ESCUELA DE MEDICINA HUMANA Biologa Celular y Molecular

CICLO: 2014 I

PRCTICA N 10

Espectrofotometra

I. COMPETENCIAS.

1.1. Identifica el equipo utilizado en espectrofotometra.1.2. Comprende la utilidad de la espectrofotometra en mediciones cuantitativas.1.3. Comprende el concepto de Espectrofotometra.1.4. Valora el papel de la espectrofotometra en el anlisis de muestras clnicas.1.5. Aprende el correcto uso del espectrofotmetro para medir la absorbancia de soluciones coloreadas.

II. INTRODUCCIN.

El estudio a nivel bioqumico de cualquier biomolcula requiere la utilizacin de tcnicas analticas que permitan su determinacin cualitativa y cuantitativa, as como su caracterizacin fsico-qumica y biolgica. Uno de los mtodos ms sencillos, accesibles, tiles y utilizados es la espectrofotometra, en general, y la espectrofotometra ultravioleta-visible, en particular. Se pueden identificar y cuantificar biomolculas en solucin y en muestras biolgicas, con el empleo de reactivos especficos que reaccionan con el compuesto a analizar y forman un producto coloreado que permite detectarlo en muestras complejas. El fundamento de la espectrofotometra se debe a la capacidad de las molculas para absorber radiaciones, entre ellas las radiaciones dentro del espectro UV-visible. Las longitudes de onda de las radiaciones que una molcula puede absorber y la eficiencia con la que se absorben dependen de la estructura atmica y de las condiciones del medio (pH, temperatura, fuerza inica, constante dielctrica), por lo que dicha tcnica constituye un valioso instrumento para la determinacin y caracterizacin de biomolculas. FUNDAMENTACINLas molculas pueden absorber energa luminosa y almacenarla en forma de energa interna. Esto permite poner en funcionamiento ciclos vitales como la fotosntesis en plantas y bacterias. Cuando la luz (considerada como energa) es absorbida por una molcula se origina un salto desde un estado energtico basal o fundamental, E1, a un estado de mayor energa (estado excitado), E2. Y slo se absorber la energa que permita el salto al estado excitado.

Cada molcula tiene una serie de estados excitados (o bandas) que la distingue del resto de molculas. Como consecuencia, la absorcin que a distintas longitudes de onda presenta una molcula - esto es, su espectro de absorcin - constituye una seal de identidad de la misma. Por ltimo, la molcula en forma excitada libera la energa absorbida hasta el estado energtico fundamental.Figura 1. Diagrama de niveles de energa en una molcula. La absorcin de energa luminosa hace que la molcula pase desde un estado fundamental (E1) a otro excitado (E2). Posteriormente la molcula relaja su energa mediante distintos mecanismos (vibracin, rotacin, etc.)

En espectrofotometra el trmino luz no slo se aplica a la forma visible de radiacin electromagntica, sino tambin a las formas UV e IR, que son invisibles. En espectrofotometra de absorbancia se utilizan las regiones del ultravioleta (UV cercano, de 195-400 nm) y el visible (400-780 nm).

La regin UV se define como el rango de longitudes de onda de 195 a 400 nm. Es una regin de energa muy alta. Provoca dao al ojo humano as como quemadura comn. Los compuestos con dobles enlaces aislados, triples enlaces, enlaces peptdicos, sistemas aromticos, grupos carbonilos y otros heterotomos tienen su mxima absorbancia en la regin UV, por lo que sta es muy importante para la determinacin cualitativa y cuantitativa de compuestos orgnicos. Diversos factores - como pH, concentracin de sal y el disolvente - que alteran la carga de las molculas, provocan desplazamientos de los espectros UV.

La fuente de radiacin ultravioleta es una lmpara de deuterio. En la regin visible apreciamos el color visible de una solucin y que corresponde a las longitudes de onda de luz que transmite, no que absorbe. El color que absorbe es el complementario del color que transmite. Por tanto, para realizar mediciones de absorcin es necesario utilizar la longitud de onda en la que absorbe luz la solucin coloreada. La fuente de radiacin visible suele ser una lmpara de tungsteno y no proporciona suficiente energa por debajo de 320 nm.

Longitud de Onda - (nm)ColorColor Complementario

380-435VioletaVerde-amarillo

435-480AzulAmarillo

480-490Azul-verdosoAnaranjado

490-500Verde-azuladoRojo

500-560VerdePrpura

560-580Verde-amarilloVioleta

580-595AmarilloAzul

595-650AnaranjadoAzul-verdoso

650-780RojoVerde-azulado

Transmitancia y Absorbancia: Cuando un rayo de luz de una determinada longitud de onda de intensidad Io incide perpendicularmente sobre una disolucin de un compuesto qumico que absorbe luz o cromforo, el compuesto absorber una parte de la radiacin incidente (Ia) y dejar pasar el resto (It), de forma que se cumple: Io = Ia + It

La Transmitancia (T) de una sustancia en solucin es la relacin entre la cantidad de luz transmitida que llega al detector una vez que ha atravesado la muestra, It y la cantidad de luz que incidi sobre ella, Io, y se representa normalmente en tanto por ciento: % T = It/Io x 100. La transmitancia nos da una medida fsica de la relacin de intensidad incidente y transmitida al pasar por la muestra. La relacin entre %T y la concentracin no es lineal, pero asume una relacin logartmica inversa.

La absorbancia (A) es un concepto ms relacionado con la muestra puesto que nos indica la cantidad de luz absorbida por la misma, y se define como el logaritmo de 1/T, en consecuencia: A = log 1/T = -log T = -log It/IoCuando la intensidad incidente y transmitida son iguales (Io = It), la transmitancia es del 100% e indica que la muestra no absorbe a una determinada longitud de onda, y entonces A vale log 1 = 0. La cantidad de luz absorbida depender de la distancia que atraviesa la luz a travs de la solucin del cromforo y de la concentracin de ste.

Espectrofotmetro UV-visible: La medicin de absorbancia de la luz por las molculas se realiza en unos aparatos llamados espectrofotmetros. Todos constan, segn se indica en la figura, de:

1. Una fuente de energa radiante: lmpara de deuterio y tungsteno. 2. Un monocromador para la seleccin de radiaciones de una determinada longitud de onda: filtros, prismas, redes de difraccin. 3. Un compartimento donde se aloja un recipiente transparente (cubetas) que contenga la muestra. Pueden ser de vidrio, cuarzo o plstico transparente. Para medir en UV se deben usar las de cuarzo o slice fundido, porque el vidrio no transmite la radiacin UV. 4. Un detector de luz y un amplificador convertidor de las seales luminosas en seales elctricas. 5. Un registrador o sistema de lectura de datos.

Desde el punto de vista operativo, el primer paso es seleccionar la fuente de luz y longitud de onda a la que se va a realizar la medida. Hay espectrofotmetros de un solo haz (con una sola celdilla para alojar la cubeta con la muestra) y de doble haz (con dos celdillas para dos cubetas); en nuestro caso se trabajar con los de un solo haz, pero con cmara para cuatro cubetas.

Se mide primero la absorbancia del disolvente (conocido como blanco) y al que se le asigna el valor de cero mediante el ajuste del mando, de forma que la intensidad incidente y transmitida sean iguales (Io= It), y por tanto la absorbancia es cero. A continuacin se pone en la celdilla la cubeta con la muestra y se lee la absorbancia de sta.III. MATERIAL Y MTODOS

3.1 Materiales y equipos

0. Materiales: 0. De vidrio: 10 tubos de ensayo 13x100 01 Micropipeta 100 L. 01 Micropipeta de 1000 L.

0. Reactivos: Azul de Metileno/Safranina 0,1 mg/ml Agua destilada 500 ml

0. Equipos e instrumentos: 01 Espectrofotmetro nico 2100 UV-VISIBLE Micropipetas automticas de 2-20, 100-1000 L.

0. Otros: 10 cubetas para espectrofotmetro. 03 gradillas 03 Marcadores indelebles

3.2 Procedimiento.

0. Espectrofotometra.

DETERMINACIN DE ESPECTROS DE ABSORCIN: Segn la tabla indicada lneas abajo, determinar los espectros de absorcin de cada una de las soluciones de colorantes (azul de metileno y safranina), leyendo las absorbancias en cada una de las longitudes de onda del espectrofotmetro, llevando el equipo a cero con agua destilada en cada caso. Es decir, colocar en cubetas separadas las soluciones de colorantes y medir las absorbancias a diferente longitud de onda ().

Azul de metilenoSafranina

450

500

550

600

650

Debe indicar cul es la longitud de onda de mxima absorbancia para cada una de las soluciones. Es decir, el mayor valor de absorbancia obtenido para cada colorante.

PREPARACIN DE UNA CURVA DE CALIBRACIN: Preparar 5 diluciones del colorante 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 y 1:32, utilizando agua destilada como diluyente, como sigue:

Rotular 5 tubos de ensayo: Tubo 1=1:2, Tubo 2=1:4, Tubo 3=1:8, Tubo 4=1:16 y Tubo 5=1:32

Colocar en cada tubo 2 ml de agua destilada y agregar al tubo 1, 2 ml de la solucin de safranina (0,1mg/ml). Mezclar.

2 ml 2 ml 2 ml 2 ml54321

12345

Tubos 1 a 5, contienen 2 ml de H2O destilada

Del tubo 1 coger 2 ml y agregarlos al tubo 2. Mezclar. Repetir la operacin con todos los tubos y medir las absorbancias de cada uno en la longitud de onda seleccionada en la experiencia anterior. Graficar una curva de absorbancia x dilucin.

IV. RESULTADOS.

V. CONCLUSIONES

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS.

4.1. Docon Navaza MC, Garca-Saavedra MJ, Vicente Garca JC. Fundamentos y Tcnicas de Anlisis Bioqumicos. Principios de anlisis instrumental. 2 ed. Espaa: Thompson-Paraninfo; 2005.4.2. Macarulla J y Goi F. Bioqumica humana: curso bsico. 2 ed. Barcelona. Revert; 2003.4.3. Vives J y Aguilar J. Manual de tcnicas de laboratorio en Hematologa. 3a edicin. Barcelona. Masson, S.A.; 2006

Facultad de Ciencias de la Salud