1

Doktorski studij: BIOLOGIJA NOVOTVORINA Medicinski fakultet u Splitu

FITOTERAPEUTSKI PRIPRAVCI I SPOJEVI S PROTUTUMORSKIM DJELOVANJEM

- nastavni materijal

Dr. sc. Igor Jerkovi, docent Kemijsko-tehnoloki fakultet u Splitu, Zavod za organsku kemiju

e-mail: igor@ktf-split.hr

Split, lipanj 2008.

2

1. Farmakognozija i fitoterapija

Farmakognozija je znanost o ljekovitim tvarima biljnog, ivotinjskog i mineralnog porijekla (suvremena farmakognozija obuhvaa i mikroorganizme). Rije "farmakognozija" izvedenica je grkih rijei pharmakon (droga) i gnosis (znanje). Prema "The American Society of Pharmacognosy" definira se kao "the study of the physical, chemical, biochemical and biological properties of drugs, drug substances or potential drugs or drug substances of natural origin as well as the search for new drugs from natural sources". Farmakognozija je interdisciplinarna znanost koja povezuje razliita znanstvena podruja: botaniku, biologiju, mikrobiologiju, kemiju, farmakologiju i dr. Suvremena istraivanja farmakognozije se dijele na:

medicinsku etnobotaniku (izvedenica ethno - istraivanje kulture i botany - istraivanje biljaka) - znanstvena istraivanja tradicionalne uporabe biljaka u medicinske svrhe, odnos ljudi - biljke (Journal of Ethnobiology and Ethnomedicine);

etnofarmakologiju (zdruivanje socijalne znanosti - etnologije i medicinske znanosti - farmakologije) - znanstvena istraivanja farmakoloke kvalitete tradicionalnih ljekovitih tvari koja dovode u korelaciju etnike grupe, njihovo zdravlje i kako se to odnosi na njihove navike i koritenje prirodnih ljekovitih tvari (Ethnopharmacology);

fitoterapiju - medicinska uporaba biljaka, dijelova biljaka i biljnih pripravaka (Phytotherapy Research);

3

fitokemiju - istraivanje prirodnih spojeva iz biljaka (najee sekundarnih metabolita), ukljuujui i identifikaciju novih ljekovitih spojeva iz biljnih izvora (Phytochemistry).

Fitoterapija je poveznica farmakologije i komplementarne medicine u tretiranju i prevenciji bolesti, a podrazumijeva lijeenje, ublaavanje i prevenciju bolesti primjenom ljekovitih biljaka, njihovih dijelova i biljnih pripravaka (npr. ekstrakti, tinkture). To je prvi oblik medicine koji je ovjek poznavao, stoljeima jedini oblik lijeenja i ublaavanja boli. Bioloki aktivne tvari, odgovorne za terapijski uinak, obino su koncentrirane su u pojedinim biljnim organima (list, cvijet, plod, korijen) ili ekskretima (npr. eterino ulje). U praksi se koriste dijelovi biljke bogati ljekovitim tvarima i nazivaju se ljekovitim drogama ili samo drogama. Ljekovite biljke se koriste od antikih vremena za tretiranje razliitih oboljenja. Unato znatnom napredku moderne medicine, posljednjih desetljea ljekovite biljke i dalje znatano doprinose zdravstvu (prevencija i tretiranje oboljenja). U posljednijm desetljeima porastao je broj ljekovitih tvari dobivenih iz viih biljaka, osobito fitofarmaceutika. Procjenjuje se da je cca. 25% svih modernih ljekova izravno ili neizravno izvedeno iz viih biljaka. U posebnim sluajevima, kao to su antitumorski i antimikrobni ljekovi, cca. 60% ljekova trenutno dostupnih na tritu, kao i onih u posljednjim fazama klinikih ispitivanja, izvedeno je iz prirodnih spojeva (uglavnom iz viih biljaka). Prema Svjetskoj zdravstvenoj organizaciji (WHO, "World Health Organization"), zbog siromatva i nedostupnosti moderne medicine, oko 65-80% svjetske populacije koja ivi u zemljama u razvoju ovisi prvenstveno o ljekovitim biljkama za primarnu zdravstvenu zatitu. Velike svjetske

4

farmaceutske kompanije pokazuju obnovljeni interes za vie biljke kao izvore novih vodeih bioloko-aktivnih spojeva (struktura), kao i za razvoj standardiziranih fitoterapeutskih pripravaka s dokazanom uinkovitosti, sigurnosti i kvalitetom. Biljni ljekoviti pripravci su veoma popularni u zemljama u razvoju, ali i u razvijenim zemljama. Svjetsko trite fitofarmaceutskih pripravaka raste od 1985. god. za cca. 5-18% godinje. Nekoliko vanih imbenika je doprinjelo ovakovom rastu:

sklonost prirodnim terapijama, zabrinutost zbog nepoeljnih popratnih uinaka modernih ljekova i

uvjerenja da su biljni pripravci osloboeni tih uinaka (budui milijuni ljudi irom svjeta koriste ljekovite biljke tisuama godina),

vjerovanje da ljekovite biljke mogu biti korisne u tretiranju odreenih bolesti kada se konvencionalne terapije pokau neuinkovitima,

poboljanje kvalitete i dokaza uinkovitosti i sigurnosti ljekovitih biljaka, visoka cijena sintetskih ljekova i dr.

Fitoterapeutici ili fitofarmaceutici prema definiciji (ESCOP - "Europe Scientific Corporative of Phytotherapy") kao aktivne sastojke sadre biljke, biljne dijelove i njihove pripravke, a podrazumijevaju standardizirane biljne droge sa strogo definiranim sadrajem i sastavom terapijski aktivnih tvari, ija je uinkovitost potvrena farmakolokim i klinikim istraivanjima, uz naznaku moguih nuspojava i interakcija s drugim lijekovima. Fitoterapeutici ne ukljuuju kemijski definirane izolirane tvari, bilo pojedinane ili u kombinaciji s biljnim materijalima. Izolirana pojedinana aktivna biljna tvar predstavlja granicu fitoterapije i farmakoterapije!! Uinci fitofarmaceutika se temelje, kao i u sluaju sintetskih tvari, na

5

farmakolokim zakonima. Naravno, modeli aktivne tvari u farmakologiji se temelje na jakom uinku pojedinane tvari i esto ne mogu zadovoljiti smjesu tvari sa irim podrujem djelovanja. Stoga se moraju razvijati kompleksniji modeli za objanjavanje uinaka fitoterapeutika, te bi se znanstvena fitoterapija mogla smatrati integralnim dijelom farmakologije. Meutim, ispravna upotreba fitofarmaceutika zahtijeva posebne procedure i naine razmiljanja, pa fitoterapija ipak predstavlja posebno podruje istraivanja. Osnovna karakteristika fitofarmaceutika/fitoterapeutika je postojanje smjesa prirodnih tvari, a ponekad se procesuira i nekoliko biljaka (dijelova) u jedan pripravak. Njihove komponente se dijele na aktivne i pratee tvari u skladu s njihovim udjelom na kumulativni uinak. Openito, koliina djelatne (aktivne) tvari prisutne u biljnoj drogi ovisi o:

uvjetima rasta biljke (tlo, temperatura, vlanost, godinje doba), stupnju zrelosti biljke u trenutku sabiranja, procesu suenja, nainu i vremenu skladitenja.

Pratee tvari takoer mogu doprinijeti uinku fitofarmaceutskog pripravka preko interakcije s aktivnim tvarima. Dakle, esto cijeli niz u biljci prisutnih tvari pridonosi postizanju eljenog uinka (npr. sinergistiko djelovanje). U tom sluaju iz ljekovite biljke treba izvui sve te tvari istodobno, zadravajui njihov meusobni odnos. Tako se dobiva standardizirani ekstrakt. Pri kontroliranoj preradi (dobivanju standardiziranog ekstrakta) gore spomenute varijable se kontroliraju u procesu proizvodnje sa standardiziranjem koncentracije aktivnih tvari. Uz aktivnu tvar, biljni ekstrakt sadri i "druge komponente" prisutne u biljci,

6

kemijski vrlo raznolike, koje zajedno s djelatnim tvarima ine fitokompleks. Vanost "ostalih komponenti" je u tome to moduliraju djelovanje aktivnih tvari i pospjeuju njihovu apsorpciju. Kao rezultat koritenja fitokompleksa u odnosu na pojedinanu djelatnu tvar, uoeno je smanjenje toksinosti, neeljenog djelovanja te cjelovitiji i uravnoteeniji uinak na cijeli organizam. Farmakoloka djelotvornost biljne droge je rezultat kombinacije svih prisutnih tvari u proporcionalnoj ravnotei u fitokompleksu. Openite karakteristike fitofarmaceutika su:

Blago djelovanje - Aktivne tvari u fitofarmacima obino su razrijeene prateim tvarima (bioloki neaktivnim), a i same po sebi imaju blago djelovanje. Fitofarmaceutici su manje specifini od sintetskih lijekova i obino imaju iri spektar djelovanja.

Manje neeljenih djelovanja - Aktivne tvari fitofarmaka bre se metaboliziraju i izluuju iz organizma pa rjee dolazi do nakupljanja u organizmu i mogueg tetnog djelovanja.

Tijekom terapije vie je izraena psihosomatska komponenta Pacijenti esto bolje prihvaaju fitofarmaceutike nego sintetske lijekove.

Djelovanje je sporo - esto je potrebno dugotrajno lijeenje. Mogue opasnosti - Nijedna farmakoloki aktivna tvar nije samo

ljekovita, ve istodobno ima i odreenu tetnost. Budui da sve tvari prisutne u biljnoj drogi nisu uvijek poznate, nije poznato ni da li i u kojoj mjeri mogu u odreenim situacijama biti tetne (rizik je vei u sloenijim situacijama lijeenja). Kod samoniklih biljaka, ali i tijekom pripreme mogua je kontaminacija biljne droge gljivicama, bakterijama, insektima, tekim metalima, ime se smanjuje koncentracija aktivne tvari i poveava opasnost od trovanja.

7

Fitoterapija prestaje upravo u trenutku kada se metodama izolacije i obradom izolata dobije aktivna ista tvar. Dobivena ista tvar, za koju je utvrena farmakoloka djelotvornost, postaje tada sastavni dio lijeenja u tradicionalnoj medicini. Npr. salicilna kiselina, praotac Aspirina, a time i svih protuupalnih nesteroidnih lijekova (najvie koritenih lijekova protiv bolova), potjee od kore vrbe od koje se mljevenjem dobivao praak koji se koristio kao fitofarmaceutik: analgetik (sredstvo za umanjivanje boli koje ne izaziva gubitak svjesti) i antipiretik (sredstvo za sniavanje poviene tjelesne temperature). Gotovo istodobno s ovim otkriem, uoena je i njeno tetno djelovanje na eluanu sluznicu. Zahvaljujui radu kemiara, salicilna kiselina se acetiliranjem prevodi u acetilsalicilnu kiselinu (aspirin), ime se smanjuje nepoeljno djelovanje i time je dobiven lijek - aspirin.

1.1. Jednostavni fitoterapeutski pripravci

Jednostavni fitoterapeutski pripravci se mogu lako pripraviti ekstrakcijom biljne droge s vodom i/ili alkoholom (etanolom), a meusobno se razlikuju po nainu provoenja ekstrakcije, te se mogu podijeliti na:

Rinfuz - Propisana koliina biljne droge (oko 2-5 g) prelije se kipuom vodom (150-250 mL), ostavi da stoji poklopljena 5-10 min

OHO

HOOH

O

OH

CH2OH

HIDROLIZA salicin 2-hidroksibenzil

-alkohol aspirin

CH2OH

HO

Felix Hoffman 1890-tih (Bayer)

COOH

AcO

u kori vrbe

8

uz povremeno mijeanje te se procijedi. Rinfuz je prikladan za veinu lia, cvjetnih droga, mekog korijenja i pravilno usitnjenih kora.

Uvarak - Propisana koliina biljne droge stavlja se u hladnu vodu, zagrijava do vrenja, kuha nekoliko minuta (obino 5-10 min. ili 15-30 min.), ostavi stajati poklopljeno 10-20 min. uz povremeno mijeanje, te se procijedi. Ovaj postupak prikladan je za vrste biljne droge: drvo, korijenje, koru.

Macerat - Biljna droga prelije se propisanom koliinom hladne vode, ostavi nekoliko sati na sobnoj temperaturi i zatim procijedi. Ovaj nain pripreme prikladan je za biljne droge koje sadre sluzi, budui da se biljna sluz kuhanjem unitava. Kod nekih biljnih droga ovaj se postupak moe koristiti kako bi se sprijeila ekstrakcija nekih neeljenih tvari npr. treslovine.

Prednost uporabe vrele vode u izradi pripravka je unitenje bakterija u biljnoj drogi. Zbog opasnosti od razvoja bakterija, rinfuz se moe uvati 24h, a macerat samo 4h.

1.2. Oblikovani fitoterapeutski pripravci

Osim jednostavnih fitoterapeutskih pripravaka, postoje i tzv. oblikovani pripravci koji zahtijevaju due vrijeme pripremanja, pa su obino ve pripravljeni za konzumiranje ili je olakano doziranje preko filter vreica. Prednosti filter vreica su praktinost primjene, unaprijed odreena doza za uporabu, te visoki stupanj usitnjenosti biljne droge koji omoguava kompletnije iskoritavanje djelatne tvari iz biljke. Meutim, zbog

9

usitnjenosti, u biljnim drogama koje sadre eterina ulja djelatna isparljiva tvar gotovo potpuno ishlapi. Prednost ovakovih pripravaka je i njihova vea trajnost u odnosu na jednostavne pripravke. Oblikovani fitoterapeutski pripravci mogu se podijeliti na:

Biljni prah - Dobiva se usitnjavanjem suhe biljne droge. Najee se dozira u kapsulama.

Tekui ekstrakt - Dobiva se maceracijom suene biljne droge u otapalu (najee smjesa voda-alkohol). Vrijeme maceracije je cca. 21 dan). Tako dobivene biljne tinkture sadre 60-70% alkohola.

Suhi ekstrakt - Dobiva se ekstrakcijom djelatnih tvari uz pomo odgovarajueg otapala (voda-alkohol), nakon ega se otapalo odstrani. Tako dobivena kruta tvar lako je topljiva u vodi s velikim postotkom aktivne tvari.

Majka tinktura - Dobiva se maceracijom svjee ubrane biljne droge u vodeno-alkoholnom otapalu (45-50% alkohola). Prisutnost alkohola sprIjeava razvoj mikroorganizama.

Glicerinski macerat - Dobiva se maceracijom svjee ubranih, mladih dijelova biljke u mjeavini vode, alkohola i glicerina.

Liofilizirani ekstrakt - Dobiva se sloenim, skupim tehnolokim postupkom kojim se dobiva optimana koncentracija aktivne tvari te najbolja sauvanost cjelovitosti fitokompleksa u pripravku. Liofilizacija je postupak suenja u smrznutom stanju gdje se uklanja voda sublimacijom leda u vakuumu.

Suhi ekstrakti i liofilizirani ekstrakti predstavljaju najidealniji oblik, s obzirom na koncentraciju djelatne tvari i bioraspoloivost, a prikladni su i za dobivanje gotovih farmaceutskih pripravaka (sirupa, oralnih ampula,

10

tableta...). Tako dobiveni gotovi fitofarmaceutski pripravci ne utjeu na prirodnost proizvoda ve doprinose boljoj iskoritenosti ljekovitih tvari iz biljaka. Specifikacija pripravaka biljnih droga ukljuuje:

kvalitetu biljne droge stabilnost konstituenata (mikrobioloka stabilnost, koliina prisutnih

mikroorganizama, ostatna otapala u ekstraktima, sadraj vode, tekih metala, pesticida i dr.)

definirane uvjete suenja sigurnosna i efikasna predklinika i klinika testiranja definiranje metode izolacije iz biljke odreivanje fitokemijskih karakteristika (kemijski profili: HPLC/UV,

HPLC/MS, GC/MS, TLC-denzitometrija i dr.)

Mnogi imbenici oteavaju klinika istraivanja s biljnim preparatima: nedostatak standardizacije i kontrole kvalitete biljnih preparata koritenje razliitih koliina preparata neadekvatan odabir pacijenata mali broj pacijenata za statistike znaajke potekoe u uspostavljanju prikladnih placeba zbog okusa, arome i dr. velike varijacije u trajanju tretmana i dr. Openita ideja o veoma sigurnim biljni preparatima osloboenih

sporednih uinaka nije tona!! Biljke sadre stotine konstituenata i neke su veoma toksine kao to je veina citotoksinih i antitumorskih biljnih droga. Meutim, nepovoljan uinak veine biljnih droga je openito manje uestao kada se droge upotrebljavaju ispravno u usporedbi sa sintetskim ljekovima. Dvije vrste popratnih uinaka su uoeni kod biljnih preparata. Prvi

11

(intrinsini) se odnosi na predvidljivu toksinost, predoziranje i interakciju s konvencionalnim ljekovima (mnoge alergijske reakcije). S druge strane veina poznatih popratnih uinaka (ekstrinsini) odnose se na pripremu npr. pogrenu identifikaciju biljaka, nedostatak standardizacije, kontaminacija (npr. teki metali, pesticidi) i dr.

Pravni propisi za legalizaciju biljnih preparata (droga) mijenjaju se od zemlje do zemlje. WHO je objavio ope vodilje s namjerom definiranja temeljnih kriterija za evaluaciju kvalitete, sigurnosti i uinkovitosti biljnih preparata s ciljem pomoi nacionalim zakonodavstvima, znanstvenim organizacijama i proizvoaima. Nadalje, WHO je pripremio farmakopejske monografije o biljnim preparatima i osnovne vodilje za procjenu biljnih droga. Standardizacija biljnih droga obuhvaa:

botaniku autentifikaciju droge odreivanje strane tvari organoleptiku procjenu makroskopsku i mikroskopsku analizu

sadraj i sastav isparljivih tvari udio pepela

ekstraktivnu vrijednost kromatografski profil

prisustvo marker komoponente(i) ostatak pesticida

mikrobioloku analizu

prisustvo radioaktivnih kontaminanata i dr.

12

Openiti protokol za standardiziranu proizvodnju biljnih droga:

Analiza SIROVI BILJNI MATERIJAL Izvor;

Identifikacija

Analiza u vrijeme

primjene

SKLADITENJE Odgovarajui

skladini uvjeti

Analiza tijekom procesa

PROIZVODNJA Dobro

definirani proces

Analiza

PROCESUIRANI MATERIJAL

Prikladno skladitenje

prije pakiranja

Studije stabilnosti

GOTOVI PROIZVOD

Odgovarajua ambalaa i

etiketa

Kada se sakupljaju razliiti biljni dijelovi? Listovi kada se cvatovi poimaju otvarati Cvatovi neposredno prije negoli se potpuno otvore Korijenje kada odumre nadzemni dio biljke Kora nakon perioda vlanog vremena

Plodovi potpuno zreli

Smole za vrijeme suhog vremena

13

2. Biljke kao izvor spojeva s protutomorskim djelovanjem

Biljke imaju dugu tradiciju uporabe u tretiranju tumora. Hartwell u revijalnom pregledu biljaka koje se koriste protiv tumora spominje vie od njih 3000. Meutim, u mnogim sluajevima pojam tumor nije definiran ili se odnosi na razliita stanja bolesnika, npr. pojaano znojenje i sl. Mnoge tvrdnje o uinkovitosti u tretmanu tumora trebaju se revidirati sa vie skepticizma budui se tumor, kao specifina bolest, vjerojatno slabo definira u tradicionalnoj medicini. Ovo je u suprotnosti u odnosu na druge terapije ljekovitim biljem koje se koriste u tradicionalnoj medicini za tretiranje drugih oboljenja kao to su malarija ili razne vrste boli, koji se mnogo lake definiraju i gdje su oboljenja esto prevladavajua u podrujima gdje se ekstenzivno koristi tradicionalna medicina.

Meutim, preko 60% trenutano koritenih protutumorskih sredstava izvedeno je na ovaj ili onaj nain iz prirodnih izvora, ukljuujui biljke, morske organizme i mikroorganizme. Takoer prirodni spojevi imaju i danas dominantnu ulogu u otkriu vodeih struktura za razvoj konvencionalnih ljekova za tretiranje veine oboljenja kod ljudi.

Istraivanje protutumorskih tvari iz biljaka poelo je 1950-tih sa otkriem i razvojem vinca alkaloida, vinblastina i vinkristina, te izolacijom podofilotoksina. Ova otkria su potakla United States National Cancer Institute (NCI) na poetak ekstenzivnog sakupljanja biljaka u 1960-tim, fokusiranim uglavnom na umjerena klimatska podneblja. To je dovelo do otkria mnogih novih kemotipova biljaka sa spektrom citotoksinog djelovanja ukljuujui i taksane i kamptotecine, ali se njihov razvoj u kliniki aktivne tvari proirio na period od 30 godina (od ranih 1960-tih do 1990-tih). Ovaj program sakupljanja biljaka je zavren 1982. god., ali sa

14

razvojem novih tehnologija za testiranje screening NCI je napravio reviziju sakupljanja biljaka i organizama 1986. god. Ovaj put fokus je na tropskim i subtropskim podnebljima, ali novo kliniki testirano protutomorsko sredstvo biljnog izvora jo nije dolo u fazu ope upotrebe. Meutim, neka sredstva su u predklinikom razvoju.

U daljnjem tekstu spomenute su odabrane biljake koje su posluile kao izvor prirodnih spojeva ili njihovih derivata s protutumorskim djelovanjem u klinikim ili predklinikim istraivanjima.

2.1. Catharanthus roseus G. Don - Catharanthus roseus G. Don. (Apocynaceae), je vrsta Catharanthus endenmska u Madagaskaru. Sinonimi su Vinca rosea, Ammocallis rosea i Lochnera rosea; ostala engleska imena koja se povremeno koriste su Cape Periwinkle, Rose Periwinkle i dr. To je zimzelen grm do 1m visine. Listovi su ovalni 2,5-9 cm dugi i 1-3 cm iroki, bez dlaka. Cvatovi su bijeli do tamno rozi, sa tamnijim crvenim centrom.

Catharanthus roseus G. Don.

Samonikla je veoma ugroena vrsta iako se iroko kultvira i naturalizirana je u tropskim i subtropskim podrujima diljem svijeta kao ukrasna biljka, ali i kao ljekovita biljka. U tradicionalnoj kineskoj medicini njeni ekstrakti su koriteni za tretiranje razliitih oboljenja ukljuujui

15

diabetes, malariju, Hodgkinsovu bolest. Moe biti opasna ako se konzumira oralno, kao i halucinogena. Tvari vinblastin (VLB) i vinkristin (VRC) ekstrahirani iz biljke se koriste za tretiranje leukemije. Otkriveni su za vrijeme istraivanja biljke kao potencijalnog oralnog hipoglikeminog sredstva. Nije potvrena ova aktivnost, ali je otkriveno da ekstrakti biljke reduciraju broj bijelih krvnih zrnaca, a zatim je otkriveno da tretiranje mieva s transplantatom leukemije uzrokuje znaajno produljenje ivota mieva, to je kasnije dovelo do izolacije VLB i VLC kao aktivnih tvari.

2.2. Podophyllum peltatum Linnaeus - Podophyllum je rod sa 6 vrsta (species) porodice Berberidaceae, potjee iz istone Azije (5 vrsta) i istone Sjeverne Amerike (vrsta mayapple, P. peltatum).

Podophyllum peltatum Linneaus (myapple)

Svi biljni djelovi osim plodova su otrovni. ak i plod moe uzrokovati neugodnosti u probavi. Tvar koju sadre, podofilotoksin ili podofilin, se

16

koristi kao purgativ i citostatik. Podophyllum vrste (Podophyllaceae), P. peltatum Linneaus i P. Emodii Wallich iz Indije imaju dugu tradiciju medicinske uporabe ukljuujui tretiranje konih tumora. P. peltatum je koriten od nativnih Amerikanaca (podruje Maine) za tretiranje tumora. Glavni aktivni konstituent, podofilotoksin, prvi put je izoliran 1880. god, ali je njegova tona struktura objavljena kasnije 1950-tih. Mnogi slini podofilotoksin-slini ligandi su izolirani za vrijeme ovog perioda, a nekoliko njih je uvedeno u klinika istraivanja, ali su odbaeni zbog nedostatka efikasnosti i neprihvatljive toksinosti.

2.3. Taxus brevifolia Nutt. - Taxus brevifolia (pacifika tisa (pacific yew) ili zapadna tisa (western Yew)) samonikla je u sjevernoistonom Pacifiku i u Sjevernoj Americi. Protee se od Aljaske do sredinje Kalifornije, uglavnom u pacifikim priobalnim podrujima. To je malo do srednje zimzeleno drvo, 10-15 m visoko promjera do 50 cm. Posjeduje tanku smeu koru, a listovi su tamnozeleni, 1-3 cm dugi i 2-3 mm iroki.

Taxus brevifolia (kora) Taxus brevifolia (iglice)

17

Paklitaksel (taksol) u poetku je izoliran iz kore T. Brevifolia (Taxaceae), sakupljene u Washingtonu kao dio programa sluajnog sakupljanja biljaka od strane U. S. Department of Agriculture (USDA) za NCI. Listovi T. Baccata se koriste u tradicionalnoj Azijsko-Indijskoj medicini za tretiranje tumora. Kako je postala izuzetno rijetka nakon to je otkriven njen kemoterapeutski potencijal, T. brevifolia nije nikada sabirana s njenog stanita u velikoj mjeri, a iroka upotreba paklitaksela je omoguena kada je razvijen polusintetski put.

2.4. Camptotheca acuminata Decne - Camptotheca acuminata Decne (Nyssaceae), sinonim sretno drvo (happy tree) je drvo srednje veliine do 20 m visine, potjee iz sredinje Kine. Naziv happy tree je izravan prijevod kineskog imena xi shu.

Camptotheca acuminata Decne

Ekstrakt drveta se koristu u tretiranju tumora. Kamptotecin je otkriven iz ekstrakta biljke izvorno sakupljene od U. S. Department of Agriculture kao potencijalni izvor steroidnih prekursora za proizvodnju kortizona. Ekstrakt C. acuminata je bio jedini od 1000 ekstrakata koji je testiran na antitumorsku aktivnost, a pokazao je uinkovitost, a kampotecin je izoliran

18

kao aktivni konstituent ekstrakta. Kamptotecin (kao natrijeva sol) je koriten u klinikim istraivanjima od strane NCI u 1970-tim, ali je odbaen zbog opasne toksinosti za mjehur. Meutim, intenzivna istraivanja su nastavljena od nekoliko farmaceutskih tvrtki u potrazi za mnogo uinkovitijim kamptotecin derivatima.

2.5. Betula spp. - Breza, Betula spp. (Betulaceae) se sastoji od 30-50 vrsta koje rastu u Aziji, Sjevernoj Americi i Europi. Rije betula je klasino latinsko ime za brezu. Neke vrste su uta breza (Betula alleghaniensis), slatka breza (B. lenta), papirnata breza (B. papyrifera), rijena breza (B. nigra), siva breza (B. populifolia) i zapadna papirnata breza (B. papyrifera var. commutata).

uma breza

19

Betulinska kiselina je izolirana iz mnogih taksonomski razliitih biljnih rodova. Glavni izvor je drvo breze, Betula spp., koja je primarni izvor C28-alkoholnog prekursora, betulina. Izolacija betulina je prvi put objavljena 1788. god. Betulinska kiselina je povezana sa mnogim biolokim aktivnostima ukljuujui antibakterijsko, antiupalno i antimalarijsko djelovanje, ali najvanije aktivnosti su citotoksina aktivnost protiv razliitih tumora. Znaajna in vivo aktivnost je uoena kod ivotinjskih modela sa ljudskim melanomom, a NCI pomoae u razvoju ovog sredstva za uporabu u klinikim testiranjima.

3. Od ljekovitih biljaka do fitoterapeutskih pripravaka i pojedinanih ljekovitih tvari - metode izolacije i proiavanja

Osim jednostavnih i oblikovanih fitoterapeutskih pripravaka kao smjese aktivnih tvari, dananja istraivanja usmjerena su na izolaciju pojedinanih aktivnih tvari (ili smjesa manjeg broja tvari) iz biljaka ili pripravaka u cilju odreivanja kemijske strukture djelatne tvari, te korelacije bioloke aktivnosti s kemijskom strukturom. Naime, mjeavine s velikim brojem komponenata su neracionalne, te je mogue da djelatna komponenta nije prisutna u dovoljnoj koliini pa izostaje uinak. Izolacija pojedinanih bioloki aktivnih tvari moe predstavljati vie ili manje sloen problem, ovisno o koncentraciji tvari i sloenosti prateih tvari. Prirodni spojevi mogu doprinjeti istraivanju novih ljekova na razliite naine:

djelujui kao novi ljekovi koji se mogu koristiti u nepromijenjenom stanju (npr. vinkristin iz Catharanthus roseus),

20

osiguravajui kemijske graevne elemente (eng. bilding blocks) za sintezu vie kompleksnih molekula,

indicirajui nove naine farmakolokog djelovanja koji omoguavaju potpunu sintezu novih kemijskih analoga.

Prirodni spojevi e se nastaviti smatrati glavnim izvorom novih droga u nadolazeim godinama zbog toga to:

pruaju neusporedljivu strukturnu razliitost mnogi od njih su relativno mali (

21

2. Suvremene strategije:

izolacija i identifikacija vodeih aktivnih komponenti iz prirodnih izvora koja je voena prema biolokim probama (engl. bioassay-guided), uglavnom in vitro,

vie su fokusirane na bioloku aktivnost,

odabir biljaka i organizama na temelju etnofarmakolokih informacija, tradicije, ali i sluajni odabir.

3.1. Inicijalna izolacija tvari iz biljnog materijala

Odabir procudure izolacije ovisi o prirodi biljnog materijala i spojeva koji se izoliraju. Prije odabira metode, potrebno je utvrditi cilj izolacije, koji moe biti:

nepoznata bioaktivna komponenta

poznata komponenta

skupina spojeva koji su strukturno slini svi sekundarni metaboliti prisutni u biljci

Takoer je potrebno potraiti odgovore koji se odnose na oekivane reultate izolacije:

Da li je izolacija spoja za karakterizaciju parcijalna ili potpuna? Koji je potreban stupanj istoe?

Da li je izolacija provedena s ciljem dobivanje dovoljne koliine za potvrdu ili nepotvrdu predloene strukture prethodno izoliranog spoja? potrebne manje koliine!

22

Da li se izolacija provodi za dobivanje dovoljnih koliina za daljne studije, npr. za klinika ispitivanja? potrebne vee koliine!

Tipini inicijalni izolacijski proces za biljne materijale ukljuuje sljedee korake:

suenje i usitnjavanje biljnog materijala (homogenizacija) odabir i primjena prikladne metode izolacije: ekstrakcija, destilacija

ili tijetenje proiavanje ekstrakta (dekantiranje, centrifugiranje, filtriranje) koncentriranje (npr. uparavanjem) i suenje ekstrakata

3.1.1. Metode ekstrakcije - Ekstrakcija je proces odjeljivanja sastavnica iz biljnih droga na temelju razliite topljivosti u otapalu kojim se vri ekstrakcija. Ekstrakcija ukljuuje nekoliko istovremenih procesa:

difuzija otapala u stanice biljnog materijala otapanje metabolita u otapalu difuzija otapala s otopljenim tvarima izvan stanica ispiranje

23

Ekstrakcija se moe olakati usitnjavanjem (tada ekstrakcijski proces ovisi iskljuivo o topljivosti) i poveanjem temperature (pogoduje topljivosti). Uparavanje otapala daje suhi kruti ekstrakt.

Ekstrakti (iscrpine) su koncentrirani pripravci tekue, krute ili guste konzistencije; dobivaju se maceracijom, perkolacijom ili drugim pogodnim validiranim metodama koristei etanol ili drugo prikladno otapalo (prema Europskoj farmakopeji, engl. European Pharmacopeia). Vrste ekstrakata su:

Extracta fluida - tekui ekstrakti (odnos droge i

otapala 1:1)

Extracta sicca - suhi ekstrakti (suhi dio

najmanje 95%)

Extracta spissa gusti ekstrakti (suhi dio

najmanje 70%)

imbenici koji utjeu na ekstrakciju su temperatura, veliina estica, gibanje otapala i pH-vrijednost. Poeljna svojstva otapala za ekstrakciju: selektivnost za spojeve koje se ele ekstrahirati, veliki ekstrakcijski kapacitet, nereaktivnost s biljnim sastavnicama, nekodljivost za ljude i opremu, potpuna hlapljivost i niska cijena. este metode esktrakcije s otapalima se dijele na kontinuirane i nekontinuirane postupke:

24

maceracija (engl. maceration) usitnjeni biljni materijal u pogodnom otapalu u zatvorenoj posudi se ekstrahira na sobnoj temperaturi. Povremeno ili konstantno mijeanje moe poveati brzinu ekstrakcije (maceracija uz mijeanje ili vrtlona maceracija). Nakon ekstrakcije biljni materijal se odvaja dekantiranjem uz filitriranje. Kako bi se osigurala iscrpna ekstrakcija, nakon dekantiranja, moe se dodati svjee otapalo (remacerizacija obino se provodi dva puta zastopno). Stupnjevita maceracija podrazumijeva proces u kojem se pojedine sastavnice (otapala) sredstva za ekstrakciju dodaju postepeno. Digestija je jednokratna maceracija uz povienu temperaturu.

ultrazvuno potpomognuta ekstrakcija (engl. ultrasound assisted extraction, USE) ovo je modificirana maceracija, gdje je ekstrakcija olakana upotrebom ultrazvuka (visoko-frekventni pulsevi, 20 kHz).

25

A

B

C

Aparatura za ultrazvunu ekstrakciju s organskim otapalom: A

ultrazvuna kupelj s vodom, B- Erlenmayerova tikvica s uzorkom i

organskim otapalom, C - povratno hladilo

Biljni materijal se postavlja u posudu koja se postavlja u ultrazvunu kupelj. Ultrazvuk se koristi za mehaniki stres na stanice stvarajui kavitacije u uzorku. Raspadanje stanica poveava topljivost metabolita u otapalu i poboljava ekstrakciju.

perkolacija (engl. percolation) usitnjeni biljni materijal se postavlja u perkolator (cilindrini ili konini kontejner s pipcem na dnu) i namae u otapalu. Dodatno otapalo se zatim dodaje na vrh biljnog materijala i puta da perkolira polako (kapajue) sa dna perkolatora. Fino spraeni biljni materijal moe biti zapreka za perkolaciju. Nadalje, ako materijal nije homogeno distribuiran u kontejneru (ili ako je pakiran suvie gusto) otapalo ne moe doi do cijele povrine materijala i ekstrakcija e biti nepotpuna. Reperkolacija podrazumije perkolaciju u kojoj je vie ekstraktora spojeno u nizu. Evakolacija je

26

kontinuirana ekstrakcija uz primjenu vakuuma, a diakolacija je kontinuirana ekstrakcija uz povien tlak.

Perkolator

ekstrakcija u Soxhletu (engl. Soxhlet extraction, SE) usitnjeni biljni materijal se postavlja u celulozni cilindar u ekstrakcijskoj komori koji se postavlja iznad posude za sakupljanje, a ispod refluksirajueg hladila. Pogodno otapalo se stavi u posudu, te se zagrijava i refluksira. Kada se odreeni volumen otapala sakupi u ekestrakcijskoj komori, sustavom sifona odlazi u posudu. Glavna prednost Soxhleta je kontinuirana ekstrakcija u kojem se otapalo s ekstrahiranim tvarima isprazni u posudu, svjee otapalo se kondenzira i ekstrahira biljni materijal kontinuirano, to ini ovaj proces kraim uz upotrebu manjeg volumena otapala. Mana je u tome to se ekstrakt kontinuirano zagrijava na temperaturu vrenja otapala, to moe dovesti do nastanka termikih artefakata.

27

Soxhletov ekstraktor

Ekstrakcija s otapalom pod tlakom (engl. pressurized solvent extraction) ili tzv. ubrzana ekstrakcija s otapalom zahtjeva vie temperature u odnosu na druge ekstrakcijske metode i visoke tlakove kako bi se otapalo zadralo u tekuem stanju pri visokim temperaturama. Usitnjeni biljni materijal se postavi u posudu koja se postavlja u pe. Otapalo se dovodi iz rezervoara tako da ispunjava posudu koja se zagrijava i tlai programirano zadano vrijeme. Posuda se zatim ispire s plinom duikom, a dobiveni ekstrakt koji se automatski filtrira se sakuplja. Svjee otapalo se koristi za otapanje preostale koliine spojeva. Konano ienje s duikom se provodi do suenja biljnog materijala. Visoke temperature i tlakovi poveavaju prodiranje otapala u materijal i poveavaju topljivost metabolita,

mjesto za celulozni cilindar s uzorkom

28

ubrzavajui ekstrakciji proces i prinos. Budui je nakon ekstrakcije materijal osuen, mogue je vriti ponovljene ekstrakcije s istim otapalom ili sukcesivne ekstrakcije koristei otapala s rastuom polarnosti.

ekstrakcija pod refluksom (engl. extraction under reflux) kod ove ekstrakcije biljni materijal se uranja u otapalo u okrugloj tikvici koja je spojena na kondenzator. Otapalo se zagrijava do vrenja. Kako se otapalo kondenzira, otapalo se reciklira u tikvicu.

ekstrakcija superkritinim fluidima (engl. supercritical fluid extraction, SFE) superkritini fluidi (SCFs) zamjenjuju organska otapala. Kritina toka iste tvari se definira kao najvia temperature i tlak na kojima tvar moe postojati u parno-tekuoj ravnotei. Na temperaturama i tlakovima iznad ove toke nastaje jedan homogen fluid, poznat kao superkritini fluid (engl. supercritical fluid, SCF).

Fazni dijagram za CO2

29

SCF je teak kao tekuina ali ima svojstvo prodiranja kao plin, to mu daje uinkovitost i selektivnost za ekstrakciju. SCF nastaju zagrijavanjem plinova iznad kritine temperature ili komprimiranjem tekuina iznad kritinog tlaka. Promjenom tlaka i temperature mijenja se sposobnost otapanja superkritinog CO2 (visokokomprimirani CO2 (t > tk i p > pk)), bez mijenjanja sastava otapala. Ekstrakcija se obino vri na 40-50 oC i tlaku 200-300 bara.

3.1.2. Metode detilacije - Organske tvari, koje se s vodom ne mijeaju (veina komponenti eterinih ulja), imaju svojstvo isparavanja zajedno s vodenom parom, na temperaturi nioj od njihova vrelita, odnosno nioj od 100 C. Tu injenicu objanjava Daltonov zakon parcijalnih tlakova: tlak para iznad heterogene smjese (smjese dviju ili vie tekuina koje se ne mijeaju) jednak je zbroju parcijalnih tlakova pojedinih komponenti za datu temperaturu, bez obzira na sastav smjese. Dakle, svaka komponenta u takvoj smjesi se ponaa kao ista tekuina. Kako je tlak para iznad takve smjese vei od parcijalnih tlakova pojednih komponenata, on e se izjednaiti s vanjskim tlakom pri nioj temperaturi, odnosno vrelite heterogne smjese bit e nie od vrelita bilo koje od komponentI. Vrste destilacija su:

- destilacije vodenom parom, - vodene destilacije (hidrodestilacije), - vodeno-parne destilacije.

Sve tri metode se zasnivaju na istim teorijskim principima destilacije, a razlika je u primarnom kontaktu biljnog materijala i vode, tj. vodene pare.

30

3.1.2.1. Vodena destilacija (hidrodestilacija) - Ova metoda se najee koristi za izolaciju eterinih ulja, a podrazumijeva postavljanje usitnjenog biljnog materijala u vodu uz zagrijavanje do kljuanja, najee na atmosferskom tlaku. Pare eterinog ulja i vode se kondenziraju u hladilu i sakupljaju. Postoje razliite izvedbe aparatura, a meu ostalima se mogu razlikovati ovisno da li se koriste za izolaciju eterinih ulja lakih ili teih od vode.

Standardne laboratorijske aparature za izolaciju eterinih ulja vodenom destilacijom su: aparatura po Ungeru (1), aparatura prema europskoj farmakopeji (engl. European Pharmacopoeia), aparatura po Clevengeru. Kod aparature po Ungeru biljni materijal se nalazi u vodi u tikvici, eterino ulje destilira zajedno s vodom, te se pare kondenziraju u hladilu, a eterino ulje se sakuplja u sredinjoj cijevi aparature.

Aparatura prema europskoj farmakopeji (C) je slina aparaturi po Ungeru, samo to je oduak smjeten na drugom mjestu aparature.

1

31

Nastavak po Clevengeru za destilaciju eterinih ulja: A za ulja manje gustoe od vode, B za ulja vee gustoe od vode. Na vrh nastavka stavlja se hladilo, a na bonu cijev tikvica s biljnim materijalom i vodom.

3.1.2.2. Vodeno-parna destilacija - Biljni materijal je postavljen na perforiranoj podlozi na odreenoj udaljenosti od dna posude koja je ispunjena vodom (biljni materijal se nalazi neposredno iznad vode). Voda se grije kao i kod vodene destilacije. Zasiena, u ovom sluaju vlana para podie se kroz biljni materijal. Biljni materijal je u kontaktu samo sa parom,

C

32

a ne sa kipuom vodom. Ova metoda se preteito koristi u industriji, a rjee u laboratoriju.

3.1.2.3. Parna destilacija - Vodena para iz generatora pare se uvodi sa dna, a biljni materijal je postavljen na reetku i nije u kontaktu s vodom. Koristi se zasiena ili pregrijana para, najee kod povienih tlakova. Vodena para iznosi eterino ulje iz biljnog materijala u kondenzator gdje se pare kondenziraju, a potom se ulje odjeljuje od vode u separatoru i sakuplja:

Mana ove metode je poveana mogunost stvaranja artefakata-spojeva koji nisu izvorno prisutni u biljci a nastali su zbog termikih degradacijskih reakcija, osobito hidrolize.

3.1.3. Simultana destilacija-ekstrakcija - Likens i Nickerson su 1964. god. su dizajnirali originalnu aparaturu za simultanu destilaciju-ekstrakciju hlapljivih spojeva (engl. simultaneous distillation-extraction, SDE). Uzorak destilira u tikvici na lijevom ogranku aparature. Hlapljivi spojevi

33

destiliraju kroz lijevi ogranak i simultano (istovremeno) pare otapala destiliraju kroz desni ogranak. Pare se kondenziraju u hladilu tzv. cold finger i ekstrakcijski proces poinje izmeu oba tekua filma na kondenzirajuoj povrini. Voda i otapalo se sakupljaju i odvajaju u separatoru, te vraaju u odgovarajue posude. Ova izolacija-koncentracija hlapljivih spojeva omoguuje znaajnu utedu vremena u separacijskom koraku, a zbog kontinuiranog recikliranja omoguuje i utedu volumena koritenog otapala.

Aparatura za simultanu destilaciju-ekstrakciju (Likens-Nickerson).

Danas postoje mnoge modifikacije ove originalne metode koje moguavaju preparativnu izolaciju ili izolaciju na sobnoj temperaturi uz smanjenu mogunost nastanka artefakata.

cold finger

34

3.2. Osnove frakcioniranja ekstrakata - Kruti ekstrakt je smjesa prirodnih spojeva. Mnogi od njih imaju iste molekulske formule, a razliite strukture. Stoga je teko primijeniti jednu separacijsku tehniku za izolaciju individualnih spojeva iz smjese. Ekstrakt se obino inicijalno odjeljuje u razliite frakcije spojeva sa slinom polarnosti ili molekulskom veliinom. Za poetno frakcioniranje ekstrakta nije preporuljivo napraviti veliki broj frakcija budui to moe dispergrirati ciljanu komponentu u velikom broju frakcija. Mnogo bolje je sakupiti nekoliko veih frakcija i koncentrirati se na one koje sadre komponentu od interesa.

3.3. Izolacija istih tvari - Najvaniji imbenik koji se mora razmotriti prije dizajniranja izolacijskog protokola je priroda ciljane komponente u ekstraktu ili frakciji. Openita svojstva molekula koja pomau izolacijskom procesu su topljivost (hidrofilnost ili hidrofobnost), kiselo-bazna svojstva, naboj, stabilnost i molekulska veliina. Ako se izolira poznata komponenta iz istog ili novog prirodnog izvora potrebno je sakupiti literaturne informacije i odabrati najprikladniju metodu. Mnogo je tee dizajnirati izolacijski protokol za kruti ekstrakt koji sadri potpuno nepoznate spojeve. U ovom sluaju poeljno je napraviti kvalitativni test na prisustvo razliitih grupa organskih spojeva npr. fenole, steroide, alkaloide, flavonoide i dr. Priroda ekstrakta takoer moe pomoi u odabiru ispravnog izolacijskog protokola. Razliita fizikalna svojstva ekstrakata mogu se odrediti koristei male porcije krutog ekstrakta u seriji eksperimenata.

35

3.3.1. Kromatografske metode odjeljivanja smjesa

Tvari koje se nalaze u prirodi najee se javljaju u kompleksnim smjesama. Klasine metode odjeljivanja (kristalizacija, sublimacija, ekstrakcija, destilacija) samo donekle mogu rijeiti problem odjeljivanja individualnih komponenti iz smjese. Veina smjesa organskih spojeva je sloena zbog velikog broja spojeva koji esto imaju slina fizikalno-kemijska svojstva ili ak iste molekulske formule, a razliite strukture (izomeri). Zbog navedenog, odjeljivanje komponenti iz smjese moe predstavljati ozbiljan problem.

Naziv kromatografija potjee od ruskog kemiara Tswett-a koji je 1906. god. uveo ovu tehniku za odjeljivanje biljnih boja. Kasnije se ime prenijelo na sve postupke odjeljivanja kod kojih se komponente smjese razdjeljuju izmeu stacionarne i mobilne faze. Keulemans je dao openitu definiciju za ovu tehniku: Kromatografija je fizikalna metoda odjeljivanja kojom se komponente

razdjeljuju izmeu dvaju faza; jedna je stacionarna s velikom povrinom, a druga je mobilna.

Stacionarna faza moe biti krutina ili kapljevina, a mobilna kapljevina ili plin. Mobilna faza putuje preko ili uzdu stacionarne faze utjecajem kapilarnih sila, sile tee, razlike tlakova i sl. Kromatografski proces se

temelji na uspostavljanju dinamike ravnotee nekog spoja izmeu stacionarne i mobilne faze: u stacionarnoj fazi nalazi se dio tvari koji je u ravnotei s dijelom u mobilnoj fazi. Zbog gibanja mobilne faze naruava se ravnotea i molekule putuju u smjeru gibanja mobilne faze. Zbog specifine interakcije razliitih spojeva sa stacionarnom i mobilnom fazom, razliiti spojevi putuju razliitim brzinama i tako se odjeljuju. Sam proces

36

odjeljivanja zasniva se na slijedeim naelima: adsorpciji, razdjeljenju, difuziji, ionskoj izmjeni i dr. Velika mo razluivanja kromatografskim metodama zasniva se na pojavi uzastopnog ponavljanja primarnog postupka razdjeljivanja neke tvari izmeu mobilne i stacionarne faze. Budui se uspostavljanje ravnotee neprestano ponavlja, to i male razlike u razdjeljivanju izmeu stacionarne i mobilne faze dovode do dobrog odjeljivanja tvari. Prema agregatnom stanju stacionarne i mobilne faze, nainu izvedbe, kao i prema fizikalno-kemijskim procesima tijekom razdvajanja razlikujemo slijedee vrste kromatografije:

adsorpcijska kromatografija - stacionarna faza je kruti adsorbens, a mobilna faza moe biti kapljevina ili plin (tekuinska adsorpcijska kromatografija (LSC, engl. Liquid Solid Chromatography) i plinska adsorpcijska kromatografija (GSC, engl. Gas Solid Chromatography))

razdjelna kromatografija - stacionarna faza je kapljevina vezana za sorbens ili fino zrnatu inertnu krutinu, a mobilna kapljevina ili inertni plin (tekuinska razdjelna kromatografija (LLC, engl. Liquid Liquid Chromatography) i plinska razdjelna kromatografija (GLC, engl. Gas Liquid Chromatography)

adsorpcija razdjeljivanje

37

plin GC plinska kromatografija

Mobilna faza kapljevina LC tekuinska

kromatografija

Stacionarna krutina

faza GSC LSC adsorpcijska kromatografija kapljevina GLC LLC razdjelna kromatografija

Razliite vrste adsorpcijske i razdjelne kromatografije

Shematski prikaz tekuinske adsorpcijske kromatografije (LSC)

38

ionsko-izmjenjivaka kromatografija - temelji se na interakciji naboja izmeu molekula uzorka i naboja stacionarne faze. Ionsko-izmjenjivaka smola je stacionarna faza (npr. smola koja sadri benzensulfonske grupe moe na sebe vezati proteine sa suprotnim nabojem od naboja funkcijske skupine na smoli). Eluiranje se postie ponitavanjem ionskih interakcija promjenom ionske jakosti ili promjenom pH proteina.

afinitetna kromatografija - se zasniva na sposobnosti proteina da veu odreene male molekule supstrata (liganda).

39

Molekula supstrata (liganda) odabranog enzima se vee kovalentno za odreeni nosa (stacionarna faza), koji se stavi u kolonu. Tako se iz proteinske otopine koja se proputa kroz kolonu na ligand na stacionarnoj fazi vee eljeni protein (crveni na slici). Dodavanjem otopine liganda (plavo na slici) protein (crveni) se vee na slobodni ligand i odlazi iz kolone.

kromatografija iskljuenjem - stacionarna faza je polisaharidni gel koji djeluje kao molekulsko sito. Unutar estica gela nalaze se vodom ispunjene upljine u koje mogu prodrijeti samo male molekule i one srednje veliine, a velike su iskljuene. Kada se gel ispire otapalima, molekule koje su prodrle u upljine difuzijom opet mogu izai., ali sporije od ostalih molekula.

40

4. SPOJEVI S PROTUTUMORSKIM DJELOVANJEM IZ BILJNIH IZVORA I NJIHOVI DERIVATI U PREDKLINIKIM I KLINIKIM ISTRAIVANJIMA

Prije upoznavanja kemijskih struktura prirodnih spojeva (i njihovih derivata) s protutumorskim djelovanjem, potrebno se osvrnuti na osnovne stereokemijske karakteristike organskih spojeva iz kojih esto proizlazi njihovo bioloko djelovanje. Takoer treba se prisjetiti da razliiti organski spojevi istih molekulskih formula - izomeri se dijele na strukturne (konstitucijske) izomere i stereoizomere, to moe predstavljati problem za potpunu identifikaciju nekog spoja.

41

4.1. Optika aktivnost i kiralnost organskih spojeva - Optika aktivnost je sposobnost zakretanja ravnine polariziranog svjetla organskih spojeva u otopini (J.-B. Biott, 1815. god.)

Za objanjenje kiralnosti potrebni je prouiti simetriju molekule. Simetrija objekta i molekule se opisuje elementima simetrije (zrcalne osi, sredite i ravnine simetrije) koji povezuju ekvivalentne dijelove, a s obzirom na elemente simetrije razlikuju se slijedei pojmovi:

kiralno - (gr. cheir = ruka) geometrijsko svojstvo nemogunosti preklapanja sa svojom zrcalnom slikom zbog asimetrije - odsutnosti elemenata simetrije (L. Kelvin i W. H. Thompson, 1883. god.); kiralne molekule - optiki aktivne (kiralnost nuan ali ne i dostatan uvijet za optiku aktivnost spoja!)

akiralno - (odsustvo kiralnosti) posjeduje najmanje jedan element simetrije; akiralne molekule - optiki neaktivne

42

Postojanje kiralnog sredita (sredita asimetrije) je uvjet za optiku aktivnost molekule; najee je to asimetrian ugljikov atom kiralni ugljik (ugljik povezan sa etiri razliita atoma ili skupine). Sedite kiralnosti osim atoma moe biti molekulska podstruktura (npr. prsten) ili pak itava molekula (npr. lijeva i desna DNA uzvojnica).

Apsolutna konfiguracija kiralnog sredita predstavlja prostorni raspored etiri skupine vezane za kiralno sredite, a odreuje se prema CIP (Cahn-Ingold-Prelog) - sustavu tj. pravilu sekvence:

1. skupine vezane za kiralno sredite oznaavaju se 1-4, gdje je skupina 1 najvieg, a 4 najnieg prioriteta (skupina je prioritetnija to je masa atoma neposredno vezanog za kiralno sredite vea)

2. molekula se zatim promatra u smjeru kiralno sredite 4 (suprotna strana od skupine najnieg prioriteta)

3. ako su preostali supstituenti 1-3 smjeteni u smjeru kazaljke na satu tada je to R-konfiguracija, a kada se radi o suprotnom smjeru od kazaljke na satu rije je o S-konfiguraciji.

(R)-butan-2-ol (S)-butan-2-ol

Iz razlike u konfiguraciji molekule proizlazi zrcalnosimetrian odnos (kao predmet i slika u zrcalu) kod enantiomera (vrsta stereoizomera spojevi iste molekularne formule, a razliitog prostornog rasporeda atoma u molekuli).

C

OH

H CH3C2H5

C

OH

HH3CC2H5

1

2

3

4

1

2

34

43

Enantiomeri su kiralne molekule u zrcalnom odnosu, a koje se uzajamno ne mogu preklopiti - lanovi enantiomernog para zakreu ravninu polariziranog svjetla za jednaki kut, ali u suprotnim smjerovima (oznaavaju se sa (+) i (-)). Enantiomeri s vie sredita kiralnosti se razlikuju po apsolutnoj konfiguraciji svih sredita kiralnosti. Fizika svojstva su im obino identina (Tt, Tv, gustoa) osim kuta zakretanja polariziranog svjetla. Mogu se razlikovati po biolokoj aktivnosti ili mirisu. Dijastereomeri su stereoizomeri koji koji se ne odnose kao predmet i njegova zrcalna slika. Dijastereomeri s vie sredita kiralnosti se razlikuju u konfiguraciji jednog ili vie, ali ne i svih sredita kiralnosti (nisu u zrcalnom odnosu), imaju razliita fizikalna i kemijska svojstva (mogu se meusobno odijeliti separacijskim tehnikama).

Racemat je smjesa jednakih koliina dva enantiomera (npr. (+)-butan-2-ol i (-)-butan-2-ol) koja ne pokazuje optiku aktivnost, budui da svaki enantiomer zakree ravninu polariziranog svjetla za isti iznos, ali u suprotnim smjerovima; oznaava se (); npr. ()-butan-2-ol.

Prirodni spojevi koji se upotrebljavaju kao ljekovite tvari dolaze najee u obliku samog jednog enantiomera. Djelovanje drugog enantiomera najee nije istraeno, pa se nezna da li je ono bolje ili slabije od prirodnog enantiomera. Tijekom izolacije prirodnih spojeva moe doi do racemizacije (oprez!)

Openito se smatra da racemini i enantiomerno isti spojevi u prirodi nastaju reakcijama koje kataliziraju enantioselektivni katalizatori (enzimi). Porijeklo kiralnih biokatalizatora i njihovih graevnih podjedinica (kiralnih aminokiselina) do danas nije razjanjeno.

44

4.2. Stereokemijske osnove djelovanja fitospojeva - Stereokemija je grana kemije koja se bavi prostornom graom molekula (statika stereokemija) i prostornim odvijanjem kemijskih reakcija (dinamika stereokemija) koje su neobino vane kod djelovanja lijekova. Enantiomeri kiralnog ljeka mogu se znatno razlikovati po svojim farmakodinamikim i farmakokinetikim svojstvima. Te se pojave mogu pripisati kiralnosti receptora. E. J. Arins je podijelio enantiomere prema njihovom farmakolokom djelovanju na: eutomer (gr. e - dobro) - enantiomer s veim afinitetom prema

receptoru, bolje farmakoloko djelovanje distomer (gr. dys - loe) - enantiomer s manjim afinitetom prema

receptoru, tj. sa slabijim farmakolokim djelovanjem

Uzajamno djelovanje lijeka i receptora temelji se na slijedeim interakcijama: elektrostatskim interakcijama - privlaenje ili odbijanje pozitivnih i

negativnih naboja na molekulama (npr. vodikova veza) sterikim (prostornim) Van der Waalsovim interakcijama, a interakcija

lijeka i receptora je najee stereoselektivna!! hidrofobnim djelovanjima - interakcija s otapalom.

Enantiomeri kiralnih ljekovitih tvari ne razlikuju se po kemijskim i fizikalnim svojstvima u akiralnom mediju, ali se esto razlikuju u farmakodinamikim i farmakokinetikim svojstvima jer su molekule s kojima dolaze u interakciju i same kiralne. Kiralnost lijeka utjee na sve faze njegovog djelovanja:

45

1. izlaganje (ekspozicija) - utjecaj afiniteta lijeka za receptore, djelotvornost metabolita, specifinost tkiva

2. farmakokinetika faza - obuhvaa apsorpciju, distribuciju, metabolizam i izluivanje lijeka iz organizma. Ti su fizioloki procesi stereoselektivni, a enantiomeri se mogu razlikovati po jaini djelovanja, farmakokinetikom profilu i dr.

3. farmakodinamika faza - interakcija bioaktivne tvari i specifinog receptora u ciljnom tkivu to uzrokuje krajnji farmakoloki uinak

Kiralni lijekovi se prema djelovanju svojih enantiomera (koje ukljuuje tri spomenute faze) mogu podijeliti na:

ukupna farmakoloka aktivnost lijeka proizlazi iz djelovanja samo jednog enantiomera NAJEE!!

enantiomeri lijekova djeluju podjednako (kvalitativno i kvantitativno) farmakoloko djelovanje enantiomera slino je u kvalitativnom

smislu, ali kvantitativno razliito

Uinkovito i prihvatljivo preventivno ili antikancerogeno sredstvo mora imati slijedea svojstva: bez toksinog uinka na zdrave stanice, visoku uinkovitost protiv vie tumora, mogunost oralnog uzimanja, poznat mehanizam djelovanja i malu cijenu. Klinika procjena uinkovitosti antikancerogenog spoja ukljuuje viestupanjski proces:

faza I: identifikacija optimalnog antikancerogenog spoja, faza II: demonstracija uinkovitosti na ljudima preko modulacije

tkiva, biokemijskih i molekulskih surogata, faza III: smanjenje rizika tumora na velikim skupinama ljudi.

Odabrani antikancerogeni lijekovi biljnog porijekla u klinikoj uporabi su:

46

Aktivna tvar i naziv lijeka Porijeklo

Terapeutska uporaba

Mehanizam djelovanja

Kamptotecin (engl.

Camptothecine) Camptotheca

acuminata

kliniki se koristi u Kini za

gastrointestinalne tumore

poboljava vezivanje

topoizomeraze I na DNA i tako promovira

cijepanje sastavnih dijelova

Docetaksel (engl. Docetaxel)

Taxotere Taxus baccata

za tretiranje tumora dojke,

debelog crijeva i bronhija

vezanje za tubulin podjedinicu i stabilizacija mikrotubula

Etopozid (engl. Etoposide)

Eposin Etopofos Exitop Vepesid

polusintetski derivat

podofilotoksina iz Podophyllum

sp.

leukemija, Hodgkinova

bolest, i tumor testisa

inhibitor DNA topoizomeraze II

Irinotekan Campto

polusintetski derivat

kamptotecina

colorectal karcinom

inhibitor DNA topoizomeraze I

Krizantaspas (engl.

Krisantaspas) Erwinase

Erwinia chrysanthemi Sve

inhibicija malignih asparagin-ovisnih

stanica

Paklitaksel (engl. Paclitaxel)

Taxol Taxus brevifolia

i T. cuspidata karcinom dojke i

metastazni NSCLC

vezanje za tubulin podjedinicu i stabilizacija mikrotubula

Tenipozid (engl. Teniposide)

Vumon slian etopozidu

koristi se u kombiniranoj

terapiji inhibitor DNA

topoizomeraze II

Topotekan (engl. Topotecan)

Hycamtin

derivat kamptotecina s poboljanom

vodotopljivost

karcinom debelog crijeva

inhibitor DNA topoizomeraze I

47

Vinblastin (engl.

Vinblastine) Velbe

alakloid iz Vinca rosea

Hodgkinova bolest i karcinom

antimitotik - inhibicija stanine

mitoze

Vinkristin (engl. Vincristine)

Oncovin Vincristine

alakloid iz Vinca rosea

leukemija, SCLC i maligni limfoni antimitotik

Vinorelbin (engl.

Vinorelbine) Navelbine

polusintetski derivat

vinblastina NSCLC i

karcinom dojke

antimitotik - inhibicija

polimerizacije tubulina

4.3. Odabrane stukture protutumorskih fitospojeva i derivata

4.3.1. Kamptotecin i sintetski derivati - Otkrie kamptotecina, engl. camptothecin (CPT), kao antikancerogenog spoja (1960. tih) sa jedinstvenim nainom djelovanja (inhibicija DNA topoizomeraze I) dalo je novu smjernicu u kemoterapiji. Ovaj prirodni alkaloid prvo je ekstrahiran iz razliitih biljnih dijelova kineskog drva Camptotheca acuminate, a kasnije i iz Ophiorrhiza pumila te Mapia foetida. Pokazuje antikancerogenu aktivnost na tumor debelog crijeva i pankreasa, te je odobren od US Food and Drug Administration 1970-tih god. za tretiranje tumora debelog crijeva, te za daljnja istraivanja na drugim ljudskim tumorima. Iako CPT pokazuje snanu antitumorsku aktivnost, takoer je uzrokovao nepredviene i ozbiljne popratne uinke kao to su povraanje, proljev, krvarenje i upalu mjehura i dr., to je prouzrokovalo obustavom istraivanja. 1972. god.

Meutim, istraivanja sintetskih derivata CTP-a su se nastavila, tako se trenutano prva generacija CPT derivata (topotekan, engl. topotecan i irinotekan, engl. irinotecan) koristi za tretiranje tumora debelog crijeva, a

48

drugi derivati pokazuju antikancerogenu aktivnost u jetri, prostati, dojkama i dr.

N

N

O

O

OOH

A B C

D

E20

Odnosi strukture i aktivnosti: Prstenovi A-D su osnovni za in vitro i in vivo antitumorsku aktivnost, kao i -hidroksi laktonski prsten E. Konformacija C-20 je presudna za bolju aktivnost, budui je 20 (S) izomer 10-100 puta aktivniji od 20 (R) izomera. Modifikacije prstena A i B mogu rezultirati jo boljom aktivnosti CPT-a. Jedan od nedostataka CPT analoga u klinikim istraivanjima je i gubitak terapeutske aktivnosti zbog brze hidrolize laktonskog prstena u organizmu.

Mehanizam djelovanja: Ranih 1970-tih god. poetne studije djelovanja CPT-a sugerirale su kako citotoksinost moe biti posljedica inhibicije DNA topoizomeraze I. Takoer, ova istraivanja su sugerirala da je CPT selektivno citotoksian na S-fazu stanica, zaustavlja stanice u G-2 fazi, te uzrokuje fragmentaciju kromosomske DNA.

Sintetski derivati CTP-a - Zbog toksinosti CPT-a pripravljaju se derivati sa slijedeim modifikacijama:

Modifikacije A i B prstena najuspjeniji derivati CTP-a. Tako su vodotopljivi derivati topotekan (engl. topotecan) i irinotekan (engl. irinotecan) jedini odobreni derivati CTP-a za kliniku uporabu.

49

Pripravljeni derivati su inhibirali DNA topoizomerazu I sa slinom ili boljom aktivnosti od CTP-a.

N

N

O

O

OOH

HO

CH2N

topotekan

N

N

O

O

OOH

C2H5

N C

O

N O

irinotekan

Modifikacije C i D prstena uglavnom su vodile gubitku citotoksinosti.

Modifikacije E prstena obino reduciraju ili ponitavaju aktivnost CTP-a.

Derivati CTP ostaju i dalje predmet organskih sinteza, kao i studije interakcija CTP-DNA-topoizomeraza I, koje mogu dati smjernice za sintezu novih CTP derivata.

50

4.3.2. Vinca alkaloidi - Vinblastin (engl. vinblastine) i vinkristin (engl. vincristine) su alkaloidi pronaeni u Catharanthus roseus (prijanja klasifikacija Vinca rosea). Zajedno sa polusintetskim derivatima vindezinom i vinorelbinom djeluju kao inhibirori mitoze (diobe stanice) u metafazi. Popratni uinci ukljuuju gubitak kose, proljev, snienje broja krvnih stanica, glavabolju i dr.

Vinblastin se uglavnom koristi za tretiranje Hodgkinsove bolesti, uznapredovalog tumora testisa i dojki, Kaposi sarkoma i dr. Takoer, izgleda da djeluje na tumore interferirajui sa

metabolizmom glutaminske kiseline (specifino, putova koji vode iz glutaminske kiseline do Krebsovog ciklusa i nastanka uree).

Vinkristin se koristi za tretiranje leukemije, Hodgkinsove bolesti i dr.

Vindezin se koristi za tretiranje melanoma i tumora plua i dr.

51

Vinorelbin je trenutno u fazi II klinikih istraivanja za tretiranje tumora debelog crijeva. Za sada vinorelbin izgleda da pokazuje iroki spektar antitumorske aktivnosti u odnosu na druge vinca alkaloide.

Mehanizam djelovanja: Vinblastin i njegovi polusintetski derivati vindezin i vinorelbin djeluju tako da inhibiraju mitozu (podjelu stanica) u metafazi. Ovi alkaloidi se veu za tubulin i tako sprijeavaju stvaranje niti diobenog vretena koje su potrebne za diobu stanice (slino djelovanju colchicina, ali razliito od djelovanja paklitaksela, koji interferira sa diobom stanica tako to odrava niti diobenog vretena od cijepanja). Ovi alkaloidi takoer izgleda da interferiraju sa sposobnou sinteze DNA i RNA.

4.3.3. Taksol i sintetski derivati - Taksol je kompleksni terpen izoliran iz Taxus brevifolia kasnih 1960-tih god. Kasnije je izoliran i iz drugih Taxus vrsta u kojima je pronaeno vie od 300 razliitih taksoida. Odobren je 1992. god. od US Food and Drug Administration za tretiranje tumora debelog crijeva, metastatinih tumora dojki i plua, te Kaposi sarkoma. Glavni nedostatak taksola je slaba bioraspoloivost, zbog slabe vodotopljivosti. Taksol se tolerira na receptorima bolje od bilo kojeg

52

antikancerogenog spoja, ali pokazuje i pratee uinke (smanjenje bijelih krvnih zrnaca). Danas je poznat taksoter, engl. taxotere, kao polusintetski derivat taksola sa boljim antitumorskim djelovanjem.

OAcO

OH

HO

O

H

AcO

O

O

Ph

OH

NHPh

O

A B C

D

1'2'3'

7

taksol

Odnosi strukture i aktivnosti: C-13 boni lanac je nuno potreban za antitumorsku aktivnost taksola, kao i C-2' hidroksil (kada se zatiti aktivnost se reducira). C-3' arilna skupina je kritina (Ph = benzen) Zamjena C-3' vezanog duika s kisikom je prihvatljiva bez znaajnijeg gubitka aktivnosti. Apsolutna konfiguracija na C-2' i C-3' ima dramatian utjecaj na aktivnost. Izomer (2'R,3'S) je znaajno manje aktivan od prirodnog (2'R,3'S) izomera, ali (2'S,3'S) i (2'R,3'R) izomeri pokazuju slinu aktivnost s prirodnim izomerom. C-13 boni lanac taksola se vjerojatno orijentira pomou vodikovih veza, te moe pristati na hidrofobno mjesto vezanja taksola, to stabilizira interakcije s tubulinom.

Mehanizam djelovanja: Taksol posjeduje jedinstven mehanizam djelovanja. Djeluje kao mikrotubulin stabilizator, dok drugi antitumorski spojevi destabiliziraju ovaj proces.

C-13

C-2'

C-3'

53

Sintetski derivati taksola: taksoter, engl. taxotere je strukturni analog taksola, te pokazuje

bolju antitumorsku aktivnost od taksola. Takoer pokazuje bolja farmakoloka svojstva kao to je poboljana vodotopljivost.

vodotopljivi derivati taksola derivati na C-7, C-2 ili oba hidroksila su sintetizirani, ukljuujui soli i dr. Nedavno je pripravljen izotaksel, eng. Isotaxel koji je 1800 puta vodotopljiviji od taksola.. pretvara se u aktivnu molekulu taksol u organizmu.

4.3.4. Podofilotoksin - Podofilotoksin (engl. podophyllotoxin, PDT) je dobro poznati prirodni lignan koji je prvo izoliran iz Podophyllum peltatum Linnaeus, a ksnije i iz drugih vrsta kao P. emodi Wall i P. pleianthum. Osi toga, pronaem je i 4-deoksipodofilotoksin (engl. 4-deoxypodophyllotoxin) u Anthiscus sylvestris i Pulsatilla koreana. PDT je uinkovit u tretmanu razliitih genitalnih tumora, non-Hodgkin tumora, te drugih limfoma i raka plua i dr.. Zbog popratnih uinaka kao to su proljev, oteivanje zdravih stanica i dr. PDT kao takav se ne koristi kao lijek, ve se provode njegove strukturne modifikacije kako bi se dobili potentiniji i manje toksini

54

antikancerogeni spojevi. Dva polusintetska derivata PDT-a, etopozid (engl. etoposide) i tenipozid (engl. teniposide) se koriste u kemoterapiji razliitih tumora.

PDT sadri pet prstena (A-E). Prstenovi A i E su osnovni za aktivnost. D-prsten u laktonskom obliku je preferiran za bolju aktivnost.

O

O

O

O

OCH3

H3CO OCH3

OH

A B C D

E

O

O

O

O

OCH3

H3CO OCH3

R

podofilotoksin derivat podofilotoksina

Mehanizam djelovanja: PDT djeluje kao inhibitor skupine mikrotubula i zaustavlja stanini ciklus u metafazi. PDT lignani blokiraju katalitiku aktivnost DNA topoizomeraze stabiliziranjem cijepanja enzim-DNA kompleksa u kojem se DNA cijepa i kovalentno vee za enzim. Kemijske modifikacije PDT-a su dovele do do promjene mehanizma djelovanja: inhibicija stvaranja mikrotubula ili inhibicija DNA topoizomeraze II.

Sintetski derivati podofilotoksina - modifikacije prstena C: najee na poziciji C-4, te je uoeno da prisustvo velikih skupina poveava citotoksinost te inhibiciju topoizomeraze.