Platelets and Thrombosis

阮 长 耿Jiangsu Institute of Haemotology

Suzhou University Medical CollegeSuzhou 215007, P.R. China

血栓形成机制血栓形成机制““ 血栓、栓塞、纤血栓、栓塞、纤维蛋白原”的命名维蛋白原”的命名人德国的人德国的 RudolfRudolf VirchowVirchow 教授于教授于18561856 年提出血栓年提出血栓形成三大要素：血形成三大要素：血管壁损伤、血流异管壁损伤、血流异常、血液成分异常。常、血液成分异常。该理论至今仍被该理论至今仍被认认可。可。

血流因素：血流是否淤滞血流因素：血流是否淤滞

血管因素：血管壁受损血管因素：血管壁受损

血小板因素：形成血小板血栓血小板因素：形成血小板血栓

凝血系统：纤维蛋白形成凝血系统：纤维蛋白形成

纤溶系统：纤维蛋白溶解，血管纤溶系统：纤维蛋白溶解，血管修复修复

凝血因子血小板血管内皮促凝功能

血流抗凝蛋白纤溶蛋白血管内皮抗凝功能正 常 止 血 状 态

促凝血活性 抗凝血活性

促凝血活性凝血因子血小板血管内皮促凝功能

抗凝血活性血流抗凝蛋白纤溶蛋白血管内皮抗凝功能

栓 倾 向血

或 血 栓 形 成

血流改变 血流改变 血流淤滞与涡流血流淤滞与涡流血管损伤血管损伤

血小板因素：血小板因素：血小板增多、血小板活化血小板增多、血小板活化凝血因素：凝血因素：纤溶因素：纤溶因素： 纤溶活性降低纤溶活性降低

胶原、微纤维暴露胶原、微纤维暴露血小板活化血小板活化凝血因子释放凝血因子释放 血血栓栓形形成成

血栓形成机制血栓形成机制血栓形成是机体促凝血活性与抗凝血活性失衡的结果血栓形成是机体促凝血活性与抗凝血活性失衡的结果

抗凝功能减弱抗凝功能减弱促凝功能增强促凝功能增强

凝血因子活性增高凝血因子活性增高抗凝蛋白缺陷抗凝蛋白缺陷

血液成分改变

血液成分改变

动脉血栓 : 病理过程

阻塞阻塞急性事件急性事件

栓塞栓塞

慢性缺血慢性缺血

动脉粥样动脉粥样硬化斑块硬化斑块

斑块产斑块产生裂隙生裂隙或完全或完全破裂破裂血栓与粥血栓与粥

样斑块融合样斑块融合血栓形成血栓形成

稳定性斑块稳定性斑块

动脉血栓• 定义 ( 病理生理学 ):

–在动脉粥样硬化血管内形成一个富含血小板的血栓 • 临床后果 :

–累及多处动脉血管床 ( 如 , PAD 患者发生心梗和中风的危险性增高 )–导致心肌梗死、缺血性中风、血管性死亡的主要原因

动脉血栓的流行病学 :心肌梗死和缺血性中风临床表现临床表现缺血性中风缺血性中风心肌梗死心肌梗死

年发病率年发病率 , , 美国美国 ++ 欧盟欧盟 **

1,750,0001,750,0002,100,0002,100,000

• 缺血性心脏病 缺血性心脏病 (( 包括心梗包括心梗 ) ) 和 脑血管疾病 和 脑血管疾病 ((包括出血性中风包括出血性中风 ) ) 在欧洲和北美每年的致死人数在欧洲和北美每年的致死人数占全部死亡人数的占全部死亡人数的 27-30%27-30% 。。

死亡率死亡率

**17 Western European countries. 17 Western European countries. American Heart Association. Heart and Stroke Facts: 1997 Statistical Supplement; American Heart Association. Heart and Stroke Facts: 1997 Statistical Supplement; WHO Yearbooks, Annual Statistics (last available years 1992-1994 ). WHO Yearbooks, Annual Statistics (last available years 1992-1994 ).

新华社 2002 年 10 月 8 日电讯：“ 全国高血压日”，有关资料显示：

现有 每年新增 有高血压病史 高血压患者 1 亿 300 万 脑卒中患者 500 多万 150 万 76%

冠心病患者 1000 万 65%

初期止血机制 TXA2

ADP

纤维蛋白原凝血酶 PF4

-TG

PDGF

纤维蛋白

PGI2

聚集

白色血栓

释放

粘附

v WF

EC

SE

血栓栓子血栓栓子

血管壁损伤血管壁损伤血小板附着血小板附着

血小板激活血小板激活血小板聚集血小板聚集

血栓栓子的形成

GPIa-IIa (α2β 1); GPIIb-IIIa (αIIβ3); GPIc-IIa (α5β1)

血小板膜糖蛋白与血小板的止血功能

活化 聚集

粘附

（ Fn：纤维结合蛋白， Coll：胶原， Ec：内皮细胞）

Adhension

The platelet vWF-subendothelial Axis

Immunoinhibitory probes using GPIb MoAb AN 51

suggest that GPIb on the platelet membrance is the

vWF receptor.

(Ruan et al: Brit.J.Haematal,1981)

• SZ 1 GPIX 中国科学 1986, Blood 1987• SZ 2 GPIb 中国科学 1986, Blood 1987• SZ 21 GPIIIa Thromb. Hemostas. 1987 中华内科杂志 1987• SZ 22 GPIIb Thromb. Hemostas. 1987 中华血液杂志 1987

• SZ 51 GMP140

( P-Selectin ) Nouv. Rev. Fr. Hematol.1990

血小板活化的指标1 ） TXB2,β –TG, PF4

2) P-Selectin “gold standard”

3) Platelet microparticles (PMP)

4) Circulating monocyte-platelet aggregates (MPA)

(Circulation 2001;104:1533)

5 ） Others: GPV

GMP-140 and TXB2 in patients with Acute myocardial infarction (AMI) n GMP-140 GMP-140 TXB2 (molecules/pit) (ng/ml) (pg/ml)

1 day after AMI 24 2594±208** 19.1±4.7 * 226±37**

2 days after AMI 16 3353±593** 25.7±6.7* 278±45**

3 days after AMI 18 1485±221* 29.6±8.1** 224±48**

7 days after AMI 16 718±475 16.0±9.1* 183±29*

10 days after AMI 16 13.2 ±8.0

normal controls 20 780 ±196 10.0 ±4.5 159 ±32

Data are means ±SD. * P<0.05, **P<0.01.

2 型糖尿病血小板膜与血浆中 P- 选择素水平比较 FCM测血小板膜 P-选择素 IRMA测血小板膜 P- 血浆 P-选择素

组别 例数 荧光百分率(%) 选择素(分子/血小板) (ng/ml)

对照组 30 3.75± 1.83 451± 172 3.43± 1.56

(0.34± 0.10)

Ⅱ 型糖尿病

无血管病变组 38 4.25± 2.29 757± 294 3.71± 2.12

(0.39± 0.12)

有血管病变组 47 10.28± 4.86** 1606± 1570** 6.18± 3.20*

(0.53± 0.18)**

注: (1)与对照组比较 *P<0.05 , **P<0.01 ， (2)括号内为平均荧光强度

血小板微颗粒（ PMP) 与血小板活化 PMP 是血小板粘附或活化的产物。静息血小板群体的 PMP 含量不超过 3% 。 当血小板活化时， PMP 明显增多，在一些病理条件下 PMP 作为血小板活化的指标。

各种疾病患者得血小板微颗粒（ PMPs ）PMPs (particles/ml plasma)

对照 （ 30 ） （ 1.2 ± 0.6) × 105

冠心病 （ 18 ） （ 6.1 ± 2.5) × 105

急性脑梗塞（ 12 ） （ 6.8 ± 3.4) × 105

慢性肾功能衰竭（ 23 ） （ 5.9 ± 3.1) × 105

急性白血病（ 25 ） （ 1.3 ± 0.6) × 105

马文新等：基础医学与临床 2000； 20： 90-93

Pl atel et - Deri ved Mi cropart i cl e

0

50

100

150

0 8 16 24 32 40 48Ti me af ter Di rect Angi opl asty(h)

CD41

-Imm

unofl

uore

scen

ce

AMIControl

Leukocyte Platelet Interaction

L

PSGL-1

TF

P-Sel

E.C

P

M P A (monocyte-platelet aggregates)

1) Baboons EXP

输脱颗粒血小板，很快形成 MPA。

30 分钟后 MPA 保持， Plt-P-Sel

2） PCI （ N=10 ) MPA : , P-Sel:Normal

3) 胸痛急诊（ N=93 ） MPA P-Sel

AMI （ N= 9 ） 34.2* N

非 AMI（ N=84 ） 19.3 N

Normal ( N=10) 11.5 N

肾上腺素 胶原 凝血酶 ADP

花生四稀酸

血栓烷 A2

GPIIb-IIIa 受体GPIIb-IIIa 拮抗剂

抗 血 小板 药 物 的 作 用 机 理

抵克力得阿司匹林

TICLOPIDINE:

• In animals and in man, inhibits platelet aggregation induced by: - ADP (1st and 2nd phases) • In animals and in man, increases bleeding time

S

N

CIHCl

The In Vitro Effect of Ticlopidine on Fibrinogen and Factor VIII Binding to Human PlateletsHelen Lee, R.C. Paton*, C. Ruan and J.P.Caen

From the Laboratioire d’Hemostase et de Thrombose Experimentale and* Service de Nutrition et Endocrinologie, Hopital Saint-Louis, Paris, France

Thrombosis & Haemostasis Vol 46 No.3 October 30, 1981

CATSCanadian – American Ticlopidine Study

TASSTiclopidine Aspirin Stroke Study

STA1Study of Tidopidine in Unstable Angina

30

20

10

死亡人数

P=0.038

安慰剂抵克立得

抵克立得减低 47% 死亡率

( CATS )

0 6 12 18 24 30 36 42

50 40 30 20 10

事故累积发生率（% ）

P=0.062

阿斯匹林

抵克立得P=0.036

Mantel-Haensezel 试验 P=0.087( 月份）事故累积发生率 ( TASS )

TICLOPIDINE IN CHINA

A STUDY OF TWO DOSE LEVELS ON BLEEDING TIME AND PLATELET FUNCTION IN HEALTHY VOLUNTEERS.

Ruan C, Destelle G, Wang Z et al:THROMBOS/HAEMOSTAS RES. UNIT, SUZHOU MEDICAL

COLLEGE, SUZHOU, CHINA;

SANOFI PHARMA INTERNATIONAL, PARIS, FRANCE

Haemostasis 1989;19:94-99

三年内副作用的发生率 病人数（百分率）

副作用 抵克立得 阿司匹林 X2 试验 n=165 n=169 p 胃和十二指肠溃疡 1（ 1 ） 10（ 6 ） < 0.02

胃肠道不适 8（ 5 ） 13（ 8 ） 无统计学意义脑出血 2（ 1 ） 2（ 1 ） 同上出血倾向 5（ 3 ） 5（ 3 ） 同上白细胞减少症 2（ 1 ） 0（ 0 ） 同上肝功能障碍 3（ 2 ） 4（ 2 ） 同上肾功能障碍 1（ 1 ） 0（ 0 ） 同上皮疹 3（ 2 ） 0（ 0 ） 同上其它 4（ 2 ） 5（ 3 ） 同上 合计 29（ 18% ） 39（ 23% ） 无统计学意义

波立维与阿司匹林合用对支架内血栓形成的协同作用对照组 (未灌注 )

阿司匹林 10 mg/kg 静脉注射（ IV ）血栓重量 18 mg

波立维 5 mg/kg 静脉注射血栓重量 8 mg

波立维 5 mg/kg IV + 阿司匹林 10 mg/kg IV血栓重量 1 mg

Makkar RR et al Eur Heart J 1998;19:1538–1546

动物模型

波立维单用或与阿司匹林合用对血栓形成的影响 : 动物模型

-100

-80

-60

-40

-20

0

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

时间 ( 分钟 )

波立维 + 阿司匹林 (10 + 10 mg/kg)

波立维 (10 mg/kg)

阿司匹林 (10 mg/kg) 安慰剂

Herbert JM et al Thromb Haemost 1998;80:512–518

血流量(% 降低 )

肾上腺素 胶原 凝血酶 ADP

花生四稀酸

血栓烷 A2

GPIIb-IIIa 受体GPIIb-IIIa 拮抗剂

抗 血 小板 药 物 的 作 用 机 理

抵克力得阿司匹林

Molecular Pharmacology Molecular Pharmacology

Eptifibatide Tirofiban Abciximab

Molecular weight ~800 495

~50,000

Molecules of drugPer receptor ~240-440 >100

~1.5

Infusion 20-72 h 36-96 h

12-24 hIMPACT ,Ⅱ RESTORE,

OfficialPURSUIT PRISMPLUSprescring

information

GPIIb/IIIa InhibitorsGPIIb/IIIa Inhibitors

Pharmacokinetics Pharmacokinetics

Eptifibatide Tirofiban Abciximab

Binding Competitive Competitive High

affinity

Half life Plasma ~1.5 h ~1.5 h ~1.0 min Biologic ~1.5 h ~1.5 hDays

Clearance Renal Renal

Renal/Spleen

GPIIb/IIIa InhibitorsGPIIb/IIIa Inhibitors

GPIIb/IIIa InhibitorsGPIIb/IIIa InhibitorsClinical Considerations: ReversibilityClinical Considerations: Reversibility

Adapted from Mousa, 1996.

Normal return of platelet function

PlateletAggregation

Tirofiban

Eptifibatide

Abciximab

Hours

100

80

60

40

20

00 6 12 18 24 30 36

Abciximab and AMI: EPIC

Abciximab

Placebo

% patients

30 days

P=0.06

-83%

26.14.54.5 4.5

6 months

47.8

% patients

- 91%

p=0.002

EP: Death +MI+urgent revascularization

The EPIC Investigators – am J Cardiol 1996;77:1045-51

EPICAbciximab BAbciximab B+1

Treatment Group

EPILOGAbciximab LDHAbciximab SDH

EPISTENTAbciximab + StentAbciximab + PTCA*

IMPACT IIEptifibatide 135/5Eptifibatide 135/75

RESTORETirobifan

CAPTUREAbciximab

RAPPORTAbciximab

Death, MI, or Urgent Revascularization at 30 Days Odds Ratio and 95% Confidence Intervals

0.25 1 4GP IIb/IIIa Better Placebo BetterComposite 30-day end point (death, myocardial infarction or urgent repeat

revascularization) event rates for the 7 GPIIb/IIIa interventional trials.

EPICAbciximab BAbciximab B+1

Treatment Group

EPILOGAbciximab LDHAbciximab SDH

EPISTENTAbciximab + StentAbciximab + PTCA*

IMPACT IIEptifibatide 135/5Eptifibatide 135/75

RESTORETirobifan

CAPTUREAbciximab

RAPPORTAbciximab

Deather MI at 6 MonthsOdds Ratio and 95% Confidence Intervals

0.25 1 4GP IIb/IIIa Better Placebo BetterComposite 6-month end point of death or myocardial (re-) infarction event

rates for the GPIIb-IIIa interventional trials.

Possible future indications for GP IIb-IIIa antagonists

-acute coronary syndromes: combination therapy with a) reduced dose thrombolytic agents, b) LMWH.-AIS-Anti-angiogenesis for cancer therapy

新型抗血小板药物的研究1 ） 作用于血栓形成的起始点：血小板粘附 相关的膜（胶原）受体和粘附蛋白（ vWF) 。2 ） 减少出血倾向。

MoAb Ristocetin ADP

(adhesion) （ aggregation ） SZ-2 IgG ++++ — SZ-2 ScFv ++++ — SZ-21 IgG — ++++ SZ-21 ScFv — +++ Bis-ScFv ++ ++

Effects of SZ-2 and SZ-21, and its fragments

++++: very strong ; ++: strong; +: moderate; –: None

Flow Chamber: vWF包被，观定单抗对血小板粘附、聚集、血栓形成的影响。

Platelet Adhesion to vWF , Shear Stress=0.2 N/m2

control group (tyrode’s)

Platelet Adhesion to vWF

Inhibitor group 1 (SZ-2 ScFv 20ug/ml)

Platelet Adhesion to vWF

Inhibitor group 2 (SZ-21 ScFv 20ug/ml)

Platelet Adhesion to vWF

Inhibitor group 3 (SZ-2/SZ-21 bis-ScFv 20ug/ml)

35.231.3

20.8

7.5

0

10

20

30

40

50

control SZ-2 scFv SZ-21scFV

SZ-2/ 21bi s-scFv

血小板粘附率

Adh

esio

n pr

obab

ility

Shear strees = 0.2 n/m2

t = 30 min

Platelet Adhesion to purified vWF

05

10152025303540

0 1 5 10 15 20 25 30 35

control

sz-2

sz-21

sz-2/ 21bi s-scFV

T (min)

Adh

esio

n pr

obab

ility

Platelet Adhesion to purified vWF

Shear strees = 0.2 n/m2

Prevention of Arterial Thrombosis in Baboons

Combining a GPIb blocker with a GP b/ a Ⅱ Ⅲblocker can achieve a strong antithrombotic

effect without increasing the bleeding time.

Wu,Deckmyn, ATVB 2002,22:323

胶原受体 GPVIGP VI 为 I 型单链跨膜糖蛋白，属 Ig 超家族成员。由 339 个氨基酸残基组成，分子量 62KDa。

平均每个血小板表面含 2000个 GP VI 分子。  GP VI 基因定位于 19q13.22—19q13.33 。 人 GP VI cDNA

已被克隆，全长 1017 个碱基。鼠 GP VI cDNA也已克隆，与人 GP VI 同源性为 67.3%；该序列编码 313 个氨基酸残基 .

GP VI 在介导胶原诱导的血小板粘附、信号转导、聚集、促凝活性表达过程中起到重要的作用。 基因敲除试验结果表明 GPVI 与病理性血栓形成密切相关，而似乎在生理性止血过程不起什么作用。 (Blood, 2003) 胶原— GP VI轴的抑制在血栓性疾病的防治中有重要的价值， GP VI 为抗栓治疗新的靶点。

抗血小板药物 药物 作用环节

第一代 阿司匹林 环氧酶抑制剂 临床应用 Ticlopidine ADP 活化抑制剂 临床应用第二代 Reopro GPIIb-IIIa 受体抑制剂 临床应用第三代 JAQ1 GPVI （胶原）受体抑制剂 动物实验 AjvW2, 6B4 “vWF-GPIb”抑制剂 动物实验 82D6A3 “vWF- 胶原” 抑制剂 动物实验