Phylogénie et diversité des microorganismes - frangun.orgfrangun.org/cours_pasteur_2011.pdf · l’établissement d’une classification évolutive des microorganismes Bactéries

Phylogénie et diversité des microorganismesMaster Microbiologie générale (Institut Pasteur)

Céline Brochier-Armanet

Professeur – Université Lyon ILaboratoire de Biométrie et Biologie évolutive (UMR5558)([email protected])

Phylogénie et diversité des microorganismes (Céline Brochier-Armanet 2011)

Les microorganismes jusqu’au XIXème siècle

� Découverts au milieu du 17ième

� Considérés pendant deux siècles comme:⇒ Des curiosités sans intérêt

⇒ Des intermédiaires probables entre le monde minéral et le monde vivant

⇒ Classés au sein des Plantes ou au sein des animaux (dans le groupe mal défini des vers)

Plantae Protista Animalia

Haeckel (1866)


Place des microorganismes au sein du monde vivant

Plantae Plantae

Protista

AnimaliaFungi

Monera

Copeland (1938 et 1947) Whittaker (1969)

AnimaliaProtista


Est-il possible d’établir une classification phylogénétique des microorganismes?

Culture pureÉchantillon

Morphologie

Métabolisme/Physiologie

Identification/Classification@purificacion lopez-garcia


“... the ultimate scientific goal of biological classification cannot be achieved in the case of bacteria” (Roger Y. Stanier, 1963)

Echec de l’application du principe de subordination des caractères pour l’établissement d’une classification évolutive des microorganismes

Bactéries sulfureuses(Thiobacillus)

Bactéries pourpressulfureuses

(Thiorhodaceae)

Bactéries pourpresnon sulfureuses

(Athiorhodaceae)

Bactéries sulfureusesnon pigmentées

Oxydentdes

composéssoufrés

Similaritéphysiologique

Granules de soufreintracellulaires(Thiobacteria)

Similaritémorphologique

Mêmepigmentation

(Rhodobacteria)


Une révolution en marche…

� 1955 : Séquençage de l’insuline - Sanger� Premières phylogénies moléculaires (Eucaryotes)� 1965 : “ Molecules as Documents of Evolutionary History ”

- Zuckerkandl et Pauling� 1977 : Catalogues d'oligonucléotides d’ARNr – Carl Woese� 1977 : Séquençage rapide de l’ADN - Sanger


L’accès au patrimoine génétique des organismes a radicalement changé notre connaissance de l’histoire de la vie


La biodiversité des organismes actuels définit trois grands domaines

(Sogin, 1991)

(Fox, 1977)

Archaea


Plantae

Protista

AnimaliaFungi

Monera

Plantae

Protista

AnimaliaFungi

Monera

La diversité génétique ne reflète pas la diversité morphologique

(Sogin, 1991)

(Fox, 1977)

*


Tous les êtres vivants descendent d’un même ancêtre commun: LUCA


L’arbre universel du vivant représente une infime partie de l’histoire de la vie

Arbre universel du vivant

LUCA

Première cellule

Aujourd’hui

Premier âge : Monde pré-cellulaire

Second âge : Monde cellulaire pré-luca

Troisième âge : Monde cellulaire post-lucaOrigine(s) de la vie

(Forterre et al. Medecine Science 2005)


La biodiversité actuelle ne représente qu’une fraction de la biodiversité ayant existé

(http://web.uconn.edu/gogarten/)


Qui était LUCA?

� « Dis moi quels sont tes gènes et je te dirai qui tu es »� Identifier les gènes présents dans le génome de LUCA⇒ Comparer les gènes présents dans les génomes des représentants

actuels des trois domaines⇒ Identifier les gènes communs aux trois domaines � hérités de LUCA

LUCA

Hérédité verticale


Très peu de gènes sont communs à tous les organismes actuels

Protéines universelles

LUCA était un organisme cellulaire

LUCA possédait une ARN polymérase, des ribosomes & le code génétique universel

Le répertoire n’est pas compatible avec une vie cellulaire (ex. Pas de métabolisme…)

LUCA avait un génome à ???

(Forterre et al. MS 2005)


Limites de la génomique comparée

LUCA

Perte de gène

LUCA

Trop grande divergence

LUCA

Remplacement non homologue

LUCA

Hérédité verticale Transfert horizontal de gène

LUCA +++++

- - - - - - -


LUCA avait un génome de taille comparable aux génomes des actuels

~320->1000/2000 gènes⇒LUCA avait un génome relativement large⇒Free living

Brochier-Armanet C. “Minimal cell: the biologist point of view” Origin of life (Cambridge University Press – 2010)


Questions ouvertes & Grands enjeux des prochaines années


(Woese 1994 Microbiol Rev)

(2) LUCA hyperthermophile

(4) Irrésolution des relations de parentéentre la plupart des

phyla bactériens

(3) Émergence basale des bactéries hyperthermophiles

(3) Émergence basale des protistes amitochondriaux

(4) Irrésolution des relations de parentéentre la plupart des phyla eucaryotes

(1) Enracinement dans la branche bactérienne

Début des années 90: L’histoire de la vie est presque totalement résolue



Les relations de parenté entre les trois domaines


Quelles sont les relations de parenté entre les trois domaines?

BacteriaArchaea Eucarya

LUCA

LBCALACA

LECA

Temps

Présent

6

2

3

1


Archaea

Bacteria Eucarya

Archaea

Bacteria Eucarya

Eucarya

Bacteria

Archaea

Archaea

Bacteria Eucarya

Eucarya

Bacteria

Archaea

Bacteria

Archaea

EucaryaEucarya

Bacteria

Archaea

Racine

+

Trois scénarios possiblesPhylogénie et diversité des microorganismes (Céline Brochier-Armanet 2011)

Archaea

Bacteria Eucarya

Eucarya

Bacteria

Archaea

Eucarya

Bacteria

Archaea

Eucarya

Bacteria

Archaea

Eucarya

Bacteria

Archaea

Une approche naïve �Comparer les caractères de chaque domaine


Archaea

Bacteria Eucarya

Archaea

Bacteria Eucarya

Phylogénie non racinéedu paralogue 1


Archaea

Bacteria Eucarya

Archaea

Bacteria Eucarya



Archaea

Bacteria Eucarya

Archaea

Bacteria Eucarya



Archaea

Bacteria

Eucarya

Archaea

Bacteria

Eucarya

Archaea

Bacteria

Eucarya

Racine dans la branche archée

Racine dans la branche eucaryote

Racine dans la branche bactérienne

ArchaeaBacteria

Eucarya

ArchaeaBacteria

Eucarya

D

ArchaeaBacteriaEucarya

ArchaeaBacteriaEucarya

D

ArchaeaBacteriaEucaryaArchaeaBacteriaEucarya

D

D

D

D


- EF1α/EF2 (Iwabe et al. 1989)- SRP54/SRα (Gribaldo et Cammarano 1998)- ATPase F1-a/F1-b (Iwabe et al. 1989, Gogarten et al. 1989)- Aminoacyl-tRNA synthetases (ILE/VAL/LEU) (Brown & Doolittle 1995)

Enracinement dans la branche bactérienne

Linear fatty acids EsterD - glycerol

Glycerol-3-phosphate (G3P)

— CH2

CH2

C

C — O

C — O H O-

O-

—

—

O — P — O-——

=

O

=O



— CH2

CH2

CC

C — O

C — O H O-

O-

—

—

O — P — O-

O-

O-

—

—

O-

—

—

O — P — O-——

=

O

=O



— CH2

CH2

C

C — O

C — O H O-

O-

—

—

O — P — O-——

=

O

= O



— CH2

CH2

CC

C — O

C — O H O-

O-

—

—

O — P — O-

O-

O-

—

—

O-

—

—

O — P — O-——

=

O

= O Linear fatty acids EsterD - glycerol


— CH2

CH2

C

C — O

C — O H O-

O-

—

—

O — P — O-——

=

O

= O



— CH2

CH2

CC

C — O

C — O H O-

O-

—

—

O — P — O-

O-

O-

—

—

O-

—

—

O — P — O-——

=

O

= O

Implications évolutives d’une racine dans la branche bactérienne

Lipidesd’archées


A A A A A AE E E E E

BBBB

BB

Racine

ATPase rRNAIle-RSEF-1αSRPE

Tyr-RS

(Philippe et Forterre. 1999)Artefact causé par les substitutions multiples

Cet enracinement est-il fiable?S1S2S3S4S5S6

S1S4S6S2S3S5

Attraction des longues branches (Felsenstein 1978)



Replacer les virus par rapport à l’arbre de la vie


Les virus: Un quatrième domaine du vivant ?

Fusion de 7 protéines universelles(Raoult, Science 2005)


(Moreira et Lopez-Garcia, Science 2005)

Ces gènes ont été acquis par transfert àpartir de leur hôte


(Moreira & Brochier, BMC Evol Biol 2008)

… ou parasites de l’hôte (concept de réservoir évolutif)


Questions relatives aux virus?

� Les virus ont-ils une ou plusieurs origines (groupe monophylétique ou polyphylétique)?

� Les virus dérivent-ils de cellules?

� L’origine des virus est-elle plus ancienne ou plus récente que LUCA?



La question de l’origine des eucaryotes


La question de l’origine des eucaryotes


LUCA

LBCALACA

LECA

Temps

Présent

6

2

3

1


Deux hypothèses sont en compétition

« La majorité des biologistes font dériver l’organisation plus complexe de la cellule eucaryote d’une organisation plus simple de type procaryote…»(Martin W. Current Opinion in Microbiology 2005)

Implique l’existence de3 domaines primaires

Implique l’existence de 2 domaines primaires et d’1 domaine secondaire


Une question au cœur du débat scientifiquePhylogénie et diversité des microorganismes (Céline Brochier-Armanet 2011)

…mais une absence de consensusNécessité de développer d’autres approches



Retracer les grandes étapes de la diversification de chacun des trois domaines du vivant


Elucider les grandes étapes de la diversification des trois domaines


LUCA5

LBCALACA

LECA

Temps

Présent

6


Archaea

(Bacteria

Eucarya

Microsporidia

DiplomonadsTrichomonads

Kinetoplastides

Euglena

AmibesEntamoebaSlime moulds

Algues rougesCiliés/Dinoflagellés/

ApicomplexésChampignonsAnimaux

Plantes

Straménopile

s

(Sogin, 1991)

Archezoa

Endosymbiosemitochondriale

Phylogénies basées sur l’ARNr16S (90)Phylogénie et diversité des microorganismes (Céline Brochier-Armanet 2011)

Découverte de gènes d’origine mitochondriale chez les Archezoa

Trichomonas vaginalis 1Trichomonas vaginalis 2

Giardia intestinalis

Trichomonads (localisation dans les hydrogénosomes)

Diplomonads (localisation dans les mitosomes)

Proteobacteria

IscS, formation des clusters FeS et réparation des protéines FeSTachezy, MBE, 2001, 18:1919-1928

Trichomonas

Sutak, PNAS, 2004, 101:13068-10373Tovar, Nature, 2003, 426:173-176

Diplomonads

Gènes d’originemitochondriale


Homo WFGGWKVTRKDGNASGTTLLSaccharomyces WYGGWEKETKAGVVKGKTLLGlugea WFKGWKPVSGAGDSI-FTLEArabidopsis WYKG PTLLTrypanosoma WYKG PILVPlasmodium WYKG RTLIGiardia WYEG PCLISulfolobus WYNG PTLEE. coli WEAK LELA

EF

-1αα αα

Signature fungi, m

etazoa,m

icrosporidia

Trachipleistophorahominis

Lien entre Microsporidia & FungiPhylogénie et diversité des microorganismes (Céline Brochier-Armanet 2011)

Fin de l’hypothèse Archezoa (fin 90s)

ArchezoaEndosymbiosea-proteobacteria⇒ Mitochondries⇒ Hydrogénosomes⇒ Autres organelles ?

Perte ou transformation des mitochondries en liaison avec

un mode de vie parasitaire

Micro-sporidia

Dip

lom

onad

s

Tric

hom

onad

s

Kinetoplastides

Euglena

AmibesEntamoeba

Slime mouldsAlgues rougesCiliés/Dinoflagellés/

Apicomplexés

Champignons

Animaux

Plantes

Straménopile

s

?


(Delsuc et al. Nat Rev Micro 2005)

Nouvelles méthodes d’analyse (XXIème)Phylogénie et diversité des microorganismes (Céline Brochier-Armanet 2011)

La phylogénie des eucaryotes revisitée

(Baldauf SL 2003 Science; Simpson and Roger 2002 Current Biology)


(Delsuc et al. Nat Rev Micro 2005)

Et pout les autres domaines?Phylogénie et diversité des microorganismes (Céline Brochier-Armanet 2011)


Explorer la diversité biologique existante…


Notre connaissance de la biodiversitéactuelle est encore très lacunaire

(Lopez-Garcia et al. 2002)

BACTERIA

(Forterre et al. TPB 2002)

ARCHAEA


(1) Extraction de l’ADN

(2) Amplification PCR(amorces choisies

Ex ARNr 16S)

(3) Clonage

(4) Sélection des clones positifs & Vérification de la taille des inserts,

profils des fragments (ARDRA, RFLP)

(5) Séquençage

(6) Interrogation desbanques de données

(7) Analysesphylogénétiques

ARN

RT - PCR

La naissance de l’écologie moléculaire (90s)

Analyse phylogénétique des séquences amplifiées => Aperçu « non biaisé » de la diversité en microorganismes présents dans un milieu @purificacion lopez-garcia


La diversité microbienne révélée� Au sein de groupes déjà connus (ex. Planctomycetales)� Par la découverte de nouvelles lignées (ex. Thaumarchaeota,

Korarchaeota)

(Schleper Nat Rev Micro 2005)(Brochier 2001 unpublished)


Cerner la diversité virale, un enjeu de taille

� Objets biologiques les plus courants dans les océans (Estimation des populations ~1012 particules virales/200L, 104

types viraux différents)� Rôles majeurs dans les cycles

biogéochimiques, la diversitémicrobienne, échanges génétiques

� Peu d’études de leur diversité(isolation difficile, hôtes souvent non cultivables, pas d’éléments génétiques conservés)

� La majorité des fragments génomiques viraux ne ressemble à rien de connu

(Breitbart et al. 2002 PNAS)

Inconnus

(783)Inconnus

(569)

Connus

(278)

Connus

(304)Hits

genbank

Groupes biologiques

* *

* *

95/105Familles de phages

71/95


Genome Encyclopedia of Bacteria and Archaea

� Séquencer au moins un représentant de chaque groupe taxonomique connu

� Combler les biais dans notre connaissance des fonctions présentes au sein du monde vivant




Explorer la diversité biologique existante… et comprendre le fonctionnement des écosystèmes…


FISH, Chromosome painting…

� Utilisation de sondes oligonucléotidiques avec un marquage fluorescent dirigées contre l’ARNr (1989)

� Permet l’identification de cellules individuelles et de la structure/organisation des communautés


Accéder aux fonctions biologiques� Exploration des répertoires géniques des micro-organismes au sein des

écosystèmes⇒ Séquençage de larges fragments d’ADN

Échantillon

Extraction

de l’ADN

Clonage direct (BACs, Cosmides, Fosmides)

Banque génomique

CRIBLAGEActivité spécifiques

Gènes spécifiques

SEQUENCAGE D’INSERTS (plusieurs Mb)

* Structure du génome- Distribution, densité des gènes, Introns, opérons…

* Analyse des gènes présents

- Analyse phylogénétiques (Diversité)- Détection des transferts horizontaux (Evolution)

- Gènes du métabolisme (Culture, écologie)

EXPRESSION DE GENES D’INTERETSSéquençage + étude

Sous-clonageAmélioration de l’expression

Applications biotechnologiques

(@purificacion lopez-garcia)


Découverte de nouveaux métabolismes: un nouveau type de phototrophie dans la mer

γγ γγ-pr

oteo

bact

eria

Halorhodopsines(Pompe ions Cl-,

Halophiles)

Bacteriorhodopsines(Pompe H+, Halophiles)

Récepteurs photosensibles, Halophiles

Bactérie prochedu groupe SAR86

7 segmentstransmembranaires

Béjà et al. Science (2000)

Coloration rouge des E. coli exprimant le gène. Ajout de retinal => pic d’absorption détecté à

520 nm

Fonctionne commeune pompe à H+

Phylogénie et diversité des microorganismes (Céline Brochier-Armanet 2011) Phylogénie et diversité des microorganismes (Céline Brochier-Armanet 2011)

Découverte d’archaea nitrifiantes (2005)

BetaP(AmoA)

Archaea (AmoA)

AlphaP(PmoA)GammaP

(PmoA)GammaP(AmoA/PmoA)

Verrucomicrobia(PmoA)

(Schleper AEM 2005)

(Schleper & Nicols 2010)


Séquençage & assemblage de génomes complets directement à partir de l’environnement

A. Biofilm rose dans la mine de Richmond mine

B. FISH : Sonde: verte = bactéries, bleu = archébactéries, rouge = genre Leptospirillum. (recouvrement vert + rouge = jaune => dominance des cellules de Leptospirillum)

C. Abondance relative basée sur le FISH

(Tyson et al., Nature, 2004)


Analyse de la diversité & dynamique des populations de Ferroplasma

A. Biofilm rose dans la mine de Richmond mine

B. FISH : Sonde: verte = bactéries, bleu = archébactéries, rouge = genre Leptospirillum. (recouvrement vert + rouge = jaune => dominance des cellules de Leptospirillum)

C. Abondance relative basée sur le FISH



Analyse fonctionnelle des écosystèmes



Single cell genome sequencingPhylogénie et diversité des microorganismes (Céline Brochier-Armanet 2011)


Replacer l’histoire de la vie dans un contexte temporal absolu


Replacer l’histoire de la vie dans un contexte chronologique

HA

DE

AN

AR

CH

AE

AN

PR

OT

ER

OZ

OIC

4.5

2.5

0

1.0

0.5

1.5

2.0

3.0

3.5

PR

EC

AM

BR

IAN

PALEOZOIC

MESOZOIC

CENOZOIC

Temps(109 années)

Formation de la terre

Oxygénéisation de l’atmosphère (-2.3)

Plus anciens fossiles eucaryotes

(-1.8/-1.5)

4.0

Plus anciennes traces de vie non ambiguës (-2.7)+ Hopanes (Cyano) et

stéranes (Euca)

Bombardementtardif (-4.1/-3.8)

Plus vieilles roches terrestres (-4.0)

(Gargaud et al. From sun to life Springer 2006)

Eucaryotes multicellulaires (-1)

Explosion cambrienne (Faune d’EDIACARA -0.52)

Tra

ces

de v

ie a

mbi

gües


Lectures conseillées

Forterre, Gribaldo, Brochier Medecine Science 2005Bertrand JC, Brochier C, Gouy M, Westall F. “Pendant trois milliards d'années les micro-

organismes sont les seuls habitants de la terre” Ecologie Microbienne : Microbiologie des Milieux Naturels et Anthropisés. (Presses universitaires de Pau, Eds Bertrand JC, Caumette P, Lebaron P, Normand P) 2011 (à paraître)

Brochier-Armanet C. “ Minimal cell: the biologist point of view” Origin of life (Cambridge University Press, Eds Gargaud M, Lopez-Garcia P, Martin H) 2010;26-46

Forterre P, Gribaldo S, Brochier C. “LUCA: the last universal common ancestor” Med Sci (Paris). 2005;21(10):860-865

Thomas, Lefèvre, Raymond "Biologie évolutive" Editions de boeck (2010)
