Toma, Manipulación y Preparación de Muestras Tema 2

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Tema 2. TOMA, MANIPULACIN Y PREPARACIN DE MUESTRASPARA SU ANLISIS

Tipos de muestras

Recipientes de recoleccin

Variables que afectan a la toma de muestra

Transporte de muestras

Criterios para el rechazo de muestras

Estabilidad y conservacin

Preparacin de muestras para el anlisis

Mtodos de separacin: centrifugacin, precipitacin, extraccin, cromatografa y electroforesis

TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIN DE MUESTRAS TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIN DE MUESTRAS

TIPOS DE MUESTRAS

SANGRE

ORINA

OTROS LIQUIDOS ORGNICOS: Lquido cefalorraqudeo y amnitico

HECES

ASPIRADOS GSTRICOS

CLCULOS RENALES Y BILIARES

TEMA 2. TOMA Y MANIPULACIN DE MUESTRAS

COAGULACIN SANGUINEA

Sangre entera : suspensin de clulas en una matriz de protenas y sales denominada plasma

SANGRE ENTERA

COGULO

SUERO(parte lquida)

1. coagulacin2. centrifugacin



Los cogulos de sangre se forman por interaccin de aproximadamente una docena de protenas denominadas FACTORES DE COAGULACIN que funcionan simultneamente

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PROTROMBINA TROMBINA

Factores de coagulacin

FIBRINGENO FIBRINA

REDES DE FIBRINA

Polimerizacin

Cogulo: Redes de fibrina + plaqueta + glbulos rojos

Hemostasia: Propiedad de autosellado del sistema circulatorio


RECIPIENTES DE RECOLECCIN

1. JERINGAS2. TUBOS DE VACO:

3. OTROS RECIPIENTES DE RECOLECCIN

*Stat (del latn statim=inmediatamente)


VARIABLES QUE AFECTAN A LA TOMA DE MUESTRA

Variables diurnas

Postura del paciente

Estasis (acumulacin de sangre sobre una constriccin)

Hemlisis (prdida de hemoglobina por parte de los eritrocitos)

Conservacin

Transporte


Criterio para el rechazo de muestras

1. Inadecuada identificacin

2. Recogida de volumen de sangre inadecuado

3. Utilizacin de tubos inadecuados

4. Presencia de hemlisis

5. Transporte inapropiado

6. Presencia de interferentes

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ESTABILIDAD Y CONSERVACIN DE MUESTRAS

La alteracin de muestras puede ser debida a:

1. Adsorcin sobre las paredes del vidrio del recipiente

2. Evaporacin de sustancias voltiles

3. Paso de agua de los hemates al plasma (adicin de anticoagulantes)

4. Alteraciones en la permeabilidad de los eritrocitos

5. Actividades metablicas de hemates y leucocitos (consumo de O2 yproduccin de CO2

6. Hidrlisis

7. Gluclisis

8. Fenmenos de autodegradacin

9. Contaminacin por bacterias u hongos.


ESTABILIDAD Y CONSERVACIN DE MUESTRAS

1. Alteracin de la temperatura

2. Alteracin del pH

3. Liofilizacin de muestras

4. Conservantes qumicos


Conservantes qumicos

1. SANGRE

1.1. Los que evitan transformaciones qumicas: KF y yodoacetato

1.2. Los que tienen acciones antibacterianas: timol / KF + monoclorobenceno / KF + monobromobenceno / Antibiticos

2. ORINA

Suelen aadirse agentes antibacterianos: formaldehdo / timol / ac. brico / tolueno / cloroformo.


PROCESADO DE MUESTRAS

1. En ausencia de agentes qumicos

2. En presencia de agentes qumicos:

HeparinaSales de AEDTOxalatosNaFCitrato sdicoPolietanol-sulfonato sdico

1. OBTENCIN DE SANGRE ENTERA Y PLASMA

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1. Separadores de suero

2. Filtro tipo mbolo

1. OBTENCIN DE SUERO. SEPARACIN POR CENTRIFUGACIN

2. PRECIPITACIN PARA LA ELIMINACIN DE PROTENAS

UltracentrifugacinAbsorcin sobre sustancias como el caolnCombinacin de las protenas con los correspondientes anticuerposPrecipitacin por desnaturalizacin por calor, pH adecuadoPrecipitacin mediante procedimientos qumicos



PRECIPITACIN DE PROTEINAS POR PROCEDIMIENTOS QUMICOS

Precipitaciones que dependen de la deshidratacin de protenas

- Por adicin de disolventes miscibles- Por fraccionamiento salino (salting out)

Precipitaciones que dependen de la formacin de sales insolubles

- Precipitantes aninicos: cidos tungstico, tricloroactico, metafosfrico, perclrico,etc

- Precipitantes catinicos: Hg2+, Fe3+, Cu2+, combinaciones deHg2+- Ba2+ y de Ba2+ - Zn2+

Precipitacin mediante adicin de cloroformo



3. EXTRACCIN

3.1. Extraccin lquido-liquido

- Extraccin simple

- Extracciones mltiples

- Condiciones ptimas de extraccin:

* Eleccin del disolvente

* Control del pH

* Control de la fuerza inica



3.1. Extraccin lquido-liquido de forma continua3. EXTRACCIN

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3.2. Extraccin slido-lquido de forma continua

3. EXTRACCIN

Muestra slida

disolvente



3.3. Extraccin a contracorriente

3.4. Procesado de extractos



4. CROMATOGRAFIA

Clasificacin segn la fase mvil y los aparatos fsicos:



4. CROMATOGRAFIA

Clasificacin segn el mecanismo de separacin de la fase estacionaria:

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4. CROMATOGRAFIA

Diagrama de un sistema de cromatografa lquida:



4. CROMATOGRAFIA

Componentes bsicos de un equipo de cromatrografa gaseosa:



4. CROMATOGRAFIA

Cromatograma tpico de un sistema de cromatografa lquida en columna:

tR2

tR1

tM

1 2 3 4V (mLt (min)

Res

pues

ta d

el d

etec

tor

0



4. CROMATOGRAFIA

Parmetros de retencin:

Tiempo de retencin (tr)

Tiempo muerto (tm)

Factor de retencin o capacidad: k= tr tm tm

Selectividad o retencin relativa: = (tr)B - tm(tr)A tm

Platos tericos : N = 16 tr2 N = 5.55 tr2w2 w2

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4. CROMATOGRAFIA


Factor de retencin o capacidad: k= tr tm tm

tr

tm



4. CROMATOGRAFIA


Selectividad o retencin relativa: = (tr)B - tm(tr)A tm

(tr)B

(tr)A

tm



4. CROMATOGRAFIA


Platos tericos : N = 16 tr2 N = 5.55 tr2w2 w2



4. CROMATOGRAFIA


Resolucin: R = t2 t1 (w1 +w2)

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4. CROMATOGRAFIA


Resolucin: R = t2 t1 (w1 +w2)



4. CROMATOGRAFIA

Cuantificacin usando un patrn externo:

Concentracin del patrn externo

Altu

ra

re

a de

pic

o



4. CROMATOGRAFIA

Cuantificacin usando un patrn interno: determinacin de teofilina utilizando betahidroxietilteofilina como patrn interno

Seleccin del patrn interno:

Debe estar completamente separado de otros picos Debe ser eludo cerca de la sustancia analizada Debe comportarse de forma similar a la sustancia analizado durante el pretratamiento de muestra Debe tener una altura o rea del orden de un patrn en el intervalo de concentracin deseada No debe estar presente en la muestra Debe poder obtenerse comercialmente Debe ser agregado en forma lquida



4. CROMATOGRAFIA

Cuantificacin utilizando la adicin estndar:

y = 0,0411x + 0,0101R2 = 0,9995

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

-0,4 -0,2 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2

Cromo (mg/l)A

bsor

banc

ia (u

. A.)

Concentracin de patrn aadidaA

ltura

o

rea

de p

ico

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4. CROMATOGRAFIA

Derivatizacin

muestra Agente derivatizanteNuevo producto+

Derivatizacin de barbitricos por tetrametilacin



4. CROMATOGRAFIA Muestras para HPLC:



4. CROMATOGRAFIA



5. ELECTROFORESIS

0. Definicin1. Fuerzas ejercidas sobre la partcula2. Movilidad de una partcula3. Efecto del pH sobre la movilidad4. Electrolitos5. Movimiento y conductividad de los iones6. Otros factores que afectan a la movilidad:

carga y conformacinAtmsfera inica y potencial Zenerga trmica: efecto de relajacinefecto electrofortico

7. Medios de soporte8. Tcnicas de aumento de la resolucin9. Mtodos de separacin en base al tamao molecular10. Mtodos de separacin en base al tamao y la carga11. Localizacin del compuesto de inters12. Aplicaciones clnicas13. Electroforesis capilar

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5. ELECTROFORESIS

Aplicacin de un campo elctrico a una disolucin inica:



5. ELECTROFORESIS



5. ELECTROFORESIS



5. ELECTROFORESIS

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5. ELECTROFORESIS



5. ELECTROFORESIS

PERSONA SANA

PRESENCIA DE CIRROSISHEPTICA


5. ELECTROFORESIS. EJEMPLOS



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5. ELECTROFORESIS CAPILAR



5. ELECTROFORESIS CAPILAR

Dimetro capilar 5mCampo elctrico 25 KVDetector electroqumico

Neurona

Capilar

Serotonina 3M

Res

pues

ta d

etec

tor

Tiempo (min)

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