Protocolo Preparación Muestras Nt 18

7/24/2019 Protocolo Preparacin Muestras Nt 18

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LABORATORIO NACIONAL DE REFERENCIA

PARA METALES PESADOS EN ALIMENTOS Y PIENSOS(Lista de la Direccin General de Sanidad y Consumidores de la Comisin Europea)

AANNAALLIISSIISSDDEEEELLEEMMEENNTTOOSSPPAARRAACCAATTEEGGOORRIIAASSDDEEEENNSSAAYYOONNTT--1188..

MMEEDDIIAANNTTEELLAASSTTCCNNIICCAASSDDEEEESSPPEECCTTRROOMMEETTRRAAAATTMMIICCAAOO

EESSPPEECCTTRROOMMEETTRRAADDEEMMAASSAASS

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DDEEAALLIIMMEENNTTOOSS

Mayo 2012

MINISTERIO DEAGRICULTURA, ALIMENTACIONY MEDIO AMBIENTE

DIRECCION GENERAL DE LA INDUSTRIAALIMENTARIA

SUBDIRECCION GENERAL DE CONTROL Y DELABORATORIOS ALIMENTARIOS

Laboratorio Arbitral Agroalimentario


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IINNDDIICCEEPgina

1. INTRODUCCIN 3

2. TCNICAS ESPECTROMETRICAS 4

2.1 Espectrometra Atmica 4

2.1.1 Espectrometra de Absorcin Atmica2.1.1.1.Espectrometra de Absorcin Atmica con Llama (F-AAS)2.1.1.2.Espectrometra de Absorcin Atmica con Atomizacin

Electrotrmica (ET-AAS)2.1.1.3.Espectrometra de Absorcin Atmica con Generacin de

Hidruros (HG-AAS)2.1.1.4. Espectrometra de Absorcin Atmica con Vapor Fro (CV-AAS)

2.1.2. Espectrometra de Emisin Atmica.2.1.2.1. Espectrometra de Emisin Atmica con Llama (F-AES)

2.1.2.2. Espectrometra de Emisin Atmica con Plasma de AcoplamientoInductivo (ICP-AES)

2.2 Espectrometra de Masas2.3 Preparacin de muestra

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3. INTERFERENCIAS 7

4. ACREDITACION POR CATEGORIAS DE ENSAYO NT-18 8

4.1 Definicin de la LEBA en grupos de matrices 8

4.2 Preparacin de las muestras 9

5. PROCESO DE VALIDACIN Y EVALUACIN DE LA CALIDAD 12

5.1 Caractersticas de la fiabilidad 12

5.2 Evaluacin de la calidad de los ensayos 12

6. VALIDACIONES NECESARIAS Y CRITERIOS A APLICAR 14

6.1 Protocolo de Validaciones 15

6.1.1 Validacin de un nuevo elemento

6.1.2 Validacin de una matriz en un grupo no validado de un elemento incluido enla LEBA

6.1.3 Verificacin de una matriz nueva en un grupo ya validado

7. CONCLUSIONES 21

8. BIBILIOGRAFIA 21


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1. INTRODUCCIN

El artculo 33 del Reglamento (CE) N 882/2004 del Parlamento Europeo y delConsejo, de 29 de abril de 2004, establece las funciones y responsabilidades de loslaboratorios nacionales de referencia, especialmente las que se refieren a lacoordinacin, para su rea de competencia, de las actividades de los laboratorios

oficiales encargados del anlisis de las muestras tomadas en los controles oficiales.

Por otra parte, la Nota Tcnica NT-55 Laboratorios de Referencia en el sectoragroalimentario: poltica sobre participacin en el sistema de acreditacin,elaborada por la Entidad Nacional de Acreditacin (ENAC), resalta la contribucin delos laboratorios nacionales de referencia para que los resultados de los anlisisemitidos por los laboratorios que realizan el control oficial de los productosagroalimentarios sean de elevada calidad y uniformidad. Para alcanzar este objetivo,los laboratorios nacionales de referencia pueden publicar los datos de validacin deun procedimiento de ensayo para que puedan ser utilizados por los laboratorios decontrol oficial, organizar ensayos de intercomparacin, asegurar la disponibilidad de

materiales de referencia, en lo posible, y colaborar en la formacin tcnica delpersonal responsable del control analtico oficial.

Adems, esta Nota Tcnica, establece que ENAC considerar en todo momentocomo adecuadas las decisiones, prcticas y procedimientos de ensayo utilizados porlos laboratorios que operan en el control oficial que sigan las instrucciones,directrices, recomendaciones o documentos publicados por el correspondienteLaboratorio Nacional de Referencia (LNR) de cualquier estado miembro o elLaboratorio de Referencia de la Unin Europea ( EU-RL) respectivo, y en cualquiercaso, no ser obligatorio que el Laboratorio Autorizado para participar en el ControlOficial siga necesariamente los procedimientos de ensayo del LNR o del EU-RLrespectivo, salvo indicacin expresa en la legislacin al respecto.

El Laboratorio Arbitral Agroalimentario de la Subdireccin General de Control y deLaboratorios Alimentarios de la Direccin General de la Industria Alimentaria delMinisterio de agricultura, Alimentacin y Medio Ambiente, ha sido designadoLaboratorio Nacional de Referencia para la determinacin de residuos de elementosqumicos (Grupo B3c) segn la Decisin de la Comisin 2006/130/CE de 10 defebrero de 2006, y tambin para la deteccin de metales pesados en alimentos deorigen vegetal y piensos, conforme al listado de LNR de SANCO de la ComisinEuropea y segn lo establecido en el artculo 33 del Reglamento (CE) N 882/2004

del Parlamento Europeo y del Consejo de 29 de abril de 2004.

El presente trabajo pretende presentar un protocolo o procedimiento sencillo depreparacin de muestras para determinacin de elementos en alimentos paraCategoras de Ensayo por Nota Tcnica NT18 de ENAC aplicados a las tcnicas deespectrometra atmica o espectrometra de masas, as como proporcionar unasdirectrices en cuanto a las validaciones necesarias.

Este documento ha sido consensuado en el Grupo de Trabajo de Metales Pesadoscoordinado por la Subdireccin de Control y de Laboratorios Alimentarios de la quedepende el Laboratorio Arbitral Agroalimentario, con el fin de que pueda facilitar la

implantacin de los alcances flexibles para la determinacin de estos elementos en


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los laboratorios espaoles que intervienen en el control oficial de productosagroalimentarios.

2. TCNICAS ESPECTROMTRICAS

Desde hace mas de treinta aos, los mtodos de anlisis instrumental han tenido undesarrollo importante y son ampliamente utilizados de forma rutinaria en laboratoriosde control y de investigacin.

La Espectrometra es una tcnica instrumental que permite determinar el mayornmero de elementos en una gran variedad de matrices, basada en la identificacinde analitos mediante el espectro emitido o absorbido por los mismos, pudindosediferenciar entre atmica o de masas.

22..11..EEnn llaaEEssppeeccttrroommeettrraaAAttmmiiccaappooddeemmoossmmeeddiirr la luz absorbida o emitida por

un tomo al pasar del estado fundamental al estado excitado o viceversa. En funcinde ello, se clasifica:

2.1.1. Espectrometra de Absorcin Atmicacuando mide la luz absorbida porun tomo en estado fundamental al pasar al estado excitado.

Llama F-AAS

Atomizacin Electrotrmica ET-AAS

Generacin de Hidruros HG- AAS

Vapor fro CV-AAS

Anlisis elemental/directo AMA / DMA

2.1.2. Espectrometra de EmisinAtmica cuando mide la luz emitida por untomo excitado al pasar al estado fundamental.

Emisin Atmica con Llama F- AES

Con Plasma de Acoplamiento Inductivo ICP-AES

2.1.1.1. Espectrometra de Absorcin Atmica con Llama (F-AAS)Es una tcnica monoelemental y est sujeta a muchas interferencias qumicas o de

matriz que se producen como consecuencia de diversos procesos qumicos queocurren durante la atomizacin y que alteran las caractersticas de absorcin delanalto. El tipo ms comn de interferencia es el producido por aniones que formancompuestos de baja volatilidad con el analito y reducen as su velocidad deatomizacin lo que origina resultados menores de lo esperado. Las interferenciasespectrales son poco frecuentes debido a que las lneas de la fuente sonextremadamente estrechas y especficas.


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2.1.1.2.Espectrometra de Absorcin Atmica con Atomizacin Electrotrmica(ET-AAS)Sigue siendo una tcnica monoelemental sujeta a las interferencias de matrizdescritas anteriormente pero agudizadas ya que grandes cantidades de la muestrason volatilizadas en un espacio pequeo, por lo que molculas presentes puedenabsorber la radiacin en la regin del analito, y presentan mucho efecto memoria.

Hay distintos procedimientos para intentar evitar dichos problemas como utilizar tubode grafito con plataforma, curva de adicin,etc.

2.1.1.3.Espectrometra de Absorcin Atmica con Generacin de Hidruros (HG-AAS) Tcnica monoelemental restrictiva a elementos refractario, que presenta unaalta sensibilidad, pero sujeta a interferencias qumicas debidas a altasconcentraciones de los metales de transicin, aunque controlando la acidez delmedio y la concentracin del NaBH4, son dos factores que permiten reducir almnimo dichas interferencias.

2.1.1.4. Espectrometra de Absorcin Atmica con Vapor Fro (CV- AAS)Al igual que en la Espectrometra Atmica por Generacin de Hidruros, se utiliza unagente reductor (borhidruro sdico o el ms sensible cloruro estannoso) queconsigue reducir las especies de mercurio a su estado elemental, el cual es voltil yes arrastrado por argon hasta la celda de medida.

2.1.2.1. Espectrometra de Emisin con Llama (F-AES)Presenta la ventaja que la llama acta como fuente, no necesitando como losmtodos de absorcin una lmpara diferente para cada elemento. La calidad delmonocromador no tiene que ser tan alta para alcanzar el mismo grado de

selectividad, pero tambin sufre interferencias qumicas semejantes.Resumiendo para estas tcnicas estudiadas de Absorcin y Emisin Atmica lasprincipales interferencias son las qumicas o de matriz.

2.1.2.2. Espectrometra Atmica de Emisin con Plasma de Acoplamiento Inductivo(ICP-AES)

Tcnica con gran aceptacin hoy en da, que est justificada por las caractersticasanalticas de la misma:

- Un gran nmero de elementos determinables (> 70)

- Una reproducibilidad de hasta 0,3% en los mejores casos- Buena exactitud- Tcnica multielemental

- Pocos efectos de matriz o qumicos- Una dinmica lineal de concentracin cubriendo varios rdenes de

magnitud

El ICP tiene una excelente reputacin con respecto a los efectos de matriz,particularmente cuando se compara con mtodos alternativos como laEspectroscopa de Absorcin Atmica (AAS). Sin embargo, los efectos de matriz


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pueden ser observados en ICP-AES, aunque usualmente la magnitud del efecto esbaja. En el caso de soluciones, el concepto de matriz incluye no solo el (los)elemento (s) mayoritario (s), sino los reactivos tales como solventes cidos uorgnicos, debido a que su naturaleza y concentracin pueden influir en la intensidadde la seal del analito. Tambin hay que tener en cuenta que segn el nebulizadorutilizado los efectos matriz pueden ser muy importantes, por ejemplo si se utiliza el

nebulizador ultrasnico (para intentar llegar a los lmites exigidos en Pb, Cd, enalgunos alimentos) es muy sensible a los efectos matriz, y por eso a veces slo serecomienda sobretodo para matrices no muy cidas y limpias tipo aguas, aunque escierto que si se trabaja con el patrn interno adecuado estos efectos s se veranreducidos incluso con antorcha en vista axial y nebulizador ultrasnico.

Si existieran esas interferencias de matriz que se deben a componentes de lasmuestras que afectan a la lectura de todos los elementos y teniendo en cuenta quesi el tratamiento de digestin es cenizas y se toman cantidades de muestra grandes10g para analizar Pb y Cd, ya que hay que cuantificar a niveles muy bajos, secorrigen utilizando un patrn interno, de modo que si vara la intensidad de la lectura

de este patrn, el programa corrige la lectura de las muestras multiplicndolas por unfactor proporcional a la variacin en la lectura del patrn interno.

El concepto de robustez fue usado para describir la capacidad de un mtodoanaltico para aceptar un cambio en la composicin de la matriz, sin producir uncambio en la seal del analito. La robustez est ligada las tcnicas de plasma ya quepresentan una capacidad para aceptar un cambio en la matriz sin que se modifiquenlas condiciones del plasma; sin que cambien por ejemplo, la temperatura, ladensidad electrnica y la distribucin espacial de las diferentes especies.

Por todo ello se consideran que las tcnicas de plasma estn poco influenciadas porel efecto matriz, es decir por las diferentes composiciones de la muestras y a la vezson unas tcnicas muy robustas que no se alteran ante cambios en las distintasmatrices analizadas

Pero la Espectrometra Atmica de Emisin con Plasma de Acoplamiento Inductivo(ICP-AES) presenta espectros de emisin complejos sujetos interferenciasespectrales por lo que es importante tener equipos con una alta resolucin.

2.2 .Espectrometra de Masas con Plasma de Acoplamiento InductivoCon la Espectrometra de Masas medimos la relacin masa/carga de los ionesproducidos en un Plasma ptico de Acoplamiento Inductivo ICP-MS.

Al igual que la anterior tiene escasas interferencias de matriz, las cuales se puedencorregir con el uso de patrn interno. Adems en este caso, la introduccin demuestra suele ser menor que en los ICP-AES ya que habitualmente se trabaja conmicronebulizadores, de forma que el efecto matriz es an menor.Asimismo, los mtodos de anlisis que utilizan ICP-MS presentan tambin pocasinterferencias espectrales por lo que es la tcnica ms libre de interferencias.


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2.3 En el proceso de preparacin de la muestra, es importante para lasinterferencias de matriz, la mayor o menor cantidad necesaria de pesada de lamuestra para llevar a cabo el proceso analtico, que puede ser por:

- Va seca o calcinacin(mucho peso de muestra)- Va hmedaen recipiente abierto (poco peso de muestra)

- Microondas

(poco peso de muestra)

3. INTERFERENCIAS

Los tipos de interferencias pueden ser:

Interferencias fsicas causadas por diferencias en las propiedades fsicas de lassoluciones como la viscosidad, tensin superficial o presin de vapor.

IInntteerrffeerreenncciiaass qquummiiccaass:: cualquier alteracin en el nmero total de tomos libres

formados por unidad de volumen debido a la formacin de compuestos qumicostermoestables. Las causas ms comunes de stas son:

- Disociacin incompleta de la molcula formada o formacin de una sal difcilde fundir.

- Reaccin espontnea de los tomos libres con otros tomos o radicalespresentes en el medio ambiente.

Interferencias ionizacin: debido a una excesiva ionizacin de los tomos, disminuyela poblacin de tomos neutros y disminuye la sensibilidad.

IInntteerrffeerreenncciiaass eessppeeccttrraalleess::Las interferencias espectrales de lnea ocurren cuandohay superposicin de dos lneas atmicas o cuando stas no son resueltas por elmonocromador.Las interferencias espectrales de banda se producen debido a la absorcin de laradiacin por molculas o radicales, y por dispersin de la radiacin por slidos.

Conclusin: Las tcnicas de Absorcin y Emisin Atmica estn sujetaspreferentemente a interferencias de matriz, la Emisin Atmica con Plasma deAcoplamiento Inductivo presenta preferentemente interferencias espectrales y laEspectrometra de Masas con Plasma de Acoplamiento Inductivo es la tcnica conmenor nmero de interferencias.

4. ACREDITACIN POR CATEGORAS DE ENSAYO NT-18

En la Nota Tcnica 18 de la Entidad Nacional de Acreditacin (ENAC) Laboratoriosde Ensayo: Acreditacin para Categoras de Ensayo, se especifica:


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En el punto 4.- Definiciones:A) Ensayo:un ensayo viene descrito por:

- Producto o material a ensayar (p.e. agua residual, acero, etc.)- Parmetro a determinar (p.e. cobre, pH, etc.)- Tcnicas o mtodo de medida (p.e. absorcin atmica, polarimetra, etc.)- Los intervalos o capacidades de ensayo

B) Categora de ensayo: un conjunto de ensayos realizados por una tcnica omtodo de ensayo comn para determinar un parmetro o familia de parmetrosen un producto o familia de productos.

En el punto 5.- Alcance de acreditacinEn la definicin del alcance de acreditacin para categora de ensayo, se estableceque debe indicarse:

- Categora del ensayo- La familia de productos y/o parmetros que definen la categora

- Se har mencin a un procedimiento de ensayo aplicable a la categora- Se har referencia a la Lista de Ensayos Bajo Acreditacin (LEBA)

Para definir la LEBA, en nuestro caso, es necesario establecer primero, la familia deparmetros o analitos que pueden ser elementos, definir las familias de matrices queforman la categora de ensayo que pueden ser alimentos y aguas continentalesy porltimo definir la tcnica empleada que puede ser cualquiera de las tcnicas descritasanteriormente.

Por ltimo, se elaboraran y desarrollarn procedimientos analticos (PNTs) quecontemplen todo el desarrollo de esta categora.

44..11DDeeffiinniicciinnddeellaaLLEEBBAAeennggrruuppoossddeemmaattrriicceess Una vez establecida la LEBA, en el apartado de productos que definen la categora,dividir este alcance (alimentos) estableciendo grupos que, el LAA como LNR,propone que estn basados en las diferentes sistemticas de preparacin de lasmuestras necesaria para ponerlas en disolucin y posterior proceder a sucuantificacin segn las tcnicas anteriormente mencionadas.

A continuacin, como una propuesta orientativa de clasificacin, se describen 6grupos que abarcaran el total de las matrices alimenticias:

Grupo 1 (G1)Aguas de consumo, aguas continentales y bebidasrefrescantes.

Grupo 2 (G2):Bebidas alcohlicas de baja graduacin y derivados. Porejemplo: vinos, vinagres, cervezas, sidras, etc.

Grupo 3 (G3):Bebidas alcohlicas de alta graduacin, pero bajo contenidoen azcares1* Por ejemplo: ron, vodka, ginebra, brandy,alcoholes, etc.

Grupo 4 (G4):Alimentos de alto contenido en humedad 2*(>50%) Por ejemplo:crnicos, pescados, hortalizas, frutas, zumos, conservas, leche,

yogur, licores con alto contenido en azcares y extractos de caf al


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10 %.

Grupo 5 (G5):Alimentos de bajo contenido en humedad 2*(50%) Por ejemplo:queso, cacao, mermelada, especias secas, aceites, frutos secos,cereales, legumbres, embutidos, t y similares, etc.

Grupo 6 (G6): Sal

1* Azcares menor de 50g/l.

2* Segn las tablas de composicin de alimentos publicadas por el Ministerio de

Sanidad, Servicios Sociales e Igualdad.

44..22..PPrreeppaarraacciinnddeellaassmmuueessttrraassUna vez establecidos estos grupos, se proponen las siguientes preparaciones demuestras:

GRUPO 1 Aguas de consumo , aguas continentales y bebidas refrescantes..

- Dosificacin directa en el EquipoMuestras que no necesitan preparacin: aguas y bebidas refrescantes sin gas,excepto bebidas de cola. Las aguas sern acidificadas aadiendo cido ntricodel 65% para llevarlas a una concentracin final de cido de aproximadamente el3% la misma concentracin de cido en que se preparen los patrones. Enaguas con residuos en suspensin efectuar una centrifugacin previa de lamuestra a 5000 rpm, tomando el sobrenadante e indicando en el informe deensayo que slo se analiza la fraccin soluble.

- Dosificacin directa en el Equipo previa desgasificacinMuestras de bebidas gaseosas (agua con gas, tnicas): hacer unadesgasificacin previa introduciendo un vaso de precipitados con un volumenaproximado de 50 mL de muestra en el bao de ultrasonidos duranteaproximadamente 10 min.

GRUPO 2 (G2) Bebidas alcohlicas de baja graduacin y derivados

- Dilucin de la muestra previa al EquipoMuestras de bebidas alcohlicas de baja graduacin (vino, vinagre, sidra,cervezas) y bebidas de cola. Diluir 1 mL de muestra en 10 g de cido ntrico al3%. La muestra se toma con pipetas desechables. En el caso de muestras congas se realiza la desgasificacin previa segn lo indicado anteriormente.

- En caso que la bebida no sea ntida (vinos turbios, cervezas con cuerpo, etc.)se recomienda digerir la muestra para evitar posibles problemas en sistemas deentrada de muestra capilares como puede ser el nebulizador micro-concntricodel ICP-MS.


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GRUPO 3 (G3) Bebidas alcohlicas de alta graduacin, pero bajo contenido enazcares (< 50 g/L)

- Dosificacin directa en el Equipo previa eliminacin del alcohol

Muestras de bebidas alcohlicas de alta graduacin (vodka, ginebra, ron, brandy,alcoholes). Tomar 25 50 mL de muestra y evaporar el alcohol porcalentamiento hasta casi sequedad, luego se regenera el volumen inicial con cidontrico del 3% o concentracin similar a la preparacin de patrones.

PREPARACION DE MUESTRA PARA GRUPO 4 Y GRUPO 5Digestin de la muestra previa a la cuantificacin en el equipo instrumental. Lapreparacin de las muestras se puede efectuar por digestin cida en microondas opor va seca (cenizas). Segn el tipo de muestras se pesan o se toman volmenesde alcuotas diferentes segn el % de humedad.

Grupo 4 Alimentos de alto contenido en humedad (>50%):Tipos de muestras: carnes, vsceras, peces, moluscos, crustceos, verduras,hortalizas, frutas, leche, yogures, infusiones y similares, licores con alto contenido enazcares y extractos de caf del 10 % (estos ltimos se preparan con la mismadilucin del grupo, pero sin someterlos al procedimiento de digestin).

Grupo 5 Alimentos de bajo contenido en humedad (50%)

Tipos de muestras: aceites y grasas, cacao y derivados, productos lcteos y susderivados (excepto leche y yogures), embutidos y productos crnicos tratados por elcalor, azcares, fculas, cereales, legumbres, confituras, mermeladas, frutos secos,especies.

A) Digestin en microondas:

- GRUPO 4 (G4)Se pesa 1gde muestra.Para las muestras de leche lquida, se puede pesar ms cantidad.

- GRUPO 5 (G5)

Se pesa 0.5 g de muestra.En el caso de aceites y de grasas tanto animales como vegetales, si se observanfenmenos de sobrepresin, se puede pesar menor cantidad (0,30 gramos).

A continuacin se aaden 10 mL de cido ntrico al 20% y tras media hora de esperase introducen los tubos en el microondas para su digestin. Para la mineralizacinde la materia orgnica se utiliza un microondas en el que se someten las muestras aaltas presiones y temperaturas en vasos cerrados.


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Para la digestin de las muestras grasas se aadirn 10 mL de cido ntrico al 20%y 1 mL de agua oxigenada. Una vez digeridas las muestras se transfieren a frascosde polipropileno de 50 mL y se llevan a 30 g de peso con agua destilada.

Las diluciones finales de las muestras se pueden preparar por volumetra ogravimetra. Es importante resear que se aconseja preparar las diluciones por

gravimetra, como queda indicado en el texto, ya que es un procedimiento ms exacto,pero teniendo en cuenta que, segn el procedimiento escogido, los patrones de lacurva de calibracin se deben preparar igual a las muestras.

Las diluciones y las pesadas de la muestra, as como los volmenes de cidoindicados son orientativos, ya que pueden depender del tipo de microondas y de lainstrumentacin elegida. Las preparaciones de las muestras son estables, al menos,durante 48 horas en condiciones de refrigeracin. Las muestras para ladeterminacin de estao se preparan utilizando los mismos procedimientos dedigestin indicados anteriormente pero aadiendo entre 1 y 2 mL de cidoclorhdrico, para evitar procesos de precipitacin.

B) Va seca (a modo de ejemplo, se expone el siguiente proceso):

GRUPO 4 (G4) y GRUPO 5 (G5)

Pesar una cantidad de muestra suficiente para obtener como mnimo 1 gramo demuestra seca que variar en funcin del contenido en humedad. Las muestrasdeben pesarse en cpsulas o vasos de vidrio.

Aadir nitrato de magnesio, si se quiere determinar arsenico para evitar prdidaspor volatilizacin, y adems acelera la calcinacin produciendo cenizas msesponjosas. Aadir suficiente agua destilada para conseguir una consistenciapastosa. Mezclar y evaporar hasta sequedad en estufa de aire.

Quemar con lmpara de infrarrojo y a continuacin introducir en mufla a250C25C y aumentar la temperatura progresivamente, a razn de 50C/hora,hasta 450C25C. Continuar la mineralizacin hasta obtencin de cenizas grises.Aadir 1 mL de cido ntrico y aproximadamente 2 mL de agua destilada para elblanqueo de las cenizas. Repetir el proceso hasta obtencin de cenizas blancas.

Para la determinacin de arsnico en muestras con un contenido en cloruros

>200ppm, es necesario mantener las condiciones de oxidacin de forma constanteen el tiempo, ya que se pueden producir prdidas por volatilizacin en forma detricloruro. Para ello, se aade un exceso de cido ntrico y solo se quema la muestracuando los cloruros se han eliminado en forma de nitrosil cloruro, por lo que a la vezde aadir el nitrato de magnesio se deben adicionar 20 mL de cido ntrico.Posteriormente, calentar en una placa elctrica a reflujo durante 30 minutos. Quitarel vidrio de reloj y llevar a sequedad, introduciendo la muestra en la mufla y procedercomo se ha descrito anteriormente..En el caso de arsnico las cenizas se disuelven en cido clorhdrico 6N.Para la determinacin de mercurio, debido a su alta volatilidad, se aconseja preparar

siempre por digestin en microondas


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GRUPO 6 (G6) SalPara la sal se pesa 0.5g y se diluye a 50 mL con agua desionizada.

5. PROCESO DE VALIDACIN Y EVALUACIN DE LA CALIDADLas caractersticas de funcionamiento de los mtodos analticos deben definirse ydeben comprender todos los datos y resultados experimentales que demuestran suaptitud para el uso al que se destina.Se consideran tres grupos de caractersticas:

- De fiabilidad- De practicabilidad- De idoneidad

55..11CCaarraacctteerrsstt iiccaassddeeffiiaabbii ll iiddaaddDemuestran la capacidad de un mtodo analtico para mantener a lo largo del tiempolos criterios fundamentales de validacin.

Hay cuatro criterios fundamentales:

1. Proporcionalidad entre concentracin de analito y respuesta delinstrumento.

2. Dispersin de una serie de resultados alrededor del valor medio o central(precisin, repetibilidad y reproducibilidad)

3. Diferencia entre el valor obtenido en el anlisis y el valor verdadero(veracidad y exactitud)

4. Cantidad mnima de analito requerida para obtener un resultadosignificativo.

Estos cuatro criterios se obtienen en el proceso de validacin del mtodo analtico.

55..22..EEvvaalluuaacciinnddeellaaccaall iiddaaddddeelloosseennssaayyoossAl mismo tiempo es importante asegurar que los parmetros de calidad, obtenidosen el proceso de validacin, se sigan manteniendo a lo largo del tiempo en el trabajode rutina de aplicacin de nuestro mtodo analtico en el laboratorio. Esto se alcanzamediante un conjunto de actuaciones que permitan garantizar la calidadde nuestrosresultados en condiciones normales y que tambin permitan detectar posiblescausas de errores analticos.

Por tanto, debe existir una estrecha relacin entre validacin y evaluacin de lacalidad de los ensayos, estableciendo para ello una serie de controles de calidadinternos y unos criterios de aceptacin en cada serie analtica.

Se debe recordar que la veracidad se expresa cuantitativamente en trminos desesgo y quepuede determinarse:

1. Comparando la respuesta del mtodo frente a un material de referenciacertificado (MRC) con un valor conocido

2. Comparando la respuesta frente a un mtodo de referencianormalizado


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3. Con el uso de la tcnica de la adicin/recuperacin.

En cada serie analtica se debe verificar que se siguen manteniendo la exactitud y elsesgo requerido y que, debido a la posible ausencia de materiales de referenciacertificados (por otra parte, procedimiento excesivamente costoso), se puede

comprobarmediante la tcnica de adicin/recuperacin antes mencionada.

Se propone aplicar los siguientes controles de calidad, aunque cada laboratoriopodr aplicar los que considere ms convenientes. Los ms aconsejados son:

1. Un blanco con los mismos reactivos y preparado en las mismas condicionesque las muestras, para comprobar que no existen contaminaciones en elmaterial y reactivos.

2. Muestras por duplicado para verificar la repetibilidad de los ensayos, al menosuna dentro de cada serie analtica.

3. Una muestra con una adicin de concentracin lo ms prxima posible alcontenido de la muestra problema (siempre que este sea superior al LoQ). Laadicin se debe efectuar antes de preparar o digerir las muestras. Larecuperacin obtenida nos permite saber si la matriz est interfiriendo en lalectura de algn elemento o si ha habido prdidas del analito.

4. Cada diez muestras y al principio y final de la serie analtica se realiza elcontrol que consiste en la lectura del blanco o punto cero de la curva. Sirvepara comprobar que no hay efecto memoria.

5. Cada diez muestras y al comienzo y al final de la serie analtica se realiza uncontrol que consiste en leer una solucin que es de concentracin similar alpatrn de concentracin media de la curva de calibrado pero obtenida medianteotra preparacin. Sirve para comprobar la vigencia de la curva de calibradodurante toda la serie.

6. Previamente a la lectura de las muestras se realiza el control de un patrn deverificacin de baja concentracin. Este control de calidad nos permite verificarque la lectura de los elementos que estn en bajas concentraciones se estrealizando correctamente. Tambin, se puede calcular la concentracin

equivalente en el primer estndar de calibracin, es decir el error residual, y si escorrecto, no hara falta dicha solucin, ya que quedara comprobada la lectura abajas concentraciones.

6. VALIDACIONES NECESARIAS Y CRITERIOS A APLICAR.Una vez establecidos los seis grupos de muestras en base a su preparacinanaltica, sera necesario establecer unos criterios sobre el nmero de validacionesnecesarias dentro de cada grupo, atendiendo a las diferentes matrices existentes enlos mismos.


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Previamente la categora de ensayo en ALIMENTOS, se ha establecido:

1. Divisin de la categora del ensayo ALIMENTOS en grupos basados en losdistintos procedimientos de preparacin de muestras.

2. Divisin posiblemente de familias dentro de cada grupo.

3. Validaciones por matrices representativas dentro de cada familia.

Dependiendo de la preparacin muestra y de las interferencias de matriz oespectrales que pueden afectar a la tcnica de cuantificacin empleada

>interferencias > N de familias a validar

CATEGORIA DE ENSAYO ALIMENTOS

Divisin en grupos segn su preparacin de muestras

G1 G2 G3 G4 G5 G6

Clasificacin inicial de matrices o familias representativas dentro de cada grupo

Agua Vino Ginebra Carne Aceite SalPescado HarinaVegetal

Validacin de estas familias o matrices representativas con la obtencin de losparmetros de calidad de repetibilidad (r), reproducibilidad (R), recuperacin (R%) yLoQ .

Definicin de familias:

1. Una familia se define como: conjunto de matrices que se comportan igual en elproceso de validacin.

2. Cada familia tendr unos parmetros (r, R, R % y LoQ) que servirn paracaracterizarlas.

3. Dos familias se consideran diferentes cuando sus parmetros estadsticos errorson significativamente diferentes.

4. Las diferencias en composiciones de las matrices, sobre todo en cuanto alcontenido de aniones y cationes, son las principales fuentes que producirandiscrepancias en cuanto a los parmetros estadsticos originando familiasdiferentes.


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El aplicar este protocolo a las diferentes tcnicas instrumentales de espectrometraestudiadas anteriormente y que los tipos de familias seleccionados anteriormentesean suficientes para la validacin de la categora es posible, en funcin de la mayoro menor facilidad disponible para detectar los diferentes tipos de interferencias a queestn sometidos estos mtodos de cuantificacin y que nos podran llevar a laobtencin de resultados errneos.

Pero:

- Las interferencias de matriz se detectan fcilmente estudiando lasrecuperaciones. (F-AAS, ET-AAS, CV-AAS).

- Las interferencias espectrales se detectan haciendo previamente unestudio de las posibles lneas espectrales cercanas a la longitud de ondaseleccionada para el elemento estudiado. (ICP-AES). Para ello, en elestudio previo de optimizacin del mtodo analtico, se comprueban laexistencia de estas posibles interferencias espectrales, mediante un control

de interferencias a un nivel de concentracin prximo al nivel decuantificacin del elemento interferido y adicionando diferentes niveles deconcentracin del elemento que forma el compuesto interferente, de talforma que abarquen el contenido habitual de estos elementos en lasmatrices agroalimentarias.

El LAA opina que las matrices representativas seleccionadas dentro de los gruposanteriores para realizar una validacin completa, en principio, es suficiente paraabordar este alcance de acreditacin, ya que si en los procedimientos normalizadosde trabajo se establecen unos controles de calidad suficientes para analizar matricesnuevas, de manera que estudiando dos adiciones a diferentes concentraciones,siendo una de ellas a nivel prximo del LoQ, y obteniendo resultados correctos, deacuerdo a los criterios establecidos previamente, para la recuperacin (80- 120%),repetibilidad y reproducibilidad (Horwitz), no sera necesario realizar una nuevavalidacin completa, pues no seran familias diferentes de las previamente validadas.

Solo en el caso que la respuesta del control de calidad no fuera correcta, seranecesaria una validacin completa de una familia diferente.

6.1 Protocolo de validacionesA continuacin se indican las diferentes opciones de validacin propuestas:

6.1.1 Validacin de un nuevo elemento (Opcin 1):

a) Se proceder a obtener la linealidad de la recta de calibrado y que cumpla conlos criterios establecidos previamente por el laboratorio, si es un procedimientocon calibracin externa y lineal.

b) Si existe material de referencia certificado (MRC) de este elemento en la matrizrequerida u otra matriz, se proceder a estudiar su veracidad. Se estudiarn lasmuestras adicionando patrn a tres niveles diferentes de concentracin (bajo,medio y alto) para establecer el rango de trabajo. Se analizarn por duplicado, en


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cinco das diferentes, y se estudiarn las recuperaciones obtenidas, que debencumplir con los criterios previamente establecidos.

c) Obtencin del Coeficiente de Variacin de la Reproducibilidad (CVR%) y de lareproducibilidad (CVr%) de los anlisis de las muestras realizados en cinco dasdiferentes y a tres niveles de adicin.

6.1.2. Validacin de una matriz en un grupo no validado de un elemento incluido enla LEBA (Opcin 2):.Para validar una matriz incluida en un grupo no validado, se debe obtener el CVR%,CVr% y la recuperacin en el rango de trabajo a tres niveles diferentes en cincoseries en das diferentes.

Si se dispone de los datos anteriores en tres grupos ya validados slo sernecesario realizar 3 series, siempre y cuando entre estos grupos ya validados seencuentren el 4 o el 5.

6.1.3. Verificacin de una matriz nueva en un grupo ya validado (Opcin 3):

Proceder a verificar la matriz mediante la repeticin de muestra para comprobar larepetibilidad y adicionar dos o ms niveles diferentes de concentracin, calculandolas recuperaciones obtenidas con concentraciones siempre por encima del nivelnatural de concentracin del elemento en la muestra, para comprobar la exactitud.Una de las adiciones debe ser similar al contenido natural del elemento en lamuestra, que ser el lmite de cuantificacin.


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linealidad

5 rectas decalibracin encondiciones dereproducibilidad

L0QNivel ms bajo

ensayado que cumplelo requisitos de

precisin y veracidad

Precisin

Repetibilidad +Reproducibilidadintralaboratorio

2 repeticiones en5 das distintos en

tres niveles.ISO 5725

Veracidad

Sesgo

Recuperaciones

MCR, ensayos deaptitud, ensayos

colaborativos

Muestras conadicin en 3

niveles. 2

re eticiones en 5

IncertidumbrePrecisin y

recuperacinobtenidas en la

validacin.

OPCIN 1 (elemento no inc luido en la LEBA)


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L0QNivel ms bajoensayado que cumplelo requisitos de

precisin y veracidad

Precisin

Repetibilidad +Reproducibilidadintralaboratorio

(*) 2 repeticionesen 5 das distintos

en tres niveles.

ISO 5725

Veracidad

Sesgo

Recuperaciones

MCR, ensayos deaptitud, ensayos

colaborativos

(*) Muestras conadicin en 3

niveles. 2re eticiones en 5

Incertidumbre

Precisin y

recuperacinobtenidas en lavalidacin.

OPCIN 2 (elemento inclu ido en la LEBA en grupo no validado)

(*) Si se trata de un elemento validado previamente en 3 o ms grupos elanlisis se llevar a cabo en 3 das distintos en lugar de 5


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Precisin

Anlisis de la muestrapor duplicado

Exactitud2 adiciones en 2 niveles

calculando la recuperacinen la adicin de

concentracin ms prximaal contenido natural de la

muestra

OPCIN 3 (matriz nueva en elemento y grupo inclu idos en la LEBA)


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7. CONCLUSIONES

Para facilitar la implantacin de alcances flexibles para categoras de ensayo enalimentos para estas tcnicas instrumentales, el Laboratorio ArbitralAgroalimentariocomo Laboratorio Nacional de Referencia para la deteccin de contaminantesmetlicos en alimentos y piensos, propone:

1. Establecer grupos de matrices de alimentos basados en las diferentessistemticas de preparacin de las muestras, segn el protocolo anterior detrabajo

2. Obtener los parmetros de validacin completa para las matrices ms

representativas dentro de cada grupo indicado anteriormente.3. Aplicar las diferentes opciones de validaciones estudiadas anteriormente, para

incluir matrices y elementos nuevos en la LEBA.

8.BIBLIOGRAFA

- Entidad Nacional de Acreditacin ENAC: NT-55 Laboratorios de referencia de laUE y nacionales dentro del sistema de acreditacin de laboratorios agroalimentarios

- Reglamento (CE) N 882/2004, del Parlamento Europeo y del Consejo, de 29 deabril de 2004 sobre los controles oficiales efectuados para garantizar la verificacindel cumplimiento de la legislacin en materia de piensos y alimentos y la normativasobre salud animal y bienestar de los animales.

- Directiva Comunitaria 96/23/CE de 29 de abril, donde se especifican las medidasde control y organizacin relativas a las sustancias o a sus metabolitos y los gruposde residuos.

- Decisin de la Comisin 2006/130/CE de 10 de febrero de 2006, que designa losLaboratorios Nacionales de Referencia (LNR) para la deteccin de residuos en

animales vivos y sus productos.

- Lista de Laboratorios Comunitarios de Referencia y Nacionales de Referencia deSANCO de la Comisin Europea de 2011.

Documents

Protocolo Preparación Muestras Nt 18