PCR Va Benh Nhiem Trung

TAÏI SAO CHOÏN PCR ÑEÅ PHAÙT HIEÄN CAÙC TAÙC NHAÂN GAÂY BEÄNH NHIEÃM TRUØNG ?XEÙT NGHIEÄM MEDIC
MEDIC 254 Hoøa Haûo Q. 10 TP. Hoà Chí Minh ÑT: 8357284 - 8355 136 fax: 84-8-8352543 email: [email protected]
EXIT
CME
TRUNG TAÂM Y KHOA MEDIC
TAÏI SAO CHOÏN PCR ÑEÅ PHAÙT HIEÄN CAÙC TAÙC NHAÂN GAÂY BEÄNH NHIEÃM TRUØNG ?
XEÙT NGHIEÄM MEDIC
MRI
EXIT
CME
Ñaëc ñieåm
PCR PHAÙT HIEÄN MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS (TB) TRONG CAÙC MAÃU BEÄNH PHAÅM KHAÙC NHAU
VIRUS GAÂY VIEÂM GAN SIEÂU VI B (HBV)
VIRUS VIEÂM GAN SIEÂU VI C
(HCV)
MRI
EXIT
CME
PCR: POLYMERASE CHAIN REACTION
Ñaëc ñieåm :
Ñaëc hieäu: nhôø choïn ñoaïn moài ñaëc hieäu
Phaùt hieän tröïc tieáp caùc DNA, RNA
MRI
EXIT
CME
CAÙC GIAI ÑOAÏN THÖÏC HIEÄN PCR
Laáy maãu coù chöùa nucleic acid ñích
Ly trích nucleic acid ñích
Thöïc hieän phaûn öùng PCR trong Thermal cycler ( maùy luaân nhieät)
Phaùt hieän saûn phaåm khueách ñaïi baèng ñieän di phaùt hieän kích thöôùc
MRI
EXIT
CME
TOÙM LÖÔÏC MOÄT CHU KYØ KHUEÁCH ÑAÏI TRONG MAÙY LUAÂN NHIEÄT CUÛA PCR
Trong moät chu kyø khueách ñaïi goàm coù ba böôùc: Bieán tính, baét caëp vaø keùo daøi. Ba böôùc naøy seõ ñöôïc laëp ñi laëp laïi vaø keát quaû sau n chu kyø vôùi löôïng DNA ban ñaàu laø C ta seõ khueách ñaïi thaønh C*2n.
Bieán tính: nhieät ñoä seõ ñöôïc naâng leân nhanh choùng ñeán 940C, ôû nhieät ñoä naøy thì chuoåi ñoâi cuûa phaân töû DNA seõ bò bieán tính vaø taùch ra thaønh 2 chuoåi ñôn.
MRI
EXIT
CME
Baét caëp: sau khi chuoãi ñoâi bò taùch laøm hai, coù hai ñoaïn moài cho saün trong PCR mix coù traät töï nucleotides boå sung vôùi hai ñaàu moät ñoaïn (thoâng thöôøng töø 18-20 nucleotides) cuûa gene maø ta muoán khueách ñaïi( ví duï nhö moät ñoaïn cuûa gene S trong HBV DNA ñaëc tröng cho HBV maø ta muoán khueách ñaïi), nhieät ñoä baét caëp naøy tuøy thuoäc vaøo soá löôïng cuûa caùc loaïi nucleotides
MRI
EXIT
CME
Keùo daøi: sau khi hai ñoïan moài ñaõ baét caëp vaøo, döôùi taùc duïng cuûa men Taq polymerase: caùc dNTP trong PCR mix seõ gaén vaøo ñoaïn moài vaø keùo daøi ra. Khi ñoù, töø moät maïch ñôn seõ trôû thaønh maïch ñoâi. Coù nghóa laø töø moät phaân töû DNA ban ñaàu giôø ñaõ thaønh hai phaân töû. Nhieät ñoä hoaït ñoäng toát nhaát cho Taq polymerase laø ôû 720C.
MRI
EXIT
CME
Phaûn öùng Polymerase chuoãi Polymerase Chain Reaction (PCR) K.Mullis,1985.
3’
3’
5’
5’
3. Extension by Taq
MRI
EXIT
CME
ÑIEÄN DI PHAÙT HIEÄN KÍCH THÖÔÙC SAÛN PHAÅM KHUEÁCH ÑAÏI
True negative True positive Inhibitor
IC S IC S IC S IC S
MRI
EXIT
CME
CAÙC YEÁU TOÁ THAM GIA TRONG PCR
Primer xuoâi vaø ngöôïc
dNTP
EXIT
CME
PCR PHAÙT HIEÄN MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS (TB) TRONG CAÙC MAÃU BEÄNH PHAÅM KHAÙC NHAU
MRI
EXIT
CME
TAÏI SAO CHUÙNG TA CAÀN PHAÛI DUØNG PCR ÑEÅ PHAÙT HIEÄN TB.
PCR raát nhaïy (do khueách ñaïi leân haøng tæ laàn ñeå phaùt hieän), do ñoù coù theå phaùt hieän ñöôïc TB trong nhieàu tröôøng hôïp khoù nhuoäm vaø caáy caùc beänh phaåm nhö dòch naõo tuûy, dòch maøng buïng, dòch maøng tim, dòch maøng phoåi, dòch pheá quaûn, ñaøm…
Ñoä tin caäy cao hôn phöông phaùp nhuoäm do PCR phaùt hieän TB chöù khoâng phaûi chæ phaùt hieän caùc vi khuaån khaùng acid
Nhanh hôn so vôùi phöông phaùp caáy: PCR coù keát quaû trong 24 giôø.
MRI
EXIT
CME
KYÕ THUAÄT THÖÏC HIEÄN
Caùch laáy maãu: phaûi laáy maãu ñuùng caùch, taát caû phaûi ñöïng trong loï voâ truøng, loïai duøng moät laàn
Xöû lyù maãu beänh phaåm
Thöïc hieän PCR: khueách ñaïi ñoaïn gene IS6110 cuûa TB
Phaùt hieän saûn phaåm khueách ñaïi baèng ñieän di coù ñoä daøi 249 caëp bases
MRI
EXIT
CME
VAØI ÑAËC ÑIEÅM CUÛA ÑOAÏN GENE IS6110
Ñoaïn gene naøy laëp laïi töø 8-16 laàn trong boä gene cuûa TB, do ñoù nhaïy hôn so vôùi ñoaïn gene 16SrDNA chæ coù ôû moät vò trí
Ñaëc hieäu hôn do chæ coù ôû TB
ÔÛ Vieät Nam ghi nhaän coù ñoät bieán ôû gene naøy neân seõ coù tröôøng hôïp aâm giaû
MRI
EXIT
CME
SO SAÙNH SOÁ COPIES TRONG GENOME CUÛA TB CUÛA GENE IS6110 VAØ 16Sr
16Sr DNA
IS 6110
EXIT
CME
VIRUS GAÂY VIEÂM GAN SIEÂU VI B (HBV)
MRI
EXIT
CME
VAØI NEÙT ÑAÏI CÖÔNG
Laø taùc nhaân chuû yeáu gaây vieâm gan vaø xô gan
Ñöôïc tìm thaáy trong teá baøo gan vaø serum ngöôøi bò nhieãm
Moät virus hoaøn chænh laø moät tieåu theå hình caàu coù d = 42 - 47 nm
Voû coù khaùng nguyeân beà maët HBsAg
Loûi d = 27 nm, goàm moät phaân töû DNA vaø hai khaùng nguyeân loûi HBcAg vaø HBeAg
MRI
EXIT
CME
HBsAg ñöôïc maõ hoùa bôûi gene S goàm coù 3 vuøng: S, PreS2 vaø PreS1. Gene S coù alen a laø yeáu toá chính; d/y vaø w/r laø caùc yeáu toá phuï, töø ñoù ta coù caùc subtype khaùc nhau: adw, adr, ayw, ayr
HBcAg ñöôïc maõ hoùa bôûi gene C
HBeAg ñöôïc maõ hoùa bôûi moät trình töï Nu tröôùc gene C (Precore sequence)
MRI
EXIT
CME
Thoâng thöôøng, HBeAg (+) thöôøng töông öùng vôùi löôïng virus cao trong maùu, nhöng khi coù ñoät bieán ôû precore thì seõ taïo ra maõ ngöøng vaø virus seõ ngöng khoâng saûn xuaát ra HBeAg nöõa. Khi ñoù duø beänh nhaân coù HBeAg (-) vaãn khoâng loaïi tröø beänh nhaân khoâng nhieãm vieâm gan sieâu vi B
MRI
EXIT
CME
TAÏI SAO CHUÙNG TA CHOÏN PCR ÑEÅ PHAÙT HIEÄN HBV DNA
Chaån ñoaùn xaùc ñònh nhieãm HBV
Coù chæ ñònh ñieàu trò ñaëc hieäu hay khoâng
Theo doõi ñieàu trò ñaëc hieäu
MRI
EXIT
CME
Laáy maãu: laáy serum vaøo buoåi saùng tröôùc khi aên, vaø löu ôû -200C cho tôùi khi xöû duïng
Ly trích DNA
Thöïc hieän phaûn öùng PCR trong maùy luaân nhieät. Khueách ñaïi ñoaïn gene treân gene S
Ñieän di ñoïc keát quaû: ñoaïn gene coù kích thöôùc 259 caëp bases
MRI
EXIT
CME
MOÄT SOÁ YEÁU TOÁ KHOÂNG CHO PCR ÑÖÔÏC THÖÏC HIEÄN
Hemoglobin
Heparin
EXIT
CME
VIRUS VIEÂM GAN SIEÂU VI C
(HCV)
MRI
EXIT
CME
ÑAÏI CÖÔNG
1975: Prince vaø cs : tìm ra taùc nhaân gaây vieâm gan khoâng A khoâng B sau truyeàn maùu.
Caùc phöông phaùp : caáy, kính hieån vi ñieän töû, tìm daáu veát khaùng nguyeân hoaëc khaùng theå vaãn khoâng tìm ra taùc nhaân ñoù.
Sau naøy nhôø kyõ thuaät sinh hoïc phaân töû ñaõ xaùc ñònh ñöôïc taùc nhaân gaây vieâm gan ñoù vaø ñaët teân laø virus vieâm gan sieâu vi C.
MRI
EXIT
CME
ÑAÏI CÖÔNG
HCV laø taùc nhaân chuû yeáu (70 - 90%) gaây vieâm gan khoâng A, khoâng B sau truyeàn maùu
Ñaëc bieät khoaûng 50% tröôøng hôïp khoâng roõ ñöôøng truyeàn
Tæ leä nhieãm 0,2 - 2% (qua hieán maùu) ñeán 80% (chích ma tuùy).
50 - 80% vieâm gan sieâu vi C chuyeån thaønh maïn tính, 20 - 25% ngöôøi maïn tính chuyeån thaønh xô gan vaø ung thö gan sau naøy.
MRI
EXIT
CME
CAÁU TRUÙC VIRUS
Virus nhoû coù voû boïc, boä gen laø moät chuoãi RNA maïch (+), chöùa 9400 nucleotides.
Boä gen coù vuøng maõ hoùa lôùn töông ñöông polyprotein 3011 acid amines
Vuøng 5’ UT laø vuøng khoâng maõ hoùa vaø baûo toàn. Ñaây laø vuøng ñích cho caû phaûn öùng PCR vaø bDNA.
MRI
EXIT
CME
SÔ ÑOÀ BOÄ GENE CUÛA HCV
PCR
Capture Target Probes to bind amplifier
Structural
Non-Structural
caosid Binding Helicase Binding
MRI
EXIT
CME
THÖÛ NGHIEÄM MIEÃN DÒCH COÙ THEÅ XAÙC ÑÒNH NHIEÃM HCV KHOÂNG
Caùc thöû nghieäm mieãn dòch : RIA, EIA, MEIA, RIBA.
Theá heä 1 :
Ñôn khaùng nguyeân.
Ñoä nhaïy : 80 - 90% ôû beänh nhaân vieâm gan maïn sau truyeàn maùu.
Ñoä ñaëc hieäu : duø heát beänh vaãn coøn (+), ôû nhoùm nguy cô thaáp nhieàu (+) giaû.
MRI
EXIT
CME
Theá heä 2 :
Ña khaùng nguyeân.
Theá heä 3 :
Taêng ñoä nhaïy.
MRI
EXIT
CME
Caùc theá heä mieãn dòch veà sau caøng coù giaù trò chaån ñoaùn ôû nhoùm beänh nhaân coù nguy cô cao, duøng trong saøng loïc truyeàn maùu.
Vôùi keát quaû huyeát thanh hoïc :
(-) : khoâng theå loaïi tröø khoâng nhieãm HCV.
(+) : phaûi ñoái chieáu theâm laâm saøng vaø caùc keát quaû caän laâm saøng khaùc nhö men gan.
MRI
EXIT
CME
TAÏI SAO PHAÛI CHOÏN PCR ÑEÅ PHAÙT HIEÄN HCV RNA
Chaån ñoaùn trong giai ñoaïn sôùm khi chöa coù khaùng theå (10 - 15 tuaàn, ñoâi khi 6 - 12 thaùng). Vaø khaùng theå coøn toàn taïi caû naêm sau khi heát nhieãm
Quyeát ñònh ñieàu trò ñaëc hieäu ôû beänh nhaân:
Vieâm maïn maø khaùng theå (-)
Vieâm maïn vôùi töï khaùng theå maø coù khaùng theå cuûa HCV (+).
MRI
EXIT
CME
TAÏI SAO PHAÛI CHOÏN PCR ÑEÅ PHAÙT HIEÄN HCV RNA
Ñaùnh giaù tình traïng nhieãm HCV sau khi gheùp gan maø men gan coù theå bình thöôøng
Theo doõi ñieàu trò khaùng virus:
Coù ñaùp öùng ñieàu trò khoâng
Coù caàn thay ñoåi phaùc ñoà ñieàu trò khoâng
Löôïng HCV RNA giaûm ñeán döôùi ngöôõng phaùt hieän cuûa PCR xem nhö ñaùp öùng vôùi ñieàu trò
MRI
EXIT
CME
Khoâng taùn huyeát, khoâng duøng Heparin
Taùch serum (plasma) trong voøng 4 - 6 giôø vaø löu ôû - 200C ñeán khi xöû duïng
Ly trích RNA
Ñieän di ñoïc keát quaû
MRI
EXIT
CME
Ñaõ nhieãm tröôùc ñoù vaø ñaõ heát beänh
Anti HCV (+) giaû, nhöng coù leõ thöôøng do HCV RNA döôùi ngöôõng phaùt hieän
Moät tæ leä hieám ñoät bieán cuûa virus
Trong quaù trình beänh, löôïng HCV RNA cuûa virus dao ñoäng khoâng haèng ñònh
Loãi kyõ thuaät thöïc hieän PCR
MRI
EXIT
CME
ANTI HCV (-), PCR (+)
Anti HCV (-) giaû
Giai ñoaïn sôùm cuûa beänh
PCR nhaïy hôn
MRI
EXIT
CME
KEÁT LUAÄN
PCR laø moät phaûn öùng raát nhaïy, ñaëc hieäu vaø laø test tröïc tieáp phaùt hieän DNA,RNA do ñoù raát coù lôïi duøng ñeå phaùt hieän caùc taùc nhaân gaây beänh nhö lao, vieâm gan sieâu vi B vaø C, soát xuaát huyeát…
Vì laø test tröïc tieáp tìm genome vi khuaån neân PCR hôn caùc test giaùn tieáp nhö mieãn dòch laø traùnh ñöôïc giai ñoaïn cöûa soå, toàn taïi song song vôùi beänh.

Documents

PCR Va Benh Nhiem Trung