PATOLOJİ LABORATUVAR PATOLOJİ LABORATUVAR TEKNİKLERİTEKNİKLERİ

Prof. Dr. İhsan YAMANProf. Dr. İhsan YAMANF.Ü. Sağlık Hizmetleri M.Y.O.F.Ü. Sağlık Hizmetleri M.Y.O.

PATOLOJİNİN KONUSU ve METODLARI

• Patoloji hastalıkların nasıl meydana geldiği (ETYOLOJİ ve PATOGENEZ), ne gibi şekil (MORFOLOJİ) ve fonksiyon bozuklukları yaptığı ile uğraşır.

• Özellikle bir morfoloji ilmidir.

Patoloji 2 ana dala ayrılır:

1. ANATOMİK PATOLOJİ 2. CERRAHİ (KLİNİK) PATOLOJİ

ANATOMİK PATOLOJİ de 2’ye ayrılır:1. GENEL PATOLOJİ a. Etyoloji, b. Patogenez, c. Morfoloji, d. Patolojik fonksiyon2. ÖZEL PATOLOJİ: Organ ve sistemlerin

hastalıklarını genel patoloji prensipleri içinde inceler.

METODLARI

1. Patolojinin rutin metodu histoloji metodudur. Doku parçalarından örnekler alınır; rutin

takip ve boya (Hematoksilen - Eozin) (H&E) işlemlerinden sonra ışık mikroskopuyla incelenir. Gerekirse başka histokimya ve immünohistokimya teknikleri uygulanır.

2. Günümüzde hızla gelişen ve yayılan bir metodu da sitolojik incelemelerdir.

Mikroskopik inceleme için canlıdan özel araç ve gereçlerin kullanılarak doku ve hücre örneklerinin alınmasına BİYOPSİ denir. Biyopsinin,

1. İnsizyonel: Lezyonun bir kısmı, 2. Eksizyonel : Lezyonun tamamı, veya

jinekolojideki endometrial küretaj şeklinde 3. Punch (zımba): Deri hastalıklarında derialtı

yağ dokusunu içerecek şekilde, 4. İnce iğne aspirasyonu,

5. Ponksiyon 6. Endoskopik / laparoskopik biyopsi

gibi şekilleri vardır. Bu sonuncular rastgele (kör)

olabileceği gibi, günümüzde daha çok US ve BT eşliğinde kontrollü olarak yapılmaktadır.

7. Otopsi

Patoloji laboratuarı nasıl çalışır?

Patoloji laboratuvarına gönderilen örnekler

• 1- Biyopsiler (insizyonel, eksizyonel, endoskopik, küretaj materyalleri, iğne biyopsileri)

• 2-Operasyon materyalleri (organ rezeksiyonu amputasyon, radikal ameliyatlar)

• 3- Otopsi sırasında alınan örnekler

• 4- Sitolojik materyallerdir

Materyallerin teslim alınma özellikleri:

• Operasyon materyallerinin rezeksiyonu takiben hemen,

• İğne biyopsileri ve endoskopik biyopsiler gibi küçük biyopsilerin fiksatif solüsyonları içinde gönderilmesi önerilir.

Dokular fiksatife konulmaksızın gönderildiğinde;

1- Frozen kesit 2- İmprint3- Fotoğraf çekimi4- Mikrobiyolojik kültür5- Kromozom analizi6- Hücre kültürü7- Elektron mikroskopik inceleme8- İmmünfloresan inceleme

Materyalin gönderilme şekilleri• Materyal ağzı geniş cam, plastik veya metalik

kapta gönderilmeli• Her materyal ile birlikte istek formu

doldurulmalı (materyalin niteliği ve hasta ile ilgili bilgiler)

• Laboratuvara ulaşan materyal hemen numaralanmalı, bilgisayar ve kayıt defterine kayıt edilmelidir

• İstek formundaki bilgiler, materyalin özellikleri ve protokol numarası kontrol edildikten sonra materyal mikroskobik inceleme için örneklemeler yapılmak üzere makroskopi salonuna teslim edilmelidir

Mikroskopik inceleme için gerekli hazırlıklar

• 1- Fiksasyon• 2- Doku takibi (dehidrasyon, şeffaflandırma, sertleştirme)

– Manuel (14-16 saat)– Otomatik (14 saat)

• 3- Bloklama• 4- Kesit• 5- Boyama ve kapatma

Fiksasyon• Amacı; sitoplazmadaki protein, lipid,

karbonhidrat ve diğer maddeleri koagüle ederek, mikroskopik kesit hazırlanıncaya kadar karşılaşacakları reaktiflere karşı dirençli kılmaktır

• İyi bir fiksatif öldürücü, nüfuz edici ve sertleştirici olmalıdır

• Fiksatifin hacmi dokunun hacminin en az 10 katı olmalı ve dokunun her yerine nüfuz edebilmesi için doku kalınlığının 4-5 mm yi geçmemesi gerekir.

• Özel bazı maddelerin korunması için özel fiksatifler gerekebilir.

En sık kullanılan fiksatif %10 lukformalin dir.• 1 hacim formalin + 9 hacim distile su• Fiksasyon hızı saatte 1 mm dirFormalinde fiksasyon hızı,konsantrasyonuna ve ısıya bağlıdır.

Formalinden başka;• 1- Zenker ve B5 fiksatifi (böbrek,

kemik iliği, lenf nodu ve testis)• 2- Carnoy solüsyonu( RNA ve glikojeni

göstermek için)• 3- Bouin solüsyonu (testis

biyopsilerinde)

Doku takibi

• Örneklemesi yapılmış olan dokular ototeknikon da

• formalin- etil alkol- ksilol- parafin serilerinden geçirilir

• Akşam ototeknikona konulmuş dokular ertesi sabah işlemleri bitmiş ve bloklanmaya hazır hale gelmiştir.

Bloklama• Takibi bitmiş doku örneklerinin

mikroskopik incelenebilmesi için uygun sertlikte maddeler içine yerleştirilmesi işlemidir

• Bu amaçla ısıtıldığında akışkan, soğuduğunda sertleşen özelliği olan PARAFİN kullanılır

Kesit işlemi• Bloklama işlemi parafin blokların

mikrotom ile 4 – 6 mikron kalınlığında kesilerek lam üzerine alınmasıdır.

• Bunun için; – Mikrotom-bıçak– Su banyosu– Buz-buzluk– Fırça – Lam

Mikrotom ve kesit alma ;• Mikrotomlar rutin patoloji

laboratuvarlarının vazgeçilmez cihazlarıdır. Günümüzde en sık kullanılan mikrotomlar: parafin dokular için rotary (çarklı) ve kızaklı mikrotom, taze dokular için ise kriyostattır (frozen cihazı)

Mikrotomlar 3 ana yapıdan oluşur.

1. Mikrotom gövdesi

2. Bıçak tutucusu ve bıçak

3. Blok veya materyal tutucusu

Boyama işlemi• Rutin boyalar (HE)• Histokimyasal boyalar (hücresel ürünleri

gösterir, PAS, Alcien –Blue, Retikülin, Masson Trichrom, Van- Gieson, Mason fontana, Oil red, toluidin Blue, ...)

• İmmünhistokimyasal boyalar (doku ve hücrelerin immünoloji ve enzim histokimyası temellerine dayanarak boyanması)

Artefakt

İmmünhistokimyasal boyama (IHC)Patolojide ki kullanım alanları• 1- Farklı tümör tiplerinin ayırıcı tanısında• 2- İmmünopatolojik hastalıkların

tanınmasında (Böbrek ve deri )• 3- Östrojen ve progesteron

reseptörlerinin tespitinde• 4- Enfeksiyonlara yol açan m.o ların

tanınmasın da ( hepatit B virüsü gibi…)

FROZEN KESİT• Dokuların fiksatife konulmadan , vucuttan

çıkarılır çıkarılmaz dondurulup kesilmesi işlemidir.

• 15-20 dakika süren bir işlemdir• Cryostat isimli aletle yapılır (-40 derece)• Likit nitrojen ( -190 derece soğutur ve kas

biyopsilerinde), isopentan soğutmalı likit nitrojen ve aerosol spreylerle de yapılmıştır.– Yağ boyaları

Amaçları;

– Malign tümörlerde operasyonun şeklini belirlemek

– Floresan inceleme– Kas enzim reaksiyonları

DEKALSİFİKASYON• Dokulardan kalsiyum tuzlarının

uzaklaştırılması işlemine dekalsifikasyon denir. Kemikler ve üzerine kalsiyum birikmiş dokular sert oldukları için rutin yöntemlerle kesilemezler. Bu sebeple dokudaki kalsiyumun uzaklaştırılarak dokunun yumuşatılması sağlanmalıdır. Fiksasyonu yapılır, asit solüsyonu içinde 3-4 gün kadar bekletilir. Dekalsifikasyon işlemi süresince solüsyonlar her gün değiştirilmelidir.

• İşlemin tamamlandığı, solüsyonun içinde gaz kabarcıklarının oluşmaması veya dokunun elle bükülebilmesi ile anlaşılır. Bu aşamadan sonra doku, asidin nötralize edilmesi amacıyla %5’lik lityum veya sodyum sülfat içinde bir gece bekletilir. Daha sonra alkol içinde 3-4 saat bırakılır ve akar suda bir gece yıkamaya bırakılır. Bu aşamalardan geçen doku yumuşadıktan sonra diğer dokularla beraber takip işlemlerine hazır hale gelir.

DEKALSİFİKASYON• Kemik gibi sert dokularda dokudan kalsiyumu

uzaklaştırarak dokunun kesit için uygun hale getirilmesi esasına dayanır

• Ortamın sıcaklığı ve dokunun boyutu önemlidir • 3 temel yöntemle yapılır 1-Asitler ile2- İyon değişimi (EDTA) Bir dekalsifikasyon sıvısı

olarak, kalsiyum iyonları ile çözünebilir non–iyonize bileşikler oluşturmak üzere birleşir.

3- Elektriksel iyonizasyon

ASİT DEKALSİFİKASYON SIVILARI

• 1- Nitrik Asit : %5-10• 2- Formik asit : %10• 3-Trikloroasetik asit : %5

Tatmin edici bir dekalsifikasyon sıvısı :

• Kalsiyum tuzlarını tamamen uzaklaştırmalı

• Hücrelerde ve bağ dokusunda az büzülme oluşturmalı

• Boyama reaksiyonlarına zararlı etkilerinin az olması

GENEL HİSTOTEKNOLOJİ

• Histolojik tekniklerin çoğu canlı dokuya en yakın bir biçimde korunmuş veya fikse edilmiş öldürülmüş dokulara uygulanır.

• Ölü dokulardan hazırlanan histolojik preperatların canlı dokulardan daha farklı olduğunu unutmamak gerekir. Bu değişiklikler artifakt olarak adlandırılır.

• Artifaktlar herhangi bir işlem basamağında ortaya çıkabilir. Dokuda en az hasara yol açacak yöntemler kullanılmalıdır.

• Sitolojik ve histolojik çalışmalardaki amaç, organizmayı oluşturan hücre, doku ve organların normale yakın bir şekilde morfolojik olarak mikroskop altında incelenmesidir. Bu da ancak histolojik ve histokimyasal teknikler sayesinde olabilmektedir.

• Preparat hazırlamak için çok teknik vardır. Bunların çoğu değişik tip mikroskoplarda incelenen kesitlerin hazırlanması ile ilgilidir. Tek bir yöntem tek bir boyama yöntemi dokunun ne tüm hücrelerini ne de hücre bileşenlerini ayrıntılı gösteremez. Çok az bir doku örneğinin boyanması ile morfoloji, histokimyasal ve immünolojik yöntemlerle fonksiyonel özellikleri, elektronmikroskopi ile de ince yapı gösterilebilir.

Fiksasyonun amacı hücrelerin ve doku elemanlarının canlı hale yakın bir konumda muhafaza etmektir. Bu yolla ince, boyanmış kesitlerin hazırlanması mümkün olacaktır.

Amaç:• 1- Otolizi ve bakteriyel bozulma ve çürümeyi önlemek veya durdurmak• 2- Kolaylıkla diffüzyon olan maddelerin kaybını önlemek• 3- Kesit hazırlama basamaklarındaki sağlığa zararlı kötü etkilere karşı dokuyu kuvvetlendirmek (Örnek dehidrasyon, şeffaflandırma, parafine gömme gibi)• 4- Dokuyu boyalarla ve diğer reaktiflerle diferensiyel boyamayı kolaylaştıran bir duruma getirmek

• Fiksasyon işlemi fiziksel (ısı, kurutma ve dondurma) ve kimyasal yolla yapılabilir. Isı ile fiksasyon dezavantajları nedeni ile artık uygulanmamaktadır.

• Kurutma ile fiksasyon, kan ve kemik iliği yaymalarında kullanılır. Dondurma ile fiksasyon, lipidler, enzimler ve ameliyat parçalarının hızlı teşhisinde kullanılır. Dondurulan örneklerden dondurma mikrotomu ( Cryostat ) ile kesit alınır.

• Kimyasal fiksasyon en çok kullanılan yöntemdir. Bu yöntemde alınan örnekler ya fiksatife atılır (immersiyon yöntemi ) ya da hayvan anestezi altında iken organı besleyen arter yolu önce serum fizyolojik ardından fiksatif verilerek yapılır (Perfüzyon Yöntemi). Perfüzyondan sonra örnekler alınarak tekrar fiksasyonun tamamlanması için fiksatife atılırlar.

Fiksasyon yapılırken;• Dokunun aşırı derecede sertleşmesine

müsade edilmemelidir. Doku aşırı derecede katılaşacak olursa daha sonraki işlemleri zorlaşır.

• Kaplar yeterli büyüklükte ve düz hatlı olmalı, boğazı ise dar olmamalıdır. Böylelikle örneklerin sonradan çok küçük kavanoza aktarılırken minumum hasar görmesi sağlanır.

• Uzun zaman tespit solusyonunda kalan ve tespit solusyonunun buharlaşması sonucu sertleşen dokulardan tekrar çalışmak istendiğinde bu doku antiformine konarak yumuşatılabilir.

• ANTi FORMİN SOLUSYONU: 1 gr antiformin 5 ml suya konarak yahutta konsantre solusyonun 20 ml'si 80 ml suya konarak hazırlanır. Tamamen kuruyan dokuysa Dimetilsülfoksid (DMSO) içinde yumuşatılarak tekrar çalışır hale getirilebilir.

TESPİT ESNASINDA MEYDANA GELEN HATALAR

a) Doku parçaları iyi tespit edilmemişse, tespit olmamış doku elemanları otolize uğrarlar. Böylece ileride yapılacak işlemlerde beklenen netice alınamaz.

b) Eğer bir fiksatif hazırlanırken formüle iyi dikkat edilmez ve karışımı temin edecek maddeler uygun bir denge sağlayamazlarsa hücrelerde şişme, büzülme ve ayrılmalar meydana gelerek, histolojik detaylar kaybolur.

FİKSATİFLER -TESPİT AJANLARI

A-SIVI TESPİT AJANLARI: • 1-Absolu Alkol: • 2-Soğuk Aseton: • 3-Formaldehit: • 4-Gluter Aldehit: • 5-Trikloro Asetik Asit: • 6-Asetik Asit:

B-KATI TESPİT AJANLARI:

• 1-Civa Klorür (HgCl2): • 2-Potasyum Dikromat: • 3-Kromik Asit: • 4-Pikrik Asit: • 5-Osmiyum Tetroksit:

FİKSATİFLER VE HAZIRLANIŞLARI

1-Mikro-anotomik fiksatifler: Bu fiksatifler doku tabakaları arasındaki bağlantıları ve geniş hücre kümelerinin diğeri ile bağlantılarını tam olarak korumak amaçlandığında kullanılır. Normal ve patolojik histolojinin rutin çalışmalarının çoğu bu tip fiksatiflerle yapılmaktadır.

2-Sitolojik fiksatifler: Hücreyi oluşturan elementleri korumak istendiğinde kullanılırlar. Penetre olma gücü, büyük doku kütleleri ile çalışma yeteneği, kesit almayı veya boyamayı engellememeli.

% 10’luk Formalin• Formalin 100 cc• Çeşme Suyu 900 cc%10'luk Formal Salin• Formalin 100 cc• NaCl 8.5 gr• Çeşme suyu 900 cc%10' luk Tamponlanmış Formalin (pH=7.0)• Formalin 100 cc• Çeşme suyu 900 cc• NaH2P04 : H20 4 gr .• Na2HP04 6.5 gr

• Formalini nötralize etmek için %2'lik kalsiyum asetat birçok araştırıcı tarafından tavsiye edilmiştir. Fakat yumuşak dokularda artifakta benzer alanlar oluşturabilir.

• ALKOL-FORMALİN SOLUSYONU: • Nötralize edilmiş formalin 10 cc • %95 Alkol 90 cc ,

• Bilhassa polisakkaridlerin gösterilmesi için kullanılan

fiksatiflerden biridir.

İMPREGNASYON HIZINI ETKİLEYEN FAKTÖRLER

(Hücre ve dokuların belirli bölgelerinde ağır metal tuzlarının birikmesi)

• 1- Ajitasyon: • 2- Isı: • 3- Viskozite: • 4- Ultrason: • 5- Vakum:

Dehidrasyon Sıvıları• 1-Etanol: • 2-Metil Alkol: • 3-Propan-2-ol,ipopropil • 4-Aseton: • 5-Katı Dehidrantlar:• 6-Kimyasal dehidrasyon

ŞEFFAFLANDIRMA (Clearing) : Uygun şeffaflandırıcı ajanın seçiminde

şunlara dikkat edilmelidir:• 1-Alkolü uzaklaştırma hızı, • 2-Erimiş gömme ortamı ile uzaklaştırılmasının kolaylığı,• 3-Dokulara karşı nezaketi• 4-Yanıcılık,• 5-Toksisite• 6- Fiyat

Şeffaflandıcı Ajanlar• 1-Ksilen• 2-Toluen• 3-Kloroform• 4-Benzen• 5-Karbon tetraklorür• 6-Propilen oksit• 7-Petrol• 8-Karbon disülfit• 9-Amilasetat• 10-Metil benzoate ve metil salisilat• 11-Sedir yağı• 12-Karanfil yağı

GÖMME HATALARI

1. Parafin dokuya nüfuz edememişse, blok iyi kesilemez, kesitler yırtılır veya parçalanır.

2. Parafinin dokuya nüfuzu safhasında sıvı parafinler çok sıcak ise dokuda büzülmelere sebep olurlar.

3. Demir kalıp içine parafin dikkatsizce dökülürse, donmuş blokta parafin kristalleri veya hava kabarcıkları meydana gelir. Kesit alırken parafin ufalanır ve doku parçalanır.

Kesit Alırken Meydana Gelen Hatalar:

1.Mikrotom bıçağı keskin olmazsa bıçakta mevcut olan çentikler yer yer şeritler halinde yırtılma ve ezilmelere sebep olur.

2.Eğer su banyosu çok sıcak olursa parafin erir, doku kesiti gerilir.

3.Su banyosu yeter derecede sıcak değilse kesitler açılamadığından buruşukluklar meydana gelir.

BOYAMA (Staining)

• Boyanmamış preperatlarda çoğu doku elemanları renksizdirler. Değişik kırma indeksine sahip olmaları nedeniyle ışık mikroskobu ile hücresel detayı görmek güçtür.

• Boyalar histokimyasal işlemlerle, dokuların kimyasal reaksiyonlarını ortaya koyar.

• Bazik boya ile boyanan doku elemanları "bazofilik'' asit boya ile boyananlar ise "asidofilik" olarak adlandırılırlar. Bazı doku elemanları bazik, bazıları ise asit boyaları tutmaktadır. Genel olarak kullanılan bazik boyalar doku elemanları ile mavi-mor, asit boyalar ise pembe-kırmızı renk verirler.

• Boyalar sulu bir solusyon içinde anyon ve katyonlara ayrılırlar. Boyaların renk verme kabiliyeti, anyon ve katyonlardaki boya taşıyan organik gruplara bağlıdır. Eğer boya taşıyan grup katyonda ise boya bazik (katyonik), anyonda ise asit (anyonik) bir boyadır.

• Histolojik boyama yöntemleri sıklıkla boya-boyanması ile dokularda renk oluşturmaya dayanmaktadır. Bu; boyanmış doku içinden geçen ışığın dalga boyunu değiştirir. Boya solusyonlarında kullanılan boyalarla dokuların renklendirilmesi, boya yolu ile ışığın absorbsiyonudur. Başarılı boya yöntemleri hem SPESİFİK tir hem de HASSAS tır.

VİTAL BOYAMA (Canlı hücre Boyama)

• Canlı hücreler, boyama sıvılarındaki ayrışma ile (supra-vital boyama) veya canlı organizma içine boyanın enjeksiyonu ile (intra-vital boyama) boyanabilirler. Bu yöntemler, tespit edilmiş dokudan alınan kesitlere uygulanmaz. Vital boyamada önce sitoplazmik yapılar ortaya konur. Canlı hücrelerin çekirdek zarı boyalara geçirgen değildir ve canlı çekirdeği boyamak mümkün değildir.

• Bazı boyama yöntemlerinde, doku kompenentleri ile reaksiyona girip renkli maddeler üretecek soluk veya renksiz solusyonlar kullanılır. Bu reaksiyonların sonunda oluşan renkli ürünler ya gerçek boyalar veya boya olmayan renkli kimyasal ürünlerdir.

• Birinci gruba örnek olarak PAS reaksiyonunda kullanılan Schiff reaktifi ve Feulgen reaksiyonu verilebilir.

• Saman renkli veya renksiz solusyon, dokulardaki aldehitlerin varlığı ile mor renge dönüşür.

• Histokimyasal reaksiyonların ikinci grubu renkli olan fakat bir boya olmayan final ürününe sahiptir. Reaksiyona örnek olarak demirin gösteriminde kullanılan Perls' reaksiyonu verilebilir. Potasyum ferrosiyanid, potasyum ferric ferrosiyanid (prusya mavisi) oluşturmak için demir iyonları ile birleşir (+3 değerlikli Fe). Bu basit bir kimyasal reaksiyondur. Ürün olan Prusya mavisi bir boya değildir ve boya olarak kullanılmaz. Fakat görülebilen, koyu boyanmış çözünmeyen bir birikimdir.

• Bazı metalik bileşikler dokular tarafından opak, genellikle siyah birikinti oluşturarak metalik duruma indirgenebilirler. Kolayca indirgendiğinden ve depo edilmiş gümüş stabil olduğundan Ag(NH3)20H çözeltileri histoloji için çok uygundur. Melanin gibi tyrosin türevleri ve intestinal bezlerin Kultschitzky hücre granüllerinde bulunan fenolik bileşikler, görülebilen birikinti oluşturmak üzere Ag(NH3)2)OH’ı indirgeme kapasitesine sahiptir. Bu tip hücreler arjentaffin hücreler bilinirler.

• (Ag(NH3)2)OH’ ı direkt olarak indirgeyemeyen fakat bunu dışarıdan ilave edilen bir indirgeyicinin eklenmesi ile gerçekleştiren hücreler argirofil hücreler olarak bilinir. Metalik çöktürme aynı zamanda fibrillerin gösterilmesinde kullanılan standart bir yöntemdir.

Histolojide Kullanılan Boyalara-Doğal boyalar b-Yapay (sentetik) • QUİNONOİD ROYALAR:• Asit ve bazik fuksin• Krista1 viyole• Anilin blue• Eozin• Thionin• Metilen blue• Nötral red• Doğal boyalardan hematein ve karminik asit• AZO BOYALAR : Küçük bir boya grubudur .• Orange G• Congo Red• Trypan blue• NİTRQ BOYALAR :En küçük boya grubudur.• Pikrik asit (trinitrofenol) • Aurantia

METAKROMATİK BOYANMA

• Bazı doku kompenentleri boyalarla birleştiklerinde boyanın orijinal renginden ve dokunun diğer bölümünde oluşan renkten farklı bir renk oluştururlar. Bu olay metakromazi olarak adlandırılır. Bu şekilde hareket eden boyalar ise metakromatik olarak adlandırılmaktadır. Metakromatik boyanın rengini değiştirebilen madde ise 'Kromotrop'' olarak bilinir.

• En önemli metakromatik doku kompenentleri kıkırdak, bağ dokusu, epitelyal musin, mast ve bazofil hücre granülleri ve amyloid' tir. Metakromatik olan boyalar esas olarak toluidin blue, thionin gibi thiazinlerdir. Metil viyole de yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu boyalarda kullanılan renk kontrastı mavi-kırmızıdır.

FLORESANS BOYAMA

• Fluorochromlar, asidik veya bazik boyalar olarak hareket eden kromoforlu ve auxokromlu quinonoid boyalardır. Bu boyalar dokularla birleştiklerinde ultraviyole ışığı, görünen ışığa çevirme kapasitesine sahiptirler.

• Flurokrom boya yöntemleri ise doku bileşenlerinin, bakterilerin, fungusların , ağır metallerin gösteriminde, eksfolyatif sitolojide malign hücrelerin tanınmasında rutin olarak kullanılmaktadır. Floresans mikroskopi, dokulardaki ve serumlardaki antijen ve antikorların gösteriminde kullanılan immüno floresan tekniklerin temelini oluşturmaktadır.

• İki tip floresan vardır:• 1-Primer Floresans (doğal-otofloresans):

Vitamin A, riboflavin, porfirin, kloroplast gibi biyolojik materyelin kendi özelliğidir. Dokular, genel mavi floresansa sahip olabilirler ve bu elastik fibrillerde kuvvetlidir. Civa, demir ve iodine gibi bazı maddeler doğal floresansı ortadan kaldırır.

• 2-Sekonder Floresans (yapay-indüklenmiş): Doğal floresans olmayan maddelerin acridin orange, auramine, thioflavine-T vb bir flurokrom boya ile etkileşimden sonra ortaya çıkar.

TESPİT EDİLMİŞ DOKULARI BOYAMADAKİ GENEL FAKTÖRLER

• 1-Fiksasyonun Boyama Üzerine Etkileri: • 2-Progressif ve Regressif Boyama: • 3- Direkt ve İndirekt Boyama: • 4-Differansiyasyon:

HEMATOXYLİN-EOZİN BOYASI (H&E)

• Histolojik preparasyonlar için ençok kullanılan boyalar hemotaxylin ve eosin boyalarıdır. Buna kısaca H.E. boyası denir.

• Hemotoxylin bazik bir boya olarak kabul edilirse de kendisi bizzat boya değildir. Boya olarak tesir etmesi için zincirlerinden birinde bulunan guioid' in hematein' e okside olması lazımdır.

Mikroteknikten hemateinle mordant olarak

kullanılan maddeler

• Potasyum alum : K2S04Al2 (SO4)3 24 H2O

• Ammonium alum : (NH4)2 SO4'A12 (SO4)324 H2O

• Demir alum : (NH4)2SO4 Fe2(SO4)324 H20 dur.

Eosin: Eosin, fluorescein' in tetra broma türevidir. Zayıf asidik anyonik bir boyadır. Hemataxylin-Eosin boyası ile hücre ve doku elemanları aşağıda gösterildiği gibi boyanır.

• Çekirdek Mavi,siyah ve koyu mavi• Sitoplazma Pembe• Eritrositler Kırmızı• Kas Kırmızı• Fibröz Doku Açık pembe• Kıkırdak Açıktan koyu maviye kadar renk

tonlarında• Mükoz Mavimtrak ( metakromatik)• Kalsifiye Doku Koyu mavi• Protein çökelekleri Pembe (ödem sıvısı)• Bakteri toplulukları Koyu mavi

BAĞ DOKUSU BOYALARI

Kollajen Fibrillerin Gösterimi• a-Van Gieson Boyası: • b-Masson’ un trikrom boyası: • c-Mallory boyası: • d-Gomori’ nin hızlı tek basamaklı trikrom boyası:

Retiküler Bağ Dokusu ve Retiküler Fibrillerin Gösterimi

• Retiküler bağ dokusu, lenforetiküler ve miyeloretiküler sistem gibi hücreden zengin dokuları ve organları ince dallarıyla destekleyen retiküler fibrillerden oluşmaktadır. H-E ile gösterilemezken, bazıları Masson' un trikrom yöntemi ve benzer yöntemlerle gösterilebilirler. Tam olarak gösterilebilmeleri için gümüş çöktürme yöntemleri uygulanmalıdır.

a.Gordon ve Sweets' in Retikülin Yöntemi: Retiküler fibriller siyah, kollajen ve sitoplazma kahverengi-sarı boyanır.

b.Gomori' nin Retikülin Yöntemi: Retiküler fibril siyah; kollajen koyu grimsi-mor

c.Nassar ve Shanklin' in retikülin yöntemi: Retiküler fibriller siyah, kollajen grimsi boyanır.

Elastik Liflerin Gösterimi

• a.Verhoeff' un elastik lif boyası: • b.Orcein: • c-Weigert’in Resorcin Fuksin Boyası: • d-Aldehit fuksin yöntemi:

KARBONHİDRATLARIN GÖSTERİMİ

• Dokularda karbonhidratları içeren bileşikler bulunmaktadır. Bunlar homopolisakkaritler (glikojen, nişasta ve sellüloz) veya heteropolisakkaritlerdir

(glikozaminoglikanlar, glikoproteinler, proteoglikanlar proteoglikan aggregatları ve glikolipidler).

Karbohidratların ve Polisakkaritlerin Boyanma Reaksiyonları

• Periyodik Asit Schiff reaksiyonu • Alcian blue • Azur A ve thionin gibi metakromatik

boyalar • Best carmin ve iodine

LİPİDLERİN GÖSTERİMİ

Lipidleri Boyama Yöntemleri• A-Yağda Çözünür Boyalar: • 1-Sudan III• 2-Sudan IV( daha siyah) • 3-Sudan Black B (en hassası) • 4-Oil red O Ençok kullanılan yöntem ise: Oil red 0-trietil

fosfat yöntemidir.

• B-Floresans Mikroskopi; Primer floresans, lipofuksinler olarak bilinen lipidlerin oksidasyon ürünleri ve lipidlerde çözünen carotonoid pig­mentler tarafından oluşturulur. Sekonder floresana, lipidlerde çözünen fluorokrom ( örneğin fosfin 3R ) ca gösterilir.

• C-Osmiyum tetroksit: Osmiyumun indirgeme mekanizması tam anlaşılamamıştır. Lipidler için bu pahalı ve hoş olmayan reaktif , dejenere miyelinin gös­terilmesi için özellikle uygundur.

• D-Kolesterol gösterim yöntemleri

• E-Fosfolipidlerin gösterim yöntemleri• a-Baker' in asit hematein yöntemi• b-Plasmal reaksiyon (Feulgen ve Voit, 1924)• c-PAS yöntemi: Karbohidrat içeren lipidlerin

(cerebrosidler ve gangliosidler) ve aynı zamanda aldehit içeren doymamış lipidlerin ve fosfolipidlerin gösteriminde kullanılır.

• F-Asidik lipidler için yöntemler• a-Nötral ve asidik lipidler için Nile blue yöntemi• b-Feyrter' in inklüzyon yöntemi

SİTOPATOLOJİ• Sitopatolojik analizi yapılacak olan materyal

dokulardan kendiliğinden dökülen hücrelerin, bir araç yardımıyla alınması şeklinde elde edilebileceği gibi, iğne biyopsisi ve ince iğne aspirasyon biyopsisi (İİAB) gibi yöntemlerle de insan vücudundan alınabilir. Elde edilen materyalin lam üzerine yayılması ile yayma preparat hazırlanmış olur.

SİTOPATOLOJİ Sitoloji; hücrenin normal görünüşü dışındaki sapmaları Sitoloji; hücrenin normal görünüşü dışındaki sapmaları incelerinceler İlk kez 1928 de ABD de Dr George İlk kez 1928 de ABD de Dr George PapanicalaouPapanicalaou veve Romanya da Dr Aurel Babes tarafından serviks Romanya da Dr Aurel Babes tarafından serviks eksfolyatif sitolojisinde eksfolyatif sitolojisinde Dr Dr Papanicalaou,Papanicalaou, PAPPAP tarama testini ilk kez kullanmış vetarama testini ilk kez kullanmış ve 1947 yılında dünya çapında 70 patoloğun katıldığı kursu1947 yılında dünya çapında 70 patoloğun katıldığı kursu düzenlemişdüzenlemiş Türkiye den bu kursa Türkiye den bu kursa Prof Dr Osman Nuri AKER Prof Dr Osman Nuri AKER katılmışkatılmış

• 1980 li yıllardan beri sitoloji yerine sitopatoloji terimi tercih edilir

• AMACI, hasta için minimal morbidite, güvenilir, hızlı, ekonomik tanı vermek

Uygulama Alanları

• Neoplazi tanısı ve taramasında• Tümör tipinin tanınması ve tedavinin

yönlendirilmesi• Rezidüel lezyon ve inkomplet eksizyon

tanısı• Prognoz tayini ve takip

• İnflamatuvar lezyon tanısı ve etken mikro organizma tanısı

• Jinekolojik sitolojik hormonal değerlendirme

• Baş-boyun (tiroid, meme…) bölgesi kistik lezyonların tedavisi

Sitolojik Materyal Tipleri

1- Eksfolyasyon(dış ortamla bağlantısı olan ve organ kavitesinden kendiliğinden dökülme)2- Ulaşılabilen yüzeylerden mekanik bası ile örnekleme

– Lavaj (yıkama, aspirasyon, parasentez)– Fırçalama (gis, akciğer, üriner trakt)

3- Ulaşılabilen kitlelerden direkt, derindeki organlardan görüntüleme yöntemleri ile İnce İğne Aspirasyon Sitolojisi (İİAS) ve sürüntü4- İntraoperatif konsültasyon için İİAS

Eksfolyatif Sitoloji1- Kadın-Genital Sistem2- Solunum Sistemi3- Vücut boşlukları sitolojisi Kadın Genital Sistem, 1943 yılında Papanicalou

ve Traut tarafından tanımlanmıştır• PAP testi serviks CA nın erken tanısında

tarama testi olarak kullanılır• Sıklıkla uterus serviksi ve vajen, daha az

sıklıkla tuba ve overlere ait, serviks posterior forniksine dökülmüş hücrelerin lam üzerine yayılması

• PAP testi serviks CA nın erken tanısında tarama testi olarak kullanılır

• Sıklıkla uterus serviksi ve vajen, daha az sıklıkla tuba ve overlere ait, serviks posterior forniksine dökülmüş hücrelerin lam üzerine yayılması

• Temel görev, preinvaziv ve invaziv serviks CA nun tanısında tarama testi olarak

• Bunun dışında– Benign atipi çeşitleri– İnflamatuvar değişiklik– Enfeksiyöz m.o– Endokrin durum– Neoplazm

• Yeterlilik, iyi korunmuş ve iyi görüntülenen skuamoz hücrelerin lam üzerindeki hücrelererin %10 nundan fazlası

• Yeterli endoservikal/transformasyon zon komponenti (herbiri en az 5 adet endoservikal hücre veya skuamoz metaplastik hücre içeren 2 hücre grubu

Solunum Sistemi • 3 farklı materyal • (balgam, bronşial yıkama/fırçalama ve BAL)• Tek bir balgamla tanı %61, 3 balgamda %89• Santral yerleşimli ve büyük çaplı kitlelerin

tanısında yardımcı• Derin öksürtülerek alınan ve alt solunum

yollarına ait hücreler içeren balgam yeterlidir

• Saccomanno fiksatifinde 3 günlük toplanan balgam örneği, kanser tarama ya da tanısında eşit derecede etkilidir. Tespitsiz olarak 24 saat beklemiş balgam örneği, sitopatolojik değerlendirme için uygun değildir.

• Bir balgam örneği, alveolar makrofajları içerdiği zaman tanı vermek için 'yeterli' kabul edilir

Bronşiyal Fırçalamalar (BF)• İşlem sonrasında bronkoskoptan ayrılan fırça

doğrudan lama döndürülerek-sürülür ve lama yayılan hücreler ile salgılar, Papanicolaou boyanmak üzere %95'lik alkolle tespit edilir ya da

• Wright-Giemsa ile boyanmak üzere havada kurutulur. Her bir tespit ve boyama sürecinin kendine özgü artefaktları vardır.

Eğer ortamda yayma hazırlamak üzere lam bulunmuyorsa;

• fırça doğrudan serum fizyolojik kabına/ dengelenmiş tuz solüsyonuna yerleştirilir ve kap kuvvetle sallanarak hücrelerin sıvıya dökülmesi sağlanır.

• Dökülmüş hücreleri içeren bu sıvı örneği, milipor filtrasyonu ya da sitosantrifüj işlemi için laboratuvara gönderilir.

Koyu nükleus ve dar sitoplazmaları ile reserv hücre grubu. Zeminde olağan bronş epitel kümeleri. Bronş fırçalama, MGG.

Bronşiyal Yıkamalar ve Bronkoalveolar Lavaj

• Bronş yıkamalar (BY) ve BAL, havayolları ve periferik alveolar boşluklardan dökülmüş (eksfoliye olmuş) hücrelerin varlığına dayanmakta olup; lezyona odaklanmış materyaller değildir.

• BY, bronkoskopun tepesine uygulanmış serum fizyolojik solüsyonunun aspirasyonu ile elde edilir. Bu nedenle bronşiyal epitel hücreleri, makrofajlar, değişen oranlarda yangısal hücreler ve mukusdan oluşan içeriği hücreden oldukça zengindir. Ancak küçük hacimli materyal örneği olması nedeniyle öncelikle sitopatolojik değerlendirmeler ve kültür olmak üzere sınırlı sayıda inceleme yapılabilmektedir.

• Sitopatolojik inceleme için bronşiyal yıkama yaymaları ve sitosantrifüj lamları havada kurutulup MGG ile boyanabilir veya ABD'de daha sık uygulandığı gibi; eşit hacimde, Saccomanno fiksatifi (%2 carbowax ve %50 etil alkol) veya %50'lik etil alkolle karıştırılır.

BAL Sıvısının Sitopatolojik Analizi: • BAL sıvısı hiç bekletilmeden laboratuvara

ulaştırılmalıdır, çünkü serum fizyolojik içersinde hücreler canlılıklarını uzun süre koruyamazlar.

• Laboratuvarda 4°C'ye yerleştirilen lavaj sıvısının volümü ölçülür. Oda sıcaklığında 1 saatten daha uzun süre bekletilecek olan sıvılar, buz içinde ya da buzdolabında veya HEPES tamponu içeren vasatlar içerisinde saklanmalıdır.

• BAL materyalinden elle hazırlanan yayma veya santrifüjle hazırlanmış preperatlar, havada kurutulup May-Grünvvald-Giemsa boyası ile veya alkol fıksasyonunu takiben PAP ile boyanır

• Ancak gerektiğinde; Ziehl-Nielson ya da PUTT -ARB (tüberküloz için), PAS (tümör için), Perl's (hemosiderin için), Gomori-Grocott (aspergillus ve diğer mantarlar için) boyalan ile histokimyasal olarak incelenebilir.

Vücut Boşlukları Sitolojisi• Seröz membranları nemli tutan sıvı

miktarının artışına EFFÜZYON denir.– Seröz boşlukların efüzyon sitolojisi– BOS– İdrar– Eklem sıvısı

• Primer amaç, malignitenin saptanması• Yetersizliğin nedeni, hücresel komponentin

azlığı ve hücrelerin kan-artıklar ile maskelenmesi

• Efüzyon: konjestiv kalp yetmezliğinde gözlenen, fizyolojik -mekanik faktörlere bağlı gelişen transüdat niteliğinde olabileceği gibi; inflamasyon veya tümör gibi seröz membranlarda incinmeye yol açan durumlarda eksüda niteliğindedir. Malign efüzyonların çoğu eksüdat niteliğin­dedir.

• Effüzyon;– Transudat (fizyolojik-mekanik)– Eksudat (iltihap-tümör)

• Malign plevral effüzyon;AKC/MEME/GİS//MEZOTELYOMA/

LENFOMA• Malign Peritoneal effüzyon

– OVER/ MEME/ GİS– Malign perikardial effüzyon– AKC/ MEME/ LENFOMA/ SARKOM/

MEZOTELYOMA

İnce İğne Aspirasyon Sitolojisi• Enjektör ucuna ortalama 22 guage iğneler

takılarak, bir dokudan iğnenin keskin ucu ve emme-basma hareketlerinin oluşturduğu negatif basınç ile hücre kopartma ve bu hücreleri lama yayarak değerlendirme işlemi

• İlk kez 1883 de Leyden akciğer dokusunda m.o ları görüntülemek için

• 1886 da Menetrier AKC CA tanısı için

• 1970 de güncelleşmiş• 1980 de core biyopsisi alternatif

olarak çıkmış

• 1- doğru yerden yeterli sayıda hücre alma• 2- Örneklenen hücrelerden hazırlanan

preparatın kalitesi

• İki koşul sağlandığında İİAS ile doğruluk oranı %90-95

• Raporda;– Benign– Şüpheli, muhtemelen benign– Şüpheli, muhtemelen malign– Malign

• İnce iğne aspirasyon tekniğinde aşağıdaki hususlara özen gösterilmesi gerekmektedir:

• İğne hastadan çıkarıldıktan sonra;• -İğneyi şırıngadan ayırın,• -Şırıngayı havayla doldurun• -İğneyi tekrar şırıngaya takın• -Enjektörün ucunu tutun• -İğne ucunu lama değdirin• -Hazne içindeki materyalin tümünü lamlara püskür­

tün, aspire materyalin görünümünü not edin. İdeal bir aspirasyon materyali, az miktarda sıvı içeren, krema kıvamında, kısmen granüler nitelikte ve iğne lümeni içerisinde kalan materyaldir.

• Yayma lamlarını hazırlayın,• -Lamlara kuru ya da yaş fiksasyon uygulayın,

yaş fiksasyon öncesi lamların bekleme süresi 10 saniyeyi geç­memelidir.

• - Mikrobiyolojik kültür ve sitosantrifüj işlemi uygula­nacaksa iğne doğrudan kültür ya da sitopatoloji fiksatifinde yıkanabilir.

• - İğne, enjektör ve kullanılmayan lamları biyolojik a-tıklar için olan özel çöp torbaları ve kutularına atarak or­tamdan uzaklaştırın.

Yaymaların Hazırlanması

• İnce iğne aspirasyon işleminde ustalaşma sürecinin ilk basamağı iyi bir yayma hazırlamayı öğrenmektir. Uluslara­rası merkezlerde ince iğne için eğitilen - uzmanlık alanı ve kıdemi ne olursa olsun -tüm hekimlere öncelikle yayma hazırlama ve fiksasyon konusunda teorik ve pratik öğretim programı uygulanmaktadır.

• Çünkü aspirasyon işlemi ne kadar mükemmel yapılmış, mikroskopide değerlendiren hekim ne kadar donanımlı olursa olsun iyi bir yaymaya dönüştürülememiş aspirasyon materyali zaman ve maliyet kaybından başka bir şey değildir.

• Sitoloji laboratuvarlarmda kullanılan standart lam 75 mm. x 25 mm. boyutlarında ve tercihan bir ya da iki kenan buzlu (rodajlı) olanlardır. Lamlar temiz ve kuru olmalıdır. Aspirasyona başlamadan önce, hastanın yanıbaşında iken, kurşun kalemle lamların üst taraf buzlu uçlanna hastanın adı ve soyadının baş harfleri ile aspirasyon bölgesinin ismi kaydedilmelidir. Bu kayıt, hem farklı hastaların materyalle­rinin karışmasını önleyecek hem de boyanma sonrasında lamelin, doğru lam yüzeyine kapatılmasına kılavuzluk ede­cektir. Kontaminasyonun önlenmesi için havada kurutulan preperatlarm çelik preperat taşıyıcılarda taşınması önerilir.

• İmmünohistokimyasal boyama düşünülen olgularda tüm yüzeyi buzlu olan lamlar ya da alum, albümin ve polilizinli lamlar tercih edilebilir.

• Aspirasyon materyali direkt olarak ya da bazı işlemle­rin ardından indirekt olarak yayılır. Yaymalar hazırlanır­ken, materyale aşırı basınç uygulanırsa ezilme artefaktları oluşur; bu nedenle yayma işlemi, nazik fakat sabit bir basınçla gerçekleştirilmelidir.

• Hücrelerin morfolojilerim iyi koruması için, yaymaların hızlı bir şekilde kurumaları gereklidir. Bu nedenle elde salla­ma ya da sıcak üfleme gibi yöntemler uygulanabilmektedir.

• Ancak kuruma süresini belirleyen en önemli faktör, materyalin ince ve düzgün bir tabaka halinde yayılabilmesidir. Kuruma işlemi yavaş olursa, artefaktlar artar.

• Sitopatolog, aspirasyon materyalinin makroskobik görünümüne göre lamların havada kurutma ya da yaş fiksasyon olacağına karar verir. Alkol fiksasyonu ile hazırlanmış yaymalar, aspirat özellikle nekrotik materyal, kist sıvısından materyal ya da skuamöz hücreli karsinom içerdiği zaman yararlıdır.

• Yayma hazırlandıktan sonra 10 saniye içinde %95'lik alkol ya da uygun bir sprey fiksatif ile tesbit edilir. Alkolde fikse edilen yaymalar Papanicolou, H.E ya da sitokimyasal boyalarla boyanabilir. Havada kurumaya bırakılan lamlar Giemsa türevi (MayGrünvvaldGiemsa, Senner-Giemsa, Wright, Diff-Ouick) bir boyayla boyanır.

• Uluslararası deneyimlerde, iki tekniğin birbirini tamamladığı ve birlikte kullanımının en ideali olduğu unutulmamalıdır. Benzer şekilde çok merkezli çalışmalar göstermektedir ki; materyalden çok sayıda lam hazırlana-madığı sınırlayıcı durumlarda tercih edilecek boya: eksfolyatif sitolojide PAP, İİA'da MGG'dir. Bu deneyime paralel olarak, sitopatoloji laboratuvarmda boya alışkanlı­ğını değiştirmek eğitimi gerektirmektedir .

• Papanicolaou içindeki hematoksilen nükleus boyası olup kromatin ile nükleer membranları mavi-mora; nükleolü kırmızı, pembe ya da oranj renge boyar. Zıt boya­lar sitoplazmada mevcut bazı özellikleri belirginleştirir ve nükleus ile kontrastlığı sağlar. Zıt boyalardan Orange G, keratinin mevcudiyetinde, sitoplazmayı sarı ya da oranj renge boyar. Kullanımı giderek azalan Bismarck kahveren­gisi ile glikojen, keratohyalin granüller ve bazı mantarlarda kahverengi boyanma gözlenir.

• İmmünositokimya çalışılacak preperatlarda havada ku­rutulmuş lizinli lamlar buzdolabına- +4 dereceye- 1 hafta süre ile bırakılabilir. İmmün boya işleminden önce 10 dakika süre ile -20 derecede soğutulmuş (derin buzlukta bekletilmiş ase­ton solüsyonunda bekletilmesi yeterlidir. İmmün boya işle­minin diğer basamaklan doku kesitleri ile aynıdır

Sitolojik Materyallerin Fiksasyonu

• 1- Eksfolyatif sitoloji materyalleri,• A- Vajinal sitoloji preparatları, • İdeali hemen laboratuvara

gönderilmesi

• Bu sağlanamıyor ise en az %70 lik, ideali %95’lik etil alkol de 30 dakika tutup, havada kurutmak

• Özel fiksatif spreyi püskürtmek• Hiçbirşey yok ise saç spreyi ve kolonya

ile

• B- Seröz boşluklar, balgam, bronş, idrar• İdeali alındıktan hemen sonra 1-2 saat

içerisinde lab. Göndermek• Hemen gönderilemiyor ise eşit miktarda

%50 lik alkol ilave edilmeli• Her iki şartta sağlanamıyor ise ,

buzdolabı kapağının iç rafında, yarım günü geçmeyecek şekilde bekletilebilinir

Boya Yöntemleri• Alkol fiksayonlu preparatlarda

– PAP– Hematoksilen-eozin– Sitokimyasal– İmmünohistokimyasal

• Havada kurutulan preparatlarda– Giemza türevleri ( MGG, Wright, Diff-Quick)

• Nükleer özellikleri en iyi gösteren boya PAP

• Sitoplazmik özellikler, zemin özellikleri ve sekresyonları en iyi şekilde gösteren boya ise Giemza türevleridir

• İdeal olanı, PAP ve Giemza türevi boyaları birlikte kullanılmalı ve değerlendirilmelidir

Sitolojik tanıda etken olan özellikler

• 1- Nükleus morfolojisi• 2- Sitoplazmik özellikler• 3- Yapısal patern

• Normal/ Reaktif/ Dejenere/ Displastik/ Neoplastik

Sitolojide Malignite Kriterleri• 1- Nükleer özellikler

– Kromatin paterni– Nükleer membran– Nükleol– Mitotik aktivite

• 2- Sitoplazmik özellikler– Sitoplazma miktarının azalması (N/S oranını )↑– Anormal matürasyon ve differensiasyon

• 3- Nükleus-sitoplazma ilişkisi– N/S oranı– Nükleus organizasyon polarizasyonu

• 4- Hücreler arası ilişkiler– Pleomorfizm– Molding (hücrelerin birbirine bakan

yüzlerinin düzleşmesi)– Kalabalıklaşma ve üst üste binme– Yapısal patern (asini, papilla, rozet, morul)

• 5- Zemin özellikleri– Temiz zemin (intraepitelyal lezyon ve

metastatik CA)– Kirli zemin (nekroz, inflamasyon ve eski

kanama ie oluşur ve invaziv CA bulgusu)

SIVI BAZLI SİTOLOJİ YÖNTEMLERİ

SİTOSANTRFÜJ METHODU

ÖZEL KORUYUCU SIVI İÇERİSİNDE DAĞILMIŞ HÜCRELERİ ÖZEL BİR SANTRFÜJ FUNNILI VE SEDİMANTASYON YOLU İLE SLİDE ‘A AKTARIR.

GYNO-PREP - SİTOSANTRFÜJ TEKNİĞİ

JİNEKOLOJİK SİTOLOJİ

Normal Cervix:

Vaginal Speculum

Ayers Spatula

• Concave end to fit the cervix

• Convex end for vaginal wall and vaginal pool scrapings

cervix

Body of the uterus

Fundus of the uterus

The uterus

Uterus is lined by simple columnar ciliated cells

Cytobrush

• Insert ~ 2 cm (until brush is fully inside canal)

• Rotate only 180 degrees (otherwise will cause bleeding)

Cervical – vaginal smears

• Several possibilities– Cervical scrape taken from the

squamo-columnar junction; the level of the SC junction varies with sexual maturity

– Posterior fornix aspiration

– Lateral vaginal wall [upper third] scrape

Taking the Sample

Make Pap Smear• As thin as possible

• Properly labeled

Spray with Fixative

• Within1 0-15

seconds

• Allow to fully dry

before packaging

• Cytologic Fixative

Normal Cervix

SUPER F INTERM BASAL

Squamo-columnar junction

Chronic Cervicitis:

Cervical HPV infection:

PAP Smear dysplasia:

Carcinoma Cervix:

PAP Smear Carcinoma:

SİTOLOJİK MALİGNİTE KRİTERLERİNÜKLEUSTAKİ MALİGNİTE KRİTERLERİ

  • Anizonükleoz: Nükleusların büyüklük,şekil,sayı ve boyanma özelliği açısından farklılık göstermesi.  • Nükleus şeklinin değişimi: Çoğunlukla lobule görülürler.  • Nükleus sitoplazma oranı: Nükleus hücrede daha fazla yer kaplar. Böylece oranı bozulur.   • Mitoz ve çok sayıda nükleus   • Nükleus nükleolus oranı: Nükleolus büyür ve birden fazla olur (redüplikasyon).

• Anizokromazi: Normal nükleuslarda kromatik

muntazam dağılmış,düzgün,ince granüller halindedir.

Dolayısıyla homojen boyanır. Habis hücrelerde

kromatin kümeleri çeşitli hacim ve biçimde bulunur,bu

da boyanan kromatinin kaba ve gayrimuntazam

görünümüne neden olur. Habis hücreler çoğu zaman

artmış kromatinden ve kromatinin içinde bulunan

değişik DNA yapısından dolayı hiperkromatik boyanır.

Bazen de boya almayan bölgeler gösterir.

SİTOPLAZMADAKİ MALİGNİTE KRİTERLERİ

  • Anizositozis: Hücreler büyüklük ve şekil açısından farklılık gösterir (acayip şekilli hücreler,dev hücreler).  • Boyama özelliğinin değişimi: Örneğin habis parabazal hücre,kırmızımtrak mavi boyanır. 

 • Hücrede lizis görülmesi: Sitoplazma erir, kaybolur, çıplak nükleuslar görülür.  • Fagositoz özelliğinin ortaya çıkması Sitoplazmada yukarıdaki değişimler iltihabi ve dejeneratif (radyoterapi) nedenlerle de olabilir. Bunlar atipik değil normal hücrelerdir. Displazi terimi,doku düzeyinde anarşiyi ifade eder.

Spekulum

Smear fırçaları

Vaginal smear

Vaginal smear

SİTOLOJİK TARAMA

Önceki yıllarda kanser taraması amacıyla,vaginal smearler için başlangıç zamanı 35 yaş olarak kabul ediliyordu. Ancak son yıllarda serviks kanseri için ortalama yaşın giderek küçülmeye başlaması ile sitolojik taramaya başlangıç için yeni görüşler ortaya atılmıştır. 1988 yılında Amerika Kanser Derneği tarafından vaginal smearıin ne zaman yapılmaya başlaması ve ne sıklıkla yapılması gerektiği bildirilmiştir. Buna göre: Amerikan toplumunda cinsel ilişki başlangıç yaşı erken olduğu için smear almaya 18 yaşında başlanması önerilmektedir.

Kadınlar yüksek ve düşük riskli olmak üzere 2 grupta toplanmaktadır. Yüksek riskli gruba,cinsel ilişkiye çok erken yaşta başlayan birden fazla partneri bulunan, anamnezinde DES olan ve sigara içen kadınlar girmektedir. Düşük riskli grupta ise tek partner ile cinsel ilişkide bulunanlar yer almaktadır.Yüksek riskli grupta her yıl,düşük riskli grupta ise 3 yıl arka arkaya negatif sonuç elde edilmişse,daha sonra 3 yıl arayla smear tekrarı önerilmektedir. Histerektomi operasyonu geçirmiş kadınlarda ise 3 yıl arayla smear tekrarlanmalıdır.

SMEAR TESTİSmear testi rahim ağzını (serviks) değerlendirmek ve hem enfeksiyonlar hem de kanser- kanser öncüsü durumlar açısından kontrol etmek için kadınlara yapılan özel bir rahim ağzı tarama testidir.

• Smear testi ('Smir' olarak okunur) ; (rahim ağzından) cam üstüne ince yayma,  rahim ağzından sürüntü alma, CVS (Cervico- vaginal smear testi), PAP testi veya  PAP smear testi gibi isimlerle de anılmaktadır.

• Smear (smir) alınması son derece basit ve ağrısız bir yöntemdir. Jinekolojik muayene esnasında vajinaya "spekulum" denilen bir alet takıldıktan sonra serviks görülür hale getirilir.

• Herhangi bir kanama olmadığından emin olunduktan sonra plastik bir "spatul" ya da "smear fırçası" vasıtası ile serviksten vajinaya dökülen hücreler toplanır. Ayrıca yine bu fırça vasıtası ile rahim ağzından bir sürüntü alınır.

• Alınan bu materyal bir "lam" adı verilen cam üzerine ince şekilde yayılarak alkol veya saç spreyi sıkılarak sabitlenir (fiske edilir). Buna "ince yayma" adı verilir.

DİKKAT• Fiksasyonun örnek alındıktan hemen

sonra yapılmaması hücresel şekillerin bozulmasına ve kurumasına yol açar. Bu da değerlendirmede hatalara neden olabilir.

• Serviks kanserleri (rahim ağzı kanserleri)  açısından yüksek riskli grup;

Sigara kullananlarPoligamik (çok eşli) kadınlar, VEYA partnerleri çok eşli olan kadınlarİlk cinsel tecrübesini genç yaşlarda yaşayanlarHuman Papilloma Virus (HPV) enfeksiyonu taşıyanlarDoğum kontrol hapı  kullananlardır.

• İLK TARAMA 18 yaşında veya cinsel aktivitenin başlangıcında Yüksek risk grubunda Yılda bir Düşük Risk grubunda İlk 3 yıl yılda bir defa daha sonra 3 yılda bir. Kanser tedavisini takiben İlk 2 yıl 3 ayda bir3 yıl 6 ayda bir sonra yılda bir

PAP• PAP testi

Alınan materyal bir lam üzerine yayılır ve hemen alkol dolu bir kap içine konur. Başka bir yöntem de alınan materyali lama yaydıktan sonra 30 santimetre uzaklıktan bildiğimiz saç spreyi sıkmaktır. Her iki yöntemde de amaç alınan hücrelerin lam üzerinde fikse edilmesidir. Ancak piyasada satılan spreylerin alkol içerikleri biribirinden oldukça farklılık gösterdiğinden pekçok hekim preparatı direk olarak alkolde fikse etmeyi tercih etmektedir. Fiksasyonun örnek alındıktan hemen sonra yapılmaması hücresel şekillerin bozulmasına ve kurumasına yol açar. Bu da değerlendirmede hatalara neden olabilir .PAP testinin duyarlılığı %100 değildir. Tarama testinden yeterli verimi alabilmek ve hatalı negatif sonuç görülme oranlarını en aza indirebilmek için yeni teknoloji arayışları devam etmektedir.

FİKSASYONAlınan materyal kuru temiz bir lam üzerine yayılır ve lamel ile kapatılmaz. Fiksasyonda en önemli nokta lam üzerine ince bir tabaka halinde yapılmış olan materyalin,yayma yapılır yapılmaz kurumadan derhal fiske edilmesidir. Fiksasyondaki gecikme selüler şekillerin bozulmasına ve kurumasına yol açar. Fiksasyon solüsyonu olarak,genellikle eşit miktarlarda %95’lik etil alkol ve eter karışımı kullanılır. Genital sistemden alınan yayma preparatın bu solüsyonda fiksasyonu için en az 15 dakikaya gerek vardır, lamlar fiksatif içinde 7-10 gün kadar bozulmadan kalabilir.

Hekim preparatı direk olarak alkolde fikse etmeyi tercih etmektedir. Fiksasyonun örnek alındıktan hemen sonra yapılmaması hücresel şekillerin bozulmasına ve kurumasına yol açar. Bu da değerlendirmede hatalara neden olabilir .PAP testinin duyarlılığı %100 değildir. Tarama testinden yeterli verimi alabilmek ve hatalı negatif sonuç görülme oranlarını en aza indirebilmek için yeni teknoloji arayışları devam etmektedir

.

• Ayrıca fiksasyon için ticari spreyler de (etil alkol vb.) vardır. Fiksasyon için özel solüsyon olmadığı takdirde kadınların saç spreyleri de bu amaçla kullanılabilir. Eğer boyama işlemi uzak bir yerde yapılacaksa yani patoloji laboratuarı metaryel alınan yere uzaksa fiske edilmiş lamlar birbirlerine dokunmayacak şekilde ambalajlanıp yollanmalıdır.

• Genital sistem sitolojisi ile uğraşanlar tarafından,Papanicoloau boyama yöntemi hemen hemen diğer teknikleri dışlayacak şekilde kabul edilmiştir. Yöntem uzun ve komplikedir, fakat mükemmel nükleer detay verir. Bu teknik ile epitel hücrelerinin nükleusları koyu mavi veya koyu mor görülür,sitoplazması kırmızı-pembe (eozinofilik hücreler), ya da yeşil-mavi (bazofil hücreler) şeklinde boyanır. Bakteriler gri renkte, trikomonaslar açık gri-mavi görülürler. Diğer bir boyama tekniği Shorr yöntemidir (1941).

• Thin-Prep yöntemi

Sıvı bazlı ince yaymalar bu alanda geliştirilmiş en son yöntemdir. Thin-Prep adı verilen ve şu anda bizim de kullandığımız bu teknikte alınan örnek direk olarak lam üzerine yayılmak yerine tamponlamış alkol içeren bir şişe içerisine karıştırılır. Elde edilen bu hücre süspansiyonu özel bir filtre sisteminden geçirilerek kan, mukus ve diğer ölü hücreler ayrıştırılır ve geride kalan hücreler lam üzerine yayılır. Bu sayede diğer hücreler tarafından maskelenmeyen servikse ait hücreler daha kolay incelenebilir. Thin-Prep smear ideal olmamakla birlikte zorunluluk durumunda kanama varlığında da alınabilir.Thin-Prep tekniği ile alınan smear testinde hatalı negatif oranı %4 civarındadır.

PAPNET• Smear ile ilgili bir başka yeni teknoloji de otomasyondur. PAPNET

adı verilen yöntemde hazırlanan lam mikroskop altına konur ve bir

bilgisayar görüntüyü yorumlar. En sık karşılaşılan 128 anomali

bilgisayar tarafından tanınır ve örnek manuel incelemeye alınır.

Klasik yöntemler ile negatif olarak değerlendirilen testler PAPNET

ile yeniden incelemeye alındığında %10 olguda düşük dereceli SIL

ya da daha ileri bir lezyon saptanmaktadır. Thin-Prep ve PAPNET

yöntemlerinin her ikisi de Amerikan İlaç ve Gıda Dairesi

tarafından onaylanmış olmasına karşın, maliyetinin yüksek olması

nedeni ile PAPNET'in rutin uygulanması önerilmemektedir.