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PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
MESTRADO EM AGRONOMIA
DISCRIMINAÇÃO VARIETAL DE CULTIVARES DE UROCHLOA BRIZANTHA POR MARCADOR MOLECULAR ISSR
INAÊ BRAGA
Presidente Prudente – SP 2013
Presidente Prudente – SP
2013
DISCRIMINAÇÃO VARIETAL DE CULTIVARES DE UROCHLOA BRIZANTHA POR MARCADOR MOLECULAR ISSR
INAÊ BRAGA
Dissertação apresentada a Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação, Universidade do Oeste Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestrado em Agronomia - Área de Concentração: Produção Vegetal Orientador: Prof. Dr. Nelson Barbosa Machado Neto
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO MESTRADO EM AGRONOMIA
611.018 16 B813d
Braga, Inaê.
Discriminação varietal de cultivares em Urochloa brizantha por marcador molecular ISSR /Inaê Braga. – Presidente Prudente, 2013.
52 f.: il.
Disserteção (Mestrado em Agronomia) -Universidade do Oeste Paulista – Unoeste, Presidente Prudente, SP, 2013.
Bibliografia. Orientador: Nelson Barbosa Machado Neto
1. Urochloa brizantha. 2. Discriminação Varietal. 3. Marcador Molecular ISSR. I. Título.
DISCRIMINAÇÃO VARIETAL DE CULTIVARES DE UROCHLOA BRIZANTHA POR MARCADOR MOLECULAR ISSR
INAÊ BRAGA
Dissertação apresentada a Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação, Universidade do Oeste Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestrado em Agronomia - Área de Concentração: Produção Vegetal. Presidente Prudente, 25 de Junho de 2013
BANCA EXAMINADORA
_______________________________________________ Prof. Dr.Luiz Gonzaga Esteves Vieira Universidade do Oeste Paulista – Unoeste Presidente Prudente-SP _______________________________________________ Prof. Dr. Rogério Fernandes de Souza. Universidade Estadual de Londrina Londrina - PR _______________________________________________ Profa. Dra. Alessandra Ferreira Ribas. Universidade do Oeste Paulista – Unoeste Presidente Prudente-SP
DEDICATÓRIA
Este trabalho é dedicado aos meus pais, irmãos, cunhadas, ao meu noivo e amigos,
que sempre me ajudaram com palavras de incentivo e força, para que assim eu
pudesse continuar a minha caminhada.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente, agradeço a Deus, por ter me capacitado, ter me dado
sabedoria e falado ao meu coração nas horas de desânimo e provação. Agradeço
aos meus pais por terem me dado apoio, permitindo que me dedicasse
exclusivamente aos estudos. Ao meu orientador por me acrescentar cada vez mais
conhecimento. A todos os familiares, amigos e ao meu noivo pela paciência. Aos
professores, que com muita dedicação me ensinou a como trilhar meus passos
nessa trajetória. E a todos os funcionários da Universidade que são sempre
prestativos.
“Posso todas as coisas naquele que me fortalece”.
Filipenses 4:13
“Por isso não tema, pois estou com você;
não tenha medo, pois sou o seu Deus.
Eu o fortalecerei e o ajudarei;
eu o segurarei
com a minha mão direita vitoriosa”.
Isaías 41:10
RESUMO
Discriminação Varietal de cultivares em Urochloa brizantha por marcador molecular ISSR
Aproximadamente 80 a 90% das áreas de pastagens no Brasil são constituídas por forrageiras do gênero Urochloa, sendo a espécie apomítica Urochloa brizantha [syn. Brachiaria brizantha (Hochst. ex A. Rich.) Stapf.] a mais utilizada. Alguns genótipos de Urochloa têm sido amplamente distribuídos com a nomenclatura equivocada, tanto para espécies como para cultivares. A identificação dos cultivares de Urochloa é fundamental para os programas de melhoramento e produção de sementes. Considerando a importância da pureza varietal em lotes de sementes comercializadas, o presente trabalho teve o objetivo verificar o potencial dos marcadores ISSR para a discriminação de U. brizantha (Xaraés; Piatã, Basilisk; MG4; MG5; Marandú) com a finalidade de determinar o grau de contaminação de lotes de sementes. Os marcadores ISSR apresentaram um baixo grau de polimorfismo. Todavia, os resultados mostraram ser possível identificar os cultivares em amostras puras de sementes de Urochloa, sendo necessários somente dez primers. O cultivar Basilisk foi confirmado como U. brizantha. Não foi possível diferenciar amostras contaminadas propositalmente nos níveis estipulados no trabalho. Novos estudos com outros primers e outros níveis de contaminação serão importantes para detectar misturas varietais em cultivares de U.brizantha.
Palavras-chave: Braquiaria, Marcadores Moleculares, Pureza Varietal.
ABSTRACT
Varietal discrimination of cultivars Urochloa brizantha by ISSR molecular markers
Approximately 80-90% of grassland areas in Brazil consist of the forage Urochloa, genus and the apomictic species Urochloa brizantha [syn. Brachiaria brizantha (Hochst. ex A. Rich.) Stapf.] the most used. Some genotypes of Urochloa have being widely used with a wrong nomenclature, even for species as for cultivars. In this way, the Urochloa cultivar identification is primordial for breeding programs and seed production. Considering the importance of genetic purity in comercialized seed lots, the present study aimed to investigate the potential of ISSR markers for discrimination of U. brizantha (Xaraés; Piatã, Basilisk; MG4; MG5; Marandú) in order to determine the degree of contamination of seed lots. ISSR markers showed a low degree of polymorphism . However, results showed it is possible to identify cultivars in pure samples of seeds Urochloa, requiring only ten primers. The cultivar Basilisk was confirmed as U. brizantha cultivar. It was not possible to differentiate samples intentionally contaminated at levels stipulated in the work. Further studies with other primers and other contamination levels will be important to detect varietal mixtures in cultivars U. brizanhta.
Keywords: Braquiaria, Molecular Markers, Varietal Purity.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 10
2 REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................. 12
2.1 Espécies do Gênero Urochloa Cultivadas no Brasil ............................................ 12
2.2 Cultivares de U. brizantha ................................................................................... 13
2.3 Discriminação e Pureza Varietal ......................................................................... 16
2.4 Marcadores Moleculares para Análise de Contaminação Varietal ...................... 19
2.5 Marcadores ISSR ................................................................................................ 21
3 MATERIAIS E MÉTODOS...................................................................................... 24
3.1 Extração de DNA ................................................................................................. 24
3.2 Reação de PCR com Primers ISSR .................................................................... 25
3.3 Discriminação Varietal por ISSR ......................................................................... 27
3.4 Análise de Pureza de Sementes por ISSR .......................................................... 27
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO .............................................................................. 28
5.1 Discriminação Varietal ......................................................................................... 28
5.2 Pureza de Lotes de Sementes ............................................................................ 32
6 CONCLUSÕES ...................................................................................................... 34
7 REFÊRENCIAS ..................................................................................................... 35
10
1 INTRODUÇÃO
A pecuária brasileira baseia-se na utilização de pastagens tropicais,
pois o país oferece boas condições edafoclimáticas e grandes áreas disponíveis
para a atividade. Entre as espécies forrageiras, encontra-se o gênero Urochloa, que
ocupa grande área agricultável e sua utilização representa uma contribuição
marcante na produção de carne e leite no Brasil. Aproximadamente 80 a 90% das
áreas de pastagens brasileiras são constituídas por forrageiras do gênero Urochloa.
Somente na região dos Cerrados, as espécies de Urochloa somam 51 milhões de
hectares, totalizando 85% das gramíneas forrageiras cultivadas nesse ecossistema.
Também em outras regiões e Estados, este grupo de forrageiras é muito importante,
sendo que, no Estado de São Paulo, a área ocupada com pastagens representa
39,37% do total. Desta porcentagem, 89% é cultivada com gramíneas do gênero
Urochloa, sendo a espécie apomítica Urochloa brizantha [(C. Hochst. ex A.Rich.) R.
Webster); syn. Brachiaria brizantha (Hochst. ex A. Rich.) Stapf.] a mais utilizada
(CATI / IEA, 2010).
Apesar da baixa diversidade genética, esse gênero apresenta potencial
para o desenvolvimento de cultivares superiores por intermédio do melhoramento.
Alguns genótipos de Urochloa têm sido amplamente distribuídos com a
nomenclatura equivocada, tanto para espécies como para cultivares. Discriminar
acessos baseado em um menor número de características é importante para agilizar
e dar maior confiabilidade aos diversos estudos com espécies do gênero Urochloa.
Além disto, o uso de poucas características discriminantes para diferencia-las, bem
como seus cultivares poderia reduzir a mão-de-obra e o tempo envolvido em tais
estudos.
A identificação dos cultivares de Urochloa também é fundamental para
os programas de melhoramento. Existem poucos exemplos de estudos
discriminantes com o objetivo de diferenciar espécies e cultivares de Urochloa.
Portanto, estudos morfológicos, agronômicos e moleculares detalhados para
estabelecer a identidade desses materiais são essências.
Entre as opções para a discriminação varietal, os marcadores
morfológicos, em alguns casos, podem se mostrar ineficientes, de baixa precisão e
sofrer grande influência do meio ambiente. Por outro lado, os marcadores
moleculares baseados em polimorfismos de DNA tem recebido destaque para essa
11
avaliação. Entre os marcadores baseados em polimorfismo do DNA destaca-se os
marcadores ISSR (Inter Simple Sequence Repeat), que se baseiam na amplificação
de regiões entre sequências microssatélites adjacentes do DNA via PCR
(Polymerase Chain Reaction). Além de não exigir um conhecimento prévio do
genoma, esta técnica pode resultar em elevado grau de polimorfismo, apresentar
alta reprodutibilidade e baixo custo. Ainda, os ISSRs constituem-se em uma
alternativa promissora para análises laboratorias rápidas por se tratar de uma
técnica relativamente simples, com resolução adequada em matriz de agarose, que
necessita de pequena quantidade de DNA, além de não exigir conhecimento
apronfundado de biologia molecular e instalações sofisticadas de laboratório. Desta
maneira, pode ser adotada em programas de controle de qualidade realizados em
laboratórios de pesquisa e em empresas de melhoramento genético e de produção
de sementes com instalações e equipamentos menos sofisticados.
Considerando a importância da pureza varietal em lotes de sementes
comercializadas, o presente trabalho teve o objetivo de:
a) avaliar o uso de marcadores ISSR em seis cultivares da espécie de
U. brizantha (Xaraés; Piatã, Basilisk; MG4; MG5; Marandú) com a
finalidade de discriminar os genótipos.
b) verificar o potencial uso de marcadores ISSR para determinar o grau
de contaminação de lotes de sementes de U. brizantha.
12
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Espécies do Gênero Urochloa Cultivadas no Brasil
O gênero Urochloa (syn. Brachiaria) pertence à família Poaceae e foi
introduzido da África para o Brasil, tendo como o seu principal centro de origem e
diversificação o leste daquele continente, onde ocorre naturalmente nas savanas
(NUNES et al., 1985; VILELA, 2005), em regiões de clima tropical e solos de boa
fertilidade. Segundo Ferraz (2003) esse gênero constitui-se numa importante
forrageira tropical não só na África e no Brasil, mas também em diversas regiões da
Ásia, Austrália e da América do Sul.
As áreas dedicadas à pecuária ocupam 20% do território nacional
contra apenas 10% das áreas agrícolas (IBGE, 2006). As áreas de pastagens, com
aproximadamente 172 milhões de hectares, são responsáveis pela maior parte da
produção de carne e leite no Brasil (IBGE, 2006). Além do seu uso em pastagens,
atualmente espécies de forrageiras têm sido utilizadas para cobertura do solo em
integração lavoura-pecuária (CRUSCIOL et al., 2009). Do total de áreas utilizadas
com forrageiras, ~55% ou 94 milhões de hectares, são cultivadas especialmente
com espécies do gênero Urochloa (FERRAZ, 2003). Estima-se, atualmente, que
50% das áreas de pastagens cultivadas na região Centro-Oeste do País estejam
ocupadas com esta gramínea (MACEDO, 2005). Na região Norte, as estimativas são
de aproximadamente 65% (DIAS-FILHO; ANDRADE, 2005).
Destas áreas, apenas uma pequena parte tem recebido algum tipo de
fertilização, sendo que a formação dessas pastagens quase sempre é feita em solos
de baixa fertilidade (MACIEL et al., 2007). A maioria das forrageiras hoje disponíveis
no mercado brasileiro, sobretudo do gênero Urochloa destaca-se pela adaptação à
baixa ou, pelo menos, média disponibilidade de fósforo. No entanto, essas espécies
apresentam potencial de resposta à adubação a este nutriente, podendo assim
solucionar algumas dificuldades ocorrentes nas diferentes condições edafoclimáticas
(BONFIM–SILVA et al., 2012). Uma característica importante que se deve ressaltar é
que a U. brizantha possui um sistema radicular vigoroso e profundo, apresentando
tolerância à deficiência hídrica e potencial para a absorção de nutrientes em
camadas mais profundas do solo, desenvolvendo-se em condições ambientais em
13
que a maioria das culturas produtoras de grãos e das espécies utilizadas para
cobertura do solo não se desenvolveriam adequadamente (BARDUCCI et al., 2009).
No Brasil, foram introduzidas dezesseis espécies, das quais as mais
importantes são: U. brizantha, U. decumbens, U. humidicola e U. ruziziensis (KARIA;
DUARTE; ARAUJO, 2006), que representam 87% das sementes comercializadas.
Os principais caracteres morfológicos que identificam o gênero
Urochloa são as espiguetas ovaladas a oblongas, inseridas em racemos unilaterais,
com a primeira gluma voltada em direção à ráquis. Sua inflorescência pode atingir
até 40 cm de comprimento, normalmente com 4 a 6 racemos, equidistantes ao longo
da ráquis, medindo de 7 a 10 cm de comprimento, podendo chegar até 20 cm em
plantas muito vigorosas (ASSIS et al., 2003). Em relação à altura, esta pode atingir
de 1,5 a 2,5 metros, apresentando colmos prostrados, mas produzindo perfilhos
cada vez mais eretos ao longo do crescimento da touceira, com perfilhamentos mais
intensos nos nós superiores, promovendo a multiplicação de inflorescências,
principalmente sob o regime de pastejo ou corte (NUNES et al.,1985; MEDEIROS,
2004).
A taxonomia do gênero Urochloa e de suas espécies não é ainda
suficientemente conhecida, tanto em relação à composição de espécies como na
inter-relação com outros gêneros (RENVOIZE; CLAYTON; KABUYE, 1998; ASSIS et
al., 2003). Por exemplo, o cultivar Basilisk foi introduzida no Brasil, em 1952, com o
nome de Brachiaria decumbens, mas pesquisas recentes com marcadores RAPD
têm colocado Basilisk como cultivar de U. brizantha e não de U. decumbens
(AMBIEL et al., 2008, 2010; ALMEIDA et al., 2011). E ainda, U. humidicola é tratada
muitas vezes como sinônimo de U. dictyoneura (MAASS, 1998).
2.2 Cultivares de U. brizantha
Os programas de melhoramento genético do gênero Urochloa têm
gerado conhecimentos e procedimentos que têm proporcionado tanto a liberação de
novos cultivares para diversificar as pastagens brasileiras, como o aumento da
produtividade por animal e por área (SILVA et al., 2012). Entre os quesitos
selecionados nesses programas, destacam-se: o aumento da produtividade, a
14
resistência às pragas e às doenças, a produção de sementes de boa qualidade, o
uso eficiente de fertilizantes e a adaptação aos estresses edáficos e climáticos.
No gênero Urochloa há predominância da apomixia, um modo de
reprodução assexual por sementes na qual a progênie resultante é idêntica à planta-
mãe (MILES; MAASS; VALLE, 1996). Em geral as plantas apomíticas são
poliplóides, enquanto as sexuais, diplóides (VALLE; SAVIDAN, 1996). Em Urochloa,
a maioria dos cultivares comerciais é tetraplóide e apomítica. De acordo com
Guimarães (2008), o melhoramento genético deve visar o entendimento e controle
da apomixia visando permitir fixar genótipos de interesse em híbridos, variedades
adaptadas a ecossistemas muito restritos e genótipos-elite (RODRIGUES et al.,
2003); produzir sementes híbridas sem perder o vigor (SPILLANE; CURTIS;
GROSSNIKLAUS, 2004) e, desta forma, facilitar o acesso do pequeno pecuarista à
sementes de alta qualidade. Atualmente, a Embrapa Gado de Corte é responsável
pelo maior e mais importante Bancos Ativos de Germoplasma de Forrageiras do
gênero Urochloa. (VALLE et al., 2008) utilizado para o melhoramento de plantas
desse gênero.
Um dos cultivares com maior destaque no Brasil é o Basilisk, importado
no início da década de 1960 (PIZARRO et al., 1996). Na mesma época também
foram também introduzidos cultivares de U. ruziziensis de reprodução sexual e de U.
humidicola. O sucesso desses cultivares se deve à ampla adaptação aos solos
pobres, de baixa fertilidade natural, característicos das áreas reservadas ao plantio
de pastagens no Brasil Central (MACEDO, 1995, 2000; PIZARRO et al., 1996).
O cultivar denominado Marandú (Braquiarão) de U.brizantha foi
introduzido por Paul Rankin Raymon, em 1967, na região de Ibirarema no Estado de
São Paulo. No final de 1970, esta forrageira foi fornecida à Empresa Brasileira de
Pesquisas Agropecuárias (EMBRAPA) para avaliações e possíveis distribuição no
país; e em 1984 este cultivar foi disponibilizada para comercialização como
alternativa de planta forrageira adaptada às condições dos solos de cerrado, com
média a boa fertilidade (MILES et al., 1996). Este cultivar foi muito difundido entre os
pecuaristas brasileiros devido à sua boa adaptação e à alta produtividade de matéria
seca por área (ZIMMER; SILVA; MAURO, 2002). Além disso, Vilela (2005) ressalta
sua capacidade de supressão de ervas daninhas e adaptação à condição de baixa
luminosidade. Todavia, uma forte característica que tem contribuído para a
15
dispersão deste cultivar no território brasileiro é a sua tolerância ao ataque da
cigarrinha-das-pastagens, praga que causa grandes danos às pastagens do cultivar
Basilisk (EMBRAPA, 2005). O cultivar Marandú é uma das plantas forrageiras mais
usadas nas áreas de pastagens cultivadas para pecuária no Brasil Central
(EUCLIDES et al., 2009). Estima-se, atualmente, que 50% das áreas de pastagens
cultivadas sejam ocupadas com este genótipo na região Centro-Oeste (MACEDO,
2006). Também é responsável por cerca de 30% das sementes comercializadas no
país (JANK et al., 2005; BASSO et al., 2009). A grande área ocupada por esse único
cultivar ocasiona, após algum tempo de uso com pastejo, patamares mais elevados
de pressão de seleção para pragas e doenças (MACEDO, 2005).
O cultivar Xaraés foi lançado pela Embrapa em 2003, sendo indicado
para regiões de clima tropical de Cerrados e de clima tropical úmido, podendo ser
cultivada nas regiões Centro-Oeste e Sudeste, no oeste baiano e na Mata Atlântica
deste estado (VALLE et al., 2004). É uma planta pentaplóide, o que o diferencia do
nível de ploidia tetraplóide predominantemente encontrada no gênero Urochloa. O
cultivar Xaraés é apomítico facultativo, ou seja, a reprodução sexual e apomítica
coexistem na mesma planta (PENTEADO et al., 2000).
Em 1996, a empresa Matsuda iniciou o trabalho de avaliação e seleção
de alguns acessos do Banco de Germoplasma de “braquiária” do CIAT (Centro
Internacional de Agricultura Tropical), realizando ensaios e seleção destes materiais
em diversos locais do Brasil. O primeiro resultado desta seleção foi o cultivar MG-5
Vitória de U. brizantha (RODRIGUES et al., 2006). É também um cultivar um
poliplóide de reprodução apomítica e possui uma ampla adaptação edafoclimática,
além de apresentar ciclo mais tardio (MATSUDA, 2005).
O cultivar MG-4, lançada também pela Matsuda em 1994, é
considerada um cultivar com bom comportamento em solos ácidos e de baixa
fertilidade, de textura arenosa ou argilosa, tolerando seca prolongada, tendo boa
recuperação após a queimada e excelente capacidade de rebrota, além de se
destacar pela alta produtividade, resistência à seca e capacidade de rebrota após o
pastejo (MATSUDA, 2005).
O cultivar Piatã, desenvolvido pela EMBRAPA Gado de Corte, pode ser
cultivado em praticamente todo o País, em regiões com bom regime de chuvas e
16
sem invernos rigorosos, sendo também é indicado para solos de média fertilidade
(VALLE et al., 2007).
Outro cultivar importante comercialmente é o Basilisk, originário de
Uganda, levada para a Austrália em 1930 e produzido na região chamada Basilisk,
daí o seu nome, também conhecida como “australiana e registrada como cv. Basilisk
(MACKAY, 1982, VALLE et al., 2004, 2010). Este cultivar foi introduzida pelo
Instituto de Pesquisas Internacionais (IRI) em Matão, São Paulo, no início da década
de 1960. Tem como características marcantes a capacidade de cobertura rápida do
solo e a resistência a danos significativos de pragas como formigas cortadeiras,
entre outras. É uma gramínea pouco exigente quanto à fertilidade do solo e
responde muito bem a adubação, possuindo um índice de persistência significativo
na área. O cultivar Basilisk foi apontada como o cultivar comercial de Urochloa mais
adaptada aos solos ácidos e pobres (RAO et al., 2005).
2.3 Discriminação e Pureza Varietal
Existem sete importantes coleções de Urochloa no mundo, todas ex
situ, que possuem um total de 987 acessos de 33 espécies atualmente descritas. No
entanto, problemas relacionados com classificações incorretas ainda são freqüentes
entre as espécies deste gênero, assim como entre os acessos das coleções de
germoplasma (ASSIS et al., 2003). Também, o intercâmbio de germoplasma de
Urochloa tem causado certa confusão sobre a identidade dos acessos. Diversos
autores (LOCH, 1977; MAASS, 1998; RENVOIZE et al., 1998) destacaram a
necessidade da classificação de acessos e discriminação correta de espécies,
inclusive, para que os bancos de germoplasma possam ser utilizados com eficiência
no melhoramento genético desse gênero (KELLER-GREIN; MAASS; HANSON,
1998). Entretanto, entre os cultivares de U. brizantha, não existe um padrão para
discriminação varietal. Por causa disto, muitas vezes, o consumidor acaba
adquirindo produto com alto nível de mistura varietal, pois até mesmo empresas
fornecedoras de sementes de U. brizantha possuem dificuldades técnicas para
identificar o grau de contaminação das sementes comercializadas (ZANINE et al.,
2007).
17
Nas sementes estão contidas as tecnologias obtidas com o
melhoramento de plantas. Por este motivo, esta deve ter alta qualidade fisiológica e
ser geneticamente pura (RABEL et al., 2010). A garantia da pureza genética é
primordial para a produção de sementes. A determinação da pureza genética é
complexa, pois freqüentemente as contaminações, provocam elevadas alterações
fenotípicas. Porém a pureza varietal é uma característica de um lote de sementes, e
a presença de sementes de outros cultivare acarreta a perda de sua pureza varietal
(RAMOS et al., 2006).
A comercialização de sementes de cultivares no Brasil segue a
Instrução Normativa n º 30, de 21 de Maio de 2008 (MAPA, 2008), no qual os
padrões para produção e comercialização de sementes de espécies forrageiras de
U. brizantha devem possuir uma porcentagem mínima de pureza e germinação de
60%. Portanto, as técnicas para a discriminação e pureza varietal são importantes
para o controle de qualidade em muitos pontos na produção e utilização de espécies
e cultivares vegetais. Estudos e estimativas de parâmetros de variabilidade genética
e pureza varietal são fundamentais, pois permitem distinguir genótipos de forma
eficaz, uma vez que facilitam identificações de casos de sinonímias e homonímias
entre cultivares e auxiliam na seleção dos indivíduos que poderão ser utilizados para
compor bancos de germoplasma ou serem utilizados no melhoramento genético (DE
PAULA; BIANCHI; FACHINELO, 2012).
Além do aspecto relacionado ao controle de qualidade de sementes,
outro motivo que tem aumentado significativamente o interesse pela caracterização
de cultivares nas últimas décadas é a crescente necessidade de proteção de
cultivares comerciais, em mercados econômicos cada vez mais competitivos. No
Brasil, a Lei de Proteção de Cultivares n.º 9.456, sancionada em 25 de abril de 1997,
abriu uma nova perspectiva e interesse na proteção e lançamento de materiais
genéticos (MILACH, 1998; BONOW, 2007). Afim de regulamentar esta necessidade,
entrou também em vigor a Portaria nº 38, de 7 de fevereiro de 2006, a qual
regulariza o regimento interno do Laboratório Nacional de Análise, Diferenciação e
Caracterização de Cultivares. Desta forma, os laboratórios poderam ter critérios para
suas análises, atendendo assim a legislação, em especial, aprimorando atividades e
programas relativos a proteção ao cultivar.
Assis et al. (2003) obteveram êxito ao utilizarem marcadores
morfológicos para diferenciar seis espécies de Urochloa (U. brizantha, U. humidicola,
18
U. decumbens, U. jubata, U. ruziziensis e U. dictyoneura) utilizando características
vegetativas, reprodutivas e de pilosidade. Neste caso, os caracteres vegetativos e
reprodutivos foram mais eficientes em relação a pilosidade para a classificação e
discriminação de espécies. Esse estudo revelou diferenças entre os grupos de
Urochloa, permitindo estabelecer funções para classificação e discriminação de
genótipos dentro de uma espécie. Apesar de que a discriminação varietal também
pode ser feita usando estes mesmos descritores morfológicos, muitas vezes esses
se apresentam ineficientes e de baixa precisão para a caracterização de cultivares
dentro de cada espécie. Isto porque, eles sofrem influência das condições
ambientais, são poucos, complexos e demorados para análise.
Outra forma para análise de discriminação e pureza varietal é através
de dados genômicos, que podem permiter que qualquer cultivar de diferentes
espécies seja identificado via comparações de sequências de DNA. Além disso,
discriminação varietal por meio da análise de DNA não é afetada por fatores
ambientais, como por exemplo as condições do local e das épocas de plantio e
crescimento (HENRY et al., 2007). Os métodos de análise de DNA com base em
abordagens genômica oferecem oportunidades para testar o nível de pureza ou
confirmação da identidade dos cultivares (HENRY et al., 2007). Os marcadores
moleculares e a tecnologia baseada em polimorfismo de DNA têm recebido
destaque para avaliação de discriminação e pureza varietal, pois a análise ao nível
do DNA, é precisa, sendo realizada a partir do genoma, além de não sofrer
interferência externa. Essas novas abordagens, envolvem as escolhas de
marcadores específicos (KAISSON; SIRIAMORNPUN; MEESO, 2008).
Os testes de pureza genética com marcadores moleculares podem ser
realizados com a formação de grupos de sementes, como sugerido por Schuster et
al. (2004), que avaliaram a possibilidade do uso de DNA isolado a partir de um “bulk”
de sementes de soja. A análise em “bulks” forneceu resultados com maior rapidez e
com a mesma precisão da análise individual das sementes, além de reduzir tempo e
custos. Nos resultados obtidos por aqueles autores, as amostras compostas por
DNA extraído de 5 a 8 sementes amplificaram satisfatoriamente as regiões
microssatélites, identificando a presença de misturas entre os cultivares. Em
diversas espécies de Urochloa, Ambiel et al. (2008, 2010) também trabalharam com
“bulks” de sementes.
19
Devido ao aprimoramento das técnicas de marcadores moleculares, e
a maior exigência do mercado de sementes, estas ferramentas tornaram-se uma
alternativa viável para análise de rotina de pureza varietal. A associação desta
técnica com outras análises discriminatórias têm como objetivo agilizar a rotina de
trabalho em empresas de produção de sementes.
2.4 Marcadores Moleculares para Análise de Contaminação Varietal
Os marcadores moleculares são fenótipos moleculares originários de
um gene expresso, como as isoenzima ou de um segmento específico de DNA que
pode ou não corresponder à regiões expressas do genoma. Esses marcadores são
utilizados para identificação de genótipos, avaliação de germoplasma, mapeamento
genético (FERREIRA; GRATTAPAGLIA, 1998) e, também, para análise de pureza
genética e varietal em lotes de sementes (MCDONALD; ELLIOT; SEEENEY, 1994;
RONGEWEN et al., 1995; CARVALHO, 2000; MEESANG et al., 2001; VIEIRA;
BITTENCOURT; PANOBIANCO, 2001; RAMOS et al., 2004).
Das principais técnicas moleculares existentes encontram-se as
baseadas em proteínas e isoenzimas. As proteínas podem ser usadas como
marcadores para os genes que as codificam (FERREIRA; GRATTAPAGLIA, 1998).
As diferenças nas mobilidades das proteínas quando submetidas a um campo
elétrico resultam das sequências distintas de nucleotídeos que codificam tais
proteínas, há também modificações na sequências peptídicas, pois mutações
simultâneas não são detectadas por essa técnica. Contudo têm uma base molecular
complexa, que pode incluir substituições, inserções e deleções, e ainda podem ser
resultado de modificações pós-transcricionais e pós-traducionais. Portanto, assume-
se que diferenças nos padrões eletroforéticos das proteínas possuem base genética
e são herdáveis (MURPHY et al., 1990), sendo assim recomendadas para análise de
certificação de pureza genética e contaminação varietal (COOKE, 1995). Porém, as
técnicas baseadas em eletroforese de proteínas e isoenzimas apresentam
inconvenientes, como alteração de comportamento devido à variações no ambiente,
no potencial fisiológico e da sanidade das sementes (CARVALHO, 2000; RAMOS et
al., 2006). Os descritores de DNA apresentam a vantagem de representar todo o
genótipo, mantendo consistência nos resultados e evitando o problema da
20
expressão do fenótipo (WÜNSCH; HORMAZA, 2002). A possibilidade de acessar a
variabilidade genética diretamente em nível de DNA vêm fazendo com que, cada vez
mais, sejam disponibilizadas técnicas precisas que auxiliam os processos de
proteção intelectual de materiais genéticos (PADILHA, 2002, ALMEIDA et al., 2009).
As técnicas que envolvem DNA apresentam alto poder de resolução, com as
diferenças entre os indivíduos detectadas nas seqüências de nucleotídeos
distribuídas pelo genoma (FERREIRA; GRATTAPAGLIA, 1998), o que permite a
distinção entre genótipos com elevada facilidade.
Entre as técnicas disponíveis, as baseadas na reação em cadeia da
polimerase (PCR - Polymerase Chain Reaction) oferecem vantagens em relação a
outros métodos, dentre elas estão a utilização de quantidades reduzidas de DNA e
os perfis eletroforéticos são obtidos com maior rapidez (FERREIRA;
GRATTAPAGLIA, 1998; RAMOS, 2006). Esta técnica, baseada no uso da DNA
polimerase termoestável de Thermus aquaticus (Taq), foi desenvolvida por Mullis e
Faloona (1987), e permite a síntese enzimática de milhões de cópias de um
determinado fragmento de DNA. O desenvolvimento de variantes dessa técnica
possibilitou o surgimento de vários tipos de marcadores moleculares, sendo os mais
comuns: RAPD (WILLIAMS et al.,1990; WELSH et al., 1990), AFLP (VOS et
al.,1995), microssatélites ou sequências simples repetidas (SSR) (MORGANTE;
OLIVIERI, 1993 ) e o ISSR (Inter Simple Sequence Repeat). Este último tem sido
amplamente utilizado em estudos para identificação varietal e também na área de
produção de tecnologia de sementes, por ser uma técnica simples, eficiente por
gerar altos índices de polimorfismo (REDDY; SARLA; SIDDIQ, 2002).
Quando uma cultivar apresenta diferenças em um descritor da
semente, nem sempre essas diferenças são genéticas, ou seja, se tratam de mistura
varietal (RABEL et al., 2010). Muitas vezes as sementes estão fora do padrão da
cultivar, devido às influências do ambiente. Nessas circunstâncias, lotes de
sementes de elevado padrão correm o risco de serem descartadas, causando
prejuízos para os produtores de sementes. Para esclarecer questões como essa, os
marcadores moleculares vêm se destacando como importante tecnologia no controle
de qualidade em diversas empresas (SCHUSTER; VIEIRA; PADILHA, 2006).
Embora no Brasil o registro de cultivares não exija caracterização
molecular, em outros países com sistemas de certificação de material vegetal
consolidados, as técnicas moleculares têm permitido elaborar um tipo de impressão
21
digital molecular da planta ("fingerprinting" varietal), o que facilita o controle de
qualidade em qualquer etapa do processo produtivo (BIANCHI et al., 2004;
WICKERT et al., 2007; DE PAULA; BIANCHI; FACHINELLO, 2012).
2.5 Marcadores ISSR
Os marcadores moleculares dominantes ISSR foram desenvolvidos por
Gupta et al. (1994) e Zietkiewicz, Rafalski e Labuda (1994), e são baseados na
técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR). Os produtos amplificados da
reação de PCR produzidos na reação de ISSR correspondem a sequências de
diferentes tamanhos que se localizam entre regiões repetidas de microssatélites
idênticas e orientadas em direções opostas, ou seja, o oligonucleotídeo iniciador
amplifica o fragmento de DNA delimitado por dois microssatélites invertidos, o que
gera um alto nível de polimorfismo. Na reação, utiliza-se um único iniciador que
contém de 16 a 25 pares de bases e é composto de dinucleotídeos ou
trinucleotéideos que se ancoram na extremidade 5’ ou 3’ da fita de DNA, como
mostra a Figura 1 (WOLFE; LISTON, 1998).
Figura 1- Princípio do funcionamento do marcador molecular ISSR Fonte: do autor.
PRINCÍPIOS DO ISSR NNNN(GA)n
(GA)nNN
DNA GENOMICO NNNNNNNNNNNGAGAGAGAGANNNNNNNNNNNCTCTCTCTCTCTNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCTCTCTCTCTCTNNNNNNNNNNNGAGAGAGAGANNNNNNNNN
Repetição de GA
(GA)nNNN
NN(GA)n
Região entre a repetição
DNA GENÔMICO
Produto do PCR primers ancorado em 3’
Produto do PCR primer ancorado em 5’
Amplificação da simples sequência entre a repetição usando segmentos 5’e 3’ ancorados a primers com a repetição GA. As setas indicam os primers e as linhas duplas indicam os produtos das amplificações.
22
O ISSR é uma técnica simples e pode ser utilizada para estudos
genéticos em quaisquer grupos de organismos. Além de apresentar altos níveis de
polimorfismo, esta é mais robusta devido ao fato dos primers possuirem maior
superfície de ancoragem e também maiores temperaturas de reassociação,
produzindo assim um aumento na reprodutibilidade dos produtos de PCR
(TSUMURA; OHBA; STRAUSS, 1996; WOLFE; XIANG; KEPHART, 1998; WOLFE et
al., 2001; CANO et al., 2005; NARAYANAN et al., 2006; HAO et al., 2002; HAO et
al., 2006; BASHA; SUJATHA, 2007; NIU; CUI; WANG, 2008; SANTANA et al., 2009;
IKEGAMI et al., 2009; LIN et al., 2010; QUELOZ et al., 2011; HAQ et al., 2011). As
vantagens da utilização da técnica de ISSR estão na pequena demanda de
quantidade de DNA por reação, na rapidez, na obtenção das informações genéticas
relevantes para os estudos de diversidade genética em populações e também
porque requerem pouca infra-estrutura de equipamentos de laboratórios para a
execução dos experimentos comparados com outros marcadores (WOLFE; XIANG;
KEPHART,1998).
Hao et al. (2002) utilizaram os marcadores ISSR para estudar as
relações taxonômicas entre as espécies de Allium sacculiferum (Alliaceae)
encontrando alto grau de polimorfismo entre os táxons estudados (HAO et al., 2002).
Em orquídeas, ISSR foi utilizado para caracterizar a diversidade genética entre e
dentro das populações de Cattleya coccinea e C. mantiqueirae, mostrando um baixo
índice de diversidade genética entre os indivíduos e maior diversidade entre as
populações (RODRIGUES, 2010). A exemplo dos microssatélites, os marcadores
ISSR têm tido atualmente grande aplicabilidade em trabalhos de melhoramento de
plantas. Culturas de maior importância econômica têm sido avaliadas com esses
marcadores em relação à variabilidade genética de acessos e espécies silvestres,
visando obter dados que auxiliem programas de melhoramento para estas espécies
(ALMEIDA, 2006). Bornet e Branchard (2004), ao utilizar nove ISSRs, observaram
diferentes níveis de polimorfismo entre Brassica e Arabidopsis, e maior abundância
de sequências de microssatélites no genoma de Brassica. Silva et al. (2011) utilizou
marcadores ISSR para identificar a variabilidade inter e intraespecífica de acessos
de Mandioca (M. esculenta, M. caerulescen, M. dichotoma e M. flabellifoli). Contudo,
a utilização de marcadores ISSR em estudos visando identificar eventos de
hibridização e diversidade genética em populações naturais vem crescendo
gradativamente, como mostram os trabalhos de Souza et al. (2005), Woods et al.
23
(2005) e Souza et al. (2008). Também houve um aumento considerável de estudos
que utilizam os marcadores ISSR como ferramenta para a delimitação de espécies
de plantas (DOGAN; DURAN; HAKKI, 2007; WOOD; NAKAZATO, 2009; ANAND;
SRIVASTAVA; CHAUDHARY, 2010; RODRIGUES, 2010). Sendo assim, os
marcadores ISSR demonstram um grande potencial em estudos, tanto para análise
filogenética quanto de genética de populações naturais de plantas, e também a sua
grande utilidade em análises de espécies cultivadas (WOLFE; LISTON; 1998).
Os marcadores moleculares ISSR (Inter Simple Sequence Repeat), é
portanto, de elevado interesse pois possuem características específicas, como por
exemplo, são de herança dominante, são fragmentos de DNA de 100 a 3000 pb
amplificados via PCR usando um único primer (16-20 pb), construído a partir de um
microssatélite. Suas principais pesquisas e estudos são para Fingerprinting,
diversidade genética, análise filogenética e em análises de pureza varietal e
genética. Assim, o presente trabalho teve como objetivo verificar o potencial do uso
de marcadores ISSR para discriminar seis cultivares de U. brizantha disponíveis no
mercado de sementes e verificar se este tipo de marcador molecular teria potencial
para determinar o grau de contaminação varietal em lotes de sementes de U.
brizantha.
24
3 MATERIAIS E MÉTODOS
Sementes genéticas de Urochloa brizantha dos cultivares Piatã,
Basilisk, Xaraés, MG4, MG5 e Marandú foram fornecidas pela EMBRAPA – Campo
Grande (MS) e Sementes Matsuda (Tabela 1).
Tabela 1- Lista dos cultivares de U. brizantha utilizados neste estudo ESPÉCIE CULTIVAR
N° DO REGISTRO
DATA DO REGISTRO MANTENEDOR
OBTENTOR VEGETAL
U. brizantha XARAÉS 4509 11/09/2001 EMBRAPA/GERMISUL/MATSUDA DOMÍNIO PÚBLICO
U. brizantha PIATÃ 15978 23/06/2003 EMBRAPA EMBRAPA
U. brizantha* BASILISK 2277 10/05/1999 MATSUDA DOMÍNIO PÚBLICO
U.brizantha MG4 2256 10/05/1999 MATSUDA DOMÍNIO PÚBLICO
U. brizantha MG5 4509 02/06/2000 EMBRAPA/GERMISUL/MATSUDA DOMÍNIO PÚBLICO
U.brizantha MARANDÚ 2250 10/05/1999 EMBRAPA DOMÍNIO PÚBLICO
* Classificado erroneamente como U. decumbens cv. Basilisk Fonte: MAPA, 2003.
3.1 Extração de DNA
Foram realizadas cinco extrações de DNA de bulks de 15 sementes
para cada cultivar após a retirada das glumas e glumelas. Foi utilizado o método
CTAB com 1.5 mL de tampão de extração (2,0 g de CTAB, 10,0 mL 1M Tris pH 8,0,
0.5 M EDTA pH 8,0, 28 mL 5,0 M NaCl, 40 mL H2O e 1,0 g de polivinilpirrolidona 40 -
PVP 40). As amostras foram levadas para uma centrífuga refrigerada e processadas
a 12.000 rpm por 5 min. Após, foi acrescentado 250 µL de clorofórmio isoamílico
(24:1), centrifugando-se por 2 min (13.000 rpm) a 4ºC. A fase aquosa foi transferida
para um novo tubo e a cada tubo foi adicionado 50 µL de acetato de amônia 7,5 M e
500 µL de etanol a -20ºC. As amostras foram deixadas por 1 h a -20 ºC e
centrifugadas por 13000 rpm por 5 min a 4ºC para formação do pellet, que foi lavado
três vezes com etanol 70%. Após a secagem do pellet, foi adicionado 10µL da
solução RNase (20µg/mL) e 90 µL de água ultra pura para a hidratação do pellet,
deixando-se cerca de 30 min, sendo em seguida colocado em banho-maria por 20
25
min a 65 ºC. A quantificação do DNA foi realizada via espectrofotômetro a 260/280
(Eppendorf BioPhotometer plus) e a sua integridade foi analisada via eletroforese
em gel de agarose 0,8%.
3.2 Reação de PCR com Primers ISSR
Foram testados um total de vinte e oito primers ISSR (Tabela 4). As
reações de cadeia em polimerase (PCR) foram realizadas em volume total de 25 µL
contendo: 25 ng de DNA, (10X) tampão Taq (Invitrogen), 50 mM de MgCl, 1,25 mM
de dNTPs, 0,5 µM de cada primer (Fermentas) e 2,5 U de Taq polimerase. As
amplificações foram realizadas em um ciclador térmico (PCT – 100 Programmable
Thermal Controller, MJ Research) programado para um ciclo a 94 ºC por 1,5 min
para desnaturação inicial, seguindo de 40 ciclos a 94 ºC por 40 s, 45ºC por 45 s, e
72ºC por 1,5 min, além de um ciclo final a 94ºC por 45 s, 44ºC por 45 s e 72ºC por 5
min para o alongamento ou extensão final.
A separação dos fragmentos amplificados foi realizada em gel de
agarose a 1,5%, com tampão SB 0,5 X (5 mmol L-1 de hidróxido de sódio, ajustado
para pH 8 com ácido bórico). Os géis foram corados com brometo de etídeo e
visualizados usando o sistema Eletroforese Analysis Sistem (Biosystems)
A análise das bandas foi realizada com o programa Quantum - Capt.
26
Tabela 2- Sequência de 28 primers ISSR utilizados neste estudo PRIMERS SEQUÊNCIAS (5’ – 3’)
P1 CTCTCTCTCTCTCTCTRG
P2 ATATATATATATATATATT
P3 AGAGAGAGAGAGAGAGG
P4 GAGAGAGAGAGAGAGAT
P6 CTCTCTCTCTCTCTCTA
P7 ACACACACACACCACACT
P8 TGTGTGTGTGTGTGTGG
P9 AGAGAGAGAGAGAGAGYT
P10 GAGAGAGAGAGAGAGAGAYC
P11 GAGAGAGAGAGAGAGAYG
P12 CTCTCTCTCTCTCTCTRA
P13 CTCTCTCTCTCTCTCTRC
P15 CACACACACACARY
P16A CACACACACACARG
P18 GTGTGTGTGTGTYR
P19 GTGTGTGTGTGTAY
P20 CAAGAGAGAGAGA
P21 GTGTGTGTGTGTYG
P22 GAGGAGGAGGAGRC
P23 AGAGAGAGAGAGYC
P24 GAGAGAGAGAGARG
P25 CACACACACACACAYG
P26 CTCCTCCTCCTCRC
P27 GTGTGTGTGTGTRG
P28 GTGGTGGTGGTGRC
P29 CACACACACACACAYC
P30 CACCACCACCACCCRC
P31 GGGCGAGAGAGAGAGA
R= (G ou A); Y= (C ou T) Fonte: do autor.
27
3.3 Discriminação Varietal por ISSR
Os produtos de PCR com primers ISSR das amostras de DNA de cada
um dos seis cultivares analisados foram separados em gel de agarose a 1,5%. A
marcação das bandas e o padrão dos produtos amplificados foram tabulados como
presença (1) e ausência (0) para cada fragmento polimórfico. As análises foram
realizadas pelo programa Quantum-Capt sendo gerada uma matriz de similaridade
genética utilizando o coeficiente de Jaccard e construído um dendrograma pelo
método de agrupamento UPGMA (unweighted pair-group method using arithmetic
averages), utilizando o software NTSYS v. 2.02.
3.4 Análise de Pureza de Sementes por ISSR
Foi realizada uma simulação de contaminação de DNA em diferentes
níveis em lotes de sementes de U. brizantha foi realizada uma simulação de
contaminação de DNA em extrações de DNA de sementes do cultivar Marandú.
Amostras de DNA de Marandú foram contaminadas com DNA dos demais cultivares
Xaraés, Piatã, Basilisk, MG4 e MG5 nas seguintes concentrações: 1%, 2,5% e 5%,
estas três porcentagens de contaminação para cada cultivar. Este experimento foi
realizado em triplicata, com extrações de DNA de três amostras de cada cultivar
estudado, com a finalidade de observar o poder da técnica de identificação em
diferentes níveis de contaminação.
Após a contaminação do DNA das amostras de Marandú foi realizada a
reação de PCR com os primers que apresentaram polimorfismo, sendo escolhidos
os que discriminavam o cultivar Marandú dos demais cultivares (P4, P7, P9, P10,
P15, P23 e P24).
Os produtos de PCR das amostras de DNA intencionalmente
contaminadas foram separados em gel de agarose a 1,5 % para verificar a possível
presença da banda pertencente ao cultivar contaminante. As análises foram
realizadas utilizando o programa Quantum – Cap, conforme o item 3.2.
28
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Discriminação Varietal
Neste trabalho, foram utilizados 28 primers ISSR, em seis cultivares de
U. brizantha (Xaraés, Basilisk, Piatã, MG4, MG5 e Marandú), com o intuito de
determinar seus perfis moleculares, diferenciando assim cada um deles. Dos
primers utilizados, 10 apresentaram-se polimórficos. Usando esses primers, foi
gerado um total de 65 bandas com tamanhos que variam de 120 a 2274 pb, das
quais somam 28 número de bandas polimórficas (Tabela 3).
A partir dos primers de ISSR amplificados, foi gerado um dendrograma
pelo agrupamento UPGMA, com base no cálculo do coeficiente de similaridade de
Jaccard, o qual foi possível identificar a similaridade dos cultivares de U. brizantha
(Figura 2). Apesar do alto coeficiente de similaridade, alguns cultivares de U.
brizantha apresentarão diferenças genéticas Os cultivares Xaraés e MG5 tem a
mesma origem (CIAT 26110) e possuem o mesmo registro (04509), no número de
Registro Nacional de Cultivares -RNC, tendo como Mantenedor Embrapa e Matsuda
e apresentam reprodução apomítica. No entanto, nossos dados mostram que esses
cultivares possuem divergência genética, o que foi também constatado por Ambiel et
al. (2008) utilizando marcador RAPD.
Tabela 3- Descrição dos primers, sequência, tamanho dos fragmentos, número total de bandas e número total de bandas polimórficas dos primers utilizandos em análises de ISSR – PCR em cultivares de U. brizantha
PRIMERS SEQUÊNCIA
Y=(C ou T); R=(G ou A)
TAMANHO DOS FRAGMENTOS
NÚMERO TOTAL DE BANDAS
NÚM. TOTAL DE BANDAS
POLIMÓRFICAS
P4 (GA) 8 T 813-1889 4 4 P7 (AC) 9 T 380 -1256 7 7 P9 (AG) 8 YT 430 - 2274 7 7 P10 (GA)8 YC 163 -1663 8 7 P15 (CA) 6 RY 423 - 2129 5 4 P16A (CA) 6 RG 113-433 3 2 P20 CAA(GA) 5 140-1664 14 7 P23 (AG) 7 YC 120-240 4 2 P24 (GA) 6 RG 140-555 4 1 P26 (CTC) 4 RC 309-1538 9 7 TOTAL 65 28 Fonte: do autor.
29
Podemos observar pela Figura 2 que os cultivares Basilisk,
erroneamente classificado como um genótipo de U. decumbens, e MG4 de U.
brizantha mostraram-se geneticamente iguais baseados nos polimorfirmos obtidos
com os dez primers ISSR selecionados. Estes resultados confirmam o observado
por outros autores usando diferentes tipos de marcadores moleculares. Ambiel et al.
(2008) mostrou, por meio de marcadores RAPD, que o genótipo denominado
Basilisk ficou agrupado com os acessos de U. brizantha. Isto foi novamente relatado
por Almeida et al. (2011) também utilizando marcadores RAPD. Reinvoize et al.
(1996) já tinham sugerido que o cultivar ‘Basilisk’, amplamente utilizado e
comumente identificado como U. decumbens é na verdade um cultivar de U.
brizantha. Portanto, este erro de identificação taxonômico foi constatado também
neste trabalho usando marcadores ISSR. Os demais cultivares de U. brizantha
apresentaram-se molecularmente divergentes.
É importante mencionar que foi possível identificar e diferenciar todos
os cultivares da espécie de Urochloa estudados neste trabalho com a utilização dos
10 primers ISSR selecionados.
Figura 2- Dendrograma de seis cultivares de U. brizantha construído a partir do produtos dos de amplificação de 10 primers ISSR polimórficos Fonte: NTSYS v. 2.02, [s.d.]
Azevedo et al. (2011) pesquisaram a variabilidade genética dentro do
genótipo de U. ruziziensis por meio de marcadores ISSR. Estes marcadores
mostram-se eficientes para tal avaliação pelo alto polimorfismo apresentado,
sugerindo que populações desta espécie de Urochloa possuem ampla base
30
genética. No caso de U. brizantha, apesar da grande importância comercial desta
espécie como planta forrageira, e estudos realizados para análise de divergência
genética, ainda há a grande confusão na identificação dos acessos existentes nas
coleções de germoplasma no Brasil. Também, ao contrário de U. ruziziensis, a
maioria dos cultivares comerciais de U. brizantha possuem uma reprodução
apomítica o que justifica a menor divergência entre as poucas introduções
existentes. Dos 10 primers utilizados para a distinção dos cultivares, não foi
encontrado um único primers que fosse suficiente per se para identificar todos os
cultivares. Os primers P4, P10 e P24 mostraram-se polimórficos entre Marandú e
MG4, o primer P7 diferencia Marandú de Xaraés, o primer P9 discrimina Marandú de
MG5 (Figura 3), o primer P15 apontou diferenças entre Marandú e Piatã, enquanto
que o primer P23 foi polimórfico para Marandú e Basilisk (Figura 3). Assim, mesmo
com a baixa divergência entre os cultivares comerciais de U. brizantha, nosso
trabalho mostrou que o uso de primers ISSR permite a diferenciação entre estes
genótipos.
Silva et al. (2011) utilizaram marcadores moleculares ISSR para o
gênero Manihot, o que permitiu observar alta reprodutibilidade de tais marcadores,
revelando grande divergência intra e interespecífica nos acessos estudados.
Estudos com orquídeas, também mostraram que tanto para análise filogenética
como para diversidade genética, os marcadores ISSR podem responder otimamente
a questões evolutivas em complexos de espécie de forma consistente e com valores
de confiabilidade alta (RODRIGUES, 2010). Especificamente em Urochloa, Vigna et
al. (2011) desenvolveram 15 marcadores microssatélites para estudar a variabilidade
genética dentro de U. brizantha em uma coleção de germoplasma e observaram que
esta coleção não exibe uma variabilidade considerável. Deste modo, nosso trabalho
mostra que o uso de marcadores ISSR pode complementar as informações obtidas
com outros tipos de marcadores, pois cada marcador molecular possue
características diferentes e pode amplificar diferentes regiões no genoma.
31
Figura 3- Polimorfismo de ISSR dos genótipo de Xaraés ;Piatã; Basilisk; MG4; MG5 e Marandú utilizando P 9 e P 23 Fonte: Quantum-Cap, [s.d.].
Por meio do uso de perfis de DNA, empregando vários marcadores
moleculares, tais como RFLP, RAPD e microssatélites, a identidade genética de
acessos ou cultivares podem ser determinadas (BROWN; KRESOVICH,1996).
Marcadores ISSR têm sido amplamente empregados para detectar polimorfismos
intraespecíficos em plantas, como citros, amendoim e arroz (PHARMAWATI; YAN;
MACFARLANE, 2004). Blair, Rabina e Hofton (1999) obtiveram, em arroz, maior
porcentagem de fragmentos polimórficos com marcadores ISSR quando
comparados a marcadores AFLP. Apesar de serem marcadores dominantes, os
ISSR podem ser utilizados para analisar loci múltiplos em uma única reação
(GOULÃO; OLIVEIRA, 2001) e para produzir fragmentos com grande
reprodutibilidade em comparação a outros marcadores não-específicos com base
em PCR, como o RAPD (WOLFE ; LISTON, 1998).
Técnicas moleculares como as baseadas em microssatélites e ISSR
exigem quantidade mínimas de DNA para a amplificação via PCR (FERREIRA;
GRATTAPAGLIA, 1998), sendo que podem utilizar sementes como material
fornecedor de DNA, mesmo que a quantidade extraída seja reduzida, desde que a
qualidade seja satisfatória.
P9 P23
XAR PIA BAS MG4 MG5 MAR MCD 100pb
XAR
PIA BAS
MG4
MG5
MAR MCD 100pb
32
Mcdonald, Elliot e Seeeney (1994) demonstrou que a qualidade e a
quantidade do DNA extraído de sementes secas de milho, algodão, soja, trigo e
trevo vermelho foram satisfatórias para a análises moleculares. Apesar de ser mais
fácil extrair maior quantidade a partir de tecidos de plantas, em laboratórios de
análises de sementes, este protocolo se torna inviável, pois o período necessário
para o desenvolvimento dessas estruturas é indesejável e pode comprometer o uso
de técnicas moleculares em análises de rotina.
Porém, tanto a semente como o tecido foliar podem ser adequados
para o isolamento de DNA; no entanto, para análise de rotina em Laboratório de
sementes, e Empresas, a semente, se torna mais interessante, com custo inferior,
devido a economia de tempo na obtenção dos resultados, sendo, portanto, o mais
recomendado.
5.2 Pureza de Lotes de Sementes
O segundo objetivo do trabalho foi verificar o potencial do uso de
marcadores ISSR para determinar o grau de contaminação de lotes de U. brizantha.
Para esta análise foram feitas as simulações de contaminação de 1%, 2,5% e 5% de
DNA de cada genótipo de U. brizantha no cultivar Marandú. Os marcadores ISSR
utilizados neste trabalho para a identificação dos níveis de contaminação cruzada de
DNA entre os cultivares não foram eficientes para a determinação a contaminação
nos níveis estipulados.
Segundo a Instrução Normativa nº 30, de 9 de junho de 2011, para a
análise de pureza em amostras de trabalho de U. brizantha (Hochst. ex A. Rich)
Stapf, o nível máximo permitido de outras sementes de gramíneas forrageiras
(Poaceae/Gramineae) a cada 18 gramas é de 180 sementes, ou seja, o nível
máximo de contaminação é 0,38 a 0,45% (considerando o número médio de
sementes em um grama de sementes de U. brizantha como 105 sementes,
aproximadamente) (Tabela 4).
Neste trabalho, mesmo com níveis de contaminação superiores às
permitidas, 1%, 2,5% e 5%, os primers ISSR não foram capazes de diferenciar e
identificar os níveis de contaminação de DNA. Assim, esta técnica de PCR não
demonstrou eficiência para amplificar a banda dos cultivares contaminantes a partir
33
dos três níveis de contaminação testados. Assim, esta técnica de PCR não
demonstrou eficiência para amplificar a banda dos cultivares contaminantes a partir
dos três níveis de contaminação testados.
Tabela 4- Determinação de peso mínimo da amostra em gramas para teste de análise de pureza
Espécie Peso Mínimo da Amostra de Trabalho em
gramas
Nome Científico Nome Comum Análise de Pureza Determinação de
Outras Sementes por
número (1) e (2)
Brachiaria brizantha
(Hochst. ex A. Rich)
Stapf
Brizanta, Braquiarão 18 180
Fonte: Associação Paulista dos Produtores de Sementes e Mudas, 2011.
Diversos autores têm estudado níveis de pureza varietal em diversas
espécies comerciais. Jorgensen, Hauser e Jorgensen (2007) analisaram a pureza
em lotes de sementes com marcadores ISSR, sendo que seus resultados indicaram
que a possibilidade de separar as variedades com estes marcadores estimar a
pureza varietal de Brassica napus na maioria dos casos. Estes autores observaram
que dos lotes analisados de sementes certificadas, três continham outras variedades
acima o limite permitido (0,03% para alimentos).
Convém ressaltar que para a produção e comercialização de sementes
o nível permitido para contaminação varietal é de 40% para sementes certificadas
S1 e S2 (sementes de 1 e 2 geração, respectivamente), segundo a Instrução
Normativa n° 30, de 21 de Maio de 2008. Portanto, sugere-se que novos estudos de
contaminação em U.brizantha seja realizado a níveis próximos a 40%, valor
permitido para comercialização e produção, referentes a Instrução Normativa de
2008, para verificar se os marcadores ISSR podem ser capazes de detectar misturas
varietais em níveis mais elevados, apesar de que tal grau de contaminação varietal
só torna-se aceitável frente às dificuldades técnicas atuais para a produção de
sementes de Urochloa.
34
6 CONCLUSÕES
Marcadores moleculares ISSR mostraram-se úteis para a identificação
varietal de cultivares de U. brizantha, podendo determinar diferenças genéticas entre
os cultivares comercialmente utilizados.
Foi possível reconfirmar a identificação do cultivar Basilisk como um
cultivar de U. brizantha, ao contrário do que é comumente disposto na literatura
científica e em folhetos comerciais que denominam este genótipo de U. brizantha
como um cultivar de U. decumbens.
Os marcadores moleculares microssatélites ISSR não se mostraram
eficientes para determinar contaminação em níveis de 1%, 2,5% e 5% de DNA entre
genótipos de U. brizantha.
35
7 REFÊRENCIAS
ALMEIDA, C.M.A. Diversidade genética em populações de Aechmea fulgens Brongn.(Bromeliaceae) em fragmentos de Mata Atlântica em Pernambuco. 2006. Tese (Doutorado). Universidade Federal Rural de Pernambuco, Pernambuco.
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