα Arabidopsis thalianaArabidopsis thalianaμε εμβάπτιση υπό κενόμε εμβάπτιση υπό κενό

Εικ. 3.25 Εικ. 3.25 -- Εισαγωγή DNA σε κύτταρα Εισαγωγή DNA σε κύτταρα Arabidopsis Arabidopsis thalianathaliana με εμβάπτιση υπό κενόμε εμβάπτιση υπό κενό

Παραγωγή ΓΤΦΠαραγωγή ΓΤΦΠαραγωγή ΓΤΦΠαραγωγή ΓΤΦArabidopsis thalianaArabidopsis thaliana

με εμβάπτιση υπό κενό με εμβάπτιση υπό κενό μ μβ ημ μβ η

Το Agrobacterium rhizogenes• Είναι ένα ραβδόμορφο,

Gram (-) βακτήριο του εδάφουςεδάφους.

• Ανήκει στην οικογένεια Rhizobiaceae.

• Είναι ο παθογόνος παράγοντας, που προκαλεί την ασθένεια των ρ ηθυσσανωδών ριζών.

• Προσβάλλει κυρίως δικοτυλήδονα φυτάδικοτυλήδονα φυτά.

• Περιέχει το πλασμίδιο Ri (Root Inducing).

Η ασθένεια των θυσσανωδώνΗ ασθένεια των θυσσανωδών ριζώνρ ζ

• Η ασθένεια των θυσσανωδών ριζώνύ ό β λή ύπροκύπτει κατόπιν προσβολής του φυτού

από το A. rhizogenes.• Συνεπεία της προσβολής παρατηρούνταιχαρακτηριστικές μεταβολές του φαινοτύπουτου φυτού, όπως:– διαφοροποιημένη μορφολογία ανθέων– μικρότερα μεσογονάτια διαστήματα– ζαρωμένα φύλλα– εμφάνιση των θυσσανωδών ριζών.

Φ Π

Π Φ

Φ

Φ

Π Π

Οι θυσανώδεις ρίζεςΟι θυσανώδεις ρίζες εμφανίζονται σε οποιοδήποτε σημείο του

φυτού προσβληθεί από το βακτήριο και χαρακτηρίζονται από:• υψηλό βαθμό πλευρικής διακλάδωσης• απουσία εξάρτησης της ανάπτυξης από την παρουσία

εξωγενώς προστιθέμενων αυξητικών ορμονών• εξαιρετικά ταχείς ρυθμούς ανάπτυξης (0,1-2,0 g ξηρού βάρους

ανά λίτρο καλλιέργειας και ημέρα)• απώλεια γεωτροπισμού

ξ έ ή θ ό• αυξημένη γενετική σταθερότητα• δυνατότητα παραγωγής πολλών προϊόντων:

– φυσιολογικά απαντώμενων σε αυτές– νέων, που προκύπτουν από την έκφραση γονιδίων που εισάγονται

με τη βοήθεια του T-DNA• συσσώρευση των προϊόντων σε πολλαπλάσιες συγκεντρώσεις

από τα κύτταρα στις κυτταροκαλλιέργειεςαπό τα κύτταρα στις κυτταροκαλλιέργειες

Οι θυσανώδεις ρίζεςΟι θυσανώδεις ρίζες

Το πλασμίδιο Ri • Έχει μεγάλο μέγεθος (200-800 kbp).• ∆ύναται να διαφέρει ανάμεσα στις βακτηριακές∆ύναται να διαφέρει ανάμεσα στις βακτηριακέςφυλές, τις οποίες μάλιστα και χαρακτηρίζει.

• Περιέχει τις περιοχές Ori, Vir, Con και T-DNA (ταβακτήρια που προκαλούν σύνθεση αγροπίνης έχουνβακτήρια που προκαλούν σύνθεση αγροπίνης έχουνδυο περιοχές Τ-DNA).

Αριστερή συνοριακή περιοχή ∆εξιά συνοριακή περιοχή

T-DNA-

ConVi

r

Ori

Το πλασμίδιο RiΤο πλασμίδιο Ri• Η περιοχή Οri είναι

ί έ ξαπαραίτητη για την έναρξη της αντιγραφής.

• Η περιοχή Con είναι αναγκαία για την μεταφοράαναγκαία για την μεταφορά του πλασμιδίου ανάμεσα στα βακτήρια.

• Η περιοχή Vir σχετίζεται μεΗ περιοχή Vir σχετίζεται με την μεταφορά του T-DNAστο φυτικό κύτταρο. Αποτελείται από 8 οπερόνια,

ί ό 2εκ των οποίων μόνο 2 εκφράζονται συστατικά.

• Η περιοχή T-DNAμεταφέρεται κιμεταφέρεται κι ενσωματώνεται στο φυτικό κύτταρο κατά την προσβολή του φυτού και προκαλεί την φ ρ ημεταμόρφωση αυτού.

Το T-DNA

• Το T-DNA οριοθετείται από δυο υψηλά συντηρημένες• Το T-DNA οριοθετείται από δυο υψηλά συντηρημένεςακολουθίες, μήκους 20-25 bp, οι οποίες ονομάζονταισυνοριακά άκρα.

• Στο T-DNA περιέχονται γονίδια που:– κατευθύνουν το σχηματισμό των φυτορμονών αυξίνης καικυτοκινίνης στο φυτικό κύτταρο (π χ aux tms1 tms2)κυτοκινίνης στο φυτικό κύτταρο (π.χ. aux, tms1, tms2)

– προκαλούν την παραγωγή των οπινών στο φυτικό κύτταρο(π.χ. mns, ags)επάγουν την εμφάνιση των θυσσανωδών ριζών (π χ RolA– επάγουν την εμφάνιση των θυσσανωδών ριζών (π.χ. RolA,RolB, RolC).

• Όλα τα γονίδια του T-DNA που μεταφέρονται στοφυτικό κύτταρο έχουν ευκαρυωτικούς ρυθμιστικούςπαράγοντες έκφρασης.

Η αυξίνη και η κυτοκινίνηΗ αυξίνη και η κυτοκινίνη• Είναι φυτικές ορμόνες απαραίτητες για την ανάπτυξη• Είναι φυτικές ορμόνες απαραίτητες για την ανάπτυξη

του φυτού.• Η αυξίνη διεγείρει την κυτταρική επιμήκυνση, την

ή δ ί δ ί Υ λά ί δκυτταρική διαίρεση και διαφοροποίηση. Υψηλά επίπεδααυξίνης επάγουν το σχηματισμό ριζών σε καλλιέργειεςκάλλου.

θ• Η κυτοκινίνη καθυστερεί τη γήρανση του φύλλου,απελευθερώνει τους πλάγιους οφθαλμούς από τηνκορυφαία κυριαρχία, διεγείρει το de novo σχηματισμό

θ λ ώ Υ λά ί δ ί άοφθαλμών. Υψηλά επίπεδα κυτοκινίνης επάγουν τοσχηματισμό βλαστού σε καλλιέργειες κάλλου.

• Ο μεταβολισμός της αυξίνης στα προσβεβλημέναμ β μ ς ης ξ ης ρ β β ημφυτικά κύτταρα φαίνεται να είναι απολύτως αναγκαίοςγια την επαγωγή της εμφάνισης του φαινοτύπου τωνθυσσανωδών ριζών.ρ ζ

Τα γονίδια που προκαλούν την ό ύμεταμόρφωση του φυτού

• Σημαντικότερα είναι τα γονίδια Rol (RolA, RolB, RolC,ημ ρ γ (RolD).– Ο ακριβής μηχανισμός επαγωγής της μεταμόρφωσης δενείναι γνωστός.

– Απολύτως απαραίτητο το γονίδιο RolB. Η παρουσία τουείναι αρκετή για πρόκληση της μεταμόρφωσης.

– Το RolB κωδικοποιεί τη σύνθεση πρωτεΐνης με δράσηά ί ώ ϊό R lCφωσφατάσης της τυροσίνης, ενώ το προϊόν του RolC

εμφανίζει in vitro δράση γαλακτοσιδάσης.• Εκτός από τα γονίδια Rol και τα αναγνωστικά πλαίσια

ORF3n ORF8 ORF13 του Ri τροποποιούν την εμφάνισηORF3n, ORF8, ORF13 του Ri τροποποιούν την εμφάνισητων φυτών.– Το ORF3n σχετίζεται με τη διαφοροποίηση του μήκους τωνμεσογονάτιων διαστημάτων και σε συνδυασμό με το ORF8μεσογονάτιων διαστημάτων και σε συνδυασμό με το ORF8τροποποιεί την ευαισθησία των φυτικών κυττάρων στηναυξίνη και την κυτοκινίνη

– Το ORF13 επηρεάζει τη φυσιολογική κυτταρική διαίρεση καιΤο ORF13 επηρεάζει τη φυσιολογική κυτταρική διαίρεση καιτην επιμήκυνση των φύλλων.

∆ημιουργία καλλιεργειών θ δώ ζώθυσσανωδών ριζών

Ένα τυπικό πρωτόκολλο δημιουργίας καλλιεργειών θυσανωδώνΈνα τυπικό πρωτόκολλο δημιουργίας καλλιεργειών θυσανωδώνριζών περιλαμβάνει τα ακόλουθα στάδια:

• καλλιέργεια του κατάλληλου στελέχους A. rhizogenesα έργε α ου α ά η ου σ ε έχους oge es• τραυματισμό του εκφύτου υπό άσηπτες συνθήκες (συνήθως

βλαστός, φύλλο ή και κοτυληδόνες)• εμβάπτιση του εκφύτου στην καλλιέργεια του βακτηρίου για 15-μβ η φ η ργ β ηρ γ

30 min, υπό ανακίνηση• καλλιέργεια των προσβεβλημένων εκφύτων σε μέσο MS σε

συνθήκες έλλειψης φωτός για 3 ημέρες• μεταφορά των εκφύτων σε μέσο καλλιέργειας εμπλουτισμένο

με αντιβιοτικό (π.χ. κεφοταξίμη) και αντικατάσταση αυτού 8-10φορές σε διάστημα 7-10 ημερών, ώστε να θανατωθεί ηπερίσσεια των βακτηρίων Μετά την πάροδο αυτού τουπερίσσεια των βακτηρίων. Μετά την πάροδο αυτού τουδιαστήματος αρχίζουν να εμφανίζονται θυσσανώδεις ρίζες

• υποκαλλιέργεια των θυσσανωδών ριζών σε φιάλεςκυτταροκαλλιέργειας σε μέσο καλλιέργειας MSκυτταροκαλλιέργειας, σε μέσο καλλιέργειας MS

∆ιαγονιδιακές θυσσανώδεις ρίζες • Η παραγωγή διαγονιδιακών ριζών είναι επιθυμητή για:

την μελέτη διάφορων βιοσυνθετικών μονοπατιών– την μελέτη διάφορων βιοσυνθετικών μονοπατιών– την παραγωγή ουσιών που φυσιολογικά δεν παράγονται στις ρίζες– την αύξηση της παραγωγής των ουσιών ενδιαφέροντος.

• Για τη σύνθεση νέων προϊόντων και την αύξηση της παραγωγής είναιαπαραίτητη η γνώση των βιοσυνθετικών μονοπατιών, καθώς και τωνενζύμων που ορίζουν το ρυθμό της εκάστοτε διαδικασίας.ζ μ ρ ζ ρ μ ης ς

• Οι συνηθέστερες προσεγγίσεις περιλαμβάνουν:

– την τροποποίηση απλών βιοσυνθετικών διαδικασιών με την προσθήκη τωνκατάλληλων ενζύμων

– τη χαρτογράφηση και τροποποίηση του ελέγχου των ρυθμιστικών γονιδίων– τη μείωση της αναστολής μέσω μηχανισμών ανάστροφης ανάδρασης– τη μείωση του καταβολισμού των ουσιών ενδιαφέροντος ή χρήσιμων

ενδιαμέσων για την παραγωγή αυτούύξ θ ύ ώ ά– την αύξηση του αριθμού των παραγωγών κυττάρων.

Εισαγωγή ετερόλογων γονιδίων β ήθ A hiμε τη βοήθεια του A. rhizogenes

• Για την εισαγωγή ετερόλογων γονιδίων χρησιμοποιούνται κατάΓια την εισαγωγή ετερόλογων γονιδίων χρησιμοποιούνται κατάκανόνα τροποποιημένα πλασμίδια Ri.

• Χρησιμοποιούνται δυαδικοί φορείς.• Στους δυαδικούς φορείς, τα γονίδια ενδιαφέροντοςΣτους δυαδικούς φορείς, τα γονίδια ενδιαφέροντος

αντικαθιστούν περιοχές του T-DNA.• Οι δυαδικοί φορείς αποτελούνται από δύο πλασμίδια:

– στο ένα πλασμίδιο η περιοχή T-DNA έχει τροποποιηθεί με αντικατάστασητων γονιδίων για σύνθεση οπίνης από το γοανίδιο ενδιαφέροντος και τογονίδιο επιλογής, ενώ έχει απομακρυνθεί η περιοχή Vir

– στο δεύτερο πλασμίδιο, η περιοχή T-DNA έχει απομακρυνθεί.

Εισαγωγή ετερόλογων γονιδίων με τη βοήθεια του A. rhizogenes

• Εκτός από τους δυαδικούς φορείς, έχει προταθεί καιη χρήση τριαδικών φορέων για την εισαγωγήετερόλογων γονιδίων. Οι τριαδικοί φορείς ουσιαστικάρ γ γ ρ φ ρ ςσυνιστούν τροποποιημένα συστήματα pGREEN, σταοποία έχουν προστεθεί τα γονίδια ενδιαφέροντος καιτα γονίδια Rol.τα γονίδια Rol.

• Εναλλακτικά για την παραγωγή προϊόντων, πουφυσιολογικά δεν παράγονται από τις ρίζες μπορούννα χρησιμοποιηθούν:να χρησιμοποιηθούν:– συγκαλλιέργειες θυσσανωδών ριζών και καλλιεργειώνγενετικά τροποποιημένων βλαστώνκαλλιέργειες θυσσανωδών ριζών οι οποίες προέκυψαν από– καλλιέργειες θυσσανωδών ριζών, οι οποίες προέκυψαν απότην προσβολή φυτών με το Α. rhizogenes και ακολούθωςτροποποιήθηκαν γενετικά χρησιμοποιώντας συστήματα τουΑ. tumefaciens.

Επιβεβαίωση της γενετικής ί ύ άτροποποίησης του φυτικού κυττάρου

β βΗ μεταμόρφωση του φυτικού κυττάρου επιβεβαιώνεταιμε:

• Μακροσκοπική παρατήρηση της εμφάνισης των• Μακροσκοπική παρατήρηση της εμφάνισης τωνθυσσανωδών ριζών.

• Αντοχή στον παράγοντα επιλογής, π.χ. αντιβιοτικόχή ρ γ γής, χ β(εφαρμόσιμη μόνο αν χρησιμοποιούνται γενετικάτροποποιημένα Ri πλασμίδια).Β ή άλ ή ώ• Βιοχημική ανάλυση της παραγωγής οπινών.

• Βιοχημική ανάλυση της έκφρασης των ετερόλογωνγονιδίωνγονιδίων.

• PCR, για την ανίχνευση των τμημάτων του T-DNAπου εισήχθησαν.

• Ανάλυση κατά Southern των εισαχθέντων τμημάτων.

Φαρμακευτικές ουσίες που ά ό θ ώδ ίζπαράγονται από θυσσανώδεις ρίζεςΦ ό Φ ή ί Β βλ ή άΦυτό Φαρμακευτική ουσία Βιβλιογραφική αναφορά

Aconitum heterophyllum Ακονίτης Giri, Banerjee et al. 1997

Artemisia absynthium Αιθέρια έλαια Kennedy, Deans et al. 1993

A t i i Α ί Li W t l 1998Artemisia annua Αρτεμισίνη Liu, Wang et al. 1998

Atropa belladonna Ατροπίνη, σκοπολαμίνη Jung and Tepfer 1987; Lee, Suzuki et al. 1998

Bidens spp Πολυακετυλένια McKinely, Michaels et al. 1993

B i did Αλ λ δή ί Pitt Al d Gi li tti 1998Brugmansia candida Αλκαλοειδή τροπανίου Pitta-Alvarez and Giulietti 1998

Cassia spp Ανθρακινόνες Ko, Ebizyka et al. 1988

Catharanthus roseus Αλκαλοειδή ινδολίου Rijhwani and Shanks 1998

Calystegia sepium Κουσκοϋγρίνη Jung and Tepfer 1987Calystegia sepium Κουσκοϋγρίνη Jung and Tepfer 1987

Cichorium intybus Εσκουλετίνη Bais, George et al. 1999

Cinchona ledgeriana Αλκαλοειδή κινολόνης Hamill, Parr et al. 1987

Coleus forskohii Φορσκολίνη Sasaki Udagawa et al 1998Coleus forskohii Φορσκολίνη Sasaki, Udagawa et al. 1998

Datura spp Τροπάνιο Rhodes 1989

Duboisia leichhardtii Αλκαλοειδή τροπανίου Mano, Ohkawa et al. 1989

Echinacea purpurea Αλκαλοειδή Trypsteen, Van Lijsebettens et al. 1991p p ή yp , j

Glycyrrhiza glabra Ισοπρενυλιωμένα φλαβονοειδή Asada, Li et al. 1998

Hyoscyamus albus Υοσκυαμίνη Shimomura, Sauerwein et al. 1991

Φαρμακευτικές ουσίες που ά ό θ ώδ ίζπαράγονται από θυσσανώδεις ρίζεςΦ ό Φ ή ί Β βλ ή άΦυτό Φαρμακευτική ουσία Βιβλιογραφική αναφορά

Lithospermum erythrorhizon Σικωνίνη Shimomura, Satake et al. 1986

Nicotiana tabacum Νικοτίνη Parr and Hamill 1987

P i Σ ί Y hik d F 1987Panax ginseng Σαπωνίνες Yoshikawa and Furuya 1987

Panax ginseng Γκινσενοσίδης Kunshi, Shimomura et al. 1998

Paulownia tomentosa Βερμπασκοσίδης Wysokinska and Rozga 1998

Peganum harmala Β καρβολίνη σεροτονίνη Berlin Kuzovkina et al 1992Peganum harmala Β-καρβολίνη, σεροτονίνη Berlin, Kuzovkina et al. 1992

Rauwolfia serpentina Αχμαλίνη, σερπεντίνη Benjamin, Roja et al. 1994

Rubia cordifolia Ανθρακινόνες Shin and Kim 1996

Salvia miltorrhiza ∆ιτερπένια Hu and Alfermann 1993Salvia miltorrhiza ∆ιτερπένια Hu and Alfermann 1993

Scopolia japonica Υοσκυαμίνη, σκοπολαμίνη Mano, Nabeshima et al. 1986

Scutellaria baicalensis Φλαβονοειδή Nishikawa and Ishimaru 1997

Solanum aviculare Σολασοδίνη Kittipongatana, Hock et al. 1998Solanum aviculare Σολασοδίνη Kittipongatana, Hock et al. 1998

Solanum tuberosum Στεροϊδικά αλκαλοειδή Saito, Yamazaki et al. 1991

Trichosanthes kiriowii RIP Shih, Mc Donald et al. 1998

Valeriana wallichi DC Βαλεποτριάτες Banerjee, Rahmnan et al. 1998ρ ς j ,

Weigelia ‘‘Styrica’’ Αχμαλίνη, σερπεντίνη, Hallard 2000

Φαρμακευτικές ουσίες που παράγονται ρμ ς ς ρ γαπό διαγονιδιακές θυσσανώδεις ρίζες

• Θυσσανώδεις ρίζες του Nicotiana rustica, στις οποίες κλωνοποιήθηκετο γονίδιο της αποκαρβοξυλάσης της ορνιθίνης από ζύμη, παρήγαγαναυξημένες ποσότητες νικοτίνης (Hamill Robins et al 1990)αυξημένες ποσότητες νικοτίνης (Hamill, Robins et al. 1990).

• Θυσσανώδεις ρίζες του Atropa belladona, παρήγαγαν πενταπλάσιεςποσότητες σκοπολαμίνης, όταν μεταφέρθηκε σε αυτές το γονίδιο 6-β-υδροξυλάση από το Hyoscyamus muticus (Hashimoto, Yun, et al.1993)1993).

• ∆ιαγονιδιακές θυσσανώδεις ρίζες του Peganum harmala, που περιείχαντο γονίδιο της αποκαρβοξυλάσης της τρυπτοφάνης του Catharanthusroseus παρήγαγαν αυξημένες ποσότητες σεροτονίνης (Berlin,ρήγ γ ξημ ς η ς ρ ης ( ,Ruegenhagen et al. 1993).

• Οι θυσσανώδεις ρίζες του Rubia peregrina, παρουσίασαν διπλάσιαδραστικότητα συνθάσης του ισοχωρισμικού οξέος και αυξημένη -κατά20% σε σχέση με τους μάρτυρες- παραγωγή ανθρακινονών όταν κλω-20% σε σχέση με τους μάρτυρες- παραγωγή ανθρακινονών, όταν κλω-νοποιήθηκε σε αυτές το γονίδιο της συνθάσης του ισοχωρισμικού οξέος(Lodhi, Bongaerts et al. 1996).

• Σε καλλιέργειες θυσσανωδών ριζών κατέστη δυνατή και η παραγωγήI G λ ώ ά (W th d D 1997)IgG μονοκλωνικών αντισωμάτων (Wongsamuth and Doran 1997).

Βελτιστοποίηση της παραγωγήςΕπιλογή των καταλληλότερων κλώνων

• Ορισμένα στελέχη του A rhizogenes είναι αποτελε-Ορισμένα στελέχη του A. rhizogenes είναι αποτελεσματικότερα ως προς την επαγωγή εμφάνισηςθυσσανωδών ριζών.

• Οι πληθυσμοί θυσσανωδών ριζών εμφανίζουν ετερο• Οι πληθυσμοί θυσσανωδών ριζών εμφανίζουν ετερο-γένεια λόγω:– προέλευσης από διαφορετικά είδη εκφύτων– διαφορών στην ποιότητα του εκφύτου.

• Ορισμένες φορές παρατηρούνται διαφορές ακόμη καιμεταξύ θυσσανωδών ριζών που έχουν προκύψει απόμ ξ ρ ζ χ ρ ψτο ίδιο ακριβώς έκφυτο.

• Η επανειλημμένη επιλογή (repeated selection) συχνάεπιτρέπει την επιλογή κλώνων με αυξημένηεπιτρέπει την επιλογή κλώνων με αυξημένηπαραγωγή.

• Σε ορισμένες περιπτώσεις η επιλογή διευκολύνεταιδή ή β λ ώ β θ όεπειδή η παραγωγή μεταβολιτών και ο βαθμός

ανάπτυξης της ρίζας συσχετίζονται θετικά

Βελτιστοποίηση της παραγωγήςΕύ λλ λό θ ώ λλ έΕύρεση των καταλληλότερων συνθηκών καλλιέργειας

Οι καλλιέργειες θυσσανωδών ριζώνεπηρεάζονται λιγότερο από τις

Συστατικό MS B5KNO3 1900 mg/l 2500 mg/lεπηρεάζονται λιγότερο από τις

αλλαγές στο μέσο καλλιέργειας απότις κυτταροκαλλιέργειες.

• Ο φωτισμός δε φαίνεται να

3 g gNH4NO3 1650 mg/l -(NH4)2SO4 - 134 mg/lMgSO4·7H2O 370 mg/l 250 mg/lCaCl2·2H2O 440 mg/l 150 mg/lφ μ ς φ

επηρεάζει ιδιαίτερα τη βιοσύνθεσηστις ρίζες.

• Η βέλτιστη θερμοκρασία καλλιέ-ί 25οC

CaCl2 2H2O 440 mg/l 150 mg/lKH2PO4 170 mg/l -NaH2PO4·H2O - 150 mg/lMnSO4·H2O - 10,0 mg/lMnSO4·4H2O 22 3 mg/l -ργειας είναι 25οC.

• Το pH κυμαίνεται μεταξύ 5 και 6.• Τα συνηθέστερα χρησιμοποιούμενα

έ λλ έ ί

MnSO4 4H2O 22,3 mg/lKI 0,83 mg/l 0,75 mg/lH3BO3 6,2 mg/l 3,0 mg/lZnSO4·7H2O 8,6 mg/l 2,0 mg/lCuSO ·5H O 0 025 mg/l 0 025 mg/lμέσα καλλιέργειας είναι τα

Murashige and Skoog (MS) καιGamborg’s B5, τα οποία περιέχουν:– τα απαραίτητα μέταλλα και ιχνο-

CuSO4·5H2O 0,025 mg/l 0,025 mg/lNa2MoO4·2H2O 0,25 mg/l 0,25 mg/lCoCl2·6H2O 0,025 mg/l 0,025 mg/lFeSO4·7H2O 27,8 mg/l 27,8Na EDTA 37 3 mg/l 37 3 mg/lτα απαραίτητα μέταλλα και ιχνο-

στοιχεία, που χορηγούνται ως άλατα– οργανικά συστατικά, πηγές

βιταμινών ή/και αμινοξέων

Na2EDTA 37,3 mg/l 37,3 mg/lΝικοτινικό οξύ 0,5 mg/l 1,0 mg/lΠυριδοξίνη-HCl 0,5 mg/l 1,0 mg/lΘειαμίνη-HCl 0,1 mg/l 10,0 mg/lΜ ϊ όλ 100 /l 100 /l– πηγή άνθρακα κι ενέργειας,

συνήθως σουκρόζηΜυοϊνοσιτόλη 100 mg/l 100 mg/lΓλυκίνη 2,0 mg/l -Σουκρόζη 30000 mg/l 20000 mg/l

Βελτιστοποίηση της παραγωγήςΒελτιστοποίηση της παραγωγήςΕύρεση των καταλληλότερων συνθηκών καλλιέργειαςρ η η ρ η ργ ς

• Συχνά οι συνθήκες που ευνοούν τη βέλτιστη ανάπτυξη τωνριζών, δε σχετίζονται με την αυξημένη παραγωγή, π.χ.:– σε καλλιέργειες θυσσανωδών ριζών του Catharanthus roseus καιτου Hyoscyamus niger, η παραγωγή αλκαλοειδών του ινδολίουμεγιστοποιείται όταν η συγκέντρωση της σουκρόζης και ιόντωναμμωνίου είναι μικρότερη από την απαιτούμενη για την ταχύτερηαμμωνίου είναι μικρότερη από την απαιτούμενη για την ταχύτερηαύξηση της βιομάζας

– σε καλλιέργειες θυσσανωδών ριζών του Datura stramonium ηπαραγωγή αλκαλοειδών βελτιώνεται όταν η συγκέντρωση τωνπαραγωγή αλκαλοειδών βελτιώνεται όταν η συγκέντρωση τωννιτρικών ιόντων είναι χαμηλότερη από την απαιτούμενη για τηβέλτιστη ανάπτυξη των ριζών.

• Σημαντική είναι και η επίδραση της συγκέντρωσης τωνΣημαντική είναι και η επίδραση της συγκέντρωσης τωνανόργανων φωσφορικών:– μικρές αποκλίσεις από τις συγκεντρώσεις φωσφορικών στα B5 και

MS οδηγούν σε μείωση της παραγωγικότητας (π.χ. σε θυσανώδειςηγ μ η ης ρ γ γ η ς ( χ ςρίζες του Datura stramonium).

Βελτιστοποίηση της παραγωγήςΒελτιστοποίηση της παραγωγήςΕπίδραση της επαγωγήςρ η ης γ γής

• Τα φυτά ανταποκρίνονται με μορφολογικές και φυσιολογικέςμεταβολές σε διάφορους φυσικούς και χημικούς παράγοντες, οιοποίοι είναι γνωστοί ως επαγωγείςοποίοι είναι γνωστοί ως επαγωγείς.

• Οι μεταβολές αυτές αποτελούν μέρος των αμυντικώνμηχανισμών των φυτών.Ως επαγωγείς έχουν προταθεί διάφοροι παράγοντες όπως:• Ως επαγωγείς έχουν προταθεί διάφοροι παράγοντες, όπως:– τραυματισμός– μεταλλικά ιόντα (La, Eu, Ca, Ag, Cd)

κυτταρικό τοίχωμα ζυμών σπόρια μυκήτων– κυτταρικό τοίχωμα ζυμών, σπόρια μυκήτων– πολυσακχαρίτες (π.χ. αλγινικά, κιτοσάνη) και ολιγοσακχαρίτες (π.χ.

γαλακτουρονίδια, μαννάνη)– ολιγοπεπτίδια (γλουταθειόνη) και πολυπεπτίδια (π.χ. κυτταρινάση)ολιγοπεπτίδια (γλουταθειόνη) και πολυπεπτίδια (π.χ. κυτταρινάση)– λιπίδια (λιποσακχαρίτες)– γλυκοπρωτεΐνες– πτητικές ουσίες (C6-C10).η ς ς ( 6 10)

Βελτιστοποίηση της παραγωγήςΕπίδραση της επαγωγής

• Ο ακριβής μηχανισμός δράσης των ουσιών αυτών δεν είναι• Ο ακριβής μηχανισμός δράσης των ουσιών αυτών δεν είναιγνωστός, πιστεύεται ότι σχετίζεται με:– σύνδεση του επαγωγέα με μεμβρανικούς υποδοχείς– μεταβολές στη διαπερατότητα των Ca2+ K+ Cl−– μεταβολές στη διαπερατότητα των Ca , K , Cl– μεταβολές στη φωσφορυλίωση πρωτεϊνών και στην ενεργοποίηση

των κινασών πρωτεϊνών, της MAPK και των G-πρωτεϊνών– σύνθεση μορίων- δεύτερων μηνυμάτωνη μ ρ ρ μη μ– οξίνιση του κυτοπλάσματος– ενεργοποίηση της οξειδάσης του NADPH– αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού– επαγωγή της σύνθεσης ελεύθερων ριζών και H2O2– συσσώρευση «αμυντικών» πρωτεϊνών, όπως χιτινάσες,

γλουκανάσες και ενδοπολυγαλακτουρονάσεςί ύ ώ– τροποποίηση του κυτταρικού τοιχώματος.

• Στις καλλιέργειες θυσσανωδών ριζών ενδιαφέρον παρουσιάζει ηχρήση της κιτοσάνης, η οποία επάγει και την έξοδο των ουσιώναπό το κύτταρο.

Υπό κλίμακα αύξηση των καλλιεργειών θυσσανωδών ριζών• Το μεγαλύτερο πρόβλημα για την εμπορική εκμετάλλευση των• Το μεγαλύτερο πρόβλημα για την εμπορική εκμετάλλευση των

καλλιεργειών θυσσανωδών ριζών είναι ο σχεδιασμός τωνκατάλληλων συστημάτων ανάδευσης.

• Κατά την ανάδευση θα πρέπει να ικανοποιείται μια πληθώρα αντι-η η ρ μ η ρκρουόμενων απαιτήσεων:– οι θυσσανώδεις ρίζες είναι ιδιαίτερα ευαίσθητες στη διατμητική τάση.

Τυχόν τραυματισμός θα μπορούσε να οδηγήσει στο σχηματισμόκάλλωνκάλλων

– καθώς οι ρίζες αναπτύσσονται, σχηματίζονται σφαιρικές μάζεςαποτελούμενες από νεαρότερες ρίζες στην περιφέρεια και γηραιότερεςστον πυρήνα. Παράλληλα, ο υψηλός βαθμός διακλάδωσης πουεμφανίζουν οδηγεί στο σχηματισμό ενός αλληλοσυνδεόμενουεμφανίζουν οδηγεί στο σχηματισμό ενός αλληλοσυνδεόμενουπλέγματος

– τα θρεπτικά συστατικά από την αέρια και την υγρή φάση θα πρέπει ναπαρέχονται ομοιόμορφα σε όλη την καλλιέργεια, γεγονός πουδεδομένων των συνθηκών επιτυγχάνεται μόνο με έντονη ανάδευσηδεδομένων των συνθηκών επιτυγχάνεται μόνο με έντονη ανάδευση.

• Επίσης:– για τη βέλτιστη απόδοση σε βιομάζα οι θυσσανώδεις ρίζες θα πρέπει

να είναι ομοιόμορφα κατανεμημένες και ακινητοποιημένες εντός τωνμ μ ρφ μημ ς η ημ ς ςβιοαντιδραστήρων

– για την μείωση του κόστους παραγωγής είναι αναγκαία η συνεχήςλειτουργία των βιοαντιδραστήρων.

Βιοαντιδραστήρες κατάλληλοι για καλλιέργεια θυσανωδών ριζών

Για την καλλιέργεια θυσανωδώνη ργριζών συνηθέστεραχρησιμοποιούνται:

• Βιοαντιδραστήρες με εμφύσηση

(a) (b)(a) (b)

ρ ήρ ς μ μφ η ηαερίου (a).

• Βιοαντιδραστήρες αναδευομένουδοχείου (b). ( )( )δοχείου (b).

• Βιοαντιδραστήρες άχλης (c).• Βιοαντιδραστήρες περιστρεφόμε-

νου τυμπάνου (d)

(c)(c)

νου τυμπάνου (d).

(d)(d)

Άλλες χρήσεις των καλλιεργειών θυσσανωδών ριζών

Εκτός από την παραγωγή χημικών ουσιών, οις η ρ γ γή χημ ,καλλιέργειες θυσσανωδών ριζών χρησιμοποιούνταικαι για:

• Τη συγκέντρωση απομάκρυνση και γενικότερα αδρα-Τη συγκέντρωση, απομάκρυνση και γενικότερα αδρανοποίηση του περιβάλλοντος από μέταλλα ήοργανικούς ρυπαντές του περιβάλλοντος(phytoremediation)(phytoremediation).

• Τη μελέτη του μεταβολισμού και της φυσιολογίας τωνφυτών.

• Την ανάπλαση φυτών, αποφεύγοντας το ενδιάμεσοστάδιο σχηματισμού του κάλλου που μπορεί ναοδηγήσει σε σωματοκλωνική διαφοροποίηση.ηγή μ ή φ ρ η η

• Την παραγωγή τεχνητών σπόρων με εγκλεισμό σεκάψουλες τμημάτων των ριζών και αρχέγονωνβλαστώνβλαστών.

• Τη μελέτη της ριζόσφαιρας.

“Gene Gun” “Gene Gun” T h iT h iTechniqueTechnique

DNA coated golden particles

Cell’s DNAgolden particles

Gene gun Plant cell

A plant cell withthe new gene

Cell divisionTransgenic plant

ΒΙΟΛΙΣΤΙΚΗ ΜΕΘΟ∆ΟΣ• Απευθείας μεταφορά γονιδίων στα φυτικά κύτταρα• Χρήση επιταχυνόμενων μικροσωματιδίων που είναι καλυμμένα με DNA με σκοπό να διαπεράσουν τις μμ μ μ ρ ςεξωτερικές κυτταρικές στοιβάδες και να εισαχθούν μέσα στα φυτικά κύτταραμ φ ρ

• Επιτάχυνση των μικροσωματιδίων επιτυγχάνεται μεπαλμούς αερίου- παλμούς αερίου

- ηλεκτρική εκκένωση υψηλής τάσης- πυρίτιδα

• ταχύτητα σωματιδίων ~300m/secχ η μ

ΒΙΟΛΙΣΤΙΚΗ ΜΕΘΟ∆ΟΣ

Original biolistic gun.g g

DNA is bound to the microprojectiles, which impact the i i bili d ll hi h dtissue or immobilized cells at high speeds.

From J. Sanford et al.

ΒΙΟΛΙΣΤΙΚΗ ΜΕΘΟ∆ΟΣ

Células

de porotode poroto

Helio gene gun (BioRad)(BioRad)

Closer look on (“gene gun”)

Transient Expression using the Biolistic Gun

ΒΙΟΛΙΣΤΙΚΗ ΜΕΘΟ∆ΟΣ• Συσκευές-Μηχανισμοί επιτάχυνσης σωματιδίων

όπλο βομβαρδισμού- όπλο βομβαρδισμού- βομβαρδισμός με ηλεκτρική εκκένωση- βομβαρδισμός αποξηραμένων σωματιδίων μεαπότομη είσοδο αερίου ηλίουαπότομη είσοδο αερίου ηλίου

- βομβαρδισμός σωματιδίων σε σταγόνες με τος ςκύμα της ριπής αερίου

ή ό- συσκευή μικροστόχευσης- πνευματικό όργανο αερίουμ ργ ρ

ΒΙΟΛΙΣΤΙΚΗ ΜΕΘΟ∆ΟΣ• Προσοχή στον κυτταρικό θάνατο που οφείλεται σε

- θρυμματισμό των σωματιδίωνθρυμματισμό των σωματιδίων- ωστικά κύματα

ό- ακουστικό σοκ• Ρύθμιση αριθμού μικροσφαιριδίων ανά μονάδα εισαγωγής ώστε να επιτρέπεται η ικανοποιητική κάλυψη του κυτταρικού στόχου χωρίς υπερβολική νέκρωση των επιφανειακών ιστών

• Τροποποιήσεις συσκευών/ Τοποθετήσεις πλεγμάτωνρ ή ς ή ς γμ• Ο βομβαρδισμός να ελαχιστοποιεί υπέρογκα τραύματα κυττάρων και να μην αλλοιώνει τηντραύματα κυττάρων και να μην αλλοιώνει την ολοδυναμικότητά τους

ΒΙΟΛΙΣΤΙΚΗ ΜΕΘΟ∆ΟΣ -ΠΑΡΑΜΕΤΡΟΙΠΑΡΑΜΕΤΡΟΙ

• Μάζα, μέγεθος, σχήμα, • Φύση εκφύτωνσύσταση σωματιδίων

• Φύση, μορφή,• Συνθήκες καλλιέργειας• Οσμωτική προεργασίαη, μ ρφή,

συγκέντρωση DNA• Στόχος : κύτταρα δεκτικά

Οσμωτική προεργασία ιστών

• Στάδιο κυτταρικούΣτόχος : κύτταρα δεκτικά για μετασχηματισμό και αναγέννηση

• Στάδιο κυτταρικού κύκλου

αναγέννηση• Είδος ιστούΒάθ δ ί δ• Βάθος διείσδυσης

• Θερμοκρασία, υγρασία, φωτοπερίοδος ιστών -φυσιολογία ιστών

ΒΙΟΛΙΣΤΙΚΗ ΜΕΘΟ∆ΟΣ• Πρότυπο ένθεσης

πολλαπλότητα ενθέσεων- πολλαπλότητα ενθέσεων- πολύπλοκη διαδικασία ένθεσης με αναδιοργανώσεις και επαναδιευθετήσειςαναδιοργανώσεις και επαναδιευθετήσεις του DNAΣυγκριτικά ο μετασχηματισμός μέσω Agrobacterium πλεονεκτεί• Συγκριτικά, ο μετασχηματισμός μέσω Agrobacterium πλεονεκτεί

- μικρότερος αριθμός αντιγράφων του δ δίδιαγονιδίου

- υψηλότερα επίπεδα σταθερού μετασχηματισμούδ ό ά λύ DNA ά- δυνατότητα μεταφοράς μεγαλύτερων DNA τμημάτων

• Απαραίτητη η ύπαρξη συστήματος in vitro αναγέννησης φυτικών κυττάρωνφυτικών κυττάρων

BΙΟΛΙΣΤΙΚΗ ΜΕΘΟ∆ΟΣ -ΕΦΑΡΜΟΓΕΣΕΦΑΡΜΟΓΕΣ

• Γενετική τροποποίηση ‘δύστροπων’ φυτών• Μετασχηματισμός κυτταρικών οργανιδίων• Μετασχηματισμός κυτταρικών οργανιδίων• Παροδική ρυθμιζόμενη έκφραση εισαγόμενου γονιδίου

• Μέθοδος τραυματισμού που αυξάνει τηΜέθοδος τραυματισμού που αυξάνει τη συχνότητα μετασχηματισμού μέσω του συστήματος Agrobacteriumσυστήματος Agrobacterium

Γενετικός μετασχηματισμός φαρμακευτικών φυτών με τη βιολιστική μέθοδο

• Hyoscuamus muticus (Zeef et al.,2000)- κατανόηση της παραγωγής αλκαλοειδών τροπανίου- κατανόηση της παραγωγής αλκαλοειδών τροπανίου

• Allium sativum L. (Sawahel,2002)C th th (M li k l 199 )• Catharanthus roseus (Memelink et al.,1997)- σύγκριση επίδρασης υποκινητών στον παροδικό και σταθερό μετασχηματισμό

• Catharanthus roseus (Zarate et al 1999)Catharanthus roseus (Zarate et al.,1999)• Nicotiana tabacum (Leech et al.,1998)

ή έ δί TDC STR1- εισαγωγή και έκφραση των γονιδίων TDC και STR1

Σχηματική παράσταση παροδικής έκφρασης γονιδίων με τη μέθοδο της διήθησηςγονιδίων με τη μέθοδο της διήθησης

ΗΛΕΚΤΡΟΠΟΡΩΣΗ

• Όταν η μεμβράνη του κυττάρου εκτίθεται σε μικρούς χρονικά παλμούς υψηλού ηλεκτρικού πεδίου, μπορεί παροδικά να αποσταθεροποιηθεί και να δημιουργήσει μεμβρανικούς πόρους , που στη συνέχεια κλείνουν.Κατά την διάρκεια της αποσταθεροποίησης της η ρ ης ρ η ης ηςμεμβράνης,αυτή είναι πολύ διαπερατή από διάφορα μόρια που βρίσκονται στο περιβάλλον μέσο κι έτσι μ ρ βρ ρ β μείναι δυνατή η μεταφορά DNA στο εσωτερικό των κυττάρων.ρ

• Μέθοδος διεισδυτική, απλή, γρήγορη, φτηνή, μη τοξικήμη τοξική

El t tiEl t tiElectroporation Electroporation TechniqueTechniquePower supply

DuracellPlant cell

TechniqueTechniquePower supply

Protoplast

DNA containingthe gene of interest DNA inside the

l llThe plant cell with

thplant cell the new gene

ΗΛΕΚΤΡΟΠΟΡΩΣΗ• Παροδικός και σταθερός μετασχηματισμός

- πρωτοπλαστών (σε ισοζυγισμένο οσμωτικάπρωτοπλαστών (σε ισοζυγισμένο οσμωτικά μέσο)

έ ώ ά ώ- ακέραιων φυτικών κυττάρων και ιστών • Ο μετασχηματισμός ακέραιων φυτικώνΟ μετασχηματισμός ακέραιων φυτικών κυττάρων ή ιστών βασίζεται σε προεπεξεργασία τουςπροεπεξεργασία τους - με μηχανικό τραυματισμό- με υπερτονικά / ενζυμικά διαλύματα

• Συγκεκριμένα κύτταρα είναι δεκτικά σε DNA• Συγκεκριμένα κύτταρα είναι δεκτικά σε DNA πρόσληψη μέσω ηλεκτροπόρωσης χωρίς καμιά

( )

ΗΛΕΚΤΡΟΠΟΡΩΣΗ ΠΑΡΑΜΕΤΡΟΙΗΛΕΚΤΡΟΠΟΡΩΣΗ - ΠΑΡΑΜΕΤΡΟΙ

• Χρονική διάρκεια και ένταση ρεύματος, δυναμικό

• Eπεξεργασία θερμικού σοκ πριν την ηλεκτρόπορωση

ηλεκτρικού πεδίου• Φύση και συγκέντρωση

ρ η η ρ ρ η• Προσανατολισμός του ιστού μέσα στο θαλαμίσκο

ιόντων στο ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτρόπόρωσηςΧ ό ώ

ηλεκτροπόρωσης• Μεταπαλμική προσθήκη

• Χρόνος προεπώασης τραυματισμένου ιστού στο ρυθμιστικό διάλυμα

ασκορβικού οξέος

ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροπόρωσης

• Χρόνος συνεπώασης ιστού ρ ς ηςμε το πλασμιδιακό DNA

ΗΛΕΚΤΡΟΠΟΡΩΣΗ• Αποτελεσματικά πρωτόκολλα ηλεκτροπόρωσης

ρύζι (de la Pena et al 1987)-ρύζι (de la Pena et al.,1987)-καλαμπόκι -στάρι (Zaghmout et al.,1993)Hλεκτροπόρωση για μετασχηματισμό• Hλεκτροπόρωση για μετασχηματισμό φαρμακευτικών φυτών :-Nicotiana tabacum (Abdul-Baki et al.,1990)Asparaggus officinalis (Mukhopadhyay et al-Asparaggus officinalis (Mukhopadhyay et al.,2002)-Σπανάκι (To et al.,1996)

Μετασχηματισμός φυτών με επεξεργασία πρωτοπλαστών με πολυαιθυλενική γλυκόλη (PEG)πολυαιθυλενική γλυκόλη (PEG)

• Κατεργασία πρωτοπλαστών με PEG τους καθιστά διαπερατούς ργ ρ μ ς ρ ςεπιτρέποντας την πρόσληψη DNA στο εσωτερικό τους από το περιβάλλον μέσο.

• Χημική διαδικασία που συνεπάγεται την απευθείας μεταφορά DNA χωρίς να απαιτεί φορείς

• Τρόπος εισαγωγής DNA :-ελάττωση της απώσεως όμοια φορτισμένων μορίων,όπως

β ά DNAμεμβράνης-DNA-καθίζηση DNA στις μεμβράνες κυττάρου-πρωτοπλάστη.δ έ λά ά λ ί-διέγερση πρωτοπλάστη για φαγοκυττάρωση μεγαλομορίων, όπως το DNA

ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΠΡΩΤΟΠΛΑΣΤΩΝ ΜΕ PEG - ΠΑΡΑΜΕΤΡΟΙ

• Μοριακό βάρος και συγκέντρωση PEG• Συγκέντρωση DNA • Φυσική διαμόρφωση DNA • Συγκέντρωση Ca++ και Mg++ στο διάλυμα επώασης• pH και θερμοκρασία του μέσου επώασης• Χρόνος και τρόπος επώασης

• Η αποδοτικότητα μετασχηματισμού είναι μια συνισταμένη του αριθμού των ζωντανών πρωτοπλαστών και του αριθμού των

ί DNA έ θ ί λάμορίων DNA που έχουν εισαχθεί στον πρωτοπλάστη

EΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΠΡΩΤΟΠΛΑΣΤΩΝ ΜΕ PEG

• Πλεονεκτήματα :Πλεονεκτήματα :-εύκολη και απλή διαδικασία

ξ ί λ ά θ δ ά έ ό-επεξεργασία πολυάριθμων δειγμάτων σε ένα μόνο πείραμα - απόκτηση πολλών διαγονιδιακών φυτών-μελέτη της ρύθμισης και της λειτουργίας των γονιδίων in vivo

• Μειονεκτήματα :-είσοδος πολλών αντιγράφων DNA στο φυτικόείσοδος πολλών αντιγράφων DNA στο φυτικό γονιδίωμα, τυχαία ένθεση-πιθανή η επαναδιευθέτηση της αρχικής αλληλουχίας-πιθανή η επαναδιευθέτηση της αρχικής αλληλουχίας σε μεταλλαγμένη

ΛΙΠΟΣΩΜΙΚΗ ΕΓΚΑΨΥ∆ΙΩΣΗ• Το DNA αρχικά εγκαψακιώνεται στα λιποσώματα και ρχ γ ψ μαυτά στη συνέχεια συντήκονται με πρωτοπλάστες με τη μεσολάβηση PEG. Ο μετασχηματισμός των η μ βη η μ χημ μ ςπρωτοπλαστών συμβαίνει λόγω μεμβρανικής σύντηξης και ενδοκύτωσης των λιποσωμάτων.ηξης ης μ

• Μέθοδος επιλογής για τη μεταφορά γονιδίων όταν ως φορείς χρησιμοποιούνται τεχνητά χρωμοσώματαφορείς χρησιμοποιούνται τεχνητά χρωμοσώματα ζύμης (YACs)δεν υπάρχει όριο στο μέγεθος του μεταφερόμενου-δεν υπάρχει όριο στο μέγεθος του μεταφερόμενου DNA

DNA έ λ ώ-το DNA πακεταρισμένο στα λιποσώματα προστατεύεται από αποικοδόμηση

ΛΙΠΟΣΩΜΙΚΗΛΙΠΟΣΩΜΙΚΗ ΕΓΚΑΨΥ∆ΙΩΣΗΕΓΚΑΨΥ∆ΙΩΣΗ

• Όχι συνήθης μέθοδος μετασχηματισμού λόγω χαμηλής αποδοτικότητας

• Επιτυχημένα πρωτόκολλαΕπιτυχημένα πρωτόκολλα -Καπνός (Deshayes et al.,1985)-Στάρι (Zhvetal et al.,1993)

• Απόκτηση διαγονιδιακών φυτών πατάτας που• Απόκτηση διαγονιδιακών φυτών πατάτας που εκφράζουν την ανθρώπινη α-ιντερφερόνη (S h l t l 2002)(Sawahel et al., 2002)

ΜΙΚΡΟΕΓΧΥΣΗ

ΜΙΚΡΟΕΓΧΥΣΗ ΠΡΩΤΟΠΛΑΣΤΩΝ• Χρήση γυάλινης μικροπιπέτας ως σύριγγα για τη δ έ ώ ί ή ίδιοχέτευση μικρών μορίων ή μακρομορίων στο κυτταρόπλασμα ή στον πυρήνα των κυττάρων.

• Το άκρο της γυάλινης μικροπιπέτας έχει μικρή διάμετρο,που επιτρέπει τη διείσδυσή της μέσω της πλασματικής μεμβράνης στο κυτταρόπλασμα χωρίς να καταστρέφει το κύτταρο.

• Η επιτυχία της μικροέγχυσης εξαρτάται από τον εντοπισμό και προσανατολισμό του πυρήνα,ώστε το μ ρ μ ρή ,ξένο DNA να εγχύεται απευθείας στον πυρήνα, καθώς και από τη βιωσιμότητα των επεξεργασμένων η β μ η ξ ργ μπρωτοπλαστών

ΜΙΚΡΟΕΓΧΥΣΗ ΠΡΩΤΟΠΛΑΣΤΩΝ• Για την εισαγωγή του DNA στον πυρήνα είναι απαραίτητη η ακινητοποίηση των πρωτοπλαστών σε ρ η η η η η η ραντικειμενοφόρο πλάκα-σε επίστρωμα πολύ-L-λυσίνης (τοξική)σε επίστρωμα πολύ L λυσίνης (τοξική)-σε θρεπτικό μέσο με καλής ποιότητας αγαρόζη (μείωση ορατότητας)(μείωση ορατότητας)-σε ουδέτερο μέσο,όπως το στόμιο μιας κατάλληλα δ έ έδιαμορφωμένης πιπέτας

• Η έγχυση του διαλύματος DNA από τη μικροπιπέτα γίνεται -με σύνδεσή της με μια μεγάλη σύριγγαμ ή ης μ μ μ γ η ρ γγ-με μηχανισμό με υδραυλική πίεση

ΜΙΚΡΟΕΓΧΥΣΗ ΠΡΩΤΟΠΛΑΣΤΩΝ• Ο εντοπισμός των πυρήνων γίνεται με κατάλληλη χρώση με κάποιο δείκτη φθορισμούκατάλληλη χρώση με κάποιο δείκτη φθορισμού

• Πρέπει να δίνεται προσοχή στις εξής παραμέτρουςαραμέ ρους-οι πρωτοπλάστες δεν πρέπει να αφυδατωθούν-η μικροπιπέτα δεν πρέπει να εισχωρήσει βίαια,απότομα και σε βάθοςβ μ β ς-η συγκέντρωση του DNA σε ισοτονικό διάλυμα δεν πρέπει να είναι μεγάλη για να μηνδεν πρέπει να είναι μεγάλη,για να μην στομώσει την μικροπιπέτα

ΜΙΚΡΟΕΓΧΥΣΗ ΠΡΩΤΟΠΛΑΣΤΩΝ• ∆υσκολιές και περιορισμοί

-ανάγκη για άριστα εκπαιδευμένο προσωπικό-ανάγκη για άριστα εκπαιδευμένο προσωπικό-υψηλό κόστος-χρονοβόρα διαδικασία-δυσκολία εντοπισμού πυρήνα-ενδεχόμενη καταστροφή κυττάρου

• Πλεονεκτήματα και εφαρμογές• Πλεονεκτήματα και εφαρμογές-άμεση οπτική επαφή κάτω από το μικροσκόπιο

ή λό λ ά ά-εισαγωγή ολόκληρων χρωμοσωμάτων στα φυτικά κύτταρα-μελέτη κυτταρικής διαφοροποίησης ,φυσιολογίας, κυτταρικών λειτουργιών (καπνός,Vicia faba)

MIΚΡΟΕΓΧΥΣΗMIΚΡΟΕΓΧΥΣΗ ΠΡΩΤΟΠΛΑΣΤΩΝΠΡΩΤΟΠΛΑΣΤΩΝ

• Καπνός (Schnorf et al.,1991)• Πετούνια (Griesbach et al.,1987)• Ελαιοκράμβη (Neuhaus et al 1987)• Ελαιοκράμβη (Neuhaus et al.,1987)• Κριθάρι (Holm et al.,2000)

ΜΕΤΑΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ ΦΥΤΩΝ ΜΕ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΟΡΗΣΗ ΕΜΒΡΥΩΝΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΟΡΗΣΗ ΕΜΒΡΥΩΝ

• Επιμολυσμένα έμβρυα τοποθετούνται μεταξύ των άκρων δύο σιφωνίων συνδεδεμένων με ηλεκτρόδια. Το σιφώνιο που συνδέεται με την άνοδο γεμίζει με αγαρόζη και ένα ηλεκτροφορητικό ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει EDTA, ενώ το σιφώνιο που συνδέεται με την κάθοδο περιέχει αγαρόζητο σιφώνιο που συνδέεται με την κάθοδο περιέχει αγαρόζη αναμεμειγμένη με DNA και ηλεκτροφορητικό ρυθμιστικό διάλυμα. Το δεύτερο σιφώνιο έρχεται σε επαφή με το κορυφαίοδιάλυμα. Το δεύτερο σιφώνιο έρχεται σε επαφή με το κορυφαίο μερίστωμα του φυτού, ενώ το πρώτο σιφώνιο τοποθετείται κοντά στο ακραίο μερίστωμα της βάσης του εμβρύου. Η διέλευση ηλεκτρικού ρεύματος προκαλεί αργή μετακίνηση τουDNA από την κάθοδο προς την άνοδο διαμέσου του εμβρύου (από το ακραίο μερίστωμα προς τη βάση του)(από το ακραίο μερίστωμα προς τη βάση του).

ΜΕΤΑΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ ΦΥΤΏΝ ΜΕ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΕΜΒΡΥΩΝΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΕΜΒΡΥΩΝ

• Η αποτελεσματικότητα της μεθόδου εξαρτάται από-τη διάρκεια ηλεκτροφόρησηςτη διάρκεια ηλεκτροφόρησης-τα συστατικά του ηλεκτροφορητικού διαλύματοςτις φυσικοχημικές ιδιότητες του εμβρυϊκού ιστού-τις φυσικοχημικές ιδιότητες του εμβρυϊκού ιστού

• Απλή και φτηνή μέθοδος• ∆εν προτιμάται για γενετική τροποποίηση φυτών λόγω μικρής βιωσιμότητας των ηλεκτροφορημένων εμβρύων

• Υπήρξε αποτελεσματική μόνο στην απόκτηση ήρξ μ ή μ η η ηδιαγινιδιακων φυτών Caluthe Orchid L. (Griesbach et al.,1994)

THE POLLEN-TUBE PATHWAY

• DNA εισέρχεται στο ωάριο κυκλοφορώντας μέσω του γυρεοσωλήνα

• Eφαρμόστηκε πρώτη φορά για μετασχηματισμόEφαρμόστηκε πρώτη φορά για μετασχηματισμό ρυζιού (Luo et al.,1988)A ό δ δ ώ ώ• Aπόκτηση διαγονιδιακών φυτών -σταριού (Mu et al,1999)σταριού (Mu et al,1999)-σόγιας (Hu et al,1999)-πεπονιού (Chen et al,1998) -Petunia hybrida (Tjokrokusumo et al 2000)Petunia hybrida (Tjokrokusumo et al,2000)

THE POLLEN-TUBE PATHWAY• Πλασμιδιακό DNA μπορεί επίσης να εγχυθεί σε ταξιανθίες με μητρικά κύτταρα γύρης στοταξιανθίες με μητρικά κύτταρα γύρης στο προμειωτικό στάδιο χωρίς την απομάκρυνση του στίγματος. Σε αυτήν την περίπτωση αναμένεται το ξένο DNA να ενσωματωθεί στο μ ξ μγαμετικό γονιδίωμα.

• Εφαρμογή αυτής της προσέγγισης υπήρξε στη• Εφαρμογή αυτής της προσέγγισης υπήρξε στη σήκαλη (de la Pena et al.,1987).

• Αξιοσημείωτα μικρότερη αποδοτικότητα από τη βιολιστική μέθοδοβιολιστική μέθοδο

• Αποφυγή συστήματος in vitro καλλιέργειας

SILICON-CARBIDE MEDIATED TRANSFORMATIONTRANSFORMATION

• Ινίδια πυριτικού καρβιδίου προστίθενται σε εναιώρημα που περιέχει φυτικό ιστό (κάλλοςεναιώρημα που περιέχει φυτικό ιστό (κάλλος, ανώριμα έμβρυα,ομάδες κυττάρων) και λ δ ό DNA ύπλασμιδιακό DNA και αναμειγνύονται σε

συσκευή vortex/ shaker/ blender. • Τα επικαλυπτόμενα με DNA ινίδια διαπερνούν το κυτταρικό τοίχωμα χάρη στην παρουσίατο κυτταρικό τοίχωμα χάρη στην παρουσία μικρών οπών που σχηματίζονται στα σημεία σύγκρουσης μεταξύ φυτικών κυττάρων καισύγκρουσης μεταξύ φυτικών κυττάρων και ινιδίων.

SILICON-CARBIDE MEDIATED TRANSFORMATION

Η αποτελεσματικότητα της SCMT εξαρτάται απόα ο ε εσμα ό η α ης SC εξαρ ά α α ό– το μέγεθος των ινιδίων– τους παράγοντες ανάδευσηςτους παράγοντες ανάδευσης– το φυτικό υλικό και τα χαρακτηριστικά των φυτικώνκυττάρωνρ

– το πάχος του κυτταρικού τοιχώματος.• Μειονεκτήματαήμ

- χαμηλή αποτελεσματικότητα μετασχηματισμού,- βλάβη στα κύτταρα που ενδεχομένως επιδρά αρνητικά στηβλάβη στα κύτταρα που ενδεχομένως επιδρά αρνητικά στη μελλλοντική αναγεννητική τους ικανότητα -απαίτηση για τήρηση αυστηρών κανόνων ασφαλείας κατά την η η γ ήρη η ηρ φ ς ηεργαστηριακή διαδικασία,καθώς η εισπνοή των ινιδίων(asbestos) μπορεί να οδηγήσει σε σοβαρά προβλήματα υγείας.

SILICON CARBIDE MEDIATEDSILICON-CARBIDE MEDIATED TRANSFORMATION

• Kαπνός (Kaeppeler et al,1990)• Καλαμπόκι (Bullock et al.,2001)• Ρύζι (Nagatani et al 1997)• Ρύζι (Nagatani et al.,1997)• Στάρι (Brisibe et al.,2000)• Lolium multiflorium,Lolium perenne,

Festuca arundinacea AgrostisFestuca arundinacea,Agrostis stolonifera (Dalton et al.,1997)

Επιλογή ∆ιαγονιδιακών ΦυτώνΕπιλογή ∆ιαγονιδιακών Φυτών

• Γονίδια Επιλογής• Γονίδια Επιλογής• Ανάλυση με PCR• Ανάλυση κατά Southernη• Έκφραση των ∆ιαγονιδίων

- Ανάλυση κατά northernΑ άλ ά t- Ανάλυση κατά western

- Ανάλυση ενζυματικής δραστηριότητας• Παραγωγή διαγονιδιακών ομοζυγωτών φυτώνΠαραγωγή διαγονιδιακών ομοζυγωτών φυτών

Εικ. 2.29 Εικ. 2.29 –– Ταυτοποίηση διαγονιδιακών φυτών Ταυτοποίηση διαγονιδιακών φυτών ArabidopsisArabidopsis με την τεχνική τουμε την τεχνική του PCRPCRArabidopsisArabidopsis με την τεχνική τουμε την τεχνική του PCR.PCR.

Α 23.1

Β1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

9.4

6.7

4.4

2.3

2.0

0.56

Εικ. 2.30 Εικ. 2.30 –– Ταυτοποίηση διαγονιδιακών φυτών με τη Ταυτοποίηση διαγονιδιακών φυτών με τη μέθοδο του υβριδισμού κατά μέθοδο του υβριδισμού κατά Southern.Southern.

NA

γενωματικό DNA

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

1000080006000

T-DN

A

T-DNT-DNA

πέψη γενωματικούDNA με ένζυμαπεριορισμού

500040003500300025002000

6000 περιορισμού

μέρος του Τ-DNAμετά την πέψηγενωματικό DNA

1500

1000

750

το υπόλοιπο μέροςτου T-DNAμετά τη πέψη

ενζυμική αντίδρασητης λιγάσης

500

250

τές

εκκινητ

αλυσιδωτήίδαντίδραση

πολυμεράσηςενισχυμένατμήματα DNA

Εικ 2 31Εικ 2 31 Ανάλυση διαγονιδιακών φυτών με τηΑνάλυση διαγονιδιακών φυτών με τηΕικ. 2.31 Εικ. 2.31 –– Ανάλυση διαγονιδιακών φυτών με τη Ανάλυση διαγονιδιακών φυτών με τη μέθοδο του μέθοδο του II--PCR.PCR.

Α Β Γ Δ

ΕΗ

Ζ

Εικ 1 32Εικ 1 32 –– Ανάλυση της τοπικής και χρονικήςΑνάλυση της τοπικής και χρονικήςΕικ. 1.32 Εικ. 1.32 –– Ανάλυση της τοπικής και χρονικής Ανάλυση της τοπικής και χρονικής δυναμικότητας υποκινητών. δυναμικότητας υποκινητών.

A

ΓΒ

Εικ 3 30Εικ 3 30 Επαγωγική δυναμικότητα του υποκινητήΕπαγωγική δυναμικότητα του υποκινητήΕικ. 3.30 Εικ. 3.30 –– Επαγωγική δυναμικότητα του υποκινητή Επαγωγική δυναμικότητα του υποκινητή του θερμοεπαγόμενου γονιδίου.του θερμοεπαγόμενου γονιδίου.

Γονίδιο-αναφοράς υπό υποκινητή ειδικό για ιστό

Υποκινητής -αμυλάσης ο οποίος είναι ειδικός για τοενδοσπέρμιο ελέγχει ένα βακτηριακό γονίδιο-ανταποκριτή τοενδοσπέρμιο ελέγχει ένα βακτηριακό γονίδιο ανταποκριτή, τοgusA, σε διαγονιδιακό ρύζι. Η μπλε χρωστική εκφράζεται σεκορυφαία επίπεδα την έκτη ημέρα στο διαγονιδιακό σπόροπου βλαστάνει.

http://www.agriculture.purdue.edu/agbiotech/genetransfer.html

Υπερ έκφραση της Οξειδάσης τουΥπερ-έκφραση της Οξειδάσης του Ασκορβικού Οξέος

σε διαγονιδιακό καπνόσε διαγονιδιακό καπνό

Γενετική Τροποποίηση Πεπονιούή ρ η η

Ανάλυση κατά Southern των προϊόντων PCR από διαγονιδιακά φυτά που υπέρ-εκφράζουν την οξειδάση του ασκορβικού οξέος

Ενζυματική δραστηριότητα της οξειδάσης του ασκορβικού οξέος σε αποπλαστικά και κυτταροπλασματικά κλάσματα από διαγονιδιακά

και μάρτυρες φυτά καπνού

12

ein)

A)

και μάρτυρες φυτά καπνού

6

8

10

units

/mg

prot

e

0

2

4

cific

act

ivity

(u

0C1 C2 WT 1 2 3 4 9 10 11 15 17 19 21 22 24 25 27Sp

ec

B)

8

10

12

ty (u

nits

/mg

in)

4

6

Spec

ific

activ

itpr

otei

0

2

C9 C5 WT 34 36 37 38 42 46 47 50 60 68 90 93 95 98

S

Ενζυματική δραστηριότητα Ασκορβικής Οξειδάσης (AO) σε κλάσματα κυτταρικού τοιχώματος/αποπλάστη και σε διαλυτά κλάσματα απομονωμένα από το νεότερο πλήρως ανεπτυγμένο φύλλο καπνού () and ομοζυγωτών

διαγονιδιακών φυτών R10 (), R50 (), R68 ().

7070

50

prot

ein)

50

prot

ein)

30

-1

30

-1

2

s mg

2

s mg

1

AO

(Uni

ts

1

AO

(Uni

ts

Cell wall/apoplast Soluble0

Cell wall/apoplast SolubleCell wall/apoplast Soluble0

Ευαισθησία των ΑΟ διαγονιδιακών φυτών καπνού σε όζον

Απαιτούμενα για τη γενετική τροποποίηση φυτών

Α. Κλωνοποιημένο DNA προς εισαγωγή

μ γ η γ ή ρ η η φ

Α. Κλωνοποιημένο DNA προς εισαγωγή

1. γονίδιο επιλογής- αντίσταση σε καναμυκίνη ή G148: νεομυκίνη,

φωσφοτρανσφεράση (NPTII),- υγρομυκίνη B: φωσφοτρανσφεράση της υγρομυκίνης(H B) ί λ ά(HygB) γενταμυκίνη: ακετυλοτρανσφεράση της γενταμυκίνης

- στρεπτομυκίνη: φωσφοτρανσφεράση της στρεπτομυκίνηςBi l h BAR- Bialophos: BAR

2. υποκινητής (ιδιοστατικός ή επαγώγιμος), περιοχήη ής ( ς ή γ γ μ ς) ρ χήκωδίκευσης, θέση πολυαδενυλίωσης

Απαιτούμενα για τη γενετική τροποποίηση φυτών

B. Κλωνοποιημένο DNA προς εισαγωγήΥποκινητής (ιδιοστατικός ή επαγώγιμος), περιοχή κωδίκευσης, σήμα

τερματισμού θέση πολυαδενυλίωσηςτερματισμού, θέση πολυαδενυλίωσηςΤα διαγονίδια μπορούν να εισαχθούν στους φυτικούς ιστούς σε χωριστά

πλασμίδια ή σε συν-ενσωματωμένους φορείς. Στην τελευταία περίπτωση πολλαπλά γονίδια τα οποία συμπεριλαμβάνουν τους δείκτες επιλογής β ί ίδ λ ίδβρίσκονται στο ίδιο πλασμίδιο.

Προαγωγοί οι οποίοι χρησιμοποιούνται συνήθωςΙδιοστατικοί προαγωγοί

CaMV 35S : κατάλληλο για την έκφραση ξένων γονιδίων σε- CaMV 35S : κατάλληλο για την έκφραση ξένων γονιδίων σε δικοτυλήδονα- Ο προαγωγός της ουβικιτίνης του αραβοσίτου, ένας επίσης ιδιοστατικός προαγωγός ο οποίος κατευθύνει την ισχυρή έκφραση των ς ς ςδιαγονιδίων στα μονοκοτυλήδονα.

Προαγωγοί εξειδικευμένοι για κάποια όργανα ή ιστούςΒικιλίνη και φυτο-αιμασυγκολλητίνη, γλουτενικοί προαγωγοίέκφρασης ειδικής των σπόρωνέκφρασης ειδικής των σπόρων, προαγωγός α-αμυλάσης για την έκφραση στην αλευρόνη των σπόρων δημητριακώνπροαγωγός Patatin για την ειδική στα φυμάτια έκφραση στις πατάτες και ρ γ γ ς γ η ή φ μ φρ η ς ςο προαγωγός RuBisCo για ειδικότητα στους πράσινους ιστούς

Απαιτούμενα για τη γενετική τροποποίηση φυτών

ΥποκινητέςΕπαγώγιμη και Παροδική έκφρασηΕπαγώγιμη και Παροδική έκφρασηΚάποια διαγονίδια γνωρίζουμε ότι επιδρούν στην ανάπτυξηή στην απόδοση των φυτών, κι έτσι είναι πιο συνετό να ταενεργοποιούμε μόνο όταν χρειάζονται:- Επαγωγή αρσενικής στειρότητας για την παραγωγή

β δ ώ ό ί ί ή tυβριδιακών σπόρων χωρίς χρεία γραμμής restorer, - Ενεργοποίηση γονιδίων ανθεκτικότητας σε ασθένειες μόνο

όταν εμφανίζεται ο παθογόνος παράγοντας, για να μφ ζ γ ς ρ γ ς, γαντιμετωπιστεί η προσαρμογή στον παθογόνο παράγοντα,

- Καθυστέρηση της έκφρασης των διαγονιδίων όταν η νέα πρωτεΐνη παρεμβάλλεται στην αρχική φυτική ανάπτυξηπρωτεΐνη παρεμβάλλεται στην αρχική φυτική ανάπτυξη.

Επαγώγιμη: αλκοολική αφυδρογονάση, ΑιθανόληΠαροδική: Ιός της Μωσαϊκής του καπνού (TMV) (LSBΠαροδική: Ιός της Μωσαϊκής του καπνού (TMV) (LSB

Geneware)

Σχηματική παράσταση παροδικής έκφρασης γονιδίων με τη μέθοδο της διήθησηςγονιδίων με τη μέθοδο της διήθησης

Το επιλεγμένο φυτόΕπιλογή των

άλλ λ Χημική ανάλυση

Προφίλ μεταβολιτώνΕκμαίευση

κατάλληλων συνθηκών με π.χ. MeJA, SA, άλατα βαρέων μετάλλων

Χημική ανάλυση π.χ. GC-MS, LC-

MS,NMR

Καθιέρωση καλλιεργειών κυττάρων ή οργάνων

Λειτουργική ανάλυσηΕπιλογή των υποψηφίων

Ανακάλυψη γονιδίων

Γενετική ί

Ταυτοποίηση διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων

Ανακάλυψη γονιδίωνΑύξηση της

παραγωγής σε

Ενισχυμένη παραγωγή των

ψηφγονιδίων

Συνδυαστική

τροποποίηση με επιλεγμένα γονίδια μεμονωμένα ή συνδυασμένα

• cDNA-AFLP

• SAGE

• micro-arrays

βιοαντιδραστήρες

Προϊόν

Ενισχυμένη παραγωγή των επιθυμητών ενώσεων Επιλογή των

υποψηφίων γονιδίων

Συνδυαστική βιοχημεία

Μετασχηματισμός σχετιζόμενων ή άλλων φυτών

Κατιούσα διεργασία

Προϊόν

Ανακάλυψη νέων ενώσεων

Εικόνα 1. Σχεδιάγραμμα του τρόπου με τον οποίο η λειτουργική γονιδιωματική μπορεί να συνεισφέρει στηνενίσχυση της παραγωγής γνωστών και νέων δευτερογενών μεταβολιτών στα φυτικά κύτταρα.Συντομογραφίες: AFLP – πολυμορφισμός μήκους ενισχυμένων τμημάτων (amplified fragment length polymorphism),GC-MS – αέριος χρωματογραφία-φασματομετρία μαζών (gas chromatography–mass spectrometry) LC-MS – υγρήGC-MS – αέριος χρωματογραφία-φασματομετρία μαζών (gas chromatography–mass spectrometry), LC-MS – υγρήχρωματογραφία-φασματομετρία μαζών (liquid chromatography–mass spectrometry), MeJA – μεθυλο-ιασμονικό οξύ(methyl jasmonate), NMR – πυρηνικός μαγνητικός συντονισμός (nuclear magnetic resonance), SA – σαλικυλικό οξύ(salicylic acid), SAGE – διαδοχική ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης (serial analysis of gene expression).

∆ιαγονιδιακό φυτό Προϊόν∆ιαγονιδιακό φυτό Τράπεζες κατεψυγμένων αρχικών κυττάρων και κυττάρων εργασίας

Καθιερώνουμε την Αρχειοθέτηση Σχηματισμός ϊό QA

ρ μ ηκυτταρική καλλιέργεια

Καθαρισμός με χρωμα-τογραφία

(DSP)

Επιλογή σταθερών κυτταρικών

Αύξηση κατά

κλίμακα

Ανάκτηση υπερκειμένου καλλιέργειας

Αρχειοθέτηση / Ανάκτηση προϊόντος, QA,

QC, ρυθμιστικά

Ομογενοποίηση κυτάρων

σειρών υψηλής επίδοσης

Συγκαλλιεργούμε με Agrobacterium tumefaciens ή μετασχηματίζουμε με ∆ιήθηση,

διευκρίνηση

∆ιήθηση, διευκρίνιση

∆ιαχείριση απορριμμάτων

Φυγοκέ-ντρηση και διήθηση

κυτάρωνζ

βομβαρδισμό σωματιδίων διευκρίνηση

απορριμμάτων

Κυτταροκαλλιέργεια BY-2 Ακατέργαστο ομογενοποίημα

Ομογενοποίημα χωρίς κυτταρικά υπολείμματα

Βιοφαρμακευτική παραγωγή σε φυτικά κύτταρα. Για τις εκκρινόμενες πρωτεΐνες, παίρνουμε το προϊόν απευθείας από την υπερκείμενη στρώση τηςκαλλιέργειας ενώ για τις ενδοκυτταρικές πρωτεΐνες είναι απαραίτητη η ομογενοποίηση και η διήθησηκαλλιέργειας, ενώ για τις ενδοκυτταρικές πρωτεΐνες είναι απαραίτητη η ομογενοποίηση και η διήθησηγια να απομακρύνουμε τα ακατέργαστα υπολείμματα. DSP – κατιούσα διεργασία (downstreamprocessing), QA – βεβαίωση ποιότητας (quality assurance), QC – έλεγχος ποιότητας (quality control).

Παραγωγή δευτερογενών μεταβολιτών σε κυτταροκαλλιέργειες

Είδος Προϊόν Παραγωγή (% ξηρού βάρους)

Berberis wilsonae αλκαλοειδή 10,0Catharanthus roseus σερπεντίνη, αζμαλικίνη 2,2 , 1,8Coleus blumei ροζμαρινικό 21.4Coptis japonica βενζιλισοκουϊνολίνες 15,0Coptis japonica βενζιλισοκουϊνολίνες 15,0Dioscorea deltoidea διοσγενίνη 7,8Galium mollugo σικιμικό 10,0Lithospermum eruthrorhizon σικονίνη 12,4M i d i if li θ ό 18 0Morinda citrifolia ανθρακινόνη 18,0Nicotiana tabacum νικοτίνη 5,0Syringa vulgaris ακετοσίδη 15,0

Πίνακας 4.9: Δευτερογενείς μεταβολίτες από κυτταροκαλλιέργειες με πιθανή ρ γ ς μ β ς ρ ργ ς μ ή

εμπορική εφαρμογή.

Είδος Προϊόν Χρήση Τιμή (ανα kg) Artemisia annua αρτεμισίνη αντιμαλάρια 'ΑγνωστηArtemisia annua αρτεμισίνη αντιμαλάρια ΑγνωστηCastanospermum australe

καστανοσπερμίνη αναστολή γλυκοσιδάσης, αντί-ΗIV δραστικότητα

'Αγνωστη

Catharanthus roseus

αζμαλικίνη (σπερμιντίνη)

αντιϋπερτασικό 450.000 roseus (σπερμιντίνη) βινκριστίνη αντιλευκαιμικό 6 Χ109 Chinchona ledgeriana

κινίνο αντιμαλάρια 30,000

Digitalis lanata διγκοξίνη καρδιοτονωτικό 1 200 000Digitalis lanata διγκοξίνη καρδιοτονωτικό 1,200,000Dioscorea deltoidea

διοσγενίνη στεροειδή 200,000

Ginko biloba guigkolides αντιφλεγμονώδη Αγνωστη Jasminum ιασμίνη άρωμα 1 500 000Jasminum ιασμίνη άρωμα 1,500,000Lithospermum crythrorhizon

σικονίνη αντιβακτηριακό, χρωστική 1,500,000

Murraya paniculata

yeuhchukene αντισύλληψη Αγνωστη paniculata Papaver somniferum

κοδεϊνη ηρεμιστικό 400,000

Taxus brevifolia ταξόλη αντικαρκινικό 20,000,000 V il l if li βανίλια αρω α ικό 300 000Vanila planifolia βανίλια αρωματικό 300,000Vitis

ΚΑΠΟΙΕΣ ΑΠΟ ΤΙΣ ΣΗΜΑΝΤΙΚΟΤΕΡΕΣ (ΟΙΚΟΝΟΜΙΚΩΣ) ΚΑΠΟΙΕΣ ΑΠΟ ΤΙΣ ΣΗΜΑΝΤΙΚΟΤΕΡΕΣ (ΟΙΚΟΝΟΜΙΚΩΣ) ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΕΣ ΟΥΣΙΕΣ Ή ΤΟΥΣ ΠΡΟ∆ΡΟΜΟΥΣ ΤΟΥΣ ΠΟΥ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΕΣ ΟΥΣΙΕΣ Ή ΤΟΥΣ ΠΡΟ∆ΡΟΜΟΥΣ ΤΟΥΣ ΠΟΥ

ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΙ ΑΠΟ ΦΥΤΑ ΚΑΙ ΟΙ ΥΠΟΛΟΓΙΖΟΜΕΝΕΣΠΑΡΑΓΟΝΤΑΙ ΑΠΟ ΦΥΤΑ ΚΑΙ ΟΙ ΥΠΟΛΟΓΙΖΟΜΕΝΕΣΠΑΡΑΓΟΝΤΑΙ ΑΠΟ ΦΥΤΑ, ΚΑΙ ΟΙ ΥΠΟΛΟΓΙΖΟΜΕΝΕΣ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΙ ΑΠΟ ΦΥΤΑ, ΚΑΙ ΟΙ ΥΠΟΛΟΓΙΖΟΜΕΝΕΣ ΠΑΓΚΟΣΜΙΕΣ ΠΩΛΗΣΕΙΣ ΓΙΑ ΤΟ 2002 ΓΙΑ ΤΙΣ ∆ΟΜΙΚΕΣ ΟΜΑ∆ΕΣ ΠΑΓΚΟΣΜΙΕΣ ΠΩΛΗΣΕΙΣ ΓΙΑ ΤΟ 2002 ΓΙΑ ΤΙΣ ∆ΟΜΙΚΕΣ ΟΜΑ∆ΕΣ

ΤΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ΠΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΙ ΑΠΟ ΦΥΤΑΤΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ΠΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΙ ΑΠΟ ΦΥΤΑ

ΟΝΟΜΑΟΝΟΜΑ ΤΥΠΟΣΤΥΠΟΣ ΠΗΓΗΠΗΓΗ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΗ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΗ ΧΡΗΣΗΧΡΗΣΗ

ΑΛΚΑΛΟΕΙ∆ΗΑΛΚΑΛΟΕΙ∆Η (1/3)(1/3): Προβολικές πωλήσεις για το 2002 : Προβολικές πωλήσεις για το 2002 -- US$US$44 045 εκατομμύρια045 εκατομμύρια

ΧΡΗΣΗΧΡΗΣΗΑτροπίνη, Υοσκυαμίνη, Σκοπολαμίνη

Τροπανο-αλκαλοειδή

Solanaceous spp. Αντιχολινεργικό

ΣκοπολαμίνηΚαμπτοθηκίνη Αλκαλοειδές

ινδόληςCamptotheca acuminata Deene

Αντινεοπλαστικό

Καπσαϊκίνη Φαινυλαλκυλ αμινο Capsicum spp Τοπικό αναλγητικόΚαπσαϊκίνη Φαινυλαλκυλ-αμινο αλκαλοειδές

Capsicum spp. Τοπικό αναλγητικό

Κωδεΐνη, Μορφίνη

Αλκαλοειδή οπίου Papaver somniferum L

Αναλγητικό, ΑντιβηχικόΜορφίνη somniferum L. Αντιβηχικό

Κοκαΐνη Αλκαλοειδές κοκαΐνης

Erythroxylum cocaLamarck

Τοπικό αναισθητικό

Κ λ ί Αλ λ δέ C l hi Κ ά ήΚολχικίνη Αλκαλοειδές ισοκινολίνης

Colchicum autumnale L.

Κατά της ουρικής αρθρίτιδας

ΚΑΠΟΙΕΣ ΑΠΟ ΤΙΣ ΣΗΜΑΝΤΙΚΟΤΕΡΕΣ (ΟΙΚΟΝΟΜΙΚΩΣ) ΚΑΠΟΙΕΣ ΑΠΟ ΤΙΣ ΣΗΜΑΝΤΙΚΟΤΕΡΕΣ (ΟΙΚΟΝΟΜΙΚΩΣ) ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΕΣ ΟΥΣΙΕΣ Ή ΤΟΥΣ ΠΡΟ∆ΡΟΜΟΥΣ ΤΟΥΣ ΠΟΥ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΕΣ ΟΥΣΙΕΣ Ή ΤΟΥΣ ΠΡΟ∆ΡΟΜΟΥΣ ΤΟΥΣ ΠΟΥ

ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΙ ΑΠΟ ΦΥΤΑ ΚΑΙ ΟΙ ΥΠΟΛΟΓΙΖΟΜΕΝΕΣΠΑΡΑΓΟΝΤΑΙ ΑΠΟ ΦΥΤΑ ΚΑΙ ΟΙ ΥΠΟΛΟΓΙΖΟΜΕΝΕΣΠΑΡΑΓΟΝΤΑΙ ΑΠΟ ΦΥΤΑ, ΚΑΙ ΟΙ ΥΠΟΛΟΓΙΖΟΜΕΝΕΣ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΙ ΑΠΟ ΦΥΤΑ, ΚΑΙ ΟΙ ΥΠΟΛΟΓΙΖΟΜΕΝΕΣ ΠΑΓΚΟΣΜΙΕΣ ΠΩΛΗΣΕΙΣ ΓΙΑ ΤΟ 2002 ΓΙΑ ΤΙΣ ∆ΟΜΙΚΕΣ ΟΜΑ∆ΕΣ ΠΑΓΚΟΣΜΙΕΣ ΠΩΛΗΣΕΙΣ ΓΙΑ ΤΟ 2002 ΓΙΑ ΤΙΣ ∆ΟΜΙΚΕΣ ΟΜΑ∆ΕΣ

ΤΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ΠΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΙ ΑΠΟ ΦΥΤΑΤΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ΠΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΙ ΑΠΟ ΦΥΤΑΑΛΚΑΛΟΕΙ∆ΗΑΛΚΑΛΟΕΙ∆Η (2/3)(2/3): Προβολικές πωλήσεις για το 2002 : Προβολικές πωλήσεις για το 2002 -- US$US$44 045 εκατομμύρια045 εκατομμύρια

ΟΝΟΜΑΟΝΟΜΑ ΤΥΠΟΣΤΥΠΟΣ ΠΗΓΗΠΗΓΗ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΗ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΗ ΧΡΗΣΗΧΡΗΣΗΧΡΗΣΗΧΡΗΣΗ

Εμετίνη Αλκαλοειδές ισοκινολίνης

Cephaelis ipecacuanha(Brot ) A Rich

Αντιαμοιβαδικό

(Brot.) A. Rich.Γαλανθαμίνη Αλκαλοειδές

ισοκινολίνηςLeucojum aestivumL.

Αναστολέας χολινεστεράσης

Ν ί Αλ λ δέ Ni ti Θ ίΝικοτίνη Αλκαλοειδές πυρρολιδίνης

Nicotiana spp. Θεραπεία για το σταμάτημα του καπνίσματος

Φυσοστιγμίνη Αλκαλοειδές Physostigma XολινεργικόΦυσοστιγμίνη Αλκαλοειδές ινδόλης

Physostigma venenosum Balfor

Xολινεργικό

Πιλοκαρπίνη Αλκαλοειδές ιμιδαζολίου

Pilocarpus jaborandi Holmes

Xολινεργικόιμιδαζολίου jaborandi Holmes

Κινίνη Αλκαλοειδές κινολίνης

Cinchona spp. Αντιελονοσιακό

ΚΑΠΟΙΕΣ ΑΠΟ ΤΙΣ ΣΗΜΑΝΤΙΚΟΤΕΡΕΣ (ΟΙΚΟΝΟΜΙΚΩΣ) ΚΑΠΟΙΕΣ ΑΠΟ ΤΙΣ ΣΗΜΑΝΤΙΚΟΤΕΡΕΣ (ΟΙΚΟΝΟΜΙΚΩΣ) ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΕΣ ΟΥΣΙΕΣ Ή ΤΟΥΣ ΠΡΟ∆ΡΟΜΟΥΣ ΤΟΥΣ ΠΟΥ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΕΣ ΟΥΣΙΕΣ Ή ΤΟΥΣ ΠΡΟ∆ΡΟΜΟΥΣ ΤΟΥΣ ΠΟΥ

ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΙ ΑΠΟ ΦΥΤΑ, ΚΑΙ ΟΙ ΥΠΟΛΟΓΙΖΟΜΕΝΕΣ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΙ ΑΠΟ ΦΥΤΑ, ΚΑΙ ΟΙ ΥΠΟΛΟΓΙΖΟΜΕΝΕΣ ΠΑΓΚΟΣΜΙΕΣ ΠΩΛΗΣΕΙΣ ΓΙΑ ΤΟ 2002 ΓΙΑ ΤΙΣ ∆ΟΜΙΚΕΣ ΟΜΑ∆ΕΣ ΠΑΓΚΟΣΜΙΕΣ ΠΩΛΗΣΕΙΣ ΓΙΑ ΤΟ 2002 ΓΙΑ ΤΙΣ ∆ΟΜΙΚΕΣ ΟΜΑ∆ΕΣ

ΤΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ΠΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΙ ΑΠΟ ΦΥΤΑΤΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ΠΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΙ ΑΠΟ ΦΥΤΑΤΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ΠΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΙ ΑΠΟ ΦΥΤΑΤΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ΠΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΙ ΑΠΟ ΦΥΤΑΑΛΚΑΛΟΕΙ∆ΗΑΛΚΑΛΟΕΙ∆Η (3/3)(3/3): Προβολικές πωλήσεις για το 2002 : Προβολικές πωλήσεις για το 2002 -- US$US$44 045 εκατομμύρια045 εκατομμύρια

ΟΝΟΜΑΟΝΟΜΑ ΤΥΠΟΣΤΥΠΟΣ ΠΗΓΗΠΗΓΗ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΗΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΗΟΝΟΜΑΟΝΟΜΑ ΤΥΠΟΣΤΥΠΟΣ ΠΗΓΗΠΗΓΗ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΗ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΗ ΧΡΗΣΗΧΡΗΣΗ

Κινιδίνη Αλκαλοειδές κινολίνης

Cinchona spp. Καρδιακόςdepressantκινολίνης depressant

Ρεζερπίνη Αλκαλοειδές ινδόλης

Rauwolfia serpentina L.

Αντιυπερτασικό, Ψυχοτροπικό

Τουμποκουρανίνη Αλκαλοειδές Chondodendron ΧαλαρωτικόΤουμποκουρανίνη Αλκαλοειδές διβενζυλικής ισοκινολίνης

Chondodendron tomentosum Ruiz, Strychos toxiferaBentham

Χαλαρωτικό σκελετικών μυών

Βινβλαστίνη, Βινκριστίνη

Αλκαλοειδές δισινδόλης

Catharanthus roseus L.

Αντινεοπλαστικό

Υοχυμβίνη Αλκαλοειδές Apocynaceae ΑφροδισιακόΥοχυμβίνη Αλκαλοειδές ινδόλης

Apocynaceae Rubiaceae spp.

Αφροδισιακό

ΚΑΠΟΙΕΣ ΑΠΟ ΤΙΣ ΣΗΜΑΝΤΙΚΟΤΕΡΕΣ (ΟΙΚΟΝΟΜΙΚΩΣ) ΚΑΠΟΙΕΣ ΑΠΟ ΤΙΣ ΣΗΜΑΝΤΙΚΟΤΕΡΕΣ (ΟΙΚΟΝΟΜΙΚΩΣ) ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΕΣ ΟΥΣΙΕΣ Ή ΤΟΥΣ ΠΡΟ∆ΡΟΜΟΥΣ ΤΟΥΣ ΠΟΥΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΕΣ ΟΥΣΙΕΣ Ή ΤΟΥΣ ΠΡΟ∆ΡΟΜΟΥΣ ΤΟΥΣ ΠΟΥΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΕΣ ΟΥΣΙΕΣ Ή ΤΟΥΣ ΠΡΟ∆ΡΟΜΟΥΣ ΤΟΥΣ ΠΟΥ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΕΣ ΟΥΣΙΕΣ Ή ΤΟΥΣ ΠΡΟ∆ΡΟΜΟΥΣ ΤΟΥΣ ΠΟΥ

ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΙ ΑΠΟ ΦΥΤΑ, ΚΑΙ ΟΙ ΥΠΟΛΟΓΙΖΟΜΕΝΕΣ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΙ ΑΠΟ ΦΥΤΑ, ΚΑΙ ΟΙ ΥΠΟΛΟΓΙΖΟΜΕΝΕΣ ΠΑΓΚΟΣΜΙΕΣ ΠΩΛΗΣΕΙΣ ΓΙΑ ΤΟ 2002 ΓΙΑ ΤΙΣ ∆ΟΜΙΚΕΣ ΟΜΑ∆ΕΣ ΠΑΓΚΟΣΜΙΕΣ ΠΩΛΗΣΕΙΣ ΓΙΑ ΤΟ 2002 ΓΙΑ ΤΙΣ ∆ΟΜΙΚΕΣ ΟΜΑ∆ΕΣ

ΤΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ΠΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΙ ΑΠΟ ΦΥΤΑΤΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ΠΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΙ ΑΠΟ ΦΥΤΑΤΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ΠΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΙ ΑΠΟ ΦΥΤΑΤΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ΠΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΙ ΑΠΟ ΦΥΤΑΤΕΡΠΕΝΙΑ ΚΑΙ ΣΤΕΡΟΕΙ∆Η: Προβολικές πωλήσεις για το 2002 ΤΕΡΠΕΝΙΑ ΚΑΙ ΣΤΕΡΟΕΙ∆Η: Προβολικές πωλήσεις για το 2002 -- US$US$1212 400 εκατομμύρια400 εκατομμύρια

ΟΝΟΜΑΟΝΟΜΑ ΤΥΠΟΣΤΥΠΟΣ ΠΗΓΗΠΗΓΗ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΗ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΗ ΧΡΗΣΗΧΡΗΣΗ

Αρτεμισινίνη Λακτόνη Artemisia annua L. ΑντιελονοσιακόΑρτεμισινίνη Λακτόνη sesquiterpene

Artemisia annua L. Αντιελονοσιακό

∆ιοσγενίνη, Εκογενίνη,

Στεροειδή Dioscorea spp. Αντισυλληπτικά και ορμονικά φάρμακαγ η

Στιγμαστερόληρμ φ ρμ

Ταξόλη και άλλα ταξοειδή

∆ιτερπένια Taxus brevifoliaNutt.

Αντινεοπλαστικό

ΚΑΠΟΙΕΣ ΑΠΟ ΤΙΣ ΣΗΜΑΝΤΙΚΟΤΕΡΕΣ (ΟΙΚΟΝΟΜΙΚΩΣ) ΚΑΠΟΙΕΣ ΑΠΟ ΤΙΣ ΣΗΜΑΝΤΙΚΟΤΕΡΕΣ (ΟΙΚΟΝΟΜΙΚΩΣ) ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΕΣ ΟΥΣΙΕΣ Ή ΤΟΥΣ ΠΡΟ∆ΡΟΜΟΥΣ ΤΟΥΣ ΠΟΥ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΕΣ ΟΥΣΙΕΣ Ή ΤΟΥΣ ΠΡΟ∆ΡΟΜΟΥΣ ΤΟΥΣ ΠΟΥ

ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΙ ΑΠΟ ΦΥΤΑ, ΚΑΙ ΟΙ ΥΠΟΛΟΓΙΖΟΜΕΝΕΣ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΙ ΑΠΟ ΦΥΤΑ, ΚΑΙ ΟΙ ΥΠΟΛΟΓΙΖΟΜΕΝΕΣ ΠΑΓΚΟΣΜΙΕΣ ΠΩΛΗΣΕΙΣ ΓΙΑ ΤΟ 2002 ΓΙΑ ΤΙΣ ∆ΟΜΙΚΕΣ ΟΜΑ∆ΕΣ ΠΑΓΚΟΣΜΙΕΣ ΠΩΛΗΣΕΙΣ ΓΙΑ ΤΟ 2002 ΓΙΑ ΤΙΣ ∆ΟΜΙΚΕΣ ΟΜΑ∆ΕΣ

ΤΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ΠΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΙ ΑΠΟ ΦΥΤΑΤΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ΠΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΙ ΑΠΟ ΦΥΤΑ

ΓΛΥΚΟΖΙΤΕΣ: Προβολικές πωλήσεις για το 2002 ΓΛΥΚΟΖΙΤΕΣ: Προβολικές πωλήσεις για το 2002 -- US$US$99 230 εκατομμύρια230 εκατομμύρια

ΟΝΟΜΑΟΝΟΜΑ ΤΥΠΟΣΤΥΠΟΣ ΠΗΓΗΠΗΓΗ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΗ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΗ ΧΡΗΣΗΧΡΗΣΗΧΡΗΣΗΧΡΗΣΗ

∆ιγοξίνη, ∆ιγιτοξίνη Στεροειδείς γλυκοζίτες

Digitalis spp. Καρδιοτονωτικά

Σενοσίδια Α και Β Γλυκοζίτες υδροξυ-ανθρακενικοί

Cassia angustifoliaVahl.

Μυοχαλαρωτικά

ΚΑΠΟΙΕΣ ΑΠΟ ΤΙΣ ΣΗΜΑΝΤΙΚΟΤΕΡΕΣ (ΟΙΚΟΝΟΜΙΚΩΣ) ΚΑΠΟΙΕΣ ΑΠΟ ΤΙΣ ΣΗΜΑΝΤΙΚΟΤΕΡΕΣ (ΟΙΚΟΝΟΜΙΚΩΣ) ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΕΣ ΟΥΣΙΕΣ Ή ΤΟΥΣ ΠΡΟ∆ΡΟΜΟΥΣ ΤΟΥΣ ΠΟΥΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΕΣ ΟΥΣΙΕΣ Ή ΤΟΥΣ ΠΡΟ∆ΡΟΜΟΥΣ ΤΟΥΣ ΠΟΥΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΕΣ ΟΥΣΙΕΣ Ή ΤΟΥΣ ΠΡΟ∆ΡΟΜΟΥΣ ΤΟΥΣ ΠΟΥ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΕΣ ΟΥΣΙΕΣ Ή ΤΟΥΣ ΠΡΟ∆ΡΟΜΟΥΣ ΤΟΥΣ ΠΟΥ

ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΙ ΑΠΟ ΦΥΤΑ, ΚΑΙ ΟΙ ΥΠΟΛΟΓΙΖΟΜΕΝΕΣ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΙ ΑΠΟ ΦΥΤΑ, ΚΑΙ ΟΙ ΥΠΟΛΟΓΙΖΟΜΕΝΕΣ ΠΑΓΚΟΣΜΙΕΣ ΠΩΛΗΣΕΙΣ ΓΙΑ ΤΟ 2002 ΓΙΑ ΤΙΣ ∆ΟΜΙΚΕΣ ΠΑΓΚΟΣΜΙΕΣ ΠΩΛΗΣΕΙΣ ΓΙΑ ΤΟ 2002 ΓΙΑ ΤΙΣ ∆ΟΜΙΚΕΣ

ΟΜΑ∆ΕΣ ΤΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ΠΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΙ ΑΠΟ ΦΥΤΑΟΜΑ∆ΕΣ ΤΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ΠΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΙ ΑΠΟ ΦΥΤΑΟΜΑ∆ΕΣ ΤΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ΠΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΙ ΑΠΟ ΦΥΤΑΟΜΑ∆ΕΣ ΤΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ΠΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΙ ΑΠΟ ΦΥΤΑ

ΛΟΙΠΑ ΚΑΙ ΜΙΓΜΑΤΑ: Προβολικές πωλήσεις για το 2002 ΛΟΙΠΑ ΚΑΙ ΜΙΓΜΑΤΑ: Προβολικές πωλήσεις για το 2002 -- US$US$5 014 5 014 εκατομμύριαεκατομμύρια

ΟΝΟΜΑΟΝΟΜΑ ΤΥΠΟΣΤΥΠΟΣ ΠΗΓΗΠΗΓΗ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΗ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΗ ΧΡΗΣΗΧΡΗΣΗΧΡΗΣΗΧΡΗΣΗ

Ιπεκάκια Μίγμα από αλκαλοειδή

ί άλλ

Cephaelis ipecacuanha (Brot) A Ri h

Εμετικό

ιπεκακίων και άλλα συστατικά

A. Rich.

Ποδοφυλλοτοξίνη Λιγνάνη Podophyllum peltatum L

Αντινεοπλαστικόpeltatum L.

ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΑΝΤΙΓΟΝΩΝ ΚΑΙ ΒΙΟΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΩΝ ΟΥΣΙΩΝ

ΠΑΡΑ∆ΕΙΓΜΑΤΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΩΝ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΠΑΡΑ∆ΕΙΓΜΑΤΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΩΝ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΒΑΣΙΣΜΕΝΩΝ ΣΕ ΦΥΤΑ, ΤΑ ΟΠΟΙΑ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΟΥΝΤΑΙ ΒΑΣΙΣΜΕΝΩΝ ΣΕ ΦΥΤΑ, ΤΑ ΟΠΟΙΑ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΟΥΝΤΑΙ ΣΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ (1/3)ΣΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ (1/3)

ΣΥΣΤΗΜΑΣΥΣΤΗΜΑ ΠΡΩΤΕΪΝΗΠΡΩΤΕΪΝΗ ΕΚΦΡΑΣΗΕΚΦΡΑΣΗ ΕΤΑΙΡΕΙΑΕΤΑΙΡΕΙΑ

Συστήματα μετασχηματισμού με σταθερό πυρήναΟλόκληρο φυτό

(κυτταροπλα-σματικό)

HbsAg, εμβόλιο κολλαγόνο

0.007% TSP 1 mg/g DW

AltaGen Bioscience Inc.(πατάτα), CropTech Corp.(καπνός), Medicago Inc.(αλφάλφα) Meristem(αλφάλφα), Meristem Therapeutics (καπνός)

Κυτταρικό διαμέρισμα

Χυμοτόπιο scFv, ηπατίτιδα ΒsIgA/G

0.032% TSP δεν

PlantGenix Inc. (δεν αναφέρεται)διαμέρισμα sIgA/G δεν

αναφέρεταιαναφέρεται)

Ενδοπλασμα-τικό ∆ίκτυο

scFv, κιουτινάση scFv, T84,66

1% TSP 29 μg/g FW

Novoplant GmbH (καπνός)τικό ∆ίκτυο scFv, T84,66

scFv, ABA29 μg/g FW 6.8% TSP

Αποπλάστης IgG1, IgA/G, IgG1, Fab

1,3% TSP 500 μg/g FW

Epicyte Pharmaceutical Inc. (καπνός)g μg g

13% TSP( ς)

ΠΑΡΑ∆ΕΙΓΜΑΤΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΩΝ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΒΑΣΙΣΜΕΝΩΝ ΣΕ ΠΑΡΑ∆ΕΙΓΜΑΤΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΩΝ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΒΑΣΙΣΜΕΝΩΝ ΣΕ ΦΥΤΑ, ΤΑ ΟΠΟΙΑ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΟΥΝΤΑΙ ΣΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΦΥΤΑ, ΤΑ ΟΠΟΙΑ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΟΥΝΤΑΙ ΣΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ

ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ (2/3)ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ (2/3)ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ (2/3)ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ (2/3)ΣΥΣΤΗΜΑΣΥΣΤΗΜΑ ΠΡΩΤΕΪΝΗΠΡΩΤΕΪΝΗ ΕΚΦΡΑΣΗΕΚΦΡΑΣΗ ΕΤΑΙΡΕΙΑΕΤΑΙΡΕΙΑ

Συστήματα μετασχηματισμού με σταθερό πυρήναΣυστήματα μετασχηματισμού με σταθερό πυρήναΕξειδικευ-μένος Ιστός

Σπόρος Αβιδίνη Χιρουδίνη

6% TSP 1% FW

ProdiGene Inc. (καλαμπόκι), SemBioSys Genetics Inc. (κανόλα), Applied PhytologicsΙστός (κανόλα), Applied Phytologics Inc. (ρύζι), Epicyte Pharmaceutical Inc. (καλαμπόκι), ITP, Monsanto (καλαμπόκι), M i t Th tiMeristem Therapeutics (ελαιοκράμβη)

Κόνδυλος scFv, οξαλοζόνη 2% TSP Meristem Therapeutics (πατάτα)Ρίζα IgM, RNK 0.003%

TSPΚαρπός RSV-F πρωτεΐνη ∆εν

έαναφέρεταιΈκκριμα Ανθρώπινη

SEAP20 μg/g DW/ημέρα

Phytomedics Inc. (ρίζες καπνού)

Ανθρώπινη SEAP

2.8% TEP Phytomedics Inc. (φύλλα καπνού), Biolex Inc. (Lemnaceae)

ΠΑΡΑ∆ΕΙΓΜΑΤΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΩΝ ΕΚΦΡΑΣΗΣΠΑΡΑ∆ΕΙΓΜΑΤΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΩΝ ΕΚΦΡΑΣΗΣΠΑΡΑ∆ΕΙΓΜΑΤΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΩΝ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΠΑΡΑ∆ΕΙΓΜΑΤΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΩΝ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΒΑΣΙΣΜΕΝΩΝ ΣΕ ΦΥΤΑ, ΤΑ ΟΠΟΙΑ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΟΥΝΤΑΙ ΒΑΣΙΣΜΕΝΩΝ ΣΕ ΦΥΤΑ, ΤΑ ΟΠΟΙΑ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΟΥΝΤΑΙ ΣΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ (3/3)ΣΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ (3/3)Φ (3/3)Φ (3/3)

ΣΥΣΤΗΜΑΣΥΣΤΗΜΑ ΠΡΩΤΕΪΝΗΠΡΩΤΕΪΝΗ ΕΚΦΡΑΣΗΕΚΦΡΑΣΗ ΕΤΑΙΡΕΙΑΕΤΑΙΡΕΙΑΣΥΣΤΗΜΑΣΥΣΤΗΜΑ ΠΡΩΤΕΪΝΗΠΡΩΤΕΪΝΗ ΕΚΦΡΑΣΗΕΚΦΡΑΣΗ ΕΤΑΙΡΕΙΑΕΤΑΙΡΕΙΑ

Συστήματα μετασχηματισμού με σταθερό πλαστίδιοΧλωροπλάστης Σωματοτροπίνη 7% TSP

Συστήματα μετασχηματισμού μεταβατικά

Ιικά Τριχοσανθίνη 2% TSP Large Scale Biology CorpΙικά Τριχοσανθίνη 2% TSP Large Scale Biology Corp. (καπνός)

Comparison of various commercial recombinant protein expression systems

Σύγκριση διαφόρων εμπορικών συστημάτων έκφρασης Σύγκριση διαφόρων εμπορικών συστημάτων έκφρασης ανασυνδυασμένων πρωτεϊνώνανασυνδυασμένων πρωτεϊνών

ΤαχύτηταΤαχύτητα

ΚόστοςΚόστοςΚόστος Κόστος λειτουργίαςλειτουργίας

Κόστος Κόστος κεφαλαίουκεφαλαίου

ΓλυκοσυλίωσηΓλυκοσυλίωση

Συγκρότηση Συγκρότηση ΒέλτισταΒέλτιστα

πολλαπλομερώνπολλαπλομερών

ΑναδίπλωσηΑναδίπλωση

ΑσφάλειαΑσφάλεια

Ικανότητα Ικανότητα αύξησης της αύξησης της παραγωγήςπαραγωγής

∆ δ ά∆ δ ά

ΦυτάΦυτάΖύμεςΖύμεςΒακτήριαΒακτήρια

παραγωγήςπαραγωγής

∆ιαγονιδιακά ∆ιαγονιδιακά ζώαζώα

Κυτταροκαλλιέργειες Κυτταροκαλλιέργειες θηλαστικώνθηλαστικών

ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΑ ΚΑΙ ∆ΙΑΓΝΩΣΤΙΚΑ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΑ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΑ ΚΑΙ ∆ΙΑΓΝΩΣΤΙΚΑ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΑ ΠΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΙ ΣΕ ΦΥΤΑ (1/2)ΠΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΙ ΣΕ ΦΥΤΑ (1/2)ΠΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΙ ΣΕ ΦΥΤΑ (1/2)ΠΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΙ ΣΕ ΦΥΤΑ (1/2)

ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΚΑΙ ΕΞΕΙ∆ΙΚΕΥΣΗ

ΥΠΟΚΙΝΗΤΗΣ ΣΗΜΑΤΟ∆ΟΤΙΚΕΣ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΕΣ

ΟΝΟΜΑ Ή ΤΥΠΟΣ ΑΝΤΙΣΩΜΑ-

ΦΥΤΟ ΕΠΙΠΕ∆Α ΕΚΦΡΑΣΗΣ

ΑΝΤΙΣΩΜΑ-ΤΟΣ

Τερηδόνα, Αντιγόνο Ι ή ΙΙ του

CaMV 35S Μυϊκά σηματοδοτικά

Guy’s 13 (SlgA)

Nicοtiana tabacum

500 μg/g FWφύλλων

στρεπτόκοκκου πεπτίδια IgG

∆ιαγνωστικά, Αντίσωμα της ανθρώπινης IgG

CaMV 35S Μυϊκά σηματοδοτικά πεπτίδια IgG

C5-1 (IgG) Αλφάλφα 1.0% TSP

ανθρώπινης IgG πεπτίδια IgG

Θεραπεία του καρκίνου, Καρκινοεμβρυϊκό

ό

Ουβικιτίνη αραβοσίτου

Μυϊκό σηματοδοτικό πεπτίδιο IgG,KDEL

ScFvT84,66 (ScFv)

Σίτος 900.0 ng/g φύλλων, 1.5 μg/g σπόρων

αντιγόνο KDEL

Θεραπεία του καρκίνου, Καρκινοεμβρυϊκό

Ουβικιτίνη αραβοσίτου

Μυϊκό σηματοδοτικό πεπτίδιο IgG,

ScFvT84,66 (ScFv)

Ρύζι 29.0 μg/gφύλλων, 32.0 μg/g σπόρων, ρ μβρ

αντιγόνοg ,

KDELμg g ρ ,3.8 μg/gκάλλων

Θεραπεία του καρκίνου

ΕμπλουτισμένοCaMV 35S

Μυϊκό σηματοδοτικό

ScFvT84,66 (ScFv)

Ρύζι 27.0 μg/gφύλλωνκαρκίνου,

Καρκινοεμβρυϊκό αντιγόνο

CaMV 35S σηματοδοτικό πεπτίδιο IgG,KDEL

(ScFv) φύλλων

ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΑ ΚΑΙ ∆ΙΑΓΝΩΣΤΙΚΑ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΑ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΑ ΚΑΙ ∆ΙΑΓΝΩΣΤΙΚΑ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΑ ΠΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΙ ΣΕ ΦΥΤΑ (2/2)ΠΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΙ ΣΕ ΦΥΤΑ (2/2)( )( )

ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΚΑΙ ΕΞΕΙ∆ΙΚΕΥΣΗ

ΥΠΟΚΙΝΗΤΗΣ ΣΗΜΑΤΟ∆ΟΤΙΚΕΣ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΕΣ

ΟΝΟΜΑ Ή ΤΥΠΟΣ

Ω

ΦΥΤΟ ΕΠΙΠΕ∆Α ΕΚΦΡΑΣΗΣ

ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΟΣ

Θεραπεία του καρκίνου,

ΕμπλουτισμένοCaMV 35S

Οδηγός TMV Ω, Μυϊκά σηματοδοτικά

T84,66 (IgG)

Nicοtiana tabacum

1.0 μg/gφύλλωνκαρκίνου,

Καρκινοεμβρυϊκό αντιγόνο

CaMV 35S Μυϊκά σηματοδοτικά πεπτίδια IgG, KDEL

(IgG) tabacum(μεταβατικά με διήθηση Αγροβακτηρίου)

φύλλων

Θεραπεία του Β Υποκινητής α αμυλάση του 38C13 Nictiana 30 0 μg/gΘεραπεία του Β-κυτταρικού λυμφώματος, Ιδιότυπο εμβόλιο

Υποκινητής πρωτεΐνης περιβλήματοςTMV

α-αμυλάση του ρυζιού

38C13 (ScFv)

Nictiana benthamiana

30.0 μg/gφύλλων

Καρκίνος του παχέος εντέρου, Επιφανειακό αντιγόνο

Υποκινητής U5 CP TMV

Μυϊκό σηματοδοτικό πεπτίδιο IgG, KDEL

CO17-1A (IgG)

Nicοtiana benthamiana

∆εν αναφέρεται

Απλός ιός έρπητος 2

CaMV 35S Σηματοδοτικό πεπτίδιο εξτενσίνης του καπνού

Anti-HSV-2 (IgG)

Σόγια ∆εν αναφέρεται

ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ ΜΕ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΣΕ ΕΜΒΟΛΙΑ ΓΙΑ ΑΝΘΡΩΠΟΥΣ Ή ΖΩΑ, ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ ΜΕ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΣΕ ΕΜΒΟΛΙΑ ΓΙΑ ΑΝΘΡΩΠΟΥΣ Ή ΖΩΑ, ΟΙ ΟΠΟΙΕΣ ΕΚΦΡΑΖΟΝΤΑΙ ΑΠΟ ∆ΙΑΓΟΝΙ∆ΙΑΚΑ ΦΥΤΑΟΙ ΟΠΟΙΕΣ ΕΚΦΡΑΖΟΝΤΑΙ ΑΠΟ ∆ΙΑΓΟΝΙ∆ΙΑΚΑ ΦΥΤΑ (1/3)(1/3)

Πηγή της πρωτεΐνης & είδος οργανισμού που αποτελεί στόχο του εμβολίου

Εκφραζόμενη πρωτεΐνη ή πεπτίδιο

Φυτικό σύστημα έκφρασης

Μέγιστο καταγεγραμμένο επίπεδο έκφρασης σε φυτά

Ακεραιότητα, ανοσογονικότητα & προστατευτική ικανότητα του εμβολίου

Εντεροτοξιγονική E coli Υπομονάδα Β Καπνός <0 01% TSP Η ακέραιη πρωτεΐνη σχηματίζει ολιγομερή και είναιΕντεροτοξιγονική E. coli(άνθρωπος)

Υπομονάδα Β θερμοασταθούς τοξίνης

Καπνός <0.01% TSP Η ακέραιη πρωτεΐνη σχηματίζει ολιγομερή και είναι ανοσογόνος όταν παρέχεται δια του στόματος

Εντεροτοξιγονική E. coli(άνθρωπος)

Υπομονάδα Β θερμοασταθούς τοξίνης

Πατάτα 0.19% TSP Δραστηριότητα πρόσδεσης στον υποδοχέα και ανοσογόνος και προστατευτική όταν παρέχεται δια του στόματος

Εντεροτοξιγονική E. coli(άνθρωπος)

Υπομονάδα Β θερμοασταθούς τοξίνης

Αραβόσιτος Δεν δίδεται Ανοσογόνος και προστατευτική όταν παρέχεται δια του στόματος

Vibrio cholerae(άνθρωπος)

Υπομονάδα Β τόξίνης της χολέρας

Πατάτα 0.30% TSP Η ακέραιη πρωτεΐνη σχηματίζει ολιγομερή, έχει δραστηριότητα πρόσδεσης στον υποδοχέα, και είναι ανοσογόνος και προστατευτική όταν παρέχεται δια του στόματος

Ιός ηπατίτιδας Β (άνθρωπος)

Πρωτεΐνη της επιφάνειας του φακέλλου

Καπνός <0.01% TSP Ιοειδή σωμάτια σχηματίζονται και η εκχυλισμένη πρωτεΐνη είναι ανοσογόνος όταν παρέχεται με ένεση

Ιός ηπατίτιδας Β (άνθρωπος)

Πρωτεΐνη της επιφάνειας του φακέλλου

Πατάτα <0.01% FW Ανοσογόνος όταν παρέχεται δια του στόματος

Ιός ηπατίτιδας Β (άνθρωπος)

Πρωτεΐνη της επιφάνειας του φακέλλου

Λούπινα (Lupinusspp )

<0.01% FW Ανοσογόνος όταν παρέχεται δια του στόματος

spp.)

Ιός ηπατίτιδας Β (άνθρωπος)

Πρωτεΐνη της επιφάνειας του φακέλλου

Μαρούλι <0.01% FW Ανοσογόνος όταν παρέχεται δια του στόματος

ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ ΜΕ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΣΕ ΕΜΒΟΛΙΑ ΓΙΑ ΑΝΘΡΩΠΟΥΣ Ή ΖΩΑ, ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ ΜΕ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΣΕ ΕΜΒΟΛΙΑ ΓΙΑ ΑΝΘΡΩΠΟΥΣ Ή ΖΩΑ, ΟΙ ΟΠΟΙΕΣ ΕΚΦΡΑΖΟΝΤΑΙ ΑΠΟ ∆ΙΑΓΟΝΙ∆ΙΑΚΑ ΦΥΤΑΟΙ ΟΠΟΙΕΣ ΕΚΦΡΑΖΟΝΤΑΙ ΑΠΟ ∆ΙΑΓΟΝΙ∆ΙΑΚΑ ΦΥΤΑ (2/3)(2/3)ΟΙ ΟΠΟΙΕΣ ΕΚΦΡΑΖΟΝΤΑΙ ΑΠΟ ∆ΙΑΓΟΝΙ∆ΙΑΚΑ ΦΥΤΑΟΙ ΟΠΟΙΕΣ ΕΚΦΡΑΖΟΝΤΑΙ ΑΠΟ ∆ΙΑΓΟΝΙ∆ΙΑΚΑ ΦΥΤΑ (2/3)(2/3)

Πηγή της πρωτεΐνης & είδος οργανισμού

Εκφραζόμενη πρωτεΐνη ή πεπτίδιο

Φυτικό σύστημα έκφρασης

Μέγιστο καταγεγραμμένο επίπεδο

Ακεραιότητα, ανοσογονικότητα & προστατευτική ικανότητα του εμβολίου

ς ργ μπου αποτελεί στόχο του εμβολίου

φρ ηςέκφρασης σε φυτά

Ιός Norwalk Πρωτεΐνη καψιδίου Καπνός 0.23% TSP Ακέραιη πρωτεΐνη και ιοειδή σωμάτια

ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ ΜΕ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΣΕ ΕΜΒΟΛΙΑ ΓΙΑ ΑΝΘΡΩΠΟΥΣ Ή ΖΩΑ ΟΙ ΟΠΟΙΕΣ ΕΚΦΡΑΖΟΝΤΑΙ ΑΠΟ ∆ΙΑΓΟΝΙ∆ΙΑΚΑ ΦΥΤΑ

(άνθρωπος) σχηματίζονται, ανοσογόνος όταν παρέχεται δια του στόματος

Ιός Norwalk (άνθρωπος)

Πρωτεΐνη καψιδίου Πατάτα 0.37% TSP Ιοειδή σωμάτια σχηματίζονται και ανοσογόνος όταν παρέχεται δια του όΠΡΩΤΕΪΝΕΣ ΜΕ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΣΕ ΕΜΒΟΛΙΑ ΓΙΑ ΑΝΘΡΩΠΟΥΣ Ή ΖΩΑ, ΟΙ ΟΠΟΙΕΣ ΕΚΦΡΑΖΟΝΤΑΙ ΑΠΟ ∆ΙΑΓΟΝΙ∆ΙΑΚΑ ΦΥΤΑστόματος

Ιός της λύσσας (άνθρωπος)

Γλυκοπρωτεΐνη Τομάτα 1.00% TSP Ακέραιη πρωτεΐνη

Κυτταρομεγαλοϊός Γλυκοπρωτεΐνη Β Καπνός <0.02% TSP Ανοσολογικά σχετιζόμενη πρωτεΐνητου ανθρώπου (άνθρωπος)

Ιός της αιμορραγικής

VP60 Πατάτα 0.30% TSP Ανοσογόνος και προστατευτική όταν παρέχεται με ένεση

νόσου του κουνελιού (κουνέλι)

Ιός του αφθώδους πυρετού (αγροτικά ο α ά ζώα)

VP1 Arabidopsis ∆εν δίδεται Ανοσογόνος και προστατευτική όταν παρέχεται με ένεση

οικιακά ζώα)

Ιός του αφθώδους πυρετού (αγροτικά οικιακά ζώα)

VP1 Αλφάλφα ∆εν δίδεται Ανοσογόνος και προστατευτική όταν παρέχεται με ένεση ή δια του στόματος

ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ ΜΕ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΣΕ ΕΜΒΟΛΙΑ ΓΙΑ ΑΝΘΡΩΠΟΥΣ Ή ΖΩΑ,ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ ΜΕ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΣΕ ΕΜΒΟΛΙΑ ΓΙΑ ΑΝΘΡΩΠΟΥΣ Ή ΖΩΑ,ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ ΜΕ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΣΕ ΕΜΒΟΛΙΑ ΓΙΑ ΑΝΘΡΩΠΟΥΣ Ή ΖΩΑ, ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ ΜΕ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΣΕ ΕΜΒΟΛΙΑ ΓΙΑ ΑΝΘΡΩΠΟΥΣ Ή ΖΩΑ, ΟΙ ΟΠΟΙΕΣ ΕΚΦΡΑΖΟΝΤΑΙ ΑΠΟ ∆ΙΑΓΟΝΙ∆ΙΑΚΑ ΦΥΤΑΟΙ ΟΠΟΙΕΣ ΕΚΦΡΑΖΟΝΤΑΙ ΑΠΟ ∆ΙΑΓΟΝΙ∆ΙΑΚΑ ΦΥΤΑ (3/3)(3/3)

Πηγή της πρωτεΐνης & είδος οργανισμού που αποτελεί στόχο του εμβολίου

Εκφραζόμενη πρωτεΐνη ή πεπτίδιο

Φυτικό σύστημα έκφρασης

Μέγιστο καταγεγραμμένο επίπεδο έκφρασης σε φυτά

Ακεραιότητα, ανοσογονικότητα & προστατευτική ικανότητα του εμβολίου

εμβολίου φυτά

Μεταδοτικός γαστρεντερικός κοροναϊός (χοίροι)

Γλυκοπρωτεΐνη S Arabidopsis 0.06% TSP Ανοσογόνος όταν παρέχεται με ένεση

ΐ S % S ΐΜεταδοτικός γαστρεντερικός κοροναϊός (χοίροι)

Γλυκοπρωτεΐνη S Καπνός 0.20% TSP Ακέραιη πρωτεΐνη και ανοσογόνος όταν παρέχεται με ένεση

Μεταδοτικός γαστρεντερικός

Γλυκοπρωτεΐνη S Αρραβόσιτος <0.01% FW Προστατευτική όταν παρέχεται δια του στόματοςγαστρεντερικός

κοροναϊός (χοίροι)του στόματος

Εναλλακτικές μορφές παροχής ενός εδώδιμου β λί β έ λ ό ήεμβολίου βασισμένου στο καλαμπόκι, παραγωγής της

Prodigene (College Station, TX, USA).

∆ιαγονιδιακοί σπόροι καλαμποκιού που αντιστοιχούν σε μια τυπική δόση1 mg της B υπομονάδος της θερμοασταθούς τοξίνης (Lt B) της E Coli (a)1 mg της B υπομονάδος της θερμοασταθούς τοξίνης (Lt-B) της E. Coli (a),μπορούν να επεξεργασθούν για να παράγουν ένα σνακ καλαμποκιού τηςίδιας μάζας σε ολόκληρη μορφή (b), ή να κλασματοποιηθούν για ναπαράγουν ένα εμβρυακό ή βλαστικό συστατικό στο οποίο το αντιγόνο είναιπαράγουν ένα εμβρυακό ή βλαστικό συστατικό στο οποίο το αντιγόνο είναιπερίπου έξι φορές πιο συγκεντρωμένο (c).

Το ακριβές μέγεθος μιας δοσολογίας εξαρτάται από το επίπεδο έκφρασηςί θώ έ ή λ ύτο οποίο κατορθώνεται με μια συγκεκριμένη γραμμή καλαμποκιού.

“L t f d b di i “Let food be your medicine and medicine be your food.”

Hi t— Hippocrates

ΒιοτεχνολογίαΒιοτεχνολογίαΒιοτεχνολογίατροφίμωνΒιοτεχνολογίατροφίμων

Βελτιωμένη ποιότητα τροφίμων και

ρ φ μρ φ μ

τροφίμων και επεξεργασία τροφίμων

Πιο εύγευστα

Πιο θρεπτικάΠιο θρεπτικά

Πιο καθαρά τρόφιμα

ίδ ή

ATGGGGAGCCAGCAAGACGAACCATCAATTGTACTGTAA|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||TACCCCTCGGTCGTTCTGCTTGGTAGTTAACATGACATT

5’

5’

3’

3’

γονίδιο

TTACAGTACAATTGATGGTTCGTCTTGCTGGCTCCCCAT|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||AATGTCATGTTAACTACCAAGCAGAACGACCGAGGGGTA

5’

5’

3’

3’

γονίδιο αντινοήματος

μεταγραφήμεταγραφή

AUGGGGAGCCAGCAAGACGAACCAUCAAUUGUACUGUAAAUGGGGAGCCAGCAAGACGAACCAUCAAUUGUACUGUAA5’ 3’ UUACAGUACAAUUGAUGGUUCGUCUUGCUGGCUCCCCAU5’ 3’mRNA mRNA αντινοήματος

υβριδισμός

UUACAGUACAAUUGAUGGUUCGUCUUGCUGGCUCCCCAU

AUGGGGAGCCAGCAAGACGAACCAUCAAUUGUACUGUAA|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

5’

5’

3’

3’

Εικ. 10.25 Εικ. 10.25 –– ∆ημιουργία γονιδίου αντινοήματος∆ημιουργία γονιδίου αντινοήματος

730 bp από το 5’

κωδική αλληλουχία του PG5’ 3’

730 bp από το 5άκρο

κλωνοποίηση του τμήματος του γονιδίου PGσε αντίστροφη κατεύθυμση μεταξύ προαγωγέα και ληκτικής ακολουθίας

P35S TnosΑντι-PG

Κλωνοποίηση της δόμησης στο δυαδικό φορέα pBin19

LB

RB

NPTIIpBin19

Εικ. 10.29 Εικ. 10.29 –– ∆όμηση του γονιδίου αντινοήματος ∆όμηση του γονιδίου αντινοήματος λ λ άλ λ ά (PG)(PG)της πολυγαλακτουρονάσης της πολυγαλακτουρονάσης (PG).(PG).

ΑντιΑντι--PGPG τομάτες (δεξιά) και μάρτυρες (αριστερά)τομάτες (δεξιά) και μάρτυρες (αριστερά)

Θρεπτική ΠοιότηταΑντιοξειδωτικές ουσίεςΧημειοπροληπτικοί παράγοντες

∆ιαγονιδιακές τομάτες με αυξημένη γ ς μ ς μ ξημ ησυγκέντρωση φλαβονοειδών

Επίπεδα φλαβονόλης Επίπεδα φλαβονόλης (άθροισμα κερσετίνης και(άθροισμα κερσετίνης και(άθροισμα κερσετίνης και (άθροισμα κερσετίνης και

κεμπφερόλης) στην κεμπφερόλης) στην επιδερμίδα διαγονιδιακών επιδερμίδα διαγονιδιακών

καρπών τομάτας πουκαρπών τομάτας πουκαρπών τομάτας που καρπών τομάτας που περιέχουν το γονίδιο περιέχουν το γονίδιο

ισομεράσης της χαλκόνης ισομεράσης της χαλκόνης ((CHI)CHI) του του P. hybridaP. hybrida

(Muir(Muir et alet al., 2001).., 2001).

Τα φλαβονοειδή εκχυλίστηκαν από ιστούς επιδερμίδας και αναλύθηκαν με HPLC.

Μαύρη στήλη: φυτικές σειρές που τροποποιήθηκαν με πλασμίδιο ελέγχου, μέσος όροςδύο ανεξάρτητων μετρήσεων καρπών από πέντε ανεξάρτητα τροποποιημένα φυτά.

Γκρίζες στήλες: καρποί γενετικά τροποποιημένοι με την αλληλουχία pBBC50 πουΓκρίζες στήλες: καρποί γενετικά τροποποιημένοι με την αλληλουχία pBBC50 πουκωδικοποιεί το CHI του P. Hybrida – κάθε στήλη αντιστοιχεί στο μέσο όρο δύοανεξάρτητων μετρήσεων καρπών από ένα διαγονιδιακό φυτό.

Η γραφική παράσταση αντανακλά τα δεδομένα από την ανάλυση των δέκα υψηλότερωνΗ γραφική παράσταση αντανακλά τα δεδομένα από την ανάλυση των δέκα υψηλότερωνσυσσωρευτών φλαβονόλης.