PIGMEN-PIGMEN DALAM KLOROPLAS

A. Tujuan

Mahasiswa terampil dalam mengekstraksi pigmen-pigmen yang terdapat

dalam kloroplas

Mahasiswa terampil dalam mengidentifikasi pigmen-pigmen yang terdapat

dalam kloroplas

B. Dasar Teori

Warna-warna yang umum dalam dunia tanaman adalah hijau atau nuansa

warna hijau. Klorofil (zat hijau daun) adalah bahan utama yang menghasilkan

warna hijau. Klorofil, suatu bahan yang sangat penting, adalah sebuah pigmen

yang terkandung dalam kloroplas yang tersebar dalam sitoplasma (cytoplasm)

sel-sel tanaman. Pigmen-pigmen ini menyerap cahaya yang berasal dari

matahari dengan mudah, tetapi hanya memantulkan warna hijau. Selain

memberi warna hijau pada daun, hal ini juga menyebabkan terpenuhinya

kelangsungan sebuah proses yang sangat menentukan, yang dikenal dengan

nama "fotosintesis".

Dalam fotosintesis, tanaman memanfaatkan sinar matahari, yang terdiri

dari kombinasi berbagai warna. Salah satu sifat warna-warna dalam sinar

matahari yang terpenting adalah bahwa tingkat energi mereka berbeda satu

sama lain. Ragam warna ini dinamakan spektrum, yang diperoleh dari

pembiasan warna dalam sebuah prisma misalnya, mempunyai warna merah

dan kuning di ujung yang satu, dan biru dan ungu pada ujung lainnya. Warna

dengan tingkat energi paling tinggi adalah warna pada ujung biru spektrum

tersebut.

Perbedaan tingkat energi warna sangat penting bagi tanaman, karena

mereka memerlukan sejumlah besar energi untuk melangsungkan fotosintesis.

Untuk itu, selama fotosintesis berlangsung, tanaman menyerap cahaya

matahari dengan tingkat energi tertinggi di sekitar ujung ultraviolet dari

spektrum, yaitu violet dan biru, dan juga warna sekitar ujung inframerah

(panas) dari spektrum, yaitu merah, oranye dan kuning. Daun melakukan

semua proses ini melalui pigmen klorofil yang terdapat dalam kloroplas

(harunyahya.com, 2005).

Kurva terputus-putus dan solid berwarna putih di bawah ini menggambarkan

spektrum absorpsi klorofil a dan b. Kurva hitam di atas menggambarkan efektivitas

pelbagai panjang gelombang cahaya dalam menguatkan fotosintesis. Angka-angka

menunjukkan betapa miripnya spektrum absorpsi kombinasi klorofil a dan b

dengan spektrum kerja fotosintesis (harunyahya.com, 2005).

Kloroplas dijumpai terutama pada bagian daun yang disebut mesofil, yang

sering disebut pula daging daun. Kloroplas juga dijumpai di bagian-bagian lain,

bahkan juga pada batang dan ranting yang berwarna hijau. Hal ini disebabkan

karena dalam kloroplas terdapat pigmen yang berwarna hijau disebut klorofil.

Pigmen ini dapat menyerap energi cahaya. Klorofil terdapat pada membran

tilakoid dan perubahan energi cahaya menjadi energi kimia berlangsung dalam

tilakoid, sedangkan pembentukan glukosa sebagai produk akhir fotosintesis

berlangsung di stroma. Disamping klorofil a ( pigmen berwarna hijau ) dikenal

pula klorofil b yang mempunyai struktur mirip klorofil a, yaitu pigmen yang

berwarna kuning sampai jingga yang disebut karoten (wordpress.com, 2005).

Kromatografi kertas merupakan teknik untuk memisahkan senyawa-

senyawa tertentu sesuai dengan tingkat kelarutannya pada suatu pelarut. Dikenal

ada beberapa teknik kromatografi, yaitu kromatografi kertas, kromatografi lapis

tipis, kromatografi gas, kromatografi kolom dan High Pressure Liquid

Cromatografi (HLPC) (wikipedia.com, 2004).

Kromatografi kertas pada hakikatnya ialah sama dengan kromatografi

lapis tipis selulosa atau kertas. Cara ini ditemukan jauh sebelum kromatografi

lapis tipis dan sudah digunakan efektif selama bertahun-tahun. Berdasarkan

hal tersebut, peneliti mengambil kesimpulan bahwa nilai Rf pada kromatografi

lapis tipis sama dengan nilai Rf pada kromatografi kertas, sehingga acuan

yang dipakai untuk menentukan pigmen boleh dengan nilai Rf pada

kromatografi lapis tipis meskipun pada penelitian menggunakan kromatografi

kertas (Gritter, dkk. 1991).

Macam-macam pigmen menurut Harborne (1984):

C. Alat dan Bahan

- mortar dan pistil - penutup tabung

- corong kaca - corong pisah

- kertas saring - gelas ukur

- pisau - pipet

- gelas piala - aseton

- gelas arloji - petroleum eter

- pipa kapiler - akuades

- kertas kromatografi - rak tabung

- tabung reaksi - daun tumbuhan

Macam pigmen Rf Warna dibawah

cahaya biasa

Bentuk senyawa

jadian

Feofitin a 0,93 Kelabu Klorofil bebas Mg

Feofitin b 0,80 Coklat kekuningan

Klorofil a 0,60 Hijau biru

Klorofil b 0,35 Hijau kuning

Feoforbida a 0,18 Kelabu Klorofilida bebas Mg

Feoforbida b 0,07 Coklat kuning

Klorofilida a 0,03 Hijau biru Klorofil tanpa rantai

samping fitil Klorofilida b 0,02 Hijau kuning

D. Cara Kerja

Menimbang daun sebanyak 5 mg

Digerus dalam mortar menggunakan pistil sampai halus

Menambahkan 30 ml aseton pada gerusan daun sambil tetap digerus

Menyaring gerusan daun menggunakan kertas saring dan dimasukkan ke

dalam corong pisah

Menambahkan 10 ml petroleum eter dan mengocoknya

Menambahkan 10 ml akuades, dikocok kemudian didiamkan sampai terlihat

adanya pemisahan

Air yang terlihat memisah dikeluarkan pelan-pelan melalui kran bawah

Mengulangi pencucian dengan akuades sampai tidak berbau aseton

Mengeluarkan larutan pigmen dari corong pisah dan diletakkan pada gelas

arloji dan biarkan menguap

Menyiapkan campuran eluat, dengan perbandingan 1 ml aseton dengan 9 ml

petroleum eter

Mengambil 1 ml eluat dan memasukkan dalam tabung reaksi yang dipakai

untuk ruang elusi

Menyediakan kertas kromatografi sesuai dengan lebar dan panjang tabung

reaksi

Membuat garis pertama dengan jarak 1 cm dari ujung kertas, dan selanjutnya

membuat garis kedua dengan jarak 15 cm

dari garis pertama

Mengambil larutan pigmen yang sudah diuapkan dengan pipa kapiler, dan

selanjutnya membuat spot pada kertas kromatografi

pada garis pertama

Setelah spot kering, kertas kromatografi dimasukkan kedalam tabung elusi

dengan ujung sedikit menyentuh pada larutan eluat kemudian tabung ditutup

rapat

Meletakkan tabung reaksi pada rak dan biarkan beberapa saat sampai eluat

bergerak sampai menyentuh garis kedua

Mengamati warna spot yang terjadi pada ketas kromatografi

E. Data Hasil Pengamatan

Nama daun Spot Warna ds de

Kembang sepatu

(muda)

1 Hijau 1,5 11,4

2 Kuning 3,5 11,4

Penitian (sedang) 1 Kuning 7,4 10

2 Hijau muda 7,6 10

Alpukat (tua) 1 Hijau tua 4 10,9

2 Hijau muda 5,6 10,9

3 Kuning 8,4 10,9

F. Analisis Data

Berdasarkan dari nilai de dan ds, dengan menggunakan rumus Rf = ds

de

maka, diperoleh harga Rf dari masing-masing warna sebagai berikut:

1) Kembang sepatu

- spot 1 = Rf = 1,5

11,4

= 0,13

- spot 2 = Rf = 3,5

11,4

= 0,31

2) Penitian

- spot 1 = Rf = 7,4 = 0,74

10

- spot 2 = Rf = 7,6

10

= 0,76

3) Alpukat

- spot 1 = Rf = 4

10,9

= 0,37

- spot 2 = Rf = 5,6

10,9

= 0,51

- spot 3 = Rf = 8,4

10,9

= 0,77

Dari perhitungan nilai Rf diatas maka dapat dimasukkan ke dalam tabel

sebagai berikut:

Dari data pengamatan yang didapat, kemudian menentukan macam-

macam pigmen yang ada di dalam daun suatu tumbuhan dengan cara

mencarinya dalam tabel Rf dan warna klorofil a dan b menurut Harborne

(1984: 262), sebagai berikut:

Pada daun yang kami amati yaitu daun kembang sepatu yang masih muda

dan daun penitian yang sedang, warna yang terbentuk pada kertas Whatman

ada dua macam spot, yaitu pada kembang sepatu spot pertama berwarna hijau

dengan Rf = 0,13, dan spot yang kedua berwarna kuning Rf = 0,31, jarak

Nama daun Spot Warna ds de Rf

Kembang sepatu

(muda)

1 Hijau 1,5 11,4 0,13

2 Kuning 3,5 11,4 0,31

Penitian (sedang) 1 Kuning 7,4 10 0,74

2 Hijau muda 7,6 10 0,76

Alpukat (tua) 1 Hijau tua 4 10,9 0,37

2 Hijau muda 5,6 10,9 0,51

3 Kuning 8,4 10,9 0,77

Macam pigmen Rf Warna dibawah

cahaya biasa

Bentuk senyawa

jadian

Feofitin a 0,93 Kelabu Klorofil bebas Mg

Feofitin b 0,80 Coklat kekuningan

Klorofil a 0,60 Hijau biru

Klorofil b 0,35 Hijau kuning

Feoforbida a 0,18 Kelabu Klorofilida bebas Mg

Feoforbida b 0,07 Coklat kuning

Klorofilida a 0,03 Hijau biru Klorofil tanpa rantai

samping fitil Klorofilida b 0,02 Hijau kuning

tempuh eluat yaitu 11,4 cm. Pada daun Penitian juga terbentuk 2 spot, yaitu

spot yang pertama berwarna kuning dengan Rf = 0,74 dan spot yang kedua

berwarna hijau muda dengan Rf = 0,76, dengan jarak tempuh eluat 10 cm.

Sedangkan pada daun alpukat yang tua, terbentuk 3 spot, yaitu spot pertama

berwarna hijau tua dengan Rf = 0,37, spot yang kedua berwarna hijau muda

dengan Rf = 0,51 dan spot yang ketiga berwarna kuning dengan Rf = 0,77,

jarak tempuh eluat yaitu 10,9 cm.

Rf dari daun yang diamati dalam praktikum yang mendekati atau sama

dengan Rf menurut Harborme (1984: 262), sebagai berikut:

Dari tabel perbandingan antara Rf daun yang diamati dengan Rf menurut

Harborne (1984), maka dapat diketahui Rf daun pengamatan yang mendekati

Rf dari feofitin b (coklat kekuningan) ada 3 macam, yaitu Rf daun alpukat

pada spot 3 dengan selisih 0,03, daun penitian spot 1 dengan selisih 0,06 dan

daun penitian spot 2 dengan selisih 0,04. Sedangkan Rf daun amatan yang

mendekati Rf klorofil a (hijau biru) ada 1 macam, yaitu Rf pada daun alpukat

spot 2 dengan selisih 0,09. Rf bahan amatan yang mendekati Rf klorofil b

(hijau kuning) ada 2 macam, yaitu Rf pada daun alpukat spot 1 dengan selisih

0,02 dan Rf pada daun kembang sepatu spot 2 dengan selisih 0,04. Rf yang

Macam pigmen Rf Rf daun amatan

Feofitin a 0,93

Feofitin b 0,80 0,77 (daun alpukat spot 3)

0,76 (daun penitian spot 2)

0,74 (daun penitian spot 1)

Klorofil a 0,60 0,51 (daun alpukat spot 2)

Klorofil b 0,35 0,37 (daun alpukat spot 1)

0,31 (daun kembang sepatu spot 2)

Feoforbida a 0,18 0,13 (daun kembang sepatu spot 1)

Feoforbida b 0,07

Klorofilida a 0,03

Klorofilida b 0,02

mendekati Rf pada feoforbida a (kelabu) ada 1 macam, yaitu Rf pada daun

kembang sepatu spot 1 dengan selisih 0,05.

Berdasarkan harga Rf tersebut, maka pigmen yang terdapat pada daun

kembang sepatu yang masih muda yaitu pigmen klorofil b (hijau kuning) dan

feoforbida a (kelabu). Pada daun penitian yang sedang terdapat pigmen

feofitin b (coklat kekuningan). Sedangkan pada daun alpukat yang tua

terdapat pigmen feofitin b (coklat kekuningan), klorofil a (hijau biru) dan

klorofil b (hijau kuning).

G. Pembahasan

Menurut Parikesit (2006), sebenarnya tumbuhan memiliki berbagai jenis

molekul pigmen, masing-masing pigmen mampu menyerap gelombang cahaya

yang berbeda. Karena itu, sesungguhnya molekul pigmen pada daun memang

menyerap cahaya, akan tetapi dalam proporsi yang berbeda-beda.

Molekul pigmen yang menangkap energi dari cahaya biru bekerja paling

efisien, sehingga lebih banyak memperoleh energi daripada molekul pigmen

lainnya. Sedangkan molekul pigmen yang bisa menyerap warna merah juga

penting, terutama pada waktu subuh dan petang hari. Klorofil adalah molekul

pigmen yang paling efektif untuk menyerap gelombang cahaya merah dan

biru. Dikarenakan untuk efisiensi kerjanya, maka jumlah klorofil pada daun

diproduksi dalam jumlah banyak daripada molekul pigmen lainnya (Parikesit,

2006).

Kelarutan pigmen dalam pelarut organik berbeda-beda, sehingga dapat

dipisahkan dengan tekhnik kromatografi kertas. Pada pemisahan pigmen

digunakan pelarut dan eluat tertentu. Sebagai fase diam dipakai kertas

Whatman yang khusus untuk kromatografi, sedangkan untuk fase bergerak

(eluat) digunakan pelarut organik yaitu campuran antara 1 ml aseton dengan

9 ml petroleum eter (Dahlia, dkk. 2001: 117).

Selama perbedaan kelarutan pigmen dalam eluat pada saat elusi

menyebabkan terjadinya pemisahan komponen-komponennya. Pigmen yang

memiliki kelarutan paling tinggi akan mengikuti eluat sampai jarak yang

terjauh. Selama pergerakan bersama eluat, pergerakan solut akan dihambat

oleh fase diam, sebab solut berada dalam fase gerak tetapi juga berada pada

fase diam. Besarnya hambatan tersebut dinyatakan dengan nilai Rf

(Retandation Factor) dengan rumus Rf = ds/de (Dahlia, dkk. 2001: 116).

Pada percobaan pigmen dalam kloroplas ini, teknik kromatografi yang

dipakai adalah kromatografi kertas. Menurut Harborne (1984), keuntungan

dari pemakaian kromatografi kertas adalah kemudahan tekniknya dan cara

yang paling sederhana dan murah. Selain itu, keterulangan bilangan Rf

merupakan parameter yang berharga dalam memaparkan senyawa tumbuhan

yang baru ditemukan.

Menurut Gritter, dkk (1991: 157), kromatografi kertas pada hakikatnya ialah

sama dengan kromatografi lapis tipis selulosa atau kertas. Cara ini ditemukan

jauh sebelum kromatografi lapis tipis dan sudah digunakan efektif selama

bertahun-tahun. Berdasarkan hal tersebut, peneliti mengambil kesimpulan

bahwa nilai Rf pada kromatografi lapis tipis sama dengan nilai Rf pada

kromatografi kertas, sehingga acuan yang dipakai untuk menentukan pigmen

boleh dengan nilai Rf pada kromatografi lapis tipis meskipun pada penelitian

menggunakan kromatografi kertas.

Berdasarkan hasi pengamatan diketahui Rf daun pengamatan yang mendekati

Rf dari feofitin b yang berwarna coklat kekuningan ada 3 macam, yaitu pada

Rf daun alpukat pada spot 3 dengan selisih 0,03, daun penitian spot 1 dengan

selisih 0,06 dan daun penitian spot 2 dengan selisih 0,04. Sedangkan pada Rf

daun amatan yang mendekati Rf klorofil a (hijau biru) ada 1 macam, yaitu Rf

pada daun alpukat spot 2 dengan selisih 0,09. Rf bahan amatan yang

mendekati Rf klorofil b (hijau kuning) ada 2 macam, yaitu Rf pada daun

alpukat spot 1 dengan selisih 0,02 dan Rf pada daun kembang sepatu spot 2

dengan selisih 0,04. Rf yang mendekati Rf pada feoforbida a (kelabu) ada 1

macam, yaitu Rf pada daun kembang sepatu spot 1 dengan selisih 0,05. Oleh

karena itu, praktikan untuk menetapkan jenis pigmen daun yang diamati

dengan selisih nilai Rf yang terkecil dari nilai Rf literatur.

Secara kimia, pada klorofil terdapat satu inti tetra pirol dengan sati atom

magnesium yang terikat secara ketat pada bagian tengah dan satu rantai

samping hidrokarbon panjang tergabung melalui gugus asam karboksilat. Di

dalam tumbuhan sekurang-kurangnya terdapat 5 jenis klorofil, semuanya

memiliki struktur dasar yang sama tetapi memiliki bermacam-macam sifat

sesuai dengan rantai samping alifatik yang terikat pada inti porfirin (Harborne,

1987: 259).

Dengan demikian, dari pembahasan diatas dapat diketahui bahwa spot dengan

warna coklat kekuningan pada daun alpukat spot 3 adalah pigmen yang

memiliki kalarutan paling tinggi. Hal ini tampak dari jarak yang ditempuh

solut untuk mengikuti eluat. Hal yang dapat mempengaruhi nilai Rf

kemungkinan disebabkan oleh beberapa faktor, yaitu jumlah sampel yag

ditotolkan pada kertas Whatman, kemiringan eluat, ketebalan spot yang

dibuat, perbandingan konsentrasi pada campuran untuk membuuat eluat,

kejenuhan dari tabung reaksi dan suhu serta waktu pemisahan klorofil. Karena

itu, perlu diperhatikan faktor tersebut untuk mendapatkan nilai Rf yang cukup

valid.

H. Kesimpulan

Dari hasil pengamatan dan pembahasan diatas, maka dapat ditarik

kesimpulan sebagai berikut:

a. Terdapat beberapa jenis pigmen yang berperan dalam fotosintesis, yaitu

klorofil a dan b, feofitin b dan feoforbida a.

b. Kelarutan antar masing-masing pigmen berbeda-beda. Semakin jauh jarak

yang ditempuh oleh solut, maka kelarutan dari solut tinggi dan harga Rf-nya

juga semakin besar.

c. Daun bahan amatan yang memiliki kelarutan tinggi adalah pada daun

alpukat yang sudah tua dengan nilai Rf = 0,77.

d. Ada beberapa faktor yang mempengaruhi nilai Rf amatan, yaitu jumlah

sampel yang ditotolkan pada kertas Whatman, kemiringan eluat, ketebalan

spot yang dibuat, perbandingan konsentrasi pada campuran untuk membuat

eluat, kejenuhan dari tabung reaksi dan suhu serta waktu pemisahan klorofil.

I. Daftar Pustaka

Anonimus. 2005. Kesempurnaan Warna Seni Illahi, (Online)

(http://www.harunyahya.com/indo/buku/citarasa005d.htm, diakses tanggal

20 Maret 2009)

Anonimus. 2005. Analisis Kuantitatif Klorofil, (Online)

(http://gedbinlink.wordpress.com/tag/analisis-kuantitatif-klorofil/, diakses

tanggal 20 Maret 2009)

Anonimus. 2004. Kloroplas, (Online) (id.wikipedia.org/wiki/Kloroplas,

diakses tanggal 20 Maret 2009)

Dahlia, dkk. 2000. Petunjuk Praktikum Fisiologi Tumbuhan. Malang: JICA

Gritter, Roy J, dkk. 1991. Pengantar Kromatografi. Bandung: ITB

Harborne, J. B. 1984. Metode Fitokimia. Bandung: ITB

Lakitan, Benyamin. 1993. Dasar-dasar Fisiologi Tumbuhan. Jakarta: PT Raja

Grafindo Persada

Parikesit, Gea O. F. 2006. Mengapa daun tidak selalu berwarna hijau?,

(Online) (http//72.14.235.104/search?q=cache:4yu, diakses tanggal 28

Maret 2009)