PEDİATRİK MAKROTROMBOSİTOPENİLİ

OLGULARDA

MYH9 & TUBB1 GEN MUTASYONLARI

1Didem Torun Özkan, 2Abdullah A. Waheed, 3Yeşim Oymak, 3Canan Vergin, 2Ayten Kandilci, 4Nejat Akar

1. Okan Üniversitesi, Sağlık Hizmetleri Meslek Yüksekokulu, İstanbul2. Gebze Teknik Üniversitesi, Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü, İstanbul3. Dr. Behçet Uz Eğitim ve Araştırma Hastanesi,Hematoloji ve Onkoloji Kliniği, İzmir4. TOBB-ETU Hastanesi, Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Anabilim Dalı, Ankara

Bu çalışma TÜBİTAK- 3001-Başlangıç Ar-Ge Projelerini Destekleme Kapsamında (214S601) desteklenmektedir.

TROMBOSİTLER

Boyutu: 1-4 µm

Yaşam Süresi: 7-10 gün

Bulunduğu Yer: 1/3 Dalak

2/3 Dolaşım

Normal Trombosit Sayısı: 150000-450000/mm3

Düşük sayıda olmasıyla karakterize olan trombositopeni

Trombositopeni + dev trombosit sendromu ise makrotrombositopeni

Otozomal dominant kalıtım

MYH9 (Miyozin Ağır Zincir-9) Geni

May-Hegglin anomalisi (MHA)

Sebastian sendromu (SBS)

Fechtner sendromu (FTNS)

Epstein sendromu (EPTS)

Proteinin farklı doku ve organlarda sentezlenememesi sonucu;

non hematolojik bulgular: işitme kaybı, katarakt, nefrit

Makrotrombositopeni

MYH9 Geni

5.8kb’lık mRNA

40 ekzon

Kromozom 22q13.1’de lokalize

Baş Boyun Helikal Olmayan Kuyruk

Makrotrombositopeni Genetiği

Makrotrombositopeni

Tübülin Beta-1 (TUBB-1) Geni

Mikrotübüllerin fonksiyonunda oluşan defekt proplatelet formasyonunda

değişime sebep olarak makrotrombositopeni’ye yol açar mı?

TUBB-1 Geni

Kromozom 20q13.32’ de lokalize

451 aa

4 ekzon

Mikrotübüllerin en önemli bileşeni

GTP bağlanma bölgeleri

Özellikle ekspresyonu; trombositler ve megakaryositlerde

Otozomal dominant; Makrotrombositopeni

2000-2017 yılları arasında literatürde MYH9 geninde, 17 tanesimakrotrombositopeni taşıyan hastalarda olmak üzere, toplam 52 mutasyontanımlanmıştır.

Makrotrombositopeni ile ilişkili olarak TUBB1 geni ile ilgili ise yalnızca

2 mutasyon tanımlanmıştır. (Kunishima ve ark., 2015)

Amaç

Türkiye’nin farklı hematoloji kliniklerinden makrotrombositopeni tanısıalarak laboratuvarımıza ulaştırılan hastalarda makrotrombositopeniyleilişkili olduğu öngörülen genlerden MYH9 ve TUBB1 genindekideğişimlerin, DNA ve RNA boyutundaki genetik ve fonksiyoneldeğişimlerini tek bir çalışmada ve ilk kez Türk populasyonundagerçekleştirmektir

Materyal ve Yöntemler

Hasta Grubunun Oluşturulması

DNA Ekstraksiyonu

PolimerazZincir

Reaksiyonu

DNA Dizi Analizi

Verilerin

Değerlendirilmesi

Hasta Grubunun Oluşturulmasında Klinik Bulgular

TOBB- ETU Hastanesi Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Bölümü

Dr. Behçet Uz Eğitim ve Araştırma Hastanesi Hematoloji Kliniği

Kriterler:

Trombosit sayısı genelde 20000-130000mm3 arasındadır.

Hastaların kanama semptomları hafif ve ender olup, hematomlar ve kolay morarma

gözlenebilmektedir.

Lökositlerde inklüzyon cisimciği periferik yaymada saptanan tipik bir bulgudur.

DNA İzolasyonu Klasik Fenol- Kloroform Yöntemi

PCR MYH-9 7 ekzon

TUBB-1 Geni 4 ekzon

Hedef Bölge

DNA Dizi Analizi

TUBB-1 Geni

Ekzon Forward primer Reverse primer Amplikon

uzunluğu (bç)

Ekzon 1CATACCACGGTCACTAGGGC AAAGCCCAAAGGCATTGTC 587

Ekzon 2 GGAAACAGGCTTGGGAATG CATTTCCATCTCCTGGGC 282

Ekzon 3TTTGGACCAGTATCACAAAGTTC AAAAGAGAAACCAGCAGGGG 295

Ekzon 4-1GCATTCGATCTAGCAAATTAGG ATCGAACATCTGCTGGGTG 766

Ekzon 4-2TACCCTGAAGCTGACGACAC GCTGCAGGAGAAACACTCATC 789

Ekzon4-3AACGAATTTGGGGAAGCTG GAAAGCAGGATGCCAGTCAG 608

Ekzon 4-4GGATTTGCAGGGAGCCAC TTCCTGCATTTGAATGGTTG 623

Ekzon 4-5TTTCATTCAGTCATCACCCC TTGGTATGTATTTTAGTTATTTCCTCG 604

Ekzon 4-6GGGTTCTCATCTCTTGATTTGC CGAAAGAGTAGGATGGTGAGATG 620

4010 bç

Santa Cruz Genom Browser Database /Primer tasarım programı

BULGULAR

C. Ailesi- MYH9 /Ekzon 26B

AŞ

VU

RU

NE

DE

Nİ

YA

Ş&

CİN

SİY

ET

TR

OM

BO

SİT

10

3/u

L

MP

V(f

L)

PC

T(%

)

PD

W(f

L)

MY

H9

TU

BB

1

AMELİYAT ÖNCESİ

TROMBOSİT

DÜŞÜKLÜĞÜ

19E 39 11,1 0,04 14,1 c.3756 C>A,

c.3762 G>A

c.821 C>T, c.920G>A

Klinik Tablo

MYH9 Geni/ Ekzon 26

İki yeni mutasyon birlikteliği

c. 3756 C>A (p.L1176M) + 3762 G>A (p.E1182K)

İlk kez bu çalışmada gösterilmiştir

Çocukta görülen bu mutasyon

De Novo Mutasyon

olarak adlandırılabilir mi?

Marker Baba (A.C.) Anne (F. C.) (Hasta) /Çocuk (M.H.C.)

D851179 210/218 206/218 206/210

TMOI 333/338 338/346 333/346

D355818 251/255 246/246 246/251

D18551 461/465 461/472 461/472

D351358 193/197 193/197 193/193

D21511 183/191 191/191 183/191

FGA 293/297 297/305 297/305

%99,9 oranında baba, çocuğun babası

Düzen Laboratuvarı- DNA Fingerprint Analysis

C.AilesiTUBB1/ Ekzon 4

(821C>T (p. T274M)+ 920 G>A (p.R307H))

Forward primer Reverse primer

Species Match AA Alignment

Human 274 LHFFMPGFAPLTAQGSQQYRALSV

Mutated not conserved 274 LHFFMPGFAPLMAQGSQQYRALS

P.troglodytes all identical 274 LHFFMPGFAPLTAQGSQQYRALS

M.mulatta all identical 274 LHFFIPGFAPLTAQGSQQYRALS

M.musculus all identical 274 LHFFMPGFAPLTAQGSQQYRALS

G.gallus all identical 274 LHFFMPGFAPLTARGSQQYRALS

D.rerio all identical 274 LHFFMPGFAPLTARGSQQYRALT

D.melanogaster all identical 283 LHFFMPGFAPLTSRGSQQYRALT

C.elegans all conserved 274 LHFFMPGFAPLSAKGTQAYRALT

p.T274M Threonine (T) Hydrophilic/Polar – Neutral Methionine (M) Hydrophobic/Non-Polar

Natarajan K. and Senepati S., 2012, PLoSONE, 78(8); e42351.

p.R307H

Species Match AA Alignment

Human 307 ARNTMAACDLRRGRYLTVACIFRG

Mutated not conserved 307 AACDLRHGRYLTVACIFR

P.troglodytes all identical 307 AACDPRRGRYLTVACIFR

M.mulatta all identical 307 AACDPRRGRYLTVACIFR

M.musculus all identical 307 AACDPRRGRYLTVACIFR

G.gallus all identical 307 AACDPRRGRYLTVACIFR

D.rerio all identical 307 TACDPRRGRYLTVAGIFR

C.elegans not conserved 307 AACDPRHGRYLTVAAMFR

D.melanogaster not conserved 316 AKNMMAACDPRHGRYLTVAAIFR

p.T274M ve p. R307H mutasyonlarının TUBB1 proteinine etkisi

PROVEAN (Protein Variation Effect Analyzer)

MYH9 ve TUBB1 mutasyonlarının aynı hastada birlikte görülme durumu

şimdiye kadar yapılan çalışmaların hiçbirinde gösterilmemiş olup ilk kez bu

araştırma ile ortaya konulmuştur.

Aynı zamanda Human Gene Mutation Database’de (HGMD) daha önce

tanımlanmayan mutasyonlarla makrotrombositopenili bir ailede ilk kez

‘’de novo’’ mutasyon varlığı da gösterilmiştir.

MYH9 Geni Ekzon 1

c.286 T>G, p.S96A

BA

ŞV

UR

U

NE

DE

Nİ

YA

Ş&

CİN

SİY

ET

TR

OM

BO

SİT

10

3/u

L

MP

V(f

L)

PC

T(%

)

PD

W(f

L)

MY

H9

TU

BB

1

AMELİYAT ÖNCESİ TROMBOSİT

DÜŞÜKLÜĞÜ

20E 22 9,0 0,02 16,6 c.286 T>G c.803G>T

Ekzon 25c.3814 T>G, p. S1195A

İlk kez bu çalışmada gösterilmiştir

BA

ŞV

UR

U

NE

DE

Nİ

YA

Ş&

CİN

SİY

ET

TR

OM

BO

SİT

10

3/u

L

MP

V(f

L)

PC

T(%

)

PD

W(f

L)

MY

H9

TU

BB

1

BURUN KANAMASI 18E 94 11,6 1,08 16,6 c.3814 T>G,

p. S1195A

c.803G>T

Ekzon 26

c.3660 T>G, p.A1144L

Ensembl / rs71081 polimorfizmi

BA

ŞV

UR

U

NE

DE

Nİ

YA

Ş&

CİN

SİY

ET

TR

OM

BO

SİT

10

3/u

L

MP

V(f

L)

PC

T(%

)

PD

W(f

L)

MY

H9

TU

BB

1

AMELİYAT

ÖNCESİ TROMBOSİT

DÜŞÜKLÜĞÜ

11 E 89 8,4 0,074 17,1 c.3660 T>G,

p.A1144L

c.803G>T

TUBB1 GeniEkzon 4

TUBB1 geni 635C>T, p.H122H TUBB1 geni 636 G> C, p. E123Q

Hasta Hasta

İlk kez bu çalışmada gösterilmiştir

TUBB1 GeniEkzon 4

c.705G>A, p. G146R

Hasta

İlk kez bu çalışmada gösterilmiştir

Mutasyon mu, polimorfizm mi?

E123Q G146R

Sonuçlar..

TUBB1 geninde bulduğumuz bazı değişimler literatürde daha öncefarklı hastalıklarda bildirilmiş olmakla birlikte,makrotrombositopeniyle ilişkisi henüz bilinmemektedir.

Bu çalışma ile TUBB1- makrotrombositopeni ilişkisi net biçimdeortaya konulmuştur.

Human Gene Mutation Database’de (HGMD) yer almayanmutasyonlar ilk kez bu çalışmada bildirilmiş olmakla birlikte ,yine ilk kez bu çalışma ile makrotrombositopenili bireyde ‘’denovo’’ mutasyon varlığı da gösterilmiştir.

Sağlıklı ve hasta (C.U.) periferik kan örneklerinden

(trombosit) RNA izolasyonu yapıldıktan sonra cDNA sentezi

yapılmıştır. TUBB1 ve referans gen olarak seçilen HPRT’ye

ait Ct değerleri saptanarak replikaların aritmetik ortalamaları

alınmıştır.

TUBB1’de meydana gelen mutasyon mikrotübül organizasyonunda

defektlere yol açmaktadır.

TEŞEKKÜRLER…