Preparación de muestras: Simplificando la Extracción en ... · ©2015 Waters Corporation 3 Agenda Introducción – Tendencias de la Industria en Preparación de Muestras Simplificando

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Preparación de muestras:

Simplificando la Extracción en Fase Sólida

Xavier Rodríguez Piró


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La presentación durará unos 45 minutos. Al final habrá tiempo para comentar alguna pregunta


Agenda

Introducción – Tendencias de la Industria en Preparación de Muestras

Simplificando la Extracción en Fase Sólida (EFS) – Introducción a “Simple Prep”

Comparativas utilizando la estrategia “Simple Prep”

Conclusiones


Retos actuales de la Industria

Retos empresariales

– Aumentar los beneficios – Disminuir los costes – Maximizar el uso de los

recursos

Retos científicos

– Hacer más con menos – Muestras/analitos diversos – Dar resultados más

rápidamente

Necesidades de los laboratorios hoy en día…

¿Cómo afrontar estas necesidades?

vs.


Comparativa de distintas Técnicas de Preparación de Muestra

Menor Mayor Sensibilidad

Precipitación de proteínas

Extracción Líquido / Líquido

Extracción Líquida en soporte

sólido (SLE)

Extracción en Fase Sólida

(EFS)

Más rápida Más limpia Preparación de Muestra


Técnicas de Preparación de Muestra: Motivos para su elección



Extracción Líquida en

soporte sólido (SLE)

Extracción en Fase Solida

(EFS)

Opción simple

Económica

Rápida

Reduce la complejidad de la

muestra

“Suficiente”


Técnicas de Preparación de Muestra: Percepciones



Extracción líquida en



(EFS)

La Precipitación de Proteínas es “Simple”

La percepción de LLE & SLE es

que son técnicas “Simples”

La percepción de la EFS es que es

una técnica “Compleja”


Técnicas de Preparación de Muestra: Percepciones



Extracción líquida en



(EFS)

La Precipitación de Proteínas es “Simple”

La percepción de LLE & SLE es

que son técnicas “Simples”

La percepción de la EFS es que es

una técnica “Compleja”


Técnicas de Preparación de Muestra: Un nuevo enfoque



Extracción Líquida en



(EFS)

La EFS es percibida como una técnica “Compleja”:

Demasiadas etapas

Múltiples sorbentes disponibles Necesidad de desarrollar el

método

¿Podemos simplificar el proceso?


Historia – Simplificando la EFS

Desde 1996, Waters ha intentado simplificar el proceso de preparación de muestra mediante EFS con sorbentes y protocolos genéricos – Oasis HLB: introducido en el mercado en 1996 como el primer

sorbente de EFS polimérico y humectable – Sorbente de referencia en preparación de muestra durante los

últimos 18 años – Técnica de preparación de muestra de elección para análisis

por LC-MS por la limpieza de sus extractos y su carácter genérico.

– Tecnología de EFS conocida – Protocolo genérico con 5 etapas


Hydrophilic-Lipophilic Balanced Copolymer

Sorbentes Oasis: HLB

• Humectable • Retención de polares • Estable a todos los pH’s (1-14) • Sin interacciones con silanoles • Area superficial específica elevada (810 m2/g) • Recuperaciones elevadas para ácidos, bases y neutros

Monomero Hidrofílico

Monomero Lipofílico

N O

Retención por Fase Inversa Retención de Polares


Oasis HLB: Importancia de la humectabilidad

Procainamide

Acetaminophen (polar) Ranitidine

Propranolol Doxepin

% S

PE

Rec

over

y

En sorbentes no humectables el secado de los poros tiene como resultado la no retención de los analitos en el paso de carga recuperaciones bajas e irreproducibles Con Oasis el secado del sorbente no impacta las recuperaciones

C18 (1cc/100mg) HLB (1cc/30mg)

0

20

40

60

80

100

0 4 8 Drying Time (minutes)

0

20

40

60

80

100

0 5 10 Drying Time (minutes)

Acetaminophen (Polar)

• Sorbente acondicionado con MeOH • Equilibrado con agua • Secado durante tiempos distintos • Carga de la muestra • Elución


Oasis HLB Protocolo Genérico

Preparar la muestra

Acondicionar/Equilibrar 1 mL metanol, 1 mL agua

Carga de la muestra

Lavar 1 mL 5% metanol/agua

Eluir 1 mL metanol

Evaporar, Reconstituir

Oasis® HLB Protocolo EFS

Condiciones para cartuchos de 1 cc 30 mg


¿Cómo se comportan otros sorbentes poliméricos de EFS?


Recuperaciones (4 réplicas) Comparativa

Competitor S Competitor S-X Competitor P Oasis HLB


Historia – Simplificando la EFS

Introducción de los sorbentes de modo mixto: Fase inversa e intercambio iónico – Simplificar los métodos de preparación de muestra complejos con

protocolos genéricos – 2 Protocolos para 4 sorbentes: estrategia de 2x4

Introducción de Ostro: preparación de muestras en modo pass-

through …


Simplificando la EFS: preparación de muestra en modo pass-through

Cargar la muestra

Analitos de interés

Retención de fosfolípidos Sorbente

Ostro

Retención de Proteínas

Los analitos pasan (pass-through) pero no lo hacen las proteínas y los fosfolípidos


¿Qué es Ostro?

Ostro es una producto para la preparación de muestra diseñado para eliminar las proteínas y los fosfolípidos presentes en la muestra gracias a una combinación de filtración e interaccción con el sorbente

Beneficios: – Muestras más limpias en menos tiempo – Protocolo sencillo y genérico que elimina la necesidad de desarrollo

de métodos

Ostro proporciona métodos consistentes, robustos y rápidos utilizando un protocolo simple y fácil de implementar

Matrices y campos típicos de aplicación: – Suero, plasma, sangre total, leche, tejidos y otras matrices que

contengan proteínas y lípidos – Toxicología, Clínica, Bioanálisis, Alimentación, Medio Ambiente etc.


Ostro: Campos de aplicación y pretratamiento según matrices

Clínica / Toxicología sangre total

• Sangre total: lísis con

Sulfato de Zinc

Bioanálisis / Clínica Plasma/Suero

• No necesario

Alimentación Leche/Tejido

• Extracción con

acetonitrilo


Ostro: ¿Cómo funciona?

Clinica / Toxicología sangre total/plasma

• Sangre total: lísis con

Sulfato de Zinc

Bioanálisis Plasma/Suero

• No necesario

Alimentación Leche/Tejido

• Extracción con

acetonitrilo Cargar la muestra

Añadir solvente

Mezclar

Analitos pasan

Colectar & Inyectar

Los analitos pasan (pass-through) pero no lo hacen las proteínas, los fosfolípidos y el material particulado


Ostro en Toxicología: Análisis de opiáceos en sangre total

Los laboratorios de toxicología-forense requieren a menudo analizar drogas en sangre total

Muchas estrategias de preparación de muesta se han usado para el análisis de sangre total

Ostro representa una alternativa simple que permite realizar todo el proceso en los pocillos de la placa


Ostro en Toxicología: Protocolo de preparación de muestra

Añadir 150 μL de solución 0.1 M ZnSO4 /0.1 M NH4CH3COOH

Añadir 50 µL of sangre total

Mezclar (para lisar las células)

Añadir 600 µL de ACN

Vortex

Pass through (vacío o presión positiva)

Evaporar (N2)

Reconstituir con 50 µL de 0.1% ácido fórmico en 2% acetonitrilo

Analizar


Ostro en Toxicología: Recuperaciones de opiáceos en sangre total

Ostro proporciona recuperaciones reproducibles

Recuperaciones medias en sangre total (n=4)


Removal of phospholipids from whole milk using Ostro

Ostro en Alimentación: análisis de drogas veterinarias en leche


Agenda




Conclusiones


Introducción a “SIMPLE PREP”

¡ Convierta la preparación de muestra en algo rápido y sencillo !

Sigamos con algo más de información básica…


Formatos de Oasis:

Carga típica: 250-1000 µL de muestra no diluida

Volumen de elución mínimo: alrededor de 200 µL

Evaporación y reconstitución necesarias para concentrar

Carga típica: 25-375 μL de muestra no diluida (=50-750 µL de muestra diluida)

Volumen de elución mínimo: 25 μL

Evaporación y reconstitución no necesarias para concentrar

Placa convencional Placa µElution

Carga típica: 0,5-1000 mL de muestra

Volumen de elución mínimo: alrededor de 0,5 mL

Evaporación y reconstitución necesarias para concentrar

Cartuchos


Placa Oasis µElution

Diseñada para la limpieza y la concentración en fluidos biológicos

Contiene 2 mg/pocillo de sorbente Oasis para la extraccíón de una amplia gama de compuestos ácidos, básicos y neutros

Ideal para aquellos usuarios con volumenes de muestra reducidos (< 200 µL)

Permite la elución con <50 µL, pudiendo concentrar hasta 15 veces los analitos sin evaporación ni reconstitución

Compatible con la mayoría de sistemas robóticos de manejo de líquidos de alto rendimiento, tanto por vacío como por presión positiva

Uniendo el diseño específico de la placa con las excelentes propiedades del sorbente Oasis HLB podemos llevar la EFS a un nuevo nivel de simplicidad, no posible en la inmensa mayoría de otros sorbentes/formatos: – Protocolo con 3 únicos pasos: Carga-Lavado-Elución – Sin necesidad de Acondicionar y Equilibrar ni de Evaporar y

Reconstituir

Diseño Patentado

Compatible con el diseño estándard

ANSI


Protocolo EFS estándard con µElution

Acondicionar • 200 µL Metanol (MeOH)

Equilibrar • 200 µL H2O

Lavado • 200 µL 5% MeOH en H2O

Elución • 25 µL*2 MeOH

Carga

• 200 µL plasma diluido y dopado (100 µL plasma + 100µL 4% H3PO4)

100 µL Plasma 5 µg/mL

Eluato 10 µg/mL

A menudo para la elución en µElution se utiliza la mezcla ACN:MeOH (6:4)


Protocolo EFS estándard con µElution

Eliminacion de estos pasos Acondicionar

• 200 µL Metanol (MeOH)

Equilibrar • 200 µL H2O



Carga



Comparativa de protocolos Oasis µElution: Estándard vs. Simplificado

Acondicionar

Equilibrar



Carga


• 200 µL Metanol (MeOH)

• 200 µL H2O

• 200 µL 5% MeOH en H2O

• 25 µL*2 MeOH


Inyección directa del eluato Evaluación de recuperaciones, variabilidad, efecto matriz y limpieza del extracto

Estándard Simplificado


Agenda




Conclusiones


Evaluación del Protocolo Simplificado

Comparar los protocolos estándard y simplificado – Recuperaciones, Efecto Matriz y limpieza del extracto

Validación del protocolo simplificado – Reproducibilidad lote a lote (años 2005 -2013) – Capacidad de carga de plasma

Comparitivas: – Otras matrices: orina – Otros formatos: placas de 10mg y cartuchos de 30mg – Otros sorbentes: Oasis HLB vs. sorbentes C18 de base sílice y

poliméricos

Resumen


Condiciones LC de las pruebas

Instrumento ACQUITY UPLC I class - Xevo TQ-S

Columna UPLC 1.7 µm CSH C18, 2.1 x 100mm Temperatura Columna 40°C Temperatura Muestra 10°C

Tiempo de cromatograma (Caudal) 7 minutes (0.5 mL/min)

Fase Móvil A: Agua con 0.1% ácido fórmico Fase Móvil B: ACN con 0.1% ácido fórmico

Solventes de limpieza (Strong y Weak)

70/30 ACN/agua con 2% ácido fórmico

Seal wash 10% MeOH Detección MS: Xevo TQ-S

Condiciones MS ESI+ MRM

CSH: Charged Surface Hybrid UPLC : Ultra Performance Liquid chromatography


Analitos

Name pKa Log P Comments

1B Azidothymidine (AZT) 9.68 0.05 Antiretroviral drug for HIV/AIDS 2B 7-Hydroxycoumarin 7.8 1.6 Gradient in sunscreen, absorb UV 3A Phenacetin 2.2 1.6 Pain, fever reducer

4N Betamethasone -- 1.1 Anti-inflammatory and immunosuppressive

5B Protriptyline 8.2 4.4 Antidepressant 6A Alprazolam 2.4 4.9 Panic and anxiety disorders 7B Amitriptyline 9.7 4.8 Antidepressant 8A Naproxen 4.2 3.2 Pain, fever reducer 9B Propranolol 9.5 2.5 Hypertension

Drogas para distintas campos de aplicación Amplio rango de pKas y Log Ps (indicación de la hidrofobicidad)


Recuperaciones con muestras plasmáticas: protocolo estándard vs. Simplificado

Protocolo de 5 pasos vs. protocolo de 3 pasos: Recuperaciones y desviaciones estándard

comparables Recuperaciones medias >90% y RSDs <5%

)dopada-postmuestra deRespuesta

extraídamuestra deRespuesta (100ónRecuperaci ×=

Recuperaciones

0

20

40

60

80

100

120

AZT Propra 7HC Phen Protrip Amitrip BetaMeth Alpraz Naprox AVG

Protocolo estándard Protocolo simplificado


Factor de matriz (MF): Protocolo estándard vs. simplificado

* Bioanalytical Method Validation Guide de la European Medicines Agency, 2012

blancoenRespuesta matrizenRespuesta MF =*

Protocolo estándard Protocolo simplificado

Matrix factor

0.60

0.80

1.00

1.20

1.40

Procain N

-

acety AZT Propra 7HC Phen Protrip Amitrip BetaMeth Alpraz Naprox

Factores de Matriz equivalentes con ambos protocolos (MF de 1.00±0.15 obtenidos con el protocolo simplificado

(Carga-Lavado-Elución) ) Factor de Matriz:

1.0 = no hay efecto matriz >1.0 = ion enhancement <1.0 = ion suppression


Limpieza del extracto: Comparativa

No se observan diferencias en el test de limpieza por MS entre el protocolo de 5 pasos y el de 3 pasos (Carga-Lavado-Elución)

Cromatogramas LC/MS obtenidos usando un Xevo TQ-S

Referencia: MeOH

Extractos con el protocolo simplificado

Extractos con el protocolo estándard

ESI+ MS scan 50-650


Protocolo Simplificado: Capacidad de carga de muestra

La capacidad de carga se mantiene constante en los distintos volumenes

La capacidad de carga evaluada fue entre 25 y 375 µL de plasma

Recuperacciones entre 80 - 110% con RSDs inferiores al 5% para todos los analitos

0

20

40 60 80

100 120

Diferentes volumenes de plasma cargados

25µL 50µL 100µL 250µL 375µL


Protocolo Simplificado: Reproducibilidad lote a lote

Recuperaciones muy consistentes entre todos los lotes

Cuatro lotes diferentes de Oasis HLB seleccionados entre 2005 - 2013 Recuperaciones medias entre todos los lotes: 90±6%

0

20

40

60

80

100

120

Batch 1 Batch 2 Batch 3 Batch 4


Veamos ahora cómo se comportan las muestras de orina


Protocolo Simplificado vs. Estándard: Evaluación de fármacos en orina

Recuperaciones y Factores Matriz comparables

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

Propra 7HC Phen BetaMeth Alpraz Naprox

0

20

40

60

80

100

Propra 7HC Phen BetaMeth Alpraz Naprox

Protocolo estándard Protocolo simplificado Recuperaciones Matrix factor

Protocol estándard Protocolo simplificado

Muestras de orina diluidas 1:1 con 100 mM acetato sódico pH 5.0

Matrix factors of 1±0.2 is considered comparable


¿Podemos aplicar esto a otros sorbentes?

¿Y a otros formatos (cartuchos o placas convencionales)?


Protocolo Simplificado: Comparativas

Comparativas realizadas: – Placas µElution, placas de 10mg y cartuchos – Oasis HLB vs. sorbente C18 de base sílice – Oasis HLB vs. otros sorbentes poliméricos

En las distintas comparativas nos centramos en 2 parámetros

– Recuperaciones – Efecto matriz


Protocolo Simplificado: Cartuchos Oasis HLB 1cc/30 mg

Comparable (high) recoveries and (low) matrix effects with plasma when comparing 5-step protocol versus simplified 3-step (Load-Wash-Elute) protocol

Recuperaciones (elevadas) y efectos matriz (bajos) comparables entre el protocolo de 5 etapas y el de 3 (Carga-Lavado-Elución)


Protocolo Simplificado vs. Estándard: Cartuchos Oasis HLB 1 cc/30 mg

Recuperaciones comparables entre los dos protocolos trabajando con cartuchos HLB y orina como matriz


Oasis HLB µElution vs. C18 de base sílice µElution; Protocolo Simplificado

Únicamente HLB da buenos resultados trabajando con el protocolo simplificado de 3 etapas, tanto para plasma

como para orina

Con el sorbente C18 de base sílice se obtienen recuperaciones muy bajas

0

20

40

60

80

100

Plasma Oasis HLB Silica-based C18

Orina 0

5

Oasis HLB Silica-based C18


Oasis HLB vs Sorbentes poliméricos similares; plasma - 4 réplicas

0

20

40

60

80

100

120

Oasis HLB Competitor S RP Competitor SX RP Competitor P RP

AZT

7 - Hydroxycoumarin

Phenacetin

Betamethasone

Protriptyline

Alprazolam

Methoxyverapamil

Terfenadine

Oasis AVG Recovery: 100% Oasis AVG RSD: 1%


Comparativa de Efectos Matriz

0.60

0.80

1.00

1.20

1.40

1.60

1.80

Oasis HLB Competitor S RP Competitor SX RP Competitor P RP

AZT

7 - Hydroxycoumarin

Phenacetin

Betamethasone

Protriptyline

Alprazolam

Methoxyverapamil

Terfenadine

blankin Responsematrix in ResponseMF =

Con Oasis HLB se obtienen los efectos matriz más bajos (mejores resultados)

Factor Matriz: 1.0 = efecto matriz inexistente

>1.0 = ion enhancement <1.0 = ion suppression


Conclusiones de las comparativas con otros sorbentes

El protocolo simplificado (Carga-Lavado-Elución) únicamente funciona con Oasis HLB (un sorbente 100% humectable)

Con un sorbente C18 de base sílice se obtienen recuperaciones muy bajas

Con sorbentes poliméricos similares se obtienen recuperaciones inferiores.


Próximos pasos: Protocolos simplificados para modos mixtos


Protocolo Simplificado para Oasis MCX: Screening toxicológico en orina


Screening Toxicológico en orina Resultados

Sistema LC: Acquity I-Class Columna: BEH Ph 2,1x100mm 1,7µm Detector: Xevo TQD


Agenda




Conclusiones


Conclusiones

El protocolo simplificado (Carga-Lavado-Elución) para Oasis HLB permite: – Mejorar el flujo de trabajo reduciendo los pasos del método de

extracción en fase sólida de 5 a 3 – Reducir alrededor de un 40% el tiempo de procesado, así como

ahorrar una media del 70% en solventes – Obtener recuperaciones elevadas, baja variabilidad y efectos matriz

bajos – Compatible con muestras plasmáticas y de orina – El protocolo funciona tanto para placas como para cartuchos Oasis – Los resultados de aplicar el protocolo simplificado a otros sorbentes

(C18 base sílice y poliméricos) son claramente peores – Trabajando con la placa µElution se puede cargar entre 25 y 375 µL

de muestra y concentrar los analitos hasta 15x


Gracias

A continuación de este webinario: – Recepción

o Presentación en PDF

o Application Notes relacionadas • 720005140EN • 720005290EN • 720005053EN • 720004673EN

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Para cualquier pregunta: o Soporte Técnico Waters: 902 254 254 o [email protected] o Su Responsable de Ventas local

mailto:[email protected]


Agradecimientos

Frank Marszalkowski Doug McCabe Chris Poz Mary Lame Pamela Iraneta Xin Zhang Euan Ross Erin Chambers Kenneth Fountain Gregory Lawless


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