Baltymų skirstymasy ų y

Chromatografijag jBaltymų elektroforezinis skirstymas

Kapiliarinė elektroforezė SDS/PAGE IzoelektrofokusavimasDvimatė elektroforezė2-DIGE sistema

Kodėl analizuojamas Kodėl analizuojamas proteomasproteomas??

• DNR seka pilnai neatspindi biologinių funkcijų• Vienas genas gali koduoti daugiau negu vieną baltymą

– Genų persitvarkymai– RNR sukirpimas (splicing)– Baltymų modifikacijosy ų j

• Skirtingai nei genomas proteomas nėra fiksuotasSkirtingai nei genomas, proteomas nėra fiksuotas – S kirtumai tarp skirtingų ląstelės tipų– Audinių skirtumaiAudinių skirtumai– Vystymosi stadijų skirtumai– Aplinkos poveikiai– Aplinkos poveikiai

Globali proteomikaGlobali proteomika

Identifikuoti visus esamus baltymusIdentifikuoti visus esamus baltymus

Tikslinė proteomika

Identifikuojama ir tiriama baltymų tam tikra grupė

Tikslinė proteomikaTikslinė proteomika

kiekybiniai pasikeitimai : kiekis

k k bi i i ik iti i t li i ė• kokybiniai pasikeitimai : potransliacinės modifikacijos (PTMs)

• subląstelinės frakcijos : branduoliai, citozolis, membranos, mitochondrijos, citoskeletas.

• funkciniai įvertinimai : baltymų sąveikos

ChromatografijaChromatografijaChromatografijaChromatografija

Chromatography – “color” ir “to write”

Pirmą kartą aprašyta Tswett 1906 metais; metodas augalų p y gpigmento skyrimui per kolonėlę užpildytą CaCO3; pridėjus augalų ekstrakto buvo gautos spalvotos juostelės plaunant k l ėl i i i i ikli ikolonėlę organiniais tirpikliais

Chromatografijos apibrėžimas:

– metodologija įgalinanti atskirti komponentus pagal skirtingą judėjimą dėl skirtingo poliariškumog j j g

– komponentai yra atskiriami dėl skirtingo afiniškumo

Chromatografijoje naudojamų matricų tipaiChromatografijoje naudojamų matricų tipaiChromatografijoje naudojamų matricų tipaiChromatografijoje naudojamų matricų tipai

Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, 2002

Kapiliarinė Elektroforezė (Kapiliarinė Elektroforezė (Capillary electrophoresisCapillary electrophoresis, , CECE))• Išvystyta 1960 kapiliarinė elektroforezė (CE) naudojama keletoje

sričių. • CE rutiniškai naudojama daugelyje ligoninių ir klinikų, ypač tiriant j g yj g ų ų, yp

serumo baltymus ir ligų žymenis.• Skirstymas priklauso nuo krūvio/dydžio santykio.• Puikiai skirsto makromolekules su krūviu (baltymai, nukleino

rūgštys)rūgštys)• Naudojama DNR tyrimuose.

Kapiliarinės elektroforezės privalumai:- didelis efektyvumas – šimtai

komponentų gali būti išskirti tuo pačiu metu,automatizuotas- automatizuotas,

- reikia mažai pavyzdžio,- gali būti naudojamas kiekybiniam

įvertinimui.

Kapiliarinė ElektroforezėKapiliarinė ElektroforezėElektroforezės atskyrimo metodas paremtas dalelių su

krūviu judėjimu elektros lauke. Elektroferograma panaši į chromatogramą. g p į g ą

Metodas vykdomas:Metodas vykdomas:- buferiu užpildytame kapiliare 10 - 100 µm

diametro ir 40 -100 cm ilgio,- kapiliaras patalpinamas tarp dviejų buferio

rezervuarų kuriuose yra elektrodairezervuarų, kuriuose yra elektrodai,- pavyzdys užnešamas i vieną kapiliaro pusę,- tarp dviejų elektrodų 10 -30 kV įtampa,- molekulės registruojamos detektoriumi, kuris

paprastai būna priešingoje kapiliaro pusėje nei užnešamaspaprastai būna priešingoje kapiliaro pusėje nei užnešamas pavyzdys.

Kapiliarinės elektroforezės tipaiKapiliarinės elektroforezės tipaiKapiliarinės elektroforezės tipaiKapiliarinės elektroforezės tipai

K ili i ė l kt f ėK ili i ė l kt f ė•• Kapiliarinė zonų elektroforezėKapiliarinė zonų elektroforezė•• Kapiliarinis Kapiliarinis izoelektrofokusavimasizoelektrofokusavimas•• Kapiliarinė Kapiliarinė SDS elektroforezėSDS elektroforezėpp•• KapiliarinKapiliarinė ė izotakoforezėizotakoforezė•• Ir kt.Ir kt.

KapiliarinKapiliarinės elektroforezės trūkumaiės elektroforezės trūkumaiKapiliarinKapiliarinės elektroforezės trūkumaiės elektroforezės trūkumai

• Kai kurias medžiagas sunku paskirstyti KE.Kai kurias medžiagas sunku paskirstyti KE.• Skirstymo pagerinimui yra modifikuojama buferio sudėtis arba įtampa.

2D2D geliųgelių elektroforezė (2DE IEF/PAGE)elektroforezė (2DE IEF/PAGE)2D 2D gelių gelių elektroforezė (2DE, IEF/PAGE)elektroforezė (2DE, IEF/PAGE)

•Izoelektro fokusavimas (IEF)B l j d l i l k škBaltymas juda pagal savo izoelektro tašką,Baltymas sustoja ties pH, kur baltymo krūvis yra

neutralusneutralus.

•SDS-PAGEbaltymas juda poliakrilamido matriksu pagal

l k li į įmolekulinį svorį.

Mėginio užnešimas ir pasiskirstymasMėginio užnešimas ir pasiskirstymas(I bili t H G di t IPG)(Imobilizuotas pH Gradientas - IPG)

3 10

“S ” t li

“Išbrinkintas”Rehidratacija

“Sausas” strypelis (Drystrip)

Išbrinkintas strypelis(Drystrip)

+ - 3500 V3 10

n n- +

20 h3 10

Pasiskirstymas pagal baltymo Pi

kDa2DE2DE

kDa- 200

96

5 h66

50 MW

40

30

1616

10+

2DE2DE2DE2DE

1 k ti pI1 kryptisPasiskirstymas pagal krūvį(izoelektrinis fokusavimas) pH 3 pH 10

pI

2 k ti2 kryptisPasiskirstymas pagal molekulinį svorį

(SDS-PAGE)kDa

Baltymų analizė: izoelektrinisy ųfokusavimas (skirstymas pagal krūvį)

Izoelektrinio fokusavimo principai

•Izoelektrinis fokusavimas vyksta pH gradiente. H di f j i li f i ė l k lė ( f li i) i či b f i•pH gradientą formuoja specialios amfoterinės molekulės (amfolitai), turinčios buferio

savybes, esančios laidžios ir tirpios jų pI taške. •pH gradientas yra sukuriamas elektros lauko. Prieš elektros lauko sukūrimą gelis turi

i d H t S kū l kt l k i i k ū į t i t f lit i j d li kvienodą pH-vertę. Sukūrus elektros lauką, neigiamą krūvį turintys amfolitai juda link anodo, teigiamą krūvį turintys – link katodo, o jų greitis priklauso nuo bendro krūvio.•Katodo pusėje yra aukštesnis pH nei anodo pusėje.•Amfolitai “išsirikiuoja” tarp katodo ir anodo priklausomai nuo jų pI ir tokiu būdu•Amfolitai išsirikiuoja tarp katodo ir anodo priklausomai nuo jų pI ir tokiu būdu sąlygoja savo aplinkoje atitinkamą pH. Suformuojamas pH gradientas priklausomai nuo naudojamų amfolitų mišinio. •Kadangi amino rūgštys turi amfoterinių savybių ir turi teigiamą krūvį pH kuris yraKadangi amino rūgštys turi amfoterinių savybių ir turi teigiamą krūvį pH, kuris yra žemiau jų pI ir neigiamą – aukščiau jų pI reikšmės, todėl baltymai elektros lauke juda link jų pI. Daugelio baltymų pI yra tarp 5 ir 8,5.

AmfolitaiAmfolitai

• Amfolitai – molekulės, turinčios ir rūgštines, ir bazines grupes, todėl yra amfoterinės.

• Iš graikų kalbos ampho- (αµφί-) reiškia “abu". Dėl šių savybių jos yra zviterjonai tam tikroje pH reikšmėje. y ų j y j j p jpH reikšmė, kurioje bendras krūvis lygus “0” yra molekulės izoelektrinis taškas.

Kas yra IEF?IEF vyksta pH gradiente. Baltymai yra amfoterinės molekulės, turinčios rūgštines ir bazines grupes

Kas yra IEF?

(šoninės grandinės).Bazinėje aplinkoje rūgštinės grupės įgyja neigiamą krūvį.Rūgštinėje aplinkoje bazinės grupės įgyja teigiamą krūvįRūgštinėje aplinkoje bazinės grupės įgyja teigiamą krūvį.Baltymo krūvis yra visų amino rūgščių šoninių grandinių krūvių suma.Izoelektrinis taškas (pI) – tai pH, kuriame baltymo krūvis lygus nuliui.

pH gradiento sukūrimaspH gradiento sukūrimas

A. Klasikinė IEF metodikaf li i k i diAmfolitai sukuria pH gradientą.

B. Moderni IEF metodikaImobilizuotas pH gradientas.

A. Klasikinė IEF metodikaAmfolitai sukuria pH gradientą.

Pirmą kartą pasiūlyta Svensson (1961).Praktikoje tai realizavo Vesterberg (1969). Dirbtinai sukurtas pH gradientas: alifatinių oligoamino-oligokarboksilop g ų g grūgščių izomerų sintezė.

CH2 (CH2)xN (CH2)xN (CH2)xCH2 (CH2)xN (CH2)xN (CH2)x

NR

(CH2)x (CH2)x

R H (CH ) COOH X 2 3NR

(CH2)x (CH2)x

R H (CH ) COOH X 2 3COOHNR2 R = H or (CH2)x-COOH, X=2 or 3COOHNR2 R = H ar (CH2)x-COOH, X=2 ar 3

Sintetiniai amfolitai v.s. natūralūs amfolitaiSintetiniai amfolitai v.s. natūralūs amfolitai

Sintetiniai amfolitai:

Geros buferinės savybės ir geras tirpumas pI taške.Tinkamas elektros laidumas pI taške.Biologinių efektų nebuvimas.Mažas molekulinis svoris.

Natūraliai esantys amfolitai:Amino rūgštys ir peptidai.Neturi savybių, išvardintų aukščiau.Negali būti naudojami IEF.

Amfolitų krūvis

Neigiamą (-) krūvį turintys amfolitaiJuda link anodo (+).Turi grupes -COO-

T i i ( ) k ū į t i t f lit iTeigiamą (+) krūvį turintys amfolitaiJuda link katodo(-).Turi grupes NH3

+Turi grupes NH3

Problemos vykdant tradicinę IEF

1. Ilgas IEF vykdymo laikas. Baltymai šalia jų pI yra mažiau judrūs. Denatūruoti polipeptidai gelyje juda lėčiau nei natyvūs baltymai.

2. Gradiento “šleifas”.pH gradientas tampa nestabilus. p g pBaziniai baltymai išeina iš gelio.

3. Baltymai juda kaip papildomai pridėti amfolitai. Baltymai pakeičia pH gradientą.

B. Moderni IEF metodikaImobilizuotas pH gradientas, IPG

Pirmas pasiūlė Righetti, (1990). Imobilizuotas pH gradientas sukurtas akrilamido junginių (Immobilines) pagalba.(Immobilines) pagalba.Imobilinai yra silpnos rūgštys ar bazės.Bendra struktūra.

CH2 CCN N

H

H

O

CH2 CCN N

HO CH2 CCN N HCH2 CCN N R 2 N

R i k b k il ė

HO

2 N

HO

Ak il idR = amino ar karboksilo grupė Akrilamidas

Komerciniai imobilizuoto pH gradientogeliai (IPG strips)

Pasiūlyti Gorg. A.

Ref: Gorg. A (1994), Westermeier (2001)( )

Geliai gali būti saugomi -20 to -80 C.

Amfolitų pasirinkimo kriterijaiAmfolitų pasirinkimo kriterijai

l k ži dži ki i• Platus pH spektras nežinomų pavyzdžių skirstymui.• Pasirinktų baltymų skirstymas siauruose pH gradientuose.• Koncentracija 2-8%.j

Siauro pH gradiento amfolitų pasirinkimo kriterijai

R li ij i i i• Rezoliucijos pagerinimui• pH gradiento stabilizavimui aukšto ir žemo pH srityse• Siauro pH srityse amfolitai gali būti naudojami kartu su plataus pH

kt f lit ispektro amfolitais• Tačiau naudojant siauro pH spektro amfolitus pasiekiamas geresnis pI

kalibracijos tikslumasSi H di t t j d j i ti t l kt lit i k i i l t• Siauro pH gradiento atveju naudojami tie patys elektrolitai kaip ir plataus pH gradiento atveju

BBaltymųaltymų vizualizavimas 2DE geliuosevizualizavimas 2DE geliuosey ųy ų gg

Dažymas Matomas baltymų kiekisKumasi >75 ngKumasi >75 ngSidabras >5 ngFluorescentiniai dažai >5 ngg

K i Sidabras Fluorescentiniai dažaiKumasi Sidabras Fluorescentiniai dažai

2DE gelių analizė ir baltymo dėmių 2DE gelių analizė ir baltymo dėmių g ų y ųg ų y ųįvertinimasįvertinimas

Vaizdo analizės programinė įranga, pvz. Bio-Rad PDQuestį g , p Q

-Vaizdų palyginimaiVaizdų palyginimai,

-Baltymo dėmių įvertinimas,

Baltymo dėmių-Baltymo dėmių charakterizavimas.

Pasitaikančios klaidos vykdant 2DEPasitaikančios klaidos vykdant 2DEPasitaikančios klaidos vykdant 2DEPasitaikančios klaidos vykdant 2DE

Nesusifokusavęs mėginys

N š hid t i iNešvarus rehidratacinis tirpalas

Pavyzdžio agregacija

Veritkalios juostos dėl polimerizacijos klaidų ir kt.

Kritiniai veiksniai 2DEKritiniai veiksniai 2DEKritiniai veiksniai 2DEKritiniai veiksniai 2DE

Reproduktyvumas: daugiapakopė procedūra – atvira įvairoveip y g p p p

Patikimumas: ypač kokybiniam įvertinimui

Įtikinamumas: naudoja kitus, papildomus metodus

Pavyzdžio paruošimas:Kruopštus, pastovus metodas sąlygoja nepilną baltymo

tirpumą, disagregaciją, denaūraciją ir redukavimą

IEF IEF –– ko vengtiko vengtigg

NaCl < 10 mM SDS < 0.25%

Tris < 50 mM fosfatųTris < 50 mM fosfatų

Nukleino rūgščių lipidų

fenolų netirpių medžiagų

šildymošildymo

ProteomiProteomikoskos eigaeiga

Baltymo išskyrimasBaltymo išskyrimasy yy y

Analizė ir pasirinkimasAnalizė ir pasirinkimas

Baltymo paruošimas proteominei analizei Baltymo paruošimas proteominei analizei (tripsinizacija)(tripsinizacija)p jp j

MasMasių spektrometrijaių spektrometrija

Skaitiniai metodaiSkaitiniai metodai