PENAPISAN HEMOGLOBIN E PADA SISWI SMA NEGERI … · Penelitian diawali dengan dilakukannya pengambilan kadar hemoglobin dan darah vena untuk dilakukan analisis molekuler pada responden

i

PENAPISAN HEMOGLOBIN E PADA SISWI SMA

NEGERI KECAMATAN SINGOSARI DI KABUPATEN

MALANG, JAWA TIMUR

Laporan penelitian ini ditulis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

SARJANA KEDOKTERAN

OLEH:

Ajeng Ristia Sari Putri

NIM: 11141030000067

PROGRAM STUDI KEDOKTERAN DAN PROFESI DOKTER

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH

JAKARTA

1438 H/2017 M

LEMBAR PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

Dengan ini saya menyatakan bahwa:

1. Laporan penelitian ini merupakan hasil karya asli saya yang

diajukan untuk memenuhi salah satu persyaratan memperoleh

gblar Strata 1 di Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif

Hidayatullah Jakarta.

2. Semua sumber yang saya gunakan dalam penulisan ini telah saya

cantumkan sesuai dengan ketentuan yang berlaku di UIN Syarif

Hidayatullah Jakarla.

3. Jika di kemudian hari terbukti bahwa karya ini bukan karya asli

saya atau merupakan hasil jiplakan dari karya orang lain, maka

saya bersedia menerima sanksi yang berlaku di UIN Syarif

Hidayatullah Jakarta

Ciputat, 25 Jub 2017

Ajeng Ristia Sari Putri

PROFIL LAJU ENDAP DARAH PADA PASIEN TUBERKULOSIS PARIJKASUS BARU DI RSU KOTA TANGERANG SELATAN

Laporan PenelitianDiajukan kepada Program Studi Kedokteran dan Profesi Dokter, Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan untuk Memenuhi Persyaratan Memperoleh GelarSarj ana Kedokteran (S.Ked)

OlehWidyaLestari NingrumNIM : 11141030000072

Pembimbing I Pembimbing II

M (ll^.rq$dr. Mery Nitalia" SpPK Dr. dr. Muk&tar lkhsan. SoP(K). MARS. [,lRS

NrP. 19781230 200604 2 }At NrP. 19s40406 198111 I 001

PROGRAM STUDI KEDOKTERAN DAN PROFESI DOKTER

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

TINIVERS ITAS ISLAM NEGERI SYARI F H IDAYATU LLAH

JAKARTA

1439H.t2017 M

l1r

LEUIBAR PENGESAHAN

Laporan Penelitian be{udul PR0FIL LAJU ENDAP DARAH PADA PASIENTUBERKULOSIS PARU KASUS BARU DI RSU KOTA TANGERANGSELATAN yang diajukan cleh widya Lestari Ningnun (NIM: 11141030000072),telah diujikan dalarn sidang di Fakultas Kedokteran dan Xmu Kesehatan pada 24Oktober 2017. Laporan penelitian ini telah diterima sebagai salah satu syaratmemperoleh gelar Sarjana Kedokteran (S.Ked) pada Frogram Studi Kedokterandan Profesi Dokter.

Ciputat, 24 Oktober 201 7

DEWAN PENGUJIKetua Sidang

dr. MeryNitalia. SpPK}\IIP. 19781?302A06A420A1

Pembimbing I Pembimbing II

dr. Mery Nitalia. SpPKNiP. 19781230 200604 2 001

dr. Erike Anggaini Suwarsono. M.Pd" SpMKNIP. 19810926 20110t 2 007

Penguji I

%

lLtu"r_Z

Dr. dr. Mukhtar lkhsan, SpP(K), MARS. FIRSNIP. 19540406 198111 1 001

Penguji II

dr. Murdroh. SpPKNIP. 19770326 200901 2 00s

PIMPINAN FAKULTAS

NrP. 19650808 198803 1 002

Kaprodi PSKPD FKIK UIN

9721103 200604

v

KATA PENGANTAR

Penulis mengucapkan terima kasih kepada:

1. Puji syukur kepada Allah SWT atas rahmat dan hidayahNya, penulis telah

diberikan kesabaran, kekuatan dan kemudahan sampai penulis dapat

menyelesaikan Riset ini dengan lancar. Dan Nabi besar Muhammad SAW

yang telah membimbing umat islam hingga akhir hayatnya.

2. Orang tua penulis, bapak dan ibu yang selalu memberi bantuan dan

dukungan dari hati yang tulus hingga penulis dapat menyelesaikan Riset

ini dengan lancar. Terima kasih juga kepada saudara penulis Agung

Rahbianto dan Annisa Maulida yang menyemangati penulis dan pengingat

sampai saat ini.

3. SEAMEO RECFON FKUI dan DINKES Malang atas kerjasama

penelitian pemetaan beta globin dan kesempatan serta ilmu yang sudah

diberikan kepada penulis.

4. Prof. DR. H. Arif Sumantri, M.Kes selaku Dekan Fakultas Kedokteran dan

Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta

5. dr. Nouval Shahab, Sp.U, FICS, FACS, Ph.D selaku Ketua Program Studi

Kedokteran dan Profesi Dokter UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

6. Pembimbing penulis yaitu Pak Chris Adhiyanto, M. Biomed, Ph.D dan dr.

Yanti Susianti, Sp. A (K) yang telah membimbing dengan penuh

kesabaran dan keikhlasan serta ketulusan dan atas seluruh pengalaman

yang diberikan sehingga saya dapat menyelesaikan riset ini.

7. dr. Hari Hendarto, SpPD, Ph.D, FINASIM dan DR. Zeti Harriyati, M.

Biomed selaku penguji sidang laporan penelitian riset.

8. Seluruh Civitas Akademik PSKPD UIN seluruh dokter, dosen, dan staff.

9. Laboran yang telah membantu riset penulis mbak Suryani S.Si, mbak Ayu

Latifah A.Md, yang setia menemani dan membantu serta mengingatkan

penulis

10. Riset ALAD dan Thalasemia dari Biologi UNJ kak Annisa, kak Ratna, kak

Finka, serta kak Nadira Biologi ITB teman seproject SEAMEO yang telah

vi

membantu penulis dalam penelitian, serta tahap penulisan, dan ilmu-ilmu

yang telah diajarkan kepada penulis.

11. Carotis PSKPD UIN 2014 selaku sejawat yang menjadi penyemangat dan

mendukung penulis.

12. Keluarga besar penulis Yoga, Titi, Dilla, Raya, Salman, Bunga, Galang,

Hafis, Radit yang telah menjadi keluarga yang terus menghibur dan

menyemangati penulis.

13. Sahabat penulis yaitu Rahmy, Nansa, Indira, Desti, Sasa, Azifa, Silma,

Hani, Tiara, Rahma, Thalia, Sherli yang telah menjadi sahabat yang tetap

memberi dukungan serta penyemangat penulis selama di PSKPD.

14. Keluarga pohon PSKPD Nisa Uzlifatul, Farras, Rahayu Muhsi, dan Arini

yang turut membantu menyemangati satu sama lain sehingga dapat

bertahan di PSKPD UIN.

15. CIMSA 2014, 2015, 2016 yang telah memberi dukungan dan kesempatan

untuk aktif disertai menyelesaikan riset.

16. Official CIMSA periode 2016-2017, BBQ yang telah memberi saya

pelajaran berorganisasi disertai mengatur prioritas untuk menyelesaikan

riset.

17. SCORP CIMSA UIN 2014, 2015, 2016 yang telah menjadi keluarga di

PSKPD yang mendukung dalam keaktifan project maupun menyelesaikan

riset.

18. Sahabat SMA penulis Yaya, Jeihan, Cita, Syifa, Ali, Nadya yang terus

mendukung dan memberi semangat kepada penulis.

19. Sahabat penulis Kya, Encha, Charmila, Fadhia, Vani, Ajeng, Jupe,

Amirah, Kiela yang telah menyemangati penulis.

Penulis sadar atas ketidaksempurnaan Riset ini dan berharap semua

kekurangan bisa dimaklumi karena kesalahan adalah proses dari

pembelajaran. Penulis juga memohon kritik-kritik membangun yang dapat

membantu dalam kesuksesan Riset ini. Terima kasih.

Ciputat, 25 Juli 2017

Peneliti

vii

ABSTRAK

Ajeng Ristia Sari Putri. Program Studi Kedokteran dan Profesi

Dokter. Penapisan Hemoglobin E Pada Siswi SMA Negeri Kecamatan

Singosari di Kabupaten Malang, JawaTimur

Latar Belakang: Hb E merupakan kelainan darah yang paling umum

ditemukan di Asia Tenggara. Untuk mengetahui persentase HbE,

penelitian dilakukan SEAMEO-RECFON FKUI bekerjasama dengan

PSKPD FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. Penelitian ini bertujuan

untuk menentukan frekuensi alel hemoglobin E pada remaja putri berumur

16-19 tahun di Kecamatan Singosari, Kabupaten Malang. Metode:

Penelitian diawali dengan dilakukannya pengambilan kadar hemoglobin

dan darah vena untuk dilakukan analisis molekuler pada responden.

Sebanyak 85 sampel dilakukan PCR serta sequencing DNA. Hasil:

Berdasarkan hasil penapisan, terdapat 7 individu dengan mutasi Hb E.

Tiga di antara 7 individu memiliki hemoglobin di bawah normal yaitu

11,7;11,8;dan 11,8. Penurunan kadar hemoglobin pada individu tersebut

disebabkan oleh terjadinya mutasi pada kodon 26 G>A. Kesimpulan:

Frekuensi alel hemoglobin E pada remaja putri di kecamatan Singosari,

kabupaten Malang adalah 8,8%.

Kata Kunci :Hemoglobin E, HbE/β+-thalassemia

Ajeng Ristia Sari Putri. Medical Study Program and Doctor Profession.

Screening of Hemoglobin E In High School Students at Singosari

District in Malang, East Java

Background: HbE is the most common blood disorder found in Southeast

Asia. To determine the percentage of HbE, a study was conducted by

SEAMEO-RECFON FKUI in cooperation with PSKPD FKIK UIN Syarif

Hidayatullah Jakarta. This study aims to determine the frequency of allele

hemoglobin E in adolescent girls aged 16-19 years in the Singosari district,

Malang. Method: The study begins with the taking of hemoglobin and

venous blood levels for molecular analysis of the respondents. A total of 85

samples performed PCR as well as DNA sequencing. Result: Based on the

screening results, there were 7 individuals with Hb E mutations. Three

among 7 individuals had benign hemoglobin of 11.7; 11.8; And 11.8. The

decrease in hemoglobin levels in these individuals is caused by mutations in

the codon of 26 G> A. Conclusion: The frequency of hemoglobin E allele

in adolescent girls in Singosari sub-district, Malang district was 8.8%.

Keywords: Hemoglobin E, HbE / β + -thalassemia

viii

DAFTAR ISI

LEMBAR JUDUL. ................................................................................................. i

LEMBAR PERNYATAAN .................................................................................. ii

LEMBAR PERSETUJUAN ................................................................................. ii

LEMBAR PENGESAHAN ................................................................................. iv

KATA PENGANTAR ........................................................................................... v

ABSTRAK ........................................................................................................... vii

DAFTAR ISI ....................................................................................................... viii

DAFTAR GAMBAR ............................................................................................ xi

DAFTAR TABEL ............................................................................................... xii

DAFTAR LAMPIRAN ...................................................................................... xiii

DAFTAR SINGKATAN .................................................................................... xiv

BAB I PENDAHULUAN ...................................................................................... 1

1.1 Latar Belakang .............................................................................................. 1

1.2 Rumusan Masalah ......................................................................................... 3

1.3 Hipotesis ........................................................................................................ 3

1.4 Tujuan Penelitian ........................................................................................... 3

1.4.1 Tujuan Umum ......................................................................................... 3

1.4.2 Tujuan Khusus ........................................................................................ 3

1.5 Manfaat Penelitian ......................................................................................... 3

1.5.1 Manfaat bagi Peneliti .............................................................................. 3

1.5.2 Manfaat Bagi Perguruan Tinggi ............................................................. 4

1.5.3 Manfaat Bagi Dinas Kesehatan Malang ................................................. 4

1.5.4 Manfaat bagi Masyarakat........................................................................ 4

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ........................................................................... 5

2.1 Landasan Teori .............................................................................................. 5

2.1.1 Hemoglobin ............................................................................................ 5

2.1.2 Fungsi Hemoglobin................................................................................. 6

2.1.3 Polimorfisme β Globin ........................................................................... 6

2.1.4 Hemoglobinopati .................................................................................... 7

2.1.5 Anemia .................................................................................................... 8

ix

2.1.6 HbE ....................................................................................................... 10

2.1.6.1 Genotip dan Fenotip HbE .................................................................. 12

2.1.7 PCR ....................................................................................................... 14

2.1.8 Elektroforesis ........................................................................................ 17

2.1.9 Sequencing DNA .................................................................................. 18

2.2 Kerangka Teori ............................................................................................ 21

2.3 Kerangka Konsep ........................................................................................ 22

2.4 Definisi Operasional .................................................................................... 22

BAB III METODOLOGI PENELITIAN ......................................................... 23

3.1 Desain Penelitian ......................................................................................... 23

3.2 Tempat dan Waktu Penelitian ..................................................................... 23

3.3 Populasi dan Sampel .............................................................................. 23

3.3.2 Kriteria Pemilihan Sampel .............................................................. 23

3.3.3 Perkiraan Besar Sampel ........................................................................ 24

3.3.4 Teknik Pemilihan Sampel ..................................................................... 26

3.4 Alat dan Bahan Uji ...................................................................................... 26

3.5 Cara Kerja Penelitian ................................................................................... 29

3.5.1 Pengumpulan Data ................................................................................ 29

3.5.2 Isolasi DNA .......................................................................................... 29

3.5.3 Pengukuran kemurnian dan konsentrasi hasil DNA ............................. 32

3.5.4 Amplifikasi Fragmen DNA dengan PCR ............................................. 32

3.5.5 Analisis Fragmen DNA Menggunakan Elektroforesis ......................... 33

3.5.6 Deteksi Polimorfisme alel HbE dengan Sequencing ............................ 33

3.5.7 Analisis Hasil Sequencing DNA menggunakan Chromas software ..... 34

3.5.8 Alur Kerja Penelitian ............................................................................ 34

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................ 35

4.1 Hasil ............................................................................................................. 35

4.1.1 Hasil Isolasi Genom DNA dari Whole Blood ....................................... 35

4.1.2 Analisis Hasil Sequencing .................................................................... 37

4.2 Pembahasan ................................................................................................. 38

4.2.1 β Thalassemia-HbE ............................................................................... 38

4.2.2 HbE ....................................................................................................... 40

x

4.2.3 Tata laksana HbE .................................................................................. 40

4.2.4 Pencegahan Prenatal& Neonatal ........................................................... 41

4.2.5 Perhitungan Frekuensi HbE .................................................................. 41

BAB V SIMPULAN DAN SARAN .................................................................... 43

5.1 Simpulan ...................................................................................................... 43

5.2 Saran ............................................................................................................ 43

BAB VI PERNYATAAN PENELITIAN .......................................................... 44

DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 45

LAMPIRAN..........................................................................................................48

xi

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1 Pola splicing dengan beberapa tipe mutasi pada ekson 1 dan IVS-1

β globin. ................................................................................................................ 10

Gambar 2.2 Apusan darah pada HbE. ................................................................... 11

Gambar 2.3 Pola Penyebaran HbE di Asia Tenggara. .......................................... 12

Gambar 2.4 fenotip, genotip, anemia, dan sifat lain dari HbE...............................13

Gambar 2.5 Komponen PCR................................................................................. 15

Gambar 2.6 Denaturasi DNA. ............................................................................... 15

Gambar 2.7 Annealing. ......................................................................................... 16

Gambar 2.8 Elongasi. ............................................................................................ 16

Gambar 2.9 Sequencing DNA. ............................................................................. 20

Gambar 4.1 Hasil PCR β globin pada gel elektroforesis ...................................... 36

Gambar 4.2 Hasil sequencing sampel nomor 6827. .............................................. 38

Gambar 4.3 Hasil sequencing sampel nomor 1120. .............................................. 38

xii

DAFTAR TABEL

Tabel 2.1 Kriteria Anemia....................................................................................... 8

Tabel 3.1 Alat dan bahan pengambilan sampel darah........................................... 26

Tabel 3.2 Alat dan bahan pengukuran kadar hemoglobin..................................... 26

Tabel 3.3 Alat dan bahan isolasi genom DNA dari darah..................................... 27

Tabel 3.4 Alat dan bahan pengukuran kemurnian dan konsentrasi hasil DNA. ... 27

Tabel 3.5 Alat dan Bahan untuk PCR. .................................................................. 28

Tabel 3.6 Alat dan bahan elektroforesis genom DNA hasil PCR. ........................ 28

Tabel 3.7 Alat dan bahan sequencing DNA. ......................................................... 28

Tabel 3.8 Tahapan Isolasi genom DNA. ............................................................... 29

Tabel 3.9 Komposisi Mix PCR. ............................................................................ 33

xiii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1 Tabel Konsentrasi, Kemurnian, dan Kemurnian relatif DNA ........... 48

Lampiran 2. Hasil Penggolongan genotip dan fenotip HbE ................................ 51

Lampiran 3. Gel documentation hasil Elektroforesis agarose dari isolasi genom 54

Lampiran 4. Alat dan Bahan Penelitian ................................................................ 57

Lampiran 5 Hasil sequencing HBE + pada sampel nomor 4613 .......................... 63

Lampiran 6. Lembar persetujuan responden ......................................................... 64

Lampiran 7. Surat Persetujuan Etik ...................................................................... 66

Lampiran 8. HBB sequence .................................................................................. 67

xiv

DAFTAR SINGKATAN

Hb Hemoglobin

HbE Hemoglobin E

WHO World Health Organization

PCR Polymerase Chain Reaction

HPLC high performance liquid chromatography

RISKESDAS Riset Kesehatan Dasar

CO2 Karbondioksida

ALAD-δ Delta aminolevulinat Dehidratase

2,3 DPG 2,3-difosfogliserat

RNA Ribonucleic Acid

DNA Deoxyribonucleic Acid

LCR locus control region

MCV Mean Corpuscular Volume

MCHC Mean Corpuscular Hemoglobin Concentration

MCH Mean Corpuscular Hemoglobin

dNTP Deoksiribonukleotidatrifosfat

TE Tris-Edta Buffer

UV Ultra Violet

TAE Tris-Acetat- EDTA

Et-Br Ethidium Bromide

SNP Single Nucleotide Polymorphism

1

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Kelainan hemoglobin atau hemoglobinopati adalah kelainan yang

disebabkan oleh gangguan sintesis hemoglobin akibat mutasi di dalam atau

dekat gen globin α atau β. Kelainan hemoglobin endemik pada 229 negara.

Berpotensi mempengaruhi 75% kelahiran, dan dewasa ini terjadi pada 71%

dari negara-negara di antara 89% kelahiran. Sekitar 1,1% dari pasangan di

seluruh dunia berisiko memiliki anak dengan kelainan hemoglobin dan 2,7

per 1.000 konsepsi terdapat kelainan hemoglobin.2 Salah satu bentuk kelainan

hemoglobin adalah varian hemoglobin thalassemia. HbE (Hemoglobin E)

adalah hemoglobinopati yang prevalensinya terbanyak kedua setelah HbS.

Hemoglobin E adalah varian Hb paling umum di antara populasi Asia

Tenggara yaitu lebih dari 15% mengalami HbE Homozigot. Hal ini menjadi

salah satu kekhawatiran karena HbE dapat berpotensi menjadi Thalassemia

mayor jika mutasi bersamaan dengan Thalassemia β.4

Kelainan hemoglobin seperti Thalassemia dan HbE adalah beban genetik

utama dalam populasi Asia Tenggara khususnya Khmer, Laos, Zhuang di

Guangxi, Republik China, India, dan Srilanka. Namun pusatnya berada di

Thailand, Laos, dan Kamboja dengan frekuensi genetiknya mencapai 0,05

hingga 0,5. Pada Asia Tenggara terdapat 30 juta individu terdiagnosis HbE

heterozigot serta 1 juta lainnya terdiagnosis HbE homozigot. Salah satunya

termasuk di Indonesia. HbE adalah gangguan hemoglobin yang paling umum

di Indonesia. HbE heterozigot (HbAE) dan homozigot (HbEE) yang

asimptomatik atau memiliki gejala anemia ringan dengan manifestasi

laboratorium abnormal antara lain anemia mikrositik hipokrom. HbAE juga

memiliki eritropoiesis yang tidak efektif dan meningkatkan penyerapan zat

besi dengan tingkat yang lebih rendah daripada HbEE atau HbE / β0

2

thalassemia. Kondisi ini dapat menyebabkan risiko penumpukkan zat besi

yang menyebabkan disfungsi multi-organ.7

Karena tingkat mortalitas dan morbiditas yang tinggi serta tata laksana

adekuat, maka hemoglobinopati menjadi salah satu penyakit yang dicermati

oleh WHO dan seluruh dunia. Pasien Hb E dan beta-thalassemia memiliki

penyakit hemolitik lebih parah dari thalassemia atau penyakit Hb E

homozigot dan biasanya memiliki splenomegali.5

Berbagai macam penelitian

dilakukan untuk pencegahan serta pemeriksaan awal untuk mendiagnosis

HbE thalassemia. Untuk itu, pencegahan thalassemia perlu ditingkatkan

kembali untuk memperkecil kemungkinan lahirnya individu dengan

thalassemia mayor. Pencegahan dapat dilakukan dengan melakukan skrining

thalassemia pada pasangan pra-nikah. Hal ini menjadi sebuah kewaspadaan

karena batas usia minimal untuk perempuan menikah di Indonesia adalah 16

tahun. Maka dari itu penelitian ini bertujuan untuk skrining HbE-β

Thalassemia pranikah pada perempuan berusia lebih dari 16 tahun yang

berada di tingkat SMA.6

HbE merupakan kelainan hemoglobin yang bersifat genetik, maka

terdapat beberapa cara untuk mendeteksi kelainan tersebut. Beberapa cara

yang digunakan antara lain high performance liquid chromatography/HPLC,

elektroforesis hemoglobin, dan analisis DNA menggunakan sequencing DNA.

Penapisan gen HbE dengan jumlah sampel yang banyak, maka dilakukan

sequencing DNA yang memberikan hasil berupa identifikasi kelainan

hemoglobin pada genotype HbE.7

Untuk itu peneliti melakukan riset skrining HbE pada populasi SMA

Negeri di Kecamatan Singosari Kabupaten Malang untuk menjadi identifikasi

awal HbE. Penulis memilih kabupaten Malang karena menurut RISKESDAS

anemia terjadi pada pedesaan daripada perkotaan, data prevalensi Malang

masih belum diketahui dan Malang mudah diakses untuk penelitian.

3

1.2 Rumusan Masalah

Berdasarkan uraian latar belakang di atas, rumusan masalah dalam

penelitian ini adalah berapa jumlah persentase siswi SMAN Kecamatan

Singosari di Kabupaten Malang yang mempunyai HbE?

1.3 Hipotesis

Hipotesis yang diajukan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut:

terdapat siswi di SMAN Kecamatan Singosari Kabupaten Malang yang

mempunyai HbE.

1.4 Tujuan Penelitian

1.4.1 Tujuan Umum

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui jumlah persentase

siswi SMAN Kecamatan Singosari di Kabupaten Malang yang memiliki HbE.

1.4.2 Tujuan Khusus

Untuk mengetahui genotip HbE pada siswi SMAN Kecamatan Singosari

Kabupaten Malang.

1.5 Manfaat Penelitian

1.5.1 Manfaat bagi Peneliti

1. Bagi peneliti, menambah ilmu pengetahuan dan keterampilan

khususnya bidang biomolekuler serta meningkatkan kemampuan

penulis dalam penelitian.

2. Mendapatkan pengetahuan mengenai hubungan HbE dengan

anemia.

4

3. Sebagai salah satu syarat mendapat gelar Sarjana Kedokteran dari

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri

Syarif Hidayatullah Jakarta.

1.5.2 Manfaat Bagi Perguruan Tinggi

1. Melaksanakan Tri Darma Perguruan Tinggi dalam

melaksanakan fungsi dan tugas perguruan tinggi sebagai

lembaga yang menyelengggarakan pendidikan, penelitian, dan

pengabdian masyarakat.

2. Sebagai sumber informasi dan bahan referensi bagi penelitian

selanjutnya,

1.5.3 Manfaat Bagi Dinas Kesehatan Malang

1. Sebagai data prevalensi kejadian HbE pada siswi SMAN

kecamatan Singosari kabupaten Malang

2. Sebagai kebijakan untuk tindakan pencegahan seperti

dilakukannya skrining untuk mendeteksi kelainan hemoglobin

yaitu HbE-β Thalassemia.

1.5.4 Manfaat bagi Masyarakat

1. Bagi masyarakat, sebagai tindakan prevensi dan diagnosis untuk

penyakit HbE.

2. Memberi informasi dan pengetahuan tentang mutasi alel HbE

dan kaitannya dengan hemoglobin dan anemia.

3. Sebagai konseling pra nikah untuk analisis kemungkinan

penyakit HbE-β thalasemia yang akan diwarisi seorang anak.

5

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Landasan Teori

2.1.1 Hemoglobin

Fungsi utama sel darah merah adalah mengangkut O2 ke jaringan dan

mengembalikan karbondioksida (CO2) dari jaringan ke paru. Untuk mencapai

pertukaran gas ini, sel darah merah mengandung protein spesial yaitu hemoglobin.

Tiap sel darah merah mengandung sekitar 640 juta molekul hemoglobin. Tiap

molekul hemoglobin A (HbA) dewasa normal (hemoglobin dominan dalam darah

setelah usia 3-6 bulan) terdiri dari empat rantai polipeptida, α2β2 masing-masing

dengan gugus heme-nya. Berat molekul HbA adalah 68000. Darah orang dewasa

normal juga mengandung sejumlah kecil dua macam hemoglobin lain: Hb F dan

Hb A2. Hb F dan Hb A2 juga mengandung rantai α tetapi berturut-turut bersama

rantai γ dan δ, sebagai ganti rantai β.10

Sintesis heme terutama terjadi di mitokondria melalui suatu rangkaian

reaksi biokimiawi yang dimulai dari kondensasi glisin dan suksinil koenzim A

dalam pengaruh kerja enzim kunci asam δ-aminolevulinat (ALA) sintase yang

membatasi laju reaksi. Piridoksal fosfat (Vitamin B6) adalah koenzim untuk reaksi

ini, yang dirangsang oleh eritropoietin. Pada akhirnya protoporfirin bergabung

dengan besi dalam bentuk ferro (Fe2+

) untuk membentuk heme; setiap molekul

heme bergabung dengan satu rantai globin yang dibuat pada poliribosom. Suatu

tetramer yang terdiri dari empat rantai globin masing-masing dengan gugus heme-

nya dalam suatu “kantong” kemudian dibentuk untuk menjadi satu molekul

hemoglobin.10

Darah orang dewasa normal mengandung tiga jenis hemoglobin.

Komponen utama adalah hemoglobin A dengan struktur molekul α2β2.

Hemoglobin minor mengandung rantai globin γ (Hb Fetus atau Hb F) atau δ (Hb

A2) menggantikan rantai β. Pada embrio dan janin, Gower 1, Portland, Gower 2

5

6

dan Hb Fetus mendominasi pada stadium berbeda. Gen untuk rantai globin

terdapat dalam dua kelompok: ε, γ, δ, dan β pada kromosom 11 dan α pada

kromosom16.10

2.1.2 Fungsi Hemoglobin

Sel darah merah dalam darah arteri sistemik mengangkut O2 dari paru ke

jaringan dan kembali dalam darah vena dengan membawa CO2 ke paru. Seiring

molekul hemoglobin mengangkut dan melepas O2, setiap rantai globin pada

molekul hemoglobin tersebut bergerak mendekati satu sama lain. Kontak antara

α1β1 dan α2β2 menstabilkan molekul tersebut. Rantai β bergeser pada kontak α1β2

dan α2β1 selama oksigenasi dan deoksigenasi. Pada saat O2 dilepaskan, rantai β

ditarik terpisah, memungkinkan masuknya metabolit 2,3-difosfogliserat (2,3

DPG) yang menyebabkan penurunan afinitas molekul tersebut terhadap O2.

Pergerakan ini bertanggung jawab atas bentuk sigmoid kurva disosiasi O2. P50

(Yaitu tekanan parsial O2 pada saat hemoglobin tersaturasi setengah dengan O2)

darah normal adalah 26,6 mmHg. Dengan meningkatnya afinitas terhadap O2 yang

menurun, kurva bergeser ke kanan (P50 meningkat) .Pada keadaan normal, in vivo,

pertukaran O2 terjadi antara saturasi 95 % (darah arteri) dengan tekanan O2 arteri

rata-rata 95 mmHg dan saturasi 70 % (darah vena) dengan tekanan O2 vena rata-

rata 40 mmHg.Posisi normal kurva bergantung pada konsentrasi 2,3 DPG, ion

H+dan CO2 dalam sel darah merah, dan pada struktur molekul hemoglobin.

Konsentrasi 2,3-DPG, H+

, CO2 yang tinggi dan adanya hemoglobin tertentu.10

2.1.3 Polimorfisme β Globin

Semua gen globin mempunyai tiga ekson (regio yang mengkode) dan dua

intron (regio yang tidak mengkode) yang DNA-nya tidak terwakili dalam protein

yang telah selesai). RNA awal disalin dari intron dan ekson, dan dari salinan ini,

RNA yang berasal dari intron dibuang melalui proses yang dikenal sebagai

penggabungan (splicing). Intron selalu dimulai dengan dinukleotida G-T dan

diakhiri dengan dinukleotida A-G. Mekanisme penggabungan mengenali sekuens-

sekuens ini dan juga sekuens-sekuens di dekatnya yang dipertahankan. RNA

7

dalam inti juga “ditutup” dengan penambahan suatu struktur pada ujung 5’ yang

mengandung suatu gugus tujuh-metil-guanosin. Struktur tutup mungkin penting

untuk perlekatan mRNA pada ribosom, mRNA yang baru terbentuk juga

mengalami poliadenilasi pada ujung 3’. Proses ini menstabilkan mRNA.

Thalassemia dapat terjadi akibat mutasi atau delesi salah satu sekuens tersebut.10

Sejumlah sekuens lain yang dipertahankan penting dalam sintesis globin,

dan mutasi pada tempat-tempat ini dapat juga menyebabkan thalassemia.

Sekuens-sekuens ini mempengaruhi transkripsi gen, memastikan keandalannya,

Menentukan tempat untuk mengawali dan mengakhiri translasi, dan memastikan

stabilitas mRNA yang baru disintesis. Promotor ditemukan pada posisi 5’ pada

gen, apakah dekat dengan tempat inisiasi atau lebih distal. Ini adalah tempat RNA

polimerase berikatan dengan mengkatalisis transkripsi gen. Penguat (enhancer)

ditemukan pada posisi 5’ atau 3’ terhadap gen. Penguat penting dalam regulasi

ekspresi gen globin yang spesifik jaringan dan dalam regulasi ekspresi gen globin

yang spesifik jaringan dan dalam regulasi sintesis berbagai rantai globin selama

kehidupan janin dan pasca kelahiran.10

Regio pengendali lokus (locus control region/LCR) adalah unsur regulasi

genetik yang terletak jauh di hulu kelompok β globin. mRNA globin memasuki

sitoplasma dan mendekat pada ribosom (translasi) tempat terjadinya sintesis rantai

globin. Ini terjadi melalui perlekatan RNA transfer, masing-masing dengan asam

amino tersendiri, melalui perpasangan basa kodon-antikodon pada posisi yang

sesuai pada cetakan mRNA.10

2.1.4 Hemoglobinopati

Kelainan ini disebabkan oleh:

1. Sintesis hemoglobin abnormal

2. Menurunnya kecepatan sintesis rantai globin α atau β yang normal

(Thalassemia α dan β).

Kelainan yang paling penting secara klinis adalah anemia sel sabit.

Hemoglobin C, D, dan E juga sering ditemukan, dan seperti HbS merupakan

substitusi rantai β. Hemoglobin tak stabil jarang ditemukan dan menyebabkan

8

anemia hemolitik kronik dengan derajat keparahan yang bervariasi dengan

hemolisis intravaskular. Hemoglobin abnormal juga dapat menyebabkan

polisitemia (familial) atau methemoglobinemia kongenital.10

Defek genetik hemoglobin adalah kelainan genetik yang paling banyak

ditemukan di seluruh dunia. Kelainan ini ditemukan pada daerah tropis dan

subtropis dan sebagian besar bersifat terseleksi karena status pembawa

memberikan sedikit perlindungan terhadap malaria.10

2.1.5 Anemia

2.1.5.1 Kriteria Anemia

Parameter yang paling umum dipakai untuk menunjukkan penurunan

massa eritrosit adalah kadar hemoglobin, disusul oleh hematokrit dan hitung

eritrosit. Pada umumnya ketiga parameter tersebut saling bersesuaian. Yang

menjadi masalah adalah berapakah kadar hemoglobin yang dianggap abnormal.

Harga normal hemoglobin sangat bervariasi secara fisiologik tergantung pada

umur, jenis kelamin, adanya kehamilan dan ketinggian tempat tinggal. WHO

menetapkan cut off point anemia untuk keperluan penelitian lapangan.10

Tabel 2. 1 Kriteria Anemia Menurut WHO

Kriteria Anemia

Kelompok Kriteria Anemia (Hb)

Laki-laki dewasa <13 g/dl

Wanita dewasa tidak hamil <12 g/dl

Wanita Hamil <11 g/dl

Sumber: A.V. Hoffbrand, 2005

2.1.5.2 Patofisiologi dan gejala anemia

Gejala umum anemia (sindrom anemia atau anemic syndrom) adalah

gejala yang timbul pada setiap kasus anemia. Apapun penyebabnya, apabila kadar

hemoglobin turun di bawah nilai tertentu.

9

Gejala umum anemia timbul karena anoksia organ yang merupakan

mekanisme kompensasi tubuh terhadap berkurangnya daya angkut oksigen1

Gejala umum anemia menjadi jelas (anemia simptomatik) apabila kadar

hemoglobin telah turun di bawah 7 g/dl. Berat ringannya gejala umum anemia

tergantung pada:

A. Derajat penurunan hemoglobin.

B. Kecepatan penurunan hemoglobin.

C. Usia.

D. Adanya kelainan jantung atau paru sebelumnya.1

Gejala anemia dapat digolongkan menjadi tiga jenis gejala yaitu:

1. Gejala umum anemia

Gejala umum anemia disebut juga sebagai sindrom anemia, timbul karena

iskemia organ target serta akibat mekanisme kompensasi tubuh terhadap

penurunan kadar hemoglobin. Gejala ini muncul pada setiap kasus anemia

setelah penurunan hemoglobin sampai kadar tertentu (Hb<7 g/dl). Sindrom

anemia terdiri dari rasa lemah, lesu, cepat lelah, telinga mendenging

(tinnitus), mata berkunang-kunang, kaki terasa dingin, sesak napas dan

dispepsia. Pada pemeriksaan, pasien tampak pucat, yang mudah dilihat pada

konjungtiva, mukosa mulut, telapak tangan, dan jaringan bawah kuku.

Sindrom anemia bersifat tidak spesifik karena dapat ditimbulkan oleh

penyakit di luar anemia dan tidak sensitif karena timbul setelah penurunan

hemoglobin yang berat (Hb<7 g/dl).1

2. Gejala khas masing-masing anemia

Gejala ini spesifik untuk masing-masing jenis anemia. Sebagai contoh:

A. Anemia defisiensi besi: disfagia, atrofi papil lidah, stomatitis

angularis, dan kuku sendok (koilonychia).

B. Anemia megaloblastik: glositis, gangguan neurologik pada

defisiensi vitamin B12.

10

C. Anemia hemolitik: ikterus, splenomegali, dan hepatomegali.

D. Anemia aplastik: perdarahan dan tanda-tanda infeksi.1

2.1.6 HbE

HbE= HbE (α2β226 glu-lys

) adalah hemoglobin variant hasil dari pewarisan

alel β-thalassemia dari satu orang tua dan varian struktural HbE dari yang

lain. Hasil HbE dari subtitusi G → A di kodon 26 dari gen β globin, yang

menghasilkan hemoglobin struktural yang abnormal serta mengaktifkan

cryptic splice site, sehingga mRNA menjadi abnormal karena terdapat kodon

stop baru yang dihasilkan sehingga mRNA menjadi non fungsional. HbE

memiliki gejala seperti bentuk ringan dari β-thalassemia. Patofisiologi Hb E /

β-thalassemia terkait dengan banyak faktor termasuk ketidakseimbangan

rantai globin, eritropoiesis yang inefektif, apoptosis, kerusakan oksidatif, dan

usia sel darah merah yang singkat.13

Gambar 2.1 Pola splicing dengan beberapa tipe mutasi pada ekson 1 dan IVS-1 β

globin23

11

Tiga mutasi pada ekson 1 yang menyebabkan alternative splicing

berlokasi pada kodon 24, 26, dan 27. Ketiga mutasi ini akan mengaktifkan

situs cryptic splicing pada nomor 2 tetapi tidak pada nomor 1 dan 4. Splicing

dapat juga terjadi pada 5’ pada IVS-1 (nomor 3).21

Faktor genetik termasuk jenis pewarisan mutasi β-thalassemia dengan

HbE, pewarisan alpha (α) thalassemia, dan polimorfisme terbukti

berhubungan dengan peningkatan sintesis hemoglobin janin (HbF).19

Pasien yang mewarisi alel β-thalassemia ringan dengan Hb E mungkin

memiliki gejala ringan, sementara mereka yang ikut mewarisi β+ atau alel β

0-

thalassemia mungkin akan mengalami gejala yang lebih parah. HbE terdapat

pada keadaan heterozigot (genotip AE atau HbE trait), homozigot (EE atau

HbE) dan berbagai variasi heterozigotseperti HbE / β thalassemia (E / β thal),

sel sabit / penyakit E hemoglobin (SE genotip).19

Nilai hemoglobin normal, namun sel darah merah menunjukkan mikrositik

dengan MCV 73 fl serta MCH menurun, dan MCHC normal.27

Jumlah HbE

pada AE heterozigot menurun jika menjadi defisiensi besi. Sedangkan pada

individu yang memiliki HbE Homozigot juga termasuk HbE asimptomatik.

Dan mempunyai normal atau menurun pada level hemoglobin, sel darah merah

terlihat lebih mikrositik.26

Dengan MCV 67 fl, MCHC normal, retikulosit dan

sel darah merah dalam keadaan normal, pada apusan darah tepi dapat terlihat

sel target, dan peningkatan lisis osmosis.27

Gambar 2.2 Apusan darah pada HbE23

12

Rantai β dari HbE (βE) disintesis sangat rendah dibandingkan dengan

hemoglobin dewasa normal (HbA). Hal ini karena terdapat mutasi yang

menciptakan splicing site yang bergantian dalam suatu ekson. Hal ini

menyebabkan berkurangnya sintesis rantai βE. HbE homozigot menunjukkan

beberapa gejala thalassemia β. Oleh karena itu HbE dianggap sebagai

hemoglobinopati thalassemia.13

Gambar 2. 3 Pola penyebaran HbE di Asia Tenggara23

2.1.6.1 Genotip dan Fenotip HbE

Walaupun terlihat persamaan genotip, β Thalassemia heterozigot dan

HbE mempunyai variasi fenotip. Variasi pada anemia, pertumbuhan,

perkembangan, hepatosplenomegali, dan ketentuan transfusi. Derajat

keparahan berdasarkan usia saat pertama kali transfusi, frekuensi transfusi,

hepatosplenomegali, perubahan tulang, dan retardasi mental. Dengan kriteria

tersebut, fenotip dari HbE-β Thalassemia diklasifikasikan menjadi 3

kelompok yaitu:

1. Ringan

Kadar hemoglobin>7,5 g/dl dapat dipertahankan walaupun tanpa transfusi.

Jika transfusi kurang dari satu kali setiap 2 tahun, atau kurang dari 6 bulan

jika transfusi pertama kali setelah umur 10 tahun.

13

2. Moderate

Membutuhkan transfusi dimulai umur 4 tahun atau lebih tua. Frekuensi

transfusi antara 6 minggu-4 bulan, atau antara 3 dan 4 bulan jika pertama kali

transfusi sebelum umur 4 tahun.

3. Berat

Membutuhkan transfusi yang dimulai antara usia 1-2 tahun. Dengan

variasi hemoglobin antara 2,5-13,5 g/dl.28

Penelitian sebelumnya menyebutkan bahwa variasi dari aspek klinis HbE

serta tingkat keparahan dari anemia berhubungan dengan semakin

abnormalitas splicing βE

akan semakin parah gejala dengan kadar hemoglobin

antara 2,9-6,1 % dan merupakan faktor dominan dari tingkat keparahan

anemia.25

Gambar 2.4 Fenotip, genotip, anemia, dan sifat lain dari HbE25

14

2.1.7 PCR

Reaksi polimerase (Polymerase Chain Reaction, PCR) adalah suatu

metode enzimatis untuk amplifikasi DNA dengan cara in vitro. PCR ini

pertama kali dikembangkan pada tahun 1985 oleh Kary B. Mullis.

Amplifikasi DNA pada PCR dapat dicapai bila menggunakan primer

oligonukleotida yang disebut amplimers. Primer DNA suatu sekuens

oligonukleotida pendek yang berfungsi mengawali sintesis rantai DNA. PCR

memungkinkan dilakukannya pelipatgandaan suatu fragmen DNA. Umumnya

primer yang digunakan pada PCR terdiri dari 20-30 nukleotida. DNA

template (cetakan) yaitu fragmen DNA yang akan dilipat gandakan dan

berasal dari patogen yang terdapat dalam specimen klinik. Enzim DNA

polymerase merupakan enzim termostabil Taq dari bakteri termofilik

Thermusaquaticus. Deoksiribonukleotidatrifosfat (dNTP) menempel pada

ujung 3’ primer ketika proses pemanjangan dan ion magnesium menstimulasi

aktivasi polimerase.39

Prinsip-prinsip PCR yaitu langkah-langkah yang mengarah ke

amplifikasi DNA secara bertahap dapat diringkas sebagai:

1. Denaturasi

Ketika molekul ganda DNA (dsDNA) molekul dipanaskan mencapai

94ºC, untaian yang berpasangan akan terpisah (denaturasi). Hal ini

memungkinkan primer dapat mengakses ke DNA beruntai tunggal (ssDNA).

2. Annealing

Campuran reaksi didinginkan (sekitar 50ºC) untuk memungkinkan

primer untuk memilih dan mengikat (berhibridisasi) ke posisi pelengkap

mereka pada molekul Template ssDNA.

3. Pemanjangan

ssDNA / primer solution dipanaskan hingga 72ºC. terdapat heat stable

polimerase, PCR buffer, dNTP dan magnesium (Mg2 +), prosedur replikasi

dimulai. Dengan setiap pengulangan siklus ini, target dua kali lipat dan

15

segera, setelah sekitar 30 siklus,reaksi akan menghasilkan lebih dari 1 juta

kopi dari fragmen DNA target.39

Gambar 2. 5 Komponen PCR15

Gambar 2. 6 Denaturasi DNA15

16

Gambar 2. 7 Annealing15

Gambar 2. 8 Elongasi15

Untuk mengkatalisis amplifikasi, sebuah enzim DNA polymerase

digunakan dan enzim ini perlu disediakan buffer yang tepat. Ion logam

kofaktor (s) dan DNA blok, dNTP. Serta komponen opsional yang dapat

ditambahkan untuk aplikasi tertentu (misalnya, untuk menstabilkan enzim,

memanipulasi denaturasi suhu, dll). Dalam reaksi PCR, komponen-komponen

17

berikut dicampur dalam tabung PCR dan dibuat untuk 25-100 uL dengan

penambahan (dd) H2O.15

PCR pada dasarnya melibatkan jumlah siklus pada temperatur yang

berbeda. Template didenaturasi pada suhu (+ 94 °C); lain halnya di mana

primer yang hibrid ke template berbagai suhu mungkin hingga 72 °C dan

siklus suhu ketiga di mana primer diperpanjang (72 °C).39

Primer adalah rangkaian pendek spesifik untai tunggal DNA (ssDNA),

yang dikenal sebagai oligodeoxyribonucleotides atau oligomer. Primer ini

mengapit helai yang berlawanan pada kedua ujung DNA target. Desain

primer sangat penting dan merupakan komposisi, urutan dengan template.

Konsentrasi primer yang memainkan peran penting dalam hasil PCR.39

Konsentrasi primer harus 0,1-0,5 pM dalam reaksi optimal yang bersifat

standar. Untuk mendapatkan molaritas 0,1-0,5 pM, jumlah molar yang sesuai

primer yang dibutuhkan dalam reaksi 100 uL, adalah 10-50 pmol. Hal ini

berguna untuk mencairkan oligonukleotida. Primer dengan konsentrasi 10

pmol / uL (10 M), memungkinkan penambahan volume primer yang baik

untuk reaksi PCR (1-5 uL / 100uL PCR reaksi).39

2.1.8 Elektroforesis

Setelah melakukan PCR, cara mengetahui keberhasilan PCR adalah

dengan menggunakan elektroforesis. Amplikon dapat dipisahkan dan

divisualisasikan pada matriks yang memungkinkan pemisahan molekul asam

nukleat. Matriks ini, adalah gel agarosa yang paling umum digunakan.15

Agarosa adalah medium yang mudah dan murah. Dalam bentuk gel

agarosa memberikan viskositas yang akan memungkinkan DNA memisahkan

medan listrik, berdasarkan ukuran dan konformasi. Ukuran dari matriks

dalam gel agarosa ditentukan oleh persentase agarosa dalam gel dan mungkin

dimanipulasi untuk memungkinkan efisiensi elektroforesis optimal,

18

tergantung pada rentang ukuran amplikon diharapkan dari analisis PCR

tertentu.15

Setelah elektroforesis selesai ada metode yang yang dapat digunakan

untuk membuat DNA dalam gel terlihat. Yang paling umum digunakan

adalah etidium bromida untuk mewarnai gel, dan kemudian

memvisualisasikan gel pada UV trans-illuminator. Etidium bromida

dimasukkan bersama molekul DNA dan akan mengirimkan cahaya UV

sebagai fluoresensi gelombang yang mudah untuk dilihat dan difoto.

Kondisi elektroforesis tergantung pada:

1. Kekuatan saat ini (Ampere)

2. Kekuatan diterapkan (Watt)

3. Beda potensial (Volt)

Paling umum kriteria 5 Volts / cm gel diterapkan dan menghasilkan

tegangan total 60- 100 V untuk sebagian besar gel. Secara umum tegangan

yang lebih tinggi mengakibatkan pemisahan lebih cepat, tetapi tegangan yang

lebih rendah dapat terjadi pemisahan yang paling akurat dan resolusi spesies

DNA yang berbeda.15

2.1.9 Sequencing DNA

Kualitas dan kemurnian DNA yang akan dilakukan sequencing sangat

penting dalam memastikan reaksi sequencing berjalan dengan baik. Terdapat

banyak kit komersial di pasaran yang dapat digunakan untuk memurnikan

amplikon PCR sebelum sequencing. Sebagian besar menggunakan metode di

mana DNA terikat pada matriks dalam kolom pendek dapat dibersihkan

secara ekstensif untuk menghilangkan kotoran, dan kemudian ditambahkan

elusi dalam volume yang sesuai dari air atau TE. Pada dasarnya, amplikon

adalah elektroforesis yang dipisahkan dari komponen lain dalam campuran

PCR, kemudian DNA tersebut dilakukan elusi dari agarose dan diendapkan

dengan alkohol.15

19

Ada dua prosedur umum untuk menentukan urutan nukleotida gen atau

genom:

1. The chemical cleavage method yang dirancang oleh Allan Maxam

dan Walter Gilbert dimulai dengan DNA yang diberi label di salah satu ujung

satu untai dengan Phospat. DNA berlabel kemudian akan rusak di salah satu

ujung dari empat nukleotida. Kondisi yang dipilih sehingga rata-rata satu

yang rusak dibuat per rantai dan fragmen yang dihasilkan dianalisis pada

pemisahan gel akrilamida untuk divisualisasikan melalui radioaktif marker

pada autoradiogram. Metode ini menemukan aplikasi terbatas dan hampir

tidak pernah digunakan.

2. Prosedur DNA sequencing yang lebih sering digunakan adalah The

controlled interruption of enzymatic replication, metode yang dikembangkan

oleh Fred Sanger dan rekan-rekannya. Dalam metode ini, DNA polimerase

digunakan untuk menyalin molekul untai tunggal (template). Reaksi sintesis

ini dilengkapi oleh fragmen pelengkap (primer sequencing, yang sangat mirip

dengan PCR primer). Selain empat trifosfat deoxyribonucleoside (yang diberi

label dengan radioaktivitas atau dengan fluoresensi marker), campuran

inkubasi berisi 2 ', 3'-dideoksi analog dari salah satu dNTP. Penggabungan

analog blocks sintesis lebih lanjut rantai baru karena kekurangan ujung 3'-

hidroksil yang dibutuhkan untuk membentuk ikatan fosfodiester berikutnya

dan menghentikan rantai baru. Oleh karena itu, panjang fragmen yang

berbeda dihasilkan dan dianalisis pada gel akrilamida. Aplikasi ini telah

melihat beberapa perkembangan yang luar biasa. Dideoxy metode sequencing

telah otomatis untuk mendukung beban besar urutan yang akan dianalisis

(Misalnya, proyek genom manusia), dan sistem pemisahan telah dimodifikasi

untuk memungkinkan beberapa pilihan (misalnya, plate format vs gel tube

format vs capillary columns).15

Tahap dalam sequencing DNA adalah:

1. Menyiapkan template DNA.

2. Automatisasi reaksi siklus sequencing.

3. Kondisi siklus sequencing.

4. Purifikasi produk extension.

20

5. Menggunakan sequencer ABI PRISM 3730xl Genetic Analyzer

develop by Applied Biosystems®, US.17

Gambar 2. 9 Sequencing DNA17

21

2.2 Kerangka Teori

Faktor terjadinya HbE

Ineffective

eritropoiesis

Apoptosis

sel

kerusakan

oksidatif

Usia sel

darah merah

yang singkat

Ineffective

hemopoiesis

heme globin

Lokus β

globin

α globin

Gen HBB mengkode pembentukan

rantai β yang terletak pada

kromosom 11P15.4

Terdapat 1606 basa

dan 3 ekson

β globin

Subtitusi GA di

kodon 26

Cryptic mRNA

splicing site

Kodon stop baru

Berkurangnya

produksi protein

rantai β

Mutasi pada intron

IVS-1 posisi 5

Mutasi pada IVS-1

posisi 1

Subtitusi basa

guanin

sitosin

Berkurangnya

produksi

protein β globin

Hilangnya

produksi β globin

Β thalassemia HbE

Manifestasi klinis:

Anemia akut dengan

Hb=7 g/dl

22

2.3 Kerangka Konsep

Skrining siswi16-19 tahun SMAN Kecamatan Singosari kabupaten

Malang

: Variabel yang diukur

2.4 Definisi Operasional

Dalam penelitian ini peneliti menggunakan istilah-istilah yang

didefinisikan sebagai berikut:

No Variabel Definisi Alat Ukur Skala Skor

1 HbE Mutasi pada kodon

26 β globin

ABI PRISM 3730xl

Genetic Analyzer

develop by Applied

Biosystems,US.

Ordinal 1. HbE trait: 2

puncak pada

basa GAG

2. Wildtype

2 Hemoglobin Komponen

penyusun sel darah

merah

Hemoglobinometer

Easy touch

Nominal Normal

hemoglobin

pada:

Wanita:>12 g/dl

Variabel independen:

HbE:

1. Wildtype

2. Mutant

Variabel dependen:

Persentase HbE

Variabel dependen:

Pengukuran hemoglobin

23

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Desain Penelitian

Metode yang digunakan pada penelitian ini adalah deskriptif dengan

desain studi cross sectional. Penelitian ini dilakukan dengan tahap isolasi

DNA, selanjutnya penentuan konsentrasi dan kemurnian hasil DNA diukur

menggunakan spectrophotometer, lalu dilakukan PCR dan dilanjutkan dengan

elektroforesis. Setelah itu produk PCR akan dikirim ke first base

laboratorium untuk dilakukan sequencing dengan menggunakan teknik

sequencer Abi Prism 3730xl Genetic Analyzer develop by Applied Biosystems,

US. Untuk pengukuran hemoglobin menggunakan hemoglobinometer easy

touch.

3.2 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilakukan mulai bulan Desember 2016 sampai dengan

Februari 2017. Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Kultur Sel,

Laboratorium persiapan MPR, Laboratorium Biologi, dan ruangan geldoc

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif

Hidayatullah, Jakarta.

Penelitian ini merupakan bagian dari Penelitian pemetaan β globin di

Indonesia dengan SEAMEO RECFON FKUI.

3.3 Populasi dan Sampel

3.3.1 Populasi Terjangkau

Populasi terjangkau penelitian ini adalah siswa SMA Negeri Kecamatan

Singosari, Kabupaten Malang.

3.3.2 Kriteria Pemilihan Sampel

Pemilihan Kecamatan, SMA, dan sampel menggunakan simple random

sampling. Lalu didapatkan Kecamatan Singosari, Kabupaten Malang.

23

24

Responden untuk pengambilan sampel darah adalah remaja putri yang

masih duduk di kelas 10 dan 11 SMA di Kabupaten Malang. Responden yang

dipilih harus memiliki kriteria inklusi sebagai berikut:

1. Berusia antara 16-19 tahun.

2. Berdomisili di Kabupaten Malang.

3. Berkenan berpartisipasi dalam screening dengan tidak terpaksa.

Kriteria eksklusi dari penelitian ini adalah:

1. Dalam kondisi hamil, haid, dan puasa.

2. Sedang dalam kondisi sakit.

Kriteria yang dipilih remaja putri karena menurut RISKESDAS

Berdasarkan jenis kelamin didapatkan bahwa proporsi anemia pada

perempuan lebih tinggi dibandingkan pada laki-laki. Kriteria lain yaitu

berusia 16-19 tahun karena untuk tindakan pencegahan pranikah. Hal ini

menjadi sebuah kewaspadaan karena batas usia minimal untuk perempuan

menikah di Indonesia adalah 16 tahun. Maka dari itu penelitian ini bertujuan

untuk screening HbE/Thalassemia pranikah pada perempuan berusia lebih

dari 16 tahun yang berada di tingkat SMA. Lalu untuk kriteria berdomisili di

Kabupaten Malang yaitu dibandingkan berdasarkan tempat tinggal didapatkan

bahwa anemia di pedesaan lebih tinggi yaitu 22,8% dibandingkan dengan

perkotaan yaitu 20,8 %.3

Dan memilih pemetaan β globin di Kabupaten

Malang karena mengikuti penelitian SEAMEO-RECFON FKUI dan belum

terdapat data prevalensi HbE di Kabupaten Malang serta terjangkau dari

peneliti.

3.3.3 Perkiraan Besar Sampel

Perhitungan besar sampel menggunakan penelitian deskriptif. Penelitian

deskriptif yaitu penelitian yang bertujuan untuk menggambarkan proporsi

atau rerata suatu variabel dan hasil pengukurannya dikelompokkan dengan

klasifikasi tertentu11

.

25

Rumus perhitungan adalah:

n =Zα2xPxQ

d2

n =1,962x35,7 %x(1 − 35,7%)

0,102

n =1,962x0,357x(1 − 0,357)

0,102

n = 88

Untuk mengetahui syarat sampel deskriptif, terdapat panduan prediksi

yaitu:

NxP>5

88x0,357>5

31,416>5

Karena memenuhi syarat besar sampel deskriptif, maka peneliti boleh

memakai besar sampel sebesar 88 individu.

Keterangan:

N : Besar sampel

Zα : nilai distribusi normal baku pada tabel Z

P : Proporsi dari penelitian sebelumnya

26

Q : 1-P

D : Presisi (ditentukan oleh peneliti)

Zα yang dipilih yaitu 5 % karena penelitian kedokteran menggunakan 5%

dan 2 arah karena menyatakan ada perbedaan proporsi tanpa menyebutkan

secara spesifik yaitu sebesar 1,96. Proporsi penelitian sebelumnya dari

penelitian Fucharoen et al tentang prevalensi HbE di Thailand yaitu sebesar

35,7%.14

Presisi yang digunakan oleh peneliti yaitu 10% karena presisi

merupakan kesalahan penelitian yang masih bisa diterima untuk memprediksi

yang akan diperoleh dengan selisih kurang lebih 10% masih dapat diterima.

3.3.4 Teknik Pemilihan Sampel

Sampel yang dipilih berdasarkan Simple Random Sampling. Sampel

diambil secara acak pada SMAN Kecamatan Singosari, Kabupaten Malang.

3.4 Alat dan Bahan Uji

Tabel 3. 1 Alat dan bahan pengambilan sampel darah

Pengambilan sampel darah Alat Bahan Keterangan Spuit 3 cc Torniquet

Tabung EDTA

Handscoon

Alcohol swab

- -

Tabel 3. 2 Alat dan bahan pengukuran kadar hemoglobin

Pengukuran kadar hemoglobin

Alat Bahan Keterangan Hemoglobinometer easy touch Strip hemoglobin

Whole blood 3 cc

27

Tabel 3. 3 Alat dan bahan isolasi genom DNA dari darah

Isolasi Genom DNA dari darah Alat Bahan Keterangan

Tabung mikrosentrifugasi 1,5 ml steril

Whole Blood

RBC

RBC Lysis

Buffer

300 μL

900μL

Water bath AS ONE TRW-42TP, 60

oC

(untuk rehidrasi DNA yang cepat)

GD column

2 mL collection tube

Microcentrifuge Eppendorf 5417

Vortex DAAD

Pipet mikro Nichipet EX Nichiryo

ukuran 2-20 μLdan 20-200 μL

Pipet mikro BIORAD ukuran 100-

1000 μL

Tip mikro Biologix ukuran 10 μL, 200

μL, dan 1000 μL

Biomedical Freezer SANYO

Aluminium foil

R

Ethanol Absolut

W1 Buffer

Wash Buffer

Elution Buffer

200 μL

400 μL

600 μL

50 μL

Tabel 3. 4 Alat dan bahan pengukuran kemurnian dan konsentrasi hasil DNA

Pengukuran kemurnian dan konsentrasi hasil DNA

Alat Bahan Keterangan

Spektrofotometer Denovix DS-

11

Aquadest

Elusi buffer

Micropipet

Tip

Genom DNA -

28

Tabel 3. 5 Alat dan bahan untuk PCR

PCR Alat Bahan Keterangan

Mesin PCR Applied

Biosystems 2720 Thermal

Cycler

Kappa Hifi HotStart

ReadyMix PCR kit

Primer reverse dan

froward

Nuclease Free

Water

Sample DNA

12,5μL

1 μL

6,5 μL

4 μL

Tabel 3. 6 Alat dan bahan elektroforesis genom DNA hasil PCR

Elektroforesis genom DNA Alat Bahan Keterangan Elektroforesis ATTO My Power

II 300 AE-8135

Microwave SHARP low

wattage Timbangan analitik

AdventureTM

Gel doc system

Printgraph ATTO AE-6905

CF CCD

camera controller

Tray elektroforesis

Comb elektroforesis

Ladder Geneaid 100 bp

Gelaskimia

Gelasukursibata

Agarose

Ethidium

bromide

Loading dye

Plastic wrap

EDTA (TAE) 1x

-

Tabel 3. 7 Alat dan bahan sequencing DNA

Sequencing DNA

Alat Bahan Keterangan

DNA sequencing ABI PRISM

3730xl Genetic Analyzer

develop by Applied

Biosystems, US

Plate sequencer

DNA yang sudah di

PCR

Primer reverse dan

forward

25 μL

29

3.5 Cara Kerja Penelitian

3.5.1 Pengumpulan Data

Sebelum mengambil darah dilakukan lembar informed concent pada

siswi. Pengambilan darah dilakukan oleh tim SEAMEO-FKUI pada bulan

November sampai Desember 2016. Cara pengambilan data dalam penelitian

ini yaitu data primer. Lalu menggunakan punksi vena untuk skrining HbE.

Untuk melakukan penelitian ini terdapat lembar informed consent

(lampiran 3) untuk kesediaan siswi SMA menjadi sampel. Dilakukan

pengambilan darah sebanyak 3 cc satu kali. Sampel darah diberi nomor dan

disimpan dalam cold room untuk dilakukan isolasi genom DNA, kemudian

dilakukan teknik PCR, elektroforesis, dan sequencing DNA, dan selanjutnya

dianalisis.

3.5.2 Isolasi DNA

Tabel 3. 8 Tahapan Isolasi genom DNA

Persiapan Sampel 1. Darah sebanyak 300 μl dimasukkan kedalam 1,5 ml

tabung mikrosentrifugasi

2. 900 μl RBC Lysis Buffer kemudian ditambahkan dan

dikocok.

3. Tabung diinkubasi 10 menit dalam suhu ruangan.

4. Tabung disentrifugasi selama 5 menit pada

kecepatan 3000 rpm selama 5 menit, supernatant

dibuang.

5. 100 μl RBC Lysis Buffer ditambahkan untuk

meresuspensi endapan leukosit, kocok, kemudian

diproses dengan cell lysis.

30

Langkah 1:Cell lysis 6. 200 μl GB Buffer ditambahkan ke dalam tabung.

7. Tabung diinkubasi pada suhu 60o

C selama 10

menit untuk memastikan sampel lisis.

8. Pada saat yang sama tabung lain berisi 50 μl Elution

Buffer untuk tiap satu sampel disiapkan, kemudian

diinkubasi pada suhu 60oC.

9. Setelah tabung sampel diinkubasi, tabung

didinginkan di suhu ruangan.

Langkah 2: DNA

binding

10. 200 μl ethanol absolute ditambahkan kedalam

tabung tadi, kemudian secara cepat dikocok selama

10 detik.

11. GD Column pada 2 mL Collection Tube disiapkan.

12. Campuran ethanol dipindahkan kedalam GD

Column.

13. Tabung disentrifugasi pada 14.000 RPM selama 5

menit.

14. Cairan pada 2 ml Collection Tube dibuang.

15. GD Column ditempatkan kembali pada 2 ml

Collection Tube.

Tabel 3. 8 Tahapan Isolasi genom DNA(lanjutan)

31

Langkah 3: Wash

16. 400 μl W1 Buffer ditambahkan kedalam GD

Column kemudian disentrifugasi pada 14.000 RPM

selama 1 menit.



Collection Tube.

19. 600 μl Wash Buffer ditambahkan kedalam GD

Column.

20. Tabung disentrifugasi pada 14.000 RPM selama 1

menit.



Collection Tube.

23. Tabung disentrifugasi pada 14000 RPM selama 1

menit.

Langkah 4: DNA

Elution

24. GD Column yang sudah kering dipindahkan

kedalam tabung mikrosentrifugasi yang steril.

25. 50 μl Elution Buffer yang sudah diinkubasi

ditambahkan kedalam matriks kolom, dibiarkan

selama 15 menit

26. Tabung disentrifugasi pada 14.000 – 16.000 x g

selama 1 menit untuk mendapatkan hasil.

Tabel 3. 8 Tahapan Isolasi genom DNA(lanjutan)

32

3.5.3 Pengukuran kemurnian dan konsentrasi hasil DNA

DNA genom hasil isolasi dianalisis secara kuantitatif dengan

menggunakan Denovix Spectrophotometer sehingga diketahui konsentrasi

dan kemurnian DNA.

1. Sebanyak 1 μl ddH2O dimasukkan ke dalam apparatus sebagai

blanko.

2. Apparatus dibersihkan dengan tisu.

3. Sebanyak 1 μl elusi buffer dimasukkan ke dalam apparatus sebagai

blanko.

4. Aparatus dibersihkan dengan tisu dan dapat dimulai pengukuran

DNA.

5. Sebanyak 1 μl DNA hasil isolasi dimasukkan ke dalam apparatus

kemudian dilakukan pengukuran.

6. Konsentrasi DNA dapat diketahui dari nanogram/μl dan kemurnian

DNA dapat diketahui dari nilai 260/280.

3.5.4 Amplifikasi Fragmen DNA dengan PCR (Polymerase Chain

Reaction)

DNA genom hasil isolasi diamplifikasi dengan PCR menggunakan

primer spesifik forward dan reverse. Forward primer F 5’-

TAGCAATTTGTACTGATGGTATGG-3’ dan Reverse Primer R 5’-

TTTCCCAAGGTTTGAACTAGCTCTT-3’. PCR berlangsung selama 30

siklus dengan program PCR yang terdiri dari initial denaturasi 95oC selama 3

menit, denaturasi 98oC selama20 detik, annealing 60-75

oC selama 15 detik,

extension 72oC selama 15-60 detik, final extension 72

oC selama 15-60 sec/kb.

Konsentrasi dan suhu yang digunakan sudah merupakan hasil optimasi.

Produk PCR pada 306 bp.

33

Tabel 3. 9 Komposisi Mix PCR

Komponen dan konsentrasi bahan Volume akhir dalam larutan

Kappa Hifi HotStart ReadyMix PCR kit 12,5 μl

Primer forward (10 pmol) 1 μl

Primer reverse (10 pmol) 1 μl

DNA Template (100 ng/μl) 4 μl

ddH2o 6,5 μl

Total voume reaksi 25 Μl

3.5.5 Analisis Fragmen DNA Menggunakan Elektroforesis

Hasil isolasi dan amplifikasi DNA dianalisis menggunakan

elektroforesis. Tahap elektroforesis adalah sebagai berikut:

1. Pada elektroforesis menggunakan gel agarosa 1,5% dengan cara

mencampurkan 1,5 gram bubuk agarosa dengan 100 mL buffer

TAE 1x.

2. Larutan Ethidium bromide ditambahkan pada gel sebanyak 1 μl

untuk visualisasi DNA.

3. Sebanyak 3 μl DNA hasil PCR dicampurkan dengan 1 μl loading

dye dan dimasukkan ke dalam sumur.

4. Sebanyak 5 μl ladder 100 bp dicampur dengan 1 μl loading dye

sebagai marker dimasukkan ke dalam sumur.

5. Elektroforesis berlangsung selama 60 menit dengan beda potensial

90 V dalam buffer TAE. Setelah elektroforesis selesai, gel

ditempatkan pada UV transiluminator pada Gel Doc System.

3.5.6 Deteksi Polimorfisme alel HbE dengan Sequencing

Setelah mendapatkan hasil produk PCR, selanjutnya produk PCR diambil

sebanyak 25 μl dan dikirim ke first base laboratorium menggunakan applied

byosystem untuk dilakukan sequencing.

34

3.5.7 Analisis Hasil Sequencing DNA menggunakan Chromas software

Hasil sequencing dianalisis menggunakan Chromas software.

3.5.8 Alur Kerja Penelitian

Amplifikasi fragmen

DNA menggunakan

PCR

Deteksi HbE menggunakan

Sequencing

Pengambilan

sampel darah

Persentase frekuensi Hb E

pada populasi siswi SMAN

Kecamatan Singosari

Kabupaten Malang

Analisis fragmen DNA

dengan elektroforesis

Analisis konsentrasi DNA

dengan spektrofotometri

Isolasi DNA

Responden

Penelitian

Interpretasi hasil sequencing

menggunakan Chromas

software

Pengukuran Hb

35

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil

4.1.1 Hasil Isolasi Genom DNA dari Whole Blood

Hasil isolasi genom DNA menggunakan spektrofotometri dapat dilihat

pada tabel (Lampiran 3)

N (μg ml-1

) = 70 A260 – 40 A280

A260 dan A280 merupakan daya serap DNA pada panjang gelombang 260 nm

dan 280 nm. Indikator yang lebih baik dari kemurnian sampel DNA adalah rasio

A260 : A234. DNA memiliki daya serap minimum pada 234 nm dan daya serap

protein tinggi pada 205 nm. Rasio A260 : A234 merupakan indikator yang sangat

sensitif untuk menentukan kontaminasi protein. Rasio antara 1,8-2,0 menunjukkan

asam nukleat yang murni. A260 dan A234 merupakan daya serap sampel DNA

pada panjang gelombang 260 nm dan 234 nm. Dengan menggunakan kedua

panjang gelombang tesebut, konsentrasi DNA dapat dihitung dengan

menggunakan rumus berikut.36

N(μg ml-1

) = 52,6 A260 – 5,24 A234

Identifikasi kontaminasi memiliki makna tertentu. Jika rasio 260/280

rendah, maka terdapat kontaminan yang diserap pada gelombang 280 nm. Hal

tersebut bias disebabkan oleh fenol atau reagen lain pada protocol dan

konsentrasi asam nukleat yang sangat rendah (>10 ng/uL). Meskipun kualitas

DNA merupakan hal yang penting, namun bergantung kembali pada teknik

apa yang digunakan.

Berdasarkan nilai konsentrasi, syarat konsentrasi DNA genom minimum

adalah 100 ng/μl.37

Pada penelitian ini semua sampel dapat dianalisis dengan

baik saat PCR walaupun terdapat nilai konsentrasi yang dibawah syarat

minimum.

Nilai kemurnian relatif sebaiknya berada di atas rentang 1,4-2.0 guna

proses amplifikasi yang optimal. Nilai di bawah rentang optimum

36

menandakan terjadinya kontaminasi dari sisa bahan kimia yang digunakan

pada proses isolasi DNA.38

Setelah mengetahui jumlah konsentrasi serta

kemurnian DNA dengan nano drop, dilanjutkan dengan tahap amplifikasi

dengan PCR serta elektroforesis.

Elektroforesis gel agarosa adalah cara paling efektif untuk memisahkan

fragmen DNA dengan berbagai ukuran mulai dari 100 bp hingga 25 kb.32

DNA yang dimasukkan ditambahkan dengan loading dye. Loading dye

membantu untuk melacak sejauh mana sampel DNA berada, dan juga

memungkinkan sampel meresap ke dalam gel. EtBr adalah reagen yang paling

umum digunakan untuk menandai DNA dalam gel agarosa.33

Marker adalah

segmen DNA yang spesifik dan telah diketahui ukurannya. Marker berfungsi

untuk mengetahui ukuran DNA hasil amplifikasi. Marker DNA yang terdapat

dalam gel elektroforesis berfungsi sebagai penanda posisi molekul DNA yang

bermigrasi untuk menentukan perkiraan ukuran basa-basanya.34

Berikut

adalah hasil PCR pada gel elektroforesis.

Gambar 4. 1 Hasil PCR gen β globin pada gel elektroforesis (sumber:

dokumentasi pribadi)

36

1200 bp

37

Pada Gambar 4.1 didapatkan hasil gen HbE pada gel elektroforesis,

dimana terdapat gen target pada 1200 Bp. Pita yang berpendar tersebut

mengindikasikan berhasilnya PCR pada gen target. Berdasarkan hasil tersebut,

reaksi uji spesifisitas PCR dilakukan pada konsentrasi primer 1 µM karena

pita DNA yang dihasilkan spesifik, yaitu menghasilkan pita DNA tebal dan

tidak terbentuk smear. Pada Gambar 4.1 di atas terdapat gen target pada semua

sampel kecuali sampel nomor 96 pita yang dihasilkan lebih tipis dibandingkan

yang lain. Hal tersebut diduga bahwa sampel nomor 96 memiliki konsentrasi

DNA yang lebih sedikit.

4.1.2 Analisis Hasil Sequencing

Berdasarkan hasil sequencing, terdapat 7 individu yang memiliki genotype

HbE homozygot dan 78 individu yang tidak memiliki genotype HbE/wildtype.

7 individu ini adalah individu dengan nomor sampel 4613, 5414, 2203, 1104,

6804, 1120, dan 6814 (lampiran 2).

Berikut adalah contoh hasil sequencing sampel DNA. Semua sampel

dalam penelitian ini memiliki hasil sequencing DNA yang dapat

diinterpretasikan dengan baik pada software Chromas.

38

Terlihat pada Gambar 4.2 adalah hasil sequencing yang memiliki

genotypeβN/ β

N karena pada kodon 26 terdapat pola basa nukleotida yang

normal yaitu GAG (glutamat) dan tidak berubah menjadi AAG (lisin). Terlihat

pada highlight biru, Basa Guanin tidak mengalami perubahan menjadi adenin,

dan menunjukkan hanya terdapat satu puncak saja. Jadi dapat disimpulkan

bahwa sampel nomor 6827 tidak memiliki mutasi alel jenis HbE.

Berbeda pada gambar 4.3 adalah hasil sequencing yang menyebabkan

munculnya trait Hb E. Karena pada kodon 26 terdapat pola basa nukleotida

yang berubah yaitu GAG (glutamat) berubah menjadi AAG (lisin). Terlihat

pada highlight biru, Basa guanin mengalami perubahan menjadi adenin, dan

menunjukkan terdapat dua puncak. Jadi dapat disimpulkan bahwa sampel

nomor 1120 memiliki mutasi alel jenis HbE trait (βHbE

/ βN).

4.2 Pembahasan

4.2.1 β Thalassemia-HbE

Mutasi β Thalassemia melibatkan donor splice pada ujung 5’dari IVS-1

dengan 2 struktur abnormal Hemoglobin, yaitu HbE (β26 GluLys) and Hb

Gambar 4. 2 Hasil sequencing

sampel nomor 682717

Terdapat 1

puncak dan

basa

guanine

tidak

berubah

menjadi

adenine

Terdapat 2

puncak.

adanya

mutasi pada

basa

guanine

tersebut

menjadi

basa

adenine

munculnya

trait HbE

Gambar 4. 3 Hasil sequencing

sampel nomor 112017

39

Knossos (β 27 alaser) yang berkaitan dengan fenotip β Thalassemia karena

subtitusi basa menyebabkan penggantian asam amino juga menyebabkan

alternative splicing prekursor molekul β mRNA. Subtitusi basa yang bersifat

silent mutation. Untuk itu tidak dapat mensintesis struktur rantai β globin

secara normal. 22,

Kedua hemoglobin varian ini ini berkaitan dengan fenotip β Thalassemia

ringan. Namun jika HbE bersama dengan β Thalassemia maka gejalanya akan

parah seperti β Thalassemia homozigot. Defisit sintesis globin pada HbE

homozigot setara dengan β Thalassemia heterozigot. HbE tidak stabil dan

oksidatif. Semakin ia kelebihan rantai α pada double heterozigot akan

menghasilkan stress oksidatif dan denaturasi serta presipitasi sehingga akan

meningkatkan hemolisis.23

Uji hematologi pada β Thalassemia terkait HbE adalah mikrositik dan

hipokrom berkorelasi dengan menurunnya rasio sintesis rantai β/α globin dan

menurunnya retikulosit β globin mRNA. Rasio β/α mRNA diukur di RNA

sumsum tulang dari empat homozigot HbE dibandingkan dengan individu

normal. Rasio rata-rata β/α mRNA pada HbE adalah 1,59 di nukleus sumsum

tulang; 2,59 di sitoplasma sumsum tulang; dan 4,36 di retikulosit. Sedangkan

pada individu normal adalah 1,29; 1,84; dan 1,79. Dari data tersebut dapat

disimpulkan bahwa mRNA rantai βE pasti tidak stabil dan secara progresif

terdegradasi pada sitoplasma saat pematangan sel eritrosit. Pada sediaan

apusan darah menunjukkan kesamaan dengan β Thalassemia heterozigot serta

terdapat target sel pada HbE homozigot.24

Hb Elektroforesis menunjukkan bahwa HbE mempunyai persentase HbF

yang tinggi dan biasanya tidak terdapat Hb A. Sehingga tanda klinis dari HbE-

β Thalassemia adalah pembengkakan sumsum tulang, osteoporosis, kelebihan

besi, gagal jantung, hepatomegali, dan rentan terkena infeksi. Komplikasi

lebih lanjut dari HbE-β Thalassemia adalah kematian karena tromboemboli.

Tata laksana pasien dengan HbE-β Thalassemia tidak jauh beda dengan β

Thalassemia mayor. Tetapi tidak memungkinkan untuk transfusi reguler serta

terapi besi.25

40

4.2.2 HbE

HbE (Hb E) merupakan variasi dari struktur hemoglobin dengan

pembagian klasifikasi menjadi asimtomatik dan simptomatik.25

Berdasarkan

hasil penapisan, terdapat tujuh individu dari 85 individu yang memiliki mutasi

HbE. Tiga di antara 7 individu memiliki hemoglobin di bawah normal yaitu

sampel nomor 4613 , 2203, dan 1104 dengan hemoglobin 11,7; 11,8; dan 11,8.

Dan 4 di antara 7 individu memiliki kadar hemoglobin yang normal. Walaupun

kadar hemoglobin<12 g/dl, penurunannya hanya sedikit sehingga tidak terdapat

manifestasi klinis yang nyata. Hal tersebut karena individu dengan HbE trait

merupakan jenis HbE yang asimtomatik.

Sintesis HbE di retikulosit yang tidak seimbang saat pematangan

eritrosit karena terdapat splicing baru menyebabkan subtitusi basa kodon 26

sehingga prosses mRNA menjadi abnormal dan mengakibatkan menurunnya

kadar βE mRNA sehingga mempengaruhi ketidakseimbangan pula produksi

rantai βE. Ketidakseimbangan pematangan eritrosit itu menyebabkan

eritropoiesis pada HbE secara besar meningkat 10-15 kali dari normal karena

gejala anemia tersebut menstimulasi untu memproduksi eritropoietin.

Eritropoiesis secara menyeluruh terjadi pada hati, limpa, dan tulang sehingga

terjadi penumpukan eritropoiesis. Gumpalan eritropoiesis di spinal

menyebabkan kompresi spinal cord dan paraplegia.29

Eritropoiesis secara

masif juga menyebabkan kerapuhan dari tulang dan menurunkan bone density

sehingga dapat terjadi osteoporosis dan osteomalasia. Dapat pula

meningkatkan volume darah sehingga meningkatkan cardiac output dan

menyebabkan gagal jantung.25

4.2.3 Tata laksana HbE

Prinsip tata laksana HbE mirip dengan pasien β Thalassemia berat yaitu

transfusi dan chelating iron. Namun kelebihan besi dapat terakumulasi, bisa

41

karena transfusi darah dan absorbsi dari gastrointestinal. Kulit menjadi lebih

gelap dan desposisi besi di sumsum tulang, hati, limpa, jantung, pankreas, dan

lain-lain.30

dapat terjadi aritmia, fibrosis hati, asites. Harus dipantau pasien

dengan usia 30-40 tahun dengan pigmentasi kulit, nafsu makan yang buruk,

penurunan berat badan, peningkatan anemia, dan bahkan kematian. Hal ini

disebabkan oleh stress oksidatif dari overload besi yang kronik. Maka dari itu

karena komplikasi tetap dari terapi chelating iron maka harus direduksi

dengan level antioksidan seperti vitamin C, dan vitamin E,31

Manajemen standard terdiri dari transfusi darah hingga mencapai 10-12

g/dl. Namun, untuk fenotip thalassemia intermedia, indikasi transfusi harus

diperhatikan. splenektomi direkomendasikan jika terdapat splenomegali.

Hidroksiurea dapat meningkatkan kadar HbF pada HbE-β Thalassemia namun

harus ditinjau kembali. Ada pula alternatif terapi lain seperti transplantasi

sumsum tulang dan tali pusat.29

4.2.4 Pencegahan Prenatal& Neonatal

Diagnosis ini menggunakan sistem HPLC untuk mengetahui kelainan

HbE. Dapat didiagnosis saat prenatal melalui cordocentesis, dapat pula saat

neonatal melalui darah tali pusat. Pada bayi baru lahir jumlah HbA2 normal

lebih rendah daripada dewasa tidak dapat divisualisasikan dengan

elektroforesis. Namun tidak dapat membedakan HbE dan HbE-β Thalassemia,

perlu analisis DNA lebih lanjut untuk membedakan antara 2 HbE dan HbE-β

Thalassemia.

4.2.5 Perhitungan Frekuensi HbE

Berdasarkan hasil penelitian, jumlah individu pembawa sifat HbE adalah

tujuh orang dari total responden 85 individu. Berikut adalah kalkulasi

frekuensi HbE

Frekuensi HbE : 7

85= 0,0823 x 100= 8,2%

Persentase HbE pada siswi kecamatan Singosari tersebut adalah 8,2%.

Selanjutnya frekuensi HbE yang didapatkan dipersentasikan melalui grafik 4.1

42

Grafik 4.1 Grafik Persentase HbE pada siswi SMAN Kecamatan

Singosari,Kabupaten Malang

4.2.6 Keterbatasan Penelitian

Sebanyak 94 sampel yang dilakukan sequencing. Namun, terdapat 3

sampel yang double yaitu nomor 4514, 3420, dan 4621 serta 6 yang tidak

teridentifikasi hasil Hemoglobin. Jadi sampel yang dapat dibahas adalah

sebanyak 85 sampel dari jumlah perhitungan sampel yaitu 88 sampel.

Kekurangan dari penelitian ini adalah diperlukan optimasi konsentrasi dan

jumlah primer sehingga dilakukan berkali-kali untuk dapat menghasilkan pita

yang jelas dielektroforesis, perlu ketelitian untuk memasukkan hasil

elektroforesis ke plate sequencing sehingga tidak terdapat double sampel, dan

pengerjaan harus hati-hati agar DNA tidak terkontaminasi oleh kontaminan di

sekitar penelitian. Untuk pembacaan hasil sequencing di software Chromas,

terdapat 85 sampel berhasil dibaca dan diolah.

8,2

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

HbE

Grafik Persentase HbE pada siswi SMAN kecamatan

Singosari Kabupaten Malang

Persentase

43

43

BAB V

SIMPULAN DAN SARAN

5.1 Simpulan

1. Siswi SMA kelas 10 dan 11 usia 16-19 tahun di SMAN Kecamatan

Singosari Kabupaten Malang yang mempunyai hemoglobin E

berdasarkan penapisan hasil analisis sequencing DNA adalah 7 orang

dari 85 individu dengan persentase 8,2%.

5.2 Saran

Saran penelitian ini adalah:

1. Skrining terhadap kelainan darah seperti thalassemia dan kelainan

hemoglobin perlu dilakukan sejak dini (pra marital) sehingga prevalensi

thalassemia dan hemoglobin E dapat ditentukan dengan tepat. Hal

tersebut dapat mencegah bertambahnya individu dengan thalassemia

mayor.

2. Untuk penelitian selanjutnya dapat melakukan pemetaan β thalassemia

serta HbE di Indonesia untuk mengetahui prevalensi secara detail per

kota/kabupaten.

3. Untuk penelitian selanjutnya diperlukan jumlah sampel yang besar

supaya hasilnya dapat bermakna.

4. Untuk siswi SMAN kecamatan Singosari Kabupaten Malang dapat

melakukan pencegahan secara dini dengan konsultasi genetik pra marital.

44

44

BAB VI

PERNYATAAN PENELITIAN

Penulis mengucapkan terima kasih kepada SEAMEO-RECFON

FKUI, dr. Umi Fahrida; DIKTIS DEPAG RI; DitJen Anggaran Kemenkeu;

SMAN kecamatan Singosari Kabupaten Malang, Chris Adhiyanto M. Biomed

Ph.D, dr. Yanti Susianti Sp.A (K), Dr Fase Badriah, S.KM., M.Kes., PhD ; bu

Nurlaeli Mida Ph.D, Dr Zeti H, FKIK UIN-Laboratorium Biomolekuler, dan

Politeknik Kesehatan Kementrian Kesehatan Malang yang telah memberikan

bantuan dalam ide, pendanaan dan sampel DNA. Penelitian ini merupakan

bagian dari penelitian pemetaan β globin di Indonesia yang diketuai oleh Dr.

Umi Fahmida dari SEAMEO-RECFON bekerjasama dengan FKIK UIN dan

Poltekes Malang.

45

45

DAFTAR PUSTAKA

1. Sudoyo AW, Setiyohadi B, Alwi I, Simadibrata M, Setiati S. Buku Ajar

Ilmu Penyakit Dalam Jilid III edisi V. Jakarta: Interna Publishing. 2009.

2. De Benoist B et al., eds. Worldwide prevalence of anaemia 1993-

2005. WHO Global Database on Anaemia Geneva. World Health

Organization. 2008.

3. Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan Kementerian Kesehatan

RI. Riset Kesehatan Dasar. Indonesia: Kementerian Kesehatan Republik

Indonesia. 2013.

4. Bernadette Modell, Matthew Darlison. Global epidemiology of

haemoglobin disorders and derived service indicators. WHO Bulletin of

the World Health Organization. 2008 Jun;86(6):480–7.

5. Braunstein Evan M. Homozygous Hb E disease (a hemoglobinopathy)

causes a mild hemolytic anemia, usually without splenomegaly.

http://www.merckmanuals.com/professional/hematology-and-

oncology/anemias-caused-by-hemolysis/hemoglobin-e-disease. diakses

2017-03-17

6. Kementerian Kesehatan RI. Situasi Kesehatan Reproduksi Remaja.

Kementerian kesehatan RI pusat data dan informasi.

7. APHLC, CDC. hemoglobinopathies current practices for screening

confirmation and follow-up. US: Association of Public Health

laboratories; 2015.

8. Sherwood, L. Fisiologi Manusia; dari Sel ke Sistem. Edisi 6. Jakarta;EGC.

2013

9. Silbernagl, S., Lang, F. Color Atlas of Pathophysiology. New York :

Thieme Stuttgart. 2014

10. A.V. Hoffbrand, Kapita Selekta Hematologi edisi 6. Jakarta: EGC; 2015.

11. Dahlan, Sopiyudin. Statistik Untuk Kedokteran dan Kesehatan Edisi 5.

Jakarta: Salemba Medika; 2015

12. Nancy F. Olivieri, Zahra Pakbaz & Elliott Vichinsky+. Hb E/beta-

thalassaemia: a common & clinically diverse disorder. Indian J Med Res.

2011;134:522–31.

http://www.msdmanuals.com/professional/hematology-and-oncology/anemias-caused-by-hemolysis/sickle-cell-disease#v970277

http://www.merckmanuals.com/professional/hematology-and-oncology/anemias-caused-by-hemolysis/hemoglobin-e-disease.%20diakses%202017-03-17



46

13. Bachir, Dora et al. Hemoglobin E disease.France: Orphanet Encyclopedia;

2004.

14. Fucharoen, Goonnapa et al. A simplified screening strategy for

Thalassemia and Hemoglobin E in rural communities in south-east Asia.

Bulletin of World Health Organization 2004;82:364-72.

15. Viljoen, Gerit J et al. Molecular diagnosis PCR Handbook. Netherlands:

Springer; 2005.

16. Aggarwal, S et al. HbE variants – Retrospective analysis in a tertiary care

centre. JIACM 2011;12 (4):263-5.

17. Applied Biosystem. BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit

Protocol. US: Applied Biosystem; 2002.

18. Chatterjee, Tathagata et al. A Rare Case of Hemoglobin E

Hemoglobinopathy with Gaucher’s Disease.

www.ncbi.nlm.nih.gov/PMC/articles/PMC3636348.

19. Moiz, Bushra et al. Hemoglobin E syndromes in Pakistani population.

www.ncbi.nlm.nih.gov/PMC/articles/PMC3329421.

20. Munshi, Anjana. Dna Sequencing Methods and Application. Croatia:

inTech; 2012.

21. Goldsmith, M, E., Humphries, R. K., Ley, T., Cline A., et al. “Silent”

nucleotide subtitution in a β+ thalassemia globin gene activates splice site

in coding sequence RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1983;88:2318.

22. Orkin, S. H., Kazazian, H. H., Jr., Antonarakis, S.E., et al. Abnormal RNA

processing due to the exon mutation of βE globin gene. Nature 1982;

300:768.

23. Bunn, H. Franklin., Forget, Bernard G. Hemoglobin: Molecular, Genetic

and clinical Aspects. W. B Saunders company; 1986.

24. Traeger, J., Winichagoon, P., and Wood., et al. Instability of βE

messenger

RNA during erythroid cell maturation in hemoglobin E homozygotes. J

Clin Invest. 1982; 69:1050.

25. Martin H. Steinberg, Bernard G. Forget, Douglas R. Higgs, and Ronald L.

Nagel, editors. Disorders of Hemoglobin: Genetics, patophysiology, and

clinical management. Cambridge University Press; 2001.

47

26. Keller, P., and Kohne, E: Hypochromic der erythrozyten Hamoglobins

among normal Chinese residents of Taiwan. Isr. J. Med Sci 1965; I:759.

27. Fairbanks, V. F., Gilchrist, G.S., Brimhall, B., et al: Hemoglobin E trait

reexamined: A cause of microcytosis and erythrocytosis, Blood 1979; 53:

109.

28. Ho, PJ, Hall, GW, Luo, et al. 1998. Beta-thalassemia intermedia: is it

possible concistency to predict phenotype from genotype? Br. J. Haematol

100: 70-8.

29. Fucharoen, S and winichagoon, p. Haemoglobinopathies in southeast asia:

Molecular Biology and clinical medicine. Hemoglobin 1997; 21: 299-319.

30. Sonakul, D, Pacharee, P, and Thakerngpol, K. Pathologic findings in 76

autopsy cases of thalassemia. Birth defects 1988; 23 (5b): 157-176.

31. Vatavicharn, S, Yenchitsomanus, P, and Shiddikol, C. Vitamin E in β

thalassaemia dan α thalassaemia(HbH disease). Acta haematol. 1985;

73:183.

32. Sambrook J, Russell DW. Molecular cloning. 3rd. 2001.

33. Lee, Pei Yun., Costumbrado, John., Kim, Yong Hoon. Agarose Gel

electrophoresis for the separation of DNA fragments.

34. Martin, R. Gel electrophoresis: nucleid acids. Oxford: Bios scientific

Publisher. 1996.

35. Innis, M.A. and D.H. Gelfand. PCR protocols : A Guide to Methods and

Appplications: Optimizations of PCRs. Academic Press, Inc., San Diego,

California. 1990; pp : 3-12.

36. Surzycki, S. Basis Techniques in Molecular Biology. Springer-Verlag,

Berlin, Heidelberg, New York; 2000.

37. Ghatak, Souvik., Muthukumaran, Rajendra Bose., Nachimutu, Senthil

Kumar. A simple Method of Genomic DNA Extraction from Human

samples for PCR-RFLP Analysis. J Biomol Tech 2013; (24): 224-231.

38. Boesenber-Smith, Kelly A., Pessarakl, Mohammad M., Wolk, Donna M.

Assessment of DNA Yield and Purity: an Overlooked Detail of PCR

Troubleshooting. Clinical Microbiology Newsletter 2012; (34): 1-6.

39. Zuhriana K Yusuf. Polymerase Chain Reaction (PCR). Saintek. 2010;5(6).

48

No.

Sequence

No.

isolasi

No.

sampel

Konsentrasi

DNA (ng/μl)

Kemurnian

DNA A

260/ A 280

Kemurnian

Relatif A

260/A 230

A 260

A1 148 3420 55,569 1,99 3,8 1,1114

B1 1 6804 82,315 1,86 1,83 1,6463

C1 2 4543 25,941 1,79 1,3 0,5188

D1 3 5725 63,204 1,87 1,68 1,2641

E1 4 6806 45,488 1,8 1,23 0,9098

F1 5 6827 93,93 1,82 1,98 1,8786

G1 15 6814 36,013 1,83 1,42 0,7203

H1 70 5705 215,495 1,8 1,5 4,3099

A2 73 5733 311,953 1,74 1,01 6,2391

B2 68 4606 39,512 1,61 1,14 0,7902

C2 96 6824 12,303 1,24 5,94 0,2461

E2 108 6819 29,651 1,94 1,05 0,593

F2 164 2203 49,213 1,89 1,61 0,9843

G2 195 1110 33,678 1,83 1,91 0,6736

A3 242 2225 43,035 1,46 0,53 0,8607

B3 255 1128 38,5 1,33 0,41 0,77

C3 256 3332 47,344 1,65 1,47 0,9469

D3 259 1129 1574,366 1,9 2,16 31,487

E3 156 2204 22,663 1,95 0,81 0,4533

F3 260 1104 48,235 1,72 2,28 0,9647

G3 253 1136 13,913 1,4 0,34 0,2783

H3 214 3431 105,947 1,77 1,99 2,1189

A4 250 2223 98,736 0,96 0,78 1,9747

B4 258 1105 86,17 1,83 1,27 1,7234

C4 231 3408 60,603 1,61 1,33 1,2121

D4 64 4621 158,647 1,75 1,63 3,1729

E4 31 6801 9,601 2,08 3,71 0,192

F4 54 4631 24,587 1,32 2,66 0,4917

G4 92 4607 106,23 1,84 2,1 2,1246

H4 185 4535 108,759 1,82 1,99 2,1752

A5 212 2212 33,279 1,69 1,4 0,6656

B5 213 4503 374,29 1,76 2,14 7,4858

C5 172 4513 17,707 1,82 10,1 0,3541

D5 177 4633 59,199 1,7 1,57 1,184

E5 228 1121 17,984 1,69 0,75 0,3597

F5 233 4514 94,605 1,6 0,99 1,8921

G5 254 1124 66,6 1,86 1,53 1,332

H5 257 3302 29,059 1,55 0,64 0,5812

A6 261 4613 16,013 1,84 1,09 0,3203

B6 39 6823 23,21 1,9 3,95 0,4642

Lampiran 1 Tabel Konsentrasi, Kemurnian, dan Kemurnian relatif DNA

49

No.

Sequence

No.

isolasi

No.

sampel

Konsentrasi

DNA (ng/μl)

Kemurnian

DNA A

260/ A 280

Kemurnian

Relatif A

260/A 230

A 260

C6 47 5716 10,998 1,88 0,95 0,22

D6 74 5711 21,789 1,69 1,45 0,4358

E6 76 5701 73,322 1,54 0,64 1,4664

F6 77 6839 80,182 1,86 1,56 1,6036

H6 200 2208 58,05 1,82 1,45 1,161

A7 36 6833 57,836 1,72 1,14 1,1567

B7 57 6821 96,36 1,78 1,79 1,9272

C7 34 6805 16,845 1,71 1 0,3369

E7 24 4617 31,165 1,78 1,68 0,6233

F7 63 5734 55,17 1,36 0,37 1,1034

H7 226 3427 30,428 1,98 0,61 0,6086

A8 66 5724 1083,297 1,85 2,22 21,6659

E8 232 4509 49,031 1,35 0,31 0,9806

F8 46 4629 27,761 1,84 4,23 0,5552

G8 227 4525 29,433 1,71 1,47 0,5887

H8 298 3327 17,815 1,46 0,56 0,3563

A9 297 3334 17,377 0,3475 1,8 0,66

B9 296 1102 34,122 1,78 2,37 0,6824

C9 295 3320 65,121 1,81 1,69 1,3024

E9 293 3307 37,275 1,79 1,66 0,7455

F9 292 3314 64,249 1,73 1,78 1,285

G9 291 1131 34,691 1,82 1,64 0,6938

H9 290 1113 45,184 1,75 1,86 0,9037

A10 289 4625 68,764 1,8 1,94 1,3753

B10 286 3346 31,353 1,87 1,3 0,6271

C10 285 3335 32,551 1,93 1,9 0,651

D10 284 4642 46,672 1,78 1,48 0,9334

E10 283 1120 18,718 1,78 1,13 0,3744

F10 282 3329 34,776 1,77 1,5 0,6955

G10 281 3312 139,297 1,77 1,98 2,7859

H10 280 3322 40,195 1,8 1,29 0,8039

A11 279 1138 47,638 1,76 2,07 0,9528

B11 272 3305 31,172 1,32 0,66 0,6234

C11 244 2211 48,422 1,67 1,04 0,9684

D11 243 2218 40,624 1,81 1,66 0,8125

E11 241 2226 98,343 1,82 1,81 1,9669

F11 287 3326 44,177 1,82 1,79 0,8835

G11 288 3310 16,011 1,42 0,3 0,3202

H11 140 4523 148,924 1,89 2,57 2,9785

A12 149 4502 121,12 1,88 2,34 2,4224

Lampiran 1 Tabel Konsentrasi, Kemurnian, dan Kemurnian relatif DNA (lanjutan)

50

No.

Sequence

No.

isolasi

No.

sampel

Konsentrasi

DNA (ng/μl)

Kemurnian

DNA A

260/ A 280

Kemurnian

Relatif A

260/A 230

A 260

B12 152 2207 90,914 1,88 2,59 1,8183

C12 154 3416 54,354 1,88 2,62 1,0871

E12 144 5414 56,441 2,01 3,24 1,1288

F12 135 2231 82,896 1,9 2,82 1,6579

G12 128 4508 135,709 1,89 2,66 2,7142

Lampiran 1 Tabel Konsentrasi, Kemurnian, dan Kemurnian relatif DNA (lanjutan)

51

No seq

No

isolasi

No

Sampel Anemia genotip fenotip

A1 148 3420 Tidak βN/ β

N wildtype

B1 1 6804 Tidak βHbE

/ βN HbE trait

C1 2 4543 Tidak βN/ β

N wildtype

D1 3 5725 Tidak βN/ β

N wildtype

E1 4 6806 Tidak βN/ β

N wildtype

F1 5 6827 Tidak βN/ β

N wildtype

G1 15 6814 Tidak βHbE

/ βN HbE trait

H1 70 5705 Tidak βN/ β

N wildtype

A2 73 5733 Tidak βN/ β

N wildtype

B2 68 4606 Anemia βN/ β

N wildtype


N wildtype

E2 108 6819 Anemia βN/ β

N wildtype

F2 164 2203 Anemia βHbE

/ βN HbE trait

G2 195 1110 Anemia βN/ β

N Wildtype

A3 242 2225 Anemia βN/ β

N Wildtype


N Wildtype

C3 256 3332 Anemia βN/ β

N Wildtype

D3 259 1129 Anemia βN/ β

N wildtype

E3 156 2204 Tidak βN/ β

N wildtype

F3 260 1104 Anemia βHbE

/ βN HbE trait


N wildtype

H3 214 3431 Anemia βN/ β

N wildtype

A4 250 2223 Tidak βN/ β

N wildtype


N wildtype


N wildtype


N wildtype


N wildtype

F4 54 4631 Anemia βN/ β

N wildtype


N wildtype


N wildtype

A5 212 2212 Anemia βN/ β

N wildtype


N wildtype


N wildtype


N wildtype


N wildtype

F5 233 4514 Anemia βN/ β

N wildtype

Lampiran 2. Tabel hasil Penggolongan genotip dan fenotip HbE

52

No Seq

No

isolasi

No

sampel Anemia Genotip Fenotip


N wildtype


N wildtype

A6 261 4613 Anemia βHbE

/ βN HbE trait

B6 39 6823 Tidak βN/ β

N wildtype


N wildtype

D6 74 5711 Tidak βN/ β

N wildtype


N wildtype


N wildtype

H6 200 2208 Tidak βN/ β

N wildtype


N wildtype

B7 57 6821 Tidak βN/ β

N wildtype


N wildtype


N wildtype


N wildtype

H7 226 3427 Tidak βN/ β

N wildtype


N wildtype

E8 232 4509 Tidak βN/ β

N wildtype


N wildtype

G8 227 4525 Tidak βN/ β

N wildtype

H8 298 3327 Tidak βN/ β

N wildtype

A9 297 3334 Tidak βN/ β

N wildtype

B9 296 1102 Tidak βN/ β

N wildtype

C9 295 3320 Tidak βN/ β

N wildtype

E9 293 3307 Tidak βN/ β

N wildtype

F9 292 2314 Tidak βN/ β

N wildtype

G9 291 1131 Tidak βN/ β

N wildtype

H9 290 1113 Tidak βN/ β

N wildtype

A10 289 4625 Tidak βN/ β

N wildtype

B10 286 3346 Tidak βN/ β

N wildtype

C10 285 3335 Tidak βN/ β

N wildtype

D10 284 4642 Tidak βN/ β

N wildtype

E10 283 1120 Tidak βHbE

/ βN HbE trait

F10 282 3329 Tidak βN/ β

N wildtype

G10 281 3312 Tidak βN/ β

N wildtype

H10 280 3322 Tidak βN/ β

N wildtype

A11 279 1138 Tidak βN/ β

N wildtype

B11 272 3305 Tidak βN/ β

N wildtype

C11 244 2211 Tidak βN/ β

N wildtype

D11 243 2218 Tidak βN/ β

N wildtype

E11 241 2226 Tidak βN/ β

N wildtype

F11 287 3326 Tidak βN/ β

N wildtype

Lampiran 2. Tabel hasil Penggolongan genotip dan fenotip alel HbE

(lanjutan)

53

No seq

No

isolasi

No

sampel Anemia Genotip Fenotip

G11 288 3310 Tidak βN/ β

N wildtype

H11 140 4523 Tidak βN/ β

N wildtype

A12 149 4502 Tidak βN/ β

N wildtype

B12 152 2207 Tidak βN/ β

N wildtype

C12 154 3416 Tidak βN/ β

N wildtype

E12 144 5414 Tidak βHbE

/ βN HbE trait

F12 135 2231 Tidak βN/ β

N wildtype

G12 128 4508 Tidak βN/ β

N wildtype

Lampiran 2. Tabel hasil Penggolongan genotip dan fenotip alel HbE

(lanjutan)

54

Lampiran 3. Gel documentation hasil elektroforesis agarose dari isolasi genom

dan amplifikasi gen target

Hasil Elektroforesis 1 Hasil Elektroforesis 2


55

Lampiran 3 Gel documentation hasil Elektroforesis agarose dari isolasi genom

dan amplifikasi gen target (lanjutan)



56

Lampiran 3 Gel documentation hasil Elektroforesis agarose dari isolasi genom

dan amplifikasi gen target (lanjutan)


Hasil Elektroforesis 11

57

Lampiran 4. Alat dan Bahan Penelitian

Centrifuge Elution Buffer

Micro centrifuge

Wash Buffer

58

Lampiran 4. Alat dan Bahan Penelitian (Lanjutan)

GB Buffer Micro pipet

DNA tube

Loading dye

59

Lampiran 4. Alat dan Bahan Penelitian (Lanjutan)

Etanol Absolut Kappa Ladder 100 bp

Spektrofotometer Denovix DS-11

Primer

60

Lampiran 4. Alat dan Bahan Penelitian (lanjutan)

Elektroforesis ATTO MY power II 300 AE

8135

TAE Buffer

Timbangan analitik

Agarose LE Analytical grade

Promega

61


PCR Applied Biosystem 27,0 Thermal

cycler

Ethidium Bromide

Gel Doc system dan printgraph ATTO

AE 6905 CF CCD Camera controller

Mikrotips Biologix ukuran 1000 μl,

100 μl, dan 10 μ

62


Plate sequencing

Reagen KAPPA hifi HotStart RM

Freezer

Inkubator

63

Lampiran 5 Hasil

sequencing HBE + pada sampel nomor 4613

64

Lampiran 6. Lembar persetujuan responden

SURAT PERSETUJUAN PENELITIAN

Skrining Hemoglobin E Pada Siswi SMA Negeri Kecamatan

Singosari di kabupaten Malang, Jawa Timur

Saat ini saya Ajeng Ristia Sari Putri mahasiswa PSKPD UIN Jakarta

angkatan 2014 sedang melakukan penelitian dengan judul Skrining

Hemoglobin E Pada Siswi SMA Negeri Kecamatan Singosari di

kabupaten Malang, Jawa Timur.

Pada penelitian ini saya akan dilakukan pengambilan darah partisipan

sebanyak satu kali yaitu 3 cc. Darah tersebut akan dibawa ke laboratorium

untuk dilakukan skrining. Pengambilan darah dilakukan oleh analis yang

sudah berpengalaman. Untuk itu, dengan hormat saya memohon kesediaan

Anda untuk ikut serta dalam penelitian ini. Apabila siswi yang mengalami

kriteria:

1. Berusia antara 16-19 tahun

2. Berdomisili di kabupaten Malang

3. Berkenan berpartisipasi dalam screening dengan tidak terpaksa

4. Tidak dalam kondisi hamil, haid, dan puasa

5. Sedang dalam kondisi sehat

Mengundang siswi turut berpartisipasi dalam penelitian ini. Setelah

membaca penjelasan diatas, bahwa yang bertanda tangan dibawah ini:

Nama:

Umur: ______

Alamat:

65

Dengan sukarela diikut sertakan dalam penelitian ini. Segala hal

yang menyangkut kerahasiaan tentang partisipan akan terjaga dengan baik

oleh peneliti.

Jakarta, November 2016

Mengetahui,

( )

(Ajeng Ristia Sari Putri)

66

Lampiran 7. Surat Persetujuan Etik

67

Lampiran 8. HBB sequence

0 M * * H * YM Y * M **R**** RKS*N*Y*** 12

NCATTTGNTNCTGACACAANTNTGTNNACNAGNAANCTNNNNNNNACACCNNNNNNNNNN 59

..................................................ATGGTGCATC 10 ..................................................-M--V--H-- 3

0 H*MM**Y*V**VRD********MDW* KM *K***RSR**R**K*RRNDW*R**NWWD 29 NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNACTNNCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 93

11 TGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGATGAAG 70

4 L--T--P--E--E--K--S--A--V--T--A--L--W--G--K--V--N--V--D--E-- 23

0 K*S**SR****NN*****RYRR****SNRR*RKH*YWHS* *VDMH*Y*S K**N**K** 30

NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTNNNNNNNNNANNNNNNNNN

71 TTGGTGGTGAGGCCCTGGGCAGGCTGCTGGTGGTCTACCCTTGGACCCAGAGGTTCTTTG 130

24 V--G--G--E--A--L--G--R--L--L--V--V--Y--P--W--T--Q--R--F--F-- 43

0 **YS**Y****K******S*WVY*VYSN**********BRYRV**M**MNSY*WWBSHYY 29

NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN

131 AGTCCTTTGGGGATCTGTCCACTCCTGATGCTGTTATGGGCAACCCTAAGGTGAAGGCTC 190 44 E--S--F--G--D--L--S--T--P--D--A--V--M--G--N--P--K--V--K--A-- 63

0 RY***MWBRM*RN*YHYR**SN*YY*****D*SR**Y*S******K*NRYWRNSKVMNB* 35 NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN

191 ATGGCAAGAAAGTGCTCGGTGCCTTTAGTGATGGCCTGGCTCACCTGGACAACCTCAAGG 250 64 H--G--K--K--V--L--G--A--F--S--D--G--L--A--H--L--D--N--L--K-- 83

0 **RY**Y**H MH*S***VWDRBY**MMVYRK*******Y HMN** RWDMBYSMNM**D 34 NNNNNNNNNNCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGNNNNNGNNNNNNNNNNNNN

251 GCACCTTTGCCACACTGAGTGAGCTGCACTGTGACAAGCTGCACGTGGATCCTGAGAACT 310

84 G--T--F--A--T--L--S--E--L--H--C--D--K--L--H--V--D--P--E--N-- 103

0 SD******W*****RN****Y*KY*YRD*W MY**H ***SV**K*SK RW*** NYN* 25

166 TNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGNNNNNCNNNNNNNNNNNCNNNNNANNNN 225 311 TCAGGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTCTGTGTGCTGGCCCATCACTTTGGCAAAGAATTCA 370

104 F--R--L--L--G--N--V--L--V--C--V--L--A--H--H--F--G--K--E--F-- 123

0 YYYM*******NM*SM*S**K****SNMHVYS*Y*SM*KRKR*RSY*DMHRH *K*RM*Y 36

NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCNNNNNNN

371 CCCCACCAGTGCAGGCTGCCTATCAGAAAGTGGTGGCTGGTGTGGCTAATGCCCTGGCCC 430 124 T--P--P--V--Q--A--A--Y--Q--K--V--V--A--G--V--A--N--A--L--A-- 143

0 *NW*N**WY****** YRS Y Y Y S R * R S 15 NNNNNNNNNNNNNNNCTNNNTTNCNTGNTGTCCAATTTNTNTTAANGNTTNCTTTGTTCC 278

431 ACAAGTATCACTAA.............................................. 444

144 H--K--Y--H--*-.............................................. 147

0 *Y R M R RR R R R****YS****** 11

NNANGTNCANCTACTAAACTGGGNNATNTTATGANGGGCCTTGANNNNNNNNNNNNNGCC 336

............................................................

............................................................

0 **H**R* M * * 3

337 TNNNNNNNANCATTTATTTTCANTGNAA 364

............................ ............................

68

CURICULUM VITAE

Nama : Ajeng Ristia Sari Putri

Panggilan : Ajeng

Jenis Kelamin : Perempuan

Tempat, Tanggal Lahir : Jakarta, 21 Januari 1995

Usia : 22 tahun

Golongan Darah : B

Agama : Islam

Alamat : Jl. H. Enjong no. 61 RT 012/001 Kalisari, Pasar

Rebo, Jakarta Timur

Mobile : 08990308595

Email : [email protected]

Pendidikan

a. TK : TK Islam Toledo (1999-2000) dan TK Islam Al-

Azhar 20 Cibubur (2000-2001)

b. SD : SD Islam Al-Azhar 2 Pasar Minggu (2001-2007)

c. SMP : SMP Islam Al-Azhar 2 Pejaten (2007-2010)

d. SMA : SMA Islam Lazuardi High School(2010-2013)

e. Universitas :

mailto:[email protected]

69

Program Studi Perencanaan Wilayah dan Kota Universitas Brawijaya

(2013-2014)

Program Studi Kedokteran dan Profesi Dokter UIN Syarif Hidayatullah

Jakarta

Pengalaman Organisasi :

1. Humas Lazuardi Festival 2012

2. Fundraising and Merchandise Team CIMSA Nasional 2015/2016

3. Grant and Sponsorship Team CIMSA Nasional 2015/2016

4. Koordinator Acara October Meeting CIMSA 2016 di Sawangan, Depok

5. Vice Local Coordinator for Internal Affairs CIMSA UIN 2016-2017

Penghargaan :

1. Juara 2 Lomba Karya Tulis Ilmiah tingkat Provinsi di SMA Fajar Hidayah

tahun 2011

2. Juara 2 lomba tari Saman di Prasetya Mulya tahun 2010

3. 10 Besar PKM Fakultas Teknik Universitas Brawijaya tahun 2013

4. Best SCORPION Periode 3 CIMSA UIN 2016

Karya Tulis :

1. Konsentrasi Optimasi Larutan Tepung Besi sebagai inhibitor korosi pada

Paku Besi 2011

2. SIMENTZ (Siwak Permen Mint) Inovasi Permen Sehat Sebagai

Pembersih Mulut Dan Gigi Yang Praktis 2013

3. Patch!” (Nilam Spray anti nyamuk): Inovasi spray anti nyamuk Sehat dari

minyak daun nilam (patchouli oil) 2013

4. Kearifan Lokal Suku TOLAKI Dalam Budaya Monda’u untuk

Membangun Karakter Mahasiswa Universitas Brawijaya 2013

Documents

PENAPISAN HEMOGLOBIN E PADA SISWI SMA NEGERI … · Penelitian diawali dengan dilakukannya pengambilan kadar hemoglobin dan darah vena untuk dilakukan analisis molekuler pada responden