LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍAPRÁCTICA NÚMERO 4

Facultad de Ciencias MédicasCátedra de MicrobiologíaTercer Semestre

REALIZADO POR: JESSICA G. JIMÉNEZ B.REVISADO POR: DR. ROBERTO AGUIRRE

COLORACIÓN DE ZIEHL- NEELSEN

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Cátedra de Microbiología – Universidad Central del Ecuador

UNIDAD DE COMPETENCIA:Identificar prácticamente los microorganismos patógenos con los alteraciones orgánicas por ellos producidas: con responsabilidad y orden

ELEMENTO DE COMPETENCIA:4.- Comprende los pasos necesarios para realizar la tinción de Zhiel Neelsen además de reconocer los microorganismos Zhiel Neelsen positivos con orden e iniciativa.

NÚCLEOS DE CONOCIMIENTO:4.- Técnica de tinción – Coloración de Zhiel Neelsen. Realización de tinción de Ziehl-Neelsen a partir de expectoraciones de los propios alumnos. Visualización de tinciones de Ziehl-Neelsen positivas.

ACTIVIDADES TRABAJO AUTÓNOMO: Guía de prácticas descriptiva. Realización de de una coloración Ziehl Neelsen y visualización en el microscopio.

CRITERIOS DE EVALUACIÓN: Comprender la aplicabilidad clínica de la tinción Gram y la morfología bacteriana

en cuestión de distinción entre Gram positivas y Gram negativas.

Coloración de Ziehl Neelsen.

“La razón habla, la ignorancia y el error gritan” anónimo.

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OBJETIVOS: Realizar la tinción de Ziehl-Neelsen a partir de expectoraciones de los propios

alumnos. Visualizar las tinciones de Ziehl-Neelsen positivas.

FUNDAMENTOS DE LA PRÁCTICA:

La tinción de Ziehl-Neelsen es una técnica de tinción diferencial que se basa en que las paredes celulares de ciertas bacterias contienen ácidos grasos (ácidos micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloración con alcohol-acido, después de la tinción con colorantes básicos. Las micobacterias absorben los colorantes solo muy lentamente debido a la elevada proporción de ceras y lípidos en la pared celular. Para acelerar la absorción del colorante fuscina y así la formación del complejo micolatofusina en la pared celular, se calienta la solución de fuscina fenicada aplicada sobre el preparado normalmente hasta la formación de vapores. Una vez que las micobacterias han absorbido el colorante, difícilmente lo ceden a pesar del tratamiento con solución decolorante alcohol-ácido clorhídrico. Por esto se denominan bacilos alcohol acido resistente o BARR y aparecen en el preparado microscópico teñidas de rojo, mientras que todos los microorganismos no resistentes a los ácidos se tiñen de acuerdo con la contratinción.1

Esta tinción tiene interés desde el punto de vista del diagnóstico clínico puesto que algunos microorganismos patógenos ácido-alcohol resistentes, tales como Mycobacterimum tuberculosis son patógenos muy importantes para los humanos.2

MICOBACTERIAS.

Las micobacterias son bacilos aerobios no formadores de esporas, existen más de 50 especies de Mycobacterium, las cuales incluyen muchas que son saprófitas. Entre las especies consideradas patógenas tenemos al M. tuberculosis cuyo único reservorio es el humano, es el agente causal de la tuberculosis pulmonar y diseminada. El M. leprae en el causante de la lepra y al igual que en el M. tuberculosis su reservorio es el humano.Mycobacterium bovis también esta considerado dentro de este grupo, origina una enfermedad similar a tuberculosis.3

Otras especies potencialmente patógenas en humanos tales como: el M. avium-intracellulare y las atípicas con frecuencia infectan a pacientes con SIDA, son patógenos oportunistas en otras personas inmunodeficientes, y en ocasiones producen enfermedad en pacientes con sistema inmunitario normal.3

Las micobacterias no constituyen el único grupo que tienen propiedades alcohol-acido resistentes. Las especies de Nocardia y Rhodococcus poseen una alcohol-acido resistencia parcial así como Legionella micdadei causante de neumonía. Los quistes de los géneros Cryptosporidium e Isospora tienen resistencia definida a las tinciones con acido alcohol.5

Pared Celular de las bacterias Acido- Alcohol Resistentes (BAAR).

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Químicamente, la pared celular de los BAAR consiste en un esqueleto formado por dos tipos de polímeros, unidos covalentemente entre sí:

Un peptidoglucano especial (la diferencia más importante es que en vez de N-acetil murámico existe N-glucolil-murámico);

Un arabinogalactano de gran peso molecular.7

Ambos polímeros se encuentran enlazados a través de fosfodiéster entre una unidad de murámico y una de las arabinosas. Pero a su vez, este esqueleto se une covalentemente a los ácidos micólicos.7

Los ácidos micólicos son ß-hidroxiácidos grasos ramificados en a, cuya longitud de cadena es grande (desde C78 a C91 en Mycobacterium). Están unidos al esqueleto de la P.C. de forma uniforme, a través de enlaces con los -OH en 5 de las unidades de arabinosa.7

Por lo tanto, el esqueleto de la P.C. de estas bacterias consiste en:

peptidoglucano---arabinogalactano---ácidos micólicos.

Pero aparte de este esqueleto complejo, la P.C. de las bacterias ácido-alcohol resistentes exhibe una variedad de lípidos:1) Glucolípidos:a) Micolatos de trehalosa: Constituyen el llamado factor de crecimiento en cuerdas, debido a que son responsables de la agregación de los individuos bacterianos en forma de “cuerdas”.b) Sulfolípidos de trehalosa: están localizados en la periferia de la P.C., y parecen ser importantes factores de virulencia. En Mycobacterium tuberculosis estos sulfolípidos de trehalosa funcionan como evasinas, es decir, facilitan el que la bacteria escape a la acción de los macrófagos inhibiendo la fusión del fagosoma con el lisosoma, lo cual puede explicar el hecho de que estos microorganismos tengan éxito como parásitos intracelulares.c) Micósidos: Localizados en la periferia, consisten en la unión por enlace éster entre ácidos micólicos y azúcares (incluyendo ácidos urónicos, desoxiosas, aminozúcares, etc.).2) Ceras: Unión de ácidos micólicos con tioceroles (alcoholes ramificados de alto peso molecular).7

El alto contenido en lípidos confiere una serie de propiedades a estas bacterias (aparte de la ácido-alcohol resistencia ya citada): aspecto y consistencia cérea de sus colonias; crecen formando grumos en medios líquidos; gran impermeabilidad de la P.C., que a su vez condiciona una gran resistencia a la desecación y gran resistencia a sustancias antibacterianas (detergentes, oxidantes, ácidos, bases, etc).5

MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS.

Las estadísticas muestran que un tercio de la población mundial está infectada por el bacilo causante de la tuberculosis. Según la Organización Mundial de la Salud, “Una persona con tuberculosis activa, no tratada, infecta un promedio de 10 a 15 personas al año y cada segundo se produce en el mundo una nueva infección por el bacilo de la tuberculosis. Del 5 % al 10% de las personas infectadas por el bacilo de la tuberculosis, enferman o son contagiosas en algún momento de sus vidas. La tuberculosis es la principal causa de muerte en las personas infectadas por el VIH.8

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En el Ecuador, la tasa de prevalencia de tuberculosis para el año 2007 fue de 36.7 x 100.000 habitantes y la tasa de incidencia de 32.6 x 100.000 habitantes; tuberculosis pulmonar con baciloscopía positiva, que es la forma contagiante de la enfermedad se presentaron 3448 casos que corresponden al 78% del total; tuberculosis pulmonar con baciloscopía negativa 480=11%, y extrapulmonares 503=11%.8

La transmisión de los bacilos de la tuberculosis se produce casi exclusivamente por medio de núcleos suspendidos en pequeñas gotas que son expulsadas con la expectoración de las personas afectadas por tuberculosis pulmonar. Estas pequeñas gotas pueden permanecer infectantes en el aire durante bastante tiempo y pueden ser inhaladas por otras personas. La infección de los contactos es más probable cuando conviven o permanecen durante un tiempo prolongado cerca del enfermo que está expectorando bacilos y en un ambiente poco ventilado. No todas las personas infectadas enferman, sólo una de cada diez aproximadamente, que son las más susceptibles. La tuberculosis puede manifestarse en cualquier órgano, porque M. tuberculosis se disemina por todo el organismo; sin embargo, la enfermedad pulmonar es la más frecuente (80-85% de todos los casos diagnosticados) debido a que el bacilo necesita abundante oxígeno para multiplicarse. En los pulmones de los enfermos se pueden formar cavidades en las que se alojan grandes poblaciones de bacilos que pueden ser detectados en muestras de esputos. Los síntomas más característicos de la tuberculosis pulmonar son la tos y la expectoración persistentes por más de 2 semanas. A las personas con estos síntomas se Los llama Sintomáticos Respiratorios (SR). Otras manifestaciones pueden ser pérdida de peso, febrícula, sudores nocturnos, cansancio físico y dolores de tórax.4El diagnóstico de certeza de tuberculosis puede hacerse en forma confiable en el laboratorio demostrando la presencia de bacilos en una muestra deLa lesión o el cultivo.4

LA MUESTRA.La muestra más examinada es el esputo debido a que, como se ha dicho, la tuberculosis pulmonar es la más frecuente. Sin embargo, dado que la enfermedad puede manifestarse en cualquier órgano, con menor frecuencia puede requerirse la investigación de muestras muy variadas: orina, líquido cefalorraquídeo, líquido pleural, líquido ascítico, sangre, pus de cavidades abiertas, biopsias. Estas muestras de lesiones extrapulmonares deben procesarse también por cultivo.4

EL ESPUTO.El envase.Debe tener las siguientes características:• Boca ancha: de no menos de 50 mm de diámetro• Capacidad entre 30 y 50 ml: para facilitar que el paciente puedaDepositar la expectoración con facilidad dentro, sin ensuciar susManos o las paredes del frasco y para que en el laboratorio se puedaSeleccionar y tomar la partícula más adecuada, con comodidad, paraRealizar el extendido.• Cierre hermético: con tapa a rosca, para evitar derrames duranteEl transporte y la producción de aerosoles cuando se abre en el laboratorio.• Material plástico transparente, resistente a roturas, para poderObservar la calidad de la muestra cuando la entrega, evitarRoturas y derrames de material infeccioso y para que pueda ser desechado.4

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Obtención espontánea del esputo.Para la recolección de las muestras:• Elegir un lugar bien ventilado y que ofrezca privacidad.Puede ser una habitación bien ventilada y con acceso de luz natural (sol) o algún lugar abierto no concurrido.2• Entregar el envase de recolección ya rotulado con su nombre o número de identificación y el servicio que solicita. Estos datos deben ser escritos en la pared del frasco y no en la tapa para evitar errores, con rótulos que no se despeguen o con lápiz indeleble.• Obtener una buena muestra de esputo instruyendo al paciente con lenguaje simple y comprensible para que:- inspire profundamente llenando sus pulmones de aire tanto como sea posible- retenga el aire un momento (10 a 15 segundos)- expulse luego la expectoración con un esfuerzo de tos, tratando de arrastrar las secreciones del pulmón- recoja el esputo producido dentro del envase tratando de que entre en su totalidad, sin manchar sus manos o las paredes externas del frasco- repita esta operación otras dos veces colocando todas las secreciones en el mismo frasco- limpie el exterior del envase con un pañuelo de papel y se lave las manos con agua y jabón

Calidad de la muestraLa muestra de esputo mucopurulenta, proveniente de árbol bronquial, es la que asegura mayor probabilidad de que se puedan observar bacilosUna buena muestra tiene aproximadamente 3 a 5ml, es generalmente espesa y mucoide. Puede ser fluida con partículas de material purulento. El color es variable (blanco, amarillento y hasta verdoso). A veces son sanguinolentas.Las secreciones nasales, faríngeas o la saliva no son buenas muestras para investigar tuberculosis, aunque es conveniente examinarlas, de todas formas, porque siempre existe la posibilidad de que contengan parte de la expectoración o bacilos expulsados por la tos que hayan quedado en la boca, nariz o faringe.3

Mucopurulenta Sanguinolenta Mucosa Salivosa

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Si las muestras de esputo no van a ser procesadas en el día, es aconsejable introducir cada envase en una bolsa de polietileno y anudar la bolsa encima de la tapa, de manera que quede sujeta firmemente. Las muestras deben ser conservadas en refrigerador, preferentemente dentro de la caja de plástico. Si no se cuenta con refrigerador, ubicarlas en un lugar fresco y protegidas de la luz.4

PROCEDIMIENTO PARA LA TINCION ZIEHL- NEELSEN.

El calentamiento del portaobjetos permite mayor penetrancia de la carbolfuscina en la pared celular. Los ácidos micólicos y las ceras forman complejos con el colorante básico, que luego no se eliminan con la decoloración con ácidos débiles.5

MATERIALES:PortaobjetosMecheroAsa de siembraPipetasPinzas de maderaMicroscopio ópticoEquipo de tinción (barras paralelas)REACTIVOS:Fucsina fenicada básicaAlcohol acido 3,0 %Azul de metilenoMicroorganismos uno BAAR y uno no BAARAceite de inmersión

PROCEDIMIENTO: (ver anexo 1)1. Se fija los portaobjetos al calor con la muestra.2. Se cubre el frotis con el reactivo de colorante de carbolfuscina y se calienta con

suavidad hasta la aparición de vapores durante 1 minuto mediante flameo por debajo de la rejilla de sostén con un mechero de gas.

3. Se deja actuar el colorante sobre el portaobjetos durante 4-5minutos, sin calentar.4. Se lavan los frotis con agua destilada y se los inclina para eliminar el exceso de

agua.5. Se decoloran con acido alcohol al 3,0 % durante 2 minutos. Se lavan los frotis con

agua destilada y se los inclina para escurrir el resto de agua.6. Se cubren los frotis con reactivo de azul de metileno durante 1 minuto.7. Se lavan con agua destilada y se dejan secar al aire.8. Se examinan con aceite de inmersión en búsqueda de BAAR.5

RESULTADOS: Positiva rojos BAARNegativo azul no BAAR

Un hallazgo positivo significa “presencia de bacilos alcohol acido resistentes” y un hallazgo negativo significa “ausencia de bacilos alcohol acido resistentes”.6

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BAAR POSITIVO

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ANEXO 1

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BIBLIOGRAFÍA1. - CLARE, George. Stains and staining (microscopy). 4ta edition Williams and Williams.2.- Prácticas de Microbiología. Departamento de Microbiología y Genética Universidad de Salamanca3.- Jawetz Ernest, Microbiología médica, 17ª edición en español, Manual moderno, México, México 20024.- SEQUEIRA, L. Manual para el diagnóstico bacteriológico de la tuberculosis normas y guía técnica. OPS 20085.- Bailey & Scott, Diagnóstico microbiológico, 11ª edición, Editorial Panamericana, Buenos Aires – Argentina, 2 004.6.- Koneman, E. Diagnostico microbiológico, Editorial médico panamericana, 110 − 111.7. - Mandell, Bennett, & Dolin: Principles and Practice of Infectious Diseases 6th ed. Copyright © 2005. Churchill Livingstone, An Imprint of Elsevier.8.- http://www.opsecu.org/informativo/informativo5/tuberculosis.htm

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