PHÂN TÍCH 3-CHLOROTYROSINE BẰNG GCMS 1. Mẫu: - Hòa tan protein bằng đệm pH 7.4 hoặc pH 3.8. - Oxy hóa protein bằng HOCl - Cho 2 mL dd protein + 0.5 mL HOCl nồng độ từ 0 – 200 mM. - Thêm nội chuẩn 3-Cl-(C 13 ) tyrosine. - Thêm nội chuẩn (C 13 ) tyrosine. 2. Dãy chuẩn: - Chuẩn 3-Cl-Tyr nồng độ từ 2.5 – 10 µg/mL và 25 – 100 µg/mL. - Chuẩn Tyr nồng độ từ 2.5 – 10 µg/mL và 25 – 100 µg/mL. - Thêm nội chuẩn 3-Cl-(C 13 ) tyrosine. - Thêm nội chuẩn (C 13 ) tyrosine. 3. Thủy phân: - Thủy phân mẫu và chuẩn bằng HCl 6M (0.1% phenol, 0.1% Na 2 SO 3 ). - Trung hòa bằng NaOH 10N. - Chỉnh pH về 1.5. 4. Khử muối bằng cột trao đổi cation: - Cột được nhồi bằng Dowex 50WX8 (công suất trao đổi 1.7 meq/mL). - Rửa cột: 3x3mL HCl 1M 3x3mL H 2 0 3x3mL NaOH 1M 3x3mL H 2 0 - Conditioning: 3x3mL HCl 1M 3x3mL H 2 0 - Load 2mL mẫu - Rửa cột: 3x3mL H 2 0 -Thu mẫu bằng 2x3mL NH 3 10% - Cho bay hơn NH 3 bằng khí N 2 . 5. Dẫn xuất: Mẫu sau khi cho bay hơi đến khô được tạo dẫn xuất bằng - 100 µL trifluoroethanol:pyridine (80:20) - 10 µL ethylchloroformate - 150 µL chloroform có chứa 2% ethylchloroformate 6/ GC/MS: 3-Cl-Tyr: m/z (441/447), (352/358), (314/320) Tyr: m/z (318/324), (280/286) 7. Tổng hợp nội chuẩn 3-[ 13 C 6 ] chlorotyrosine: - Hòa tan L-[ 13 C 6 ] tyrosine trong đệm phosphate pH2 (50mM Na 2 HPO 4 + 100 mM NaCl) - Thêm NaOCl, ủ 60 phút ở 37 0 C. - Thêm trifluoroacetic acid (TFA). - 3-[ 13 C 6 ] chlorotyrosine được tách bằng HPLC reverve-phase ở abs 276nm Dung môi A: 0.1% TFA trong nước, pH 2.5. Dung môi B: 0.1% TFA trong methanol, pH 2.5.
PHN TCH 3-CHLOROTYROSINE BNG GCMS 1. Mu: - Ha tan protein bng m
pH 7.4 hoc pH 3.8. - Oxy ha protein bng HOCl - Cho 2 mL dd protein
+ 0.5 mL HOCl nng t 0 200 mM. - Thm ni chun 3-Cl-(C13) tyrosine. -
Thm ni chun (C13) tyrosine. 2. Dy chun: - Chun 3-Cl-Tyr nng t 2.5
10 g/mL v 25 100 g/mL. - Chun Tyr nng t 2.5 10 g/mL v 25 100 g/mL.
- Thm ni chun 3-Cl-(C13) tyrosine. - Thm ni chun (C13) tyrosine. 3.
Thy phn: - Thy phn mu v chun bng HCl 6M (0.1% phenol, 0.1% Na2SO3).
- Trung ha bng NaOH 10N. - Chnh pH v 1.5. 4. Kh mui bng ct trao i
cation: - Ct c nhi bng Dowex 50WX8 (cng sut trao i 1.7 meq/mL). -
Ra ct: 3x3mL HCl 1M 3x3mL H20 3x3mL NaOH 1M 3x3mL H20 -
Conditioning: 3x3mL HCl 1M 3x3mL H20 - Load 2mL mu - Ra ct: 3x3mL
H20 -Thu mu bng 2x3mL NH3 10% - Cho bay hn NH3 bng kh N2. 5. Dn
xut: Mu sau khi cho bay hi n kh c to dn xut bng: - 100 L
trifluoroethanol:pyridine (80:20) - 10 L ethylchloroformate - 150 L
chloroform c cha 2% ethylchloroformate 6/ GC/MS: 3-Cl-Tyr: m/z
(441/447), (352/358), (314/320) Tyr: m/z (318/324), (280/286) 7.
Tng hp ni chun 3-[13C6] chlorotyrosine: - Ha tan L-[13C6] tyrosine
trong m phosphate pH2 (50mM Na2HPO4 + 100 mM NaCl) - Thm NaOCl, 60
pht 370C. - Thm trifluoroacetic acid (TFA). - 3-[13C6]
chlorotyrosine c tch bng HPLC reverve-phase abs 276nm. Dung mi A:
0.1% TFA trong nc, pH 2.5. Dung mi B: 0.1% TFA trong methanol, pH
2.5.
Cc cng thc
3-Chlorotyrosine
Ethyl chloroformate
Trifluoroethanol
Dowex 50WX8 Dung dch m PBS pH 7.4: (7.89 g NaCl + 0.204g KH2PO4
+ 2.865g Na2HPO4 + 0,201 g KCl) 1L Acetate pH 3.8: (0.1M Acetic
acid + 0.013M Natri acetate) 1L Cu hi: 1. Ti sao phi thm ni chun
Tyrosine trong khi ch cn phn tch nng 3-Cl-Tyr? 2. Thy phn protein
bng acid ct lin kt peptide, vy tc dng ca 0.1% phenol v 0.1% Na2SO3
l g? 3. Vit cc phng trnh phn ng trong qu trnh trao i cation (bc 4).
4. Tc dng ca pyridine v chloroform c cha 2% ethylchloroformate? 5.
Tnh mass chromatography (441, 352, 314) v (318, 280) ca cc dn xut.
Ch vit cng thc sau khi kt hp Cl-Tyr vi Ethyl chloroformate v
Trifluoroethanol thnh C14H15O5F3NCl nn ch c mass 370, trong khi thy
tnh ra l C17H19O7F3NCl, mass 441!!! 6. C phi tc dng ca TFA l lm
ngng qu trnh phn ng gia NaOCl v Tyr? Vit phng trnh. 7. Vai tr ca
dung mi A v B khi chy HPLC reverve-phase. 8. Tnh meq/mL ca dung dch
m pH 7.4 v pH 3.8.
