Univerzitet u Beogradu - Poljoprivredni fakultet

Primena molekulskih metoda

i Ramanove mikroskopije/spektroskopije

u poljoprivrednim i prehrambeno - tehnološkim

naukama

Praktikum sa teorijskim osnovama

Urednici:

Vesna Rapić-Otrin

Dejan Lazić

Biljana Vucelić Radović

Miomir Nikšić

2017

Urednici:Vesna Rapić-OtrinDejan LazićBiljana Vucelić RadovićMiomir Nikšić

Primena molekulskih metodai Ramanove mikroskopije/spektroskopijeu poljoprivrednim i prehrambeno - tehnološkimnaukamaPraktikum sa teorijskim osnovama

Izdavač:Univerzitet u Beogradu - Poljoprivredni fakultet

Za izdavača:Prof. dr. Milica Petrović, dekan

Glavni i odgovorni urednik:Prof. dr Dušan Radivojević

Recenzenti:dr Smilja Teodorović, vanredni profesorKriminalističko-policijska akademija, Univerzitet u Beogradu

dr Radoš Gajić, naučni savetnikInstitut za �ziku, Univerzitet u Beogradu

Izdanje u elektronskom oblikuTiraž: 100 primerakaUmnožava: KAKTUS Print d.o.o. Beograd

CIP - Каталогизација у публикацијиНародна библиотека Србије, Београд

663/664:658.562(035)(02.034.2)543.424.2(035)(02.034.2)57.086.2/.3(035)(02.034.2)

PRIMENA molekulskih metoda i Ramanove mikroskopije/spektroskopije u poljoprivrednim i prehrambeno-tehnološkim naukama [Електронски извор] : praktikum sa teorijskimosnovama / urednici Vesna Rapić-Otrin ... [et al.]. - Beograd : Univerzitet, Poljoprivredni fakultet, 2017(Beograd : Kaktus Print). - 1 elektronski optički disk (CD-ROM) ; 12 cm

Sistemski zahtevi: Nisu navedeni. - Nasl. sa naslovnog ekrana. - Tiraž 100. - Bibliogra�ja uz svako poglavlje.

ISBN 978-86-7834-285-1

1. Рапић-Отрин, Весна, 1954- [уредник]a) Пољопривреда - Молекуларна испитивања - Приручници b) Прехрамбени производи - Молекуларна испитивања - Приручници c) Микроскопија - Приручници d) Спектроскопија - ПриручнициCOBISS.SR-ID 247151116

Istraživanja u ovom praktikumu sa teorijskim osnovama finansirane su

od strane projekta EU komisije - AREA,

Broj 316004 (FP7-REGPOT-0212-2013–I)

Sadržaj:

Deo I: PCR u poljoprivredi i prehrambenoj tehnologiji Osnove lančane reakcije polimeraze

Vesna Rapić-Otrin 1-28

Specifični protokoli za PCR u prehrambeno-tehnološkim i poljoprivrednim naukama: Biljne nauke

1. Fiziologija stresa biljaka: Dvostepeni PCR u realnom vremenu - analiza ekspresije 7 gena paradajza (Lycopersicon esculentum Mill.) Ivana Petrović 29-40

2. Herbologija:

Primena molekularnih metoda u proučavanju korova Dragana Božić, Markola Saulić, Sava Vrbničanin 41-47

3. Oplemenjivanje biljaka: Ekstrakcija DNA i primena SSR markera u genetičkoj indentifikaciji sorti vinove loze Zorica Ranković-Vasić and Dragan Nikolić 48-65

Mikroorganizmi

1. Ekološka mikrobiologija: Primena qPCR metode u ispitivanju kolonizacije biljaka patogenim bakterijama Igor Kljujev 66-78

2. Molekularna dijagnostika biljnih virusa i gljiva: Primena molekularnih metoda u dijagnostici fitopatogenih virusa, gljiva i pseudogljiva Ivana Stanković, Ana Vučurović 79-105

3. Fitobakteriologija: Real-time PCR detekcija karantinskih fitopatogenih bakterija u krtolama krompira i biljkama masline Milan Ivanović, Nemanja Kuzmanović, Nevena Zlatković 106-119

Prehrambena tehnologija i biohemija

1. Biohemija hrane: Primena PCR metode u biohemiji hrane Milica Pavlićević, Biljana Vucelić-Radović 120-140

Ribarstvo

1. Akvakultura šarana: Primena molekularnih metoda u akvakulturi i ribarstvu Zorka Dulić, Božidar Rašković, Saša Marić, Tone-Kari KnutsdatterØstbye 141-160

Deo II: Ramanova mikroskopija/spektroskopija u poljoprivredi i prehrambenoj tehnologiji

Uvod u Ramanovu mikroskopiju/spektroskopiju Dejan Lazić 160-166

Specifični protokoli za Ramanovu mikrospektroskopiju u prehrambeno-tehnološkim i poljoprivrednim naukama:

Uslovi rada u laboratoriji za Ramanovu mikrospektroskopiju Steva Lević 167-173

Mikroorganizmi Karakterizacija mikroorganizama pomoću Ramanove mikrospektroskopije Danka Radić 174-177

Ispitivanje hrane:

Polisaharidni ekstrakti gljiva-Traganje u mraku Jovana Vinduk 178-180 Primena Ramanove mikrospektroskopije za analizu proizvoda od mleka

Aleksandar Nedeljković 181-183

Biljne nauke: Funkcionalna anatomija biljaka:

Ramanova mikrospektroskopija u biljnim istraživanjima, detekcija

karotenoida u plodovima

Ilinka Pećinar 184-189

Materijali: Karakterizacija materijala metodom Ramanove mikrospektroskopije Steva Lević 190-194 Dodatna objašnjenja i praktična rešenja: Polarizaciona mikroskopija Dragana Rančić 195-198 Kratko uputstvo za upotrebu Ramanovog mikroskopa Horiba Xplora Dejan Lazić 199-204

Deo I: PCR u poljoprivredi i prehrambenoj tehnologiji

1

Osnove lančane reakcije polimeraze

Vesna Rapić-Otrin

Izvod

Cilj ovog poglavlja je predstavljanje osnova lančane reakcije polimeraze (PCR) i

podvarijante, kvantitativne lančane reakcije polimeraze u realnom vremenu (qPCR).

PCR predstavlja jedno od najznačajnijih otkrića u oblasti molekularne biologije, koje je

revolucionalizovalo analizu DNK molekula. Tokom ove reakcije, DNK molekul se

eksponencijalno umnožava uz kvalitativnu analizu na kraju PCR-a. qPCR je osetljiva,

precizna i pouzdana tehnologija za kvantifikaciju nukleinskih kiselina. Koristi se za

odredjivanje apsolutne ili relativne količine ciljne nukleinske kiseline (DNK, RNK i

cDNK) u realnom vremenu. Ubrzano je usvojena kao značajna istraživačka alatka u

istraživanju hrane. Test je standardizovan za otkrivanje i kvantifikovanje patogena,

kao sto su bakterije, virusi i paraziti koji se prenose hranom. Ovaj metod se takođe

koristi za proveru razlicitih aspekata bezbednosti i kvaliteta hrane, kao sto su detekcija

GMO i alergena u hrani i odedjivanje autenticnosti hrane.

1. Uvod u lančanu reakciju polimeraze - PCR

1.1. Šta je PCR?

• PCR je akronim koji potiče od engleskog naziva Polymerase Chain Reaction.

• PCR je enzimska reakcija zasnovana na osobinama specifičnih termostabilnih

DNK polimeraza (npr. Taq polimeraze).

• PCR se zasniva na seriji ponovljenih toplotnih ciklusa, koji omogućuju brzo i

eksponencijalno umnožavanje bilo koje sekvence DNK (lančana reakcija).

• PCR je molekularno biološka tehnika/metoda u kojoj se fragment DNK, prisutan

u vrlo malom broju kopija, umnožava in vitro. Za nekoliko sati može se

proizvesti do 109 kopija određene sekvence DNK.

• Metoda PCR zasniva se na mehanizmu in vivo replikacije DNK. Kratak rezime

o strukturi DNK nalazi se u Apendiksu A.

• VIDEO link: Polymerase Chain Reaction (PCR) DNA Learning Center (

https://www.youtube.com/watch?v=2KoLnIwoZKU).

1.2. PCR i Nobelova nagrada

• Kary Mullis i saradnici, koji su radili u korporaciji Cetus (Emeryville, CA),

eksperimentalno su definisali osnovne korake PCR-a (Mullis et al., 1986;

Saiki et al., 1985).

• Kasnija upotreba termostabilne DNK polimeraze iz bakterije Thermus

aquaticus bila je ključna inovacija koja je dovela do klasičnog PCR-a (Saiki et

al., 1988).

2

• 1989. godine časopis Science nazvao je Taq polimerazu (i PCR) "molekulom

godine". Članak “Taq PCR” (1988) je tokom nekoliko narednih godina postao

najčešće citirana publikacija u biologiji.

• 1993. godine Kary Mullis je dobio Nobelovu nagradu za hemiju “za razvijanje metode lančane reakcije polimeraze (PCR-a)”. U jednom intervjuu Kary Mullis objašnjava kako je lančana reakcija polimeraze (PCR) dobila svoj naziv - VIDEO link: http://www.dnalc.org/view/15138-Naming-PCR.html

1.3. Značaj i primena PCR-a

• Jedno od najznačajnijih otkrića u oblasti molekularne biologije koje je dovelo do

revolucije u analizama molekula DNK.

• Od otkrića, PCR je korišćen u više od 300,000 naučnih publikacija (pretražite

pubmed.com koristeći termin ‘real-time PCR’) (Rodríguez-Lázaro&Hernández,

2013).

• U istraživanjima u molekularnoj biologiji, PCR se često koristi u genetičkom

inženjerstvu, za genotipizaciju i sekvenciranje DNK, kao i za analize genske

ekspresije.

• U kliničkim laboratorijama, PCR je ključan za detekciju izazivača infektivnih

bolesti i utvrđivanje humanih genskih mutacija.

• Primene PCR-a u forenzici obuhvataju DNK profilisanje i utvrđivanje očinstva.

• PCR je doveo i do revolucije u nauci o hrani – detekcija patogena poreklom iz

hrane i vode, testiranje prisustva genetički modifikovanih organizama (GMO),

određivanje autentičnosti namirnica.

• Prednosti ovih testova su izuzetna osetljivost, prilagodljivost i specifičnost

PCR-a, s obzirom da se ciljne sekvence mogu detektovati čak i iz samo

jedne ćelije.

• Širok spektar primena, posebno u oblasti brige o zdravlju i bezbednosti hrane,

zahteva da dobijeni rezultati treba da budu pouzdani i uporedivi među

različitim laboratorijama.

1.4. Razvoj detekcije produkata PCR-a Detekcija DNK fragmenata amplifikovanih PCR-om može se izvršiti upotrebom

elektroforeze na agaroznom gelu, što je poznato kao krajnja ili analiza posle

PCR-a. Tokom gel elektroforeze, produkti nastali tokom PCR-a se razdvajaju

prema veličini i naelektrisanju; pojedinačni produkti se identifikuje na osnovu

očekivane dužine DNK. Ovaj test je označen kao tradicionalni PCR krajnjeg

produkta (PCR).

Upotrebom raznih fluorescentnih obeleživača, tradicionalni PCR se razvijao od

detekcije na kraju reakcije do detekcije umnožene DNK tokom same reakcije u

realnom vremenu. To je omogućilo tačnu kvantifikaciju ciljnih DNK i poznato je

kao kvantitativni PCR u realnom vremenu (qPCR).

3

Slika 1. Evolucija detekcije produkata PCR-a dovela je do razvoja kvantitativnog

PCR-a u realnom vremenu, (RT)-qPCR. (Adaptirano iz:

http://www6.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/rtpcr_vs_tradpcr.pdf )

2. Uvod u tradicionalni PCR krajnjeg produkta (PCR)

2.1. Princip PCR-a

Princip PCR-a se zasniva na replikaciji ćelijske DNK, procesu u kojem nastaju

dve identične kopije DNK od jednog originalnog molekula DNK. DNK se sastoji od

para komplementarnih polinukleotidnih lanaca (dvolančana DNK – dsDNK od eng.

double stranded DNA), od kojih svaki (jednolančana DNK – ssDNK od eng. single

stranded DNA) služi kao matrica za sintezu novog lanca DNK. Na taj način nastaju

dve identične kopije molekula DNK. Metoda zahteva: (i) visoku temperaturu za

denaturaciju DNK (dsDNK disosuje na ssDNK), (ii) toplotno stabilnu DNK polimerazu,

(iii) prajmere (kratke jednolančane nukleotidne sekvence) koji ograničavaju ciljnu

sekvencu koja će biti umnožena, i (iv) temperaturne cikluse koje generiše PCR aparat

(PCR cycler). U PCR-u, DNK fragment od interesa (ciljna DNK) amplifikuje se

eksponencijalno. Novosintetisana ciljna DNK iz jednog ciklusa služi kao matrica za

sledeći ciklus sinteze, čime započinje lančana reakcija. Posle 40 ciklusa PCR-a dobija

se oko 240 kopija ciljne sekvence DNK (Slika 2).

4

Slika 2. Eksponencijalna amplifikacija DNK PCR-om (Adaptirano iz: Rodríguez-Lázaro

&Hernández, 2013)

2.1.1. DNK polimeraze koje se koriste za PCR

Nekoliko tipova termostabilnih DNK polimeraza je dostupno za upotrebu u

PCR-u. One imaju dve sposobnosti koje ih čine pogodnim za PCR: (i) mogu da

generišu nove lance DNK koristeći DNK matrice i prajmere, i (ii) otporne

su na visoke temperature.

Taq DNK polimeraza, izolovana iz eubakterije Thermus aquaticus (Chien et

al., 1976), je najčešće korišćeni enzim za standardni PCR. Ova polimeraza je

aktivna na sobnoj temperaturi, tako da je neophodno da se reakcija priprema

na ledu, kako bi se izbegla nespecifična amplifikacija.

Modifikovani oblici Taq DNK polimeraze sada su dostupni za različite primene

PCR-a. Taq DNK polimeraza brzog starta pokazuje aktivnost tek na

temperaturama višim od 75°C, na kojima se prajmeri više ne vezuju

nespecifično za dsDNK matricu. Kao posledica toga, nespecifična amplifikacija

tokom početnih koraka uspostavljanja PCR-a je redukovana.

Pfu DNK polimeraza (izolovana iz Pyrococcus furiosus) široko se koristi zbog

svoje tačnosti prilikom kopiranja DNK. Ova polimeraza poseduje 3’5’

egzonukleaznu korektivnu aktivnost. Kako se komplementarna DNK sintetiše u

smeru 5’3’ na matričnoj DNK, egzonukleazna aktivnost odmah uklanja

nukleotide koji su pogrešno ugrađeni na 3’-kraj rastućeg lanca DNK.

Posledično, nastali PCR fragmenti imaju manje grešaka nego lanci koje

sintetiše Taq polimeraza.

5

2.2. Procedura PCR-a

2.2.1. Komponente osnovne reakcije PCR-a

Osnovna reakcija PCR-a zahteva nekoliko komponenti:

DNK matricu koja sadrži ciljnu DNK koja treba da bude amplifikovana.

Uobičajeno je da ciljni fragmenti DNK budu dužine između 0.1 i 10 hiljada

baznih parova (kb), u zavisnosti od specifične primene PCR-a.Dva prajmera

koja su komplementarna 3’-krajevima ciljnih fragmenata na obe ssDNK, koji se

nazivaju direktan (eng. forward) i obrnut (eng. reverse). Direktan prajmer

označava početak, dok obrnuti prajmer označava kraj ciljne sekvence DNK koja

treba da se amplifikuje.

Termostabilnu DNK polimerazu (videti 2.1.1.)

Nukleotide (dNTPs, dezoksinukleozid trifosfate), specifično četri tipa

nukleotida: A/dATP, T/dTTP, G/dGTP i C/dCTP, koji služe kao gradivni

elementi za sintesu novog lanca DNK.

Puferski rastvor koji obezbeđuje pogodno hemijsko okruženje za optimalnu

aktivnost i stabilnost DNK polimeraze.

Dvovalentni katjon, obično Mg2+.

Monovalentni katjon, K+.

Po potrebi, PCR aditive/ko-rastvarače (glicerol, deterdženti, PEG, BSA).

2.2.2. Uspostavljanje PCR reakcije

PCR se obično uspostavlja u reakcionoj zapremini od 10–100 μl u epruvetama

ili pločama, čija zapremina zavisi od tipa testa i PCR aparata koji se koriste.

Sve komponente reakcije mogu se pomešati bilo kojim redosledom, osim što

DNK polimerazu treba dodati na kraju. Preporučljivo je da se komponente

pomešaju neposredno pre započinjanja ciklusa. Za svaki PCR, obično se

koriste sldeće koncentracije komponenti:

o matrična DNK: 1-500 ng

o prajmeri: 0.05-1.0 μM

o Mg2+: 0.5-5 mM

o dNTP: 20-200 μM svaki

o 1xPCR pufer: 1 mM Tris-HCl and 5 mM KCl

o DNK polimeraza: 0.5-2.5 U na svakih 50μL PCR reakcione smeše

Zavisno od tipa DNK polimeraze koja se koristi, reakcija se priprema na ledu ili

na sobnoj temperaturi. Sa Taq DNK polimerazom reakcija treba da se priprema

na ledu kako bi se sprečila nespecifična amplifikacija. DNK polimeraze brzog

starta i vrućeg starta ne zahtevaju led, jer nisu aktivne na 75°C.

Epruvete se postavljaju u PCR aparat i bira se odgovarajući program za

amplifikaciju DNK.

VIDEO link: Kako postaviti PCR reakciju

(https://www.youtube.com/watch?v=NYlT3f-MZ5o)

6

2.2.3. PCR zahteva temperaturne cikluse kako bi se različiti koraci reakcije

odvijali

Jedan ciklus PCR-a sastoji se od tri koraka, od kojih svaki zahteva različitu

temperaturu.

o Korak 1: Denaturacija matrične dsDNK

o Korak 2: Hibridizacija prajmera za specifične sekvence matrične

ssDNK

o Korak 3: Elongacija svakog prajmera DNK polimerazom

Slika 3.PCR zahteva temperaturne cikluse kao uslov za odvijanje tri koraka reakcije

(denaturacije DNK, hibridizacije prajmera i elongacije prajmera). Povišavanjem i

snižavanjem temperature kontroliše se amplifikacija ciljne DNK. (Adaptirano iz:

http://biosistemika.com/workshops/qpcr-basics/)

Temperatura koja se primenjuje u svakom ciklusu zavisi od mnogih parametara,

kao što su temperatura topljenja prajmera, enzim koji se koristi za amplifikaciju DNK,

koncentracija Mg2+ i drugi. Pored pomenutih koraka koji se ponavljaju u ciklusima,

tipična PCR reakcija podrazumeva i dodatne temperaturne korake (videti ispod). Broj

ciklusa, kao i trajanje i temperatura svakog koraka, se zdadaju programom PCR

aparata.

Početna denaturacija: zagrevanje reakcije do temperature od 92-96°C (2-5

min)

Ciklirajući koraci (20-40 ciklusa):

o Korak denaturacije: Zagrevanje reakcije na 94–98°C u trajanju od

20–30 sec do 1min, čime se prouzrokuje denaturacija (topljenje)

dsDNK, tj. razdvajanje dsDNK u ssDNK.

o Korak hibridizacije prajmera: Reakciona temperatura se spušta na

50–68 °C tokom 20–40 sec do 1 min, kako bi se omogućila hibridizacija

prajmera sa matričnom ssDNK. Temperatura hibridizacije je obično za

7

oko 3–5°C niža od temperature denaturacije prajmera koji se koriste

(videti 2.5.1.).

o Korak elongacije prajmera: Temperatura zavisi od DNK polimeraze.

Za Taq polimerazu ona iznosi 72°C. Po pravilu, na svojoj optimalnoj

temperaturi, DNK polimeraza će polimerizovati oko 1000 baza u jednoj

minuti. Korak elongacije može se produžiti ako je ciljna DNK dugačka (>

1000 bp). U većini PCR reakcija, 1 min je dovoljan za kompletnu

elongaciju.

Finalna elongacija: Sprovodi se na temperaturi od 70-74°C u trajanju od 5-15

min, nakon zadatog broja ciklusa, kako bi se osigurala potpuna elongacija svih

prisutnih ssDNK.

Finalna zadrška: Zadržavanje reakcije na 4–15°C u neograničenom trajanju

može se primeniti za njeno kratkotrajno odlaganje.

Slika 4. Shema PCR reakcije (Adaptirano iz: Nolan, Huggett & Sanchez, 2013)

VIDEO link: PCR https://www.youtube.com/watch?v=iQsu3Kz9NYo

2.3. Faze PCR-a

Pod optimalnim uslovima, odnosno, ako ne postoje ograničenja u pogledu

dostupnosti supstrata ili reagenasa, u svakom koraku elongacije količina ciljne DNK

se udvostručuje, što vodi eksponencijalnoj amplifikaciji. Međutim, u standardnim

eksperimentalnim uslovima PCR se odvija kroz tri faze:

8

o Eksponencijalna faza: Količina sintetisane DNK (amplikon – proizvod

reakcije amplifikacije) se duplira i akumulira u svakom ciklusu. Reakcija

je vrlo specifična i precizna.

o Linearna faza: Reakcija se usporava zbog smanjenja dostupnosti

komponenata (inaktivacija polimeraze i potrošnja prajmera i dNTP).

o Plato: Reakcija se zaustavlja i nema više akumuliranja proizvoda zbog

nedostatka reagenasa i enzima. Ukoliko se ostavi duže na

neodgovarajućoj temperaturi, može započeti degradacija proizvoda

PCR-a.

Slika 5. Faze krive amplifikacije PCR-om. Prikazane su tri reakcije amplifikacije istog

uzorka. (Adaptirano iz:

http://www6.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/rtpcr_vs_tradpcr.pdf)

Region platoa predstavlja kraj amplifikacije i sadrži količinu PCR proizvoda koja se

detektuje elektroforetski u tradicionalnom PCR-u. Kao što je prikazano (Slika 5)

kvantifikacija PCR proizvoda u fazi platoa je nepouzdana. Neki od problema vezanih

za analizu u završnoj fazi su: (i) slaba preciznost, (ii) mala osetljivost, (iii) obrada posle

PCR-a, (iv) razlikovanje proizvoda samo na osnovu veličine, i (v) vizualizacija DNK

traka bojenjem etidijum bromidom nije kvantitativna. Rezultati se smatraju

kvalitativnim i pokazuju samo prisustvo ili odsustvo ciljne DNK, ali ne i njenu

koncentraciju. Dakle, PCR krajnjih proizvoda (konvencionalni PCR) je kvalitativni

PCR.

2.4. Sistemi detekcije PCR proizvoda

Detekcija proizvoda PCR reakcije može se izvršiti metodama gel ili kapilarne

elektroforeze.

Gel elektroforeza je metoda za razdvajanje DNK produkata prema njihovoj

veličini i naelektrisanju. Prema medijumu kroz koji se kreću negativno

naelektrisani fragmenti DNK, za validaciju PCR se mogu koristiti:

o Agarozna gel elektroforeza, koja ima veći opseg separacije,

jednostavna je za rad i u kojoj se DNK boji interkalirajućom bojom (npr.

9

etidijum bromid, SybrSafe, itd.). Detekcija DNK fragmenata

podrazumeva korišćenje izvora UV svetlosti, kao i sistem za

dokumentaciju.

o Poliakrilamidna gel elektroforeza (PAGE, od eng. polyacrylamide gel

electrophoresis) omogućava bolju rezoluciju i razdvajanja manjih

fragmenata.

o VIDEO link: elektroforeza DNK u gelu

https://www.youtube.com/watch?v=8RBs0Ghg_48

Kapilarna elektroforeza ima značajne prednosti u odnosu na gel

elektroforezu:

o Kapilarni sistem kombinuje kapilarnu elektroforezu sa fluorescentnom

detekcijom, što smanjuje potrošnju uzorka i vreme razdvajanja.

o Obezbeđuje preciznu analizu niske koncentracije nukleinskih kiselina sa

rezolucijom od 3-5 bp.

o Brza analiza velikog broja uzoraka bez manuelne intervencije.

o Pogodnost i bezbednost rukovanja sa unapred pripremljenim kasetama

gelova koje se isporučuju sa uređajem za kapilarnu elektroforezu (npr.

QIAxcel Advanced System).

o VIDEO link: Qiagen QIAxcel advanced

https://www.youtube.com/watch?v=RHMCr82_TEI

Slika 6. PCR proizvodi obojeni etidijum bromidom nakon gel elektroforeze. U uzorku

#1 nije bilo amplifikacije. DNK trake u uzorcima #2 i #3 pokazuju uspešnu amplifikaciju

ciljne sekvence. Na gelu se vidi i pozitivna kontrola, kao i lestvičasti obrazac DNK

fragmenata definisanih dužina (DNK standard) koji služi za određivanje dužine DNK

fragmenata u eksperimentalnim PCR reakcijama. (Adaptirano iz:

https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=17271079)

10

2.5. Dizajniranje prajmera i optimizacija PCR testa

2.5.1. Dizajniranje prajmera

Dobar dizajn prajmera je jedan od najvažnijih parametara efikasnosti PCR-a.

Prajmeri se dizajniraju tako da budu potpuno komplementarni sekvencama matrične

DNK sa kojima treba da hibridizuju. Osnovni principi dizajniranja prajmera su:

• Dužina prajmera: Dužina prajmera je kritična za uspeh PCR-a; ona utiče na

specifičnost, temperaturu topljenja i vreme potrebno za hibridizaciju. Dužina

prajmera od 18-30 baza je optimalna za najveći broj primena PCR-a. Kraći

prajmeri mogu da rezultiraju u nespecifičnoj PCR amplifikaciji. Duži prajmeri su

specifičniji, ali mogu da formiraju sekundarne strukture. Direktni i obrnuti

prajmeri treba da imaju slične temperature topljenja.

• Temperatura topljenja prajmera: Specifičnost PCR-a umnogome zavisi od

tačke topljenja (Tm) prajmera. Tm je temperatura na kojoj se polovina lanaca

DNK nalazi u obliku slučajno ispresavijanog klupka ili u jednolančanom stanju

(ssDNK). Tačka topljenja (Tm) se može izračunati prema formuli:

Tm=2°C x (A+T) + 4°C x (G+C)

• Optimalna temperatura topljenja prajmera je od 55 do 60°C.

• Temperatura topljenja amplikona: Pored izračunavanja temperature

topljenja prajmera, temperature topljenja proizvoda treba da budu dovoljno

niske tako da njihovo topljenje bude potpuno na 92°C. U principu, proizvodi

između 100 i 600 bp uspešno se amplifikuju PCR-om.

• Sekundarne strukture: Prilikom dizajniranja prajmera treba obratiti pažnju i na

sekundarne strukture. Sekvence prajmera sa sebi-homologim regionima mogu

da formiraju strukture delimično dvolančanih ukosnica, a homologija među

prajmerima može dovesti do formiranja dimera prajmera. Dimeri prajmera se

mogu detektovati na gelu, kao trake malih molekulskih tezina.

P1: 5'-...GGCGATCG-3'

|| | | | |

3'-GCTAGCGG...-5' : P1

• Ponovljene sekvence i monotoni nizovi: Prajmere sa dugačkim nizovima

jedne iste baze (...AAAAA...) ili sa ponovljenim sekvencama, u principu, treba

izbegavati.

• GC spona: Uključivanje G ili C ostatka na 3’-kraj prajmera povećava efikasnost

prajmera. “GC spona” pomaže da se osigura ispravno sparivanje 3’-kraja

prajmera zbog jačeg vezivanja G i C ostataka vodoničnim vezama.

• Amplifikacija ciljnih sekvenci sa visokim sadržajem GC: Za amplifikaciju

DNK bogatih GC nukleotidima preporučuju se prajmeri sa višim Tm (75°C-

80°C). Temperatura razdvajanja lanaca za DNK bogate GC je znatno viša u

poređenju sa normalnim DNK.

• Nenamerne homologije: Takve homologije mogu da dovedu do pogrešne

hibridizacije prajmera i proizvodnje nespecifičnih amplikona. Stoga je

preporučljivo upotrebljavati programe poput BLAST

(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/howto/design-pcr-primers/), kako bi se ispitala

11

unakrsna homologija prajmera sa ponovljenim sekvencama ili sa nenamernim

ciljnim sekvencama u genomu.

2.5.2. Alatke za dizajniranje prajmera dostupne online

Postoji nekoliko servisa za dizajniranje komplementarnih prajmera (i proba,

korišćenih za qPCR) koje pružaju proizvođači oligonukleotida ili državne i obrazovne

institucije:

Primer3: http://bioinfo.ut.ee/primer3/

OligoArchite: http://www.sigmaaldrich.com/technical-

documents/articles/biology/probe-design-services.html

Beacon Designer: http://www.premierbiosoft.com/qpcr/index.html (provides a

software package for purchase)

PrimerBank: https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/

NCBI GenBank: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/

Mfold Webserver: http://unafold.rna.albany.edu

NCBI Primer Design Tool – Primer-BLAST:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

VIDEO link: Using NCBI for Primer Design

https://www.youtube.com/watch?v=ms1uqG79oFs

2.5.3. Optimizacija testa

Osim dizjniranja prajmera, hemijska priroda same reakcije je kritican parameter

za uspesan PCR:

Dvovalentni katjon: Prisustvo slobodnih jona magnezijuma je neophodno za

aktivnost DNA polimeraze. Mg2+ formira komplekse sa nukleotidima, što

omogucava njihovo ugradjivanje u amplikon tokom elongacije. Zbog toga je

neophodno obezbedititi ravnotezu koncentracija Mg2+ i dNTPs. Osim za

nucleotide, joni magnezijuma se vezuju za prajmere i dvolancanu DNK, te je

potrebno voditi računa o koncentraciji magnezijuma ukoliko se koncetracija ovih

komponenti menja. Prisustvo magnezijuma u koncentraciji većoj od optimalne

može da stabilizuje nespecificno vezivanje prajmera, što dovodi do smanjnenog

prinosa specifične sekvence.

Monovalentni katjon: Većina komercijalnih PCR pufera sadrži monovalentne

jone K+, koji stabilizuju hibridizaciju prajmera, vezujući se za negativne fosfatne

grupe na DNK.

PCR aditivi (glicerol, deterdženti, PEG, BSA, DMSO) mogu da uticu na

temperature topljenja, pojačavaju enzimsku procesivnost, stabilizuju DNK

polimerazu i sprečavaju vezivanje polimeraze za plastiku tuba u kojima se

izvodi test.

Upotreba reagenasa visoke čistoće je bitna za uspešan PCR, pogotovo za

amplifikaciju gena koji se nalaze u pojedinačnim kopijama u genomskoj DNK.

12

2.6. Primene dobre laboratorijske prakse u izvodjenju PCR-a

Izuzetna ostljivost je jedno od najznačajnijih svojstava PCR, ali istovremeno i

njegova najveća mana, jer test ima tendenciju da proizvede lažno pozitivan rezultat

usled egzogene kontaminacije. Zaštita od kontaminacije je najznačajniji činilac u

organizovanju PCR laboratorije, naročito ako se radi o dijagnostičkoj laboratoriji

(Public Health England 2013; Lo & Chan 2006).

Izvori kontaminacije:

o PCR produkat iz predhodne amplifikacije

o DNK predhodno klonirana u laboratoriji

o kontaminacija izmedju uzoraka

o neizbežno pristvo matrične DNK u laboratorijskom prostoru, bilo da je

izvor osoblje ili materijal koji se koriste za ekstrakciju DNK

Principi izbegavanja kontaminacije:

o Fizičko razdvajanje pojdinacnih faza u toku izvodjenja PCR-a:

Preporučuje se organizovanje tri zasebna prostora: prostor za pripremu

uzoraka; prostor za pripremu PCR reakcije i prostor za analizu produkta

PCR-a. Preporučuje se da se svaki deo opreme smesti u zaseban

proctor. Tokom eksperimenta, prenošenje materijala i kretanje osoblja

mora biti jednosmerno, od prostora za pripremu uzoraka do prostora za

njihovu analizu.

o Laboratoriska praksa dizajnirana da smanji rizik od kontaminacije:

Razdeliti sve reagense u manje zapremine i kolicine i tako ih čuvati;

često menjati rukavice; koristiti jednokratne pipete i nastavke za

pipetiranje kao i ostalu laboratorisku plastiku; gde je moguce, pripremiti

“master-mix” i time smanjiti broj pipetiranja za pojedinačne uzorke; ako

je moguce koristiti zatvoren PCR system (qPCR sa fluorescentnom

probom) koji ne zahteva otvaranje tuba i ploča u kojima se nalazi

reakciona smeša, čime se smanjuje mogućnost kontaminacije izmedju

uzoraka i eliminiše post-PCR analiza.

o Primena posebnih mera za izbegavanje kontaminacije: koristiti UV-

lampe za sterilizaciju suvih laboratoriskih površina; primeniti selektivnu

eliminaciju nukleinskih kiselina u uzorku bez razaranje matrice DNK (npr.

ugradjivanje dUTP i tretiranje uracil glikozilazom-UNG nakon

toga:Longo et al., 1990).

Detekcija kontaminacije: Praćenje pojave kontaminacije je podjednako važno

kao i primena preventivnih mera. Obavezno primeniti višestruke kontrole za

svaku fazu u PCR testu: negativna kontrola bez matrične DNA; kontrola za

proveru kontaminacije tokom ekstrakcije uzorka i specificne kontrole u zvisnosti

od vrste testa.

Korektivne mere: U slucaju da se ustanovi prisustvo kontaminacije, potrebno

je zaustaviti sve eksperimentalne radnje dok se uzrok kontaminacije ne

eliminiše, najčešće odbacivanjem kontaminiranih reagenasa i/ili čišćenjem

opreme.

VIDEO link: Kako kontrolisati kontaminaciju u PCR laboratoriji?

https://www.youtube.com/watch?v=k4_AVz6IoUM

13

3. Uvod u kvantitativnu lančanu rekciju polimeraze u

realnom vremenu (qPCR) Ograničenja analize podataka posle PCR-a, kada je u pitanju PCR krajnjih

proizvoda, nametnula su potrebu da se test modifikuje tako da se podaci prikupljaju i

kvantifikuju u realnom vremenu. Razvoj specifičnih fluorescentnih marker boja

iinstrumenata ranih 90-tih godina 20. veka (Holland et al., 1991; Higuchi et al., 1992;

Higuchi et al., 1993) omogućila je razvoj i širu upotrebu kvantitativnog PCR-a u

realnom vremenu (qPCR).

• qPCR meri apsolutnu ili relativnu količinu ciljne sekvence u realnom

vremenu, kvantitativno određuje polaznu količinu DNK, RNK ili cDNK.

• qPCR obično određuje da li je sekvenca DNK prisutna u uzorku, kao i broj

njenih kopija u uzorku

• qPCR je izvanredna metoda u laboratorijama za molekularnu dijagnostiku,

zato sto omogućava procesuiranje velikog broja uzoraka (384 do 1536 reakcija

po plate-u), sa minimalnim učešćem laboratorijskog osoblja. qPCR se redovno

koristi za detekciju i kvantifikaciju genetski modifikovanih organizama, testiranje

autentičnosti hrane i odredjivanje genotipa.

• Smernice “Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR

Experiments” (MIQE) predlažu da se skraćenica qPCR upotrebljava u značenju

kvantitativnog PCR-a u realnom vremenu, a skraćenica RT-qPCR se koristi da

označi proces reverzne transkripcije qPCR-om (Bustin et al., 2009).

3.1. Princip qPCR-a

Princip qPCR-a je isti kao i princip PCR-a krajnjih proizvoda, uz dve

modifikacije: (i) umnožena DNK je fluorescentno obeležena (fluorescentne boje ili

DNK probe koje sadrže fluorofore), i (ii) količina fluorescencije oslobođena tokom

amplifikacije direktno je proporcionalna količini amplifikovanog proizvoda u realnom

vremenu. Fluorescencija se posmatra tokom čitavog PCR procesa. Ako je početni broj

molekula DNK u uzorku veći, fluorescencija će rasti brže tokom PCR ciklusa; ako

uzorak sadrži više ciljnih sekvenci, fluorescencija će biti detektovana ranije. Ciklus u

kome fluorescencija dostiže nivo praga detekcije naziva se pražni ciklus (Ct), tačka

ukrštanja (Cp) ili kvantifikacioni ciklus (Cq). Vrednost Ct/Cp/Cq je u obrnutoj

korelaciji sa količinom nukleinske kiseline koja je bila prisutna u originalnom

uzorku. Ova vrednost je uvek u eksponencijalnoj fazi amplifikacije. Niža vrednost

Ct/Cp/Cq označava da je veći broj kopija ciljne sekvence inicijalno bio prisutan u

uzorku (Slika 7).

14

Slika 7.Dijagram amplifikacije tokom PCR-a u realnom vremenu. Prikazana je

zavisnost fluorescentnog signala iz svakog uzorka od broja cilusa. Krive amplifikacije

dobijene su serijskim razblaženjem ciljne DNK. Krive predstavljaju akumulaciju

proizvoda tokom PCR reakcije. (Adaptirano iz: Real-time PCR handbook,

ThermoFisher Scientific - https://www.thermofisher.com/rs/en/home/life-

science/pcr/real-time-pcr/qpcr-education/real-time-pcr-handbook.html)

3.2. Koraci qPCR-a

Osnovni koraci qPCR-a su isti kao i u PCR-u krajnjih proizvoda (denaturacija,

hibridizacija i elongacija), uz dodatak koraka u posebnoj varijanti qPCR-a poznatoj kao

kvantitativni PCR sa reverznom transkripcijom (RT-qPCR). U ovom testu, polazni

materijal je iRNK, koja se reverznom transkripcijom (RT) prevodi u cDNK, i dalje

amplifikuje PCR-om u realnom vremenu bilo jednostepenom ili dvostepenom RT-

qPCR reakcijom.

Jednostepeni RT-qPCR: u ovom testu reverzna transkripcija i PCR se

istovremeno dešavaju u reakcionoj smeši. Specifični prajmeri za ciljni gen se

koriste za sintezu cDNK i za kasniju amplifikaciju. Prednosti jednostepene

reakcije su: umanjen broj koraka, eliminianje mogućnosti kontaminacije izmedju

RT i PCR faze i olakšano procesiranje velikog broja uzoraka. Metoda najbolje

funkcioniše u eksperimentima sa velikim brojem RNK uzoraka i malim brojem

ciljanih gena.

Dvostepeni RT-qPCR: u ovom testu reverzna transkripcija i PCR se odvijaju

kao dve zasebne reakcije, gde se prvo RNK konvertuje u cDNK, koristeći

random heksamere ili oligo dT prajmere, čime nastaje cDNK biblioteka svih

RNK vrsta prisutnih u uzorku.Deo uzorka dobijen reverznom transkripcijom se

koristi u qPCR-u. Upotrebom cDNK iz iste RT reakcije za višestruke PCR-ove

olakšava uporedjivanje rezultata izmedju različitih eksperimenata. Dodatno,

detektovane promene i greške su ograničene na proces amplifikacije qPCR-

om. Zbog mogućnosti optimizacije obe reakcije, dvostepeni PCR je mnogo

osetljiviji od jednostepenog.

15

3.3 Komponente qPCR/RT-qPCR-a

3.3.1. Specifične komponente i parametri qPCR-a su:

Reverzna transkriptaza (RT) je enzim čija DNK polimerazna aktivnost zavisi od

prisustva RNK molekula, koji služe kao matrica za sintezu cDNK u RT-qPCR.

Važno je izabrati RT koja će obezbediti sintezu ukupne dužine ciljne cDNK i

koja radi efikasno na visokim temperaturama.

dNTP: preporučuje se da budu od istog dobavljača kao DNK polimeraza da bi

se smanjila mogućnost gubitka aktivnosti u toku eksperimenta.

Koncentracija Mg2+ od 3mM je uobičajena za amplifikaciju većine DNK, mada

se u nekim slučajevima može koristiti i do 6mM.

Matrica: preporučljivo je koristiti 10 do 1000 kopija matrica nukleinske kiseline

za svaku qPCR reakciju. Ovo je ekvivalentno količini od 100pg do 1μg

genomske DNK ili cDNK dobijene od 1pg do 100 ng ukupne RNK.

3.3.2. Dizajn prajmera i proba

Osnovna razmatranja su slična onima za dizajniranje prajmera za konvecionalni

PCR, uz dodatne zahteve koji se odnose na dizajniranje proba.

Dužina probe je obično 20-30 baza;

Kada se koriste probe za hidrolizu, Tm treba da bude 7 to 10°C viša nego Tm

prajmera kako bi se osiguralo da se proba veže pre nego što prajmeri

hibridizuju i elongacija započne;

Ako se probe za hidrolizu koriste za kvantitativne studije, proba treba da se

postavi u blizinu 3’-kraja direktnog prajmera, ali da se ne preklopi sa njim;

Treba izbeći guanidin na 5’-kraju proba, pored reportera, zato što to uzrokuje

prigušivanje;

Treba obezbediti da nema više G nego C u sekvenci probe.

3.4 Kvantitativna analiza qPCR-a

Emisija fluorescencije tokom qPCR-a je proporcionalna sintetisanoj DNK, i

može se vizualizovati kao amplifikaciona kriva (Slike 7 i 8). Kvantifikacija proizvoda

qPCR-a moguća je samo u fazi amplifikacije. Glavni pojmovi koji se koriste u ovoj

analizi:

Osnovna linija odnosi se na nivo signala tokom početnih ciklusa (3 do 15) u

kojima se signal veoma malo menja. Osnovna linija se određuje empirijski za

svaku reakciju, obično automatskom analizom krive. Osnovna linija treba da

bude pažljivo definisana kako bi se mogao precizno odrediti pražni ciklus (Ct).

Kada se porede različiti eksperimenti, osnovna linija za svaki od njih treba da

bude definisana na isti način (Slika 8).

16

Slika 8. Osnovna linija i prag PCR-a u realnom vremenu. (Adaptirano iz: Real-time

PCR handbook, ThermoFisher Scientific)

Prag je nivo signala koji reflektuje statistički značajan porast u odnosu na

osnovnu liniju. Najčešće, njega automatski postavlja softver instrumenta.

Pražni ciklus (Ct), ili prema MIQE odrednicama (3.4.) kvantifikacioni ciklus

(Cq), je ciklus u kome fluorescencija dostiže/prelazi preko pražnog nivoa

detekcije (Bustin, 2004; Bustin & Nolan, 2004; Logan et al., 2009). Kao što je

rečeno (3.1), Ct/Cp/Cq se koristi za izračunavanje početnog broja kopija DNK

(RNK ili cDNK), zato što je vrednost Ct obrnuto proporcionalna početnoj količini

ciljne DNK (RNK ili cDNK). Ako se porede uzorci sa različitom količinom ciljnih

molekula, uzorak sa dvostrukim brojem kopija u odnosu na drugi uzorak, dostići

će Ct za jedan ciklus ranije od drugog uzorka. Sa serijom razblaženja od 10

puta, vrednosti Ct se razlikuju za oko 3,3 (Slika 7).

Standardna kriva: Serija razblaženja poznate koncentracije matrice koristi se

za uspostavljanje standardne krive za određivanje početne količine ciljne

sekvence u eksperimentalnim uzorcima (Rutledge & Côté, 2003). Logaritam

svake od poznatih koncentracija u seriji razblaženja (x-osa) predstavlja se na

grafiku nasuprot Ct vrednosti za odgovarajuću koncentraciju (y-osa) (Slika 9).

Iz standardne krive se mogu odrediti različiti parametri reakcije:

o Nagib je mera efikasnosti reakcije. Da bi se dobili tačni i

reproducibilni rezultati, efikasnost reakcije treba da bude blizu 100%,

što je ekvivalentno nagibu od ~ 3.32.

o Koeficijent korelacije (R2) pokazuje koliko se dobro podaci uklapaju

u standardnu krivu. Vrednost R2 reflektuje linearnost standardne

krive; idealno, R2 = 1, iako je 0.999 maksimalna vrednost.

o Odsečak na y-osi odgovara teorijskoj granici detekcije reakcije. Broj

kopija od 2-10 je određen kao najniži nivo ciljne sekvence koji se

može pouzdano kvantifikovati primenom qPCR-a.

17

Slika 9. Primer standardne krive za qPCR. Standardna kriva pokazuje pražni ciklus

(Ct) na y-osi i početnu količinu ciljne RNK ili DNK na x-osi. Vrednosti za nagib, odsečak

na ordinati i koeficijent korelacije koriste se za dobijanje informacija o efikasnosti

reakcije. (Adaptirano iz: Real-time PCR handbook, ThermoFisher Scientific)

Kvantifikacija: Postoje dva načina za kvantifikaciju nukleinske kiseline qPCR-

om:

o Apsolutna kvantifikacija opisuje qPCR eksperiment u kojem su uzorci

sa poznatim količinama serijski razblaženi i amplifikovani kako bi se

generisala standardna kriva. Nepoznati uzorci se onda kvantifikuju

poređenjem sa tom krivom.

o Relativna kvantifikacija opisuje qPCR eksperiment u kojem se

ekspresija gena od interesa u jednom uzorku poredi sa ekspresijom istog

gena u drugom uzorku. Takvi rezultati se predstavljaju kao promena

ekspresije u prvom uzorku u odnosu na drugi. U ovaj tip eksperimenta

mora se uključiti gen za normalizaciju ili referentni gen kao kontrola za

eksperimentalnu varijabilnost. Relativno poređenje genske ekspresije je

najpouzdanije kada je nivo ekspresije referentnog gena konstantan u

svim uzorcima.

3.5. Fluorescentni sistem detekcije za validaciju qPCR-a

3.5.1. Fluorescencija koja se posmatra tokom procesa qPCR-a može se detektovati

na dva načina: (i) strategijom nespecifične detekcije nezavisne od ciljne sekvence ili

(ii) pomoću fluorescentnih oligonukleotidnih proba specifičnih za sekvencu.

Detekcija fluorescencije nespecifične za ciljnu sekvencu zasniva se na

fluorescentnim bojama koje imaju posebne fluorescentne osobine kada su

vezane za dsDNK. Najčešće korišćeni test se zasniva na upotrebi boje SYBR

Green I (Bengtsson et al., 2003). SYBR® Green I se vezuje za mali žljeb

dsDNK, nezavisno od ciljne sekvence. Pobuđivanje bojeSYBR® Green vezane

za DNK proizvodi mnogo jači fluorescentni signal u poređenju sa nevezanom

bojom (Slika 10). Ako je ciljna sekvenca prisutna, akumulirani proizvodi dsDNK

18

će proizvesti vidljivi fluorescentni signal iznad pražne linije. Veoma je važno

ispitati specifičnost testa kada se koristi SYBR Green I detekcioni sistem, zato

što dobijena kriva amplifikacije može da potiče od ciljne sekvence, nespecifične

ciljne sekvence ili smeše obe. Prema tome, treba da se uradi analiza krive

topljenja kako bi se napravila razlika između amplikona specifičnih za ciljnu

sekvencu i nespecifičnih amplikona. Različiti proizvodi qPCR-a mogu imati

različitu dužinu i bazni sastav, što ima za posledicu različite Tm.

Slika 10. Princip metode za detekciju na bazi bojenja dsDNK bojom SYBR® Green

I. (Adaptirano iz: Nolan, Huggett & Sanchez, 2013)

Fluorescentne oligonukleotidne probe specifične za sekvencu. Zajednička

osobina različitih proba je homologija sa internim regionom, amplifikovanim sa

dva prajmera. Tako se detekcioni sistem sastoji od tri oligonukleotida: dva

prajmera i jedne probe. Najpoznatije probe za hidrolizu su TaqMan probe (Slika

11.) Proba je dvostruko obeležena sa reporterskom fluoroforom na 5’-kraju

(reporterska boja) i prigušivačem na 3’-kraju (prigušivačka boja). Pored toga,

proba mora da bude blokirana na 3’-kraju, kako bi se sprečila njena ekstenzija

tokom hibridizacije. Posle amplifikacije ciljne sekvence specifičnim prajmerima,

specifična TaqMan proba će hibridizovati sa homolognom ciljnom sekvencom.

U narednom elongacionom ciklusu, proba će se naći na putu Taq polimeraze

koja izdužuje prajmer. Kada enzim stigne do hibridizovane probe, on svojom

5’3’ egzonukleaznom aktivnošću degradira probu (Lyamichev et al., 1993).

Kada se intaktna TaqMan proba pobudi svetlosnim izvorom, emisija

reporterske boje biva prigušena prigušivačkom bojom zbog njihove blizine. U

ranim ciklusima PCR-a, detektuje se samo nizak, prigušeni reporterski signal.

Kada je proba degradirana, poveća se rastojanje između reportera i

prigušivača, što dovodi do toga da se pojača fluorescentna emisija reportera, a

smanji emisija prigušivača. Fluorescentna emisija merljiva u realnom vremenu

direktno je proporcionalna koncentraciji ciljne sekvence sa kojom je TaqMan

proba hibridizovana (Heid et al., 1996). Pošto polimeraza degradira probu samo

kada je ova hibridizovana sa ciljnom DNK, temperaturni uslovi faze elongacije

PCR-a moraju biti takvi da obezbeđuju vezivanje probe.

19

Slika 11. Princip metode za detekciju na bazi upotrebe TaqMan® proba (Adaptirano

iz: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Taqman.png )

Pasivne referentne boje često se koriste za PCR u realnom vremenu za

normalizaciju fluorescentnog signala reporterske boje i korekciju za fluktuacije

u fluorescenciji koje nisu vezane za PCR (npr. izazvane variranjem u pipetiranju

ili “šumom” samog aparata). Većina PCR instrumenata koristi ROX boje kao

pasivne referentne boje, zato što ove boje ne utiču na reakciju PCR-a u realnom

vremenu.

3.5.2.Instrumenti za qPCR i kalibracija

Instrumenti: Pored aparata za umnožavanje DNK, svaki model mora da

poseduje izvor za pobuđivanje, koji pobuđuje fluorescentne boje, kao i detektor

za detekciju fluorescentne emisije. Termalni blok može da primi različite

reakcione ploče za PCR (sa 48, 96 ili 384 bunara, sa 384-microwell cards, itd).

Svi instrumenti za PCR u realnom vremenu opremljeni su softverom za

prikupljanje i analizu podataka. Prva qPCR mašina je opisana 1993. godine

(Higuchi et al., 1993).

Kalibracija: Instrumenti za PCR u realnom vremenu treba da budu kalibrisani

kao deo redovnog protokola održavanja, kao i pre prve upotrebe novih boja,

prema uputstvima proizvođača.

20

3.6. MIQE odrednice: “Minimum Information for Publication

of Quantitative Real-Time PCR Experiments”

qPCR je postala standardna tehnologija za detekciju i kvantifikaciju nukleinskih

kiselina u istraživanjima, dijagnostici, forenzici i biotehnologiji. Uprkos širokoj primeni,

metoda je manjkavo standardizovana, što može dovesti do problema u kritičkoj

proceni kvaliteta publikovanih rezultata ili prilikom ponavljanja rezultata od strane

drugih istraživača. Neprikladna kombinacija pripremnih radnji, dizajna testa i metoda

analiziranja rezultata može rezultirati u publikacijama sa nekonzistentnim i čak

netačnim podacima. Ovo ugrožava integritet naučne literature i može imati ozbiljne

posledice za bazična istraživanja, kao i istraživanja lekova, kontrolu zdravlja i hrane.

(Bustin 2010.) Medjunarodni konzorcijum akademskih naučnika se pozabavio ovim

pitanjem i publikovao odrednice kojima se predlaže minimum standarda za pisanje

izveštaja o qPCR eksperimentima (“MIQE”). Odrednice se sastoje iz sledećih delova:

1) dizajn eksperimenta, 2) uzorkovanje, 3) ekstrakcija nukleinske kiseline, 4) reverzna

transkripcija, 5) informacija o ciljanom uzorku, 6) oligonukleotidi, 7) protokoli, 8)

provera i 9) analiza rezultata. U okviru svakog dela, pojedinačne stavke se

obeležavaju kao E (neophodne) ili D (poželjne). One koje su obeležene sa E se

smatraju obaveznim, dok su one obeležene sa D smatraju potrebnim za kvalitetno

izvodjenje eksperimenta (Bustin et al., 2009). Tabela 1 “Checklist for authors,

reviewers and editors” iz publikacije (Bustin et al., 2009) se nalazi u Apendiksu B.

Primena ovih smernica u izvodjenju qPCR-a i publikaciji rezultataje bitna za

prerastanje qPCR-a u robustan, precizan i pouzdan metod za kvantifikaciju

nukleinskih kiselina (De Keyser et al., 2013; Rodríguez-Lázaro, 2013).

VIDEO link: Stephen Andrew Bustin: Why the need for qPCR publication

guidelines? – The case for MIQE

http://www.econferences.de/why-the-need-for-qpcr-publication-guidelines-the-

case-for-miqe/

4. Zahvalnice

Ovaj rad je omogućen zahvaljujući podršci AREA projekta,broj 316004(FP7-

REGPOT-0212-2013–I), finansiranog od strane Evropske Unije. Autor se zahvaljuje

svim članovima AREA tima, a posebno onima koji su direktno učestvovali u pripremi

ovog priručnika, na izvanrednoj i uspešnoj saradnji tokom trajanja projekta. Specijalna

zahvalnost profesorki Dr. Gordani Matić za pomoć u prevodjenju ovog poglavlja na

srpski jezik.

21

Pitanja:

1. Koji je princip lančane reakcije polimeraze?

2. Koji su koraci tokom PCR reakcije?

3. Na šta treba obratiti pažnju tokom dizajniranja PCR prajmera?

4. Koja je glavna prednost kvantitativne PCR reakcije (qPCR) u poređenju sa

standardnom PCR reakcijom?

5. Koje vrste qPCR reakcije postoje i po čemu se razlikuju?

5. Literatura

Bengtsson M et al. (2003).A new minor groove binding asymmetric cyanine reporter

dye for real-time PCR.Nucleic Acids Res. 31, e45.

Bustin SA (2010). Why the need for qPCR publication guidelines?--The case for MIQE. Methods 50 (4):217–26.

Bustin SA (2000).Absolute quantification of mRNA using real-time reverse

transcription polymerase chain reaction assays.J Mol Endocrinol.25 (2):169–93.

Bustin SA et al. (2009). The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4):611-22.

Bustin S A & Nolan T (2004). Pitfalls of quantitative real-time reverse-

transcriptionpolymerase chain reaction. J Biomol Tech.15 (3):155-166.

Bustin S A (2004). A-Z of quantitative PCR. International University line, La Jolla,

California, pp. 5-26, 87-112, 244-245.

Chien A (1976). Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile

Thermus aquaticus. J Bacteriol. 127(3):1550–1557.

De Keyser et al. (2013). How to perform RT-qPCR accurately in plant species? A case

study on flower colour gene expression in an azalea (Rhododendron simsii hybrids)

mapping population. BMC Mol Biol. 14:13

Heid CA 1996). Real time quantitative PCR. Genome Res. 6: 986–994.

Higuchi R (1992). Simultaneous amplification and detection of specific DNA

sequences. Biotechnology.10(4):413–417.

Higuchi R (1993). Kinetic PCR: Real time monitoring of DNA amplification reactions.

Biotechnology. 11(9):1026–1030.

Holland PM (1991).Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing

the 5' to 3' exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase. Proce Natl

Acad Sci USA. 88(16): 7276–7280.

22

Logan J (2009). Real-Time PCR: Current Technology and Applications Caister

Academic Press. Editor: Applied and Functional Genomics, Health Protection Agency,

London. (2009), pp. 284

Lo YM & Chan KC (2006). Setting up a polymerase chain reaction laboratory. Methods

Mol Biol. 336:11-8.

Longo MC et al. (1990). Use of uracil DNA glycosylase to control carry over

contamination in polymerase chain reactions. Gene. 93:125-8.

Lyamichev V (1993). Structure-specific endonucleolytic cleavage of nucleic acids by

eubacterial DNA polymerases. Science. 260(5109):778–783.

Mullis KB et al. (1986). Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the

polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symp.Quant. Biol. 51:263–73.

Nolan T et al. (2013), Good practice guide for the application of quantitative PCR. UK

National Measurement System.

http://www.lgcgroup.com/our-science/national-measurement-institute/publications-

and-resources/good-practice-guides/good-practice-guide-for-the-application-of-

quantit/#.V0NkniSbBVI

Health England (2013). Good Laboratory Practice when Performing Molecular

Amplification Assays. UK Standards for Microbiology Investigations. Q 4 Issue 4.4

https://www.gov.uk/government/publications/smi-q-4-good-laboratory-practice-when-

performing-molecular-amplification-assays

Rodríguez-Lázaro D &Hernández M (2013). Real-time PCR in Food Science:

Introduction. Curr. Issues Mol Biol. 15:25-38.

Rodríguez-Lázaro D. (2013). Editor: Real-time PCR in Food Science: Current

Technology and Applications.Caister Academic Press/Horizon Scientific Press, Poole,

United Kingdom

Rutledge R G & Côté C (2003).Mathematics of quantitative kinetic PCR and the

application of standard curves. Nucleic Acids Res. 31(16):1-6.

Saiki RK et al. (1985). Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and

restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia.Science. 230, 1350–1354.

Saiki RK et al. (1988) Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a

thermostable DNA polymerase. Science.239: 487–491.

23

Apendiks A.

Slike koje su prikazane ovde adaprirane su iz “Scitable by nature education”.

http://www.nature.com/scitable/topicpage/discovery-of-dna-structure-and-function-

watson-397

Slika A1: Hemijska struktura nukleotida.

Pojedinačni nukleotid čine tri molekula: azotna baza, sećer pentoza i fosforna kiselina.

Azotne baze su purinske ili pirimidinske. Pentozni šećer je riboza, u RNK ili

deoksiriboza u DNK molekulima. U izdvojenom kvadratu, su pokazane hemijske

strukture tri pirimidina: citosin (C), timin (T), i uracil (U), i hemijske structure dva

purina, adenin (A) i guanin (G). U sastavu DNK se nalaze A, G, T I C, a u sastavu

RNK su A, G, U i C. Vezivanjem azotne baze za ribozu ili deoksiribozu formira se

nukleozidni molekul. Kada se fosfat veze za šečer, formirana trikomponentna struktura

se naziva nukleotid. Nukeotidi su osnovne gradivne jedinice DNA i RNK molekula.

24

Slika A2: Šta je Chargaff-ovo pravilo?

Struktura DNK se bazira na Chargaff-ovom pravilu (1950), koje glasi: ukupan broj

purina u molekulu DNK je jednak ukupnom broju pirimidina.

Slika A3: Molekul DNK je dvolančana zavojnica (spirala).

3-dimenzionalna struktura dvolančane zavojnice DNK je definisana modelom James

Watson-a and Francis Crick-a (1953). DNK je dvolančana zavojnica čiji su lanci

komplementarni i antiparalelni.

25

Slika A4: Sparivanje baza u DNK molekulu.

Komplementarnost: Lanci DNK su povezani vodoničnim vezama, jer su

komplementarne baze uvek uparene: dve vodonične veze uparuju A sa T; tri

vodonične veze uparuju C sa G (saglasno sa Cargaff pravilom).

Antiparalelnost: DNK lanci su anti-paralelni, 5’-kraj jednog lanca se uparuje sa3’-

krajem komplementarnog lanca.

Literatura

Watson, J. D., & Crick, F. H. C. A structure for deoxyribose nucleic acid. Nature 171,

737–738 (1953)

Chargaff, E. Chemical specificity of nucleic acids and mechanism of their enzymatic

degradation. Experientia 6, 201–209 (1950)

26

Apendiks B:

Bustin SA et al., The MIQE guidelines: minimum information for publication of

quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 2009, 55(4), 611-22.

27

28

29

Dvostepeni PCR u realnom vremenu - analiza ekspresije 7

gena paradajza (Lycopersicon esculentum Mill.)

Ivana Petrović

Izvod

Zahvaljujući identifikaciji i karakterizaciji gena čija ekspresija je indukovana stresom

suše, moguće je razumeti molekularne mehanizme koji rezultuju pojačanom

tolerancijom biljaka na vodni deficit. Kvantifikacija nivoa genske ekspresije pomoću

PCR-a u realnom vremenu (qPCR), kome prethodi reverzna transkripcija (RT), može

da pruži veoma značajne informacije za unapređenje otpornosti biljaka na stres suše.

Svrha ovog poglavlja jeste upoznavanje sa protokolom za kvantifikaciju genske

ekspresije pomoću RT-qPCR-a u listovima paradajza koji je bio izložen vodnom

deficitu. Analizirana je i kontrolna grupa biljaka, koja je bila optimalno navodnjavana.

Opisani protokol može biti prilagođen i korišćen za analizu genske ekspresije i kod

drugih poljoprivrednih kultura.

1. Uvod

Klimatske promene su jedan od najozbiljnijih problema sa kojima se suočava

savremena poljoprivreda. Poljoprivredna proizvodnja mnogih zemalja je suočena sa

stresom suše, koji je obično praćen i nadprosečno visokim temperaturama. Stres suše

smanjuje prinos većine poljoprivrednih kultura i utiče na njih na morfološkom,

fiziološkom i molekularnom nivou (Ashraf I sar., 2013). Na molekularnom nivou, vodni

deficit indukuje ekpresiju gena koji su značajni za otpornost biljaka na stres suše.

Produkti ekspresije ovih gena sprečavaju nastanak većih ćelijskih oštećenja i

omogućavaju prilagođavanje biljke na nepovoljne uslove spoljašnje sredine (Bray,

1993).

Paradajz (Lycopersicon esculentum Mill.) je jedna od najviše gajenih

poljoprivrednih kultura na svetu. Plodovi paradajza se koriste sveži, ali su značajni i

za prerađivačku industriju. Većina komercijalnih kultivara paradajza je osetljivo na

stres suše, posebno u stadijumu germinacije semena i rasta klijanca (Foulard i sar.,

2004). Kao što je slučaj kod većine drugih poljoprivrednih kultura, i za uzgajanje

paradajza su neophodne velike količine vode (400-600 mm ha-1) (Hanson i May,

2004).

PCR u realnom vremenu je tehnika koja kvantifikuje ciljnu sekvencu i koja se

najčešće koristi da bi se kvantifikovale DNK ili RNK u uzorku. Kvantifikacija se zasniva

na merenju količine umnoženog produkta pri svakom PCR ciklusu.Detekcija bazirana

na fluorescentnoj boji SYBR Green je najjeftinija i najlakša za primenu. SYBR Green

se specifično vezuje za dvolančanu DNK interkalacijom između baznih parova i

fluorescira samo kada se veže za dvostruku DNK. Detekcija fluorescentnog signala

se dešava tokom PCR ciklusa, bilo tokom hibridizacije prajmera na komplementarne

delove DNK ili kada je prisutna najveća količina dvolančane DNK, u fazi ekstenzije.

30

Ukoliko se kvantifikuje nivo ekspresije ciljnih gena u uslovima stresa suše i

kontrolnim uslovima, može se zaključiti koja je uloga produkata tih gena u reakcijama

biljaka na stres suše. Dobijene informacije mogu biti značajne za selekcione programe

koji su usmereni ka dobijanju genotipova otpornih na sušu.

2. Materijal, metode i napomene

Slika 1. Koraci realizacije RT-PCR-a u realnom vremenu (RT-qPCR)

2.1. Priprema uzorka – listovi paradajza

Napomene:

- Uzorkovati samo mlade i potpuno razvijene listove. Za analize ne treba

uzorkovati stare i oštećene listove.

- Uzorci ne treba da se otope nijednom nakon skladištenja u tečnom azotu. U

suprotnom, delovanjem RNaze se RNK degraduje.

- Da bi se izbegla kontaminacija mešanjem uzoraka, nakon svakog uzorkovanja,

potrebno je očistiti pribor za uzorkovanje rastvorom koji u sebi poseduje enzime

koje razgrađuju RNK i DNK.

2.1.1. Uzorkovati list paradajza i ubaciti ga u sterilnu i nekorišćenu vrećicu. Vrećica

treba da bude od materijala koji je otporan na destruktivno dejstvo tečnog

azota. Vrećicu sa uzorkom bez odlaganja brzo potopiti u tečni azot.

2.1.2. Samleti zaleđene uzorke u mlinu ili ručno u čistom keramičkom avanu.

2.1.3. Prebaciti oko 150 mg usitnjenog biljnog materijala u tubu od 2 ml.

2.1.4. Tube čuvati na -80 °C do analiza.

2.2. Ekstrakcija RNK

Napomene:

- Metoda koja uključuje korišćenje TRIzol REAGENT-a je jedna od najefikasnijih

metoda za ekstrakciju RNK. Ceo protokol za ekstrakciju se može realizovati za

1 h i stabilizacija nedegradovane RNK je uspešnija za 30-150% nego kod

drugih metoda ekstrakcije. Pomoću TRIzol REAGENT-a se dobija velika

Priprema uzorka

Ekstrakcija RNK

Provera kvaliteta i količine

izolovane RNK

DNazni korak

RT PCR

Optimizacija i validacija prajmera

qPCR

Normalizacija i analiza

podataka

31

količina RNK dobrog kvaliteta iz listova paradajza. U analizama listova je

korišćen TRIzol Reagent proizvođača Thermo Fisher Scientific.

Ekstrakcija RNK iz listova paradajza se realizuje praćenjem sledečih koraka:

a) HOMOGENIZACIJA

2.2.1. Homogenizovati uzorak sa TRIzolom (1 ml/100 mg uzorka*). Vorteksovati.

2.2.2. Ostaviti homogenate 5 minuta na sobnoj temperaturi.

Zapremina uzorka ne sme da bude veća od 10% zapremine TRIzola jer može

doći do DNK kontaminacije izolovane RNA.

b) SEPARACIJA

2.2.3. Dodati 200μl hlororforma po 1 ml TRIzola (200:1000 ml), zatvoriti tube i

vorteksovati 15 sekundi.

2.2.4. Skladištiti mešavinu na sobnoj temperaturi 2-15 minuta.

2.2.5. Centrifugirati 15 munuta na 4°C maksimalnom brzinom.

2.2.6. Pipetirati 500 μl supernatanta u novu tubu od 1,5 ml.

c) RNK PRECIPITACIJA

2.2.7. Dodati 500 μl izopropanola. Mešati brzo rotiranjem tube.

2.2.8. Skladištiti uzorke na sobnoj temperaturi 5-10 minuta, nakon toga

centrifugirati sadržaj maksimalnom brzinom 10 minuta na 4°C.

d) RNK ISPIRANJE

2.2.9. Ukloniti supernatant i isprati RNK vorteksovanjem sa 1 ml 75% etanola.

2.2.10. Centrifugurati na10000rpm-a 5 minuta na 4 °C.

e) RNK SOLUBILIZACIJA

2.2.11. Ukloniti etanol i lagano sušiti RNK na vazduhu 5-10 minuta. Važno je da se

RNK pelet ne osuši potpuno jer će u suprotnom biti smanjena rastvorljivost RNK.

2.2.12. Rastvoriti RNK u 50 ml vode u kojoj nema RNaze. Prilikom rastvaranja više

puta ispirati nastavak pipete. Vorteksovati ako je potrebno.

2.2.13. Skladištiti na -20º C kratkotrajno, na -80º C dugotrajno.

2.3. Provera kvaliteta i količine izolovane RNK

Nakon izolacije, neophodno je izvršiti proveru kvaliteta i kvantiteta RNK. Kvalitet

se proverava pomoću elektroforeze na agaroznom gelu. U ovom eksperimentu,

korišćen je 1% agarozni gel. Bunarčići na gelu su napunjeni mešavinom napravljenom

od 2μl RNK, 3μl RNase-free H2O i 1μl pufera. Informacija o kvalitetu dobijene RNK

može se dobiti posmatranjem dobijenih traka na gelu. Tako se može uočiti

ribozomalna RNK, kao i produkti potencijalne degradacije. Prilikom analize RNK u

32

ovom radu, totalna RNK je formirala dve jasne trake (28S i18S rRNA u odnosu 2:1),

što je ukazalo na činjenicu da je izolovana RNK dobrog kvaliteta.

*Delimično degradovana RNK će imati razmazane trake, koje neće imati jasne ivice,

ili pak neće biti prisutan odnos 2:1=28S:18S. Kompletno degradovana RNK će

formirati niskomolekularni trakasti razmaz. Korisno je upotrebljavati markere na gelu

prilikom elektroforeze, da bi se tačno definisala priroda dobijenih traka, kao i da bi se

uspostavio sistem kontrole u slučaju da elektroforeza ne funkcioniše kako bi trebalo.

Kvantifikacija RNK je urađena pomoću NanoDrop spektrofotometra i uzorci su

razblaženi dok nije dobijena koncentracija od 200 ng RNK/1 μl uzorka. Deo

koncentrovanih uzoraka je sačuvan za DNazni test. Prilikom kvantifikacije, poželjno je

da je odnos apsorbanci 260/280 približno 2, što ukazuje na činjenicu da je izolovani

materijal pogodan za dalje analize.

2.4. DNazni tretman

Napomene:

- Važan korak prilikom qPCR analize jeste tretman uzoraka DNazom. Ovaj korak je važan jer omogućava prečišćavanje uzorka od DNK kontaminacije. Ukoliko se ne realizuje DNazni tretman, može se dobiti lažni pozitivni rezultat koji potiče od genomske DNK, a ne od RNK. DNaza korišćena u ovim analizama je bila deo standardizovanog RNase-Free DNase Qiagen kita (ref: 79254).

Tabela 1. Protokol za pripremu pufera (5 ml) za DNazni korak

Pre tretmana svih uzoraka DNazom, neophodno je testirati efikasnost DNaze, ali i

DNaznog pufera. Da bi se ovo testiranje realizovalo, potrebno je odabrati i pomešati

nekoliko koncentrovanih uzoraka, koji nisu razblaženi.

Za test su potrebne tri tube:

Tuba 0 = 18 μL H20 RNaze free + 2 μL RNK

Tuba 1 = 16 μL H20 RNaze free + 2 μL RNK + 2μL DNaznog pufera

Tuba 2 = 15.8 μL H20 RNaze free + 2μL RNK + 2μL DNaznog pufera + 0.2 μL DNaze

PripremaTris-HCl (1M pH 8,00)

605,7 mg Tris-a

235μL 37 % HCL-a

Podešavanje pH=8,00

5mL H2O

Priprema MgCl2 0,5M

508 mg MgCl2

5mL H2O

Rastvaranje DNaze

2 ml 1M Tris-HCl pH=8,00

0,4 ml MgCl2

0,4 ml DTT (0,1 M) – iz kita

5mL of H2O

Filtrirati rastvor pomoću 0.22 μM filtera

Skladištiti na -20 °C

33

2.4.1. Testiranje pufera

2.4.1.1. Inkubirati tube 0, 1 i 2 30 minuta na 37°C + 5 minuta na 65 °C.

Svrha ove inkubacije jeste inaktivacija enzima, posebno DNaze u

tubi 2.

2.4.1.2. Sadržaj tube 0 i 1 testirati na agaroznom gelu, da bi se proverilo

da DNazni pufer ne degraduje RNK.

2.4.1.3. Tube čuvati na -80°C za testiranje DNaze.

2.4.2. Testiranje DNaze

Napomene:

- Ovaj test je qPCR sa housekeeping genima i fluorescentnom probom SYBR

Green. Cilj testa jeste da se proveri da li u uzorcima ima još uvek DNK nakon

DNaznog tretmana.

- Testiranje DNaze zahteva prisustvo pozitivne i negativne kontrole. Pozitivna

kontrola je izolovana RNK, a negativna kontrola je voda.

- Za testiranje DNaze, dobro je koristiti produkte prethodnog testa DNaznog

pufera (sadržaj iz tube 1 – uzorak kome nije dodata DNaza) i sadržaj tube 2

(uzorak kome je dodata DNaza).

Tabela 2. PCR u realnom vremenu – uslovi za testiranje DNaze

95°C 10 minuta 1 ciklus

95°C 30 sekundi

40 ciklusa 55°C 1 minuta

72°C 30 sekundi

Prilikom provere rezultata, ne treba da bude uočljivih produkata PCR reakcije.

To je znak da nema DNK u uzorcima.

2.4.3. DNazni tretman

Napomene:

- Pre primene DNaznog tretmana na svim uzorcima, važno je razblažiti RNK na

koncentraciju od 2 μg/μl. Najlakše je razblaženja napraviti u bunarčićima PCR

ploče. U ovom eksperimentu, svaki uzorak je razblažen tako da se na kraju

dobije 17.8 μL razblažene RNK svakog uzorka. Ova količina RNK je dovoljna

za veći broj testova, ukoliko se pravilno procesira, u cilju sprečavanja

degradacije i kontaminacije.

2.4.3.1.U svaki bunarčić dodati 2 μL DNaznog pufera i 0,2 μL DNaze

2.4.3.2.Inkubirati 30 minuta na 37°C.

2.4.3.3. Inkubirati ploču 5 minuta na 65°C da bi se inaktivirala DNaza.

2.4.3.4. Skladištiti ploču na -80°C.

34

2.5. Dvostepeni PCR u realnom vremenu (RT-qPCR)

Postoje dva pristupa realizaciji PCR-a u realnom vremenu. Prvi pristup je

jednostepeni RT-qPCR, prilikom koga se kombinuje realizacija reverzne transkripcije

i PCR-a u realnom vremenu na istoj PCR ploči, bez prostornog i vremenskog

razdvajanja ova dva koraka. Drugi pristup je dvostepeni PCR, prilikom koga se prvo

realizuje reverzna transkripcija, a zatim odvojeno od nje i qPCR. Dvostepeni postupak

omogućava bolju kontrolu celog procesa, kao i veći stepen fleksibilnosti. Takođe je

jednostavnije utvrditi uzrok potencijalnih problema nego kod jednostepenog postupka.

Slika 2. A. Jednostepeni RT-qPCR B. Dvostepeni RT-qPCR

2.5.1. RT-PCR TEST

Napomena:

- Cilj ovog testa jeste provera efikasnosti pufera i DNaze tokom RT PCR procesa.

Za ovaj test potrebno je izdvojiti 2-3 koncentrovana uzorka i od njih formirati

mešavinu na kojoj će biti izvršen test. Ukoliko je cilj eksperimenta poređenje

uzoraka koji su tretirani na nekoliko različitih načina, poželjno je napraviti

mešavine RNK za svaki tretman ponaosob.

35

Tabela 3. RT PCR test

Bez

superskriptom

Bez

superskripta

Sa

superskriptom

Sa

superskriptom

H2O test Tretman 1 Tretman 2 Tretman 1 Tretman 2

Oligo (dT)21 1 μl 1 μl

1 μl

RNA / 10 μl 10 μl

dNTP Mix 2,5 μl 2,5 μl 2,5 μl

H2O 10 μl / /

Inkubacija 5 min na 65°C + 5 min na ledu

Pufer (kit) 4 μl 4 μl 4 μl

DTT (kit) 1 μl 1 μl 1 μl

Superskript

III

0,75 μl / 0,75 μl

Inkubacija 60 min na 42°C + 5 min na 70°C

Ovaj test predstavlja RT-qPCR. Nakon poslednje inkubacije, rezultate je

neophodno proveriti na agaroznom gelu. Poželjno je na gelu analizirati i negativne

kontrole (voda i RT bez superskripta), i RT produkt sa dodatim superskriptom.

Negativne kontrole ne sadrže DNK, tako da nema vidljivih tragova DNK na gelu.U

ovom koraku je poželjno koristiti DNK marker, zahvaljujući kome se potvrđuje kvalitet

krajnjeg produkta. Marker se može koristiti i kao pozitivna kontrola, kao potvrda

dobijanja DNK željene dužine i dobrog kvaliteta. DNK koja nije degradovana formira

jednu jasnu traku na gelu. Ako se pojave dve trake, to možda ukazuje na pisustvo

nekih jednolančanih produkata. Ukoliko je traka razmazana, DNK je verovatno

degradovana.

2.5.2. RT-PCR

Ukoliko je RT-PCR test uspešan, RT PCR se može realizovati sa svim

pojedinačnim uzorcima. Rezultat RT-PCR je cDNA svakog uzorka. Nakon RT-PCR,

potrebno je pomešati 2 μl svakog uzorka u jedinstveni pul, koji će se koristiti u procesu

validacije prajmera. cDNA se čuva na -80 °C.

Tabela 4. RT PCR

1 uzorak 50 uzoraka 98 uzoraka

RNA 10μL 10 μL 10 μL Po bunarčiću

oligo(dT)21 1 μL 50μL 98 μL 3,5μL po bunarčiću

dNTP Mix 2,5 μL 125 μL 245 μL

Inkubacija 5 min na 65°C + 5 min na ledu

Pufer (kit) 4 μL 200 μL 392 μL 5,75 μL po

bunarčiću DTT (kit) 1 μL 50 μL 98 μL

Superskript III 0,75 μL 37,5 μL 73,5 μL

Inkubacija 60 in na 42°C + 5 min na 70°C

36

2.6. Optimizacija i validacija prajmera

Optimizacija i validacija prajmera su ključni koraci svake PCR analize i neophodni

su čak i kada se radi o dobro poznatim prajmerima koji se prodaju komercijalno.

Optimizacija je proces u kome se potvrđuje senzitivnost prajmera i njegova

specifičnost u odnosu na gen od interesa.

Da bi se validacija prajmera realizovala, poželjno je napraviti cDNA pul svih

uzoraka koji će biti analizirani. U ovom ogledu su, zbog prisustva dva tretmana,

formirana dva pula, jedan od uzoraka koji nisu bili izloženi stresu i drugih koji su bili

izloženi stresu suše. Oba pula su razlažena ultra-čistom vodom (10μl cDNA pula i 90

ml ultra-čiste vode). Razblaženja su čuvana na-20°C. Prajmere je potrebno takođe

razblažiti dok se ne dobije širi spektar odgovarajućih koncentracija (10-3-10-12). Sem

podataka o specifičnost prajmera, validacija pruža podatke i o njihovoj efikasnosti.

Slika 3. Disocijacioni pikovi visoko specifičnog prajmera (ZEP gen)

37

Slika 4.Disocijacioni pikovi prajmera koji je nespecifičan (Aquaporin gen)

Optimizacija prajmera podrazumeva qPCR koji se takođe realizuje sa pulom

uzoraka i sa različitim razblaženjima prajmera. Optimizacija se radi da bi se povrdilo

da prajmeri funkcionišu ispravno na predloženim temperaturnim opsezima, kao i da bi

se pronašlo optimalno razblaženje prajmera, koje može biti korišćeno i kao kontrola

tokom realizacije qPCR-a. U ovom eksperimentu, razblaženja 10-7 i 10-8 su imala

najoptimalnije Ct vrednosti, tako da su ta razblaženja korišćena kao pozitivne kontrole

tokom svih qPCR reakcija. Ct vrednost se definiše kao broj ciklusa potreban da bi

fluorescentni signal prešao prag detekcije

U ovom ogledu je testirano 12 prajmera, ali je samo 7 prošlo procese validacije i

optimizacije. Sem ovih 7 gena, analizirana su još i dva housekeeping gena, koji su

značajni kao unutrašnje kontrole tokom analiza. U eksperimentima sa paradajzom, β-

aktin i elongacioni faktori su se pokazali kao dobri housekeeping geni.

38

Tabela 5. Prajmeri za kvantitativni PCR u realnom vremenu (prošli proces validacije i

optimizacije)

Prajmeri F R

ZEP1-1 ATCAACTGTGGGAACACCTG ACGACCAGACATCTGCAATC

ZEP1-2 TGCATGGCCATAGAGGATAG TGGATGACTCCAACTCGAAG

PPC2 TCAAACTCCACAGTGCGATG CCGCAATTGGAAACGATG

SlAPXcyto CCTTTGTGATCCTGCTTTCC CAGCTCTTCCAATCAGCATC

NCED1 AGGCAACAGTGAAACTTCCATCAAG TCCATTAAAGAGGATATTACCG

GGGAC

SlAPXcp TTGATCCACCTGAGGGTTTC TCCCAAGCCTTCGTATTCTG

abi1 GGCAGCAAGGACAACATAAC TGAGGCCAATTGTGTTGAAG

2.7. qPCR analize uzoraka

Napomene:

- Gen treba biti testiran u dva tehnička ponavljanja.

- Sem gena od interesa, u testove moraju biti uključeni i 2 housekeeping gena.

- Da bi se eliminisali netačni pozitivni ili negativni rezultati, neophodno je da

postoje pozitivne i negativne kontrole:

U ovom slučaju, korišćene su sledeće kontrole:

*negativna kontrola u vidu mešavine za PCR kojoj je dodata voda umesto

uzorka

*pozitivna kontrola koja predstavlja odgovarajuća razblaženja prajmera (10-7

and 10-8). Ova razblaženja su potvrđeno dobra u procesu validacije i sačuvana

su do qPCR analiza.

Ove kontrole su neophodne da bise garantovala tačnost PCR reakcija.Važno

je da rezultati dobijeni u procesu validacije prajmera budu slični onima

dobijenim u qPCR analizama uzoraka.

- Tokom pripreme uzoraka i qPCR analiza, ključno je izbegavanje kontaminacije.

Ukoliko se kontaminacija ipak desi, bitno je odrediti izvor. Više informacija o

detektovanju izvora kontaminacije i rešavanju problema može biti pronađeno

na sledećem linku: http://www.gene-quantification.com/mifflin-optimisation-

report.pdf .

2.7.1. Razblažiti sve uzorke 1/15 (5 μlcDNA i 70 μl ultra-čiste vode) u ploči, u

redosledu u kome će uzorci biti raspoređeni tokom svih analiza.

39

2.7.2. Rasporediti po 2 μl razblažene cDNA u nekoliko plejtova. Ovi plejtovi su

spremni za upotrebu (“radne” ploče) i čuvaju se kraće vreme na-20° C.

2.7.3. Neposredno pre qPCR-a dodati 18 μl Master Mix-a u radnu ploču.

2.7.4. Uraditi qPCR i sačuvati rezultate.

Da bi se izbegla potencijalna kontaminacija, poželjno je uzorke na PCR ploči

razdvojiti prostorno od kontrola (poželjno je da budu na različitim delovima ploče).

Tabela 6. Mešavina za PCR u realnom vremenu

Broj bunarčića 1 6

H20 6.2 37.2

Briliant II Sybr Green Master Mix - Agilent

Technologies Stratagene

10

60

Rox 1/500 0.3 1.8

prajmer 1.5 9

Tabela 7. PCR u realnom vremenu - uslovi

95°C 10 min 1 ciklus

95°C 30 sec 40 ciklusa 55°C 40 sec

72°C 30 sec

Disocijaciona kriva

Nakon qPCR-a, proveravaju se amplifikacioni grafici i disocijacioni pikovi.Za

svaki pojedinačni gen, mora biti uočljiv samo jedan disocijacioni pik. To pokazuje da

je prajmer specifičan za dati gen. Idealne CT vrednosti su između 15 i 25, što ukazuje

na visok nivo ekspresije.

Nakon qPCR analiza, potrebno je normalizovati podatke pre statističkih analiza.

Normalizacija podataka dobijenih PCR-om u realnom vremenu je jedan od kritičnih

koraka PCR analize. Normalizacije se vrši ili prema referentnim genima ili prema

ukupnoj DNK ili RNK u ćeliji. U ovoj analizi, normalizacija je vršena u odnosu na dve

interne kontrole, koje u osnovi predstavljaju dva referentna housekeeping gena.

Transkripti takvih gena, koji se eksprimiraju na visokom nivou u svim ćelijama, čine

idealne pozitivne kontrole za determinaciju ekspresije gena od interesa u uzorcima

izloženim različitim tretmanima.

Preporuka je da se za normalizaciju koriste dva do pet validiranih referentnih

gena, koji imaju stabilnu ekspresiju. Neophodno je da ovi geni prođu proces validacije

i da imaju stabilnu ekspresiju. Stabilnost referentnog gena može biti određena

računanjem njegove M vrednosti ili koefiicjenta varijacije normalizovanih relativnih

parametara (CV). Ove vrednosti zatim mogu biti upoređene sa empirijskim podacima,

da bi se potvrdila njihova stabilnost.

40

Zahvalnica

Ovaj rad je finansiran od strane EU Commission project AREA, no. 316004. Želeli

bismo da zahvalimo istraživačima iz INRA-e (Avinjon, Francuska), posebno

istraživačima Nadia Bertin i Matilde Causse koje su organizovale ovu specijalizaciju,

kao i tehničarki Justine Gricourt za tehničku podršku.

Pitanja:

1. Koji geni u paradajzu pokazuju promenu ekspresije kao odgovor na stres

indukovan vodenim deficitom?

2. Kakvi uzorci paradajza treba da budu da bi se mogli analizirati qPCR-om?

3. Koja je metoda ekstrakcije najefikasnija za ekstrakciju RNK iz paradajza?

4. Koji se dodatni testovi izvode tokom kvantitativne lančane reakcije

polimeraze i koja je njihova uloga?

5. Na koji način se vrši optimizacija prajmera za qPCR?

Literatura:

Ashraf, M., Harris, P.J.C. (2013): Photosynthesis under stressful environments; An

overview. Photosyntetica 51: 163-190

Foolad, M.R., Zhang, L.P., Subbiah, P. (2003): Genetics of drought tolerance during

seed germination in tomato: inheritance and QTL mapping. Genome 46: 536-545

Hanson, B., May, M. (2004): Effect of subsurface drip irrigation on processing tomato

yield, water table depth, soil salinity, and profitability. Agric. Water Manage. 68: 1–17

http://www.gene-quantification.com/mifflin-optimisation-report.pdf .

41

Primena molekularnih metoda u proučavanju korova

Dragana Božić, Markola Saulić, Sava Vrbničanin

Izvod

Molekularne metode su veoma korisne za istraživanja u proučavanju korova,

naročito u oblasti proučavanja rezistentnosti korova na herbicide i transfera gena sa

useva tolerantnih na herbicide na njihove divlje srodnike. Takođe, genetička

varijabilnost korova ima značajnu ulogu u osetljivosti korova na herbicide, što određuje

strategije za njihovo suzbijanje. Za sva pomenuta istraživanja ekstrakcija DNK, kao

polaznog materijala za dalja proučavanja, je moguća različitim metodama, ali najlakša

i najpodesnija je ekstrakcija pomoću komercijalnih kitova. Veoma značajan deo

molekularnih analiza je izbor i dizajniranje odgovarajućih prajmera za uspešnu

amplifikaciju DNK. Izbor i dizajniranje prajmera su najčešće zasnovani na korišćenju

sekvenci DNK deponovanih u banci gena (GenBank). Dalje analize odabranih

fragmenata DNK zavise od vrste istraživanja. Za praćenje rezistentnosti korova na

herbicide ili transfera gena odgovornih za tolerantnost/rezistentnost na herbicide,

amplifikovani fragmenti se sekvenciraju, a dobijene sekvence se porede sa postojećim

u banci gena, sa ciljem da se proveri prisustvo mutacije/mutacija. Za proučavanje

genetičkog diverziteta korovskih vrsta analiza amplifikovanih fragmenata DNK

zahteva korišćenje kapilarne elektroforeze.

1. Uvod

Molekularne metode mogu biti korisne za istraživanja u različitim oblastima

proučavanja korova uključujući molekularnu determinaciju korovskih vrsta čija

determinacija klasičnim metodama taksonomije je otežana, zatim populacionu

varijabilnost, rezistentnost korova na herbicide i transfer gena između useva

tolerantnih na herbicide i njihovih divljih srodnika.

Rezistentnost korova na herbicide je problem koji je stalno u porastu (Moss i sar.,

2007; Michitte i sar., 2007). U većini slučajeva, rezistentnost je posledica

mutacije/mutacija na genu koji kodira sintezu enzima koji predstavlja primarno mesto

delovanja herbicida. Zahvaljujući tome za potvrđivanje rezistentnosti je moguće

koristiti različite metode zasnovane na molekularnim analizama, koje su mnogo brže i

zahtevaju manje fizičkog rada od tradicionalnih metoda (npr. biotestova). Detekcija

rezistentnosti korova na herbicide pomoću tehnika zasnovanih na analizi DNK je

veoma važna, a njen značaj naročito raste usled sve intezivnijeg gajenja useva

tolerantnih na herbicide. Gajenje ovakvih useva povezano je sa rizikom od transfera

gena sa ovih useva na konvencionalne useve, zatim njihove divlje srodnike ili

samonikle useve. Sve to dovodi do nastanka rezistentnih vrsta (korova) (Martinez-

Ghersa i sar., 1997). Molekularni markeri su se pokazali kao korisni za određivanje

frekvencije hibridizacije između useva i korova.

42

U cilju proučavanja genetičkog diverziteta korova korišćeni su različiti pristupi

zasnovani na primeni molekularnih metoda. Istraživanja genetičkog diverziteta mogu

se koristiti za utvrđivanje centara porekla vrsta (Goolsby i sar., 2006, Madeira i sar.,

2007). Takva znanja mogu da se iskoriste kako bi se usmerilo proučavanje

potencijalnih agenasa za biološku kontrolu (Paterson i sar., 2009). Neke studije

genetičkog diverziteta su rađene na višegodišnjim vrstama koje se razmnožavaju

vegetativno, sa ciljem da se utvrdi značaj polnog i vegetativnog razmnožavanja u

širenju korova (Slotta i sar., 2006). Takođe, istraživanja genetičkog diverziteta u

korovskim populacijama mogu biti veoma značajna jer predstavljaju osnovu za njihovu

različitu osetljivost prema herbicidima.

2. Materijal, metode i zapažanja

2.1. Procena transfera gena sa suncokreta tolerantnog na herbicide na

hibridne forme divljeg suncokreta pomoću konvencionalnog PCR-a

Konvencionalni PCR je podesan metod za detekciju mutacija odgovornih za

rezistentnost korova na herbicide i potvrđivanje transfera gena sa tolerantnih useva

na njihove divlje (korovske) srodnike. Naime, jedna od mogućih tačkastih mutacija na

ALS (acetolaktat sintetaza) genu je glavni mehanizam rezistentnosti korova na

herbicide ALS inhibitore, koji predstavljaju grupu herbicida (sulfoniluree, imidazolinoni)

na koju korovi često razvijaju rezistentnost. Postoji 8 mogućih mutacija koje su do sada

detektovane kod različitih korovskih vrsta. S obzirom da je pozicija potencijalnih

mutacija poznata, njihova detekcija je zasnovana na amplifikaciji odgovarajućeg

fragmenta DNK pomoću specifičnih prajmera. Nakon amplifikacije proizvodi PCR

reakcije se sekvenciraju i proverava se prisustvo mutacija u dobijenim sekvencama.

2.1.1. Biljni materijal

Semenski material za ispitivanje rezistentnosti korova na herbicide se sakuplja

iz polja za koja postoje indikacije o razvoju rezistentnosti. Takođe, neophodno je

sakupiti semena iste vrste sa površina na kojima nikada nije bilo primene herbicida.

Za ispitivanje transfera gena, moguće je postaviti poljske eksperimente koji uključuju

različite varijante udaljenosti useva i njegovog divljeg srodnika ili sakupiti semena sa

divljih srodnika useva (u našem slučaju semena hibridnih formi divljeg suncokreta) iz

područja gajenja tolerantnog useva. Za analizu su korišćene mlade biljke dobijene iz

sakupljenih semena, pri čemu su neki uzorci listova (uzeti sa iste biljke) korišćeni za

ekstarkciju DNK neposredno nakon uzorkovanja, dok su neki čuvani u zamrzivaču (-

20oC) do analize. Pre analize ovi uzorci su liofilizirani nakon izlaganja temperaturi od

-80oC u trajanju od 24h.

2.1.2. Ekstrakcija DNK

Ekstrakcija DNK je obavljena pomoću komercijalnog kita QiagenDneasy® Plant Mini

Kit prema protokolu proizvođača (https://www.qiagen.com/dz/shop/sample-

technologies/dna/dna-preparation/dneasy-plant-mini-kit/). Kvalitet i koncentracija

43

ekstrahovane DNK su određeni spektrofotometrijski pomoću Nanodrop® 1000.

Ekstrakti DNK su čuvani na temperaturi od -20oC.

Zapažanje: Uzorci su usitnjavani do finog praha pomoću avana i tučka ili pomoću

uređaja “TissueLyser”. Liofilizirani uzorci su uspešno usitnjavani na oba načina, ali

“TissueLyser” nije bio dobar izbor za sveže uzorke. Umesto da se dobije fini prah

“TissuLyser” je pretvorio svež material u kašast proizvod.

2.1.3. Izbor prajmera

Sekvence DNK iz nekoliko izvora su korišćene za dizajniranje oligonukleotidnih

prajmera za amplifikaciju fragmenata ALS gena (White et al., 2003, Kolkman et al.,

2004). Par prajmera je dizajniran pomoću softvera Primer 3. Prajmeri Hel ForA

(CAATGGAGATCCACCAAGCT) i Hel RevA (AACGCAAGCAACAAATCACT) su

korišćeni za amplifikaciju fragmenata dužine oko 700 bp.

Zapažanje: U literaturi ima mnogo prajmera koji mogu da se koriste za detekciju

mutacija odgovornih za rezistentnost/tolerantnost različitih formi suncokreta na

herbicide. Na osnovu njihove analize i poređenja sekvenci DNK fragmenata

suncokrata deponovanih u banci gena dizajnirani su novi prajmeri.

2.1.4. Amplifikacija specifičnog regiona ALS gena

Finalna reakciona smeša za PCR reakciju je sadržala: 19 µl mastermiksa (10 jedinica

Biomix-a, 7 jedinica DEPC vode, 1 jedinica “forward” prajmera i 1 jedinica “reverse”

prajmera) i 1µl uzorka DNK. Uslovi PCR reakcije su bili sledeći: 2 min inkubacije na

94oC, 35 ciklusa od 30 sec denaturacije na 94oC, 20 sec hibridizacije prajmera na

53oC i 45 sec elongacije na 72oC, i 5 min finalne elongacije na 72oC. Provera

amplifikacije je urađenja elektroforezom na 2% agaroznom gelu koji sadrži etidijum

bromid.

Zapažanje: Amplifikacija DNK fragmenata je bila uspešna dok je korišćen Biomix

nabavljen od jednog proizvođača. Prelaskom na Biomix drugog proizvođača nisu

dobijeni nikakvi proizvodi PCR reakcije. U početku se nije znalo šta je uzrok tome, pa

je dosta vremena i materijala utrošeno na proveru drugih činilaca PCR reakcije i

optimizaciju protokola, ali nije nađeno rešenje. Konačno, kada je ponovo korišćen

prvobitni Biomix, amplifikacija je bila uspešna.

2.1.5. Sekvenciranje

Prečišćavanje proizvoda PCR reakcije je urađeno pre sekvenciranja pomoću Spin

Column PCR Purification Kit u skladu sa protokolom proizvođača

(http://www.nbsbio.co.uk/downloads/DNA_Cleanup_Handbook.pdf). Prečišćeni

proizvodi PCR reakcije su poslati zajedno sa odgovarajućim prajmerom (Hel ForA) na

sekvenciranje u Sorce Bioscience (Osford, UK). Analiza dobijenih sekvenci je

urađena na osnovu poređenja sa sekvencama amplifikovanog regiona ALS gena koje

44

su deponovane u banci gena pomoću programa za višestruko poravnanje sekvenci

Clustal Omega.

Zapažanje: Nekoliko sekvenci dobijenih od Source Bioscience nisu bile čitljive (Grafik

1), stoga je bilo neophodno da se ponovi sekvenciranje.

Grafik 1. Hromatogram neuspelog sekvenciranja

2.2. Višestruka analiza mikrosatelita kod tri populacije hibridnih formi divljeg

suncokreta (Helianthus annuus) na osnovu PCR-a

Višestruka analiza mikrosatelita zasnovana na PCR-u je pogodna za ispitivanje

populacione varijabilnosti korova. Naime, varijacije satelitskih DNK sekvenci

(ponovljene sekvence DNK različite veličine) mogu se koristiti za određivanje

genetičkih razlika između organizama ili individua bliskih srodnika (npr. hibridnih formi

divljeg suncokreta koje su rezultat hibridizacije između različitih formi suncokreta

uključujući biljke useva, atipične biljke, divlje biljke, samonikle biljke i hibridne forme

divljeg suncokreta). Satelitski lokusi mogu biti definisani dužinom osnovnog ponovka,

brojem ponovaka ili ukupnom dužinom ponovaka. Mikrosateliti su ponavljanja

sekvenci dužine 2-6 nukleotida, koje se takođe zovu jednostavne ponavljajuće

sekvence (SSRs) ili kratki tandemski ponovci (STRs).

2.2.1. Biljni materijal

Semena tri različite populacije hibridnih formi divljeg suncokreta su sakupljena i

posejana u stakleniku. Ponici su presađeni u veće saksije. Svež lisni materijal sa 10

slučajno izabranih biljaka iz svake populacije je uzet za ekstarkciju DNK. Neki uzorci

listova (uzeti sa iste biljke) su korišćeni za ekstrakciju DNK neposredno nakon

uzorkovanja, dok su neki čuvani u zamrzivaču (-20oC) do analize. Pre analize ovi

uzorci su liofilizirani nakon izlaganja temperaturi od -80oC tokom 24h.

2.2.2. Ekstrakcija DNK

DNK je izolovana iz oko 100 mg svežih listova pomoću komercijalnog kita

QiagenDneasy®Plant Mini Kit prema protokolu proizvođača

(https://www.qiagen.com/dz/shop/sample-technologies/dna/dna-preparation/dneasy-

plant-mini-kit/). Kvalitet i koncentracija ekstrahovane DNK su određeni

45

spektrofotometrijski pomoću Nanodrop® 1000. Ekstrakti DNK su čuvani na

temperaturi od -20oC.

Zapažanje: Prinos DNK iz liofiliziranih uzoraka je bio nizak i kriva na Nanodrop® 1000

je bila neprihvatljiva. Moguće je da je razlog tome bila visoka koncentracija proteina.

Da bi se to izbeglo, dodavan je polivinilpirolidon (PVP), ali problem ni tada nije bio

rešen. Ekstrakcija je ponovljena tako što su korišćeni sveži uzorci listova i dobijen je

zadovoljavajući prinos DNK.

2.2.3. Izbor prajmera

Izabrano je sedam mikrosatelitskih lokusa koje su koristili Garayalde i sar. (2011) i

Muller i sar. (2010). Fluorescentni SSR markeri su poređani prema opsegu dužina

alela (Tabela 1).

Tabela 1. Mikrosatelitski lokusi, fluorescentne boje, sekvence, opseg veličine alela za

7 SSR markera

Ime

markera

Sekvenca “forward” prajmera

Sekvenca “reverse” prajmera

Opseg

veličine

alela

ORS297 FAM-

GTGTCTGCACGAACTGTGGT

TGCAAAGCTCACACTAACCTG 214-

237

ORS309 FAM-

CATTTGGATGGAGCCACTTT

GATGAAGATGGGGAATTTGTG 116-

130

ORS337 FAM-

TTGGTTCATTCATCCTTGGTC

GGGTTGGTGGTTAATTCGTC 165-

197

ORS342 NED-

TGTTCATCAGGTTTGTCTCCA

CACCAGCATAGCCATTCAAA 305-

361

ORS371 HEX-

GGTGCCTTCTCTTCCTTGTG

CACACCACCAAACATCAACC 234-

264

ORS432 HEX-

TGGACCAGTCGTAATCTTTGC

AAACGCATGCAAATGAGGAT 155-

167

ORS656 NED-

TCGTGGTAAGGGAAGACAACA

ACGGACGTAGAGTGGTGGAG 181-

254

Amplifikacija je rađena za svaki prajmer odvojeno i u reakciju je bilo uključeno 0,1 µl

“reverse” prajmera i 0,1 µl “forward” prajmera, fluorescentno obeleženih sa NED, HEX

ili FAM, 5 µl MMx2 (Taq), 3,8 µl molekularne vode i 1µl uzorka DNK što je činilo ukupnu

zapreminu od 10 µl. Takođe, rađena je reakcija amplifikacije sa svih 7 prajmera

istovremeno, pri čemu su u reakciju bili uključeni svi “reverse” prajmeri (7x0.1 µl) i

svaki od “forward” prajmera (7x0,1µl), 5 µl MMx2 (Taq), 2,6 µl molekularne H2O i 1µl

uzorka DNK pri čemu je ukupna zapremina bila 10 µl.

46

2.2.4. PCR analiza

PCR analiza je urađena u skladu sa protokolom proizvođača Type-it®Microsatellite

PCR Handbook (https://www.qiagen.com/dz/resources/search-resources).

PCR uređaj (Applied Byosistems Verite 95 Well) je programiran za inicijalnu

denaturaciju na 94°C tokom 5 min, zatim 6 ciklusa koji uključuju: 94°C u trajanju 30 s,

zatim hibridizaciju prajmera na promenljivoj temperaturi (Tx) u trajanju 90 s (Tx je na

početku bila 63°C i smanjivala se za 1°C u svakom ciklusu od prvih 6 ciklusa, tako da

je na kraju iznosila 57°C) i 72°C u trajanju 60 s. Proizvodi PCR reakcije su naknadno

amplifikovani tokom 29 ciklusa na 94°C u trajanju od 30 s, zatim 57°C u trajanju 90 s

i 72°C u trajanju 60 s, sa finalnom elongacijom na 63°C u trajanju 30 min. Analiza

fragmenata DNK je urađena kapilarnom elektroforezom u Source Bioscience

(Nottingham, UK).

Analiza podataka

GENEMAPPER (Applied biosystem) i softver PEAK SCANNER su korišćeni za

analizu fragmenata DNK i sumiranje genotipova.

3. Zahvalnica

Ovaj rad je finansiran od strane projekta EU komisije, AREA, br. 316004. Autori žele

da se zahvale prof. Radmili Stikić koja im je omogućila obuku za molekularna

istraživanja i starijem laboratorijskom tehničaru dr George Gibbins za realizaciju obuke

u School of Agriculture, Policy and Development na Univerzitetu u Redingu. Takođe,

zahvaljujemo se dr Tijani Blanuši za podršku u realizaciji obuke.

Pitanja:

1. Koja mutacija je jedna od najzastupljenih kod biljnih vrsta rezistentnih na

herbicide? 2. Koji su kriterijumi za izbor semenskog materijala za ispitivanje rezistentnosti?

3. Koji se eksperimenti mogu izvoditi za ispitivanje transfera gena?

4. Zbog čega “TissueLyser” uređaj nije dobar izbor za usitnjavanje svežih uzoraka

i koji metod bi trebalo primeniti?

5. Koje informacije se mogu dobiti višestrukom analizom mikrosatelita?

4. Literatura:

Garayalde, A.F., Poverene, M., Cantamutto, M., Carrera, A.D. (2011): Wild sunflower

diversity in Argentina revealed by ISSR and SSR markers: an approach for

conservation and breeding. Annals of Applied Biology, 158, 305-317.

Gaskin, J. F., Bon, M. C., Cock, M. J., Cristofaro, M., De Biase, A., De Clerck-Floate,

R., Ellison, C.A., Hinz, H.L., Hufbauer, R.A., Julien, M.H., Sforza, R. (2011): Applying

molecular-based approaches to classical biological control of weeds. Biological

Control, 58,Goolsby, J.A., De Barro, P.J., Makinson, J.R., Pemberton, R.W., Hartley,

47

D.M., Frohlich, D.R. (2006): Matching the origin of an invasive weed for selection of a

herbivore haplotype for a biological control programme. Molecular Ecology, 15, 287-

297.

http://www.nbsbio.co.uk/downloads/DNA_Cleanup_Handbook.pdf

https://www.qiagen.com/dz/resources/search-resources

https://www.qiagen.com/dz/shop/sample-technologies/dna/dna-preparation/dneasy-

plant-mini-kit/

Kolkman JM, Slabaugh MB, Bruniard JM, Berry S, Bushman BS, Olungu C, Maes N,

Abratti G, Zambelli A, Miller JF, Leon A, Knapp SJ (2004): Acetohydroxyacid synthase

mutations conferring resistance to imidazolinone or sulfonylurea herbicides in

sunflower. Theoretical and AppliedGenetics, 109, 1147-1159.

Madeira, P.T., Coetzee, J.A., Center, T.D., White, E.E., Tipping, P.W. (2007): The

origin of Hydrillaverticillata recently discovered at a South African dam. Aquatic

Botany, 87, 176-180.

Michitte, P., De Prado, R., Espinoza, N., Ruiz-Santaella, J.P., Gauvrit, C.

(2007):Mechanism of Resistance to glyphosate in Ryegrass (Lolium multiflorum)

Biotype from Chile. Weed Science, 55, 435-440.

Moss, S.R., Perryman, S.A.M., Tatnell, L.V. (2007): Managing Herbicide-Resistant

Blackgrass (Alopecurus myosuroides): Theory and Practice. Weed Technology, 21,

300-309.

Muller, M-H., Latreille, M., Tollon, C. (2010): The origin and evolution of a recent

agricultural weed: population genetic diversity of weedy population od sunflower

(Helianthus annuus L.) in Spain and France. Evolutionary application, Blackwell, 4,

499-514.

Paterson, I. D., Douglas A. D., Hill, M. P. (2009): Using molecular methods to

determine the origin of weed populations of Pereskia aculeata in South Africa and its

relevance to biological control. Biological Control, 48, 84-91.

Slotta T.A.B., Rothhouse J.M., Horvath D.P., Foley M.E.(2006): Genetic diversity of

Canada thistle (Cirsium arvense) in North Dakota. Weed Science54: 1080–1085.

White, A.D., Graham, M.A., Owen, M.D.K. (2003): Isolation of acetolactate synthase

homologs in common sunflower. Weed Science, 51, 845-853.

48

Ekstrakcija DNA i primena SSR markera u genetičkoj

indentifikaciji sorti vinove loze

Zorica Ranković-Vasić, Dragan Nikolić

Izvod

Mikrosatelitski markeri (SSR markeri) se dosta koriste u genetskim istraživanjima

vinove loze za identifikaciju sorti, analizu porekla i genetičku karakterizaciju

germplazme. Cilj ovog rada bio je ekstrakcija ukupne količine DNK, izbor prajmera,

PCR protokola i analiza DNK sekvenci sa posebnim osvrtom na varijabilnost između

prikupljenih uzoraka različitih sorti vinove loze. Materijal koji je koriščen u ovoj studiji

su uzorci listova vinove loze različitih autohtonih i introdukovanih sorti iz kolekcije na

oglednom polju "Radmilovac" na Poljoprivrednom fakultetu Univerziteta u Beogradu i

iz Nacionalne kolekcije voćaka "Brogdale" iz Velike Britanije. Korišćen je standardni

set od devet prajmera za vinovu lozu. Analize su izvršene u molekularno-genetičkoj

laboratoriji na Poljoprivrednom fakultetu Univerziteta u Redingu u Velikoj Britaniji.

Ekstrakcija i prečišćavanje ukupne DNK iz svežih i zamrznutih uzoraka (listova vinove

loze) je izvedena korišćenjem „DNeasi ® Plant Mini (Kiagen Inc.) kit”. Koncentracija

ekstrahovane DNK izmerena je uz pomoć NanoDrop spektrofotometra i čuvana na -

20oC do upotrebe. U radu je korišćen protokol „Type-it Microsatellite PCR Kit”,

optimizovan za fluorescentne prajmere, koji je praćen analizom fragmenata visoke

rezolucije pomoću kapilarnih sekvencionih instrumenata „Tipe-to Microsatellite PCR

(Kiagen Inc.)”. Rezultate analize DNK treba kombinovati sa ampelografskim

deskriptorima prilkom identifikacije sorti i planirati izbor sorti vinove loze sa poželjnim

vinogradarskim i enološkim vrednostima.

1. Uvod

Vinova loza (Vitis vinifera L.) je jedna od najvrednijih hortikulturnih vrsta. Trenutno,

postoji veliki, ali neprecizan broj sorti vinove loze na svetu. U mnogim regionima

postoje sinonimi (različiti nazivi za istu sortu), kao i homonimi (različite sorte

identifikovane pod istim imenom). Taj broj bi mogao verovatno biti smanjen kada se

utvrdi genotipizacija i poređenje sorti. Identifikacija sorti vinove loze na osnovu

morfoloških razlika između biljaka može biti pogrešna zbog uticaja ekoloških faktora,

zato su razvijene metode za analizu na nivou genotipa sorte. U poslednjih dvadeset

godina, uspostavljene su različite tehnike za karakterizaciju sorti na nivou DNK (RFLP,

RAPD, AFLP, SCAR i SSR markeri) i izoenzima. Za genotipizaciju su najpogodniji

mikrosatelitski markeri (Jakše et al., 2013). U protekloj deceniji, primena metoda za

molekularnu karakterizaciju je značajno poboljšana, posebno, DNK tehnologije koje

pomažu ampelografiiji da se identifikuju sorte i njihovo poreklo. Microsatelitski markeri

(SSR markeri) se široko koriste u genetskim istraživanjima vinove loze, za

49

identifikaciju sorti, analizu porekla i genetičku karakterizaciju germplazme.

Mikrosateliti ili ponavljanje jednostavne sekvence (SSR) su se pokazali kao

najefikasniji markeri za genotip vinove loze (Sanchez-Escribano et al., 1999; Laucou

et al., 2011). Tomas i Skot (1993) su prvi put upotrebili mikrosatelite za identifikaciju

sorti vinove loze i pokazali da su mikrosateliti sekvence koje su često zastupljene u

genomu vinove loze i veoma su informativni za identifikaciju Vitis vinifera sorti. Stotine

mikrosatelitskih markera za vinovu lozu su razvijeni i većina njih je javno dostupna

(Bowers et al., 1996; Arroyo-Garcia and Martinez-Zapater, 2004; Adam-Blondon et

al., 2004; Merdinoglu et al., 2005; Cipriani et al., 2008). Set od šest (VVS2, VVMD5,

VVMD7, VVMD27, VrZag62, VrZAG79) ili devet (prethodnih šest, u kombinaciji sa

sledeća tri: VVMD32, VVMD36, VVMD25) mikrosatelitskih markera se koristi u

studijama genotipizacije vinove loze, uglavnom za utvrđivanje genetičke varijabilnosti

između evropskih sorti vinove loze, koje su visoko polimorfne (Sefc et al., 2001; This

et al., 2004; Žulj et al., 2013). Cilj ovog istraživanja je bio ekstrakcija ukupne DNK,

izbor i dizajn prajmera, PCR protokola i analiza DNK sekvenci sa posebnim osvrtom

na varijabilnost između prikupljenih uzoraka različitih sorti vinove loze.

2. Materijali, metode i napomene

2.1. Biljni materijal

U ovim istraživanjima kao materijal su korišćeni listovi različitih sorti vinove loze.

Odabrane su autohtone i introdukovane sorte koje su kolekcionisane u kolekciji na

Oglednom dobru “Radmilovac”, Poljoprivrednog fakulteta Univerziteta u Beogradu,

kao i sorte koje su kolekcionisane u nacionalnoj kolekciji voćaka "Brogdale" u Velikoj

Britaniji. Upotrebljeni su razvijeni listovi na čokotima u vinogradu iz kolekcije

"Brogdale", veličine od nekoliko centimetara (Sl. 1a, b, c). Takođe su korišćeni listovi

vinove loze razvijeni iz reznica u laboratoriji (metodom provokacije), poreklom iz

kolekcije "Radmilovac" (Sl. 2a, b).

Sl. 1a Sl. 1b Sl. 1c

50

Napomena:

Ne mogu se koristiti delimično razvijena ili „neaktivirana“ okca (Sl. 3).

Okca imaju visoku koncentraciju proteina.

Izolacija DNK neće uspeti (ili će biti jako otežana), ako se vrši ekstrakcija iz

okaca (kada se za ekstrakciju koristi Kit), jer se ne može dobiti adekvatna

koncentracija DNK prilikom očitavanja.

Listovi se mogu čuvati u zamrzivaču (u papirnim vrećama) do početka izolacije

(Sl. 4).

Uzorci se mogu čuvati (-20oC) u ependorf tubama od 1,5 ili 2 ml (Sl. 5).

Sveži uzorci listova se mogu liofilizirati (težina oko 20 mg), ali ekstrahovana

DNK nekada nije odgovarajućeg i zadovoljavajućeg kvaliteta (Sl. 6).

Rad sa liofiliziranim uzorcima je teži (merenje mase uzorka je komplikovano).

Svaki uzorak mora biti obeležen šifrom.

Sl. 2a Sl. 2b

Sl. 3

51

2.2. Ekstrakcija DNK

Napomene pre početka rada:

Pripremiti sve korake centrifuge za rad na sobnoj temperaturi (15-20oC).

Ako je potrebno, rastvoriti koncentrovane forme bufera AP1 i bufera AP3/E.

Dodati etanol u koncentrovani bufer AW i bufer AP3/E.

Zagrejati vodeno kupatilo na 65oC.

Staviti AP1 bufer u vodeno kupatilo na 65oC.

rRNA se stavi pre početka rada na led.

Protokol za ekstrakciju:

1. Odmeriti od 150 do 170 mg svežeg materijala (uzorak listova) (Sl. 7) i usitniti

tečnim azotom (Sl. 8), do finog praha, korišćenjem avana i tučka (Sl. 9.) ili

koristiti “Tissue Lyser” (Sl. 10). Usitnjeno lisno tkivo prebaciti u ependorf tubu

od 1,5 ml i uroniti u tečni azot (Sl. 11).

2. Odpipetirati 400 ul AP1 bufera i 4 ul RNaze u ependorf tubu sa uzorkom.

Mućkati ependorfice na vorteksu sa najjačom brzinom (Sl. 12).

Sl. 4 Sl. 5

Sl. 6

52

3. Ependorf tube inkubirati na 65°C u trajanju od 10 minuta u Termomixer-u, na

450 ili 500 rpm (Sl. 13). Tokom ovog koraka dobiće se lizat.

Sl. 7 Sl. 8 Sl. 9

Sl. 10 Sl. 11

Sl. 12

Sl. 13

53

4. Odpipetirati 130 μl AP2 (P3) bufera u lizat, ručno mešati i staviti ependorf tube

na led u trajanju od 5 minuta. Tokom ovog koraka talože se deterdženti, proteini

i polisaharidi. Ependorf tube sa lizatom se centrifugiraju 5 minuta na 14 000

rpm (ili na maksimum 14 680 rpm) kako bi se uklonio talog (Sl. 14). Uzorci u

centrifugi treba da budu ravnomerno raspoređeni (u ravnoteži) (Sl. 15).

5. Ceo lizat se odpipetira (Sl. 16) u ependorf tube “QIAshredder spin column” od

2 ml (roze poklopac) i centrifugira se 2 minuta na 14 000 rpm (ili na maksimumu

od 14 680 rpm).

6. Ceo lizat (400-450 µl) iz koraka 5 se odpipetira u nove ependorf tube bez

uvlačenja otpadnog čvrstog dela.

7. Odpipetira se i doda 600 µl AW1 bufera u čist lizat i mućka se sa pipetom.

8. Odpipetira se 650 μl miksture iz koraka 7 u ependorf tube od 2 ml “DNeasy mini

spin column” i centrifugira 1 minut na 8 000 rpm. Nakon toga se skine filter i

prospe uzorak. Vrati se filter na istu ependorficu i odpipetira se ostatak uzorka

preko filtera.

9. Centrifugira se na 8 000 rpm, 1 minut.

10. Filter “DNeasy column” se prebaci na novu ependorf tubu od 2 ml i otpipetira

500 μl AW2 (AW) pufera u “DNeasy column”. Centrifugira se 1 minut na 8 000

rpm. Posle toga se tečnost prospe.

11. Ponovo se odpipetira 500 μl AW2 (AW) bufera u “DNeasy column” i centrifugira

2 minuta na 14 000 rpm (ili maksimum 14680 rpm) do sušenja membrane.

Važno je da se membrana osuši od ostatka etanola koji može ometati naredne

reakcije. Posle centrifugiranja se prospe tečni deo.

12. Filter “DNeasy column” se prebaci na novu ependorf tubu od 1,5 ml i odpipetira

se 60 μl AE bufera iz vodenog kupatila (65°C) direktno na centar “DNeasy”

membrane. Ostavi se tako na sobnoj temperaturi, inkubira 5 minuta (može do

15 minuta), a potom se centrifugira 1 minut na 8 000 rpm.

13. Ponavlja se korak 12.

14. Skine se filter. Tuba sa uzorkom se zatvori i stavi na led.

Sl. 14 Sl. 15 Sl. 16

54

Napomena:

Uvek se šifrom označe ependorf tube koje se koriste za ekstrakciju.

Voditi računa o čistoći stola.

Radna površina mora da se čisti više puta u toku rada.

Uvek nositi čiste rukavice (nekoliko puta menjati rukavice tokom rada).

Za svako pipetiranje se moraju koristiti novi nastavci za pipete.

2.3. Merenje koncentracije DNK

Spektrofotometrija se koristi za utvrđivanje koncentracije DNK u uzorku. U ovom radu

koncentracija DNK je merena uz pomoć NanoDrop spektrofotometra (Sl. 17). DNK je čuvana

na -20oC do korišćenja.

Postupak:

1. Uključiti laptop.

2. Kliknuti na NanoDrop 2000.

3. Kliknuti na Nucleic Acid.

4. Odpipetirati 1,5 μl AE blank bufera na iglu spektrofotometra.

5. Zatvoriti spektrofotometar.

6. Kliknuti na “BLANK”.

7. Sačekati merenje.

8. Obrisati izlu spektrofotometra papirnim ubrusom.

9. Odpipetirati 1,5 μl DNK uzorka koji je čuvan na ledu i staviti na iglu

spektrofotometra.

10. Kliknuti na “MERENJE”. Tipična DNK kriva je kao na slici u priručniku (Sl. 18a),

ili ona koja je dobijena merenjem ekstrahovane DNK uzoraka u ovom radu (Sl.

18b).

Sl. 17

55

Napomena:

Kod konfiguracije, spektrofotometar mora biti zatvoren.

Kada se očita BLANK, ne sme da bude spektar na ekranu (bez spektra).

Dobra koncentracija DNK je prikazana u Tabeli 1.

Odnos 260/280 i 260/230 očitane koncentracije DNK mora biti veći od 1,7 da bi

ekstrahovana DNK bila visokokvalitetna i pogodna za dalju analizu.

Osim za procenu kvaliteta prečišćene ukupne DNK izračunavanjem odnosa

260/280 i 260/230, takođe su analizirani svi uzorci u gelu (videti 2.6.1).

Tab. 1. Primer očitane koncentracije DNK kod različitih sorti vinove loze

2.4. PCR amplifikacija

2.4.1. Analiza mikrosatelita

Analiza je izvršena pomoću devet mikrosatelitskih lokusa: VVS2 (Thomas i Scott,

1993), VVMD5, VVMD7, VVMD25, VVMD27, VVMD28, VVMD32 (Bowers et al., 1996,

1999), VR-ZAG62 i VrZAG79 (Sefc et al., 1999). Ovaj skup visoko polimorfnih markera

je korišćen od strane Evropskog konzorcijuma „Grape-Gen06„

(http://www1.montpellier.inra.fr/grapegen06/accueil.php) kao standardni set za

skrining kolekciju vinove loze. Ekvivalentna lista prajmera za Vitis vinifera L. je

prikazana u Tabeli 2.

Šifra Konc. DNK (ng/μl) A260 A280 260/280 260/230

28 175,6 3,513 1,907 1,84 2,66

31 128,3 2,566 1,439 1,78 2,05

32 335,8 6,716 3,660 1,84 2,60

34 89,3 1,786 0,975 1,83 2,76

Sl. 18a Sl. 18b

56

Tabela 2. Ekvivalentna lista prajmera za Vitis vinifera L.

Svi "forward" prajmeri su označeni 6-FAM, VIC, PET, ili NED fluorescentnom bojom.

Napomena:

Analize DNK treba kombinovati sa ampelografskim deskriptorima (IPGRI, UPOV, OIV

(1997) prilikom determinacije sorti i planiranja izbora sorti vinove loze sa poželjnim

vinogradarskim i enoloških vrednostima

Materijal neophodan za PCR amplifikaciju:

1. TAq enzim miks

2. Prajmer (R i F)

3. Uzorci

4. Dejonizovana voda

Master miks (za 1 uzorak):

1. TAq enzim miks (10x1 μl)

2. Prajmer R (0,7 μl)

3. Prajmer F (0,7 μl)

4. Dejonizovana voda (7,6 μl)

Naziv Sekvence Izvor Fluorescen

tna boja

VVS2 "forward" 5'-CAG CCC GTA AAT GTA TCC ATC-3' Thomas and Scott

(1993.)

6FAM

"reverse" 5'-AAA TTC AAA ATT CTA ATT CAA CTG G-3'

VVMD5

"forward" 5'-CTA GAG CTA CGC CAA TCC AA-3’ Bowers et al.

(1996.)

6FAM

"reverse" 5'-TAT ACC AAA AAT CAT ATT CCT AAA-3’

VVMD7 "forward" 5'- AGA GTT GCG GAG AAC AGG AT -3' Bowers et al.

(1999.)

VIC

"reverse" 5'- CGA ACC TTC ACA CGC TTG AT -3'

VVMD25 "forward" 5'-TTC CGT TAA AGC AAA AGA AAA AGG-3' Bowers et al.

(1999.)

NED

"reverse" 5'-TTG GAT TTG AAA TTT ATT GAG GGG-3'

VVMD27 "forward" 5'-GTA CCA GAT CTG AAT ACA TCC GTA AGT-3' Bowers et al.

(1999.)

NED

"reverse" 5'-ACG GGT ATA GAG CAA ACG GTG T-3'

VVMD28

"forward" 5'-AAC AAT TCA ATG AAA AGA GAG AGA GAG A-

3' Bowers et al.

(1999.) 6FAM

"reverse" 5'-TCA TCA ATT TCG TAT CTC TAT TTG CTG-3'

VVMD32 "forward" 5'-TAT GAT TTT TTA GGG GGG TGA GG-3' Bowers et al.

(1999.)

PET

"reverse" 5'-GGA AAG ATG GGA TGA CTC GC-3'

VrZAG62 "forward" 5'-GGT GAA ATG GGC ACC GAA CAC ACG C-3'

Sefc et al. (1999.) PET

"reverse" 5'-CCA TGT CTC TCC TCA GCT TCT CAG C-3'

VrZAG79 "forward" 5'-AGA TTG TGG AGG AGG GAA CAA ACC G-3'

Sefc et al. (1999.) NED

"reverse" 5'-TGC CCC CAT TTT CAA ACT CCC TTC C-3'

57

Napomena:

Ukupna količina master miksa je 19 μl.

Sve se pažljivo mućka pipetom 20 puta.

Količina master miksa se množi sa brojem uzoraka (za veći broj uzoraka).

Procedura:

1. U PCR tubu odpipetirati 1 μl izolovane DNK i 19 μl master miksa.

2. U kontrolnu PCR tubu odpipetirati 1 μl dejonizovane vode i 19 μl master miksa.

3. Centrifugirati 1-2 sekunde.

4. Podesiti PCR aparat – “VeritiTM Thermal Cycler (Applied Biosystems, Foster City,

California, USA)” (Sl. 19).

Napomena:

PCR aparat obično radi oko 1,30 sati.

U zavisnosti od prajmera i planiranog eksperimenta, mogu se koristiti različita

podešavanja temperature i vremena (Sl. 20). Različite temperature su

prikazane u Tabeli 3.

Kod PCR-a u “VeritiTM Thermal Cycler (Applied Biosystems, Foster City,

California, USA)” primenjeni su sledeći temperaturni ciklusi: inicijalizacija na

94°C, 2 minuta; 35 ciklusa: denaturacija 1 minut na 94°C, hibridizacija prajmera

1 minut na 50°C i elongacija 1 minut na 72°C; završna elongacija u trajanju od

30 minuta na 72°C.

Kod PCR reakcije u “GeneAmp PCR 9700 thermocycler (Applied Biosystems,

Foster City, CA)” primenjeni su sledeći uslovi: 94°C 5 min, 30 ciklusa: 1 min na

94°C, 1 minut na 51°C ili 49°C (za multipleks ili singlpleks PCR) i 1 minut na

72°C, sa finalnom ekstenzijom 30 minuta na 72°C.

Mogu se primeniti singlpleks ili multipleks reakcije. Ovde su korišćene dve

multipleks i jedna singlpleks PCR reakcija: prva multipleks reakcija za pet

lokusa (VVS2, VVMD7, VVMD27, VrZAG62, VrZAG79), druga za tri lokusa

(VVMD25, VVMD28, VVMD32) i jedna singlpleks reakcija za VVMD5 (Vilanova

et al., 2009).

58

Tabela 3. Različite temperature za različite prajmere u PCR reakciji

2.5. Priprema za sekvencioniranje: prečišćavanje PCR produkata:

www.nbsbio.co.uk

Preneti PCR reakcione smeše (cela količina, oko 35 μl) u ependorf tube sa filterom od

1,5 ml (plavi poklopac) i dodati 3 puta veću zapreminu vezujućeg pufera “Binding

buffer 1” (105 μl).

Napomena: U ovom radu je korišćena zapremina DNK uzorka od 40 μl umnožena

tokom PCR reakcije

1. Cela količina se odpipetira i ostavi da stoji na sobnoj temperaturi 2 minuta.

Centrifugira se na 10 000 rpm 2 minuta.

PCR amplifikacioni

koraci

Prajmer

VVS2, VVMD5, VrZAG79, VVMD7

VVMD27 VVMD28

VrZAG62 VVMD25 VVMD32

Preciklus/Inicijalizacija 95°C 1 min 94°C 2 min

94°C 2 min 94°C 2 min

Denaturacija 95°C 30 s 92°C 40 sek

92°C 40 s 92°C 40 s

30x ili 35x Aniling

51°C 30 s (57-58°C, 30 s) (48-56°C, 30 s)

55-56°C 30 s 49°C 30 s

56-59°C 40 s 44-45°C 30 s 48-49°C 30 s

Elongacija/Ekstenzija 72°C 30 s 72°C 2 min

72°C 2 min 72°C 2 min

Post ciklus/Finalna

elongacija 72°C 1 min

72°C 5

min 72°C 5 min 72°C 5 min

Sl. 19 Sl. 20

59

2. Prospe se tečnost iz ependorf tube, vrati se filter i preko njega se odpipetira

750 μl rastvora za ispiranje “Wash solution” i centrifugira se na 10 000 rpm 2

minuta.

3. Ponoviti korak 3. Centrifugira se 10 000 rpm dodatni minut da bi se uklonile sve

nečistoće.

4. Prebaci se filter na “običnu” ependorf tubu od 1,5 ml i doda se 30-50 μl (obično

30 μl) bufera za eluciju “Elution buffer”. Inkubira se na sobnoj temperaturi 2

minuta (može takođe i 5 minuta). Centrifugira se na 10 000 rpm 2 minuta za

eluciju DNK.

Napomena: Vrlo je važno dodati puffer za eluciju “Elution buffer” u centar

kolone sa filterom. Ako se inkubira kolona sa “Elution buffer”, na višoj

temperaturi (od 37oC do 50oC), može se neznatno povećati “prinos”, posebno

kod velike DNK. Pred zagrevanje “Elution buffer” na 55-80oC može neznatno

povećati efikasnost eluiranja.

5. Čuvati pripremljenu DNK na -20oC.

Napomena:

Ako PCR reakcija generiše nespecifične amplifikovane DNK

fragmenate, preporučuje se DNK Gel Ektraction Kit.

2.6. Elektroforeza

Elektroforeza je metod koji se koristi za razdvajanje DNK fragmenata i određivanje

njihove veličine, poredeći ih sa veličinama poznatih dužina fragmenata. U našem

protokolu primenili smo ovaj metod za analizu ukupne prečišćene DNK (2.2.) i analizu

PCR produkata (2.4.).

2.6.1. Gel elektroforeza

Procedura za spravljanje agaroznog gela:

1. Odmeri se 0,25 g agaroze i 25 ml x 1 TAE pufera (100 ml TAE x 10 i doda se

1000 ml destilovane vode).

Napomena: Agarozni gel: uobičajeno se koriste koncentracije agaroznog gela

od 0,7% do 2% u zavisnosti od veličine traka koje je potrebno izdvojiti. Odmeri

se 0,60 g agaroze i 60 ml x 1 TAE pufera za najveću kadicu za elektroforezu.

Podesi se početna agaroza %g/100 mL TAE (npr. 2g/100mL daće 2%).

Napomena: Oprez VRUĆE! Pažljivo mešati, može doći do eruptivnog ključanja.

60

2. Rastvoriti agarozu zagrevanjem u mikrotalasnoj pećnici (20-30 sekundi).

3. Agarozni gel treba da se hladi 5 minuta.

4. Odpipetirati Etidijum bromid (EtBr) do konačne koncentracije od približno 1,0

μl. Etidijum bromid se vezuje za DNK i omogućava vizualizaciju DNK pod

ultraljubičastom (UV) svetlošću.

Napomena:

PAŽNJA! Etidijum bromid je poznati mutagen. Nositi laboratorijski

mantil, zaštitu za oči i rukavice prilikom rada sa ovom hemikalijom.

“Mildori Green Nucleic Acid Staning Solution” je sigurna alternativa

tradicionalnom EtBr za detekciju DNK u agaroznim gelovima.

5. Sipati agarozni gel u ležište.

Napomena: Sipati polako da se izbegne stvaranje mehurića koji će

poremetiti gel. Ako ih bude, mehurići mogu biti pomereni pomoću nastavka

za pipetu daleko od razlivenog gela prema stranama, ivicama gela.

6. Razliveni gel ostaviti na 4°C od 10 do 15 minuta ili na sobnoj temperaturi 20-30

minuta, sve dok ne bude potpuno čvrst.

Priprema uzoraka za elektroforezu:

1. Pažljivo odpipetirati uzorak DNK (4 μl).

2. U svaki od uzoraka odpipetirati DNK bufer (2 μl stop plavog).

Postupak stavljanja gela u elektroforezu:

1. Ukloniti zaštitnu traku.

2. Staviti ploču sa gelom u elektroforezu.

3. Ukloniti češalj.

4. Popuniti kadicu za elektroforezu 1xTAE buferom, dok gel ne bude pokriven.

Ubacivanje uzoraka u agarozni gel:

1. Pažljivo odpipetirati marker (DNK 1000) u prvu traku “bunarčić” gela

(odpipetirati 3-4 ul).

2. Pažljivo odpipetirati pripremljeni uzorak DNK (4 μl DNA + 2 μl “stop plavog”) u

dodatnie trake „bunarčiće” na gelu (Sl 21).

3. Pažljivo odpipetirati marker (DNK 1000) u poslednju traku “bunarčić” gela

(odpipetirati 3-4 ul).

4. Strujom napona od 80-150V pokrenuti gel dok se plava boja (linija) ne „spusti”

za 75-80% na dole u gelu (Sl. 22).

61

Napomena:

Crna je negativna, a crvena je pozitivna elektroda. DNK je negativno

naelektrisana i pokrenuće se ka pozitivnoj elektrodi. Uvek postaviti tako

da uzorci migriraju ka pozitivnoj elektrodi (crvene na dnu, crna pri vrhu)

(Sl. 23a, b).

Tipično vreme rada elektroforeze je oko 1-1,5 sat, u zavisnosti od

napona struje.

5. Isključiti napajanje struje i isključiti elektrode iz izvora napajanja, a zatim

pažljivo izvaditi fioku sa gelom iz kadice za elektroforezu.

Napomena:

TAE pufer se može dopunjavati i koristiti do 10 puta.

Traka se obavezno stavlja na kutiju elektroforeze (napisati koliko je puta

korišćen gel) (Sl. 24).

Za gel elektroforezu koja je male do srednje veličine, dobro razdvajanje

fragmenata DNK se postiže ako gel “radi” na 50V oko 45 minuta (Sl. 25).

Sl. 21 Sl. 22

Sl. 23a Sl. 23b

62

2.7. Vizuelizacija DNK fragmenata

1. Za vizuelizaciju DNK fragmenata se koristi bilo koji uređaj koji emituje UV zrake.

Napomena:

Kada se koristite UV zraci, štititi oči i kožu noseći zaštitne naočare

ili štitnik za lice, rukavice i beli mantil.

Ako se vizualizovana DNK prečišćava za dalju analizu, koristiti duge

talasne dužine UV zraka i izlagati kratko vreme, da bi se mogući

štetni efektni na DNK minimizirali.

Fragmenti DNK se obično nazivaju "trake" zbog njihovog

pojavljivanja na gelu.

2. Vizualizacija DNK fragmenata je obavljena uz pomoć WP transiluminatora

(GelDoc – ItTS2/Imager Benchop UV Transilluminator) (Sl. 26).

3. Gel na Transiluminatoru (Sl. 27).

4. Korišćen je softver: “Software UVP TS2” (Sl. 28).

5. Štampanje slike uz pomoć digitalnog štampača ”UP-D897”.

Sl. 24 Sl. 25

Sl. 26 Sl. 27 Sl. 28

63

2.8. Analiza gela:

Koristiti DNK marker, u prvoj koloni, kao vodič (instrukcije proizvođača će ukazati na

veličinu svake trake), da se odredi dužina ”bandova” dobijenih u kolonama uzoraka i

vizualizuje prečišćena ukupna DNK (Sl. 29) ili DNK amplifikovana PCR-om (Sl. 30).

Napomene:

Kako dobiti bolju rezoluciju traka?

Postoji nekoliko jednostavnih načina da se poveća rezolucija (oštrina) DNK traka, kao

što su: a) gel treba da “radi” na nižem naponu duži vremenski period; b) koristiti širi

gel češalj; c) pipetiranje manje količine DNK u “bunarčiće”.

• Kako dobiti bolje razdvajanje traka?

Ako se dobiju približno iste veličine traka koje su preblizu (zbog slične molekulske

mase DNK fragmenata), može se podesiti procenat agaroze u gelu da bi njihovo

odvajanje bilo bolje. Veći procenat agaroze u gelu će pomoći u razdvajanju manjih

traka, a manji procenat gela će pomoći da se razdvoje veće trake.

• Pravilo 10%:

Za svaki uzorak koji se želi otpipetirati na gel, uzeti 10% veći volumen nego što je

potrebno, jer se nekoliko mikrolitara može izgubiti pipetiranjem. Na primer, ako se želi

odpipetirati 1.0μg u 10 uL, staviti 1.1μg u 11μl.

3. Zahvalnica

Ovaj rad je realizovan kao deo Projekta: “FP7-REGPOT-2012-2013-1. No. 316004-

AREA”, koji je finansiran od strane Evropske unije. Ispitivanja su izvedena zahvaljujući

pomoći i podršci dr George Gibbings-a, dr Matthew Ordidge-a, dr Tijane Blanuše i dr

Sl. 29 Sl. 30

64

Edward Paul Venison-a, sa Poljoprivrednog fakulteta Univerziteta u Reding-u u Velikoj

Britaniji.

Pitanja:

1. Koje informacije se mogu dobiti analizom mikrosatelitskih (SSR) markera

vinove loze?

2. Koji uzorci su iskorišćeni za analizu genotipova vinove loze?

3. Šta su kriterijumi za odabir uzoraka vinove loze iz kojih se ekstrahuje DNK?

4. Na koji način se meri količina ekstrahovane DNK i kako se utvrdjuje njena

čistoća?

5. Na koji način se može dobiti bolja rezolucija i bolje razdvajanje traka na gelu?

4. Literatura

Adam-Blondon, A.F., Roux, C., Claux, D., Butterlin, G., Merdinoglu, D., This, P. (2004):

Mapping 245 SSR markers on the Vitis vinifera genome: a tool for grape genetics.

Theoretical and Applied Genetics, 109(5):1017-1027.

Arroyo-Garcia, R., Martinez-Zapater, J.M. (2004): Development and characterization

of new microsatellite markers for grape. Vitis, 43(4):175-178.

Bowers, J.E., Vignani, R., Meredith, C.P. (1996): Isolation and characterization of new

polymorphic simple sequence repeat loci in grape (Vitis vinifera L.). Genome, 39:628-

633.

Bowers, J.E., Dangl, G.S., Meredith, C.P., (1999): Development and characterization

of additional microsatellite DNA markers for grape. American Journal of Enology and

Viticulture, 50:243-246.

Cipriani, G., Marrazzo, M.T., Di Gaspero, G., Pfeiffer, A., Morgante, M., Testolin, R.

(2008): A set of microsatellite markers with long core repeat optimized for grape (Vitis

spp.) genotyping. Bmc Plant Biology, 8(127):1-13.

Jakse, J., Štajner, N., Tomić, L., Javornik, B. (2013): Application of microsatellite

markers in grapevine and olives. Intech Open Science.

Laucou, V., Lacombe, T., Dechesne, F., Siret, R., Bruno, J.P., Dessup, M., Dessup,

T., Ortigosa, P., Parra, P., Roux, C., Santoni, S., Varès, D., Péros, J.P., Borsiquot,

J.M., This, P. (2011): High throughput analysis of grape genetic diversity as a tool for

65

germplasm collection management. Theoretical and Applied Genetics, 122(6):1233-

1245.

Merdinoglu, D., Butterlin, G., Bevilacqua, L., Chiquet, V., Adam-Blondon, A.F.,

Decroocq, S. (2005): Development and characterization of a large set of microsatellite

markers in grapevine (Vitis vinifera L.) suitable for multiplex PCR. Molecular Breeding,

15(4):349-366.

O. I. V. (1997): (Off. Int. Vigne Vin). Paris, France, Int. Plant Genet. Resour. Institute

(IPGRI), Rome, Italy.

Sanchez-Escribano, E.M., Martin, J.R., Carreno, J., Cenis, J.L. (1999): Use of

sequence-tagged microsatellite site markers for characterizing table grape cultivars.

Genome, 42(1):87-93.

Sefc, K.M., Regner, F., Tutetschek, E., Gloessl, J., Steinkellner, H. (1999):

Identification of microsatellite sequences in Vitis riparia and their applicability for

genotyping of different Vitis species. Genome, 42:367-373.

Sefc, K.M., Lefort, F., Grando, M.S., Scott, K., Steinkellner, H., Thomas, M.R. (2001):

Microsatellite markers for grapevine: A state of the art. In: Molecular Biology and

Biotechnology of Grapevine. Roubelakis-Angelakis KA, editor. Amsterdam:Kluwer

Publishers, 407-438.

This, P.,Jung, A.,Boccacci, P.,Borrego, J.,Botta, R.,Costantinim, L.,Crespan,

M.,Dangl, G.S.,Eisenheld, C.,Ferreira-Monteiro, F.,Grando, S.,Ibáñez, J.,Lacombe,

T.,Laucou, V.,Magalhães, R.,Meredith, C.P.,Milani, N.,Peterlunger, E.,Regner,

F.,Zulini, L.,Maul, E. (2004): Development of a standard set of microsatellite reference

alleles for identification of grape cultivars. Theoretical and Applied Genetics,

109(7):1448-1458.

Thomas, M.R., Scott, N. (1993): Microsatellite repeats in grapevine reveal DNA

polymorphisms when analysed as sequence-tagged sites (STSs). Theoretical and

Applied Genetics, 86:985-990.

Vilanova, M., Fuente, de la M., Fernández-González, M., Masa, A. (2009):

Identification of New Synonymies in Minority Grapevine Cultivars from Galicia (Spain)

Using Microsatellite Analysis. American Journal of Enology and Viticulture, 60:236-

240.

Žulj Mihaljević, M., Šimon, S., Pejić, I., Carka, F., Sevo, R., Kojić, A., Gaši, F., Tomić,

L., Jovanović Cvetković, T., Maletić, E., Preiner, D., Božinović, Z., Savin, G., Cornea,

V., Maraš, V., Tomić Mugoša, M., Botu, M., Popa, A., Beleski, K. (2013): Molecular

characterization of old local grapevine varieties from South EastEuropean countries.

Vitis, 52(2):69-76.

66

Primena qPCR metode u ispitivanju kolonizacije biljaka

patogenim bakterijama

Kljujev Igor

Izvod

Konzumiranje povrća je veoma važno zbog prevencije kardiovaskularnih

bolesti i preporučuje se od strane Svetske zdrastvene organizacije (WHO). Sveže

povrće je neophodno u zdravoj ishrani ljudi, jer obezbeđuje unos minerala i vitamina.

Povrće se uglavnom konzumira sirovo, odnosno u svežem stanju i veoma je važno da

se izbegne njegova mikrobiološka kontaminacija tokom proizvodnog procesa. Bolesti

izazvane patogenim bakterijama predstavljaju veliki problem za zdravlje

stanovništva.Ove bakterije su u stanju da kontaminiraju sveže povrće u bilo kom delu

proizvodnog lanca. Salmoneloze predstavljaju uobičajene infekcije izazvanje

konzumiranjem kontaminirane hrane, a uzrokuju ih bakterije roda Salmonella spp.

Prema podacima Američkog zavoda za javno zdravlje (U.S. Public Health Service)

(2009), Salmonella se nalazi na drugom mestu u SAD-u kao uzročnik bolesti nastalih

konzumiranjem kontaminirane hrane. Najčešće prisutni sojevi Salmonella sp.širom

sveta su Salmonella enteritidis i Salmonella typhimurium dok su ostali sojevi

ograničeni na specifična geografska područja (OIE, 2005). Konvencionalne metode

za detekciju patogenih bakterija u hrani su uglavnom dugotrajne. Metoda PCR je

mnogo brža i pomoću qPCR metode se mogu dobiti rezultati za samo nekoliko časova.

PCR metod omogućava kraće vreme analize, veću osjetljivost kao i specifičnost za

otkrivanje patogenih bakterija u svežem povrću. Cilj ovog istraživanja je primena

qPCR metoda u detekciji Salmonella enterica subsp. Welteweden i Salmonella

typhimurium LT2 u klijancimabiljaka pšenice. Bakterijski sojevi, korišćeni u ovim

istraživanjima, bili su Salmonella enterica subsp. Welteweden i Salmonella

typhimurium LT2. Model biljka je bila pšenica. Koncentracija bakterija, primjenjena za

inokulaciju semena biljaka, je bila ≈ 108 CFU. Inokulisane biljke su gajene u fitotronu

tri sedmice. Standardni PCR je urađen za oba soja Salmonella spp. Korišćeni prajmeri

za Salmonella sojeve su bili: rfbJ; fliC; fijB; invA, hilA. Takođe, urađeno je kloniranje u

cilju dobijanja plazmida sa invA genom što je korišćeno za pripremu standardaza

qPCR. Izolacija Salmonella-DNA iz uzoraka biljaka je urađeno pomoću kit-a za

izolaciju DNA. Sekvencioniranje invA, izolovanog iz uzoraka biljnog materijala, je

takođe urađeno. Metoda qPCR je urađena za uzorke bakterijske DNA izolovane iz

uzoraka korena, nadzemnog dela klijanaca pšenice i tečne faze substrata u kome su

biljke gajene za biljke inokulisane sa Salmonella sojevima. Metoda Fluorescence In

Situ Hybridization je urađena za sve uzorke inokulisanih biljaka. U ovoj metodi su

korišćene strogo specifične oligonukleotidne probe radi detekcije i potvrde Salmonella

ćelija pomoću CLSM-a. Rezultati su pokazali da su oba ispitivana Salmonella soja

imala veliku sposobnost kolonizacije klijanaca pšenice.

1. Uvod

67

Poslednjih nekoliko godina, javlja se sve veći broj epidemija uzrokovanih

konzumiranjem svežeg povrća koje je kontaminirano patogenim bakterijama. Primena

organskih đubriva i kontaminirane vode za navodnjavanje su glavni izvori

kontaminacije biljaka patogenim bakterijama tokom proizvodnje hrane.

Konzumiranje povrća je veoma važno za prevenciju kardiovaskularnih bolesti i

preporučuje se od strane Svetske zdravstvene organizacije. Sveže povrće je

neophodno za zdravu ishranu i obezbeđuje organizmu neophodne minerale i

vitamine. Povrće se uglavnom konzumira u sirovom stanju i veoma je važno da se

izbegne njegova mikrobiološka kontaminacija tokom proizvodnog lanca.

Poslednjih godina, javlja se rastući broj epidemija uzrokovanih konzumiranjem

kontaminiranog svežeg povrća. Prema podacima CDC-a (Centar za kontrolu i

prevenciju bolesti) (2010), mikrobiološki kontaminirana zelena salata je bila jedan od

najčešćih uzroka epidemija u SAD-u tokom 2007. godine.

Danas postoji mnogo metoda za detekciju patogenih bakterija u hrani.

Konvencionalne metode, koji se baziraju na izolaciji patogena, su uglavnom

dugotrajne, te su neophodne nove, pouzdanije i brže metode. Npr. Imunološke metode

za otkrivanje i detekciju patogena su veoma moćni alati, jer omogućavaju izolaciju

uzročnika iz bakterijske suspenzije pomoću antitelo-obloženih magnetskih kuglica.

PCR metode daju preciznije rezultate, što je posebno omogućio napredak u PCR

tehnologiji koji se dešava poslednjih godina. Dakle, pomoću RTPCR-a mogu se dobiti

veoma precizni rezultati za samo nekoliko časova. Danas, najčešće metode za

detekciju patogena u svežem povrću su: metoda brojanja kolonija na agarnim

pločama, PCR i imunološke metode. Metoda PCR je mnogo brža u odnosu na ostale

metode (rezultati se mogu dobiti za svega 6 do 24 časa) i ne zahteva predhodno

obogaćenje radi detekcije patogena. S druge strane, pomoću RT PCR metode

možemo dobiti rezultat još brže, za samo nekoliko sati.

Uobičajeni PCR protokol za detekciju patogenih bakterija u uzorcima obuhvata:

DNA denaturaciju, prajmer aniling, ekstenziju. Dobijeni PCR produkt se može

analizirati pomoću elektroforeze na gelu ili sekvenciranjem DNK. Metoda qPCR je

tehnika za amplifikaciju i istovremenu kvantifikaciju ciljanog dela DNK. Lančana

reakcija polimeraze (PCR) omogućava detekciju i kvantifikaciju DNA sekvence u

realnom vremenu nakon ciklusa amplifikacije. Kvantifikacija uključuje fluorescentne

boje koja se ubacuju preko dvostruke DNA tokom PCR ciklusa i oligonukleotidne

probe koje fluoresciraju nakon hibridizacije sa komplementarnom DNA - fluorescentni

signal je proporcionalan količini DNA koja se stvara tokom PCR ciklusa. Takođe,

moguće je koristiti oligonukleotidne probe koje su označene sa različitim bojama i

omogućavaju kvantifikaciju i detekciju multiplih ciljnih gena u jednoj PCR reakciji.

U poređenju sa konvencionalnim metodama u mikrobiologiji, PCR tehnika je

znatno brža i zahteva manje vremena za postizanje preciznih i validnih rezultata.

Prednost PCR metode je detekcija bakterija koje ne možemo izolovati

konvencionalnim mikrobiološkim metodama (na agarnim ploćama). Metoda PCR

omogućava kraće vreme analize, veću osjetljivost i specifičnost u detekciji patogenih

bakterija u svežem povrću i povrću koje je spremno za konzumiranje.

68

Danas su poznate dve RT PCR metode, TaqMan i SYBR Green. SYBR Green

qRT PCR omogućava brže rezultate u odnosu na druge tehnike, a detekcija je

bazirana na vezanju SYBR-Green boje u dvolančane PCR produkte. Ova metoda se

može primeniti bez potrebe za probama koje su vezane za fluorescentne molekule.

Cilj ove studije je da se napravi i unapredi protokol za brzu i preciznu detekciju

patogenih bakterija u kontaminiranim biljkama korišćenjem qPCR metode. Ovim će se

razviti i unaprediti mikrobiološke laboratorijske analize patogena korišćenjem RT-

PCR-a, poboljšati PCR metod i razviti validaciju PCR protokola. Veoma je važno razviti

jednostavnu i pouzdanu qPCR metodu u kojoj će se koristi SYBR Green i koja će biti

pogodna za rutinske analize detekcije Salmonella spp. u biljkama i svežem povrću.

Cilj ovog rada je primena qPCR metoda u detekciji Salmonella enterica subsp.

Welteweden i Salmonella typhimurium LT2 kod klijanaca pšenice i usavršiti znanje

korišćenja qPCR tehnike u detekciji patogena u biljnom materijalu.

2. Materijal, metode i beleške

Bakterijski sojevi, korišćeni u ovom eksperimentu,su bili Salmonella enterica

subsp. Weltevreden i Salmonella typhimurium LT2. Model biljka za inokulaciju je bila

pšenica. Sterilisano seme pšenice je inkubirano na NB agaru na tempetaruri 30⁰ C

tokom 3 dana, da bi proklijalo, a onda su klijanci gajeni na kvarcnom pesku u sterilnim

uslovima. Koncentracija bakterijske suspenzije, korišćene za inokulaciju klijanaca, je

iznosila ≈ 108 CFU (OD600 = 0,7) za oba soja Salmonella. Pre inokulacije, klijanci

biljaka su isprani u sterilnoj H2O pet puta, a nakon toga su držani u bakterijskoj

(Salmonella) suspenziji 1 čas na t = 20⁰C pre sadnje. Inokulisani klijanci su gajeni u

fitotronu tri sedmice.

Slika 1. Biljke pšenice u epruvetama i klijanci pšenice u Petri kutijama

69

Urađen je standard-PCR za čiste kulture Salmonella enterica subsp.

Weltevreden i Salmonella typhimurium LT2. Standard PCR je obuhvatao ekstrakciju

bakterijske (Salmonella) DNA pomoću Genomic DNA From Tissue kit,

NucleoSpinTussue (Machery-Nagel, www.mn-net.com). Korišćeni su specifični

prajmeri za Salmonella i to: rfbJ; fliC; fijB; invA i hilA (za Salmonella typhimurium LT2).

Korišćen je sledeći PCR program: Hotstart na 94⁰C - 5 min.; Denaturating na 94⁰C -

45 sekundi .; Annealing na 54⁰C - 45 sekundi .; Elongation na 72⁰C - 45 sekundi .;

Final elongation na 72⁰C - 5 min .; Store na 4⁰C - kontinuirano (30 ciklusa).

Elektroforeza je rađena u 1% agarozi u TAE puferu + 3μl EtBr/100 ml, pri 120V;

400mA; 100W; u trajanju od 45 minuta.

Tabela 1: Prajmeri za Salmonella sojeve

Prajmer Ciljani

gen

Dužina

Prajmer

a

(bp)

Sekvenca Veličina

amplifikovanog

fragmenta (bp)

Genbank-EMBL-

DDBL ID brojevi

sekvenci u bazi

podataka

RfbJ-s

RfbJ-as

rfbJ 24

24

5’-CCAGCACCAGTTCCAACTTGATAC-3’

5’-GGCTTCCGGCTTTATTGTTAAGCA-3’

663 AE008792

FliC-s

FliC-as

fliC 24

24

5’-ATAGCCATCTTTACCAGTTCCCCC-3’

5’-GCTGCAACTGTTACAGGATATGCC-3’

183 D13689

FljB-s

FljB-as

fljB 24

24

5’-ACGAATGGTACGGTCTCTGTAACC-3’

5’-TACCGTCGATAGTAACGACTTCGG-3’

526 AF045151

139-s

141-as

invA 26

22

5’-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3’

5’-TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3’

284 Malorny at al.

(2003)

Slika 2. Standard-PCR za čiste culture Salmonella sojeva

70

Takođe, urađena je FISH (fluorescentna in situ hibridizacija) analiza za čiste

kulture Salmonella enterica subsp. Welteweden i Salmonella typhimurium LT2.

Salmonella sojevi su inkubirani preko noći u NB bujonu na t=37⁰C. Nakon toga,

urađena je fiksacija paraformaldehidom (PFA) (za G- bakterije) prema protokolu za

fiksaciju bakterijskih kultura. Oligonukleotidne probe, korišćene za ovu analizu, bile

su: Salm-63-Cy3; Gam42a-Fluos; Bet42a-Oligo. Protokol za FISH analizu je: dodati

1-10μl PFA-fiksiranog uzorka na mikroskopsku pločicu; sušiti na 46⁰C; izvršiti

dehidrataciju u seriji 50%, 80%, 100% EtOH i držati uzorak 3 min. u svakom; sušiti

uzorka na vazduhu; dodati 8μl hibridizacionog pufera i 1 μl probe. Nakon toga, uzorci

su posmatrani pomoću CLSM-a (confocal laser scanning microscopy).

Slika 3. FISH za čistu kulturu Salmonella typhimurium LT2

qPCR analiza: U cilju pripreme serije standarda za qPCR, izvršeno je

kloniranje za dobijanje plazmida kod Salmonella sojeva.Urađen je PCR-kloning za

invA gen kod ispitivanih Salmonella sojeva (Salmonella enterica subsp.

WeltewedeniSalmonella typhimurium LT2) prema PCR-kloning protokolu StrataClone

PCR Clonong Kit (Stratagene).Ovaj protokol je obuhvatao sledeće: izolacija plazmid

asa invA iz E. coli-kompetentnih ćelija (urađeno pomoću kit-a Plasmid DNA purification

prema protokolu NucleoSpin Plasmid QuickPure protocol); priprema serije standarda

za qPCR (izračunat je broj molekula po 1 µl invA kopija). Nakon toga, urađen je qPCR

za uzorke DNA izolovane iz čistih kultura Salmonella sojeva prema 16 S PCR-

programu i qPCR-produkti su dalje ispitivani elektroforezom.

71

Slika 4. Bakterijske kolonije transformisanih kompetentnih ćelija sa plazmidom

koji nosi invA

Izolacija bakterijske (Salmonella) DNA iz biljaka: Bakterijska DNA je izolovana

iz: korena pšenice; nadzemnog dela pšenice (stablo i list) i tečne faze supstrata

(kvarcni pesak) prema sledećem protokolu: uzeto je 0,5 g biljnog materijala i 500 ul

tečne faze supstrata za analize; koren i nadzemni deo biljaka pšenice je izmrvljen sa

tučkom u avanu sa tečnim azotom; nakon toga, bakterijska DNA iz biljnog materijala i

tečne faze substrata je izolovana pomoću FastDNA SPIN Kit-a (www.mpbio.com).

Zatim, urađen je standard-PCR za DNA koja je izolovana iz biljnog materijala i tečne

faze substrata radi provere prisustva Salmonella-DNA. Pozitivna kontrola je bila DNA

izolovana iz čiste kulture Salmonella sojeva, a negativna kontrola je bila PCR-

reakciona smeša bez DNA.

Slika 5. Standard PCR za bakterijsku (Salmonella)DNA izolovanu iz biljnog

materijala (invA).

Legenda: 3–koren pšenice inokulisan Salmonella typhimurium LT2; 4–nadzemni deo pšenice

inokulisan S.typhimurium LT2; 5-koren pšenice inokulisan Salmonella enterica subsp.

Welteweden; 6–nadzemni deo pšenice inokulisan S.enterica subsp. Welteweden; 7–tečna

faza substrata inokulisanaS.typhimurium LT2; 8–tečna faza substrata inokulisanaS.enterica

subsp. Welteweden; S.e.i S.t.-pozitivna kontrola; NC-negativna kontrola.

72

Takođe, urađeno je i sekvencioniranje invA izolovanog iz uzoraka biljnog materijala

i ova analiza je obuhvatala sledeće: standard-PCR; elektroforeza; prečišćavanje PCR

master mix uzoraka; određivanje koncentracije DNA pomoću NanoDrop-a; Seq-PCR;

prečišćavanje Seq-PCR produkta; stavljanje uzoraka u mikrotitar ploču i samog

sekvenciranja.

Konačno, kvantitativni PCR (qPCR) je urađen za uzorke DNA izolovane iz:

korena pšenice inokulisane sa Salmonella typhimurium LT2; nadzemnog dela pšenice

inokulisane sa Salmonella typhimurium LT2; korena pšenice inokulisane sa

Salmonella enterica subsp. Weltevreden; nadzemnog dela pšenice inokulisane sa

Salmonella enterica subsp. Weltevreden; tečne faze substrata inokulisanog

saSalmonella typhimurium LT2 i tečne faze substrata inokulisanog sa Salmonella

enterica subsp. Welteweden. Za ove DNA uzorke je urađena elektroforeza.

Slika 6. qPCR produkti DNA izolovanog iz uzoraka biljnog materijala (3; 4; 5; 6)

inokulisanog Salmonella sojevima

Legenda: 3–koren pšenice inokulisan Salmonella typhimurium LT2; 4–nadzemni deo pšenice

inokulisan S.typhimurium LT2; 5–koren pšenice inokulisan Salmonella enterica subsp.

Welteweden; 6–nadzemni deo pšenice inokulisan S.enterica subsp. Welteweden; PC-

pozitivna kontrola; NC-negativna kontrola.

Takođe, urađena je FISH analiza za uzorke biljnog materijala koji su inokulisani

Salmonella sojevima, u kombinaciji sa CLSM. Uzorci za ovu analizu su bili: koren,

stablo i list biljaka pšenice. Specifične oligonukleotidne probe, korištene za detekciju

sojeva Salmonella pomoću CLSM-a su bile: Salm 63 - Cy3; Gam 42 - Fluos i Bet 42 -

Oligo. FISH analiza je urađena prema protokolu In Situ Hybridization Protocol za biljni

material.

73

Ispitani Salmonella sojevi imali su izrazito veliku sposobnost da kolonizuju biljke

pšenice. Broj Salmonella DNK kopija bio je 4.01 x 106 po 1 g korena (S. enterica) i

3.32 x 107 po 1 g korena (S. typhimurium).

Slika 7. CLSM mikrografija endofitne kolonizacije korena sa Salmonella typhimurium

3. Zahvalnica

Ovaj rad je realizovan kao deo Projekta: “FP7-REGPOT-2012-2013-1. No.

316004-AREA”, koji je finansiran od strane Evropske unije i Ministarstva obrazovanja,

nauke i tehnološkog razvoja Republike Srbije (Projekt TR 31080).

Takođe, dugujem zahvalnost Prof. Anton Hartmann-u, dr Michael Schmid-u,

Angelo Weiss-u i svim kolegama iz Helmholtz Zentrum Munchen, Nemačka, AMP

Research Unit, koji su mi pomogli u realizaciji ovih istraživanja.

Pitanja:

1. Šta su salmoneloze i koje su dva glavna soja bakterija koja ih izazivaju?

2. Šta su prednosti qPCR metode za detekciju patogenih bakterija u poređenju sa

konvencionalnim metodama?

3. Koje tri vrste uzoraka pšenice se mogu koristiti za detekciju Salmonella

bakterija?

4. Koja je prednost SYBR Green qPCR tehnike u poredjenju sa TaqMan qPCR

metodom za detekciju bakteriskih sojeva?

5. Za šta se koriste FISH i CLSM metoda pri detekciji patogenih bakterija?

74

4. Literatura

Amann R I, Krumholz L & Stahl D A (1990) Fluorescent-oligonucleotide probing of

whole cells for determinative, phylogenetic, and environmental studies in

microbiology. J Bacteriol 172: 762–770.

Amann R I, Zarda B, Stahl D A & Schleifer K H (1992) Identification of individual

prokaryotic cells by using enzymelabeled, rRNA-targeted oligonucleotide probes. Appl

Environ Microbiol 58: 3007–3011.

Barak D. J., Whitehead L. C., Charkowski A. O. Difference in Attachment of

Salmonella enterica Serovars and Escerichia coli O157:H7 to Alfalfa Sprouts. Appl.

Environ. Microbiol. 2003; Vol 69, No 8:4556–4560.

Beuchat, L. R. 2002. Ecological factors influencing survival and growth of human

pathogens on raw fruits and vegetables. Microbes and Infect. 4: 413–423.

Beuchat, L. R., and J. H. Ryu. 1997. Produce handling and processing practices.

Emerg. Infect. Dis. 3:459–465.

Blomme, B., & Handler, A. (2009). Fluorescence In Situ Hybridization. Retrieved

from Enviromental Microbiology:

http://filebox.vt.edu/users/chagedor/biol_4684/Methods/FISH.html

Brandl, M. T., and R. E. Mandrell. 2002. Fitness of Salmonella enterica serovar

Thompson in the cilantro phyllosphere. Appl. Environ. Microbiol. 68:3614-36Burun B.,

Coban Poyrazoglu E. 2002. Embryo Culture in Barley (Hordeum vulgare L.). Turk. J.

Biol. 26. 175-180.

CDC (2006b) Ongoing multistate outbreak of Escherichia coli serotype O157:H7

infections associated with consumption of fresh spinach – United States, September

2006. Morb Mortal Wkly Rep 55, 1045–1046.

Charkowski, A. O.J. D. Barak, C. Z. Sarreal, and R. E. Mandrell. 2002. Differences in

growth of Salmonella enterica and Escherichia coli Ol57:H7 on alfalfa sprouts.

Appl.Environ. Microbiol. 68:3114-3120.

Cooley, M. B., W. G. Miller, and R. E. Mandrell. 2003. Colonization of Arabidopsis

thaliana with Salmonella enterica or enterohemorrhagic Escherichia coli Ol57:H7

andcompetition by Enterobacter asburiae. Appl. Environ. Microbiol. 69:4915-4926.

Cummings, K., E. Barrett, J. C. Mohle-Boetani, J. T. Brooks, J. Farrar, T. Hunt, A.

Fiore, K. Komatsu, S. B. Werner, and L. Slutsker. 2001. A multistate outbreak of

75

Salmonella enterica serotype baildon associated with domestic raw tomatoes.

Emerg.Infect. Dis. 7: 1046–1048.

Dong, Y, A. L. Iniguez, B. M. Ahmer, and E. W. Triplett. 2003. Kinetics and strain

specificity of rhizosphere and endophytic colonization by enteric bacteria on seedlings

of Medicago sativa and Medicago truncatula. Appl. Environ. Microbiol. 69:1783-1790.

Doyle, M. P., and J. L. Schoeni. 1986. Isolation of Campylobacter jejuni from retail

mushrooms. Appl. Environ. Microbiol. 51:449– 450.

Eldor, P. (2007). Soil Microbiology, Ecology and Biochemistry. Oxford: Academic

Press is an imprint of Elsevier.

FAO/WHO Multistate Outbreak of Salmonella Serotype Poona Infections Associated

With Eating Cantaloupe from Mexico- United States and Canada, 2000-2002.

Newsletter 2003b;74/75:7.

Gandhi, M., S. Golding, S. Yaron, and K. R. Matthews. 2001. Use of green fluorescent

protein expressing Salmonella Stanley to investigate survival, spatial location, and

control on alfalfa sprouts. / Food Prot. 64:1891-1898.

Gillespie, I.A. (2004) Outbreak of Salmonella Newport infection associated with lettuce

in the UK. Eurosurveillance Weekly 8,

http://www.eurosurveillance.org/ew/2004/041007.asp.

Guo, X. J. Chen, R. E. Brackett, and L. R. Beuchat. 2001. Survival of salmonellae on

and in tomato plants from the time of inoculation at flowering and early stages of fruit

development through fruit ripening. Appl. Environ. Microbiol. 67:4760-4764.

Guo, X., van Iersel, M. W., Chen, J., Brackett, R. E., and Beuchat, L. R. 2002.

Evidence of association of salmonellae with tomato plants grown hydroponically in

inoculated nutrient solution. Appl. Environ. Microbiol. Vol 68, No 7:3639–3643.

Hedberg, C. W., F. J. Angulo, K. E. White, C. W. Langkop, W. L. Schell, M. G.

Stobierski, A. Schuchat, J. M. Besser, S. Dietrich, L. Helsel, P. M. Griffin, J. W.

McFarland, and M. T. Osterholm. 1999. Outbreak of salmonellosis associated with

eating uncooked tomatoes: implications for public health. The investigation team.

Epidemiol. Infect. 122:385–393.

Horby, P.W., O’Brien, S.J., Adak, G.K., Graham, C., Hawker, J.I., Hunter, P., Lane,

C., Lawson, A.J., Mitchell, R.T., Reacher, M.H., Threlfall, E.J., Ward, L.R., (2003) A

national outbreak of multiresistant Salmonella enterica serovar Typhimurium definitive

phage type (DT) 104 associated with consumption of lettuce. Epidemiol. Infect. 130,

169–178.

76

Islam, M., Morgan, J., Doyle, M.P., Phatak, S.C., Millner, P. and Jiang, X. (2004) Fate

of Salmonella enterica serovars Typhimurium on carrots and radishes grown in fields

treated with contaminated manure composts or irrigation water. Appl Environ Microbiol

70, 2497–2502.

Jablasone, J., Warriner, K., Griffiths, M., 2005. Interactions of Escherichia coli

O157:H7, Salmonella Typhimurium and Listeria monocytogenes in plants cultivated in

a gnotobiotic system. Int. J. Food Microbiol. 99, 7–18.

Jerngklinchan, J., and K. Saitanu. 1993. The occurrence of salmonellae in bean

sprouts in Thailand. Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health 24:114–118.

Manz W., Amann R., Ludwig W., Wagner M. and Schleifer K.-H. (1992). Phylogenetic

oligodeoxynucleotide probes for the major subclasses of Proteobacteria: problems

and solutions. Syst. Appl. Microbiol.15: 593 - 600.

Moter, A., & Gobel, U. (2000). Fluorescence in situ hibridization (FISH) for direct

visualisation of microorganisms. Jurnal of Microbiological Methods , 85-112.

Natvig, E.E., Ingham, S.C., Ingham, B.H., Cooperband, L.R., Roper, T.R., 2002.

Salmonella enterica serovar Typhimurium and Escherichia coli contamination of root

and leaf vegetables grown in soils with incorporated bovine manure. Appl.

Environ.Microbiol. 68: 2737–2744.

Pezzoli, L., Elson, R., Little, C., Fisher, I., Yip, H., Peters, T., Hampton, M., De Pinna,

E. et al. (2007) International outbreak of Salmonella Senftenberg in 2007.

Eurosurveillance Weekly 12, (accessed on 15 ⁄ 06 ⁄ 07)

http://www.eurosurveillance.org/ew/2007/070614.asp

Smit, G., J. W. Kijne, and B. J. Lugtenberg. 1987. Involvement of both cellulose fibrils

and a Ca2+-dependent adhesin in the attachment of Rhizobium leguminosarum to pea

root hair tips. J. Bacteriol. 169:4294-4301.

Soderstrom, A., Lindberg, A. and Andersson, Y. (2005) EHEC O157 outbreak in

Sweden from locally produced lettuce, August–September 2005. Eurosurveillance

Weekly 10, E050922.1. (http://www.eurosurveillance.org/ew/2005/050922.asp#1).

Takkinen, J., Nakari, U-M., Johansson, T., Niskanen, T., Siitonen, A. and Kuusi, M.

(2005) A nationwide outbreak of multiresistant Salmonella Typhimurium

var.Copenhagen DT104B infection in Finland due to contaminated lettuce from Spain,

May 2005. Eurosurveillance Weekly 10, (accessed on 16 ⁄ 01 ⁄ 07).

http://www.eurosurveillance.org/ew/2005/050630.asp

77

Viswanathan, P., and R. Kaur. 2001. Prevalence and growth of pathogens on salad

vegetables, fruit and sprouts. Int. J. Environ. Health 203:205–213.

Warriner, K., S. Spahiolas, M. Dickinson, C. Wright, and W. M. Waites. 2003b.

Internalization of bioluminescent Escherichia coli and Salmonella Montevideo in

growing bean sprouts. J. Appl. Microbiol. 95:719-727.

Zogaj, X., M. Nimtz, M. Rohde, W. Bokranz, and U. Romling. 2001. The multicellular

morphotypes of Salmonella Typhimurium and Escherichia coli produce cellulose as

the second component of the extracellular matrix. Mol. Microbiol. 39:1452-1463.

78

Primena molekularnih metoda u dijagnostici fitopatogenih

virusa, gljiva i pseudogljiva

Ivana Stanković i Ana Vučurović

Izvod

Identifikacija biljnih patogena, pored konvencionalnih, zahteva primenu čitavog

niza različitih molekularnih metoda, koje doprinose tačnosti, pouzdanosti, brzini i

efikasnosti rada u fitopatologiji uopšte. Pored toga, opasnost od introdukcije invazivnih

patogena biljaka, bilo gajenih, ukrasnih ili biljaka u prirodnim zajednicama (šume,

pašnjaci) raste kao rezultat globalizacije, povećane mobilnosti ljudi, klimatskih

promena i evolucije patogena i njihovih vektora. Biljni patogeni mogu da prouzrokuju

veoma značajne ekonomske gubitke na globalnom nivou bilo da su ekspanzivni

(emerging), patogeni koji su ponovo u ekspaniji (re-emerging-nove rase, patotipovi,

forme otporne na pesticide i antibiotike) ili da su davno otkriveni i poznati, ali i dalje

mogu da izazovu epidemije (chronic/endemic). Upravo zbog toga, primena

molekularnih metoda dobija na značaju i danas nije moguće dobiti potpuno pouzdane

rezultate u detekciji, identifikaciji i karakterizaciji biljnih virusa, gljiva i pseudogljiva bez

primene ove grupe metoda (Anderon et al. 2004; Miller et al. 2009).

Pravilna i pravovremena dijagnoza bolesti i detekcija patogena ključne su za

pravovremenu zaštitu gajenih useva, kao i prirodnih biocenoza (šumski ekosistemi i

pašnjaci), bilo u cilju preduzimanja preventivnih ili primeni malog broja terapeutskih

mera. Greške prilikom detekcije patogena i dijagnoze bolesti mogu da dovedu do

primene pogrešnih mera kontrole bolesti, a samim tim i do smanjenja prinosa ili tržišne

vrednosti useva (Strange and Scott, 2005). Neodgovarajuće fitosanitarne mere

zasnovane na nepravilnoj i neblagovremenoj identifikaciji patogena prouzrokovača

bolesti dovode do toga da se introdukcija novih, invazivnih i karantinskih patogena

kasno otkrije, što se često ekonomski veoma negativno odražava na proizvodnju u

zemlji, kao i na izvoz produkata biljne proizvodnje (Miller et al. 2009).

Uvod- molekularne metode u biljnoj virusologiji i mikologiji

Konvencionalne metode koje se koriste u detekciji biljnih patogena ponekad su

dugotrajane, naporne, a često zahtevaju i veliko iskustvo i stručnost osobe koja ih

primenjuje. U određenim slučajevima pojave blisko srodnih patogena, konvencionalne

metode mogu da dovedu do pogrešnog zaključka ili do nedovoljno preciznog nivoa

identifikacije. Upravo zbog tih ograničenja, razvijene su brojne metode zasnovane na

proučavanju osobina nukleinskih kiselina koje čine genom biljnih patogena. Ove

metode se obično zbirno nazivaju molekularnim metodama. Postoji veliki broj

molekularnih metoda, a zajedničko za sve je da su brze (često značajno brže u odnosu

na konvencionalne), pouzdane i specifične. Korišćenjem molekularnih metoda,

79

omogućena je detekcija patogena u različitim delovima biljaka domaćina, kao i u

različitim prirodnim okruženjima, kao što su voda za piće ili navodnjavanje ili zemljište

(Miller et al. 2009).

Molekularne metode koriste se u nauci u različite svrhe od kasnih 50-ih i ranih

60-ih godina XX veka, međutim najveći napredak i najbrži razvoj ostvario je Kary Mullis

1983. Godine, pronalaskom metode lančane reakcije polimeraze (Polymerase Chain

Reaction, PCR). Ovo revolucionarno otkriće promenilo je u potpunosti molekularnu

biologiju, kao i sve biološke i druge nauke koje se na nju naslanjaju, a bave se

izučavanjem gena i genoma. Od pronalaska PCR, napravljen je veliki broj modifikacija

prilagođenihspecifičnim namenama, tako da danas ova metoda ima veoma široku

upotrebu u svim sferama života od medicine, preko kriminalistike, do proizvodnje i

kontrole bezbednosti hrane (McPherson, and Møller, 2000; Reece, 2004).

PCR metoda ima nekoliko osnovnih komponenti koje se koriste u

svakodnevnom laboratorijskom radu, kako bi se napravio veliki broj kopija određenog

dela DNK u laboratorijskoj tubici. PCR, zapravo funkcioniše kao DNK foto-kopir

mašina. Iako naoko jednostavan, PCR je zapravo komplikovan proces u kom

učestvuje veliki broj komponenti/reaktanata. Neki od njih, kao DNK matrica, na

početku su prisutni u veoma malim koncentracijama, ali kako se reakcija odvija njihova

koncentracija dramatično raste, dok se koncentracija nekih komponenti (dNTP,

prajmeri) bitno ne menja u toku procesa. Takođe, brze promene u temperaturi i pH

vrednosti značajno utiču na interakcije molekula u toku procesa PCR. Sve to čini PCR

u isto vreme veoma komplikovanim, ali otvara i veliki broj raznovrsnih mogućnosti za

manipulaciju i analizu DNK (McPherson, and Møller, 2000).

U tekstu koji sledi navedeni su neki od protokola koji se svakodnevno koriste u

istraživanjima biljnih virusa, gljiva i pseudogljiva, uključujući detaljna uputstva kao i

pozitivna iskustva stečena tokom istraživanja. Svaka od ovih grupa patogena, i još

više svaka vrsta virusa, gljiva ili pseudogljiva, svaka vrsta početnog materijala u smislu

biljnog organa, vrste biljke domaćina, doba godine i uslova u laboratoriji, zahteva

posebna prilagođavanja pojedinih protokola. U tekstu koji sledi uključene su i

specifične preporuke nastale na osnovu iskustva u radu sa molekularnim metodama

u okviru istraživanja u Laboratoriji za virusologiju i mikologiju, Katedre za fitopatologiju,

Poljoprivrednog fakulteta, Univerziteta u Beogradu.

Primena molekularnih metoda u detekciji fitopatogenih virusa

1. Odabir biljnog materijala

Pri odabiru početnog biljnog materijala za pripremu uzorka za molekularne

analize treba voditi računa o mogućoj neravnomernoj distribuciji virusa u biljci. U cilju

poboljšanja tačnosti testa i dobijanja validnih rezultata, preporučuje se priprema

zbirnog uzorka od manjih komadića listova sa više različitih mesta na biljci i sa što

izraženijim simptomima. Ukoliko se radi o nekrotičnim simptomima, treba odabrati

zeleno tkivo koje se graniči sa nekrotičnim. Treba koristiti sveže, mlado, ali potpuno

razvijeno lišće sa simptomima i izbegavati starije delove biljke. Sa starenjem biljnog

80

tkiva ili nekrozom, opada koncentracija virusa i teže ga je uspešno detektovati (Krstić

et al., 2008, 2010).

2. Ekstrakcija ukupnih RNK

Reverznoj transkripciji praćenoj lančanom reakcijom polimeraze prethodi

ekstrahovanje ukupnih ribonukleinskih kiselina (RNK) iz zaraženog biljnog materijala.

Razvijen je veći broj protokola za izolaciju ukupnih RNK iz biljnog materijala uključujući

korišćenje komercijalno dostupnih kitova kao što su RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen,

Hilden, Germany; https://www.qiagen.com) i RNAqueous Small Scale Phenol-Free

Total RNA Isolation Kit (Ambion, Inc., Applied Biosystems, USA;

http://www.appliedbiosystems.com /http://www.thermofisher.com) koji podrazumevaju

korišćenje kolona sa membranama za koje se vezuje nukleinska kiselina. Međutim,

ukoliko se izolacija vrši iz semena ili biljnih vrsta sa visokim sadržajem polifenola i

polisaharida, koji brzo i lako zapušavaju membrane na kolonama koje se koriste za

ekstrakciju ukupnih RNK (McKirdy et al., 1998), preporučuje se korišćenje CTAB

(hexadecyltrimethylammoniumbromide) metode (Bekesiova et al., 1999; Zeng and

Yang, 2002; Iandolino et al., 2004). Primena navedenih i drugih različitih kitova je

nešto skuplja, ali zahteva manju obučenost i iskustvo i obično omogućava dobijanje

uniformnijih rezultata, dok primena CTAB metode obezbeđuje da se esktrakcija bolje

prilagodi specifičnostima početnog materijala koji se obrađuje (Krstić et al., 2008,

2010).

2.1. Ekstrakcija ukupnih RNK primenom RNeasy Plant Mini Kit-a (Qiagen, Hilden,

Germany; https://www.qiagen.com)

Važna napomena:

1. Korišćenjem RNeasy Plant Mini Kit-a homogenizacija se obavlja uz korišćenje

RLT ili RLC pufera. U većini slučajeva koristi se RLT pufer koji sadrži guanidin

tiocianat, ali u zavisnosti od količine i vrste sekundarnih metabolita u samom

tkivu kao što su mlečni endosperm žita ili micelija filamentoznih gljiva, usled

prisustva guanidin tiocianata može doći do stvrdnjavanja uzorka i

nemogućnosti izolacije RNK. U tom slučaju koristi se RLC pufer koji sadrži

guanidin hidrohlorid.

2. Može doći do taloženja RLT pufera tokom čuvanja, pa ga treba zagrejati da bi

se rastvorio, a zatim ga čuvati na sobnoj temperaturi.

3. Sve korake treba izvoditi brzo i na sobnoj temperaturi.

4. Sva centrifugiranja treba izvoditi na 20–250C. Proveriti da temperatura tokom

centrifugiranja ne bude ispod 200C.

5. Pre upotrebe RLT i RLC puferu treba dodati β–merkaptoetanol i to 10 µl na 1

ml pufera. Kada se doda β–merkaptoetanol, puferi se mogu čuvati najduže

mesec dana.

6. RPE pufer je u obliku koncentrata i pre upotrebe treba dodati 4 zapremine 96–

100% etanola (dodaje se 4 ml etanola na svaki ml pufera).

81

Protokol za ekstrakciju ukupne RNK sa objašnjenjima:

1. Odmeriti do 100 mg biljnog materijala sa simptomima.

2. Odmeren biljni materijal prebaciti u avan, dodati tečni azot i potpuno ga smrviti

tučkom. Usitnjen biljni materijal i tečni azot prebaciti u RNase–free tube od 2 ml

(ne nalaze se u kitu), prethodno ohlađene u tečnom azotu. Dopustiti da tečni

azot ispari, ali ne i da se biljno tkivo otopi.

3. Dodati 450 µl RLT (ili RLC) pufera na 100 mg biljnog praha i snažno

vorteksovati. Kratka inkubacija u vodenom kupatilu 1–3 min na 560C pomaže

bolju razgradnju biljnog tkiva, ali je ne treba koristiti kod uzoraka sa visokim

sadržajem skroba.

4. Pipetirati uzorak u QIAshredder spin filter (lila boje) smešten u kolekcione tube

od 2 ml i centrifugirati 2 min (3 min) na maksimalnom broju obrtaja. Supernatant

pažljivo prebaciti u novu mikrotubu od 2 ml (ne nalaze se u kitu) pazeći da ne

dođe do resuspenzije taloga. Ovaj supernatant koristi se u sledećem koraku.

Centrifugiranje lizata kroz QIAshredder filter obezbeđuje odstranjivanje ćelijskih

delova i istovremeno homogenizovanje lizata. Većina delova ćelije zadržava se

na QIAshredder filteru, a mala količina koja prođe može formirati talog u

kolekcionoj tubi. Prilikom prebacivanja supernatanta u novu tubu od 2 ml treba

voditi računa da se ne razbije ovaj talog, pa se preporučuje pažljivo pipetiranje.

5. Dodati 0,5 zapremine (225 µl) 96–100% etanola da bi se razbistrio supernatant

i promešati pipetiranjem. Ne centrifugirati.

6. Uzorak (približno 650 µl) pipetirati, uključujući i precipitat koji se može formirati

nakon dodavanja etanola, u RNase spin filter (rozeboje) smešten u kolekcione

tube od 2 ml. Zatvoriti poklopac nežno i centrifugirati 15 s na ≥8000 g (≥10000

rpm). Odbaciti tečnu fazu, a kolekcione tube ponovo koristiti u koraku 7.

7. Na RNase spin filter smešten u kolekcionu tubu pipetirati 700 µl RW1 pufera za

ispiranje, zatvoriti poklopac i centrifugirati 15 s na ≥8000 g (≥10000 rpm).

Odbaciti tečnu fazu, a kolekcione tube ponovo koristiti u koraku 8.

8. Na RNase spin filter smešten u kolekcionu tubu, pipetirati 500 µl RPE pufera.

Zatvoriti poklopac i centrifugirati 15 s na ≥8000 g (≥10000 rpm) da se ispere

filter. Odbaciti tečnu fazu, a kolekcione tube koristiti ponovo u koraku 9.

9. Dodati 500 µl RPE pufera u RNase spin filter smešten u kolekcionu tubu.

Zatvoriti poklopac i centrifugirati 2 min na ≥8000 g (≥10000 rpm) da se ispere

filter. Nakon centrifugiranja, pažljivo pomeriti filter iz kolekcione tube i odbaciti

kolekcionu tubu zajedno sa tečnom fazom.

10. Prebaciti RNase spin filter u novu kolekcionu tubu od 2 ml (nalaze se u kitu),

zatvoriti poklopac i centrifugirati 1 min na maksimalnom broju obrtaja, što

omogućava uklanjanje ostataka etanola ili RPE pufera iz prethodnih koraka koji

mogu negativno uticati na RT–PCR reakciju.

11. Prebaciti RNase spin filter u novu kolekcionu tubu od 1,5 ml (nalaze se u kitu).

Pipetirati 30–50 µl RNase–free vode direktno na filter. Zatvoriti poklopac i

centrifugirati 1 min na ≥8000 g (≥10000 rpm) da bi se rastvorila RNK.

82

12. Ako je očekivani prinos RNK>30 µg, ponoviti korak 11 koristeći drugih 30–50 µl

RNase–free vode ili koristeći tečnu fazu iz koraka 11. Ponovo koristite

kolekcione tube iz koraka 11.

13. Izolovanu RNK čuvati na –80oC.

Protokol za ekstrakciju ukupne RNK – Bench protokol:

Po dospevanju u laboratoriju RNeasy Plant Mini Kit treba čuvati na sobnoj

temperaturi (150C – 250C).

Pre upotrebe RLT i RLC puferu treba dodati β–merkaptoetanol i to 10 µl na 1

ml pufera u količini koja je potrebna za broj uzoraka koji se radi.

RPE pufer je u obliku koncentrata i pre upotrebe treba dodati 4 zapremine 96–

100% etanola (4 ml etanola na 1 ml pufera).

1. Odmeriti do 100 mg biljnog materijala sa simptomima.

2. Odmeren biljni materijal prebaciti u avan, dodati tečni azot i potpuno ga smrviti,

prebaciti u RNase–free tube od 2 ml (ne nalaze se u kitu), ohlađene u tečnom

azotu. Dopustiti da tečni azot ispari, ali ne i da se biljno tkivo otopi.

3. Dodati 450 µl RLT (ili RLC) pufera na 100 mg praha i vorteksovati.

4. Inkubirati u vodenom kupatilu 1–3 min na 56oC.

5. Pipetirati uzorak u QIAshredder spin filter (lila boje) u tubama od 2 ml i

centrifugirati 2 min (3 min) na maksimalnom broju obrtaja.

6. Supernatant pažljivo pipetirati u novu mikrotubu od 2 ml (ne nalaze se u kitu)

pazeći da se ne razbije talog.

7. Dodati 0,5 zapremina (oko 225 µl) 96–100% etanola i promešati pipetiranjem.

Ne centrifugirati.

8. Uzorak (približno 650 µl) pipetirati, uključujući i precipitat koji se može formirati

nakon dodavanja etanola, u RNase spin filter (rozeboje) smešten u kolekcione

tube od 2 ml. Centrifugirati 15 s na ≥10000 rpm.

9. Odbaciti tečnu fazu, a kolekcione tube ponovo koristiti.

10. Na RNase spin filter smešten u kolekcionu tubu pipetirati 700 µl RW1 pufera za

ispiranje i centrifugirati 15 s na ≥10000 rpm.

11. Odbaciti tečnu fazu, a kolekcione tube ponovo koristiti.

12. Na RNase spin filter smešten u kolekcionu tubu, pipetirati 500 µl RPE pufera.

Centrifugirati 15 s na ≥10000 rpm da se ispere filter.

13. Odbaciti tečnu fazu, a kolekcione tube koristiti ponovo.

14. Dodati 500 µl RPE pufera u RNase spin filter smešten u kolekcionu tubu.

Centrifugirati 2 min na ≥10000 rpm da se ispere filter.

15. Pažljivo pomeriti filter iz kolekcione tube i odbaciti kolekcionu tubu zajedno sa

tečnom fazom.

16. Prebaciti RNase spin filter u novu kolekcionu tubu od 2 ml (nalazi se u kitu),

centrifugirati 1 min na maksimalnom broju obrtaja, radiuklanjanjaostataka

etanola.

83

17. Prebaciti RNase spin filter u novu kolekcionu tubu od 1,5 ml (nalazi se u kitu).

Pipetirati 40+10 µl RNase–free vode direktno na filter. Zatvoriti poklopac i

centrifugirati 1 min na ≥10000 rpm da bi se rastvorila RNK.

18. Izolovanu RNK čuvati na –20oC ili –80oC u RNase–free vodi.

2.2. Ekstrakcija ukupnih RNK primenom RNAqueous Small Scale Phenol-Free

Total RNA Isolation Kit-a (Ambion, Inc., Applied Biosystems, USA;

http://www.appliedbiosystems.com/http://www.thermofisher.com)

Važna napomena:

1. Pre prve upotrebe dodati 38,4 ml 100% etanola u vodu radi dobijanja 64%

etanola.

2. Wash Solution #2/3 Concentrate se nalazi u obliku koncentrata i pre prve

upotrebe treba dodati 64 ml 100% etanola.

3. Pre korišćenja Filter Cartridge proveriti da li se filter nalazi na dnu ketridža. Ako

nije nežno ga gurnuti pipetom koristeći RNase free nastavak.

4. Pre upotrebe Elution Solution zagrejati u vodenom kupatilu na 70–80ºC u

RNase Free mikro tubama.

5. Sva centrifugiranja treba izvoditi na 20–25ºC. Proveriti da temperatura tokom

centrifugiranja ne bude ispod 20ºC.

Ekstrakcija RNK obavlja se prema sledećem protokolu:

1. Odmeriti 60 mg biljnog materijala sa simptomima.

2. Odmeren biljni materijal prebaciti u avan, dodati tečni azot i potpuno ga smrviti

tučkom. Dopustiti da tečni azot ispari, ali ne i da se biljno tkivo otopi, a zatim

dodati 12 zapremina (720 µl) Lysis/Binding Solution i 60 µl Plant RNA Isolation

Aid i u potpunosti homogenizovati uzorak.

3. Prebaciti uzorak u mikrotubu od 2 ml i centrifugirati 2–3 min na 10000–14000

rpm.

4. Supernatant prebaciti u novu mikrotubu od 2 ml vodeći računa da se ne razbije

talog, a zatim dodati 720 µl 64% etanola i promešati pipetiranjem.

5. Uzorak prebaciti u Filter Cartridges smeštene u Collection Tube (maksimalna

zapremina koja se odjednom može prebaciti je približno 700 µl). Zatvoriti

Collection Tube i centrifugirati 1 min na 10000–14000 rpm (13000). Nakon

centrifugiranja odbaciti tečnu fazu, a kolekcione tube ponovo koristiti.

6. Ponoviti ovaj korak sa ostatkom uzorka.

Napomena: ukupna zapremina koja prolazi kroz Filter Cartridge ne treba da

bude veća od 2 ml.

7. Dodati 700 µl Wash Solution #1 na Filter Cartridge smešten u kolekcione tube

i centrifugirati 1 min na 10000–14000 rpm (13000). Odbaciti tečnu fazu, a

kolekcione tube ponovo koristiti.

84

8. Na Filter Cartridge smešten u kolekcione tube pipetirati 500 µl Wash Solution

#2/3. Zatvoriti poklopac i centrifugirati 1 min na 10000–14000 rpm (13000).

Odbaciti tečnu fazu, a kolekcione tube ponovo koristiti.

9. Ponoviti ovaj korak sa novih 500 µl Wash Solution #2/3.

10. Odbaciti tečnu fazu, a Filter Cartridge smešten u kolekcione tube ponovo

centrifugirati 1 min na 10000–14000 rpm (13000).

11. U centar Filter Cartridge smeštenog u nove kolekcione tube pipetirati 40 µl

Elution Solution prethodno zagrejanog na 70–80ºC i centrifugirati 30 s na

10000–14000 rpm (13000).

12. Ponoviti ovaj korak sa novih 10 µl Elution Solution.

13. Izolovanu RNK čuvati na –80ºC.

2.3. Ekstrakcija ukupnih RNK pomoću CTAB metode (Bekesiova et al., 1999)

Važna napomena:

1. Korišćenjem CTAB metode homogenizacija se obavlja uz korišćenje 2% CTAB,

2% PVP K 25, 100 mM Tris–HCl, 25 mM Na–EDTA i 2 M NaCl ekstrakcionog

pufera pH 8,0. Pripremljeni pufer se čuva na sobnoj temperaturi pri difuznoj

svetlosti.

2. Pre upotrebe ekstrakcionom puferu treba dodati β–merkaptoetanol i to 20 µl na

1 ml pufera. Kad se doda β–merkaptoetanol pufer se može čuvati najduže

mesec dana.

3. Pre početka izolacije pripremiti rastvor hloroforma i isoamil alkohola u odnosu

24:1, 10 M LiCl i 3 M natrijum acetat pH 5,2.

4. Sva centrifugiranja treba izvoditi na 4ºC.

5. Određenu količinu ekstrakcionog pufera prebaciti u mikrotube i zagrejati na

65˚C u vodenom kupatilu.

Ekstrakcija RNK obavlja se prema sledećem protokolu:

1. Odmeriti do 100 mg biljnog materijala, na primer lišća ili semena.

2. Odmeren biljni materijal prebaciti u avan, dodati tečni azot i potpuno ga smrviti

tučkom. Usitnjen biljni materijal i tečni azot prebaciti u RNase–free tube od 2

ml. Dopustiti da tečni azot ispari, ali ne i da se biljno tkivo otopi.

3. Dodati 700 µl ekstrakcionog pufera zagrejanog na 65˚C na 100 mg biljnog

praha i snažno vorteksovati. Inkubacija u vodenom kupatilu na 65˚C u trajanju

10 min uz povremeno mešanje snažnim protresanjem mikrotube pomaže bolju

razgradnju biljnog tkiva.

4. Po isteku inkubacije u uzorak dodati 700 µl smeše hloroforma i isoamil alkohola

u odnosu 24:1 i centrifugirati 10 min na 10 000 rpm na temperaturi 4˚C.

5. Nakon centrifugiranja formiraju se tri faze. Gornju fazu, u kojoj se nalazi RNK,

prebaciti u novu mikrotubu od 2 ml i dodati novih 700 µl smeše hloroforma i

85

isoamil alkohola u odnosu 24:1 (na 24 ml hloroforma dodati 1 ml isoamil

alkohola).

6. Uzorak ponovo centrifugirati 10 min na 10 000 rpm na temperaturi 4˚C.

7. Nakon centrifugiranja gornju fazu prebaciti u novu mikrotubu od 2 ml, dodati

175 µl 10 M LiCl i inkubirati na 4˚C preko noći.

8. Taloženje RNK obaviti centrifugiranjem uzorka 20 min na 10 000 rpm na

temperaturi 4˚C. Supernatant odbaciti, a talog rastvoriti dodavanjem 50 µl

DEPC vode.

9. Ponovno taloženje RNK obaviti dodavanjem 70 µl 3 M natrijum acetata (pH

5.2), 1750 µl 96% etanola i inkubacijom u trajanju od 30 min na –70˚C.

10. Nakon inkubacije, uzorak centrifugirati 20 min na 10 000 rpm na temperaturi

4˚C. Supernatant odbaciti, a talog isprati dodavanjem 1 ml 75% etanola uz

mešanje okretanjem tubice.

11. U cilju koncentrovanja RNK, uzorak centrifugirati 5 min na 10 000 rpm na 4˚C,

nakon čega treba ponovo ukloniti supernatant, a talog prosušiti na vazduhu.

12. Nakon isparavanja etanola, RNK rastvoriti u 30 µl RNase free vode,

pipetiranjem sadržaja mikrotube više puta.

13. Izolovanu RNK čuvati na –80oC.

3. RT-PCR metoda

Većina biljnih virusa ima genom u vidu RNK i da bi se mogla obaviti njihova

detekcija primenom PCR metode, neophodno je predhodno prepisati virusnu RNK u

komplementarni lanac DNK (cDNK). Ovaj korak označava se kao reverzna

transkripcija ili RT korak.

RT korak i PCR mogu se obaviti kao dva nezavisna procesa ili u jednom koraku

odnosno jedan za drugim u istoj rekcionoj tubi. Primena „One–step“ RT–PCR

protokola podrazumeva kombinovanje dva enzima i ima nekoliko prednosti u odnosu

na protokol koji se odvija u dve faze. Osnovna prednost je što se i reverzna

transkripcija izolovane RNK u cDNK i sama amplifikacija cDNK odvijaju u istoj tubici,

čime su smanjeni rizici od moguće kontaminacije ispitivanog uzorka. Kontinuirani RT–

PCR, u kome RT i PCR metoda čine neprekidnu reakciju, osetljiviji je od protokola koji

se odvija u dva zasebna koraka (Sellner and Turbet, 1998).

86

Protokol za OneStep RT–PCR Kit (Qiagen, Hilden, Germany;

https://www.qiagen.com)

Važne napomene pre početka:

HotStartTaq DNA polimeraza, koja se nalazi u mixu enzima, zahteva inicijalnu,

početnu aktivaciju inkubacijom na 95ºC 15 min pre nego što dođe do

amplifikacije. Ova inkubacija u isto vremeinaktivira reverznu transkriptazu. Ne

treba aktivirati zagrevanjem Taq polimerazu dokle god reakcija reverzne

transkripcije nije gotova.

Ovaj kit napravljen je da se primenjuju gen–specifični prajmeri u finalnoj

koncentraciji 0,6 µM. Upotreba random oligomera ili oligo–dT prajmera nije

preporučljiva jer će dovesti do amplifikacije nespecifičnih produkata.

Pripremiti sve reakcije na ledu.

Proveriti da je termosajkler prethodno zagrejan na 50ºC pre stavljanja uzoraka.

5xRT–PCR pufer pruža finalnu koncentraciju od 2,5 mM MgCl2 u reakcionom

mixu, što proizvodi zadovoljavajuće rezultate u većini slučajeva.

Okruženje bez (free) RNase mora da se obezbedi i održava tokom RNK

ekstrakcije i pripreme reakcije.

Pripremiti reakcioni mix u prostoru koji je odvojen od mesta za pripremu RNK

ili analizu PCR produkata.

Koristiti nastavke za jednokratnu upotrebu sa hidrofobnim filterima da bi se

smanjila mogućnost zagađenja.

Uputstvo i priprema

Priprema i čuvanje sadržaja QIAGEN OneStep RT–PCR kita

1. Po dospevanju u laboratoriju QIAGEN OneStep RT–PCR kit treba čuvati na –

20ºC.

2. Enzimski mix kita uvek ostaje u zamrzivaču na –200C. Ne centrifugira se, ne

vorteksuje se. Čim se uzme potrebna količina za PCR–mix vraća se u

zamrzivač.

3. 5x RT–PCR pufer i dNTP Mix dele se u manje porcije koje se čuvaju u

zamrzivaču na –20ºC. 5x RT–PCR pufer podeliti u tubice po 50 µl, dNTP Mix

po 10 µl. Količine koje se svakodnevno koriste čuvati u frižideru na 4ºC.

4. RNase–free voda kad se prvi put odledi, čuva se u frižideru na 4ºC.

5. Svaki sastojak kita (osim enzimskog mixa) se, pre stavljanja u PCR–mix, kratko

vorteksuje (vorteksovanje je posebno bitno za MgCl2 jer utiče na njegovu

aktivnost) i centrifugira (10 s na 5000 rpm/min). Kada se svi sastojci PCR–mixa

sipaju u tubicu, ona se kratko vorteksuje ili se promeša pipetiranjem prilikom

dodavanja svakog reagensa i na kraju pre razlivanja u tubice za pojedinačne

uzorke.

87

Protokol za RT–PCR:

1. Otopiti RNK uzorka, rastvore prajmera, dNTP mix, 5xRT–PCR pufer i RNase

free vodu i staviti ih na led. Važno je potpuno promešati (vorteksovati), a zatim kratko

centifugirati (10 s na 5000 obrtaja) rastvore pre upotrebe da bi se izbegle lokalizovane

razlike u koncentraciji.

2. Pripremiti PCR master mix prema tabeli 1. Master mix sadrži sve komponente

potrebne za reakciju izuzev RNK uzorka. Zbog gubitaka pri pipetiranju, pripremiti

zapreminu master mixa veću za 10% od potrebne, odnosno na svakih 10 reakcija

dodati po 1 uzorak više od one koja je potrebna. Negativna kontrola (B, blank RNase

free voda, bez RNK uzorka) obavezno mora da bude uključena u svaki eksperiment,

a po jedna DNK blank – negativna kontrola uključuje se posle svakih 10 uzoraka i

tretira se kao svaki drugi uzorak. U svaku analizu obavezno uključiti kao ravnopravan

uzorak i bar jednu pozitivnu kontrolu, odnosno RNK referentnog izolata.

Tabela 1. Komponente PCR master mixa za ukupnu zapreminu reakcije od 50 µl po

uzorku

Komponenta Zapremina/reakcija Krajnja

koncentracija

Master mix

RNase free voda Varijabilna –

5x RT–PCR pufer 10 µl 1x

dNTP mix (sadrži 10 mM od

svakog dNTP

2,0 µl 400 µM svakog

dNTP

Prajmer A1 Varijabilna 0,6 µM

Prajmer B1 Varijabilna 0,6 µM

Enzimski mix 2 µl –

Template RNK uzorka (dodaje se

u koraku 4)

Varijabilna 1 pg–2

µg/reakciji

Ukupna zapremina 50 µl

1Krajnja koncentracija od 0,6 µM je optimalna za većinu sistema prajmer – ciljana

sekvenca. Ipak, u nekim slučajevima korišćenje drugih koncentracija prajmera 0,5 –

1,0 µM može da poboljša uspeh amplifikacije.

Napomena: Kako veliki broj laboratorija ne poseduje spektrofotometar i nije u

mogućnosti da meri koncentraciju ekstrahovane RNK, preporučuje se dodavanje 2 µl

RNK uzorka na 50 µl reakcione zapremine.

3. Promešati master mix dobro pipetiranjem i rasporediti odgovarajuće zapremine

(48 µl) u obeležene mikrotube, za svaki uzorak.

88

4. Dodati ciljanu RNK uzorka (2 µl na 50 µl reakcione zapremine) u pojedinačne

PCR tube. Između uzoraka obavezno menjati nastavke za pipetu i pažljivo rukovati sa

mikrotubama da bi se izbeglo formiranje aerosola i moguće kontaminacije.

5. Programirati termosajkler prema programu iz Tabele 2. Ova tabela opisuje

uopšteni program koji se preporučuje za primenu QIAGEN OneStep RT–PCRkita. Ovaj

program uključuje korake i za reverznu transkripciju i za PCR. Amplifikacija fragmenta

sa PCR mora da započne sa početnim korakom zagrevanja na 95ºC 15 min da bi se

aktivirala HotStartTaq DNA polimeraza. Za maksimalni prinos i specifičnost,

temperature i vreme trajanja ciklusa treba da se optimizuju za svaki nov sistem ciljana

sekvenca i prajmer. Uslove je potrebno prilagoditi delovanju svakog para prajmera za

detekciju određenog virusa.

Tabela 2. Uslovi u termosajkleru za primenu QIAGEN OneStep RT–PCR kita

Faza Trajanje tºC Dodatne primedbe

Reverzna

transkripcija

30 min 50ºC Reakciona tºC za reverznu

transkripciju od 50ºC je

preporučena. Ipak, ukoliko se

ne pojave zadovoljavajući

rezultati primenom 50ºC,

reakciona tºC može da se

poveća do 60ºC

Početni, inicijalni

korak PCR

aktivacije

15 min 95ºC HotStartTaq DNA polimeraza

se aktivira tokom ovog

koraka zagrevanja. Omni

skript i sensiskript reverzne

transkriptaze se inaktiviraju, a

cDNK se denaturiše

Ciklus od 3 koraka

Denaturacija 0,5–1 min 94ºC

Hibridizacija 0,5–1 min 50–68ºC Približno 5ºC niže od melting

tºC (tačka topljenja) prajmera

Ekstenzija 1 min 72ºC Za RT–PCR produkte 1–2kb

povećati vreme ekstenzije za

30 – 60 s.

Broj ciklusa 25–40 Broj ciklusa zavisi od količine

RNK uzorka i obilja ciljanog,

očekivanog transkripta.

Finalna

ekstenzija

10 min 72ºC

89

6. Startovati RT–PCR program dok su PCR tube još na ledu. Čekati dok

termosajkler ne dostigne 50ºC i tek tada staviti tube u sajkler.

Napomena: posle amplifikacije, uzorci mogu da se čuvaju na 2–8ºC.

Napomena: Program reakcije se obično sastoji od 25–40 ciklusa, u zavisnosti od broja

kopija početne sekvence. Povećavanje broja ciklusa, neće obavezno dovesti do većeg

prinosa RT–PCR produkta, nasuprot tome može dovesti do povećanja nespecifične

pozadine, pratećih sastojaka i smanjenja prinosa specifičnog produkta.

Primena molekularnih metoda u detekciji fitopatogenih gljiva i pseudogljiva

1. Odabir biljnog materijala za ekstrakciju DNK

Detekcija fitopatogenih gljiva i pseudogljiva PCR metodom može se vršiti nakon

ekstrakcije DNK direktno iz biljnog tkiva, lišća i grančica, ili iz micelije čistih kultura koje

su identifikovane na osnovu morfoloških karakteristika. U oba slučaja, DNK se

uspešno može ekstrahovati primenom navedene metode. Ukoliko se ekstrakcija DNK

vrši iz micelije čistih kultura, njih je potrebno odgajiti u tečnoj kulturi i izdvojiti miceliju

od agara u hranljivim podlogama.

2. Gajenje micelije za ekstrakciju DNK

Postoji više različitih tečnih podloga za gajenje micelije koje su obično

prilagođene konkretnim osobinama gljive ili pseudogljive koja je predmet istraživanja,

a najčešće korišćene su krompir dekstrozna čorba (PDB) i podloga od graška (PB).

PDB (krompir dekstrozna čorba, potato dextrose broth) – Priprema se od 200 g

krompira i 20 g dekstroze u 1 l destilovane vode, sve se autoklavira 15 min na 121ºC.

U Erlenmajer kolbe razlije se po 150 ml PDB i steriliše, a potom zaseje sa pet

fragmenata kolonije (1 cm2) iz kultura starih sedam dana, odgajenih na PDA ili drugoj

podlozi, pri 24ºC, u mraku. Zasejane Erlenmajer kolbe inkubiraju se 15 dana u mraku,

pri 24ºC, uz povremeno mešanje horizontalnom rotacijom. Tečne kulture odabranih

izolata filtriraju se preko sloja filter papira, a micelija sakupi i osuši pod vakumom.

Osušena micelija podeli se u porcije od 100 mg i zamrzne na –80ºC i tako čuva do

korišćenja (Konstantinova et al., 2002).

PB (podloga od graška, pea broth) tečna podloga – Priprema se od 120 g smrznutog

graška i 1 l destilovane vode, koji se autoklaviraju 15 min na 121ºC. Nakon sterilizacije,

podloga se procedi i razlije u pripremljene Erlenmajer kolbe, 150 ml po izolatu. Kolbe

se ponovo sterilišu autoklaviranjem 15 min na 121ºC i zasejavaju isečcima čistih

kultura starih 7 dana ispitivanih izolata odgajenih na CPA na 20ºC u mraku. Inkubacija

zasejanih kolbi obavlja se na sobnoj temperaturi, u uslovima prirodne smene dana i

noći u toku 7 dana. Po isteku inkubacije, sakuplja se razvijena micelija bez fragmenata

agara i čuva na –80ºC do ekstrakcije (Kroon et al., 2004).

90

3. Ekstrakcija DNK

Metodi lančane reakcije polimeraze prethodi ekstrakcija ukupnih

dezoksiribonukleinskih kiselinakiselina (DNK). Postoji više protokola za ekstrakciju,

kao i komercijalnih kitova. Najčešće korišćene su metoda pomoću DNeasy Plant Mini

Kit−a (Qiagen, Hilden, Germany; https://www.qiagen.com) i standardna CTAB

(Cetyltrimethylamonium bromide) metoda (O’Donnell et al., 1998).

3.1. Ekstrakcija DNK pomoću DNeasy Plant Mini Kit−a (Qiagen, Hilden,

Germany; https://www.qiagen.com)

Sve komponente DNeasy Plant kita, uključujući RNase A rastvor, treba da se

čuvaju na suvom, na sobnoj temperaturi (15-25ºC) i pod tim uslovima stabilni su

godinu dana.

Napomena: Navedena procedura je predviđena da obradi maximum 100 mg biljnog

materijala. Korišćenje veće količine može negativno da utiče na uspeh ekstrakcije.

Protokol za izolaciju DNK sa objašnjenjima:

Važne napomene pre početka:

Pufer AP1 može da razvije, dobije žutu boju tokom skladištenja. Ovo ne utiče

na njegovu efikasnost.

Svi koraci centrifugiranja se izvode na sobnoj temperaturi 15-20ºC u

mikrocentrifugi.

Puferi AP1 i AP3/E koncentrat mogu da formiraju talog tokom čuvanja. Ukoliko

je potrebno, zagrejati ih do 65ºC da bi se ponovo rastvorio talog (pre dodavanja

etanola puferu AP3/E). Ne zagrevati AP3/E pufer kada je dodat etanol.

Puferi AW i AP3/E se dostavljaju kao koncentrati. Pre korišćenja prvi put –

dodati odgovarajuću količinu etanola (96-100%) kako je navedeno na boci da

bi se dobio radni rastvor.

Pre početka rada zagrejati vodeno kupatilo ili grejni blok na 65ºC.

Procedura za izolaciju DNK:

1. Biljni materijal ili tkivo gljiva može da se smrvi u fini prah pod tečnim azotom uz

korišćenje tučka i avana. Prebaciti prah od tkiva i tečni azot u kolekcionu tubu

odgovarajuće veličine i ostaviti da tečni azot ispari. Ne dozvoliti da se uzorak

otopi, odmrzne. Odmah nastaviti korak 2.

2. Dodati 400 µl pufera AP1 i 4 µl RNase A stok rastvora (100 mg/ml) maksimalnoj

količini od 100 mg (vlažnog tkiva) ili 20 mg (suvog materijala) smrvljenog biljnog

ili tkiva gljiva i vorteksovati jako. Ne treba da budu vidljivi fragmenti tkiva.

91

Vorteksovati ili pipetirati dalje da bi se uklonili fragmenti koji se neće lizirati

potpuno i što bi dovelo do nižeg prinosa DNK.

Napomena: Ne mešati pufer AP1 i RNase A pre upotrebe.

3. Inkubirati mešavinu 20 min na 65ºC. Mešati 2 do 3 puta tokom inkubacije

okretanjem tuba. U ovom koraku dolazi do liziranja ćelija.

4. Dodati 130 µl AP2 pufera lizatu, promešati i inkubirati 5 min na ledu. Ovaj korak

taloži deterdžente, proteine i polisaharide.

5. Preporučuje se centrifugiranje lizata 5 min na 20 000 g ili 14 000 rpm. Neki biljni

materijali mogu da daju veoma viskozne lizate i velike količine taloga tokom

ovog koraka. To može dovesti do oštećivanja DNK u sledećem koraku. U tom

slučaju, optimalni rezultati se dobijaju ukoliko veći deo ovog taloga ukloni

centrifugiranjem 5 min na 20 000 g ili 14 000 rpm. Posle centrifugiranja naneti

supernatant na QIAshredder Mini spin kolone.

6. Pipetirati lizat u QIAshredder mini spin kolone (lila boje) koje se nalaze u

kolekcionim tubama od 2 ml i centrifugirati 2 min na 20 000 g ili 14 000 rpm.

Ukoliko je potrebno (gust lizat ili prisustvo fragmenata) iseći vrh nastavka za

pipetu da bi lizat mogao da bude nanet na spin kolonu. QIAshredder spin mini

kolona uklanja većinu taloga i ostataka biljnog tkiva, ali manja količina će proći

i formirati talog na dnu kolekcione tube. Paziti da se u sledećem koraku taj talog

ne dodirne.

7. Prebaciti supernatant iz prethodnog koraka u novu kolekcionu tubu, koja se ne

nalazi u kitu, bez kontakta sa talogom na dnu. Obično se dobija oko 450 µl

lizata. Od nekih biljnih tkiva dobija se manje lizata. U tom slučaju pažljivo

preračunati zapremine u sledećim koracima.

8. Dodati 1,5 zapreminu AP3/E pufera prosvetljenom lizatu i promešati

pipetiranjem. Npr., za 450 µl lizata treba dodati 675 µl pufera AP3/E. Ukoliko je

zapremina lizata manja, potrebno je umanjiti zapreminu pufera. Nakon

dodavanja, može da se formira talog ali to ne utiče na uspeh procedure.

Napomena: Proveriti da je puferu AP3/E dodat etanol kao što je navedeno u koracima

koje treba uraditi pre početka rada.

Napomena: Važno je pipetirati pufer AP3/E direktno na prosvetljeni lizat i odmah

promešati.

9. Pipetirati 650 µl mešavine iz prethodnog koraka, uključujući i talog koji se

možda formirao u DNeasy mini spin kolonu, koja se nalazi u kolekcionoj tubu

od 2 ml i koja se nalazi u kitu. Centrifugirati 1 min na brzini većoj od 6000 g, ili

8 000 rpm u većini centrifuga, i odbaciti tečnost koja prođe kroz filter. Ponovo

koristiti kolekcionu tubu u sledećem koraku.

10. Ponoviti prethodni korak sa ostatkom uzorka. Odbaciti tečnost koja prođe kroz

filter i samu kolekcionu tubu.

92

11. Staviti DNeasy mini spin kolonu u novu kolekcionu tubu od 2 ml koja je data u

kitu, dodati 500 ml AW pufera i centrifugirati na brzini većoj od 6000 g ili 8000

rpm. Odbaciti tečnost koja prođe kroz kolonu i ponovo koristiti tubu u sledećem

koraku.

12. Dodati 500 µl pufera AW u DNeasy mini spin kolonu i centrifugirati 2 min na 20

000 g ili 14 000 rpm da bi se osušila membrana. Važno je osušiti membranu u

koloni zato što etanol koji bi mogao da zaostane može da ometa reakcije koje

slede. Ovaj korak centrifugiranja osigurava da se ne prenose ostaci etanola

tokom rastvaranja. Odbaciti i tečnost koja je prošla i kolekcionu tubu. Posle

ispiranja sa puferom AW, DNeasy mini spin kolona je obično blago obojena.

Napomena: Posle centrifugiranja, izvaditi DNeasy mini spin kolonu iz kolekcione tube

pažljivo, tako da kolona ne dođe u kontakt sa tečnošću koja je prošla kroz kolonu, jer

bi to dovelo do prenošenja etanola.

13. Prebaciti DNeasy mini spin kolonu u 1,5 ili 2 ml tubu za mikrocentrifugiranje

(nije data u kitu), pipetirati 100 µl AE pufera direktno na membranu. Inkubirati

5 min na sobnoj temperaturi (15-20ºC) i potom centrifugirati 1 min na brzini

većoj od 6000 g ili 8000 rpm da bi došlo do rastvaranja. Rastvaranje sa 50 µl

(umesto 100 µl) povećava krajnju koncentraciju DNK u rastvoru značajno, ali

takođe smanjuje ukupni prinos. Ukoliko se očekuju veće količine DNK (preko

20 µg) rastvaranje sa 200 µl (umesto 100 µl) povećaće prinos.

14. Ponoviti prethodni korak. Za drugi krug rastvaranja može se koristiti odvojena

kolekciona tuba da bi se sprečilo razređivanje rastvora posle prvog kruga. Može

se koristiti i ista tubica u drugom koraku i da se kombinuju rastvori posle oba

kruga rastvaranja. Ekstrahovanu DNK čuvati na –80ºC ili ako nije moguće,

onda na –20ºC.

Napomena: Više od 200 µl ne bi trebalo koristiti u tubama od 1,5 ml zato što će

DNeasy mini spin kolona doći u kontakt sa rastvorom.

Protokol za izolaciju DNK - Bench protocol:

Važne napomene pre početka:

Sve korake centrifugiranja izvesti na sobnoj temperaturi (15-20ºC),

Ukoliko je neophodno, rastvoriti bilo koji precipitat u koncentrovanim puferima

AP1 i AP3/E,

Proveriti da je dodat etanol puferima AW i AP3/E,

Prethodno zagrejati vodeno kupatilo ili grejni blok na 65ºC.

93

Procedura:

1. Homogenizovati materijal uzorka (100 mg vlažnog ili 20 mg liofiliziranog tkiva)

pomoću tučka i avana i tečnog azota.

2. Dodati 400 µl pufera AP1 i 4 µl RNase A. Vorteksovati. (Napomena: ne mešati

pufer AP1 i RNase A pre upotrebe).

3. Inkubirati 10 min na 65ºC.

4. Dodati 130 µl pufera AP2. Promešati i inkubirati 5 min na ledu. Preporučuje se

centrifugiranje lizata 5 min na 20 000 g ili 14 000 rpm.

5. Pipetirati lizat u QIAshredder mini spin kolone u kolekcionim tubama od 2 ml.

Centrifugirati 2 min na 20000 g ili 14 000 rpm.

6. Prebaciti frakciju koja prođe kroz kolonu u novu tubu bez dodirivanja taloga.

7. Dodati 1,5 zapreminu AP3 pufera i promešati pipetiranjem.

8. Prebaciti 650 µl mešavine u DNeasy Mini spin kolone u kolekcionim tubama od

2 ml. Centrifugirati 1 min na više od 6 000 g ili više od 8 000 rpm. Odbaciti tečnu

fazu koja prođe kroz kolonu.

9. Ponoviti ovaj korak sa preostalim uzorkom.

10. Prebaciti spin kolonu u novu kolekcionu tubu od 2 ml. Dodati 500 µl AW pufera

i centrifugirati 1 min na više od 6000 g ili više od 8 000 rpm. Odbaciti tečnu fazu

koja prođe kroz kolonu.

11. Dodati još 500 µl AW pufera i centrifugirati 2 min na 14000 g. Napomena:

pažljivo ukloniti spin kolonu iz kolekcione tube tako da ne dođe u kontakt sa

tečnom fazom koja je prošla kroz kolonu.

12. Prebaciti spin kolonu u novu kolekcionu tubu od 1,5 ml ili 2 ml. Dodati 100 µl

AE pufera za rastvaranje. Inkubirati 5 min na sobnoj temperaturi. Centrifugirati

1 min na više od 6000 g ili više od 8 000 rpm. Ponoviti ovaj korak.

3.2. Ekstrakcija DNK pomoću CTAB metode (O’Donnell et al., 1998)

1. 100 mg micelije zamrznute na −80°C homogenizovati u prisustvu tečog azota,

a zatim dodati 800 μl ekstrakcionog pufera.

2. Dobijenu suspenzija prebaciti u mikrotubu zapremine 2 ml i inkubirati u

vodenom kupatilu na 65°C u trajanju od 1 h. Svakih 15 min sadržaj snažno

promešati. Tokom ovog dela ekstrakcije dolazi do razgradnje ćelijskih zidova i

oslobađanja sadržaja ćelije.

3. U svaku mikrotubu dodati 600 μl hloroforma i promešati na Vortexu 10 s, a zatim

centrifugirati 10 min na 13 000 rpm.

4. Posle centrifugiranja izdvajaju se dve faze. Gornji sloj, približne zapremine oko

500 μl, pipetirati u novu mikrotubu, a zatim dodati 300 μl izopropanola i

inkubirati 10 min na sobnoj temperaturi, a zatim centrifugirati 10 min na 13 000

rpm.

5. Supernatant pažljivo odliti, a talog isprati sa 600 μl 70% etanola i centrifugirati

10 min na 13 000 rpm.

94

6. Odliti tečnu fazu, a mikrotube prosušiti na sobnoj temperaturi ili 3 min na 56°C

u termobloku.

7. Dobijeni talog resuspendovati u 50 μl TE pufera.

8. Izolovanu DNK čuvati na −80°C

Sastav pufera za izolaciju

100 mM Tris HCl, pH 8,0

1,4 M NaCl

20 mM EDTA

2% CTAB (cetiltrimetilamonijum bromide) pH 8,0

Sastav TE pufera

10 mM Tris-HCl pH 8,0

1 mM EDTA

4. Primena konvencionalnog PCR

Pouzdana i osetljiva metoda za detekciju fitopatogenih gljiva iz micelije sprovodi

se korišćenjem univerzalnih prajmera ITS1/ITS4 (White et al., 1990). Ovaj par

univerzalnih prajmera omogućava umnožavanje i kasnije sekvenciranje ITS regiona

ribozomalne DNK Eukariota. ITS region je visoko varijabilan između morfološki

različitih vrsta gljiva i sa druge strane konzervativan na nivou vrste i kod mnogih rodova

fitopatogenih gljiva koristi se za filogenetske analize. Kako je ITS1/ITS4 par prajmera

koji može da amplifikuje ITS region svih Eukariota, koristi se i za proveru uspešnosti

ekstrakcije DNK. Pored toga, ovi prajmeri se uključuju u istraživanja u cilju ispitivanja

njihove pogodnosti za korišćenje u okviru protokola za identifikaciju sekvenciranjem.

Ova metoda pokazala se pouzdanom za detekciju različitih fitopatogenih gljiva.

Pripremiti PCR master mix (reakcionu mešavinu) korišćenjem 2x PCR master mix–a

(ThermoFisher Scientific; http://www.thermofisher.com) koja po sastavu i količini

odgovara preporukama iz tabele.

95

Tabela 3.Količine i komponente za pripremu PCR mixa za reakciju zapremine od 25

µl

Komponente 1 uzorak Broj uzoraka+1K++nB+nR

RNase-free water 9 µl

2x PCR master mix

(ThermoFisher Scientific)

12,5 µl

Prajmer 1 koncentracije

10 µM

1,25 µl

Prajmer 2 koncentracije

10 µM

1,25 µl

Uzorak (ekstrahovana

DNK)

1 µl

Totalna količina 25 µl 1K+–pozitivna kontrola; nB – odgovarajući broj negativnih kontrola (Blank); nR –

odgovarajući broj viška radi gubitaka reagenasa prilikom manipulacije; n=broj

uzoraka/10.

(Na svakih 10 uzoraka koji se testiraju, dodati jednu negativnu kontrolu (PCR mix sa

RNase free vodom) i zapreminu za još jedan uzorak zbog gubitka reagenasa tokom

manipulacije. Količina svake komponente PCR mixa množi se tim brojem i dodaje u

tubicu za master mix).

Master mix se priprema u odvojenom, najbolje sterilnom prostoru, u laminaru.

Potrebni sastojci se pripreme, tako što se otope rastvor PCR mixa i prajmeri, dobro

promešaju vorteksovanjem i potom kratko centifugiraju (10 s na 5000 obrtaja/min) da

bi se izbegle lokalizovane razlike u koncentraciji. U jednu mikrotubicu od 0,5 ml ili veću

po potrebi, sipaju se odmerene količine za potreban broj uzoraka i negativnih kontrola

prema preporukama ispod tabele. Sipaju se svi sastojci izuzev DNK uzorka. Ovako

pripremljen master mix se promeša vorteksovanjem i kratko centifugira (10 s na 5000

obrtaja/min).

U pripremljene i obeležene mikrotubice od 0,2 ml razliva se po 24 µl mixa, i

potom se dodaje ekstrahovana DNK uzorka i promeša pipetiranjem. Između uzoraka

obavezno menjati nastavke za mikropipetu. Mikrotubice se potom centrifugiraju da bi

se izjednačila koncentracija i stavljaju u termosajkler programiran prema uslovima

prikazanim u tabeli.

Tabela 4. Uslovi u termosajkleru za primenu PCR reakcije

Uslovi u termosajkleru Trajanje tºC Broj ciklusa

Inicijalna denaturacija 2-5 min 950C

Denaturacija 0,5–1 min 94ºC

25–40x Hibridizacija 0,5–1 min 50–68ºC

Elongacija 1 min 72ºC

Finalna elongacija 10 min 720C

96

Pozitivnom reakcijom smatra se pojava amplikona od oko 500-600 bp, koji mora biti

prisutan u pozitivnoj kontroli (ekstrahovana DNK referentnog izolata) i koji ne sme biti

prisutan u B (blank – PCR mix sa RNAse free vodom) – negativnoj kontroli.

Analiza PCR produkta

Bez obzira da li se primenjuju u proučavaju fitopatogenih virusa ili gljiva i

pseudogljiva, nakon završene PCR reakcije neophodno je učiniti dobijene rezultate

vidljivim da bi se mogli analizirati. Dobijeni amplifikovani produkti mogu se detektovati

na više načina, a najčešće se detekcija obavlja primenom elektroforeze u gelu od

agaroze. U zavisnosti od veličine produkta, priprema se gel različite koncentracije

agaroze (1-2%), koji se boji etidijum-bromidom (EtBr) i posmatra pod UV-svetlom (Lee

et al., 2012).

Ukoliko je očekivana veličina fragmenata do 1000 bp, što je najčešći slučaj u

detekciji i karakterizaciji fitopatogenih virusa i gljiva, koristi se 1% agarozni gel. U gel

se unose i posmatraju svi analizirani uzorci, sve pozitivne i negativne kontrole, kao i

markeri sa fragmentima u odgovarajućem rasponu veličina.

Priprema gela i izvođenje elektroforeze (Lee et al., 2012)׃

1. Pripremiti agarozni gel koncentracije 1% dodavanjem odgovarajuće količine

agaroze u 1x TBE pufer.

2. Namestiti kalup za gel, sve fiksirati i staviti češljeve u kalup.

3. Rastvor agaroze i pufera zagrejati da prokuva u mikrotalasnoj peći (oko 30 s ili

dok se agaroza ne rastopi).

4. Ohladiti rastopljenu agarozu do temperature 50–60ºC pod mlazom vode i sipati

u oformljen aparat za elektroforezu sa umetnutim češljevima. Prilikom sipanja

gela paziti da se ne naprave mehurići vazduha.

5. Ostaviti gel na ravnom da se formira i ohladi (oko 30 min).

6. Kada se gel oformi, izvaditi češljeve i staviti ga u komoru za elektroforezu u

kojoj se već nalazi 1x TBE pufer.

7. Od 20 µl amplikona uzorka, za elektroforezu se koristi 5 µl i prethodno se meša

sa bojom. Dobijeni amplikoni se boje da bi moglo da se prati njihovo kretanje u

gelu i da bi bili teži i tako potonuli na dno bunara.

Napomena: Za bojenje uzoraka koristi se posebno napravljena ili kupljena boja,

Loading Day. Boja se čuva u frižideru, a za duži vremenski period čuva se zamrznuta

na – 20ºC.

8. Pripremiti uzorke za elektroforezu mešanjem sa bojom. Na komadu parafilma

napraviti loptice od otprilike 1 µl loading boje u broju koliko ima uzoraka i jedan

više za marker. Marker se stavlja u količini od 5 µl. Marker se čuva u

zamrzivaču, a onaj koji se koristi u frižideru.

9. Pripremljene uzorke nanositi u bunare obavezno menjajući nastavke posle

svakog uzorka.

97

10. Elektroforeza se obavlja u uslovima stalne struje 100 V/40 mA u trajanju od

oko 1 h ili dok front boje ne dođe do oko 1 cm pre donje ivice gela. Isključiti

izvor struje pre oslobađanja gela iz aparata.

11. Posle završene elektroforeze gel inkubirati 15–30 minuta u rastvoru etidijum-

bromida (EtBr) u destilovanoj vodi u finalnoj koncentraciji od 0,5 µg/ml. EtBr je

moćan mutagen i potrebne su posebne mere opreza u radu. Gel staviti u rastvor

etidijum-bromida pomoću široke špahtle, posudu zatvoriti. Gel ostaviti 15

minuta da bi došlo do vizuelizacije PCR produkata. Kada se radi sa EtBr koristiti

2 para rukavica, pri čemu se drugim parom dodiruje samo ono što je stalno u

kontaktu sa EtBr.

Napomena: Alternativni metod bojenja gela je postupak po kojem se 0,1% rastvor

EtBr dodajedirektno u rastvoreni gel (pre izlivanja u kalup) u količini od 5 μl u 100 ml

gela. Na ovaj način uzorci se odmah boje dok teku kroz agarozni gel.

12. Ispiranje gela (obezbojavanje) vrši se inkubacijom u destilovanoj vodi 15–20

min.

13. Posmatranje gela obavlja se na UV–transiluminatoru. DNK fragmenti vidljivi su

kao trake narandžaste boje. Gel izložiti UV–svetlu što je kraće moguće s

obzirom na to da UV-svetlost oštećuje DNK postepeno je uništavajući. UV–

svetlost je takođe opasna za posmatrača tako da obavezno treba koristiti

zaštitu prilikom posmatranja.

14. Proveriti dobijene rezultate upoređivanjem sa trakama markera i reakcijama

pozitivne i negativne kontrole.

15. Fotografisati aparatom sa žutim filterom.

16. Gel ubaciti u plastičnu kesu koja se lepi i zatim u kontejner za uništavanje EtBr

ili ga ostaviti pod UV svetlom ili direktnim sunčevim svetlom dok se ne osuši.

Kloniranje DNK

Kloniranje DNK ili tehnologija rekombinantne DNK jednaje od metoda

molekularne biologije koja omogućava dobijanje identičnih kopija fragmenta DNK ili

određenog gena od interesa. Kloniranje se postiže ugrađivanjem željenog fragmenta

u genom plazmida ili virusa (faga) određenih bakterija, tako da se sa njihovom

replikacijom umnožava i ubačena DNK sekvenca. Genom nosač u koji se ugrađuje

željeni fragment DNK naziva se vektor. Kao domaćin u kome se omogućava

umnožavanje vektora najčešće se koristi bakterija Escherichia coli, mada su

konstruisani i vektori za druge vrste bakterija i neke jednostavne eukariotske ćelije kao

što su kvasci (Lodish et al., 2000).

Generalno posmatrano, DNK fragment koji želimo da kloniramo dobija se

korišćenjem lančane reakcije polimeraze (PCR). Nakon toga, fragmenti DNK

kombinuju se sa vektorskom DNK, a potom ubacuju u organizam domaćina koji lako

raste kao što je bakterija E. coli. Na ovaj način dobija se populacija organizama u

kojima se rekombinantni DNK molekul replikuje zajedno sa DNK domaćina.

98

Iako se za kloniranje mogu koristiti različiti vektori i organizmi domaćini,

najčešće se za kloniranje DNK koriste pGEM®-T easy vektor i laboratorijski soj

bakterije E. coli, DH5α. pGEM®-T easy vektor je linearizovana DNK plazmida poznate

sekvence sa timinom na oba 3´ kraja koji sprečavaju recirkularizaciju vektora i

olakšavaju ligaciju PCR produkta sa adeninom na oba 3´ kraja koje generišu

termostabilne polimeraze kao što su GoTaq, Taq i AmpliTaq ili Tfl i Tth. Pored toga,

pGEM®-T easy vektor nosi i gen odgovoran za rezistentnost bakterija na ampicilin kao

i T7 i SP6 RNA polimeraza promotor bočno od polilinker regiona (oblast višestrukog

kloniranja) koji se nalazi unutar lacZ gena koji kodira sintezu enzima beta-

galaktozidaze. Ubacivanje DNK sekvence u plazmid dovodi do inaktivacije i

nemogućnosti stvaranja beta-galaktozidaze i tako da se kolonije sa rekombinantnim

DNK molekulima prepoznaju kao bele kolonije na podlozi sa laktozom. Klonovi koji

sadrže plazmid sa PCR proizvodom proizvode bele kolonije, dok klonovi sa plazmidom

bez PCR proizvoda daju plave kolonije na podlozi sa laktozom jer je lacZ gen

funkcionalan i stvara se beta-galaktozidaza. Unutar polilinker regiona nalaze se i

brojna restrikciona mesta za različite restrikcione enzime (endonukleaze) koja

omogućavaju izdvajanje umetnutog DNK fragmenta iz plazmida (Lodish et al., 2000;

Russell and Sambrook, 2001).

Kloniranje bilo kog DNK fragmenta u suštini uključuje nekoliko koraka: (1)

umnožavanje DNK sekvence koju želimo da kloniramo, (2) povezivanje ili ligaciju PCR

proizvoda sa DNK vektora (stvaranje rekombinantne DNK), (3) unošenje

rekombinantne DNK u bakterijsku ćeliju, (4) umnožavanje bakterija zajedno sa

rekombinantnom DNK, (5) skrining klonova sa rekombinantnom DNK i (6) izdvajanje i

prečišćavanje plazmida iz bakterijske ćelije.

1. Ligacija (povezivanje) PCR produkta i vektora

Korišćenje pGEM-T Easy Vector Systems kita (Promega GmbH, Mannheim,

Germany; https://promega.com) zasniva se na korišćenju pGEMT Vectora koji je

linearizovan, na krajevima sadrži po jedan nukleotid timina na 3’ kraju oba lanca, ima

gen koji je odgovoran za rezistentnost na amplicilin i višestruki region za kloniranje

(multiple cloning region) koji prepoznaju brojni restrikcioni enzimi. Ligacija PCR

produkta i samog vektora je jednostavna i zasniva se na komplementarnosti veze

adenina i timina jer većina polimeraza prilikom sinteze fragmenta u PCR reakciji na

krajeve dodaje po jedan nukleotid adenina.

Sadržaj kita:

1. pGEM®-T Vector (50ng/μl)

2. Control Insert DNA (4ng/μl)

3. T4 DNK Ligase

4. 2X Rapid Ligation Buffer, T4 DNK Ligase

5. JM109 Competent Cells, High Efficiency (opciono, pošto postoji mogućnost

kupovine kita i bez transformisanih ćelija)

99

Protokol (Promega GmbH, Mannheim, Germany; https://promega.com):

1. Otopiti pGEM®-T vektor, 2X Rapid Ligation pufer i kontrolnu DNK, zatim

vorteksovati (naročito je bitno dobro vorteksovati pufer jer se od stajanja mogu

istaložiti soli), spustiti kratkim spinom i staviti na led. Enzim T4DNA ligaza se

stalno drži na ledu i ne meša se.

2. Umnožene fragmente uzoraka takođe vorteksovati, spustiti kratkim spinom i

staviti na led.

3. Pripremiti miks koji sadrži elemente iz tabele 5.

Tabela 5. Količine i komponente za pripremu PCR mixa za primenu pGEM-T Easy

Vector Systems kita

Komponente reakcije Uzorak Pozitivna kontrola

2X Rapid Ligation Buffer 5 μl 5μl

pGEM®-T or pGEM®-T

Easy Vector (50ng)

1 μl 1 μl

PCR produkt 3 μl* -

Kontrolna DNK - 2 μl

T4 DNA Ligase (3 Weiss

units/μl)

1 μl 1 μl

Nuclease free H2O Do ukupne zapremine

10 μl

Do ukupne zapremine

10 μl

*Količina PCR produkta određuje se u zavisnosti od koncentracije PCR

produkta i željenog odnosa vektora i PCR produkta. Odnos vektora i PCR

produkta kreće se od 8:1 do 1:8, ali najbolje je koristiti odnos od 3:1 do 1:3.

Količina se određuje prema sledećoj formuli:

Konc. vektora (ng) × dužina PCR produkta (kb) × odnos vektora i PCR produkta

= konc. PCR produkta

Dužina vektora (kb)

Primer: Ako je odnos 3:1 a dužina PCR fragmenta 1000 bp onda treba dodati

50 ng PCR produkta,

jer je 50 ng x 1 kb x 3= 50 ng

3 kb

4. U većini slučajeva može se koristiti 3 μl PCR produkta i u tom slučaju treba

napraviti miks koji sadrži sve komponente izuzev uzorka (PCR produkta),

vorteksovati i spustiti kratkim spinom, a zatim podeliti po 7 μl u tubice od 1,5

ml. Nakon toga u tubicedodati po 3 μl PCR produkta, vorteksovati, spustiti

kratkim spinom i ostaviti na inkubaciji preko noći na 4°C (u frižideru).

100

2. Transformacija ćelija Escherichiacoli izolata DH5α

Umesto transformisanih ćelija koje se kupuju u kitu, može se uraditi i

transformacija ćelija E. coli izolata DH5α. Transformacija ćelija E. coli podrazumeva

otvaranje pora na ćelijskom zidu bakterija i povećanje broja receptornih mesta kako bi

se plazmid povezan sa željenim PCR produktom ubacio u unutrašnjost bakterijske

ćelije.

Protokol (D. Gallitelli et al., Dipartimento di Scienze del suolo, della pianta e degli

alimenti, Università degli Studi di Bari Aldo Moro, Bari, Italy, personal

communication):

1. Zasejati bakterijske ćelije u 3 ml LB tečne podloge i ostaviti na inkubaciji preko

noći na 37°C uz stalno mešanje na 250 rpm (ovo uraditi istog dana kad se

započne i ligacija PCR produkta).

2. Prebaciti 50 μl suspenzije bakterija u novih 10 ml LB podloge i ostaviti na

inkubaciji 3,5 h na 37°C uz stalno mešanje na 250 rpm (prebacivanje bakterija

uraditi velikom pipetom ili manjom pipetom, ali u tom slučaju odseći vrh

nastavka).

3. Nakon isteka inkubacije centrifugirati suspenziju bakterija 5 min na 6000 rpm

na temperaturi od 4°C.

4. Odbaciti supernatant i dodati 5 ml pufera za transformaciju sa suprotne strane

od taloga bakterija. Resuspendovati talog bakterija nežnim lupkanjem tube

prstom, ostaviti na inkubaciji na ledu u trajanju od 20 min, a zatim centrifugirati

5 min na 6000 rpm na temperaturi od 4°C.

5. Odbaciti supernatant i dodati novih 600 μl pufera za transformaciju sa suprotne

strane od taloga bakterija. Resuspendovati talog bakterija nežnim lupkanjem

tube prstom i ostaviti na inkubaciji na ledu u trajanju od 2 h.

6. Nakon isteka inkubacije, bakterijske ćelije su transformisane i spremne za

kloniranje.

Pufer za transformaciju

735 mg CaCL2xH20 (neophodan za pravljenje pora na ćelijskom zidu bakterija)

5 mg timidina (aktivira receptore na površini ćelijskog zida)

1 ml 1M Tris-HCl pH 7,5 (ima ulogu pufera)

Dopuniti sterilnom H2O do 100 ml, a zatim sterilisati primenom bakterioloških filtera.

Umesto pufera za transformaciju može se koristiti i autoklaviran 100 mM rastvor CaCl2.

101

3. Ubacivanje plazmida u transformisane ćelije bakterija (Promega GmbH,

Mannheim, Germany; https://promega.com)

1. Dodati po 100 μl transformisanih ćelija u 10 μl produkta ligacije i nežno

promešati lupkanjem tube prstom, a zatim ostaviti na inkubaciji na ledu u

trajanju od 30 min. Obavezno raditi na ledu i dodavanje ćelija vršiti ili velikom

pipetom ili manjom pipetom sa odsečenim vrhom nastavka. Pre svakog

dodavanja bakterija suspenziju bakterijskih ćelija obavezno promešati laganim

lupkanjem prstom.

2. Nakon toga tube prebaciti u vodeno kupatilo zagrejano na 42°C u trajanju od 3

min.

3. Nakon isteka inkubacije tube prebaciti na led u trajanju od 2 min, a zatim

inkubirati još 2 min na sobnoj temperaturi.

4. Nakon isteka inkubacije u tube dodati po 300 μl LB podloge i ostaviti na

inkubaciji 1 h na 37°C uz stalno mešanje na 150 rpm.

4. Zasejavanje bakterija (Promega GmbH, Mannheim, Germany;

https://promega.com)

1. Otopiti LB podlogu sa agrom i ohladiti na 50°C, a zatim dodati amplicilin

koncentracije 100 μg/ml i to 1 μl na 1 ml podloge.

2. Razliti podlogu u Petri kutije i ostaviti da se stegne (za svaki uzorak pripremiti

po 2 Petri kutije).

3. 15 min pre zasejavanja bakterija dodati po 40 μl X-Gala u podlogu i ostaviti da

podloga upije tečnost (X-Gal naneti pipetom u vidu sitnih kapi a zatim

ravnomerno rasporediti po podlozi).

4. Nakon isteka inkubacije naneti po 100 μl bakterija sa plazmidom pipetom u vidu

sitnih kapi i rasporediti ravnomerno po podlozi (obavezno koristiti manju pipetu

sa odsečenim vrhom).

5. Ostatak bakterijske suspenzije istaložitikratkim spinom, odbaciti po 100 μl

supernatanta i resuspendovati talog lupkanjem ependorfice prstom.

6. Naneti po 100 μl bakterijske suspenzije u drugu Petri kutiju i rasporediti

ravnomerno po podlozi.

7. Inkubirati Petri kutije preko noći na 37°C, tako što je poklopac okrenut na dole.

8. Nakon isteka inkubacije pojaviće se bele (koje sadrže ugrađen plazmid) i plave

kolonije (koje ne sadrže plazmid).

9. Petri kutije čuvati u frižideru do momenta prečišćavanja plazmida.

102

X-Gal

Rastvoriti 100 mg 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside u 2 ml 2NN

dimetil formamida i čuvati na -20°C.

5. Ekstrakcija plazmidne DNK iz ćelija Escherichia coli (D. Gallitelli et al.,

Dipartimento di Scienze del suolo, della pianta e degli alimenti, Università degli

Studi di Bari Aldo Moro, Bari, Italy, personal communication):

1. Zasejati 3 ml LB podloge u koju je dodat ampicilin koncentracije 100 μg/ml,

jednom kolonijom bele boje koja se razvila u Petri kutiji i inkubirati na 37°C uz

stalno mešanje na 250 rpm.

2. Nakon inkubacije prebaciti deo podloge u tube od 1,5 ml i centrifugirati 30 s na

14000 rpm, a zatim odbaciti supernatant i prosušiti na filter papiru. Ovaj korak

ponoviti sa preostalim delom suspenzije.

3. U mikrotube dodati 350 μl STET rastvora (8% saharoze, 20 mM Tris-HCl pH

8, 50 mM EDTA, 0,5% Triton) i 15 μl lizozima koncentracije 20 μm/μl i rastvoriti

talogmešanjem na vorteksu.

4. Inkubirati mikrotube u ključaloj vodi u trajanju 40 s, a zatim odmah prebaciti na

led i inkubirati 5 min.

5. Nakon završene inkubacije uzorak centrifugirati 20 min na 14000 rpm.

6. Nakon centrifugiranja sterilnom čačkalicom ukloniti hromozomnu DNK

bakterije.

7. U mikrotube dodati 175 μl fenola i 175 μl smeše hloroforma i izoamil alkohola

u odnosu 24:1, promešati na vorteksu u trajanju 40 s, a zatim centrifugirati 10

min na 14000 rpm.

8. Gornju tečnu fazu prebaciti u novu mikrotubu od 1,5 ml, a zatim dodati 200 μl 5

M amonijum acetata pH 5,5 i 1 ml hladnog apsolutnog alkohola i kratko

vorteksovati.

9. Mikrotube centrifugirati 10 min na 14000 rpm, a zatim odbaciti supernatant i

mikrotube posušiti na filter papiru.

10. Isprati talogsa 500 μl hladnog 70% etil-alkohola, a zatim centrifugirati 3 min na

14000 rpm. Odbaciti super natant pipetom i osušiti talogna 65°C u trajanju od

5 min.

11. Resuspendovati talogu 50 μl TE pufera (10 mM Tris-HCl pH 8, 1mM EDTA), a

zatim dodati 1 μl RnaseA koncentracije 10mg/ml i inkubirati na 37°C u trajanju

30 min u cilju razgradnje RNK.

12. U mikrotube dodati 30 μl PEG-NaCl (20% Polyetilen glikol 6000 i 2,5 M NaCl) i

pažljivo promešati na vorteksu, a zatim inkubirati na ledu 1 h.

13. Po isteku inkubacije mikrotube centrifugirati10 min na 14000 rpm.

14. Supernatant odbaciti, a talogisprati sa 300 μl 70% etil alkohola.

15. Mikrotube centrifugirati 2 min na 14000 rpm, a zatim odbaciti supernatant i

talogosušiti na 65°C u trajanju od 5 min.

16. Nakon isparavanja alkohola, talograstvoriti dodavanjem 30 μl RNase free vode.

103

Dobijeni talog predstavlja klonirani ciljani fragment DNK dobijen u velikoj količini

koji se dalje može koristiti za ispitivanja drugim metodama, kao što je na primer

sekvenciranje za proveru identiteta ili druge molekularne metode ispitivanja

fitopatogenih virusa i gljiva i pseudogljiva.

Pitanja:

1. Šta su prednosti primene molekularnih metoda za detekciju fitopatogena u

poređenju sa konvencionalnim metodama?

2. O čemu treba voditi računa pri odabiru biljnog materijala za ekstrakciju RNK?

3. Koje su prednosti i mane upotrebe kitova za ekstrakciju RNK iz biljnog

materijala u poredjenju sa konvencionalnim metodama ekstrakcije, kao što je

CTAB ekstrakcija?

4. Kada se prilikom ekstrakcije koristi RLT, a kada RLC pufer?

5. Koje su prednosti korišćenja „One–step“ RT–PCR protokola za detekciju biljnih

virusa u poređenju sa „Two–step“ RT–PCR protokolom?

Literatura

Iandolino, A. B., Goesda Silva, F., Lim, H., Choi, H., Williams, L. E., Cook, D. R.

(2004): High-quality RNA, cDNA, and derived EST libraries from grapevine (Vitis

vinifera L.). Plant Molecular Biology Reporter 22: 269-278.

Konstantinova, P., Bonants, P. J. M., van Gent-Pelzer, M. P. E., van der Zouwen, P.,

R. van den Bulk (2002): Development of specific primers for detection and

identification of Alternaria spp. in carrot material by PCR and comparation with blotter

and plating assays. Mycological Research 106: 23-33.

Kroon, L. P. N. M., Verstappen, E. C. P., Kox, L. F. F., Flier, W. G., Bonants, P. J. M.

(2004): A Rapid Diagnostic Test to Distinguish Between American and European

Populations of Phytophthora ramorum. Phytopathology 94: 613-620.

Krstić, B., Bulajić, A., Đekić, I. (2008): Tomato spotted wiltvirus, TSWV-Standardna

operativna procedura za fitopatološke dijagnostičke laboratorije. Univerzitet u

Beogradu-Poljoprivredni fakultet i Ministarstvo poljoprivrede, vodoprivrede i

šumarstva, Beograd.

Krstić, B., Bulajić, A., Ivanović, M., Stanković, I., Vučurović, A. (2010): Alfalfa

mosaicvirus, AMV-Standardna operativna procedura za fitopatološke dijagnostičke

laboratorije. Univerzitet u Beogradu-Poljoprivredni fakultet i Ministarstvo poljoprivrede,

vodoprivrede i šumarstva, Beograd.

104

Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. (2012): Agarose Gel

Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. Journal of Visualized

Experiments 62: e3923.

Lodish, H., Berk, A., Zipursky, S. L., Matsudaira, P., Baltimore, D., Darnell, J. (2000):

Molecular cell biology, 4th edition. New York: W. H. Freeman.

McKirdy, S. J., Washer, S., Berryman, D., Sargent, K., Selladurai, S., Jones, R. A. C.,

Coutts, B. (1998): Virus testing in chickpea and lentil seed. Pea seed-borne mosaic

and other viruses. Pulse Research and Industry Development in Western Australia,

1998. Updates, Observation City, February 1998. pp. 94-95.

McPherson, M. J., and Møller, S. G. (2000): PCR. BIOS Scientific Publishers Ltd.

Miller, S. A., Beed, F. D., Harmon, C. L. (2009): Plant disease diagnostic capabilities

and networks. Annual Review of Phytopathology 47: 15-38.

Reece, R. J. (2004): Analysis of genes and genomes. John Wiley & Sons.

Russell, D. W., Sambrook, J. (2001): Molecular cloning: a laboratory manual. Cold

Spring Harbor, N.Y: Cold Spring Harbor Laboratory.

Sellner, L. N. and Turbett, G. R. (1998): Comparison of three RT–PCR methods.

Biotechniques 25: 230-234.

Strange, R. N., Scott, P. R. (2005): Plant disease: a threat to global food security.

Annual Review of Phytopathology 43:83-116.

White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. (1990): Amplification and direct sequencing

of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics.. In: M. Innis, D. Gelfand, J. Sninsky,

T. White (eds.), PCR protocols: A guide to methods and applications, pp. 315-322.

Academic Press, Inc., San Diego.

Zeng, Y., Yang, T. (2002): RNA Isolation From Highly Viscous Samples Rich in

Polyphenols and Polysaccharides. Plant Molecular Biology Reporter 20: 417a-417e.

105

Real-time PCR detekcija karantinskih fitopatogenih bakterija u krtolama krompira i biljkama masline

Milan Ivanović, Nemanja Kuzmanović, Nevena Zlatković

Izvod

Ovo poglavlje bavi se molekularnom detekcijom karantinskih fitopatogenih bakterija u

krompiru i maslinama. Opisana je real-time PCR metoda za detekciju dva patogena

krompira u Evropi: Ralstonia solanacearum rasa 3 i Clavibacter michiganensis subsp.

sepedonicus. Ovaj metod omogućava istovremenu detekciju obe vrste tokom jedne

PCR reakcije, sa internom kontrolom iz krompira. Opisani protokol je osetljiv i

specifičan i može se koristiti u rutinskoj laboratorijskoj analizi većeg obima. Takođe je

opisana i procedura real-time PCR detekcije fitopatogene bakterije Xylella fastidiosa

u tkivu masline.

Istovremena detekcija Ralstonia solanacearum rasa 3 i

Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus u krtolama krompira pomoću

multiplex real-time PCR metode

1. Uvod

Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. rasa 3 (Rs) prouzrokuje bakterioznu

uvelost i mrku trulež krompira (Slika 1), dok Clavibacter michiganensis (Smith) Davis

et al. ssp. sepedonicus (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al., (Cms) izaziva

prstenastu trulež i uvelost krompira (Slika 2). Ova oboljenja predstavljaju ozbiljnu

pretnju gajenju krompira (Solanum tuberosum) u umerenom klimatu. Obe bakterije

nalaze se na A2 listi štetnih organizama u EPPO regionu i kao karantinski patogeni

nulte tolerancije u Evropskoj uniji. Ove vrste mogu biti prisutne latentno duži period u

asimptomatičnim krtolama krompira, što je jedan od glavnih faktora širenja oboljenja.

Postojeći fitosanitarni propisi oslanjaju se na dostupnost zdravih krtola semenskog

krompira.

106

Slika 1. Simptomi mrke truleži na uskladištenom krompiru prouzrokovanom bakterijom Ralstonia solanacearum. Primetiti mrku obojenost sprovodnog prstena krtole. (Foto: M. Ivanović)

Slika 2. Propadanje i šupljikavost uskladištenih krtola krompira sa prstenastom truleži prouzrokovanih bakterijom Clavibacter michiganensis. subsp. sepedonicus. (Foto: M. Ivano

107

2. Materijal, metode i beleške S obzirom da protokoli uključuju metode detekcije karantinskog organizma, što

podrazumeva i upotrebu živih referentnih kultura R. solanacearum i C.m. subsp.

sepedonicus, procedura se mora izvoditi u propisanim karantinskim uslovima sa

odgovarajućim objektima za odlaganje, čuvanje i uništavanje otpada u skladu sa

zakonom.

2.1. Priprema uzoraka – krtole krompira

Napomena:

- Standardna veličina uzorka je 200 krtola po testu. Veći broj krtola u uzorku

dovešće do inhibicije ili će otežati tumačenje rezultata. Postupak se može

primeniti i za uzorke sa manje od 200 krtola, kada je na raspolaganju manje

krtola.

- Metoda za utvrđivanje prisustva patogena, koje su opisane u daljem tekstu,

bazira se na testiranju uzoraka od 200 krtola;

- Procedura koja prethodi pripremi uzorka: oprati krtole, upotrebiti odgovarajuća

dezinfekciona sredstva (pri korišćenju PCR testa upotrebiti jedinjenja hlora radi

uklanjanja eventualno prisutne DNK patogena) i deterdžente između svakog

uzorka, osušiti krtole na vazduhu.

- Postupak pranja je posebno koristan ali ne i obavezan za slučajeve obrade

uzoraka sa većom količinom zemlje, pri izvođenju PCR testa ili procedure

direktne izolacije.

2.1.1. Čistim i dezinfikovanim skalpelom ili nožem za povrće ukloniti pokožicu sa

pupčanog dela krtole tako da se vide sprovodni sudovi. Pažljivo izrezati

mali konusni deo sprovodnog tkiva na pupčanom delu zahvatajući što

manje okolnog, nesprovodnog tkiva.

Napomena: Ako se prilikom vađenja konusa iz pupčanog dela uoče

potencijalni simptomi prstenaste truleži, krtole treba vizuelno pregledati.

Svaku presečenu krtolu sa ovakvim simptomima treba ostaviti dva dana na

sobnoj temperaturi, a potom čuvati u karantinskim uslovima (na 4 do 10°C)

do kraja testiranja.

2.1.2. Izvađene konuse iz pupčanog dela krtole koji sadrže delove sprovodnog

tkiva staviti u sterilne posude koje se mogu zapečatiti i/ili hermetički zatvoriti

(ako su posude već upotrebljavane, moraju se temeljno očistiti i

dezinfikovati upotrebom sredstava na bazi jedinjenja hlora). Uzorke je

poželjno odmah obraditi. Ako to nije moguće, potrebno je čuvati ih u posudi

bez dodatka pufera, najduže 72 sata u frižideru ili najduže 24 sata na sobnoj

temperaturi. Tokom čuvanja dolazi do sušenja i suberizacije sržnog dela

108

konusa, kao i do rasta i razvoja saprofita, što može ometati utvrđivanje

prisustva bakterije prouzrokovača mrke truleži i prstenaste truleži.

2.1.3. Izvađene konuse iz pupčanog dela krtole obraditi korišćenjem jednog od

sledećih postupaka:

(a) izvađene konuse prekriti dovoljnom količinom (oko 40 ml) ekstrakcionog

pufera (pogledati recept u napomeni) i ultracentrifugirati na 50 do 100

obrtaja/min, četiri sata na temperaturi ispod 24°C ili 16 do 24 sata uz

hlađenje; ili

(b) izvađene konuse homogenizovati sa dovoljnom količinom (oko 40 ml)

ekstrakcionog pufera, bilo u mešalici (npr. Waring ili Ultra Thurax) bilo

drobljenjem u zatvorenoj kesi za maceraciju za jednokratnu upotrebu

(npr. kese Stomacher ili Bioreba od čvrstog politena, 150 mm x 250

mm, sterilizovane zračenjem) koristeći gumeni čekić ili odgovarajući

aparat za maceriranje (npr. Homex).

Napomena:

- Ako se uzorci homogenizuju u blenderu, postoji velika opasnost od njihove

unakrsne kontaminacije. Preduzeti mere opreza u cilju sprečavanja nastajanja

aerosola ili prosipanja tokom ekstrakcije. Za svaki uzorak upotrebiti

sterilizovane nožiće i posude. Tokom procedure PCR-a, sprečiti prenos DNK

na kontejnere ili aparaturu za maceriranje. Za PCR test preporučuje se

maceriranje uzoraka u kesicama za jednokratnu upotrebu i dalje korišćenje

epruveta i tuba za jednokratnu upotrebu.

- Recept za ekstrakcioni puffer (50 mM fosfatni pufer): Na2HPO4 (anhidridni),

4.26 g; KH2PO4, 2.72 g; destilovana voda, 1 L. Rastvoriti komponente, podesiti

pH na 7.0 i sterilisati autoklaviranjem pri 121 °C u trajanju 15 min.

2.1.4. Odliti supernatant. Ako je previše mutan, razbistriti ga ultracentrifugiranjem

na manjem broju obrtaja (najviše 180 g/ 10 minuta na temperaturi od 4 do

10°C) ili vakuumskom filtracijom (40 do 100 Om) tokom koje se filter

dodatno ispira ekstrakcionim puferom (oko 10 ml).

2.1.5. Izvršiti koncentrovanje frakcije bakterija centrifugiranjem na 7000 g 15

minuta (ili 10.000 g 10 minuta) na temperaturi od 4 do 10ºC, posle čega se

pažljivo, bez mešanja sa talogom odliva supernatant.

2.1.6. Resuspendovati talog u 1,5 ml pelet pufera (pufera za rastvaranje taloga)

(pogledati recept u napomeni). Od ove količine koristiti 500 µl za testiranje

na prisustvo C. m. subsp. sepedonicus, 500 µl za testiranje na prisustvo

Ralstonia solanacearum i 500 µl kao referentni materijal za čuvanje. U

poslednji, referentni deo od 500 µl dodati sterilni glicerol u konačnoj

109

koncentraciji od 10 do 25% (v/v), promešati i čuvati na temperaturi od -16

do -24°C (nedeljama) ili na -68 do -86°C (mesecima). Delove odvojene za

utvrđivanje prisustva bakterija, tokom testiranja čuvati na temperaturi od 4

do 10°C. Ne preporučuje se višestruko zamrzavanje i odmrzavanje. U

slučaju potrebe za transportom uzoraka, isti dostaviti u prenosivom frižideru

u roku od 24 do 48 sati.

Napomena:

- Recept za puffer za rastvaranje taloga (10 mM fosfatni pufer):

Na2HPO4•12H2O, 2.7 g; NaH2PO4•2H2O, 0.4 g; destilovana voda, 1 L.

Rastvoriti komponente, podesiti pH na 7.0 i sterilisati autoklaviranjem pri 121

°C u trajanju 15 min.

- Važno je da se sve pozitivne kontrole Rs i Cms, i uzorci drže odvojeno da bi

se izbegla kontaminacija.

2.2. DNK ekstrakcija (Pastrik, 2000)

2.2.1 Pipetom odmeriti 220 μl lizis pufera [100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl

(pH 8,0), 1 mM EDTA (pH 8,0)] u Eppendorf mikroepruvetu od 1,5

ml.

2.2.2 Dodati 100 μl ekstrakta uzorka i staviti u termoblok ili vodeno kupatilo

pri 95°C u trajanju 10 minuta.

2.2.3 Inkubirati mikroepruvete na ledu u trajanju pet minuta.

2.2.4 Dodati 80 μl rastvora lizozima (50 mg lizozima po ml u 10 mM Tris

HCl, pH 8,0) i inkubirati pri 37°C u trajanju 30 minuta.

2.2.1 Dodati 220 μl rastvora Easy DNA® A (Invitrogen), dobro izmešati na

vorteksu i inkubirati pri 65°C u trajanju 30 minuta.

2.2.2 Dodati 100 μl rastvora Easy DNA® B (Invitrogen) i izmešati na

vorteksu do postizanja uniformnog viskoziteta uzorka.

2.2.3 Dodati 500 μl hloroforma, izmešati na vorteksu dok se viskozitet ne

umanji i smesa postane homogena.

2.2.4 Centrifugirati na 15000 g u trajanju 20 minuta pri 4°C da se podele

faze i stvori međufaza.

2.2.5 Preneti gornju fazu u novu Eppendorf mikroepruvetu.

110

2.2.6 Dodati 1 ml 100% etanola (-20°C), kratko promešati na vorteksu i

inkubirati na ledu 10 minuta.

2.2.7 Centrifugirati na 15000 g u trajanju 20 minuta pri 4°C i ukloniti etanol

od taloga.

2.2.8 Dodati 500 μl 80% etanola (-20°C) i promešati okretanjem tube.

2.2.9 Centrifugirati na 15000 g u trajanju 10 minuta pri 4°C, sačuvati talog,

a ukloniti etanol.

2.2.10 Ostaviti talog da se suši na vazduhu ili u vakuumskoj centrifugi (DNA

speed vac).

2.2.11 Resuspendovati talog u 100 μl sterilne ultra čiste vode i ostaviti na

sobnoj temperaturi najmanje 20 minuta.

2.2.1 Čuvati na -20°C do izvođenja PCR metode.

2.2.2 Bilo koji beli talog izdvojiti centrifugiranjem i za PCR upotrebiti 5 μl

supernatanta koji sadrži DNK.

Napomena:

- Za PCR analizu se preporučuje priprema jednog razređenja ekstrahovanog

uzorka DNK (1:10 u sterilnoj destilovanoj vodi).

- Druge metode DNK ekstrakcije, npr. pomoću Qiagen DNeasy Plant Mini

komercijalnog kompleta, mogu se primeniti s obzirom da je pokazano da su

podjednako efikasne u prečišćavanju DNK iz kontrolnih uzoraka koji su sadržali

103 do 104 ćelija ptogena po ml.

2.3 Real-time PCR metoda (Massart et al., 2014)

Ovaj multiplex real-time PCR test omogućava istovremenu detekciju Rs i Cms u

krtolama krompira. Prajmeri za obe bakterije (Tabela 1) dizajnirani su na osnovu

regiona između 16S i 23S rRNK gena. Takođe, pouzdanost ovog molekularnog

dijagnostičkog testa poboljšana je istovremenim umnožavanjem interne kontrole -

gena krompira ekstrahovanog iz uzorka. Za internu kontrolu prajmeri i probe (Tabela

1) su dizajnirani na osnovu gena hloroplasta (ATP synthase beta-subunit) iz krompira.

Minor Groove Binder (MGB) probe su nabavljene od Applied Biosystems, sa

fluorescentnom bojom (FAM, VIC or NED) povezanom kovalentnom vezom za 5’ kraj,

i nefluorescentnim kvenčerom i MGB delom na 3’ kraju. Sastav reakcione smeše i

temperaturni uslovi za reakciju prikazani su u Tabelama 2 i 3.

111

Tabela 1. Prajmeri i probe za kvantitativni real-time PCR

Prajmer ili probaa Sekvenca (5'-3') Boja

MultiRaso-F CGCGGAGCATTGATGAGAT

MultiRaso-R TCGTAATACTGGTTGATACAATCACAAC

MultiRaso-P CTCGCAAAAACGC VIC

MultiClav-F TGGTTTCTTGTCGGACCCTTT

MultiClav-R CGTCCACTGTGTAGTTCTCAATATACG

MultiClav-P CGTCGTCCCTTGAGTGG FAM

MultiPot-F GGTTTCGTAATGTTCCTCACCAA

MultiPot-R AAAGGTATTTATCCAGCAGTAGATCCTT

MultiPot-P CATGGTTGACGTTGAAT NED a F, forward; R, reverse; P, proba

Tabela 2. Reakciona smeša za kvantitativni real-time PCR

Reagens Zapremina

Qiagen mix 12,5 μl

Molecular grade voda 0,75 μl

10 μM Forward MultiPot-F Primer 0,75 μl

10 μM Reverse MultiPot-R Primer 0,75 μl

10 μM TaqMan MultiPot-P Probe 1,25 μl

10 μM Forward MultiRaso-F Primer 0,75 μl

10 μM Reverse MultiRaso-R Primer 0,75 μl

10 μM TaqMan MultiRaso-P Probe 0,5 μl

10 μM Forward MultiClav-F Primer 0,75 μl

10 μM Reverse MultiClav-R Primer 0,75 μl

10 μM TaqMan MultClav-P Probe 0,5 μl

Uzorak DNK 5 μl

Ukupno 25 μl

Tabela 3. Temperaturni profil za kvantitativni real-time PCR

95 ºC 15 min 1 ciklus

95 ºC 20 sec 40 ciklusa

60 ºC 60 sec

Odgovarajuće negativne i pozitivne kontrole su od ključne važnosti za eliminaciju

lažnih negativnih i lažnih pozitivnih rezultata. Stoga je potrebno uključiti sledeće

negativne kontrole u real-time PCR test:

112

- DNK ekstrahovana iz ekstrakta uzorka koji je prethodno bio negativan na prisusvo

Rs i Cms. Ekstrakti uzoraka treba da sadrže što je moguće manje zemlje u sebi. Zato

je u nekim slučajevima preporučljivo da se ekstrakti pripreme od opranih krompira;

- Pufer kontrole koje su korišćene za ekstrakciju bakterije i DNK iz uzorka;

- Uključiti negativnu kontrolu koja sadrži samo PCR miks, a umesto uzorka dodati istu

nuclease-free vodu koja je korišćena za pravljenje PCR miksa.

Takođe, potrebno je uključiti i sledeće pozitivne kontrole:

- Ekstrahovana DNK iz uzorka, koji je prethodno bio negativan na prisustvo Rs i Cms,

u koji su dodate suspenzije Rs i Cms (nekoliko razređenja);

- Ekstrahovana DNK iz vodene suspenzije referentnog soja Rs i Cms (npr. NCPPB

4156 = PD 2762 = CFBP 3857 za Rs; NCPPB 2140 ili NCPPB 4053 za Cms),

koncentracije 106 ćelija/ml;

Ukoliko je moguće, koristiti i ekstrahovanu DNK iz pozitivnog uzorka u PCR testu.

Da bi se sprečila kontaminacija, pozitivne kontrole pripremati u posebnoj prostoriji,

odvojeno od uzoraka koji se testiraju.

3. Zahvalnica

Ovaj rad finansiran je od strane projekta Evropske Komisije AREA, broj 316004. Autori

se zahvaljuju Holandskom Generalnom Inspekcijskom Servisu i NAK Institutu u

Emelordu, posebno Miriam Kuman i Jap Janse-u za organizaciju naše posete,

Robertu Vreburgu i Robertu Bolemi za podršku u laboratorijskom radu.

4. Literatura Massart, S., Nagy, C., Jijakli, M.H. (2014) Development of the simultaneous detection of Ralstonia solanacearum race 3 and Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by a multiplex real-time PCR assay. Eur J Plant Pathol.;138 (1): 29–37. doi: 10.1007/s10658-013-0294-4. Pastrik, K. H. (2000). Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by multiplex PCR with coamplification of host DNA. European Journal of Plant Pathology, 106 (2), 155–165.

113

Real-time PCR detekcija Xylella fastidiosa subsp. pauca (CoDiRo

soj) u biljkama masline

1. Uvod

Nedavno je u provinciji Leće (Italija) došlo do iznenadne pojave oboljenja masline,

nazvanog „sindrom brzog propadanja masline“ (eng. olive quick decline syndrome,

OQDS). Godine 2013., utvrđeno je da oboljenje prouzrokuje karantinska fitopatogena

bakterija Xylella fastidiosa, što je ujedno i prvi nalaz ovog patogena u Evropi. Osim iz

masline, bakterija je izolovana iz badema, oleandera, trešnje i nekoliko jednogodišnjih

ornamentalnih vrsta (Cariddi i sar., 2014; EPPO, 2016). Izolacija bakterija na hranljive

podloge predstavlja najvažniji i osnovni korak u fitobakterilologiji, ali s obzirom da su

X. fastidiosa podvrste spororastuće, molekularne i serološke metode su se pokazale

pogodnijim za praćenje i testiranje velikog broja uzoraka. U ovom priručniku, opisana

je metoda real-time PCR detekcije X. fastidiosa iz biljnog tkiva.

2. Materijal, metode i beleške

S obzirom da protokol uključuje metodu detekcije karantinskog organizma, što

podrazumeva i upotrebu živih referentnih kultura X. fastidiosa, procedura se mora

izvoditi u propisanim karantinskim uslovima sa odgovarajućim objektima za odlaganje,

čuvanje i uništavanje otpada u skladu sa zakonom.

2.1. Prikupljanje uzoraka

Za izolaciju vrste X. fastidiosa može se koristiti simptomatičan ili asimptomatičan biljni

materijal masline. Karakteristični simptomi oboljenja OQDS jesu prisustvo paleži

listova (Slika 1) i sušenja pojedinih grančica i grana. U ranim stadijumima infekcije,

simptomi se prvo pojavljuju u gornjim delovima krune. Vremenom, simptomi se

uočavaju na celoj kruni, pri čemu biljke ubrzano propadaju.

Slika 1: Početni simptomi OQDS na listovima masline

114

2.2. Prirema uzoraka

Za izolaciju DNK X. fastidiosa iz čiste kulture ili biljnog tkiva, koriste se standardni

komercijalni kitovi i metoda ekstrakcije korišćenjem CTAB pufera. Za ekstrakciju se

koristi bazalni deo liske i lisna drška, težine između 0,5-0,8 g. Odabrani listovi treba

da budu reprezentativni za ceo uzorak. U slučaju da su simptomi oboljenja vidljivi, za

izolaciju bi trebalo iskoristiti simptomatične listove.

2.3. Ekstrakcija DNK iz biljnog materijalom korišćenjem CTAB pufera

2.3.1 Izmeriti između 0,5 - 0,8 g svežih, sitno iseckanih delova centralnog nerva

i lisne drške (1/4 ako je tkivo liofilizovano), prebaciti tkivo u kese za maceraciju

i dodati 2ml CTAB pufera. Zdrobiti tkivo čekićem, a potom ga homogenizovati.

2.3.2. U svaku kesu dodati po 3 ml CTAB pufera.

2.3.3. Prebaciti 1ml macerata u mikroepruvetu zapremine 2 ml.

2.3.4. Zagrejati uzorke na 65°, u trajanju 30 min.

2.3.5. Centrifugirati uzorke na 10,000 rpm u trajanju 5 min i prebaciti 1ml

supernatanta u novu mikroepruvetu zapremine 2ml, vodeći računa da se

prenošenjem ne dotakne talog koji se nalazi na dnu mikroepruvete. Dodati 1ml

hloroforma: izoamil alkohol 24:1 i dobro promešati okretanjem ili

vorteksovanjem.

2.3.6. Centrifugirati uzorke na 13,000 rpm u trajanju 10 min. Prebaciti 750 ml u

mikroepruvetu zapremine 1.5 ml i dodati 450 μl (otprilike 0,6 zapremine)

hladnog 2-propanola. Promešati 2 puta okretanjem mikroepruvete. Inkubirati na

4°C ili -20°C u trajanju 20 min.

2.3.7. Centrifugirati uzorke na 13,000 rpm u trajanju 20 min, pa odbaciti

supernatant.

2.3.8. Dodati 1 ml 70% etanola.

2.3.9. Centrifugirati uzorke na 13,000 rpm u trajanju 10 min, sačuvati talog i

odbaciti 70% etanol.

2.3.10. Ostaviti mikroepruvete otvorene da se talog osuši na vazduhu ili koristiti

vakuumsku centrifugu.

2.3.11. Resuspendovati pelet u 100μl TE ili ultra čiste vode.

115

2.3.12. Ekstrahovana DNK može se čuvati na 4º C za upotrebu u kraćem

vremenskom roku ili na 2.3.13. -20ºC za čuvanje na duže vreme.

2.3.14. Pomoću spektrofotometra (Nanodrop 1000 ili sl.) odrediti koncentraciju

izolovane DNK. Očitati absorpciju (A) na 260nm i na 280 nm. Optimalan odnos

A260/280 za DNK dobrog kvaliteta trebalo bi da bude oko 2.

2.3.15. Podesiti koncentraciju na 50-100ng/μl. Koristiti 2 μl (u ukupnoj zapremini

od 20-25μl) kako bi se ispravno odvile reakcije konvencionalne ili real time PCR

metode.

Napomena: Receptura za CTAB pufer: 2% CTAB (heksadecil trimetil-

amonijum bromid), autoklaviran 0.1M TrisHCl pH 8, autoklaviran 20mM EDTA,

autoklaviran 1.4M NaCl, 1% PVP-40.

2.4. DNK ekstrakcija uz pomoć komercijalnog kita

DNeasy Plant Mini Kit, Cat. No. 69104 – Qiagen, Valencia, CA

2.4.1. Izmeriti 200 mg svežeg tkiva (1/4 ako je liofilizovano), a potom ga

macerirati uz pomoć avana i tučka u tečnom azotu. Dobijeni prah prebaciti u

mikroepruvetu zapremine 2ml. Ostalo tkivo se može sačuvati u zamrzivaču, na

-20ºC.

2.4.2. Dodati 800 μl Qiagen DNeasy Plant Mini extraction kit AP1 pufera i 8 μl

RNase A stock solution (100 mg/ml) u svaku mikroepruvetu.

2.4.3. Inkubirati mikroepruvetu sa miksom na 65ºC u trajanju 10 min.

2.4.4. Dodati 260 μl pufera AP2, blago vorteksovati i inkubirati na ledu u trajanju

5 min.

2.4.5. Centrifugirati na 20,000 g (14,000 rpm) u trajanju 10 min.

2.4.6. Prebaciti supernatant u QIAshredder Mini Spin Column (ljubičasta boja)

smeštenu u kolektorskoj mikroepruveti zapremine 2 ml i centrifugirati u trajanju

2 min na 20,000 x g (14,000 rpm). Potom baciti kolonu (obično ostaje oko 500

μl izfiltrirane tečnosti).

2.4.7. U mikroepruvetu dodati AP3/E pufer u zapremini od 1,5 puta tečnosti koju

smo dobili filtriranjem. Promešati pipetom.

116

2.4.8. Prebaciti 650 μl ovog mixa u DNeasy Mini Spin Column, koja se nalazi u

kolektorskoj tubi. Centrifugirati na 6000 x g (8000rpm) u trajanju 1 min. Baciti

izfiltriranu tečnost.

2.4.9. Ponoviti korak 2.4.8. sa ostatkom mixa. Baciti izfiltriranu tečnost i

kolektorsku mikroepruvetu.

2.4.10. Staviti spin kolonu u novu mikroepruvetu zapremine 2 ml. Dodati 500 μl

pufera AW na kolonu i centrifugirati na 8000 rpm u trajanju 1 min. Baciti

izfiltriranu tečnost.

2.4.11. Dodati još 500 ml AW pufera i centrifugirati u trajanju 2 min na 20,000

x g (14,000 rpm).

2.4.12. Prebaciti spin kolonu u mikroepruvetu zapremine 1.5 ml i dodati 200 μl

AE pufera (sobna temperatura) direktno na membranu kolone. Inkubirati u

trajanju 5 min na sobnoj temperature a potom centrifugirati u trajanju 1 min na

6,000 x g (8000rpm).

2.4.13. Ekstrahovana DNK može biti čuvana pri 4º C u slučaju upotrebe u

kraćem vremenskom roku ili pri -20ºC, za čuvanje na duži vremenski period

2.5 Real-time PCR (Harper i sar., 2010)

Harper i sar. (2010) razvili su real-time PCR metodu i dizajnirali prajmere na osnovu

rimM gena vrste X. fastidiosa, koji detektuju sve podvrste ovog patogena. U

prethodnim proučavanjima, ovaj set prajmera se pokazao pogodnim za detekciju

CoDiRo soja u tkivu masline (Tabela 1). Sastav reakcione smeše i temperaturni uslovi

reakcije dati su u Tabelama 2 i 3. Svaka reakcija treba da sadrži pozitivnu, negativnu

i kontrolu koja sadrži samo PCR mix. prilikom primene ove metode, potrebno je svaki

uzorak testirati u dva ponavljanja. Prisustvo fragmenta očekivane veličine znači da je

uzorak pozitivan na prisustvo vrste X. fastidiosa. U slučaju da uzorak ima vrednost

FAM Cq u rangu od 0.00 - 35.00, uzorak se smatra pozitivnim na prisustvo vrste X.

fastidiosa. Ako je FAM Cq=0.00 ili >35.0, onda se testirani uzorak smatra negativnim.

U slučaju da je vrednost FAM Cq između 32.01 i 34.99, onda uzorak treba ponovo

testirati real-time PCR metodom da bi se potvrdio rezultat.

Tabela 1. Prajmeri i probe za kvantitativni real-time PCR

Prajmer ili proba Sekvenca (5'-3') Boja

XF-F (forward) CACGGCTGGTAACGGAAG

XF-R (reverse) GGGTTGCGTGGTGAAATCAAG FAM

XF-P (proba) 6FAM-TCGCATCCCGTGGCTCAGTCC-BHQ1

117

Tabela 2. Reakciona smeša za kvantitativni real-time PCR

Reagent Volume

DNK uzorka 1 μl

2X master mix 5.5 μl

10 μM Forward prajmer 0.3 μl

10 μM Reverse prajmer 0.3 μl

10 μM TaqMan proba 0.1 μl

Molecular grade voda 3.8 μl

Total 11 μl

Tabela 3. Temperaturni profili za Real-time PCR reakciju

50 ºC 2 min 1 ciklus

95 ºC 10 min 1 ciklus

94 ºC 10 sec 39 ciklusa

63 C 40 sec

3. Zahvalnica

Ovaj rad finansiran je od strane projekta Evropske Komisije AREA, broj 316004.

Zahvaljujem se Nacionalnom Savetu za istraživanja (CNR) i Institutu za održivu zaštitu

bilja (IPSP) u Bariju, posebno dr Mariji Saponari koja je nesebično podelila svoje

znanje i pružila mi podršku u laboratorijskom radu. Svi pomenuti protokoli su objavljeni

od strane CNR Instituto per la Protezione Sosteinibile delle Piante (Bari, Italy), u okviru

Workshop programa “Current tools for the detection of Xylella fastidiosa in host plants

and vectors” (Saponari i sar., 2014).

Pitanja:

1. Koje dve bakterijske vrste su izazivači uvelosti i truleži krompira u Evropi? 2. Koji uslovi moraju biti ispunjeni da bi se pristupilo pripremi uzoraka za koji se

sumnja da su zaraženi bakterijom Ralstonia solanacearum ili Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus?

3. Šta su kriterijumi za odabir uzorka krompira koji ce biti testiran na prisustvo bakterija Ralstonia solanacearum ili Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus?

4. U čemu je značaj multiplex PCR metode pri analizi bolesti krompira? 5. Šta su karakteristični simptomi „sindrom brzog propadanja masline“ i koja je

bakterijska vrsta izazivač ove bolesti?

118

4. Literatura

Cariddi, C., Saponari, M., Boscia,D., Stradis, A. D., Loconsole, G., Nigro, F., Porcelli,

F., Potere, O., Martelli, G. P. (2014): Isolation of a Xylella fastidiosa strain infecting

olive and oleander in Apulia, Italy. Journal of Plant Pathology, 96 (3), 1-5.

EPPO (2016): First report of Xylella fastidiosa in EPPO region, Special

Alert.http://www.eppo.int/QUARANTINE/special_topics/Xylella_fastidiosa/Xylella_fas

tidiosa.htm

Harper, S. J., Ward, L. I., Clover, G. R. G. (2010): Development of LAMP and Real-

Time PCR Methods for the Rapid Detection of Xylella fastidiosa for Quarantine and

Field Applications. Phytopathology, Vol. 100, No. 12: 1282-1288.

Saponari, M., Loconsole, G., Potere,O., Palmisano, F., Boscia, D. (2014): Current

protocols for detection of Xylella fastidiosa in host plants and vectors. Workshop

manual, CNR Instituto per la Protezione Sosteinibile delle Piante, Bari, Italy.

119

Primena PCR metode u biohemiji hrane

Milica Pavlićević and Biljana Vucelić-Radović

Izvod

Nekoliko pristupa se može primeniti za detekciju genetski modifikovanih organizama

u hrani. Za praćenje promena na nivou DNK i/ili RNK koriste se različite vrste

kvantitativnog PCR-a (qPCR). Podela na vrste PCR-a izvršena je na osnovu vrste

jedinjenja i mehanizma koji se koristi za detekciju (interkalirajuće boje, prajmeri i

probe). Pored različitih vrsta PCR-a, nekoliko novijih metoda se koristi za detekciju

genetski modifikovanih organizama u hrani. Sekvenciranje naredne generacije koristi

se za dobijanje informacije o lokalizaciji insertovanog segmenta kao i njegovih

varijabilnih regiona. Mikroarej tehnologija omogućava analizu većeg broja različitih

DNK molekula istovremeno na čipu. “Decision-support“ sistemi kojima se GMO

detektuju i kvantifikuju bazirano na vrednostima Ct, Tm, LOD i LOQ se koriste u tzv.

matriks-baziranim metodama. U takozvanom “forenzičkom ispitivanju hrane” određuju

se parametri kao što su zaštićena oznaka porekla (PDO) i zaštićena geografska

oznaka (PGI) koji služe kao indikatori kvaliteta ispitivane hrane. Prilikom određivanja

PGI, u zavisnosti od vrste molekula ili parametra koji se analizira, može se primeniti

nekoliko metoda, npr. masena spektroskopija za odredjivanje odnosa izotopa,

spektroskopija ili hromatografija za praćenje promena u lipidnom profilu, itd. Za

određivanje PDO koriste se PCR tehnike koje detektuju jedinstvene sekvence, kao što

su polimorfizam pojedinačnog nukleotida (SNPs), polimorfizam restrikcionih

fragmenata različite dužine (RFLPs), polimorfizam amplifikovanih fragmenata različite

dužine (AFLP), polimorfizam dužine prostih sekvenci (SSLPs). Danas se za

određivanje autentičnosti hrane simultano koriste genomika, proteomika i

metabolomika. Prilikom ekstrakcije i DNK i RNK, kao posledica “matriks efekta”, od

ključnog značaja za dobijanje velike količine čiste, nedegradovane nukleinske kiseline

je izbor metode ektrakcije. Stoga, iako se procedura za ekstrakciju i DNK i ekstrakciju

RNK sastoji iz istih osnovnih koraka (homogenizacija, liziranje i ekstrakcija,

prečišćavanje (precipitacija ili vezivanje) i elucija ili resolubilizacija), korak liziranja i

ekstrakcije imaće najveći značaj na kvalitet izolovane nukleinske kiseline. Tokom DNK

ekstrakcije moguće je ili koristiti kitove (razvijene za posebnu namenu) ili “tradicionalne

metode” pri kojima se za ekstrakciju koristi organski rastvarač. Danas se za ekstrakciju

RNK pretežno koriste kitovi namenjeni za RNK ekstrakciju iz specifičnog organzma ili

tkiva. Za praćenje ekspresije gena koristi se Real Time PCR. Dizajn prajmera je

moguć u besplatnim on-line softverima kao što su Primer3 i Primer3Plus ili u softveru

koji je deo Real time PCR aparature. Analiza prajmera (mogućnost građenja

sekundarnih struktura kao što su ukosnice ili prajmer-dajmer ) može se vršiti u

softverima kao što su Vector NTI i MP primer.

120

“Forenzičko ispitivanje hrane”

Kako je poslednjih godina tema kvaliteta i sigurnosti hrane postala popularna,

određivanje zaštićene oznake porekla (protected designation of origin-PDO) i

zaštićene geografske oznake (protected geographic indication-PGI) kao parametara

kvaliteta hrane postalo je imperativ.

Prikom određivanja zašićene geografske oznake, koristi se nekoliko tehnika koje se

razlikuju u vrsti molekula koji detektiju i vrsti parametara koje prate (Luykx et al., 2008).

U metodama masene spektrometrije sastav uzorka se određuje jonizacijom uzorka,

merenjem m/z odnosa nastalih jona i konstrukcijom masenog spektra. Masena

spektrometrija koja meri odnos izotopa u uzorku uspeštno se primenjuje za

autentikaciju hrane životinjskog porekla (Vinci et al., 2013). Odnos izotopa zavisi od

nekoliko faktora, kao što su ishrana životinja, upotreba djubriva, ali među

najznačajnijim su geografski faktori (sastav zemljišta, nadmorska visina, itd.) (Luykx

et al., 2008). Spektroskopske metode, kao što je infracrvena spektroskopija, mogu se

koristiti I za praćenje procesa, kao što je npr. zrenje sira (Woodcock et al., 2008) ili za

autentikaciju praćenjem promena u npr. profile masnih kiselina, sterola i/ili fenolnih

jedinjenja, sadržaju isparljivih komponenti, itd. Hromatografske metode, kao što su

gasna hromatografija ili tečna hromatografija visokih performansi, mogu se koristiti za

autentikaciju biljnih ulja određivanjem, npr. sadržaja i vrste diacilglicerola i

triacilglicerola (Cserháti et al., 2008).

Forenzika hrane za utvrđivanje autentičnosti kombinuje genomiku, proteomiku i

metabolomiku (Primrose et al., 2010). Glavna prednost ovog integrativnog pristupa je

u tome što se rezultati svake metode pojedinačno verifikuju u narednim koracima i što

se nedostaci pojedinačne tehnike prevazilaze tako što se koristi nekoliko nivo analize.

PCR metode koje se koriste u autentikaciji hrane baziraju se na praćenju jedinstvenih

sekvenci (tzv. DNK fingerprinting). Te metode uključuju polimorfizam pojedinačnog

nukleotida (SNPs), polimorfizam restrikcionih fragmenata različite dužine (RFLPs),

polimorfizam amplifikacionih fragmenata različite dužine (AFLP), polimorfizam dužine

prostih sekvenci (SSLPs) i upotrebu kvantitativnog PCR-a i heterodupleks analizu

(Primrose et al., 2010; Agrimonti et al., 2011).Sve ove metode detektuju male varijacije

u sekvenci baznih parova (“polimorfizam”).

U novom pristupu, nazvanom DNK barkodiranje, koriste se markeri (kratka sekvenca

komplementarna ciljnom regionu) kako bi se detektovala ne samo vrsta, već i razlike

kod kultivara (Galimberti et al., 2013). Iako je DNK barkodiranje brza, jeftina i osetljiva

metoda, ona se ne može primeniti na visoko procesiranu hranu, usled gubitka

integriteta DNK(Galimberti et al., 2013).

Danas se za određivanje zaštićene oznake porekla, genomske metode kombinuju sa

fizikohemijskom detekcijom. Na primer, Ganopoulos et al. (2011) su koristili detekciju

mikrosatelitskih sekvenci praćenu analizom kapilarnom elektroforezom i topljenjem

visoke rezolucije u određivanju zaštićene oznake porekla proizvoda od trešnje.

121

Detekcija GMO u hrani

Prisustvo genetski modifikovanih organizma u hrani može se detektovati različitim

metodama. Generalno gledano, ove metode mogu se podeliti zavisno od vrste

molekula čija se promena prati. Imunološki testovi, kao što su imunološki test sa

obeleženim enzimom (ELISA) i test bočnog protoka (lateral flow sticks), Western blot

i 2D elektroforeza se koriste za praćenje promena u broju i vrsti proteina. Za praćenje

promena na nivou DNK i/ili RNK, koriste se PCR metode. Grubo gledano, PCR

metode se mogu podeliti u zavisnosti od njihove primene i mehanizma koji koriste za

detekciju.

U takozvanom kvantitativnom PCR-u (qPCR) koji se koristi za skrining GMO,

upotrebljavaju se tri različita pristupa. Interkalirajuće boje su molekuli koji sadrže

aromatični prsten koji im omogućava da se “umeću” između baza u DNK (obično u

velikoj brazdi). PCR metode koje se zasnivaju na korišćenju interkalirajućih boja (kao

što je SYBR Green) su najjeftinije, ali je osetljivost niska u slučaju jednolančane DNK

i u većoj koncentraciji inhibiraju PCR reakciju (Gasparic et al., 2010). Postoji nekoliko

modifikacija tzv. prajmer-baziranog PCR-a (primer-based PCR). Princip je u svim ovim

metodama isti –fluorescentna boja (fluorofora) se veže za jedan kraj prajmera i

fluorescentni signal se menja (raste ili opada) nakon koraka hibridizacije i ekstenzije.

Međutim, ključne razlike u ovim metodama nastaju uvođenjem dodatnih sintetičkih

baza (kao kod Plexor prajmera) ili “sakupljača” (quencher-a) na suprotnom kraju

prajmera (kao kod AmpiFluor prajmera). Takve modifikacije povećavaju osetljivost i

specifičnost PCR reakcije. Iako je skuplji od PCR-a koji koristi interkalirajuće boje,

prajmer-bazirani PCR je osetljiviji i specifičniji u poređenju sa SYBR Green PCR-om i

pruža mogućnost izvođenja multipleks PCR (upotrebljavaju se 4 fluorofore od kojih je

svaka specifična za određenu bazu). Ali, prajmer-baziranim PCR-om takođe se

detektuju i prajmer-dajmeri kao i nespecifični amplikoni (Gasparic et al., 2010). U PCR-

u koji koristi probe (kao što je TaqMan) uvodi se dodatna nukleotidna sekvenca

komplementarna sekvenci između prajmera (tzv. proba). Proba je obeležena

receptorom (fluoroforom) na jednom kraju i “sakupljačem” (quencher-om) na drugom

kraju. Nakon ekstenzije, “sakupljač” i fluorofora se oslobađaju i apsorbanca raste.

TaqMan PCR je skuplji od SYBR Green PCR-a i prajmer-baziranog PCR-a, ali ima širi

dinamički opseg i veću ponovljivost i efikasnost amplifikacije (Gasparic et al., 2010).

Povećana stabilnost kompleksa DNK-proba kao i povećana osetljivost metode mogu

se postići uvođenjem TaqMan proba koje se vezuju za manju brazdu DNK. Koriste se

i noviji dizajni proba kao što su “zaključane” probe (locked nucleic acid probe-LNA),

tehnologija sa ciklirajućim probama (cycling probe technology -CPT), i “molekulski

svetionici” (molecular beacons).

Gen-specifični PCR je znatno specifičniji prisup u poređenju sa kvatnitativnim PCR-

om (Wen-Tao et al., 2009). Gen-specifični PCR omogućava umnožavanje specifičnog

gena koji kodira za protein čije prisustvo može promeniti svojstva određenog kultivara

ili prehrambenog proizvoda. Na primer, p35 gen u paradajzu kodira za protein koji

deluje inhibitor kaspaza-inhibira apoptozu i pruža zaštitu protiv bolesti (Lincoln et al,

2002).

122

Konstrukt-specifičnim PCR-om se detektuje veza između dva elementa u DNK, obično

veza između promotora i transgena. Dakle, signal će biti prisutan samo u slučaju GMO

materijala. Međutim, ukoliko je ista “strana DNK” prisutna u različitim uzorcima, razlike

između uzoraka see ne mogu detektovati (Wen-Tao et al., 2009). Ovaj tip PCR

metode koristi se npr. za detektovanje Bt gena (koji kodira za citotoksin Cry A) u

Roundup kultivarima (Mesnage et al., 2013).

S obzirom da se tzv. “događaj”-specifičnim PCR-om (event-specific PCR) detektuje

lokus između DNK domaćina i insertovane DNK, ova metodologija je robustnija i

specifičnija od konstrukt-specifičnog PCR-a (Randhawa et al., 2016). Ovakav pristup

često se upotrebljava za detekciju prisustva Roundup Ready soje i Bt-176 “Maximizer”

kukuruza u hrani (Berdal et al., 2001) čak i visokoprocesiranoj hrani (Tengel et al.,

2001).

Sleva na desno: trake 1 i 11. 50-bp standardi molekulskih masa DNK; 2. PCR blank;

3 i 4. prozvodi PCR umnožavanja u prisustvu jednog para primera (441 bp) za

detekciju DNK iz Roundup Ready soje; 5 i 6. Roundup Ready soje (156 bp); 7 i 8.

sojinog lektina (210 bp); trake 13-18. Multipleks PCR proizvodi dobijeni

umnožavanjem, u prisustvu sedam različitih parova primera, za istovremenu detekciju

endogenih gena soje i kukuruza (lektina i zeina), kao i pet rekombinantnih DNK

konstrukta genetički modifikovanih biljaka: Roundup Ready soje, kao i Bt11, Bt176,

GA21 i MON810 linija kukuruza.

Za dobijanje informacije o lokalizaciji insertovanog segmenta kao i njegovih varijabilnih

regiona, koristi se sekvenciranje naredne generacije (next generation sequencing-

NGS). Glavna razlika između “klasičnog” sekvenciranja (putem kapilarne

elektroforeze) i NGS-a je što se kod NGS-a umesto pojedinačnog DNK fragmenta

simultano sekvencira veliki broj fragmenata. Sekvenciranja naredne generacije

123

kuplovano sa site-finding PCR-om omogućava detekciju vip3Aa20 gene (kodira za

insekcidalni protein) u MIR162 kukuruzu (Randhawa et al., 2016).

U mikroarej (microarray) tehnologiji, DNK se vezuje u formi mikroskopskih tačaka na

površinu nekog materijala. Najveće prednosti mikroarej tehnologije su visoka

osetljivost i veliki kapacitet (Berdal et al., 2001). Kako više sekvenci može biti

analizirano simultano, postoji više modifikacija mikroarej metode (multiplex

microarray, ligation detection reaction coupled with universal array technology, event-

specific microarray, itd). Npr.,“događaj”-specifičnom mikroarej metodom može se

detektovati više GM “događaja” u procesiranoj hrani (od soje, kukuruza, kanole i

pamuka) (Kim et al., 2010).

Matriks-bazirane metode, kao što je "Kombinovani qPCR SYBR Green

skrining", koriste tzv. “decision-support” sisteme kojima se GMO detektuju i

kvantifikuju bazirano na vrednostima 4 parametra: Ct, Tm, LOD i LOQ (Van der Bulcke

et al., 2010). Ct (“threshold cycle”) predstavlja nivo iznad koga je fluorescenca uzorka

veća od pozadinske fluorescence. Ct vrednost je obrnuto proporcionalna količini DNK.

Tm je temperatura “topljenja”. LOD predstavlja granicu detekcije, a LOQ granicu

kvantifikacije.

Suprotno ranije pomenutim metodama, izotermalna amplifikacija posredovana petljom

(loop-mediated isothermal amplification -LAMP) se izvodi pri konstantnoj temperaturi.

Karakteristika LAMP metode je da se 4 različita prajmera koriste za detekciju 6

različitih regiona ciljnog gena, sa dodatkom “loop” prajmera koji ubrzavaju reakciju.

Prisustvo većeg broja prajmera povećava osetljivost metode. Zadnjih godina, LAMP

testovi se koriste za detekciju dva najveća komercijalna “događaja” u Bt pamuku-

MON531 i MON15985 (Randhawa et al., 2016).

Ključan faktor koji određuje ne samo metodu za detekciju GMO, već i metodu

ekstrakcije DNK je kvalitet DNK. Tokom tehnološkog procesa, menja se ne samo

količina, već i kvalitet i čistoća DNK. Npr., pri niskom pH (pH 3–4), raskidaju se

glikozidne veze između riboze i azotne baze (Gryson et al., 2010). Na pH iznad 8,

baze menja u tautomerni oblik. Nastali tautomeri mogu da formiraju nestandardne

bazne parove i da dovedu do mutacija u DNK tokom replikacije. Visoke temperature

dovode do depurinacije i deamidacije, što uslovljava degradaciju DNK. (Gryson et al.,

2010). Kombinovani efekat pritiska i temperature tokom autoklaviranja na degradaciju

DNK je veći u poređenju sa kuvanjem. Npr., nakon autoklaviranja soje na 121°C

tokom15 min samo DNK fragmenti manji od 295bp su dobijeni (Ogasawara et al.,

2003). Eksperimenti pečenja na različitim temperaturama pokazali su da pečenje

redukuje veličinu ekstrahovane DNK (Hrncirova et al., 2008).

124

Ekstrakcija DNK iz hrane

1. Uvod:

U današnje vreme postoji mnoštvo različitih metoda za ekstrakciju DNK iz hrane. Kako

bi se eliminisao tzv. “matriks efekat” izbor metode za ekstrakciju u najvećoj meri zavisi

od tipa uzorka i stepena prerade. Međutim, cilj svake od ovih metoda je dobiti veću

količinu, nedegradirane, čiste DNK dovoljne dužine. Ovakvi zahtevi za inaktnom DNK

dovoljne dužine potiču od toga što je izolovanu DNK obično neophodno amplifikovati

za naredne eksperimente. I pored toga što se mehanizmi kojima se vrši ekstrakcija,

kao i hemikalije, razlikuju od metode do metode, svaki protokol za izolovanje DNK iz

hrane sastoji se od nekoliko ključnih koraka:

1. Homogenizacija 2. Liziranje i ekstrakcija

3. Prečišćavanje (precipitacija ili vezivanje)

4. Elucija ili resolubilizacija

Korak homogenizacije ima dva cilja: disrupciju ćelijskih membrana (i/ili ćelijskih zidova)

i dobijanje homogenog, reprezentativnog uzorka. Iako postoje različite metode

homogenizacije (homogenizacija staklenim kuglicama, usitnjavanjem u avanu, rotor-

stator homogenizator, itd.), sve metode podrazumevaju upotrebu mehaničke sile.

Uticaj homogenizacije na kvalitet dobijene DNK je slabo poznat, ali rezultati nekih

istraživanja (Colatat; Miller et al., 1999) upućuju da metod homogenizacije utiče kako

na prinos i čistoću, tako i na veličinu fragmenata dobijene DNK. Kada se razmatra

čistoća i prinos DNK, najbolje rezultate daje homogenizacija sa kuglicama, ali

homogenizacija u rotor-statoru daje fragmente DNK najveće dužine. Uzorci hrane koji

sadrže veliku količinu jedinjenja koja mogu delovati kao PCR inhibitori (lipidi, fenolna

jedinjenja, polisaharidi, itd. (Wilson et al., 1997) zahtevaju pre-tretman (Terry et al.,

2002). Metode za eliminaciju kontaminanata zavise od vrste (Terry et al., 2002). Na

primer,lipidi se mogu odstraniti obezmašćivanjem heksanom.

U koraku liziranja i ekstrakcije, ćelijski zid i/ili membrana koji su “razbijeni” u

prethodnom koraku, sada bivaju rastvoreni i ćelija oslobaća svoj sadržaj, olakšavajući

tako ekstrakciju DNK iz jedra. U ovu shvrhu se koriste puferi za liziranje i premda

njihov sadržaj može varirati u zavisnosti od metode ekstrakcije, svaki pufer za

ekstrakciju mora sadržati sledeća: detergente (jedinjenja koja mogu da

uklone/rastvore membranske lipide), RNK-aze (enzyme koji razgrađuju RNK) i

proteinaze koje denaturišu proteine. Često puferi za lizu sadrže soli (kako bi se

raskinule elektrostatičke veze između proteina, u prvom redu između histona i DNK) i

helirajuća jedinjenja (koja sprečavaju degradaciju DNK vezujući dvovalentne jone kao

što je Mg2+ koje predstavlja kofaktor DNKaza). Generalno, nove metode za ekstrakciju

DNK su bazirane na upotrebi takozvanih kitova. Dve glavne vrste kitova koji se

upotrebljavaju za ekstrakciju DNK iz hrane su: kitovi bazirani na silikatima (kao što su

Wizard, NucleoSpin Food, QIAamp DNA) Stool (Turci et al., 2010; Pirondini et al.,

2010; Tung Nguyen et al., 2009) i kitovi koji koriste magnetne kuglice (kao što je

PrepFiler™ Forensic DNA Extraction Kit). U “traditionalnim metodama” za ekstrakciju

se koriste organski rastvarači (npr. fenol, hloroform, etanol itd.). Od ovih metoda, SDS

125

(natrijum dodecil sulfate) ekstrakcija i CTAB (cetil trimethilamonijum bromid) extrakcija

se i dalje koriste i modifikuju. Obe metode daju velike količine DNK (Turci et al., 2010)

i koriste realativno jeftine hemikalije, što su glavni razlozi njihove upotrebe. Međutim

poređenjem SDS i CTAB ekstrakcije, može se zaključiti da CTAB metoda daje visok

prinos čak i kada se radi o termički ili hemijski tretiranim uzorcima (kao što su sir ili

pavlaka za kuvanje) dok u slučaju SDS ekstrakcije to nije tako (Turci et al., 2010;

Pirondini et al., 2010; Tung Nguyen et al., 2009). Takođe u slučaju uzoraka koji sadrže

veliki broj PCR inhibitora, SDS ekstrakcija daje fragmentisanu DNK (Turci et al., 2010;

Pirondini et al., 2010). Međutim, modifikacije originalne CTAB procedure

podrazumevaju čest transfer uzorka iz jednog ependorfa u drugi, što povećava rizik

od kontaminacije i može dovesti do gubitka izorka. Takođe, i SDS i CTAB metoda su

dugotrajne. Kako CTAB metoda koristi veliki broj agresivnih hemikalija, ovakva

ekstrakcija daje DNK koja je lošijeg kvaliteta u poređenju sa DNK izolovanom novijim

metodama kao što je Wizard (Turci et al., 2010). Glavna prednost novih metoda je

njihova brzina. Međutim, kako je većina kitova razvijena za specifičnu namenu,

ekstrakcija pomoću kitova ne daje DNK dovoljnog kvaliteta i količine kada se radi o

visokoprocesiranim uzorcima ili uzorcima čiji se hemijski sastav znatno razlikuje od

sastava uzorka za koji je kit razvijen. Na primer, sa svežim ili procesuiranim

proizvodima paradajza, NucleoSpin Food kit daje najveći prinos od svih ispitanih

kitova, ali je takva DNK značajno degradirana u poređenju sa DNK koja se dobija

korišćenjem QIAamp DNA Stool and Wizard kitova. Dodatni problem sa korišćenjem

kitova za DNK ekstrakciju je visoka cena hemikalija koje su potrebne za vezivanje i

prečišćavanje DNK.

Tokom prečišćavanja, DNK se odvaja od kontaminanata iz rastvora. Kod tradicionalnih

metoda ovo se postiže precipitacijom. Međutim, tradicionalne metode se razlikuju po

sposobnosti da uklone određenu vrstu kontaminanata. Relativno visoka koncentracija

soli u CTAB puferu sprečava koprecipitaciju polisaharida sa DNK. Međutim, CTAB

metoda je manje efikacna od SDS metode u denaturisanju proteina, tako da proteini

mogu ostati kao kontaminanti u precipitatu. U kitovi bazirani na silikatima i kitovi sa

magnetnim kuglicama koriste negativnu šaržu DNK za prečišćavanje. Mehanizam

prečišćavanja DNK upotrebom kitova baziranih na silikatima još uvek nije u potpunosti

objašnjen, ali se smatra da su haotropne soli iz pufera uključene u formiranje sonih

mostova između silikatne membrane i DNK. U kompeksinim smešama, kao što je

hrana, problem mogu predstavljati jedinjenja koja imaju istu šaržu kao DNK, jer mogu

ostati kao nečistoće u rastvoru. Stoga, ona će sa DNk vezati za kolonu i koeluirati.

Kitovi sa magnetnim kuglicama su mnogo uspešniji u vezivanju DNK, jer se negativno

naelektrisana DNK vezuje za pozitivno naelektrisane magnetne kuglice.

Kako je promena pH i/ili jonske sile najčešće neophodna za eluciju sa membrane ili

kolona, ovaj korak je jako osetljiv, jer može dovesti do fragmentisanja DNK.

Resolubilizacija peleta može biti problem kod tradicionalnih metoda, jer upotreba

organskih rastvarača može uzrokovati promene u strukturi DNK koje otežavaju

resolubilizaciju.

Kako i ekonomičnost igra značajnu ulogu u odabiru metode ekstrakcije, novi pristuo

zvani “fuzzy logic” je uveden za evaluaciju uspešnosti ekstrakcije DNK iz hrane. Ovaj

126

pristup uzima u obzir kompleksnost individualnih uzoraka i rangira metode za

ekstrakciju ne samo po količini i kvalitetu izolovane DNK, već i po ceni.

Čistoća i koncentracija izolovane DNK se obe mogu odrediti spektrofotometrijski

određivanjem odnosa A260/A280. Apsorbanca na 260 nm potiče od prisustva

aromatičnih prstenova u azotnim bazama u DNK, dok vrednost apsorbance na 280

nm zavisi od koncentracije aromatičnih aminokiselina. Stoga se ovaj odnos može

koristiti kao mera kontaminacije proteinima. Obično se DNK čiji je A260/A280 odnos veći

od 1.8 smatra čistom.

Kvalitet izolavane DNK utvrđuje se agaroznom elektroforezom i/ili brojem uspešnih

PCR reakcija.

2. Materijal, metode i sugestije:

A. Ekstrakcija DNK iz mleka koristeći CTAB metod (prema Corbispier et al., 2007)

Potrebni reagensi:

CTAB pufer za ekstrakciju (20 g cetil trimetilamonijum bromida se rastvori u 1l 0.1 M

Tris-HCl pufera pH 8 koji sadrži 1.4 M NaCl i 20 mM EDTA)

CTAB pufer za precipitaciju (5g trimetilamonijum bromida se rastvori u 1l 40 mM NaCl)

Rastvor RNK-aze A (100 mg/mL)

Rastvor proteinaze K (20 mg/ml)

1.2 M NaCl

Hloroform

Etanol (absolutni i 70 % (v/v))

Voda bez nukleaza (nuclease-free)

Procedura:

1. Inkubirati 100 μl uzorka sa 300 μl nuclease-free vode, 700 μl CTAB pufer za ekstrakciju i 5 μl rastvora RNK-aze A na 65°C 15 min.

2. Dodati 20 μl rastvora proteinaze K 15 min na 65°C.

3. Centrifugirati 10 min na 12000 g.

4. Prebaciti supernatant u novi ependorf i dodati 500 μl hloroforma

5. Prebaciti vodenu fazu (700 μl) u novi ependorf i dodati 700 μl hloroforma

6. Centrifugirati 5 min na 12000 g

7. Prebaciti supernatant u novi ependorf i inkubirati sa dvostrukom zapreminom

CTAB pufer za precipitaciju 1 h na sobnoj temperaturi

8. Centrifugirati 15 min na 12000 g

9. Resuspendovati pelet (DNK) u 400 μl 1.2 M NaCl.

10. Resuspendovanu DNK pomešati sa 400 μl hloroform

11. Centrifugirati 10 min na 12000 g

12. Prebaciti vodenu fazu u novi ependorf i dodati dvostruku zapreminu ledenog

apsolutnog etanola.

13. Inkubirati 20 min na 20°C i potom centrifugirati 15 min na 12000 g.

14. Isprati pelet (2x) sa 500 μl 70 % etanola i osušiti na vazduhu

15. Rastvoriti u100 μl nuclease-free vode.

127

B. Ekstrakcija DNK iz mleka korišćenjem PrepFiler™ Forensic kita za DNK ekstrakciju (prema uputstvu prozvođača, Applied Biosystem, 2008)

Potrebni reagensi:

PrepFiler™ pufer za liziranje

1 M DTT (ditiotreitol)

PrepFiler™ magnetne kuglice

Izopropanol

PrepFiler™ pufer za ispiranje

PrepFiler™ pufer za eluciju

Procedura:

1. 40 μl uzorka pomešati sa 300 µL PrepFiler pufera za liziranje i 3 µl 1M DTT u ependorfu od 1.5 ml i vorteksirati 5 s

2. Inkubirati 20 min na 70 °C na 900 obrtaja u minuti.

3. Centrifugirati 2 s na 14000 obrtaja u minuti.

4. Koristeći pipetu transferovati rastvor u PrepFiler™ Filter kolonu koja je

postavljena u 1.5 mL PrepFiler™ Spin kolonu

5. Centrifugirati 2 min na 14000 obrtaja u minuti (rpm).

6. Pripremiti magnetne kuglice vorteksiranjem tube koja sadrži PrepFiler™

magnetne kuglice 5 s pri niskoj brzinu i centrifugiranjem 2 s na14000 obrtaja

u minuti .

7. Odbaciti filter kolonu i otpipetirati 15 µL magnetnih kuglica u 1.5 mL

PrepFiler™ Spin tubu.

8. Vorteksirati spin tubu na 1200 rpm 10 sekundi i centrifugirati 2 s na 14000

rpm.

9. Dodati 180 µL izopropanola i vorteksirati 5s pri niskoj brzini.

10. Centrifugirati 2 s na 14000 rpm.

11. Mešati na sobnoj temperaturi na 1000 rpm 10 minuta.

12. Vorteksirati 10 s na 14000 rpm.

13. Centrifugirati 2 s na 14000 rpm.

14. Postaviti ependorf u stalak (koji sadrži magnet) i sačekati 1-2 min dok

veličina peleta ne postane konstantna.

15. Pažljivo otpipetirati supernatant (paziti da se ne “zakači” DNK u peletu)

16. Isprati tri puta sa po 300 µL of PrepFiler™pufera za ispiranje. Izneđu svakog

ispiranja vorteksirati 5 s na maksimalnoj brzini i centrifugirati 2s na 14000

g. Supernatant se odbacuje između ispiranja.

17. Ponovo postaviti ependorf u stalak, otvoriti i ostaviti da se DNK osuši na

vazduhu (7 do 10 minuta na sobnoj temperaturi).

18. Dodati 50 µL of PrepFiler pufera za eluiranje i vorteksirati 5 s pri

maksimalnoj brzini.

19. Centrifugirati 2 s na 14000 rpm.

20. Inkubirati na 70 °C pri 900 rpm u toku 5 minuta.

128

21. Vorteksirati 5 spri maksimalnoj brzini.

22. Centrifugirati 2 s na 14000 rpm.

23. Postaviti ependorf u stalak i sačekati dok veličina peleta ne postane

konstantna (najmanje 1 minut).

24. Otpipetirati supertnatant (koji sadrži izolovanu DNK) u novi 1.5 ml ependorf.

25. Dodatni korak: ukoliko izolovana DNK pokazuje visok turbiditet,

centrifugirati 5 min na 14000 rpm i prebaciti supernatant u novi ependorf.

Ekstrakcija RNK

1. Uvod:

Osnovni koraci u ekstrakciji RNK su isti kao i u ekstrakciji DNK (homogenizacija,

liziranje, ekstrakcija, prečišćavanje i elucija). Međutim, RNk je hemijski mnogo manje

stabilna u poređenju sa DNK, što je čini osetljivom na temperaturne promene i

podložnom degradaciji RNKazama (Lepinske et al., 1997). Stoga, kada se radi sa

RNK, ključno je pripremini u odžavati "rnkaza slobodnu" (RNAses-free) sredinu,

inhibirajući enzime alkohom i niskim temperaturama. Za razliku od DNK-aza, RNK-

aze za svoju aktivnost ne zahtevaju prisustvo dvovalentnih jona. Dodatno inhibiranje

endogenih RNKaza može se postići dodatkom 2-merkaptoetanola i/ili guanidijum soli

u pufer za ekstrakciju. 2-merkaptoetanol inhibira enzime raskidanjem disulfidnih veza

u enzimima. Guanidijum soli takođe denatorišu proteine, inhibirajući na taj način i

RNKaze.

Kako je rizik od degradacije RNK RNKazama najveći tokomuzorkovanja i

homogenizacije, ova dva koraka su ključna za dobijanje dovoljne količine

nedegradirane RNK (MacRae, 2007). Tokom uzorkovanja posebnu pažnju treba

posvetiti tome da se uzorak što brže stavi u tečni azot kako bi se sprečila degradacija.

Iako se mislilo da mlađa biljna tkiva sadrže veću količinu RNK od starijih i da su stoga

bolji izbor za uzorak, skoriji eksperiment (Johnson et al., 2012) je pokazao da je razlika

u količini RNK između starijih i mlađih tkiva samo oko 13 %. Takođe, nisu sva biljna

tkiva u istoj meri metabolički aktivna i stoga ne sadrže istu količinu RNK i/ili inhibitora

(kao što su fenolna jedinjenja, posebno tanini, polisaharidi, proteini, itd.).

Tokom homogenizacije, može se javiti nekoliko problema koji će uticati na

ekstrakciju RNK. Prvo, kratko vreme i/ili nedovoljna sila tokom disrupcije mebrana

usloviće da se RNK ne oslobodi iz svih ćelija, tj. dovešće do manjeg prinosa. Drugo,

ukoliko egzogene RNKaze nisu inhibirane doći će do degradacije RNK tokom

homogenizacije. Treće, tokom ovog koreka može doći do gubitka uzorka.

Ekstrakcija RNK iz biljnog materijala može se vršiti ili komercijalnim kitovima ili

organskim rastvaračima. Među ekstrakcijama organskim rastvaračima, najpopularnija

je tzv. Trizol ekstrakcija koja koristi guanidijum tiocijanat, fenol i hloroform za

ekstrakciju RNK. Međutim, glavni nedostaci ovakve ekstrakcije su što ne daje dobre

rezultate sa tkivima bogatim polisaharidima i fenolnim jedinjenjima i što može biti teško

rastvoriti dobijeni pellet (Rio et al., 2010). U većini slučajeva, procedura ekstrakcije se

podešava prema određenoj svrsi ili prema vrsti tkiva. Većina modifikacija

129

podrazumeva uklanjanje specifičnih inhibitora koji mogu koprecipitirati sa RNK ili se

vezati za istu. Među ovim inhibitorima polisaharidi i fenolna jedinjenja su najistaknutiji.

Prisustvo polisaharida može dovesti do povećane viskoznosti nakon resuspenzije (Dal

Cin et al., 2005). Za razliku od DNK ekstrakcije, u RNK ekstrakciji enzimi tipa pektinaza

ne mogu se koristiti, jer postoji rizik od degradacije (Dal Cin et al., 2005). Pojedini

protokoli nisu modifikovani samo prema vrsti tkiva već i prema nameni. Na primer, u

eksperimentima u kojima se ispituje ekspresija gena neophodno je da se metod

modifikuje tako da bude brz, da daje jednako dobre rezultate sa tkivima koja sadrže

različite koncentracije inhibitora i da se redukuje broj koraka u kojima može doći do

gubitka uzorka (Vasanthaiah et al., 2008). Slično kao i kod DNK ekstrakcije, bazični

mehanizam ekstrakcije kitovims jeste vezivanje RNK za silikatnu kolonu ili membranu.

Takvo vezivanje može se vršiti na osnovu negativne šarže RNK ili na osnovu razlike

u molekulskim masama između RNK i inhibitora u ekstraktu.

Tokom ekstrakcije RNK organskim rastvaračima, neophodno je izvršiti

precipitaciju, jer će dobijeni pellet sadržati RNK. Resuspenzija peleta mogla bi biti

problematičan korak, jer je poznato da prisustvo sekundarnih metabolite može smanjiti

rastvorljivost peleta nakon ekstrakcije sa guanidijumskim solima (Ghawana et al.,

2011).

2. Materijal, metode i sugestije

Ekstrakcija RNK iz lišća i listova Arabidopsis thaliana (prema RNeasy Mini Handbook

Qiagen)

Potrebni reagensi:

RLT pufer

RW1 pufer

RPE pufer

“RNase-free” voda (voda bez prisustva rnk-aza)

Protokol

1. Homogenizovati 100 mg biljnog materijala (lišća ili korenja) u avanu i tučku sa tečnim azotom

2. Prebaciti usitnjeni materijal u ependorf od 2 ml

3. Dodati 450 µl RLT pufera (pufera za liziranje) i vorteksirati pri najvećoj brzini

4. Transferovati lizat u QIAshredder spin kolonu koja je postavljena u ependorf

od 2 ml i centrifugirati 2 min pri najvećoj brzini.

5. Pazeći da se ne poremeti pelet, prebaciti supernatant u novi ependorf od 2

ml

6. Dodati 500 μl absolutnog etanola i pomešati prevrtanjem ependorfa

7. Prebaciti celokupan uzorak u RNeasy spin kolonu koja je već postavljena u

ependorf od 2 ml. Zatvoriti poklopac.

8. Centrifugirati 15 s na 14000 rpm

130

9. Nakon odbacivanja tečnosti koja je prošla kroz kolonu, bez menjanja

ependorfa, dodati 700 µl RW1 pufera u RNeasy spin kolonu.Zatvoriti

poklopac.

10. Centrifugirati 15 s na 14000 rpm

11. Nakon odbacivanja tečnosti koja je prošla kroz kolonu, bez menjanja

ependorfa, dodati 700 µl RPE pufera u RNeasy spin kolonu.Zatvoriti

poklopac.

12. Centrifugirati 15 s na 14000 rpm

13. Nakon odbacivanja tečnosti koja je prošla kroz kolonu, bez menjanja

ependorfa, dodati 700 µl RPE pufera u RNeasy spin kolonu.Zatvoriti

poklopac.

14. Centrifugirati 2 min na 14000 rpm

15. Postaviti RNeasy spin kolonu u novi ependorf od 1.5 ml.

16. Dodati 30–50 µl RNase-free vode direktno na membranu kolonu

17. Zatvoriti poklopac i centrifugirati 1 min na 14000 rpm. RNK ostaje u rastvoru.

Primedba: Ukoliko je planirano odrediti ekspresiju gena, potrebno je uvesti dva

dodatna koraka (eliminaciju genomske DNK i sintezu cDNK).

QuantiTect Reverse Transcription kit kombinuje ova dva koraka.

Sinteza cDNA korišćenjem QuantiTect Reverse Transcription kita (prema QuantiTect

Reverse Transcription Handbook)

Potrebni reagensi:

gDNA Wipeout pufer

“RNAse- free” voda

Quantiscript reverzna transkriptaza

Quantiscript RT pufer

RT prajmer miks

Protokol:

1. Držeći ependorf sa DNK na ledu, dodati 2 μl wipeout pufera i sa “RNAse- free” vodom podesiti zapreminu, tako da finalna zapremina iznosi 14 μl.

2. Inkubirati 2 min na 42ºC (tokom ovog koraka, genomska DNK koja može biti

prisutna kao kontaminant se razgrađuje)

3. Vratiti ependorf na led i dodati 1μl Quantiscript reverzne transkriptaze, 4 μl

Quantiscript RT pufera i μl RT prajmer miksa.

4. Inkubirati 15 min na 42º C (u ovom koraku se sintetiše cDNK)

5. Inkubirati 3 min na 95ºC (kako bi se denaturisala reverzna transkriptaza).

131

PCR u realnom vremenu (Real time PCR)

1. Uvod:

U ovom trenutku, real-time PCR je jedina metoda koja omogućava apsolutnu

kvantifikaciju nukleinskih kiselina. Njegove glavne primene uključuju: detekciju i

kvantifikaciju patogena (Kubista et al., 2006; Yang et al., 2004), detekciju alergena u

hrani (Parfundo et al., 2009), merenje ekspresije gena (Wong et al., 2005), itd. U

zavisnosti od namene, moguće je real time PCR reakciju vršiti sa DNK i/ili RNK kao

templatom.

Nezavisno od toga da li je početni material RNK ili DNK, ključan korak u svakoj real

time procedure je dobiti polazni material zadovoljavajućeg kvaliteta i odabrati “dobre”

prajmere. Uzorak dobrog kvaliteta podrazumeva čistu, nedegradiranu nukleinsku

kiselinu. U slučaju da se prati ekspesija gena, posebnu pažnju treba posvetiti

eliminaciji genomske DNK iz uzorka koji sadrži iRNK. U suprotnom će se tokom

sinteze cDNK i naknadne amplifikacije dobijati lažno visoke vrednosti. Naravno, s

obzirom na to da je “konvencijalni” PCR sastavni deo amplifikacije ciljne sekvence, svi

inhibitori (lipidi, proteini, šećeri, itd.) koji utiču na uspešnost “konvencijalnog” PCR-a

utiču u na real-time PCR reakciju.

Pored toga što moraju da budu specifični, prajmeri za real-time PCR moraju biti stabilni

(što se ogleda kroz vrednosti za Tm i GC sadržaj) i određene veličine (kako bi se

izbeglo pogrešno sparivanje i omogućila amplifikacija). S obzirom da postoje različite

vrste real-time PCR (kao što su dupleks, multipleks, itd.) za svaku od ovih tehnika

postoje dodatni parametri za prajmere (Shen et al., 2010). Ali, nezavisno od vrste real-

time PCR-a, mora se izvršiti analiza sekvence forward ("napred") i reverse ("nazad")

prajmera kako bi se sprečilo stravanje sekundarnih struktura u samim prajmerima ili

obrazovanje prajmer-dajmera. Do stvaranja prajmer-dajmera (primer-dimer) dolazi

kada se prajmeri ne hibridizuju sa templatom već međusobom. Postoji nekoliko

softvera (npr. Primer 3, MPrimer, itd.) koji daju mogućnost da se utvrdi najbolja

sekvenca prajmera zavisno od sekvence ciljnog gena. U tim softverima moguće je

podešavati parametre prajmera kao što su temperature topljenja, GC sadržaj. Takođe

je moguće proceniti mogućnost građenja sekundarnih struktura (uključujući prajmer-

dajmere). Specifičnost prajmera i mogućnost građenja prajmer-dajmera može se

ispitati analizom krive topljenja. U idealnoj situaciji, samo jedan pik treba biti uočljiv na

krivoj. Takođe, pozicija pika mora se poklapati na različitim krivama, tj. sama krive

moraju se preklapati jedna sa drugom. Kao kontrola ekspesije koriste se geni koji

imaju konstantnu ekspesiju (jer su njihovi produkti uključeni u bazične metaboličke

procese). Takvi geni nazivaju se "housekeeping" geni. Takođe kako bi se proverila

efikasnost amplifikacije upotrebljava se interna kontola. Interna kontrola predstavlja

nedegradirani DNK fragment, dodat u poznatoj koncentraciji u reakcionu smešu, i

amplifikovan zajedno sa uzorkom.

Postoje dva osnovna mehanizma praćenja amplifikacije u realnom vremenu. Prvi

pristup koristi tzv. SYBR Green hemiju. SYBR Green je fluorescentna boja koja se

interkalira (ugrađuje se) u dvolančane nukleinske kiseline. Glavni nedostatak SYBR

132

Green pristupa je da se može vezati za bilo koju dvolančanu nukleinsku kiselinu, a ne

samo onu koja je nastala kao proizvod hibridizacije između prajmera i ciljne sekvence.

To dalje znači da će se vezivati i za prajmer-dajmere, što smanjuje specifičnost ovog

metoda u poređenju sa metodom koji koristi TaqMan probe. TaqMan proba je

oligonukleotidna proba koje je specifična za region između regiona koji prepoznaju

forward i reverse prajmer. TaqMan probeima za svaki kraj zakačenu po jednu

fluorescentnu probu. Na 5’ kraju nalazi se fluorofora (ili receptor) a na 3’ kraju "hvatač"

(quencher). Pre PCR reakcije fluorescencija fluorofore je “uhvaćena” (inhibirana)

"hvatačem". Tokom amplifikacije, DNK polimeraza se kreće od 3’ ka 5’ kraju. Na tom

putu ona "susreće" i hidrolizuje fluoroforu sa 5′ kraja. Pošto emisija fluorofore nije više

inhibirana, jer se fluorofora nalazi slobodna u rastvoru, fluorescencija počinje da raste.

Sekvenca TaqMan probe može se dizajnirati u istim softverima koji služe za dizajn

prajmera. Međutim, s obzirom na mehanizam reakcije, parametri za "dobru" TaqMan

probu se razlikuju od parametara za prajmere. Kako bi se obezbedila stabilnost i

specifičnost, preporučena Tm vrednost i dužina za TaqMan probu su veće od istih

vrednosti za prajmere. Pošto guanidine blizu 5' kraja TaqMan probe može inhibirati

fluorescenciju, probe sa takvom sekvencom ne bi trebalo koristiti. Kao i kod prajmera,

treba izbeći srekvence u kojima se javljaju nizovi iste baze (jer se smanjuje efikasnost

hibridizacije, kao posledica stvaranja sekundarnih struktura).

Kvantifikacija se vrši merenjem fluorescencije tokom ciklusa. Fluorescencija će

biti utoliko veća ukoliko je veća koncentracija proizvoda. U početku, broj DNK kopija

je nedovoljan da bi fluorescencija bila veća od granice detekcije. Nakon nekoliko

ciklusa, koncentracija uzorka raste i fluorescencija počinje eksponencijalno da raste.

Pošto je efikasnost reakcije stabilna tokom eksponencijalne faze, Ct vrednost se

izabira tako da reflektuje podatke prikupljene tokom ove faze. Nakon oduzivanja

pozadinskog signala, može se vršiti poređenje koncentracija različitih uzoraka.

2. Materijal, metode i sugestije

Procedura za izvođenje Real time PCR (prema Getting Started Guide Applied

Biosystems 7500/7500 Fast Real-Time PCR System Standard Curve Experiments)

A. Priprema za eksperiment: Pre merenja flourescencije, neophodno je dizajnirati prajmere i pripremiti miks (korak

nanošenja na ploču.

B. Dizajn prajmera:

Među besplatnim on-line softverima za dizajn prajmera i njihovu analizu, najpopularniji

su Primer3 (Thornton et al., 2011) i Primer3Plus koji su dizajnirani od strane NCBI

(National Center for Biotechnology Information). Dizajn i analiza prajmera takođe su

mogući i u softverima koji su pre-instalirani na aparate Real time PCR (u 7500/7500

Fast Real-Time PCR sistem je ugrađen Primer Express v.3 softwer). Premda

procedura za dizajn prajmera za TaqMan Real Time PCR uključuje dodatne korake

za dizajn probe, potrebno je optimizovati nekoliko parametara kako bi se dobila

133

uspešna Real time PCR reakcija. Ti parametri su: dužina prajmera, temperatura

topljenja (Tm), GC sadržaj, veličina produkta, 3′ stabilnost.

Dužina prajmera: ukoliko je prajmer isuviše kratak, zbog nedostatka specifičnosti,

neće doći do hibridizacije sa matricom. Ukoliko je prajmer isuviše dugačak, vreme za

hibridizaciju se produžava i uklanjanje proizvoda je otežano. Optimalna dužina

prajmera je 18–24 baznih parova (bp). Razlika u dužini prajmera ne bi treabalo da

bude više od 3bp.

Temperatura topljenja (Tm) se definiše kao temperature pri kojoj je 50% prajmera

hibridizovalo sa templatom. Suviše visoka Tm će voditi do sekundarnih hibridizacija,

dok će isuviše niska Tm usporavati sam process hibridizacije. Optimalan opseg za Tm

je 57-65oC. Razlika u Tm između forward i reverse prajmera ne bi trebala da bude više

od 5°C (idealno 1 °C).

GC sadržaj se definiše kao broj guanidina i citozina, izražen kao procenat ukupnog

broja baza u prajmeru. GC sadržaj je mera stabilnosti prajmera (stabilnost prajmera

se izražava kroz vrednost ΔG ) i trebao bi da bude 40-60%. Broj guanidina i citozina

u okviru zadnjih 5 baza na 3’ karju prajmera naziva se "GC stega" (GC clamp).

Vrednost za GC "stegu" trebala bi da bude manja od 3, zato što, bez obzira na to što

veći broj G i C ostataka na 3’ kraju povećava specifičnost hibridizacije, takva sekvenca

će dati suviše velike amplikone.

Veličina produkta- fluorescencija tokom SYBR Green detekcije biće intenzivnija

ukoliko je proizvod duži. Idealna veličina amplikona je između 80 i 150 bp. Manji

amplikoni se amplifikuju efikasnije od većih.

3’ stabilnost je izražena kao maksimalna ΔG vrednost zadnjih pet baza na 3’ kraju

prajmera. Veća 3’ stabilnost znači i veća efikasnost prajmera.

Neki dodatni faktori , kao što je npr. koncentracija dvovalentnih jona, možda takođe

treba da se optimizuju (obično SYBR® Green miks sadrži između 3 i 6 mM of Mg2+).

Tokom sinteze prajmera potrebno je obratiti pažnju i na broj ponovaka (repeats) i

nizova (runs), s obzirom da će veći broj ponovaka i/ili nizova dovesti do pogrešnog

sparivanja i/ili formiranja sekundarnih struktura. Ponovci (repeats) su ponovljene

sekvence dinukleotida (maksimlan broj ponovaka treba da bude 4). Nizovi (runs) se

definišu kao broj ponavljanja pojedinačnog nukleotida i njihov preporučeni maksimalni

broj je 3–4 bp. Ukoliko se podešavaju za dizajn TaqMan probe, neophodno je da Tm

probe bude za oko 10°C veće od Tm prajmera (vezivanje za malu brazdu povećaće

Tm probe) i njena veličina bi trebala da bude manja od 30 bp (kako ne bi uticala na

specifičnost). Takođe, trebalo bi izbeći sekvencu sa guanidinom na 5' kraju je može

smanjiti fluorescenciju.

Analiza prajmera može se vršiti u softwerima kao što su Vector NTI i MP primer. U

ovim softverima, moguće je videti kolika je mogućnost građenja sekunadrnih struktura

kao što su "ukosnice" (hairpins) i prajmer-dajmeri.

Koraci:

1. Naći sekvencu u FASTA format - NCBI websajt

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/) → nucleotide database (from dropdown

menu) → in search box enter gene code → search → display settings →

FASTA→ apply

134

Kopirati FASTA sekvencu u novi word-ov dokumeent.

2. NCBI website → tools→ BLAST→ primer BLAST ili alternativno “otići” na

Primer3 websajt (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)

3. Kopirati sekvencu iz word-ovog dokumenta u polje PCR template (ili polje

sequence ID u Primer3)

4. Uneti sekvencu prajmera ili dati opseg za forward i reverse prajmere (u primer

3 softveru označiti opcije: Pick left primer (ili uneti sekvencu prajmera u

polje use left primer below) i Pick right primer (ili uneti sekvencu prajmera u

polje use right primer below); ukoliko se radi sa TaqMan probom takođe

označiti opciju Pick hybridization probe)

5. U exon/intron odeljku, “iseći” sekvencu introna (u primer3 →excluded regions)

6. Promeniti parameter za prajmere ili ostaviti kao default parametre (u Primer3→

General primer picking conditions)

7. Kliknuti get (pick) primers

C. Nanošenje na ploču:

Koristiti mikrotitar ploču sa 96 bunarića. Pored uzorka, 2 tzv.unutrašnja standarda i

slepa proba se takođe nanose na ploču. Slepa proba sadrži sve što je i u uzorku, osim

cDNK. Unutrašnji standardi su tzv. “housekeeping” geni koji kodiraju za proteine koji

su prisutni u svim ćelijama, s obzirom da su uključeni u osnovne metaboličke procese

(npr. gen za GAPDH). U bunariće sa uzorkom se nanosi: 25 µl 2x SYBER Green PCR

Master miksa + 6.2 µl forward prajmera + 6.2 µl reverse prajmera + 6.2 µl uzorka

cDNK+ 6.4 µl RNAse-free H2O. Međutim, koncentracije vode, prajmera i uzorka su

varijabilne i trebaju se “podesiti” pre reakcije.

D. "Run" (umnožavanje)

Pokriti ploču prozirnom folijom i centrifugirati par sekundi (Centrifugiranje se vrši kako

bi se uklonili mehurići vazduha).

Postaviti ploču u “držač ploče” (plate holder) i podesiti sa označenim mestom.

Polako gurajući, zatvoriti fioku.

Iz Setup menija, izabrati opciju run.

U okviru opcije Run Method, moguće je odabrati broj ciklusa i promeniti parametre.

“Default” parametric su sledeći: 1. pre-PCR faza-60ºC, 30s (elongacija)

2. “holding” faza- 95ºC, 10 min (aktivacija Hot-Start DNK polimeraze)

3. “cycling” faza- 92 ºC,15s (denaturacija DNK); praćeno sa 90s na 60 ºC (hibridizacija

prajmera za templat i u slučaju TaqMan Real time PCR-a,hibridizacija i probe za

templat).

Pritisnuti dugme start run.

Primedba: “Run” se može pratiti odabiranjem view plate layout opcije iz menija

amplification plot.

135

3. Zahvalnice:

Autori su zahvalni AREA projektu (FP7-REGPOT-0212-2013–I) i Univerzitetu u

Parmi, Departmanu za prirodne nauke na treningu i ekspertizi.

Pitanja:

1. Koje se metode mogu upotrebiti za određivanje zaštićene oznake porekla?

2. Šta su prednosti i mane gen-specifične PCR tehnike u poređenju sa qPCR

metodom za detekciju genetski modifikovanih organizama u hrani?

3. Koja jedinjenja mogu delovati kao PCR inhibitori i koji su dodatni koraci koje je

neophodno primeniti prilikom homogenizacije uzoraka koji sadrže veliku

količinu datih jedinjenja?

4. Šta su prednosti i mane upotrebe “tradicionalnih” metoda ekstrakcije DNK

prilikom prečišćavanja uzorka u poređenju sa ekstrakcijom korišćenjem kitova?

5. Koji se problemi mogu javiti prilikom ekstrakcije RNK iz hrane i kako se ti

problemi mogu prevazići?

4. Literatura

Agrimonti, C., Vietina, M. Pafundo, S., Marmiroli, N. (2011).The use of food genomics

to ensure the traceability of olive oil.Trends in food science and technology 22: 237-

244.

Berdal, K.G., Holst-Jensen, A. (2001). Roundup Ready soybean event-specific real-

time quantitative PCR assay and estimation of the practical detection and

quantification limits in GMO analyses. European Food Research and Technology

213: 432–438.

Colatat, M. Effect of Homogenization Method on DNA Yield and Fragment Size.

(http://opsdiagnostics.com/applications/nucleicacids/homogdnacompare.htm)

Corbisier, P., Broothaerts, W., Gioria, S., Schimmel, H., Burns, M., Baoutina, A.

(2007). Toward metrological traceability for DNA fragment ratios in GM quantification.

1. Effect of DNA extraction methods on the quantitative determination of Bt176 corn

by Real-Time PCR.Journal of Agriculture and Food Chemistry 55:3249–3257.

Cserháti, T., Forgács, E., Deyl, Z., Miksik, I. (2005). Chromatography in authenticity

and traceability tests of vegetable oils and dairy products: a review. Biomedical

Chromatography 19: 183-190.

Dal Cin, V.; Danesin, V.; Rizzini, M.F. and Ramina, A. (2005). RNA Extraction From

Plant Tissues. The Use of Calcium to Precipitate Contaminating Pectic Sugars

Molecular biotechnology 31: 113-119.

136

Galimberti, A., De Mattia, F., Losa, A., Bruni, I., Federici, S., Casiraghi, M., Martellos,

S., Labra, M. (2013). DNA barcoding as a new tool for food traceability Food research

international 50: 55-63.

Ganopoulos, I., Argiriou, A., Tsaftaris, A. (2011). Microsatellite high resolution

melting (SSR-HRM) analysis for authenticity testing of protected designation of origin

(PDO) sweet cherry products Food Control 22:532-541.

Gasparic, M.B., Tengs, T., La Paz, J.L., Holst-Jensen, A., Pla,, M., Esteve, T., Zel,

J., Gruden, K. (2010). Comparison of nine different real-time PCR chemistries for

qualitative and quantitative applications in GMO detection Analitical and Bioanaltical

Chemistry 396:2023–2029.

Getting Started Guide Applied Biosystems 7500/7500 Fast Real-Time PCR System

Standard Curve Experiments (6), Part Number 4387779 Rev. C 06/2010

Ghawana, S.; Paul, A; Kumar, H.; Kumar., A.; Singh, H.; Bhardwaj, P.A.; Rani, A.:

Singh, S.R., Raizada, J.; Singh, K.; Kumar, S. (2011). An RNA isolation system for

plant tissues rich in secondary metabolites BMC Research Notes 4:85.

Gryson, N. (2010). Effect of food processing on plant DNA degradation and PCR-

based GMO analysis: a review Analitical and bioanalitical chemistry 396:2003–2022.

Hrncirova, Z., Bergerova, E., Siekel, P. (2008). Effects of technological treatment on

DNA degradation in selected food matrices of plant origin Journal of Food and

Nutrition Reserach 47(1):23–28.

Johnson, T.J.M.; Carpenter, J.E.; Tian, Z.; Bruskiewich, R; Burris, N.J.; Carrigan, C.;

Chase, W.M.; Neil, D.C.; Covshoff, S.; dePamphilis W.C.; Edger, P.P.; Goh, F.;

Graham, S.; Greiner, S.; Hibberd, J.M.; Jordon Thaden I.; Kutchan, T.M.; Leebens-

Mack, J.; Melkonian, M.; Miles, N.; Myburg, H.; Pires, J.M.; Ralph, P.; Rolf, M.; Soltis,

D.; Soltis, P.; Stevenson, D.; Stewart, C.N.J.; Thomsen, J.M.C.; Villarreal, J.C.; Wu,

X.; Zhang, Y.; Sage, R.F.; Surek, B; Deyholos, M.K.; Ka-Shu Wong, G. (2012).

Evaluating Methods for Isolating Total RNA and Predicting the Success of

SequencingPhylogeneticallyDiverse Plant Transcriptomes PLoS ONE 7(11):e50226.

Kim, J. H., Kim, S. Y., Lee, H., Kim, Y. R. and Kim, H. Y. (2010). An event-specific

DNA microarray to identify genetically modified organisms in processed foods

Journal of agricultural and food chemistry 58(10): 6018–6026.

Kubista M., Andrade J.M., Bengtsson M., Forootan A., Jonák J., Lind K., Sindelka

R., Sjöback R., Sjögreen B., Strömbom L., Ståhlberg A., Zoric N (2006). The real-

time polymerase chain reaction. Molecular Aspects of Medicine 27: 95-125.

137

Lepinske, M. Tips for Working with RNA and Troubleshooting Downstream

Applications (1997). Promega Notes Magazine, 63:17-22.

Lincoln, J.E., Richael, C.,Overduin, B., Smith, K., Bostock,R., Gilchrist, D.G.

Expression of the antiapoptotic baculovirus p35 gene in tomato blocks programmed

cell death and provides broad-spectrum resistance to disease (2002). Proceedings

of National Acadamy of Scienies99(23): 15217-15221.

Luykx, M.A.M.D., van Ruth, M.S. D. (2008). An overview of analytical methods for

determining the geographical origin of food products. Food Chemistry 107: 897–911.

MacRae E (2007). Extraction of Plant RNA Methods in Molecular Biology, vol. 353:

Protocols for Nucleic Acid Analysis by Nonradioactive Probes, Second Edition.Edited

by: E. Hilario and J. Mackay, Humana Press Inc., Totowa, New Jork.

Marmiroli, N. Peano, C., Maestri, E. (2003). Advanced PCR techniques in identifying

food components in Food authenticity and traceability, ed. Lees, M., CRC Press,

Boca Raton Boston New York Washington, Woodhead Publishing Limited, pp.1-33

Mesnage,R., Clair, E., Gress, S., Then, C., Székács, A., Séralini, G.E. (2013).

Cytotoxicity on human cells of Cry1Ab and Cry1Ac Bt insecticidal toxins alone or with

a glyphosate-based herbicide. Journal of Applied Toxicology 33(7): 695–699.

Miller, D.N., Bryant, J. E., Madsen, E.L., Ghiorse, W. C (1999). Evaluation and

optimization of DNA extraction and purification procedures for soil and sediment

samples. Applied and environmental microbiology 65(11)4715–4724.

Ogasawara, T., Arakawa, F., Akiyama, H., Goda, Y., Ozeki, Y (2003). Fragmentation

of DNAs of processed foods made from genetically modified soybeans. Japanese

Journal of Food Chemistry 10(3):155–160.

Parfundo S., Gulli M., Marmiroli N. (2009). SYBR-Green Real-time PCR to detect

almond traces in processed food.Food Chemistry 116: 811–815.

Pirondini, A., Bonas, U., Maestri, E., Visioli, G., Marmiroli, M., Marmiroli, N. (2010).

Yield and amplificability of different DNA extraction procedures for traceabilityin the

dairy food chain. Food Control 21: 663–668.

Primrose, S., Woolfe, M., Rollinson, S (2010). Food forensics: methods for

determining the authenticity of foodstuffs. Trends in food science and technology 21:

582-590.

QuatiTect Reverse Transcription Handbook, Qiagen, 03/2009

138

Randhawa, G.J., Singh, M., Sood, P (2016). DNA-based methods for detection of

genetically modified events in food and supply chain.Current science 110.

Uncorected proof.

Rio D.C; Ares M Jr; Hannon G.J.; Nilsen T.W (2010). Purification of RNA using

TRIzol (TRI reagent). Cold Spring Harbor Protocols 6doi: 10.1101/pdb.prot5439.

RNeasy Mini Handbook, Qiagen, 06/2012

Shen Z., Qu W.,Wang W., Lu Y, Wu Y, Li Z, Hang X., Zhao D., Zhang C and Wang

X (2010). MPprimer: a program for reliable multiplex PCR primer design. BMC

Bioinformatics 11: 143-149.

Tengel, C., Schüßler, P., Setzke, E., Balles, J.,Sprenger-Haußels, M. (2001). PCR-

based detection of genetically modified soybean and maize in raw and highly

processed foodstuffs. BioTechniques 31:426-429.

Terry, C., Harris, N. and Parkes, H. (2002). Detection of genetically modified crops

and their derivatives: critical steps in sample preparation and extraction.Journal of

AOAC International. 85(3): 768-774.

Thornton B. and Basu C. (2011).Real-time PCR (qPCR) primer design using free

online software. Biochemistry and molecular biology education 39 (2): 145-154.

Tung Nguyen, C. T., Son, R., Raha, A. R., Lai, O. M., Clemente Michael, W. V. L.

(2009). Comparison of DNA extraction efficiencies using various methods for the

detection of genetically modified organisms (GMOs). International Food Research

Journal 16: 21-30.

Turci, M., Sardaro, M., Visioli, G., Maestri, E., Marmiroli, M., Marmiroli, N. (2010)

Evaluation of DNA extraction procedures for traceability of various tomato products.

Food Control 21: 143–149.

User guide PrepFiler™ Forensic DNA Extraction Kit. Applied Biosystem, Part

Number 4390932 Rev. B 11/2008, 2008.

Van den Bulcke, M., Lievens, A., Barbau-Piednoir, E., MbongoloMbella,

G., Roosens, N., Sneyers, M., Casi, A.L.(2010). A theoretical introduction to

"combinatory SYBRGreen qPCR screening", a matrix-based approach for the

detection of materials derived from genetically modified plants. Analitical and

bioanalitical chemistry. 396(6): 2113-23.

Vasanthaiah, K.N.H.; Katam, R.; Sheikh, B.M. (2008).Efficient protocol for isolation

of functional RNA from different grape tissue rich in polyphenols and polysaccharides

139

for gene expression studies. Electronic Journal of Biotechnology 11(3), DOI:

10.2225.

Vinci, G., Preti, R., Tieri, A., Vieri, S. (2013). Authenticity and quality of animal origin

food investigated by stable-isotope ratio analysis. Journal of Science of Food and

Agriculture. 93(3):439-48.

Wen-Tao, X., Wei-Bin, B., Yun-Bo, L., Yan-Fang, Y., Kun-Lun, H. (2009). Research

progress in techniques for detecting genetically modified organisms. Chinese Journal

of Agricultural Biotechnology 6(1): 1–9.

Wilson, G.I. (1997). Minireview: Inhibition and facilitation of nucleic acid amplification.

Applied and environmental microbiology 63(10):3741-3751.

Wong M.L. and Medrano J.F. (2005). Real-time PCR for mRNA quantitation.

BioTechniques 39:75-85.

Woodcock, T, Fagan, C., O’Donnell, C., Downey, G. (2008). Application of near and

mid-infrared spectroscopy to determine cheese quality and authenticity. Food

Bioprocess Technology 1:117–129.

Yang S., Rothman RE. (2004). PCR-based diagnostics for infectious diseases: uses,

limitations, and future applications in acute-care settings. Infectious Diseases 4:337-

348.

140

Primena molekularnih metoda u akvakulturi i ribarstvu

Zorka Dulić, Božidar Rašković, Saša Marić, Tone-Kari Knutsdatter

Østbye

Izvod

Rana istraživanja u akvakulturi su uglavnom bila orijentisana na ispitivanje različitih

sistema gajenja, usmerena na poboljšanje rasta riba i tipa hraniva. Ogroman napredak

molekularne biologije tokom prošlog veka je u velikoj meri uticao na razvoj genetičkih

istraživanja i primenu molekularnih metoda u akvakulturi i ribarstvu. Ove metode su

značajno doprinele povećanju efikasnosti proizvodnje, boljem kvalitetu finalnog

proizvoda kao i poboljšanjom zdravlju gajenih životinja. Takođe, DNK bazirane metode

su omogućile veliki napredak u identifikaciji vrsta, praćenju familija, određivanju

pedigrea individua, utvrđivanju genetskih linija kao i identifikaciju markera i lokusa

odgovornih za ekonomski važne osobine. U ovom radu poseban značaj pridajemo

primeni polimorfizma dužine restrikcionih fragmenata (RFLP) u akvakulturi i ribarstvu

kao praktičnoj i relativno jeftinoj metodi za određivanje genetskih linija polimorfnih

vrsta riba. Takođe se fokusiramo na ekspresiju gena kao odličnu metodu za

razumevanje fizioloških procesa u ribama. Trenutno je kvantitativan real-time PCR

jedna od najboljih metoda za analizu ekspresije gena. Veoma je precizna, osetljiva i

daje relativno brze rezultate. Znanje dobijeno iz brojnih istraživanja ekspresije gena je

omogućilo bolje razumevanje fiziologije riba u akvakulturi sa ciljem postizanja veće

ekonomičnosti i održivosti u isto vreme.

1. Uvod

Identifikacija vrsta riba je tradicionalno bazirana na spoljašnjim morfološkim

karakteristikama koje podrazumevaju oblik tela, boju, veličinu krljušti, poziciju i veličinu

peraja kao i relativnu veličinu različitih delova tela (Strauss and Bond 1990).

Kod sličnih vrsta riba koje se teže morfološki razlikuju kao značajan sistematski

karakter može se koristiti broj branhiospina (procednih nastavaka škrga). Morfološke

karakteristike otolita, telašaca smeštenih u unutrašnjem uhu riba, se takođe koriste

radi klasifikacije, utvrđivanja starosti iIi veličine jedinke. Ova struktura se pokazala kao

značajna i kada je potrebno identifikovati vrstu riba iz fosilnih ostataka ili iz crevnog

sadržaja nekog predatora (Granadeiro and Silva 2000).

Međutim, u nekim slučajevima spoljašnje morfološke karakteristike nisu dovoljne za

identifikaciju, čak i kada se radi o celim jedinkama, bilo zbog velikog intraspecijskog

varijabiliteta ili malih interspecijskih razlika (Teletchea 2009). Zatim, identifikacija riba

koje su delimično degradirane usled digestije (iz crevnog sadržaja predatora) ili usled

procesovanja (npr. fileti ili konzervirana riba) nije moguća na osnovu morfoloških

karakteristika. Takođe, identifikacija vrsta na nivou ranih životnih stadijuma, kao što

su jaja ili larve riba je mnogo teža nego identifikacija adultih stadijuma. Zbog svih ovih

141

razloga istraživači su želeli da razviju nove metode, koje će omogućiti pouzdanije

utvrđivanje identiteta riba od morfoloških karakteristika.

Povećanje međunarodne trgovine ribama i drugim vodenim organizmima, povećanje

količine konzumirane ribe, variranja u ponudi određenih proizvoda i vrsta riba je dovelo

i do brojnih ilegalnih radnji i prevara kao što su zamene jedne vrste ribe (obično

skuplja) sa drugom (obično jeftinija), naročito kad su u pitanju filetirani ili na drugi način

tehnološki izmenjeni proizvodi (Rasmunsen et al. 2008). Izuzetno je važno znati niz

podataka o proizvodu radi sprečavanja ovih pojava. Zbog toga je danas zakonski

regulisana identifikacija i potvrđivanje “identiteta” proizvoda od riba (npr. zamrznutih

fileta, konzerviranih proizvoda) pouzdanijim metodama nego što su to morfološki

karakteri. Evropska Unija je donela zakon o obeležavanju riba i proizvoda iz

akvakulture (Regulation (EC) No 104/2000). Oznaka treba da sadrži informacije o kojoj

se vrsti radi, o poreklu ribe i načinu proizvodnje.

Tradicionalne i zvanične metode za identifikaciju različitih vrsta organizama,

ukljućujući i ribe, su bazirane na separaciji iIi karakterizaciji specifičnih proteina

korišćenjem tehnika elektroforeze, tečne i gasne hromatografije ili upotrebe

imunoloških reakcija (ELISA) (Moretti et al. 2003, Kvasnicka 2005, Hubalkova et al.

2007). Iako sve ove metode imaju značaja u identifikaciji, zapravo nisu dovoljno

praktične za rutinske analize pre svega zbog podložnosti proteina brzoj promeni

bioloških karakteristika, termolabilnosti, kao i njihovom variraju u zavisnosti od vrste

tkiva, starosti jedinke i statusa.

Kao alternativa analizi proteina, tokom 20. veka su se razvile DNK bazirane metode

za identifikaciju riba i drugih organizama. Prednost korišćenja DNK metoda je pre

svega u karakteristikama ovog molekula, njegovoj većoj rezistentnosti i

termostabilnosti u odnosu na proteine kao i mogućnosti da se upotrebom PCR-a

amplifikuju mali fragmenti DNK koji će dati dovoljno informacija za identifikaciju vrste

(Lenstra 2003).

DNK se može dobiti iz bilo kog supstrata jer je prisutna u svim ćelijama nekog

organizma. Zahvaljujući razvoju molekularne biologije, identifikacija riba je moguća iz

različitih tkiva kao što su mišići, peraja ili krv.

Postoji nekoliko molekularnih tehnika koje se danas najčešće koriste u identifikaciji

riba, a to su RFLP (restriction fragment length polymorphism), PCR sekvencioniranje

(poznato još i kao FINS - forensically informative nucleotide sequencing) i PCR

specific primers. Od novijih metoda se primenjuju i real-time PCR i microarray

tehnologija (Teletchea 2009).

U programima selekcije riba, DNK bazirane metode se koriste za praćenje familija,

utvrđivanje pedigrea jedinki, identifikaciju linija, određivanje markera kao i lokusa koji

su odgovorni za ekonomski važne osobine kao što su prirast, preživljavanje, polna

zrelost, otpornost na bolesti, deformiteti i efikasnost u usvajanju hrane (Davis and

Hetzel, 2000).

142

1.1 Primena Restriction fragment length polymorphism (RFLP) u akvakulturi i ribarstvu

RFLP spada u metode koje su jednostavnije, jeftinije i robusnije u odnosu na druge

(Aranishi 2005). Bazirana je na polimorfizmu u dužini određenih restrikciono isečenih

framenata generičkog koda (Rasmunsen et al. 2008). Metoda se sastoji u tome da se

željeni geni amplifikuju u PCR-u a zatim se restriktivnim endonukleazama selektivno

seku na određeni broj fragmenata različite dužine (Liu and Cordes 2004). Različiti

fragmenti se odvajaju pomoću gel elektroforeze. Zatim se gel izloži UV svetlu u

transluminatoru i slika. Uz pomoć DNK standarda (ladder), odredi se razlika u dužini

fragmenata i na taj način se određuje pripadnost određenoj vrsti ili liniji riba.

Ova metoda je posebno pogodna za identifikaciju genetičke udaljenosti između

različitih populacija iste vrste riba, sa šireg geografskog područja. Veoma je bitno da

date populacije riba poseduju relativno visoku polimofnost, odnosno da se jedinke iz

različitih populacija nisu često ukrštale.

Za identifikaciju linija riba koje nisu visoko polimorfne koriste se neke od pomenutih

metoda ili mikrosateliti.

1.2 Primena kvantitativnog PCR-a (qPCR) u akvakulturi

Značajan kao što su embrionalni i adultni rast, efikasnost usvajanja nutrijenata,

otpornost na bolesti i drugo, se primenjuje u brojnim istraživanjima u akvakulturi

(Nilsen and Pavey 2010). Velika količina znanja dobijena iz ovih istraživanja deo

istraživanja u ribarstvu i akvakulturi je usmeren na ekspresiju gena kao metode za

bolje razumevanje fizioloških procesa kod vodenih organizama, pre svega riba

(Overturf 2009). Evaluacija gena koji učestvuju u različitim biološkim procesima

omogućila je bolje razumevanje fiziologije riba u akvakulturi sa ciljem postizanja veće

ekonomičnosti i održivosti u isto vreme.

Kvantitativna real-time PCR (qPCR) se smatra za jednu of najkvalitetnijih metoda za

analizu ekspresije gena. Razlikuje od drugih metoda za ekspresiju gena zbog svoje

značajne preciznosti, senzitivnosti metode, dobre reproduktibilnosti, kao i brzih

rezultata (Derveaux et al. 2010). Iako je ova metoda relativno jednostavna za

korišćenje, veoma je važno primeniti intenzivnu kontrolu kvaliteta celog procesa, jer

nepreciznosti u sprovođenju protokola mogu značajno uticati na tačnost rezultata i

verodostojnost zaključaka istraživanja.

Dok tradicionalni end-point PCR omogućava samo utvrđivanje prisustva ili odsustva

određenog genskog produkta, preimućstvo real-time qPCR je u merenju broja kopija i

detekciji malih razlika u nivou ekspresije između uzoraka tokom samog toga procesa

amplifikacije. Detekcija PCR produkata je omogućena uključivanjem fluorescente boje

u reakciju što omogućava registrovanje povećanja količine DNK, time što se

fluorescentni molekul vezuje za molekul DNK. Izmerena fluorescencija u qPCR mašini

odgovara količini amplifikovanog produkta u svakom ciklusu amplifikacije. Najčešće

korišćena fluorescentna boja koja se vezuje za molekul DNK je SYBR Green I. Ova

boja se nespecifično vezuje za dvostruki molekul DNK a intenzitet fluorescencije u se

143

povećava i do 1000 puta prilikom spajanja sa DNK. Ct ili threshold cycle je vrednost

koja ukazuje na broj ciklusa amplifikacije pri kojoj fluorescentni signal reakcije prelazi

nivo praga (background fluorescence) (Grafikon 1). Što je manji broj ciklusa odnosno

što je niža vrednost Ct (<29) to je više produkta amilifikacije.

Grafikon 1. Tok procesa amplifikacije u qPCR mašini

Korišćenje metode relativne ekspresije gena je bazirana na razlikama u nivou

ekspresije target gena (gen koji se ispituje) u odnosu na jedan ili više referentnih gena

(geni čija ekspresija nije pod uticajem tretmana koji primenjujemo). Pre identifikacije

referentnog gena potrebno je proveriti njegovu ekspresiju. Postoji nekoliko onlajn

programa koji se mogu koristiti za vrednovanje gena kao što je na primer

http://fulxie.0fees.us/. Dobijene Ct vrednosti gena se ubace u program koji izračuna

koji je najstabilniji gen.

Za izračunavanje ekspresija target gena u odnosu na željeni referentni gen, mogu se

koristitii različiti matematički modeli. Jedan od često korišćenih modela je delta delta

Ct:

2^ (-ddCt), gde je ddCt = (Ct target gena tretiranog– Ct referentnog gena tretiranog) -

(Ct kontrola target gena– Ct kontrola referentnog gena)

144

Oprema Aquacarp laboratorije:

2. Materijal, metode i napomene

2.1 Upotreba PCR-RFLP za određivanje genetičkih linija visoko polimorfnih vrsta riba, potočne pastrmke (Salmo trutta)

Ova metoda koristi dva različita gena: jedarni gen za laktat dehidrogenazu(LDH) i

mitohondrijalni gen za kontrolni region mitohondrijalne DNK (CR mtDNK).

2.1.1 Izolacija DNK

Za izolaciju DNK je korišćen komercijalni kit (ZR Genomic DNA™-Tissue MiniPrep Kit,

Zymo Research, Irvine, USA) i sledeća procedura je data po uputstvu proizvođača:

- Odseći oko 25 mg peraja ribe i ubaciti u ependorf epruvetu od 1.5 ml

- U svaku epruvetu dodati:

H2O 95 μl

2X Digestion Buffer 95 μl

Proteinase K 10 μl

- Vorteksovati smešu i inkubirati u termostatu na temperaturi od 55°C od 1 do 3 sata

(opciono preko noći). Nakon sat vremena od početka inkubacije protresti epruvetu

par puta da se peraje što bolje razgradi.

- Nakon završetka inkubacije u istu pipetu dodati 700 μl Genomic Lysis Buffer i dobro

vorteksovati. Centrifugirati na 10,000xg 1 min da bi se uklonio ćelijski debris. (1 g = 1

RCF)

145

- Spin kolonu (Zymo-Spin™ IIC Column) staviti u 2 ml ependorf epruveta bez poklopca

(collection tube)

- Prebaciti supernatant u spin kolonu. Centrifugirati na 10,000xg 1 min (vezivanje DNK

za membranu).

- Ukupna zapremina collection tube-a je 1 ml. Da ne bi prelila, treba prebaciti spin

kolonu u novu collection tube i dodati u spin kolonu 200 μl DNA Pre-Wash Buffer.

Centrifugirati na 10,000xg 1 min (ispiranje DNK I).

- Dodati 400 μl g-DNA Wash Buffer u kolonu. Centrifugirati na 10,000xg 1 min

(ispiranje DNK II).

- Prebaciti spin kolonu u čistu, 1.5 ml mikrotubicu sa poklopcem. Dodati ≥50 μl DNA

Elution Buffer ili Milli-Q vode (npr. ukoliko je korišćeno 25 mg tkiva sa peraja - dodati

200 μl tečnosti) u spin kolonu. Inkubirati 2-5 minuta na sobnoj temperaturi, i potom

centrifugirati na maksimalnoj brzini 30 sekundi da bi se DNK eluirala. Eluirana DNK

može biti korišćena odmah ili čuvana na ≤-20ºC i upotrebljena u budućnosti.

Ako se izolovana DNK koristi za PCR reakcije u narednih par nedelja, onda može

stajati u frižideru.

2.1.2 Selekcija prajmera

Za CRmtDNA gen korišćeni su prajmeri 28RIBa i CytR a za LDH gen Ldhxon3F and

Ldhxon4F (Tabela 1). Ovi prajmeri su selektovani jer su se pokazali kao uspešni u

determinaciji Atlantskih i Dunavski linija pastrmki u prethodnim istraživanjima (McMeel

et al.2001; Maric et al. 2010).

Tabela 1. Prajmeri i njihove sekvence korišćeni u protokolu

Naziv prajmera Sekvenca Gen

Ldhxon3F GGCAGCCTCTTCCTCAAAACGCCCAA LDH

Ldhxon4R CAACCTGCTCTCTCCCTCCTGCTGACGAA LDH

28Riba CACCCTTAACTCCCAAAGCTAAG CR mtDNA

CytR GTGTTATGCTTTAGTTAAGC CR mtDNA

Prajmeri se isporučuju u liofilizovanom obliku, u vidu praha. Da bi se rastvorili u njih

se mora dodati MilliQ H2O i to tako što se doda 10x viže µl H2O od ukupnog broja

nmol:

npr.: prajmer 28Riba ima ukupno 31.6 nmol i u njega treba dodati 31.6 x 10 µl = 316

µl H2O

Radni rastvor se pravi tako što se razblaži 10x (u ependorf epruvetu se sipa 10 µl

rastvora i 90 µl H2O). Oba rastvora se čuvaju zaleđeni u frižideru.

146

2.1.3 PCR RFLP protokol za LDH i CR mtDNK gene

Da bi se uradila PCR reakcija, prvo je potrebno napraviti PCR Mix. Da bi se on

napravio, prvo se izvade svi sastojci (osim Taq polimeraze) i sačeka se da se odlede.

Dok se sastojci odleđuju, u stalak za hlađenje se stave PCR ependorf epruvete (0.2

ml) i u svaku od njih se stavi 1 µl uzorka DNK (eluirana DNK). Broj PCR ependoft

epruveta zavisi od broja uzoraka riba koje želimo da analiziramo (10 riba - 10 PCR

ependorf epruveta). Kada se sastojci odlede, potrebno je napraviti Mix tako što se u

stalak za hlađenje stavi i jedna ependorf epruveta od 1.5 ml i u njoj se smućkaju

sastojci u datom odnosu.

Receptura za 10 reakcija; ukoliko se radi više ili manje-potrebno je preračunati ovaj

broj:

171.5 µl MilliQ H2O

25 µl pufera A

12.5 µl MgCl2

10 µl dNTP

10 µl radnog rastvora prajmera F

10 µl radnog rastvora prajmera R

1.5 µl Taq polimeraza

Polimeraza se dodaje na kraju, jako brzo i vodi se računa da ne stoji predugo na

sobnoj temperaturi. Mix se vorteksuje i u svaku PCR ependorf epruvetu se dodaje 24

µl:

1 µl DNK + 24 µl Mix-a

Kada se pravi Mix, uvek se pravi za jednu reakciju više od broja koji želimo da

analiziramo (npr. ukoliko analiziramo DNK 10 riba, napravićemo Mix u količini za 11,

za svaki slučaj). Sve vreme PCR ependorf epruvete stoje u stalku za hlađenje. Ukoliko

stalak za hlađenje promeni boju, uzme se novi iz zamrzivača, tubice se premeste u

njega i nastavi se sa radom. Uključiti PCR mašinu i sačekati da temperatura poklopca

dostigne 100°C, doneti ependorf epruvete u stalku za hlađenje i što brže ih staviti u

PCR mašinu. Program zavisi od gena koji se analizira:

Mitohondrijalni gen (CR mtDNK)

1. korak: 94°C - 3 min

2. korak: 94°C - 45 sec*

3. korak: 54°C - 45 sec*

4. korak: 72°C - 1 min 20 sec*

5. korak: 72°C - 10 min

6. korak: 10°C - ∞

*** koraci 2-4 se ponavljaju 32 puta

Jedarni gen (LDH)

1. korak: 94°C - 3 min

2. korak: 94°C - 45 sec*

147

3. korak: 62°C - 45 sec*

4. korak: 72°C - 1 min*

5. korak: 72°C - 10 min

6. korak: 10°C - ∞

*** koraci 2-4 se ponavljaju 32 puta

Nakon završetka programa PCR produkt se čuva u frižideru na +4°C par nedelja.

Ukoliko je potrebno da se produkt sačuva na duže vreme, mora se zamrznuti.

2.1.4 Razdvajanje LDH i CR mtDNA restriciono isečenih fragmenta

Pre nego što se pristupi elektroforezi, obavezno je napraviti agarozni gel i izliti ga u

kadicu, kao i pufer, koji predstavlja elektrolit koji omogućava provođenje struje.

Priprema 1.5% agaroznog gela

Ukupna količina gela koju je potrebno pripremiti je 140-150 ml.

Za 140 ml:

- Izmeriti 210 g agaroze na analitičkoj vagi u maloj čaši.

- Prebaciti agarozu u erlenmajer.

- Sipati 140 ml TBE x0.5 pufera.

- Erlenmajer staviti u mikrotalasnu rernu i pokriti ga dnom petri šolje. Uključiti

na najjače i pustiti da provri. Kada provri ugasiti mikrotalasnu, promućkati

agarozu da se potpuno rastvori i pustiti još 10 sekundi da vri.

- Kada se rastvor malo prohladi (mora da bude tečan, ali ne potpuno hladan jer

će se stvrdnuti) sipati ga u kadicu u koju su prethodno stavljeni češljevi i

branici.

- Sačekati da se gel ohladi i pažljivo izvaditi češljeve.

Receptura za TBE x5 pufer:

Tris - 54.48 g

Borna kiselina - 27g

EDTA 10 ml 0.5 M rastvora

Destilovana H20 do 1000 ml

U malo destilovane vode sipati Tris, pa promešati. Potom dodati bornu kiselinu, pa

promešati. Ove dve supstance će se lako rastvoriti u vodi. Napraviti EDTA pufer i

čuvati ga u frižideru u normalnom sudu. Kada se koristi za elektroforezu, koristi se

TBE x0.5 pufer. On se pravi tako što se TBE x5 pufer razblaži 10 puta sa destilovanom

vodom(u menzuru sipati 100 ml TBE x5 pufera i 900 ml destilovane vode). TBE x0.5

pufer može da stoji na sobnoj temperaturi dok se ne potroši.

Napomena: Voditi računa da se elektroda za merenje pH vrednosti ne stavi u Tris, jer

će doći do uništavanja elektrode ovom substancom.

Pripremanje standardnog pufera (Buffer Blue)

Plavi pufer služi kao nosač za nanošenje uzoraka na gel:

148

Destilovana H20 - 1 ml

Glicerol - 0.5 ml

Jako malo praha Bromophenol Blue (dovoljno da oboji rastvor)

Napraviće se dve faze (glicerol i voda), ali će se nakon malo dužeg vorteksovanja (20-

tak sekundi) faze sjediniti. Boja varira od crvene (ukoliko je pH vrednost niska) do

plave (ukoliko je pH neutralan ili viši od 7). Vorteksovati pre svakog korišćenja. Može

da stoji na sobnoj temperaturi u mraku

Gel elektroforeza

Nakon što se gel ohladi staviti kadicu u aparat za elektroforezu, skinuti branike sa

strane i naliti TBE x0.5 pufer da prekrije gel. Iseći komad parafilm i na njega naneti od

5-20 µl uzorka (eluirana DNK ili PCR produkt ili produkt restrikcionog isecanja-više

detalja ispod slike 1) u kapljicama, razmaknute 2-3 cm jedna od druge. Pored ovih

kapljica, na kraju treba napraviti kapljicu od 5 µl ladder-a koji služi kao standard. U

svaku od tih kapljica dodati 0.5 µl Midori green-a (hemikalija koja se drži u frižideru, a

ne u zamrzivaču), osim tamo gde se nalazi ladder, gde treba dodati 1 µl Midori green-

a. Nakon Midori green-a u svaku kapljicu treba dodati i 2-3 µl plavog pufera. Kada se

to završi, parafilm sa kapljicama se prenese do gela i u svaki bunarčić se prenese

kapljica. Obavezno se zapiše koji uzorak je u kom bunarčiću. U prvi (ili poslednji)

bunarčić se stavlja ladder. Podesiti struju na mašini da napon konstanto iznosi 120 V.

Osim podešavanja napona, treba pojačati i jačinu struje i snagu tako da tokom rada

elektroforeze napon konstantno iznosi 120 V.

2.1.5 Slikanje gela

Uključiti aparat za slikanje gela i pritisnuti dugme „Live“. Ubaciti USB u port sa desne

strane aparata. Zaustaviti struju nakon 45-60 minuta elektroforeze, podići poklopac i

izvući i ocediti kadicu. Kadicu zajedno sa gelom treba preneti do aparata, otvoriti vrata

aparata i malo izvući ploču za slikanje da bi bilo lakše da se gel prenese. Gel postaviti

na ploču tako da nema balončića vazduha ispod njega. Gurnuti ploču sa gelom do

kraja, zatvoriti vrata i uključiti UV svetlo (postoji dugme na aparatu). Pošto gel nekada

klizi, preporučljivo je staviti komad plastike ispod gela, da ga drži, da ne bi klizao

nadole. Podesiti kontrast i jačinu stiskajući dugme „+“ ili „-“ dok se ne dobije

zadovoljavajući kvalitet slike. Podesiti zum i fokus na objektivu ručno (objektiv se

nalazi na vrhu aparata). Slikati gel pritiskom na dugme „Freeze“. Ukoliko se USB

nalazi u aparatu, slika će automatski biti sačuvana u folderu „Images“ na USB-u (Slika

1.). Ukoliko ovaj folder ne postoji, aparat će ga automatski kreirati, a ukoliko USB nije

u aparatu, slika će biti sačuvana u internoj memoriji aparata. Gel treba odmah slikati,

jer će u suprotnom, nakon nekoliko sati DNK postati nevidljiva.

149

Slika 1. Slikani gel dobijen RFLP metodom izabranih gena potočne pastrmke

Produkti digestije se mogu videti na Sl.1. Sa leve strane lestvice je restrikcija radjena

SatI enzimom na kontrolnom regionu mtDNK (1088 bp) i prikazani su fragmenti 4

uzorka (A4, A5, P4, P5). Kontrolni region mtDNK osteje neisečen, ukoliko je dunavska

linija u pitanju, dok su uzorci atlantske linije isečeni na dva fragmenta (654 i 434 bp).

Sa desne strane lestvice je restrikcija BseLI endonukleazom na genu za laktat

dehidrogenazu (428 bp) i prikazani su fragmenti 6 uzoraka (A1-A3 i P1-P3). Ribe

poreklom iz dunavske linije ostaju neisečene, dok se uzorci atlantske linije seku na

dva fragmenta (353 i 75 bp; fragmenti veličine 75 bp su suviše mali da bi bili uočeni

na gelu).

2.2 Ekspresija gena creva Atlantskog lososa (Salmo salar) nakon različitih tretmana ishrane, primenom reverzne transkripcione (RT) qPCR metode

Analizirana je ekspresija selektovanih gena u crevima lososa hranjenih različitim

nivoima n-3 masnih kiselina, odnosno eikozapentaenoinskom (EPA) i

dokozaheksaenoinskom (DHA) masnim kiselinama tokom životnog ciklusa.

Selektovani geni su uključeni u EPA i DHA sinetezu, oksidaciju masnih kiselina,

sintezu prostaglandina i imunitet.

2.2.1 Priprema uzorka

Ribe su gajene u kavezima i hranjene sa 5 različitih vrsta hraniva u periodu od 4g do

400g, a zatim sa još tri različita hraniva u periodu of 400g do 4kg. Uzorci creva lososa

su uzimani od jediniki u krajnjoj fazi gajenje, težine 4 kg, i zamrznuta na -80°C i čuvana

do analize. Za analizu ekspresije gena, uzimano je sešt uzoraka po tretmanu, tako da

je ukupnoj bilo 84 uzoraka.

150

2.2.2 Izolacija RNK

Za izolaciju RNK korišćen je komercijalni kit (PureLinkTM 96 Pro 96 Total RNA

Purification Kit, Invitrogen, USA). Prema uputstvu proizvođača urađena je procedura

koja sledi:

- Dodati 1 mL TRIzolTM reagensa (Invitrogen) u tube od 2 ml za centrifugiranje

(Precyllis24), i dodati 2-3 perlice.

- Dodati oko 20 mg tkiva creva

- Homogenizovati uzorke u Precyllis24 na 5500 rpm 2x20 sekundi

- Nakon ovoga postupak se može nastaviti ili se uzorci mogu ostaviti u zamrzivaču

na -80°C do mesec dana

Za nastavak uzimati samo po 24 uzoraka da bi sve mogle odjednom da stanu u

hladnu centrifugu.

2.2.3 Trizol protokol

-Inkubirati homogenizovane uzorke 5 minuta na sobnoj temperaturi da bi se omogućila

kompletna disocijacija nukleoproteinskih kompleksa.

- Dodati 0.2 ml hloroforma na 1 ml of TRIZOL reagensa. Dobro zatvoriti poklopce

- Snažno ručno protresti uzorke oko 15 sekundi (obično između dva plastična stalka

za tube)

- Inkubirati uzorke na sobnoj temperature 2 do 3 minuta.

- Centrifugirati uzorke na oko 12,000×g 15 minuta na 4°C u hladnoj centrifugi.

Nakon centrifugiranja tečnost će se u tubama podeliti na faze, donju ružičastu fenol-

hloroform fazu, zatim interfazu, i bezbojnu vodenu, gornju fazu. RNK ostaje samo u

vodenoj fazi. Zapremina vodene faze je oko 60% od zapremine TRIZOL reagensa

korišćenog za homogenizaciju (Slika 2. levo).

Slika 2. Levo - tube sa vidljivim fazama tečnosti, sredina - tubice spremne za

homogenizaciju tkiva, desno - 24 tubice u hladnoj centrifugi

151

2.2.4 Transfer uzoraka na PureLinkTM 96 Well Total RNA Filter ploče:

- Transferovati 350uL bezbojne faze svakog uzorka u nove tube i dodati isto toliko

PureLink Pro 96 Lysis pufera (350uL) i etanola 100% (350uL). Raditi na ledu.

- Dobro izmućkati (laganim obrtanjem između dva plastična stalka za tube)

-Uzeti PureLinkTM 96 Well Total RNA Filter ploče (prethodno ih obeležiti, slika 3) i

staviti ih preko PureLinkTM 96 Receiver ploča. Prebaciti uzorke u pripremljene

PureLinkTM 96 Well Total RNA Filter ploče, po 12 uzorka na svaki.

- Zalepiti specijlanu zaštitnu providnu foliju preko komorica.

-Centrifugirati uzorke na t ≥2,100×g 1–2 minuta na sobnoj temperaturi.

Napomena: Prilikom vađenja uzoraka preveriti da li su svi uzorci prošli kroz kolone,

ukoliko nisu ukloniti zaštitni pokrivač i centrifugirati još jednom 1 minut na 2,100×g.

- Izbaciti tečnost iz PureLinkTM Receiver ploča tapkanjem preko papirnih maramica i

vratiti PureLinkTM RNAFilter ploče na PureLinkTM Receiver ploče.

Slika 3. Levo – obeležene PureLinkTM 96 Well Total RNA Filter ploče, desno na papiru

obeleženi brojevi uzoraka koji će se stavljati u PureLinkTM 96 Well Total RNA Filter

ploče

2.2.5. On-Column DNase digestija

Za On-Column DNase Digestion korišćen je komercijalni kit (PureLinkTM 96 DNase for

use with PureLinkTM Kits, On-Column Protocol Only, Invitrogen, USA). Prema uputstvu

proizvođača urađena je procedura koja sledi:

Pripremiti DNase rastvor u zavisnosti od broja uzoraka, u ovom eksperimentu je to

bilo 24, uvek dodati malo više za svaki slučaj (Tabela 2).

Tabela 2. Količine reagensa za Dnase digestiju, desna kolona pokazuje koliko je

reagenasa potrebno za 26 uzoraka

100 x: 1 x: 16 x: 26x:

10 x DNase I pufer 0,8 ml 8 µl 128 µl 208 µl

DNase I 2700 U 9,9 µl 158 µl 257.4 µl

RNase-free voda to 8 ml 62 µl 992 µl 1612 µl

152

Napomena: DNase rastvor napraviti u većoj ependorf epuveti i stavi na led.

- Dodati 500 uL wash pufera i u svaki uzorak.

- Centrifugirati na 2100xg 2 minuta.

- Dodati 80uL DNase rastvora u svaki uzorak.

- Inkubirati uzorke 15 minuta na sobnoj temperaturi.

2.2.5 Pranje sa puferima

- Dodati po 500 uL wash buffer I u komorice i inkubirati 5 minuta

- Centrifugirati uzorke na 2100xg 2 minuta, izbaciti višak tečnosti.

- Dodati 750 uL wash buffer II u svaki uzorak (wash buffer II mora se razblažiti u

odnosu 1:5 sa 95

100% etanolom)

- Centrifugirati na 2100xg 2 minuta, izbaciti višak tečnosti.

- Dodati 750 uL wash buffer II

- Centrifugirati na 2100xg 2 minuta, izbaciti višak tečnosti.

- Osušiti komorice u centrifugi na 2100xg 10 minuta.

Napomena: Neophodno je wash buffer II pripremiti sveže pre nego što se doda u

uzorke: za 24 uzorka je potrebno 24 x 750 uL x 2 (dva pranja)=36 ml npr. za 40 ml

rastvora potrebno je 8ml wash buffer II i 32 ml 95-100% etanola

2.2.6. RNK Elucija

- Staviti filter plate na nove PureLinkTM Pro 96 Eluation proče (slika 4. levo).

- Dodati oko 60 uL RNase free vode (u zavisnosti od vrste tkiva, ako je čvrsto kao

tkivo creva dodati više od 45uL koliko piše na istrukcijama).

- Inkubirati 1 minut na sobnoj temperaturi.

- Centrifugirati na 2100xg 2 minuta da bi se eluirala RNK.

- Prebaciti eluiranu RNK u nove tubice ili ependorf epruvete. Raditi na ledu.

- Izmeriti koncentraciju i kvalitet RNK na Nanodrop-u (slika 4. desno).

- Zalediti uzoke RNK na -80 °C do daljeg korišćenja.

Slika 4. Levo PureLink Pro Eluation ploče sa obeleženim komoricama koje će se

koristiti, desno Nanodrop spektrofotometar sa kompjuterskim programom

153

2.2.8 TaqMan qPCR Assay: cDNK sinteta i amplifikacija selektovanih gena

Za sintezu cDNK i ekspresiju selektovanih gena korišćen je TaqMan Reverse

Transcription reagensi (Applied Biosystems) sa SYBR™ Green reagensom

(LightCycler® 480 SYBR Green Master I) za oznaćavanje i detektovanje qPCR

produkta.

cDNA se pravi od 1000 ng RNK. Na osnovu dobijene koncentracije RNK iz Nanodrop-

a, za svaki uzorak se izračuna koliko ima µL RNK uzorka, tako što se 1000 podeli sa

dobijenom koncentracijom RNK (npr. 1000/522 = 1.8 µL RNA). Da bi se dobila količina

µL Rnase free water koja se dodaje u uzorak ta količina se oduzima od 7.7 da bi se

dobila količina za 20 µL reakciju (7.7-1.8 = 5.9 µL of Rnase free vode) (Tabela 3.)

Tabela 3. TaqMan® Reverse Transcription reagensi i izračunavanje njihove količine

za 20 uL reakciju, desna kolona pokazuje količinu TaqMan reagenasa za 84 uzorka

Taqman cDNA sinteza Broj uzoraka

TaqMan® Reverse

Transcription Reagents

stock

conc.

20 uL reaction

(uL) 84

10x TaqMan® RT Buffer 10x 2 168

25mM MgCl2 25 mM 4.4 369.6

10mM dNTP mixture 10 mM 4 336

Oligo d(T)16, 50 uM 50 uM 1 84

RNase Inhibitor 20 U/ul 0.4 33.6

Reverse Transcriptase (50

U/µl) 50 U/ul 0.5 42

RNA 250-1000 ng x

Rnase free water 7.7

Total 20

Napomena: Prva 4 reagnesa iz tabele 2 je potrebno držati na ledu pre upotrebe, dok

se Rnase inhibitor i Reverse Transcriptase drže zaleđene do upotrebe.

Izračuna se količina Taqman reagenasa za ukupan broj uzoraka (u ovom slučaju za

84 uzorka potrebno je 1033.2 uL), a potom se izračuna koliko se Taqman miksa dodaje

u svaki uzorak tako što se ukupna količina reagens miksa podeli sa brojem uzoraka

(npr. 1033.2/84=12.3 µL). Uzme se novi ploča sa komoricama. U svaku komoricu se

unese uzorak, preračunata količina Rnase free water i po 12.3 µL Taqman miks

reagenasa, tako da u svakoj komorici ukupno bude po 20 µL. U jednu komoricu doda

se mešavina RNK bez enzima da bi se proverilo da li ima ostataka genomske DNK

(NTC – no template control) (Tabela 4, gornja tabela). Zatim se komorice kratko

centrifugiraju na 2000xg 1 minut, i stave u PCR mašinu radi amplifikacije. Uslovi rada

PCR-a su 25 °C 10 minuta, 48 °C 60 minuta i 95 °C 5 minuta.

154

Nakon amplifikacije, u svaki uzrorak se doda po 180 µL RNase free vode a zatim se

iz svakog uzorka uzme po 10 µL u jednu ependorf epruvetu da bi se napravio “cDNK

miks” radi pravljenja standardne krive. Zatim se uzorci, po polovina njihove zapremine,

95 µL, transferuju na dva nova “master plates”, pola uzoraka na jedan (42) i pola na

drugi. Pri tome se svaki uzorak duplicira (Tabela 4, srednja i donja tabela). Od svakog

master plate se pomoću microdispenser mašine napravi po onoliko kopija koliko se

želi target odnosno referentnih gena ispitati. Npr. ukoliko će se ispitati ukupno 13

prajmera (10 target gena i 3 referentna), uvek se napravi malo više kopija – 15, a

obzirom na 2 master plejta, ukupno se napravi 30 novih plejtova (Slika 5). Nakon ovog

procesa kopiranja, u proseku svaka kopija-plejt sadrži 4 µL cDNK po uzorku. Svaka

kopija se pokriva sa specijalnom zaštitnom folijom i cetrifugira 1 minut na 2000 rpm, a

zatim zamrzava na -20°C ukoliko se sa procedurom nastavlja narednog dana. U

svakom slučaju sa jednim brojem plejtova se može nastaviti rad.

Tabela 4. Gornja tabela, osnovna ploča od koje se prave dve master ploče (qPCR

master ploče 1 i 2), srednja i donja tabela.

.

cDNA synthesis

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A 1 3 7 8 9 10 11 13 14 16 20 23

B 25 26 27 28 29 30 33 40 43 45 62 72

C 153 86 144 136 128 149 141 108 147 116 82 130

D 129 154 134 140 123 115 139 96 150 110 53 146

E 182 80 163 124 212 88 183 91 159 173 180 221

F 175 170 107 185 122 145 111 168 118 174 169 165

G 84 117 77 126 102 160 161 90 NTC

H

qPCR masterplate 1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A 1 1 3 3 7 7 8 8 9 9 10 10

B 25 25 26 26 27 27 28 28 29 29 30 30

C 153 153 86 86 144 144 136 136 128 128 149 149

D 129 129 154 154 134 134 140 140 123 123 115 115

E 182 182 80 80 163 163 124 124 212 212 88 88

F 175 175 170 170 107 107 185 185 122 122 145 145

G 84 84 117 117 77 77 126 126 102 102 160 160

H cDNA mixcDNA mixcDNA mix

qPCR masterplate 2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A 11 11 13 13 14 14 16 16 20 20 23 23

B 33 33 40 40 43 43 45 45 62 62 72 72

C 141 141 108 108 147 147 116 116 82 82 130 130

D 139 139 96 96 150 150 110 110 53 53 146 146

E 183 183 91 91 159 159 173 173 180 180 221 221

F 111 111 168 168 118 118 174 174 169 169 165 165

G 161 161 90 90 NTC NTC

H cDNA mixcDNA mixcDNA mix

155

Slika 5. Levo master ploča 1, desno 15 kopija master ploče 1

Pre nego što se ploče stave u qPCR mašinu, u svaki uzorak se dodaju prajmeri i

SybrGreen reagens.

Reagensi za qPCR reakciju po uzroku:

0.5 µL reverse prajmera

0.5 µL forward prajmera

5 µL Sybrgreen reagens

3 µL cDNK (količina koja se nalazi u svakom uzorku)

Prajmeri se drže zamrznuti do upotrebe i potrebno je sačekati 1 do 2 minuta da se

malo odlede. Nalaze se u liofiliziranom obliku i rastvaraju se sa RNase free vodom.

Target geni korišćeni u radu su: ACO, COX1, COX2, d5d, d6fad_a, d6fad_b, Elovl2,

Elovl5b, nrf, nfkb, a referenti geni su etif and Ef1a (Table 5). Svaki prajmer se pravi u

posebnoj ependorf epruveti koja se uvek prvo obeleži (npr. COX1 r i COX1 f). Treba

preračunati koliko je prajmera potrebno za ukupan broj reakcija koje imamo. Ukoliko

imamo ploče od 96 komorica onda 0.5 µLx96=48 x2 (ako imamo dva plejta)=96µL

prajmera u koji se doda 10x više RNA free water - 960 µL (Slika 6).

Slika 6. Levo reverse i forward prajmer COX1 (označeni registarskim brojevima),

desno – obeležena ependorf pipeta za rastvoreni prajmer COX 1r

Prajmeri se drže na ledu dok se ne stave u uzorke. SybrGreen reagens se drži u

zamrzivaču dok se pakovanje ne otvori, a zatim se, dok se ne potroši drži u frižideru,

s tim što se mora potrošiti u roku od nedelju dana. Potrebno je odrediti njegovu količinu

za ukupan broj reakcija koje imamo, nrp. 5 µLx96=480µL.

156

Tabela 5. Prajmeri i njihove sekvence korišćeni u protokolu

Ime prajmera Sekvenca

Ssa elong 2F1 CGGGTACAAAATGTGCTGGT

Ssa elong 2R1 TCTGTTTGCCGATAGCCATT

Ssa ACO F1 CCTTCATTGTACCTCTCCGCA

Ssa ACO R1 CATTTCAACCTCATCAAAGCCAA

Ssa d5d F2 GCTTGAGCCCGATGGAGG

Ssa d5d R2 CAAGATGGAATGCGGAAAATG

Ssa d6d A F3 TCCCCAGACGTTTGTGTCAGATGC

Ssa d6d A R3 GCTTTGGATCCCCCATTAGTTCCTG

Ssa d6d B/C R2 CACAAACGTCTAGGAAATGTCC

Ssa d6d B F3 TGACCATGTGGAGAGTGAGGG

Ssa d6d B R3 AACTTTTGTAGTACGTGATTCCAGCT

Ssa d6d C F2 TGAAGAAAGGCATCATTGATGTTG

Ssa EF1a F CACCACCGGCCATCTGATCTACAA

Ssa EF1a R TCAGCAGCCTCCTTCTCGAACTTC

Ssa etif3 F1 CAGGATGTTGTTGCTGGATGGG

Ssa Etif3 R1 ACCCAACTGGGCAGGTCAAGA

Ssa nrf F2 CCGGACTCCTCGCCTTCGGA

Ssa nrf R2 GTGGATAGTTGGCTTGTCCCTTCGT

Ssa nfkb F1 CAGCGTCCTACCAGGCTAAAGAGAT

Ssa nfkb R1 GCTGTTCGATCCATCCGCACTAT

Ssa Elovl5b F2 GCAACCTTGACCCAAACAGG

Ssa Elovl5b R2 CCTTGTCTCTACGCAAGGGA

Ssa cox2 F2 CCCCCGACTTACAATGCTGA

Ssa cox2 R2 GCGGTTCCCATAGGTGTAGG

U svaku komoricu sa uzorkom dodaje se po 6 µL rastvorenog prajmera i Sybrgreen

reagensa, najčešće pomoću multistep pipete, kada se radi o pločama sa velikim

brojem komorica (npr. ploče sa 96 komorica) (Slika 7.). Zatim se komorice pokriju sa

posebnom vrstom zaštitne folije, specijalizovane za qPCR (LightCycler sealing foil) i

centrifugiraju 1 min na 2000 rpm. Potom se ploče stavljaju u LightCycler. Odabere se

tip programa i qPCR se pušta u rad (Slika 7).

Uslovi rada qPCR LightCycler™480 (Roche Diagnostics Gmbh, Germany) mašine:

predinkubacija na 95 °C 5 minuta, amplifikacija sa 45 ciklusa na 95 °C 15 sekundi i na

60°C 1 minut, kriva topljenja na na 95 °C 5 sekundi i 65 °C 1 minut, hlađenje na 40 °C

10 sekundi.

Napomena: Biti posebno pažljiv prilikom ubacivanja prajmera u komorice, obzirom da

se radi o jako maloj količini, dešava se da kapljica “iskoči” iz komorice, a ponekad

157

odskoči u uđe u susednu komoricu. Najbolje je da se vrh pipete približi zidu komorice,

bez dodirivanja, i onda polako ubaci kapljica.

Slika 7. Levo, ploče spremne za dodavanje prajmera i SybrGreen reagensa, sredina

Roche™ LightCycler™ 480, desno praćenje procesa amplifikacije na LightCycler

kompjuterskom programu

Nakon što se svi napravljeni plejtovi amplifikuju u qPCR mašini, iz kompjuterskog

programa se prezuimaju podati o Ct vrednostima (mogu se prebaciti u Excel) za sve

rekacije i dalje se obrađuju u cilju analiziranja relativne ekspresije gena.

3. Zahvalnica

Ovaj rad je finansiran od strane EU Commission projekta AREA, No. 316004. Analize

ekspresije gena su deo tekućeg projekta Nofime, Nacionalnog instituta za hranu u

Norveškoj, As, Biotehnology laboratorije. Zahvaljujemo se Bente Ruyter, Tone-Kari

Knutsdatter Østbye and Marta Bou Mira koje su obezbedile uzorke za rad i svesrdnoj

pomoći tokom analize uzoraka.

Pitanja:

1. Na osnovu kojih karakteristika se tradicionalno vrši indentifikacija vrsta riba i u

kojim slučajevima je ovakva indentifikacija neophodna?

2. Na čemu se zasnivaju zvanične metode za indentifikaciju vrsta riba i šta su

ograničenja ovih metoda?

3. Koje se molekularne metode najčešće upotrebljavaju za indentifikaciju riba?

4. Šta je princip restriction fragment length polymorphism (RFLP) metode?

5. Šta je neophodno odrediti pre korišćenja qPCR metode i na koji način se

određuje ekspresija gena?

158

4. Literatura

Aranishi F. (2005). Rapid PCR-RFLP method for discrimination of imported and

domestic. Current Zoology 56 (1): 157-174

Davis GP, Hetzel DG (2000). Integrating molecular genetic technology with traditional

approaches for genetic improvement in aquaculture species. Aquaculture Research

31: 3-10.

Derveaux S, Vandesompele J, Hellemans J (2010). How to do successful gene

expression analysis using real-time PCR . Methods 50:227–230

genetics. Aquaculture 238:1–37.

Granadeiro JP, Silva MA (2000). The use of otoliths and vertebraein the identification

and size-estimation of fish inpredator-prey studies. Cybium 24:383–393.

Hubalkova Z, Kralik P, Tremlova B, Rencova E. (2007). Methods ofgadoid fish species

identification in food and their economicimpact in the Czech Republic: a review.

Veterinarni Medicina 52:273–292.

Kvasnicka F. (2005). Capillary electrophoresis in food authenticity. Journal of

Separation Science 28:813–825.

Lenstra JA. (2003). DNA methods for identifying plant and animal species in food. In:

Food authenticity and traceability,(Ed. M.Lees). Cambridge, U.K.,Woodhead

Publishing Ltd. pp34–53.

Liu ZJ, Cordes JF. (2004). DNA marker technologies and their applications in

aquaculture mackerel. Marine Biotechnology 7(6):571–5.

Marić S, Simonović P, Razpet A (2010). Genetic characterization of broodstock brown

troutfrom Bled fish-farm, Slovenia. Periodicum Biologorum 112:145–148

McMeel M.O., HOEY M.E., Ferguson A. (2001). Partial nucleotide sequences, and

routine typing by polymerase chain reaction–restriction fragment length

polymorphism, of the brown trout (Salmo trutta) lactate dehydrogenase, LDH-C1*90

and *100 alleles. Molecular Ecology 10: 29–34

Nielsen J L, Pavey S A (2009). Perspectives: Gene expression in fisheries

management. Current Zoology 56 (1): 157-174.

Overturf, K. (2009) Quantitive PCR In: Molecular Research in Aquaculture (Ed. K.

Overturf), Wiley-Blackwell, Oxford, UK, pp 39-56.

159

Pfaffl M W (2006). Relative quantification In: Real-time PCR. (Ed. T. Dorak). Taylor &

Francis Group, pp 63-82.

Rasmussen R S, and Morrissey M T (2008). DNA-Based Methods for the Identification

of Commercial Fish and Seafood Species. Comprehensive reviews in food science

and food safety 7:280-295.

Strauss RE, Bond CE (1990). Taxonomic methods: morphology.In: Methods for fish

biology (Eds. C.B. Schreck, P.B. Moyle).American Fisheries Society, Maryland, pp

109–140

Teletchea F. (2009). Molecular identification methods of fish species: reassessment

and possible applications. Reviews in Fish Biology and Fisheries 19:265–293

Korisni linkovi relevantni za ovo poglavlje :

http://www.gene-quantification.com/real-time-pcr-handbook-life-technologies-update-

flr.pdf

http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_5279.pdf

http://www.gene-quantification.info/

http://fulxie.0fees.us/

http://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/TXT/?uri=URISERV%3Al66002

Deo II: Primena Ramanove mikroskopije/spektroskopije u poljoprivredi i prehrambenoj tehnologiji

160

Uvod u Ramanovu mikroskopiju/spektroskopiju

Dejan Lazić

Izvod

Ramanova spektroskopija/mikroskopija je nedestruktivna spektroskopska tehnika kojom se detektuju vibracione, rotacione ili druge nisko-frekventne eksitacije posmatranog sistema. U slučaju molekula, ovom metodom mogu da se detektuju one vibracije koje dovode do promene njegove polarizabilnosti. Karakteristike Ramanovih spektra zavise od masa atoma, njihovog geometrijskog uredjenja u molekulu tj simetrije atoma molekula, kao i od intenziteta sila koje povezuju ove atome. U hemiji i biologiji na primer, Ramanova spektroskopija je nezaobilazan alat da se otkrije prisustvo odredjenih molekula u posmatranom materijalu. Sa druge strane, povezivanje Raman spektroskopije sa mikroskopom omogućilo je preciznu strukturnu i morfološku analizu različitih uzoraka, te je ova metoda našla primenljivost u brojnim naučnim displinama. Primenjuje se u mnogim oblastima kao što su: hemija, biologija, fizika, medicina, astronomija, ili metalurgija zbog svoje mogućnosti odredjivanja fizičkih i hemijskih osobina nekog materijala. Vibraciona spektroskopija je grana spektroskopije koja proučava spektre, koji su uzrokovani vibracijama molekula ili atoma u čvrstom stanju. Molekul može da vibrira tačno odredjenim frekvencijam, koje odgovaraju njegovim vibracionim energetskim nivoima. Karakteristike ovih spektra zavise od masa atoma i njihovog geometrijskog uredjenja tj. simetrije molekula.

Uvod

Spektroskopija je oblast koja se bavi proučavanjem zračenja nakon njegove

interakcije sa materijom. Pri tome zračenje koje se koristi može da poseduje

elektromagnetne ili mehaničke osobine, ili da se sastoji od čestica. U slučaju

elektromagnetnog zračenja, oblast frekvencija koja se koristi može biti u intervalu od

frekvencija radio talasa do frekvencija γ zračenja, dok se za zračenje koje se sastoji od

čestica mogu koristiti elektroni, neutroni, mioni, i u nekim slučajevima celi atomi ili joni.

Informacije o materiji dobijaju se iz spektra zračenja koji nastaje nakon njegove interakcije

sa materijom (Kuzmany H, 2009).

Spektroskopija se primenjuje u hemiji, medicini, astronomiji, metalurgiji, zbog

mogućnosti određivanja fizičkih i hemijskih osobina neke materije.

Metode koje se koriste u spektroskopiji se razlikuju u zavisnosti od materije koja se

koristi, atom, molekul ili supstanca, i koje osobine materije se ispituju

(http://web.mit.edu/spectroscopy/history/history-classical.html).

Prema tome, spektroskopija se kao disciplina može podeliti u više poddisciplina, prema:

- Vrsti zračenja tj. frekvenciji (radio, mikrotalasna, terahercna, infracrvena, vidljiva,

ultraljubičasta, rendgenska, gama)

- Nivou interakcije (nuklearna, atomska, molekularna, agregacijska)

- Pronalazaču (Ramanova, Mesbauerova)

- Tehnici (Furijeova, rezonantna, laserska, koherentna, emisijska, apsorpcijska)

Spektroskopija se, prema fenomenu koji izaziva sprezanje elektromagnetnog

zračenja, može podeliti na:

161

Rotacionu spektroskopiju

Elektronsku spektroskopiju

Vibracionu spektroskopiju

(http://web.mit.edu/spectroscopy/history/history-classical.html)

Vibraciona spektroskopija je grana spektroskopije koja proučava spektre, koji su

uzrokovani vibracijama molekula. Primjenjuje se za identifikaciju molekula na osnovu

vibracija njihovih atoma, odnosno periodičnih promena uglova i udaljenosti atoma.

Vibracione spektroskopske tehnike mogu se zasnivati na apsorpciji ili rasejanju

elektromagnetnog zračenja i stoga, razlikujemo infracrvenu odnosno Ramanovu

spektroskopiju.

Svi molekuli vibriraju. Vibracije molekula, za razliku od vibracija makroskopskih tela,

su kvantne. Molekul može vibrirati tačno određenim amplitudama, koje odgovaraju

vibracionim energijskim nivoima. Spektroskopski prelaz se može dogoditi jedino ako je

energija apsorbovanog ili emitovanog fotona jednaka razlici dva vibraciona energetska

nivoa (Bohrov uslov), odnosno ako je razlika energija rasejanog i dolazećeg fotona jednaka

razlici energijskih nivoa. Ukoliko vibracija molekula uzrokuje promenu dipolnog momenta

molekula, doćiće do sprege vibracija sa elektromagnetnim zračenjem, pri čemu dolazi do

apsorpcije ili emisije zračenja. Takva vibracija će biti aktivna u infracrvenom spektru

(Crouch, 2007). Vibracija će biti aktivna u Ramanovom spektru ukoliko uzrokuje promenu

polarizabilnosti molekula.

Proučavanje spektra elektromagnetnog zračenja se sprovodi pomoću spektroskopa

tj. spektrometra. Analizom se dobijaju podaci o prisutnosti različitih vrsta atoma i molekula

u materiji. Kako molekuli predstavljaju sisteme atoma koji su međusobno povezani

određenim silama, kao rezultat ovih elastičnih veza, moguće je oscilovanje atoma unutar

molekula. Oscilovanja atoma i promene koje se dešavaju usled ovakvih kretanja opisana su

vibracionim spektrima. Karakteristike ovih spektra zavise od masa atoma, njihovog

geometrijskog uređenja u molekulu, kao i od intenziteta sila koje povezuju ove atome.

Supstance koje sadrže veliki broj molekula, kao na primer kristali, ponašaju se kao super

molekuli, odnosno u njima dolazi do slaganja pojedinačnih oscilacija molekula i do njihove

međusobne interakcije. Egzaktno objašnjavanje ovih fenomena nije moguće, zato se moraju

uvesti određene aproksimacije. Jedna od aproksimacija koja se uvodi je zanemarivanje

međusobne interakcije molekula. Kako svaka supstanca, odnosno molekul poseduje svoje

jedinstvene karakteristike, tako će se razlikovati njihovi vibracioni spektri.

Korišćenjem Ramanove spektroskopije moguće je indentifikovati vrstu nepoznatog

molekula. Takođe, moguće je određivanje molekularne strukture i proračunavanje drugih

karakteristika molekula iz njihovih vibracionih spektara. Zbog toga, danas ove vrste

spektroskopije imaju veliku ulogu u nauci.

Ramanova spektroskopija

Sir Chandrasekhara Venkata Raman (1888-1970) je indijski fizičar čiji je rad u velikoj meri

uticao na razvoj fizike. Dobitnik je Nobelove nagrade za fiziku, 1930. godine, za

162

objašnjavanje efekta promene talasne dužine svetlosti prilikom njenog prolaska kroz

transparentni materijal (Ramanovo rasejanje) (http://en.wikipedia.org/wiki/C._V._Raman ).

Neelastično odbijanje svetlosti pri interakciji sa materijom teoretski je predvideo

Brillouin 1922. godine, a eksperimentalno prvi put videli Raman i Krišnan 1928. godine. Za

izvor svetlosti koristili su fokusiran i filtriran snop sunčeve svetlosti, uzorak je bila tečnost u

kofi, a detektor oko. Isti princip se primenjuje i danas. Tokom razvoja metode, kao izvor

svetlosti korišćene su različite lampe, laseri, a danas su to uglavnom laserske diode, dok se

kao detektori koriste fotomultiplikatori ili ccd kamere.

Ramanova spektroskopija koristi neelastično rasejanje monohromatske svetlosti

(najčešće laserske). Ramanovo rasejanje se koristi za prikupljanje spektroskopskih

podataka.

Neelastično rasejanje znači da se frekvencija fotona u monohromatskom svetlu

menja nakon interakcija sa uzorkom. Elektromagnetno zračenje, koje molekul rasejava,

sadrži dve komponente koje potiču od vibracija ili rotacija molekula (Schrader, 1995). Foton

koji odlazi od sistema nema jednaku energiju kao i foton koji je došao do sistema. Sistem

Ramanovim rasejanjem dobija ili gubi energiju. Razlika u energiji sistema, pre i nakon

rasejanja odgovara razlici energija dolazećeg i odlazećeg fotona. Ukoliko odlazeći foton ima

nižu energiju od dolazećeg fotona, sistem je rasejanjem dobio energiju. Ovo rasejanje se

naziva Stokes-ovo rasejanje, u suprotnom slučaju rasejanje se naziva anti-Stokes-ovo.

Energija spektroskopskog prelaza se određuje razlikom energija iz Stokes-ove ili anti-

Stokes-ove trake i talasne dužine upadnog, monohromatskog zračenja. Kako su Stokes-ove

i anti-Stokes-ove trake mnogo manjeg intenziteta od Rejlijevog rasejanog zračenja*,

potrebno je primeniti izvor zračenja velikog intenziteta (Schrader, 1995).

*Rejlijevo rasejanje u atmosferi je posledica rasejanja na molekulima vazduha (čija je

dimenzija mnogo manja od talasne dužine upadnog zračenja) koji se haotično kreću,

odnosno posledica je fluktuacija u gustini vazduha (dovodi do različitih vrednosti indeksa

prelamanja u oblastima različitih gustina).

Stokes-ovo i anti-Stokes-ovo rasejanje zavise od promene polarizabilnosti molekula

u vremenu, tako da Ramanovi spektar pokazuju samo one vibracije i rotacije molekula koje

menjaju polarizabilnost molekula. Zato u Ramanovom i infracrvenom spektru iste trake

obično imaju različite intenzitete, a ponekad su u jednom od tih spektara potpuno nevidljive.

Zato se infracrvena i Ramanova spektroskopija smatraju komplementarnim (Schrader,

1995).

Ramanova spektroskopija ima veliku prednost nad infracrvenom spektroskopijom jer

se Ramanovi spektri mogu snimati u vodenim rastvorima. Ramanova spektroskopija može

se još upotrebiti i za proučavanje čvrstog i gasovitog uzorka. Oko 99.999% svih sudara

fotona u spontanoj Ramanovoj spektroskopiji podleže elastičnom Rayleigh-evom rasejanju.

Ovakav tip rasejanja je beskoristan za praktičnu upotrebu za molekularnu karakterizaciju.

Samo 0.001% od upadne monohromatske svetlosti stvara neelastičan Ramanovi signal

frekvencije Vo±Vm. Spontano Ramanovo rasejanje je vrlo slabo i treba preduzeti posebne

mere kako bi se razlikovalo od preovlađujućeg Rayleigh-evog rasejanja.

Sistem Ramanove spektroskopije tipično se sastoji od četiri glavne komponente:

izvora zračenja koji uglavnom predstavlja laser kontinualnog tipa, sistema za osvetljavanje

163

uzorka, sistema za razdvajanje talasnih dužina i sistema za detekciju i obradu signala

(Ferraro, 2002).

Ramanovi spektrofotometri koriste izvor monohromatskog zračenja koje je usmereno na

uzorak. Zračenje, raspršeno pod nekim uglom (obično pod 90º) vodi se na monohromator,

iz koga se propušta samo jedna talasna dužina. Skeniranjem u području talasnih dužina oko

talasne dužine izvora zračenja, dobija se spektar.

Ramanovi spektri mogu biti:

-rotacioni

-rotaciono-vibracioni

-elektronski (ređe)

U osnovi Ramanovog efekta leži neelastično rasejanje monohromatskog upadnog

zračenja (laserskog zračenja) iz ultraljubičaste, vidljive (ili bliske infracrvene) oblasti

- kada svetlost prolazi kroz transparenti materijal najveći deo svetlosti se rasejava u svim

pravcima

- deo svetlosti, koji se sastoji od fotona nepromenjene energije, poznat je kao rejlijevsko

rasejanje

- onaj mnogo manji deo upadnog zračenja koji ima promene u energiji poznat je kao

Ramanovo rasejanje

- razlika u energiji direktno zavisi od molekulske vrste prisutne u ispitivanom sistemu

Ukoliko upadno zračenje ima diskretan spektar, tada se u spektru rasutog zračenja

javljaju tri komponente:

zračenje iste frekvencije kao i upadna radijacija (RAYLEIGH-EVO RASEJANJE)

zračenje više frekvencije od upadne radijacije (ANTI-STOKES-OVO ZRAČENJE) i

zračenje niže frekvenciji od upadne (STOKES-OVO ZRAČENJE)

Slika 1.Stokes-ovo i anti-Stokes-ovo zračenje

Spektroskopija površinski pojačanog Ramanovog rasejanja (SERS)

Spektroskopija površinski pojačanog Ramanovog rasejanja (surface-enhanced

Raman scattering, SERS) metoda je koja se razvija poslednjih tridesetak godina, a

zahvaljujući vrlo visokoj osetljivosti nalazi svoju primenu u brojnim područjima kao što su

hemijska i biohemijska analiza, medicina, forenzika i arheologija (McNay i sar 2011;

Schlüker i sar 2011). SERS spektroskopijom uočava se vibracioni spektar karakterističan za

molekul smešten na ili vrlo blizu metalne, nanostrukturirane površine.

164

Praktična upotreba SERS-a je nešto otežana usled formiranja spektara koje je dosta

teško interpretirati. Ovde izuzetno treba voditi računa o fizičkim i hemijskim faktorima od

kojih zavisi kako pojavljivanje linija u spektru tako i njihov intenzitet. Upravo zbog ovakvih

komplikacija, razvijen je SERRS koji koristi efekat pojačanja usled adsorpcije na površini i

Ramanovu rezonanciju dajući intenzitet signala čak do 1014 (Stiles i sar 2008; Shatz i Van

Duyne, 2002).

Najvažniji razlog za razvoj SERS tehnike upravo je njena primenjivost u različitim

granama prirodnih nauka. Pojačanjem intenziteta rasejanog zračenja molekula na

metalnom supstratu povećava se osetljivost Ramanove spektroskopije i omogućava

strukturna analiza molekula na temelju vibracionog spektra. Budući da spektroskopija

površinski pojačanog Ramanovog rasejanja uz izuzetnu osetljivost pruža i informacije o

strukturi molekula, ona je idealna detekcijska tehnika za istraživanje različitih hemijskih i

bioloških sistema. Dodatna prednost SERS spektroskopije je i gašenje fluorescencije

molekula blizu metalne površine, usled prenosa energije sa molekula na metal (Schlüker,

2011).

Povezivanje metode Ramanove spektroskopije sa mikroskopom postalo je značajno

70-tih godina prošlog veka. Pored klasične mikroskopije upotreba elektonskog snopa je

davala precizne morfološke i strukturne slike posmatranog uzorka. Primena skenirajućeg

elektronskog mikroskopa, x-zračna mikroanaliza i analitička elektronska mikroskopija daju

precizne detalje o elementarnom sastavu ispitivane materije ali ne i informacije o strukturnoj

koordinaciji kakve možemo dobiti primenom Ramanove mikrospektroskopije. Veliki je broj

radova objavljen u oblasti fizičko-hemijske karakterizacije materijala upotrebom Ramanove

mikrospektroskopije, polako je, kao metoda, preko kontrole kvaliteta farmaceutskih

proizvoda prodrla u biološke nauke i njena primena će se širiti kako istraživači bioloških

sistema budu više shvatali mogućnosti primene ove metode.

Iako Ramanova mikroskopija/spektroskopija spada u novije metode, njena

popularnost, uzrokovana jednostavnošću pripreme uzorka i velikim brojem informacija

dostupnih sa jednog spektra, dovela je do razvoja velikog broja specifičnih protokola.

Najveći broj ovih protokola usmeren je na povećanje specifičnosti i osetljivosti metode, što

se postiže modifikacijom pripreme uzorka, podešavanjem parametra instrumenata, itd

(Butler et al, 2016). Kako bi se olakšala obrada podataka i omogućilo klasifikovanje uzoraka

na osnovu njihovog „spektralnog otiska“, razvijeni su brojni novi softveri i podprogrami u

okviru već postojećih programa (Tabela 1).

Tabela 1: Softveri za obradu podataka i klasifikaciju Ramanovih spektara (preuzeto

iz Butler i saradnici, 2016)

Softver Vebsajt Licenca

CytoSpec http://www.cytospec.com/ftir.php Komercijalna

ImageLab http://www.imagelab.at/en_home.html Komercijalna

Biodata Toolbox

(u okviru MATLAB-a)

http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/22068-biodata-toolbox

Dostupna

Extended Multiplicative Signal

http://www.models.life.ku.dk/emsctoolbox Dostupna

165

Correction (EMSC) Toolbox

IrootLab https://code.google.com/p/irootlab/ Dostupna

Multivariate Image Analysis (MIA) Toolbox

http://www.eigenvector.com/software/mia_toolbox.htm

Dostupna

Multivariate Curve Resolution– Alternating Least Squares (MCR-ALS) Toolbox

http://www.cid.csic.es/homes/rtaqam/tmp/WEB_MCR/welcome.htm

Komercijalna

PLS Toolbox (u okviru MATLAB-a)

http://www.eigenvector.com/software/pls_toolbox.htm

Dostupna

Raman Processing Program(u okviru MATLAB-a)

http://cares.wayne.edu/rp/ Komercijalna

Origin for Spectroscopy

http://www.originlab.com/index.aspx?go=Solutions/Applications/Spectroscopy

Komercijalna

PeakFit https://systatsoftware.com/products/peakfit/ Komercijalna

PyChem (u okviru Python programa)

http://pychem.sourceforge.net/ Dostupna

PyVib2(u okviru Python programa)

http://pyvib2.sourceforge.net/ Dostupna

HyperSpec (u okviru R programa)

http://hyperspec.r-forge.r-project.org/ Dostupna

The Unscrambler X (u okviru R programa)

http://www.camo.com/ Komercijalna

Zahvalnica

Zahvaljujući naporu grupe profesora Poljoprivrednog fakulteta u Beogradu, uz

podršku EU, kroz AREA projekat obezbeđen je jedan ovakav uređaj za potrebe istraživanja

u poljoprivredi. Istraživači Poljoprivrednog fakulteta Univerziteta u Beogradu su imali priliku

da se sa metodom upoznaju na višemesečnoj obuci na Institutu za fizičku hemiju

Univerziteta u Jeni (Nemačka), gde su se okupili vrhunski istraživači iz oblasti primene

Ramanove spektroskopije u biološkim sistemima. Ovde će biti predstavljena njihova

iskustva, utisci, poruke budućim istraživačima u ovoj oblasti.

166

Pitanja:

1. Koji je princip Ramanove mikrospektroskopije?

2. Na osnovu čega se može izršiti podela spektroskopskih metoda?

3. Od kojih karakteristika molekula zavisi izgled Ramanovih spektara?

4. U čemu je razlika između Stokes-ovskog i anti-Stokes-ovskog rasejanja i čime su

uslovljene promene u intenzitetu ove dve vrste rasejanja?

5. Kako se mogu podeliti Ramanovi spektri?

Literatura

Butler H.J., Ashton L., Bird B., Cinque G., Curtis K., Dorney J., Esmonde-White K., Fullwood N.J., Gardner B., Martin-Hirsch P.L., Walsh M.J., McAinsh M.R., Stone N. and Martin F.L. Using Raman spectroscopy to characterize biological materials. Nature Protocols 11(4): 664-687 (2016). Kuzmany H. Solid-State Spectroscopy, 2nd edn., Springer-Verlag, Berlin, 2009. http://web.mit.edu/spectroscopy/history/history-classical.html Crouch A. Principles of instrumental analysis, Thomson Brooks/Cole, Australlia, 2007 Schrader B. Infrared and Raman Spectroscopy, VCH, New York, 1995 C. V. Raman. http://en.wikipedia.org/wiki/C._V._Raman Ferraro J. R., Introductory Raman Spectroscopy, 2nd edn., Academic Press; New York, 2002. McNay G., Eustace D., Smith W. E., K. Faulds i D. Graham. Appl. Spectrosc. 65 (2011). 825−837. Schlüker S. Surface Enhanced Raman Spectroscopy: Analytical, Biophysical and Life Science Applications, Wiley-VCH, Weinheim (2011). Stiles P-L., Dieringer J. A., Shah N. C. i Van Duyne R. P. Annu. Rev. Anal. Chem. (2008) 601−626. Shatz G. C. i Van Duyne R. P. Electromagnetic Mechanism of Surface-enhanced Spectroscopy, u J. M. Chalmers i P. R. Griffiths (ur.), Handbook of Vibrational Spectroscopy, 1. izd., John Wiley & Sons, Chichester, 759−774 (2002).

167

Uslovi rada u laboratoriji za Ramanovu mikroskopiju

Steva Lević

Izvod

Primenom Ramanove mikroskopije/spektroskopije omogućava se kako vremensko praćenje

različitih hemijskih procesa, tako i karakterizacija materijala (tzv. Ramanovo mapiranje). U

labortoriji za Ramanovu mikroskopiju/spektroskopiju neophodno je obezbediti stabilno

napajanje električnom energijom, antivibracioni sto, konstantnu temperaturu i kontrolisan

izvor svetlosti. Pre rada sa Ramanovim mikroskopom neophodno je izabrati odgovarajući

laser, podesiti odgovarajuću talsnu dužinu i jačinu lasera i izvršiti kalibraciju instrumenta.

Uvod

Instrumenti koji se danas koriste u Ramanovoj spektroskopiji/mikroskopiji

omogućavaju praćenje različitih hemijskih procesa u realnom vremenu, ali i karakterizaciju

materijala u smislu raspodele pojedinih hemijskih komponenti preko metode koja je poznata

i kao Ramanovo mapiranje. Da bi se vršile složene analize površine uzoraka neophodno je

da Ramanovi mikroskop poseduje motorizovano postolje koje omogućava automatsko

pomeranje i analizu predhodno zadatih tačaka na uzorku. Ovako dobijeni spektri formiraju

„hemijsku mapu“ uzorka.

Laboratorija za Ramanovu mikroskopiju bi trebalo da zadovolji nekoliko osnovnih

uslova kako bi se rad sa uzorcima odvijao u skladu sa zahtevima analize. Pre svega,

mikroskop treba da ima stabilno napajanje električnom energijom. Potrebno je eliminisati

izvore vibracija koji mogu da utičnu negativno na rad mikroskopa, postavljanjem mikroskopa

na odgovarajući antivibracini sto (Slika 1). Pored toga, neophodna je ventilacija u prostoriji,

kako bi se obezbedili uslovi za rad osoblja ali i stabilna temperatura neophodna za

nesmetani rad uređaja.

Slika 1 . Ramanovi mikroskop XploRA (Horiba Jobin Yvon) postavljen na

odgovarajući antivibracioni sto.

168

Pored eliminacije uticaja vibracija, neophodno je eliminisati i uticaj ambijentalnog

svetla na tok analize, što se postiže gašenjem svetla pri ekscitaciji uzorka ili korišćenjem

specijanog zastora kojim mogu biti opremljeni mikroskopi. Mogu se koristiti male stone

lampe koje ne utiču na rad uređaja.

Slika 2. Uticaj ambijentalnog svetla na Ramanovi spektar titanijum dioksida.

a) spektar snimljen bez uticaja ambijentalnog svetla; b) spektar sa uključenim

ambijentalnim svetlom. Strelicom je označen signal koji potiče od ambijentalnog svetla.

Laser 532nm, vreme akvizicije 1s.

Izbor odgovarajuće talasne dužine lasera tj. izbor instrumenta

Prvi i osnovni uslov za uspešnu realizaciju analiza metodom Ramanove mikroskopije

je izbor uređaja tj. lasera. Stariji tipovi uređaja su obično imali samo jedan laser, tačnije

mogućnost rada na jednoj talasnoj dužini lasera. Savremeni Ramanovi mikroskopi mogu

imati više lasera čime se omogućava brzo prebacivanje sa jednog na drugi izvor

pobuđivanja u zavisnosti od potreba analize ili svojstava materijala sa kojim se radi.

Izbor odgovarajućeg lasera zavisi pre svega od prirode materijala koji se ispituje i

njegove interakcije sa laserom. Naime, prilokom upotrebe nekih lasera (npr. 532nm) može

se javiti fluorescencija, čiji intenzitet prevazilazi signal (zaklanja signal u potpunosti). Ova

pojava može biti toliko izražena da ni tehnike za uklanjanje fluorescencije ne daju nikakav

rezultat. U tom slučaju se biraju laseri više talasne dužine (785nm ili 1064nm), kod kojih je

pojava fluorescencije manja ili je uopšte nema.

169

Kalibracija instrumenta

U cilju pravilne analize, pre početka merenja neophodno je izvršiti kalibraciju

instrumenta. Ovo se obično vrši pomoću čistih supstanci sa poznatim pozicijama Ramanovih

traka u svojim spektrima. Za kalibraciju se mogu koristiti: silicijum, sumpor, barijum, itd.

Primer kalibracije Ramanovog mikroskopa XploRA (sa laserima na 532 nm i 785nm)

silicijumom (maksimum na 520 cm-1) je dat na Slici 3.

Slika 3. Rezultat kalibracije korišćenjem različitih lasera (kalibracija silicijumom)

Sama procedura kalibracije zavisi od tipa uređaja i postupka kalibracije po preporuci

proizvođača. Savremeni Ramanovi mikroskopi imaju odgovarajuću signalizaciju koja

pokazuje da li je kalibrcija urađena u skladu sa procedurom.

Postupak sa uzorcima kod Ramanove mikroskopije

Kada je u pitanju rad na Ramanovom mikroskopu, treba obratiti pažnju na neke

osnovne korake koje bi trebalo preduzeti pre same analize. Prvi i osnovni korak je svakako

priprema uzorka pre merenja i način čuvanja. Treba naglasiti da finalni oblik uzorka mora

da bude prilagođen dimenzijama mikroskopa i njegovim mogućnostima.

Generalno, za snimanje kod Ramanove mikroskopije se koriste staklene, kvarcne i

zlatne (nanometarski sloj na pločici) mikroskopse pločice. Preporuka je da se (ako drugačije

nije naglašeno) koriste kvarcne mikroskopske pločice kako bi se u što većoj meri eliminisao

uticaj spektra pločice na spektar uzorka.

Ako je moguće, trebalo bi izbegavati upotrebu plastičnih kontejnera za držanje

uzoraka pri analizi jer može doći do preklapanja signala kontejnera i uzorka. U ovom slučaju

je preporuka, kao i kod kvarcne pločice, da se obavezno snimi i prazan kontejner pre analize

kako bi se izbegli problemi usled preklapanja spektara.

170

Analiza čvrstih uzoraka

Pre same analize metodom Ramanove mikrskopije, neophodno je uzorak pravilno

naneti na odgovarajuću podlogu za snimanje. Najbolje je da se za podlogu koriste kvarcne

mikroskopske pločice jer se na taj način osigurava minimalni uticaj nosača uzorka na

Ramanovi spektar.

Kod inverznih Ramanovih mikroskpa, uzorak se analizira sa donje strane tj.

ekscitacija uzorka laserom se vrši odozdo. Kod ovakve konfiguracije je preporučljivo uzorak

naneti na površinu dvostrano-samolepljive trake, pri čemi se traka nanosi na staklenu

mikroskopsku pločicu, a zatim se nanosi uzorak (zalepi za drugu stranu trake). Ovde treba

obratiti pažnju na mogući negativan uticaj materijala trake na spektar, jer se može desiti

(posebno kod čestica manjih dimenzija kao i kod transparentnih uzoraka) da se u spektru

pojave i signal koji potiču od trake.

Analiza tečnih uzoraka

Većina tečnih uzoraka se može analizirati odmah nakon nanošenja na površinu

mikroskopske pločice. Ovakav način snimanja je moguć kod tečnih uzoraka koji se ne

menjaju značajnije (npr. minimalno isparavaju) tokom analize.

Uticaj talasne dužine lasera na kvalitet Ramanovog spektra

Izbor lasera odgovarajuće talasne dužine je svakako jedan od najvažnijih zadataka

pre početka analize. Kod uređaja koji imaju više lasera ovo je relativno jednostavno jer se

promena sa jednog na drugi laser obavlja relatino brzo. Pre izbora talasne dužine lasera

potrebno je konsultovati literaturu iz date oblasti, ali i ispitati koji je laser odgovarajući za dati

uzorak.

Slika 4 . Uticaj talasne dužine lasera na Ramanovi spektar karnauba voska.

171

Uticaj jačine lasera na kvalitet Ramanovog signala

Kvalitet Ramanovog spektra zavisi i od primenjene jačine lasera. Generalna

preporuka je da se prilikom analize teži dobijanju signala maksimalnog mogućeg intenziteta.

Sa druge strane neophodno je voditi računa o stabilnosti uzoraka koji su izloženi dejstvu

lasera. Naime, kod Ramanove mikroskopije je laser fokusiran na relativno malu površinu,

što može dovesti do oštećenja uzorka i za posledicu može imati dobijanje signala koji ne

odgovara stvarnom spektru uzorka. U drastičnim slučajevima, suviše velika jačina lasera

može dovesti do potpunog onemugaćavanja analize usled velikog oštećenja uzorka. Primer

ovakvog dejstva lasera na uzorak je dat na Slici 5.

Slika 5. Uticaj jačine lasera na uzorak. a) Uzorak magnetita pre analize; b) Uzorak

magnetita nakon analize. Laser 532nm, filter 100%, vreme akvizicije 1s, objektiv 50xLWD.

Primetićemo da je laser u velikoj meri oštetio uzorak i samim tim je analiza sa ovim

uslovima nemoguća. Kako bi se sprečio ovakav negativni uticaj na uzorak, preporuka je

smanjiti intenzitet lasera u kombinaciji sa skraćenjem vremena akvizicije.

Napomena: preporučljivo je nakon analize ponovo pregledati površinu uzorka kako

bi se utvrdilo da li je došlo do eventualnog oštećenja. U mnogim slučajevima je moguće

primetiti da dolazi do oštećenja uzorka još dok traje snimanje. Naime, ukoliko se javlja jače

oštećenje uzorka laserom, spektar tokom snimanja u realnom vremenu se naglo pomera i

obično u nekom trenutku dolazi do gubitka signala (spektar se potpuno izgubi), što je znak

da treba prekinuti snimanje, izvršiti kontrolu (i potvrdu oštečenja), a nakon toga promeniti

parametre analize kako bi se dobio spektar odgovarajućeg kvaliteta uz eliminaciju oštećenja

uzorka.

Međutim, kao što je već ranije naglašeno, kod analiza Ramanovom mikroskopijom

treba težiti dobijanju što intenzivnijeg signala kako bi tumačenje rezultata bilo što

jednostavnije i pravilnije.

Uticaj jačine lasera na kvalitet Ramanovog spektra je dat na Slici 6 .

172

Slika 6. Uticaj jačine lasera na kvalitet Ramanovog spektra titanijum dioksida. Laser

532nm, vreme akvizicije 1s, promenljivi filteri 0.1%, 1%, 10%, 25%, 50% i 100%.

Prikazani spektri titanijum dioksida (anatas) ukazuju da se sa svim filterima može

dobiti spektar, pri čemu je najbolji signal dobijen pri maksimalnoj jačini lasera (filter 100%).

Naravno, i ovde važi pravilo da je upotreba lasera pri maksimalnom intenzitetu uslovljena

stabilnošću uzorka koji se analizira.

Uticaj broja otvora na rešetci spektrometra na kvalitet Ramanovog signala

Broj linija na rešetci spektrometra se podešava pre samog snimanja. Preporuka je

krenuti sa manjim brojem otvora, a zatim, ako to analiza zahteva, ovaj broj povećavati.

Većim projem otvora se dobija bolja rezolucija kao i bolje razdvajanje pojedinih traka u

spektru. Treba naglasiti da dolazi i do smanjenja intenziteta signala, kao i da je vreme

snimanja produženo kada se koristi veći broj otvora. Intenzitet signala se može povećati

povećanjem vremena akvizicije.

Napomena: prilikom snimanja koja uključuju promenu otvora na rešetci, obavezno

sačekati da uređaj završi proceduru promene uslova snimanja (promenu na spektrometru)

kako bi se snimanje nastavilo pod novim uslovima. Program LabSpec 6 ne dozvoljava

snimanje sve dok promena broja otvora na rešetci nije završena.

173

Uticaj vremena akvizicije na kvalitet Ramanovog spektra

Vreme akvizicije direktno utiče na kvalitet signala. Generalno, sa dužim vremenom

akvizicije se dobijaju spektri koji su intenzivniji i samim tim pouzdaniji sa aspekta tumačenja

rezultata. Uobičajeno je da se analiza uzorka započne sa kraćim vremenom akvizicije, koje

se zatim može produžiti u cilju dobijanja što kvalitetnijeg spektra. Sa druge strane, suviše

kratko vreme akvizicije može da dovede do drastičnog smanjenja intenziteta signala i

konačno do lošeg tumačenja rezultata.

Napomena: Kod izbora vremena akvizicije treba obratiti pažnju na dve moguće

pojave. Prva je svakako moguće oštećenje uzorka usled dugog izlaganja dejstvu lasera.

Druga moguća pojava je izlaženje signala iz opsega intenziteta i dobijanje neupotrebljivih

spektara. Zato se izbor vremena akvizicije vrši postepeno, počevši od namanjeg vremena

koje daje signal, i postepeno se povećava dok se ne dobije najveći mogući intenzitet za dati

spektar tj. materijal.

Pitanja

1. Koje se sve informacije mogu dobiti primenom Ramanove

spektroskopije/mikroskopije? 2. Koji su uslovi koje mora da zadovolji laboratorija za Ramanovu

spektroskopiju/mikroskopiju? 3. Od čega zavisi izbor odgovarajućeg lasera i postupak kalibracije instrumenta?

4. Koje su razlike u analizi tečnih i čvrstih uzoraka Ramanovom

spektroskopijom/mikroskopijom?

5. Šta sve može uticati na kvalitet dobijenih spektara?

174

Karakterizacija mikroorganizama pomoću Ramanove

mikrospektroskopije

Danka Radić

Izvod

Ramanovim spektrima mogu se pratiti vibracije unutraćelijskih komponenti (proteina, DNK,

RNK, lipida, ugljenih hidrata, vode) u mikroorganizmima. Indentifikacija mikroorganizama

može se vršiti na osnovu razlike u karakterističnim trakama koje predstavljaju vibracije

molekula u posmatranom delu ćelije. Da bi se okarakterisali eukariotski organizmi, potrebno

je snimiti veći broj Ramanovih spektrara istog dela ćelija.

“Ramanovi spektri predstavljaju poseban vid molekulskih emisionih spektara koji

nastaju rasejavanjem intenzivnog monohromatskog zračenja na molekulima jedinjenja.

Ramanova spektroskopija predstavlja eksperimentalnu tehniku koja se zasniva na

neelastičnom rasejanju, najčešće, laserske svetlosti talasne dužine na kojoj je dati materijal

transparentan.” (Hanlon et al., 2000).

Spektroskopske vibracione tehnike, kao što je i Ramanova spektroskopija, koriste se

za identifikaciju različitih mikroorganizama na osnovu vibracija molekula u posmatranim

mikroorganizmima (Rösch et al., 2005).

Ramanova spektroskopija je od nedavno veoma zastupljena metoda, sa savremenim

pristupom biohemijskoj karakterizaciji, ali i za brzu i preciznu klasifikaciju velikog broja

prokariotskih i eukariotskih mikroorganizama (Hamasha, 2011).

Ramanovi spektri mikroorganizama oslikavaju vibracije biohemijskih komponenata

unutar ćelije, konkretno: proteina, DNK, RNK, lipida, ugljenih hidrata, vode kao i

komponenata prisutnih u manjim koncentracijama (Rösch et al., 2011).

Ramanovi spektri dve različite vrste/soja pokazuju male varijacije, koje su posledica

različitog hemijskog sastava pojedinih delova ćelije, npr. ćelijskog zida (Rösch et al., 2011).

Različiti pristupi se primenjuju za karakterizaciju eukariotskih mikroorganizama, npr.

kvasaca ili gljiva. U slučaju eukariotskih mikroorganizama preporučuje se posmatranje više

od jednog Ramanovog spektra, zbog varijacija signala od različitih organela. Neophodno je

snimiti oko pedeset spektara da bi se izvršila statistička analiza i izveli odgovarajući

zaključci. Na osnovu ovoga, zaključuje se, da se Ramanova spektroskopija može koristiti

za karakterizaciju kvasaca i gljiva (Stöckel et al., 2015).

Na primer, u ćeliji kvasca raspodela širine karakterističnih traka oslikava različite

delove ćelije. Karakteristične trake na talasnom broju (1731–1765 cm-1) potiču od C = O

vibracije i predstavljaju frakciju lipida; na talasnom broju (1624–1687 cm-1) je amid I, a

vibracija odgovara C= C lipidnoj vezi; fenilenska traka C= C (1567–1607 cm-1) može se

videti samo na periferiji ćelije (Rösch et al., 2005).

175

Priprema uzoraka

Kvasci

Čistu kulturu ispitivanog soja kvasca inkubirati 24h/280C na YPD medijumu.

U ependorf tubu se sipa 1ml sterilne destilovane vode i doda čista kultura - voditi

računa, da se ne unese hranljiva podloga. Kultura uvek treba da bude iste starosti.

Pre centrifuge (3000 obrtaja, 2 min.), sadžaj u ependorf tubi dobro vorteksovati,

centrifugirati i pažljivo izvući supernatant. Postupak ponoviti tri puta.

Nakon poslednje, treće centrifuge, odstraniti supernatant, dodati 1 ml sterilne

destilovane vode i dobro vorteksovati. Uzeti 0,1ml iz ependorf tube i preneti u drugu, u kome

je 0,9ml sterilne destilovane vode. Vorteksovati.

Uslovi snimanja:

Preporuke za snimanje spektra:

Laser talasne dužine: 532 nm, Greeting (Rešetka): 1200gr/mm, Slit: 50µm, Hole:

500µm, Acquisition time (Vreme snimanja): 20s, Range (Talasni broj): 400-3200cm-1.

Pripremljenu suspenziju naneti na kvarcnu pločicu. Sačekati da se osuši i tek onda pristupiti

snimanju.

Bakterije

Čistu kulturu bakterija inkubirati 24h na odgovarajućem medijumu i temperaturi.

Priprema uzorka je ista kao i kod kvasaca.

Uslovi snimanja:

Preporuke za snimanje spektra:

Laser talasne dužine: 532 nm, Greeting (Rešetka): 600gr/mm, Slit: 50 µm, Hole:

500µm, Acquisition time (Vreme snimanja): 30s, Range (Talasni broj): 400-3200cm-1.

Pripremljenu suspenziju naneti na kvarcnu pločicu. Sačekati da se osuši i potom pristupiti

snimanju.

Dijagram a) Spektar kvasca

176

Dijagram b) Spektar fluorescencije Dijagram c) Spektar izgorele ćelije

Pitanja:

1. Vibracije kojih molekula se mogu pratiti Ramanovom spektroskopijom?

2. Na koji način je moguće razlikovati dva soja mikroorganizama na osnovu njihovih

Ramanovih spektara?

3. Zašto se u slučaju eukariotskih organizama preporučuje posmatranje više od jednog

Ramanovog spektra?

4. Koji uslov mora da zadovolji kultura mikroorganizama koja se analizira Ramanovom

spektroskopijom?

5. Koje trake su karakteristične za Ramanove spektre kvasaca i od čega potiču?

Literatura

Hanlon EB, Manohran R., Koo TW, Shafer TW, Motz JT, Fitzmaurice M, Kramer JR, Itkazan

I, Dasari RR, Feld MS. Prospects for in vivo Raman spectroscopy. Phys Med Biol. 2000

Feb; 45(2): R1 59.

Petra Rösch M., Harz K.-D. Peschke, O. Ronneberger, H. Burkhardt, J. Popp, Identification

of Single Eukaryotic Cells with Micro-Raman Spectroscopy, Biopolymers, Vol. 82, 312–316

(2006).

Petra Rösch, Michaela Harz, Michael Schmitt and Jürgen Popp. Raman spectroscopic

identification of single yeast cells, J. Raman Spectrosc. 2005; 36: 377–379

Hamasha, Khozima Mahmoud. Raman spectroscopy for the microbiological

characterization and identification of medically relevantbacteria (2011). Wayne State

University Dissertations. Paper 311.

Petra Rösch, Stephan Stöckel, Susann Meisel, Ute Münchberg, Sandra Kloß, Dragana

Kusic, Wilm Schumacher, and Jürgen Popp, A Raman spectroscopic approach for the

cultivation-free identification of microbes. Proceedings of SPIE (Optical Society of America,

2011), paper 83111B •doi:10.1364/ACP.2011.83111B.

177

Stephan Stöckel, Johanna Kirchhoff, Ute Neugebauer, Petra Röscha, and Jürgen Poppa,

The application of Raman spectroscopy for the detection and identification of

microorganisms. Journal of Raman Spectroscopy Special Issue: International Year of Light

2015 Volume 47, Issue 1, pages 89–109, January 2016.

178

Polisaharidni ekstrakti gljiva - traganje u mraku

Jovana Vunduk

Izvod

Hemijski sastav polisahardnih ekstrakta gljiva zavisi prevashodno od načina

ekstrakcije.Prednosti primene Ramanove mikroskopije u analizi polisaharidnog ekstrakta

gljiva su: nedestruktivnost, brzina analize, jednostavna priprema uzorka. Međutim, kako su

polisaharidni ekstrakti gljiva složeni sistemi sa brojnim molekulima koji pokazuju vibracije u

Ramanovom spektru, tumačenje dobijenih složenih spektara može biti otežano.

Polisaharidni ekstrakti gljiva su složeni sistemi, dobijeni pretežno vodenom

ekstrakcijom, čije su većinske komponente polisaharidi, mahom glukani. Zavisno od vrste

gljive plodonosna tela mogu sadržati različite količine različitih glukana (Moharram i sar.

2008).

Glukani su polimerna jedinjenja izgrađena od monomera glukoze povezanih α-(1,3),

α-(1,6), β-(1,4) i β-(1,6) glikozidnim vezama (Synytsya and Novak, 2013). Označeni su kao

glavni nosioci bioloških efekata medicinskih gljiva, delijući prevashodno kao

imunomodulatori (Kozarski i sar, 2015). Hemijski sastav ekstrakata gljiva u velikoj meri zavisi

od načina ekstrakcije. Na osnovu navedenog jasno je da karakterizacija različitih ekstrakata

može ukazati na efekat primenjenog postupka ekstrakcije.

Teorijski posmatrano, Ramanova spektroskopija je efikasna metoda za ispitivanje

biološkog materijala kao što su ekstrakti gljiva.

Ramanova spektroskopija ima niz prednosti:

nije destruktivna

ne zahteva bojene agense koji bi posmatrani materijal učinili vidljivim

priprema uzoraka nije zahtevna

merenje traje od nekoliko sekundi do nekoliko minuta

U cilju karakterizacije uzoraka koji sadrže polisaharide, u literaturi se mogu naći različite

talasne dužine za korišćeni laser. Dve najčešće su 850 i 1064 nm. Talasni brojevi koji

odgovaraju polisaharidima su 1485-1464, 1363-1371, 1258-1267, 1118-1131, 1074-1084 i

1040-1048 cm-1 (Synytsya i sar., 2009). Signali u oblasti između 750 i 950 cm-1 pripadaju

anomernim strukturama oko glikozidne veze i potvrda su α i β konfiguracije (Mohaček-

Grošev et al., 2001). Kod rada sa polisaharidnim uzorcima treba očekivati složene spektre

zahvaljujući velikom broju mogućih vibracija (OH, C-H, C-C, C-C-O, C-O, C-O-C, C-O-H)

(Lamrood et al., 2014).

Priprema uzorka

Priprema uzorka kod Ramanove spektroskopije nije zahtevna, ali konkretna

procedura ne postoji. Neke uzorke moguće je meriti direktno - praškaste, rasute, ili

179

rastvorene u vodi. Sama tehnika nije destruktivna. Potrebne količine ne prelaze nekoliko

mg.

Kako definisati vreme snimanja uzorka?

Vreme snimanja je vreme tokom koga je uzorak izložen laseru. Ovaj parametar nije

striktan i bira se na osnovu konkretnog uzorka. Preporučuje se snimanje nekoliko spektara

pri različitim vremenima snimanja da bi se odabrali oni parametri koji obezbeđuju najbolji

spektar.

Šta znači „dobar spektar“?

Dobrim spektrom smatra se onaj kod koga su karakteristični pikovi jasno razdvojeni,

bez segmenata prekrivenih fluorescencijom, jer fluorescencija pokriva pikove od značaja i

čini karakterizaciju nemogućom. Da bi dobijeni podaci mogli statistički da se obrade i budu

od zančaja za izvođenje zaključka potrebno je snimiti oko 50 dobrih spektara.

Problemi koji se mogu javiti

Teorijski, Ramanova spektroskopija je idealna za ispitivanje ekstrakata gljiva. U

realnosti ova metoda ima svojih nedostataka. Uzorci ekstrakata gljiva su složeni sa brojnim

komponentama koje mogu blokirati signal, što rezultuje fluorescencijom koja pokriva deo

spektra ili sve podatke od značaja. U drugom slučaju moguć je i potpuni izostanak signala.

Razlog tome je takođe kompleksnost uzoraka. Čist β-glukan je jasno prepoznatljiv sa

karakterističnim pikovima, no uzorci ne sadrže samo ovaj tip glukana, niti samo glukane,

već i fenolna jedinjenja, proteine. Svi oni mogu usloviti izostanak signala.

Šta nas čeka u budućnosti?

Ekstrakti gljiva polako, gotovo stidljivo dolaze u kontakt sa Ramanovom

spektroskopijom, što govori da je ovo polje istraživanja na svom početku. Istraživanja treba

proširiti uz uvođenje složenijeg prečišćavanja uzoraka.

Pitanja:

1. Šta se podrazumeva pod polisaharidnim ekstraktima gljiva? 2. Od čega zavisi hemijski sastav polisaharidnih ekstrakta gljiva?

3. Kako se definiše vreme snimanja spektara?

4. Šta su karakteristike dobrog spektra?

5. Koji se problemi mogu javiti prilikom analize uzoraka Ramanovom spektroskopijom?

180

Literatura:

Kozarski M, Klaus A, Jakovljević D, Todorović N, Vunduk J, Petrović P, Nikšić M, Vrvić MM,

van Griensven L. Antioxidants of edible mushrooms. Molecules, 2015, 20, 19489-19525.

Lamrood PY, Ralegankar SD, Harpale VM. Application of Raman spectroscopy for chemical

characterization and protein conformation of Agaricus bisporus (Lange) Imabch

(Agaricomycetidae) spores. International Journal of Bioassays, 2014, 3, 3318-3323.

Mohaček-Grošev V, Božac R, Pupples GJ. Vibrational spectroscopic characterization of wild

growing mushrooms and toadstools. Spectrochemica acta Part A, 2001, 57, 2815-2829.

Moharram HA, Salama MF, Hussein AA. Characterization of Oyster mushroom mycelia as

a food supplement. Australian journal of Basic and Applied Sciences, 2008, 2, 632-642.

Synytsya a, Mičkova K, Synytsya A, Jablonsky I, Spevaček J, Erban V, Kovarikova E,

Čopikova J. Glucans from fruit bodies of cultivated mushrooms Pleurotus ostreatus and

Pleurotus eryngii: Structure and potential prebiotic activity. Carbohydrate polymers, 2009,

76, 648-556.

Synytsya A, Novak M. Structural diversity of fungal glucans. Carbohydrate polymers, 2013,

92, 792-809.

181

Primena Ramanove spektroskopije za analizu proizvoda od

mleka

Aleksandar Nedeljković

Izvod

Kvalitet Ramanovih spektara mleka i mlečnih proizvoda zavisi kako od vrste uzorka

(koncentrovani ili razblaženi uzorci), tako i od uslova snimanja. Kod razblaženih uzoraka

najveći problem predstavlja fluorescencija vode. Od uslova snimanja, najveći uticaj na

kvalitet spektara imaju izbor objektiva, vreme akvizicije i temperatura snimanja.

Ramanova spektroskopija, vibraciona spektroskopska tehnika koja se bazira na

neelastičnom rasejanju svetlosti, pruža kvalitativne i kvantitativne informacije o velikom broju

različitih tipova uzoraka i stoga je primenjena u mnogim oblastima istraživanja. Jedno od

njih je i prehrambena tehnologija, industrijska kontrola procesa i kvaliteta proizvoda kao i

primenu u istraživačke svrhe u cilju ispitivanja strukture i strukturnih promena komponenata

hrane. U poređenju sa infracrvenom apsorpcionom spektroskopijom, Ramanova

spektroskopija je pogodnija za ispitivanje komleksnih sistema kakav je hrana, prvenstveno

zbog slabog Ramanovog signala molekula vode (Li-Chan, 1996).

Međutim, tokom izvođenja analize nailazi se na nekoliko problema. Kako bi se u

potpunosti iskoristio potencijal ove moćne tehnike i kako bi se dobili zadovoljavajući spektri,

važno je pravilno podesiti nekoliko parametara Raman uređaja (laser, vreme akvizicije,

spektralni opseg). Neophodno je uzeti u obzir sve specifičnosti ispitivanog uzorka s obzirom

na to da od toga zavisi pravilno podešavanje sistema (Koca, Kocaoglu-Vurma, Harper, &

Rodriguez-Saona, 2010).

Jedna od najvećih prednosti Ramanove spektroskopije je minimalna priprema

uzorka. Na primer, za „čvrste“ proizvode od mleka (sir, maslac itd.) dovoljno je samo

postaviti uzorak na predmetno (mikroskopsko) staklo. S druge strane, za analizu tečnih

proizvoda (konzumno mleko, jogurt itd.) neophodno je koristiti „držač uzorka“. Iako je većina

Raman sistema opremljena specijalizovanim dodacima koji se primenjuju za analizu tečnih

uzoraka i koji podrazumevaju upotrebu kiveta, moguće je jednostavno koristiti posude koje

su dostupne i koje se mogu postaviti na predmetno staklo. Za ovu svrhu male posude od

plastike su se pokazale kao izuzetno pogodne. Osim toga, korišćenje kiveta za analizu

mleka ne daje zadovoljavajuće rezultate zbog velike „zamućenosti“ uzorka.

Najveća mana Ramanove spektroskopije ogleda se u pojavi fluorescencije. U slučaju mleka

i proizvoda od mleka dešava se pri korišćenju lasera talasne dužine 532 nm. Ovaj

nedostatak moguće je otkloniti upotrebom lasera veće talasne dužine (785 nm, 1064 nm)

(Slika 1.), ali na račun smanjenja intenziteta signala. Međutim, produžavanjem vremena

akvizicije dobijaju se spektri viskokog kvaliteta. Slično tome, duže vreme snimanja (duže od

45 s) primenjuje se za analizu mleka (Slika 2.).

Nasuprot tome, kod različitih „koncentrovanih“ mlečnih proizvoda (mleko u prahu, sir,

kajmak itd.) gde je sadržaj vode niži u odnosu na mleko, dobijeni spektri su intenzivniji, pa

je 10 – 20 s dovoljno za odgovarajuću akviziciju.

182

Slika 1. Fluorescencija u analizi uzoraka mleka

Još jedno važno pitanje u Ramanovoj spektroskopskoj analizi proizvoda od mleka je izbor

objektiva. Ukoliko je zadatak analize ispitivanje celokupne mase proizvoda, a ne pojednih

mikrostrukturnih delova, generalno je bolje koristiti objektiv manje moći uveličanja (x10, x5).

Korišćenje mikroskopa daje monogobrojne pogodnosti prilikom akvizicije spektara, ali

ispitivanje male površine može dovesti do poteškoća pri ispitivanju uzoraka kod kojih dolazi

do separacije faza ili kod uzoraka koji sadrže definisane delove kao što su lipidne sfere –

masne globule. Ovaj problem se može rešiti snimanjem na više različitih pozicija na uzorku

ili prethodnim mapiranjem. Mapiranjem bi se eventualno moglo dokazati da različitost delova

uzoraka ne predstavlja problem.

Slika 2. Uticaj dužine snimanja na kvalitet spektra

Na kraju, vrlo važno pitanje predstavlja temperatura uzorka tokom akvizicije spektara. Iz tog

razloga, mora se posvetiti značajna pažnja izboru odgovarajuće temperature i odabrana

temperatura se mora koristiti tokom cele date analize (Abbas, Fernandez Pierna, Codony

von Holst, Baeten, 2009; Baeten i sar., 2005). Ovo je od izuzetnog značaja za mlečne

proizvode sa visokim sadržajem masti (pavlaka, maslac, punomasni sirevi), s obzirom na to

da se strukturne karakteristike mlečne masti menjaju značajno sa promenom temperature,

a promena strukture se oslikava u Ramanovim spektrima. Bez obzira na to, primećeno je

da držanje uzorka na sobnoj temperaturi 30 – 60 min pre analize daje zadovoljavajuće

183

rezultate. U slučaju drugih temperatura, neophodno je koristiti uređaj za odražavanje

temperature.

Pitanja:

1. Šta su prednosti Ramanove mikroskopije/spektroskopije u poređenju sa

infracrvenom spektroskopijom?

2. Zbog čega nije preporučljivo korišćenje kiveta pri analizi uzoraka mleka?

3. Šta je najveća mana Ramanove spektroskopije pri analizi uzoraka mleka?

4. Od čega zavisi izbor objektiva pri analizi uzoraka mleka Ramanovom

mikroskopijom/spektroskopijom?

5. Na koji način temperatura utiče na izgled Ramanovih spektara mleka?

Literatura:

Abbas, O., Fernández Pierna, J. A., Codony, R., von Holst, C., & Baeten, V. (2009).

Assessment of the discrimination of animal fat by FT-Raman spectroscopy. Journal of

Molecular Structure, 924–926(0), 294-300. doi:

http://dx.doi.org/10.1016/j.molstruc.2009.01.027

Baeten, V., Fernández Pierna, J. A., Dardenne, P., Meurens, M., García-González, D. L., &

Aparicio-Ruiz, R. (2005). Detection of the Presence of Hazelnut Oil in Olive Oil by FT-Raman

and FT-MIR Spectroscopy. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53(16), 6201-6206.

doi: 10.1021/jf050595n

El-Abassy, R., Donfack, P., & Materny, A. (2009). Rapid Determination of Free Fatty Acid in

Extra Virgin Olive Oil by Raman Spectroscopy and Multivariate Analysis. Journal of the

American Oil Chemists' Society, 86(6), 507-511. doi: 10.1007/s11746-009-1389-0

Koca, N., Kocaoglu-Vurma, N. A., Harper, W. J., & Rodriguez-Saona, L. E. (2010).

Application of temperature-controlled attenuated total reflectance-mid-infrared (ATR-MIR)

spectroscopy for rapid estimation of butter adulteration. Food Chemistry, 121(3), 778-782.

doi: http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2009.12.083

Li-Chan, E. C. Y. (1996). The applications of Raman spectroscopy in food science. Trends

in Food Science & Technology, 7(11), 361-370. doi: http://dx.doi.org/10.1016/S0924-

2244(96)10037-6

184

Ramanova spektroskopija u biljnim istraživanjima, detekcija

karotenoida u plodovima

Ilinka Pećinar

Izvod

Prednost Ramanove mikroskopije u analizi biljnog materijala je sposobnost da obezbedi

informaciju o koncetraciji, strukturi i interakciji molekula u ćelijama i tkivima, bez njihove

degradacije. Međutim, prilikom snimanja Ramanovih spektara može doći do

autoflorescencije (koja potiče od prisutnih fenolnih jedinjenja). Kako bi se izbegla pojava

autoflorescencije pri upotrebi vidljive svetlosti, primenjuje se tzv. NIR-FT-Ramanova

spektroskopija pri kojoj se spektri snimaju na talasnim dužinama bliskim infracrvenom delu

spektra.

Da bi se bolje razumela struktura, hemijski sastav i svojstva biljnih ćelija, tkiva i

organa tokom poslednjih godina primenjen je veći broj mikroskopskih, hemijskih i fizičkih

metoda (Gierlinger i Schwanninger 2007). Ramanova spektroskopija sa različitim dodatnim

tehnikama i metodama se primenjuje oko 30 godina unazad i na biljnom materijalu, takva

istraživanja se obavljaju na makro i mikro nivou. Ramanova spektroskopija je tehnika

potpuno suprotna svetlosnoj mikroskopiji, skening elektronskoj mikroskopiji (SEM) i

transmisionoj elektronskoj mikroskopiji (TEM), koje obezbeđuju samo morfološke

informacije o posmatranom uzorku. Osim toga, nedestruktivna priroda Ramanove

spektroskopije uz minimalne zahteve za pripremu uzoraka do nepostojanja bilo kakve

pripreme uzorka čini je izuzetno korisnom za različite analize uzoraka.

Na polju biljnih istraživanja Raman je prvo korišćen u istraživanjima traheidnih ćelija

unutar ksilema kod drvenastih vrsta 80-ih godina dvadesetog veka (Atalla i Agarwal 1986).

Tokom godina tehnološki razvoj na polju filtera, detektora i lasera omogućio je da Ramanov

spektroskop postane pogodniji za istraživanja na biljnom materijalu (Agarwal 2014).

Primena Ramanove spektroskopije na biljnom materijalu dosta varira od tipa

materijala, a uključuje istraživanja na strukturnim polimerima od metabolita do mineralnih

substanci (Gierlinger i Schwanninger 2007). Ramanova spektroskopija je od velikog značaja

za istraživanje različitih tipova biljnih tkiva jer obezbeđuje informacije na molekularnom nivou

o sastavu i strukturi ćelijskih delova in situ bez bojenja i komplikovanog pripremanja uzoraka

(npr. celuloze i pektina: Atalla i Agarwal 1986; Gierlinger i sar. 2010, karotenoida u plodu

paradajza: Qin i sar. 2012; Baranska i sar. 2006, skroba, lipida i proteina u plodu pšenice:

Manfait i sar. 2004). To je relativno specifična spektroskopska tehnika koja meri različite

pokrete funcionalnih grupa koje sadrže veze kao što su C–C, C–O, C–H i O–H (Marquardta

i Wold, 2004). Jako bitna prednost ove tehnike je sposobnost da obezbedi informaciju o

koncetraciji, strukturi i interakciji molekula u netaknutim ćelijama i tkivima (Nikbakht i sar.

2011). Dobro je poznato da je informacija dobijena Ramanovom spektroskopijom može

dopuniti informacijama dobijenim infra crvenom (IR) spektroskopijom (Lang i sar.. 1986).

Jedan od glavnih problema primene Ramanove spektroskopije na biljnom materijalu je

velika autoflorescencija koju izazivaju fenolna jedinjenja (npr. lignini) pobuđeni vidljivom

svetlošću. Pored toga, energija potrebna za generisanje Ramanovog signala koji je

185

detektabilan iznad autofluorescencije, može izazvati grejanje i posledičnu modifikaciju

biljnog tkiva. Primena tehnika NIR-FT-Ramanove spektroskopije (1064 nm) dovodi do šire

upotrebe na biljnom materijalu eliminišući problem florescencije uzorka (Agarwal 2014). Za

mapiranje i formiranje slike uzoraka celih organa (semena, plodova, listova) spoljašnja

rezolucija (oko 10μm) NIR-FT tehnike je najpogodnija, dok je za istraživanja na nižem supnju

organizacije ćelije i ćelijskog zida veća rezolucija sa vidljivim laserom neophodna.

Ramanova spektroskopija i detekcija karotenoida u plodovima

Istraživanja različitih vrsta karotenoida je analizirana na nekoliko tipova plodova kod ruže,

nektarine, šljive, paprike, kukuruza i plodova paradajza. Cilj je bio da se prepoznaju moguće

razlike u tipovima karotenoida i njihovim intenzitetima u više tipova plodova, posebno u deliu

perikarpa.

Spektroskopska merenja

Ramanovi spektri su dobijeni u opsegu, talasnom broju od 900–2000 cm-1 sa mikro-Raman

uređaju (HR LabRam inverse system, Jobin Yvon Horiba). Ramanovo rasejavanje je

pobuđeno Nd/YAG laserom na talasnoj dužini od 532 nm sa snagom lasera na uzorku od

oko 2 mW. Disperzioni spektrometar ima otvor veličine 100 lm i dužinu od 800 mm i rešetku

od 1200 linija mm-1. Ramanova svetlost je detektovana CCD kamerom na 220 K. Za

kalibraciju su korišćeni titanijum dioksid i 4-acetamidofenol (4-acetamidophenol, 4AAP) koji

su mereni svakog dana.

Za analizu karotenoida u plodovima paradajza uzeti su u obzir sledeđe faze u razvoju:

nezrela zelena (20 DPA, dana nakon anteze), zrela zelena (39 DPA) i faza zrelog ploda (52

DPA). Na poprečnom preseku kroz plod na tri regiona ploda (perikarp, želatinozno tkivo i

placenta) mereno je oko deset puta, ukupno je dobijeno 30 spektara za svaku razvojnu fazu

ploda. Ukupno vreme snimanja na svakom uzorku je bilo po 1 sekund bez korekcija filtera.

Na svim merenjima su korigovane bazne linije, normalizovan intenzitet, uklonjene sumljive

trake iz spektara i uticaj kosmičkih zraka.

186

Slika 1. Ramanovi spektri na stupnju nezrelog ploda paradajza

Na Slici 1. se jasno vidi da karotenoidi pokazuju dva glavna Ramanova pika u dva odvojena

spektralna regiona, 1100–1200 i 1400–1600 cm_1, zbog pokreta C-C and C=C veza u

polienskom lancu, koji čini strukturu karotenoida: likopena, β-karotena i α- karotena (Schulz

i Baranska, 2007). Na osnovu intenziteta spektra kod paradajza u fazi nezrelog i zrelog

zelenog ploda postoji prisustvo luteina na talasnom broju 1520 i 1523 cm-1. Uočeno je da

karotenoidi nisu detektovani u spoljašnjem perikarpu, egzokarpu, pre faze zrenja, dok su u

fazi zrelog zelenog ploda detektovani pikovi koji ukazuju na prisustvo β-karotena i likopena.

Slika 2. Ramanovi spektri zrelog ploda paradajza u regionu od 900-1,600 cm-1, poseduju

nekoliko pikova kao rezultat prisustva vibracije molekula i prisustva C-C i C=C veza

Likopen se prvo detektuje u želatinoznom tkivu na stupnju zrelog ploda, dok se pre

toga njegov signal nije mogao uočiti. Intenzitet likopena je rastao u želatinoznom tkivu i u

celom perikarpu tokom faze zrenja. Kod ploda paradajza na stupnju zrelog ploda, veze na

talasnom broju 1,156 i 1,510 cm-1, su u direktnoj vezi sa pokretima usled veza C-C i C=C

kod likopena, svaki za sebe ponaosob (Slika 2). Osim toga, veze na talasnim brojevima

187

1,524 cm-1 i 1,157 cm-1 mogu biti dodeljeni pokretima usled istezanja C=C i C-C u β-

karotenu, svaki za sebe ponaosob (Schulz i sar., 2005). Osim toga, pokreti u ravni CH3

grupa priključeni polienskom lancu i u kombinaciji sa C-C vezama mogu se uočiti u vidu

pika srednjeg intenziteta na talasnom broju od 1,000-1,020 cm-1 (Slika 2).

Prema Slici 1 i razmatranjem konjugovanih veza u karotenima i likopenu, uočeno je

da je pozicija pika na 1,520 cm-1 na Slici 2 ukazuje na dominaciju karotena u odnosu na

likopen. Takođe se može videti da je pik usled veze na talasnom broju 1,143 (ili 1,157)

asimetričan i pokazuje prisustvo tri ”ramena”, nova pika koji su verovatno u vezi sa β-

karotenom ili likopenom. Cilj je da se uoče dva odvojena spektralna regiona na boljoj

spektralnoj rezoluciji (grating 1200 linija mm-1) zbog boljeg razdvajana karotenoida (Slika 3).

Detaljna analiza gore pomenutih spektralnih regiona je urađena dekonvolucijom spektara.

Ova analiza je ostvarena alatkom za analizu pikova “peak analyzer” softvera Origine

korišćenjem Vojtove (Voight) funkcije. Dekonvulzijom spektara dobijaju se merni parametri

razdvojenih pikova koji mogu opisati pojedine tipove karotenoide, kao što su: površina pika,

relativni intenzitet, pozicija, maksimalna širina na polovini (FWHM) pika. Neki od parametara

su pokazali direktne razlike u pojedinim delovima ploda paradajza koji su u vezi sa zrenjem

ploda, to se posebno odnosi na relativni intenzitet i površinu pika.

Slika 3. Dekonvulzija (razdvajanje) dva glavna karotenoidna signal u plodu paradajza

188

Slični spektri karotenoida dobijeni su i na drugim tipovima plodova (Slika 4).

Slika 4. Ramanovi spektri 1. Zbirna orašica kod šipurka, 2. koštunica šljive, 3. Bobica

paprika, 4. Koštunica nektarine, 5. Krupa kukuruza

189

Pitanja:

1. Koje su prednosti Ramanove spektroskopije za izučavanje biljnog materijala u

poređenju sa skenirajućom elektronskom mikroskopijom (SEM) i transmisionom

elektronskom mikroskopijom (TEM)?

2. Od čega zavisi primenljivost Ramanove mikroskopije za izučavanje biljnog

materijala?

3. Koji su glavni problem do kojih dolazi prilikom snimanja Ramanovih spektara biljnog

materijala?

4. Na koji način stepen zrenja ploda utiče na položaj i intenzitet pika?

5. Šta je dekonvulzija spektara i koje informacije se njome mogu dobiti?

Literatura

AGARWAL, U.P. 2014. 1064 nm FT- Raman spectroscopy for investigations of plant cell walls

and other biomass materials,Front Plant Sci. 5: 1-12.

ATALLA, R.H. and AGARWAL, U.P. 1986. Recording Raman spectra from plant cell walls. J.

Raman Spectrosc. 17: 229–231.

BARANSKA, M, SCHULTZE, W and SCHULZ, H. 2006. Determination of Lycopene and â-

Carotene Content in Tomato Fruits and Related Products: Comparison of FT-Raman, ATR-

IR, and NIR, Spectroscopy Anal. Chem. 78, 8456-8461.

GIERLINGER, N. and SCHWANNINGER, M. 2007. The potential of Raman microscopy and

Raman imaging in plant research Review Spectroscopy21: 69–89.

GIERLINGER, N, LUSS S, KÖNIG, C, KONNERTH, J, EDER, M and FRATZL P. 2010. Cellulose

microfibril orientation of Picea abies and its variability at the micron-level determined by

Raman imaging. J. Exp.Bot. 61: 587–595.

LANG, PL, KATON, JE, and O’KEEFE, JF.1986.The identification of fibers by infrared and

Raman microspectroscopy. Microchem.J. 34: 319–331.

MANFAIT M., PIOT, O. and AUTRANJC. 2004. Raman Mapping of Wheat Grain Kernels.

http://www.horiba.com/fileadmin/uploads/Scientific/Documents/Raman/Bio04.pdf

MARQUARDTA, B. J. and WOLD, J. P. 2004. Raman Analysis of Fish: A Potential Method for

Rapid Quality Screening. Lebensm.-Wiss. u.-Technol., 37: 1–8.

NIKBAKHT, A. M., TAVAKKOLI HASHJIN T., MALEKFAR, R. and GOBADIAN B. 2011. Nondestructive

Determination of Tomato Fruit Quality Parameters Using Raman Spectroscopy,J. Agr. Sci.

Tech. Vol. 13: 517-526.

QIN, J, CHAO, K. and KIM, MS. 2012. Nondestructive evaluation of internal maturity of

tomatoes using spatially offset Raman spectroscopy. Postharvest Biol. Tec. 71:21–31.

190

Karakterizacija materijala metodom Ramanove mikroskopije

Steva Lević

Izvod

Primenom Ramanove mikroskopije u karakterizaciji materijala moguće je utvrditi hemijski

sastav, morfološke karatkteristike, diistribuciju tražene komponente, itd. Da bi se

lokalizovalo prisustvo specifične komponenti u složenim sistemima (npr. prilikom

inkapsulacije), neophodno je snimiti spektar čiste supstance. Međutim, kako bi se spektar

mogao analizirati i uočiti prisustvo karakterističnih traka neophodna je tzv. obrada spektra

koja podrazumeva korekciju bazne linije, normalizaciju intenziteta i uklanjanje sumnjivih

traka.

U poslednjih nekoliko godina, Ramanova mikroskopija je privukla veliku pažnju kao

pogodna tehnika za karakterizaciju čvrstih materijala i kompozita. Njenom primenom

moguće je dobiti različite informacije kao sto su hemijski sastav uzorka, morfološke

karakteristike, distribucija pojedinih komponenti, struktura materijala, mehaničke

karakteristike uzorka, itd. Neke od glavnih prednosti Ramanove mikroskopije su

pouzdanost, generalno jednostavna interpretacija podataka, nedestruktivna analiza

uzoraka, mogućnost mapiranja uzorka kao i proučavanje profila po dubini uzorka (Hollricher,

2011;Fries i Steele, 2011).

Preporuka je analizirati čiste komponente pre hemijskih procesa ili mešanja

komponenti. Čvrsti uzorci, kristalni ili praškasti se mogu analizirati tako što se jednostavno

nanesu na mikroskopsku pločicu. U ovom slučaju, rezultati se mogu dobiti za nekoliko

sekundi (Sl.1).

Slika 1. Ramanovi spektar etil vanilina. Vreme akvizicije 1s, laser 532nm.

191

Ramanovi spektar etil vanilina pokazuje nekoliko izraženih traka koje su u saglasnosti

sa hemijskom strukturom ove arome. Materijali sa kristalnom strukturom (kao što je etil

vanilin) mogu se relativno jednostavno analizirati pomoću Ramanove mikroskopije s

obzirom da se spektar može dobiti za kraće vreme akvizicije i pri maksimalnoj snazi lasera.

Kada je spektar čiste komponete poznat, tada je moguće je lokalizovati prisustvo

komponenti u složenim sistemima. Ovo je posebno pogodno u slučaju formiranja čvrstih

čestica koje sadrže aktivne komponente (npr. inkapsulisane aktivne komponente).

Efikasnost inkapsulacionog procesa se može analizirati pomoću Ramanove mikroskopije u

kombinaciji sa mapiranjem površine čestica (Sl. 2).

Slika 2. Ramanovo mapiranje mikročestica karnauba voska i slobodnog etil vanilina koji

nije inkapsulisan u strukturu nosača (odnosno voska).

Slobodna aroma je vidljiva u obliku kristala na površini čestice. Međutim, okrugli oblik

čestice onemogućava simultanu identifikaciju svih kristala na površini čestice svetlosnom

mikroskopijom (Sl. 2a). Korišćenjem Ramanove mikroskopije je moguće prevazići ovaj

problem i kao rezultat je moguće uočiti mnogo više kristala etil vanilina (Sl. 2b). Spektri za

mapiranje su dobijeni korišćenjem akvizicijskog vremena od 1s a rezultati su prikazani kao

maksimum na 1576cm-1 (najintenzivnija traka u Ramanovom spektru etil vanilina).

Međutim, neke analize zahtevaju duže vreme akvizicije kako bi se dobili odgovarajući

Ramanovi spektri. Na Slici 3.A2A3. su prikazana dva spektra istog uzorka dobijeni pri dva

različita vremena akvizicije.

192

Slika 3. Uticaj vremena akvizicije na spektar kompozita na bazi celuloze.

Duže vreme akvizicije je neophodno kada je intenzitet glavnih traka nije dovoljno jak za

interpretaciju. U ovom slučaju, Ramanova mikroskopija se pokazala kao odlična metoda za

karakterizaciju kompozitnih matrijala i uspešnu identifikaciju razlika koje se javljaju tokom

pripreme uzorka.

Analiza prirodnih polimera se može efikasno vršiti pomoću Ramanove mikroskopije. Kao što

se može videti na Slici 4., Ramanovi spektar natrijum alginata pokazuje nekoliko izraženih

traka koje su povezane sa njegovom strukturom i molekulskim osobinama. Primena

Ramanove mikroskopije za ovakve analize obično zahteva optimizaciju metode u cilju

dobijanja informacija za dalje analize (vidi ispod).

Nekoliko glavnih parametara se mora podesiti pre finalne analize. Glavni parameter

je odabir talasne dužine lasera koji će se koristiti za analizu. Mnogi materijali pokazuju jaku

florescenciju, posebno kada se koristi laser na 532nm. Generalno, u slučaju jake

florescencije se preporučuje laser sa većom talasnom dužinom (npr. 785nm ili 1064nm).

Doijeni podaci zahtevaju dodatnu obradu i iterpretaciju pre izvođenja konačnih zaključaka o

analiziranom uzorku. Na Slici 4 su prikazani osnovni i obrađeni Ramanovi spektri natrijum

alginata.

193

Slika 4. Naknadna obrada Ramanovog spektra natrijum alginata.

Dobijeni spektar čistog natrijum alginata je postepeno obrađen „smoothing“ interpolacijom i

korekcijom bazne linije u cilju eleminisanja što je moguće više podataka koji ne pripadaju

spektru alginata. Konačno, obrađeni spektar nakon korekcije bazne linije i identifikacije

pojedinih traka daje podatke koji se mogu koristiti u daljim analizama.

Obrada osnovnih spektara se može podeliti u sledeće operacije:

1. „Smoothing“;

2. Korekcija bazne linije;

3. Normalizacija intenziteta;

4. Uklanjanje sumljivih traka iz spektara.

Ova obrada se naziva još i“pre-processing” podataka i neophodna je posebno ako su dalje

analize potrebne (npr. statistička analiza podataka).

Kada se ispituje nepoznata komponenta, tada se spektri sličnih komponenti mogu naći

online (odnosno u online bazama spektara) i uporediti sa analiziranim uzorkom

(http://sdbs.riodb.aist.go.jp/sdbs/cgi-bin/direct_frame_top.cgi). Ovo može biti korisno kod

identifikacije komponenti i interpretaciji rezultata.

194

Pitanja:

1. Koje informacije se mogu dobiti analizom čvrstih materijala i kompozita Ramanovom

mikroskopijom?

2. Zbog čega je potrebno poznavati Ramanovi spektar čiste supstance?

3. Na koji način je moguće pratiti efikasnost inkapsulacije Ramanovom mikroskopijom?

4. U kojim slučajevima je neophodno primeniti duže vreme akvizicije?

5. Šta se podrazumeva pod obradom Ramanovih spektara?

Literatura:

Fries, M., Steele, A. (2011). Raman Spectroscopy and Confocal Raman Imaging in

Mineralogy and Petrography. In Dieing, T., Hollricher, O., Toporski, J. (Eds). Confocal

Raman Microscopy. Springer-Verlag Berlin Heidelberg, pp. 111-135.

Hollricher, O. (2011).Raman Instrumentation for ConfocalRaman Microscopy. In Dieing, T.,

Hollricher, O., Toporski, J. (Eds). Confocal Raman Microscopy. Springer-Verlag Berlin

Heidelberg, pp. 43-60.

Spectral Database for Organic Compounds, AIST (SDBS).

http://sdbs.riodb.aist.go.jp/sdbs/cgi-bin/direct_frame_top.cgi

195

Polarizaciona mirkoskopija

Dragana Rančić

Izvod

Polarizaciona mikroskopija je metoda za analizu anizotropnih materijala. Naime usled

fenomena dvostruke refrakcije, tj. postojanja više indeksa prelamanja u okviru datog

materijala, moguće je dobiti informacije o apsorpciji, boji, strukturi, sastavu, prelamanju

svetlosti i drugim svojstvima različitih supstanci koje se mogu koristiti za karakterizaciju i

identifikaciju različitih materijala.

Polarizaciona mikroskopija podrazumeva osvetljavanje uzorka polarizovanom

svetlošću. Obična, nepolarizovana, svetlost (bilo da je u pitanju sunlčeva svetlost ili

svetlost poreklom od većine drugih izvora veštačkog osvetljenja) je elektromagnetni talas

čiji elektrioni osciluju normalno na smer prostiranja. Kod bele svetlosti smer oscilacija

može biti u bilo kojoj od beskonačno mnogo ravni oko centralne ose, dok je kod

polarizovane svetlosti smer osclacija samo u okviru jedne ravni. Nepolarizovanu svetlost

je moguće prevesti u polarizovanu pomoću specijalnih filtera koji dozvoljavaju da kroz njih

prodje svetlost koja oscilira samo u jednoj ravni (Fig. 1) (Collett, 1993).

Slika 1. Polarizacioni filter dozvoljava prolazak samo onih svetlosnih talasa koji

osciluju u određenom smeru

Mikroskopska proučavanja koja podrazumevaju primenu polarizovane svetlosti su

naročito pogodna za posmatranje anizotropnih uzoraka. Izotropni materijali, kao što su

neke vrste stakla ili kristali sa kubičnom rešetom, imaju iste optičke osobine u svim

smerovima, dok anizotropni materijali imaju optičke karakteristike koje zavise od

orijentacije upadne svjetlosti. Oko 90% svih čvrstih supstanci su anizotropne. Kada se ovi

anizotropni materijali rotiraju, posmatrač može da vidi promenu u boji i intenzitetu

polarizovane svetlosti što zavisi od orijentacije materijala i od puta svetlosnih zraka. Ova

tehnika omogućava istraživačima da dobiju informacije o apsorpciji, boji, strukturi,

sastavu, prelamanju svetlosti i drugim svojstvima različitih supstanci koje se mogu koristiti

za karakterizaciju i identifikaciju različitih materijala. Uzorci koji imaju više od jednog

indeksa prelamanja (npr. mnoge organske ili neorganske kristalne materije) proizvode

efekte dvostruke refrakcije, što znači da će se, ako se posmatraju polarizacionim

196

mikroskopom, u vidnom polju pojaviti kao svetla u odnosu na tamnu pozadinu. Zbog toga

posmatranje nekih bioloških uzoraka u polarizacionom svetlu donekle podseća na tehniku

tamnog polja, međutim u odnosu na običnu svetlosnu mikroskopiju korišćenje

polarizovanog svetla značajno pojačava kontrast i poboljšava kvalitet dobijene slike

anizotropnih materijala.

Polarizacioni mikroskop u svom sastavu ima dva polarizaciona filtera: prvi se

naziva polarizator i smešten je na svetlosnom putu pre nego što svetlost padne na

uzorak, dok se drugi naziva analizator i nalazi se u optičkom putu svetlosti između uzorka

i oka posmatrača (Collett 1993). Polarizovana svetlost nastaje prolaskom svetlosti kroz

polarizator koji dopušta prolazak svetlost samo u jednom pravcu. Analizatorom se

određuje količina i smer svetlosti koja osvetljava uzorak, a slika koja nastaje je posledica

interakcije polarizovane svetlosti i anizotropnog uzorka. Kada su analizator i polarizator

u optičkom putu, pravac propuštanja svetlosti polarizatora je pod pravim uglom u odnosu

na pravac propuštanja svetlosti analiztora, što znači da je potpuno blokiran prolazak

svetlosti, pa se pri pogledu kroz okular mikroskopa uočava samo tamno polje. Kristalne

strukture, ako postoje u uzorku, rotiraju mali deo polarizovane svetlosti koja dolazi od

polarizatora, dozvoljavajući svetlosti da prodje kroz analizator do oka posmatrača. Zbog

toga su slike uzoraka dobijene posmatranjem polarizacionim mikroskopom uglavnom

tamne, a svetli su samo oni delovi koji pripadaju optički anizotropnim objekatima (Slika

2).

Polarizaciona mirkoskopija se može koristiti u reflektovanom (odbijenom) ili

transmitovanom (propuštenom) svetlu (McClung 1950). Propušteno svetlo se odnosi na

svetlo koje dolazi obično sa donje strane uzorka, prolazi kroz uzorak i dolazi do oka

posmatrača. Na svom putu svetlo prolazi kroz kondenzor koji omogućava posmatraču

da dobije sliku sa pojačanim kontrastom. Reflektovano svetlo se koristi za proučavanje

neprovidnih materijala, kao što su metali, legure, mineralni oksidi i sulfidi i u tom slučaju

do oka posmatrača dolazi samo svetlost koja je odbijena od uzorka.

Polarizaciona mirkoskopija ima širok spektar primene. Ova tehnika se može

koristiti za kvalitativna i kvantitativna proučavanja u nauci o materijalima, geologiji, hemiji,

biologiji, metalurgiji i medicini. Iako je polarizacioni mikroskop možda najpoznatiji po

svojoj primeni u oblasti geologije, gde se prvenstveno koristi za proučavanje stena i

minerala, on ima veliku primenu i u proučavanju mnogih drugih materijala uključujući

prirodne i industrijske minerale, kompozite kao što su cement, keramika, mineralna

vlakna, polimeri i kristali. Takođe se koristi i za forenzička ispitivanja. Različite

komponente u biološkim uzorcima omogućavanju njihovo posmatranje u polarizovanom

svetlu, poput mehaničkih vlakna i ksilema unutar pojedinih biljnih organa (Slika 2A), dlaka

koje se nalaze na površini biljaka, polenovih zrna, skrobnih zrna (Slika 2B) (Henry et al

2011), ribljih krljušti, kostiju, vune (Sl. 2C) i dlaka životinja i ljudi (Sl. 2D). Moguće je,

takođe, posmatrati proces ćelijske deobe, raspored ćelija unutar nekog tkiva (Ivanov i

Ignatov 2013), celulozane mikrofibrile i druge detalje vezane za građu ćelijskog zida

197

(Leney 1981), silikatna tela u biljkama (Dayanandan i sar., 1983.), neprovidne ili "debele"

uzorke kao i niz drugih uzoraka.

Slika 2. Neki biološki uzorci posmatrati polarizacionim mikroskopom: A- poprečni

presek stabla pšenice, B- skrobna zrna krompira, C- vuna, D- ljudska kosa

Pitanja:

1. U čemu se ogleda princip tehnike polarizacione mikroskopije?

2. Koja je razlika u analizi izotropnih i anizotropnih materijala polarizacionom

mikroskopijom?

3. Šta se podrazumeva pod efektom dvostruke refrakcije?

4. Koji su elementi koji ulaze u sastav polarizacionog mikroskopa i šta je njihova

funkcija?

5. Koje su razlike u primeni polarizacione mikroskopije u reflektovanom i

transmitovanom svetlu?

Literatura

Collett, E., (1993) Polarized Light: Fundamentals and Applications. Marcel Dekker, New

York, 581 pages

McClung, C., (1950). The microscopical investigation of biological materials with polarized

light., Handbook of Microscopical Technique, 591-677.

Ivanov OV and Ignatov MS2013 2D Digitization of Plant Cell Areolation by Polarized Light

Microscopz. Cell and Tissue Biology 7, 103-112.

198

Dayanandan P, Kaufman PB, Franklin CI 983 Detection of Silica in Plants. American

Journal of Botany 70, 1079-1084.

Leney L. 1981 A Technique for Measuring Fibril Angle Using Polarized Light

Henry AG, Brooks AS, Piperno DR 2011 Microfosils in calculus demonstrate consumption

of plants and cooked foods in Neanderthal diets ((Shanidar III, Iraq; Spy I and II, Belgium)

Proc Natl Acad Sci U S A. 108: 486–491.

199

Kratko uputstvo za upotrebu Ramanovog spektrometra

Horiba Xplora

Dejan Lazić

Kada monohromatska svetlost lasera pogodi uzorak, većina te svetlosti se odbije

bez promene frekvencije. Deo fotona prenese energiju na uzorak a on je emituje sa

promenjenom frekvencijom. Ako uzorak absorbuje energiju i polako je ispusta pojava se

naziva fluorescencija. Trenutne promene u frekvenciji su Ramanovo rasejanje.

Pomeraj u talasnoj dužini, Ramanovi efekat, tačno odgovara razlici energije

izmedju osnovnog i pobuđenog stanja molekula koji je absorbovao foton. Emitovana

svetlost manje energije se naziva stoksove linije a veće antistoksove. Antistoksove

nastaju ako je molekul već bio u pobuđenom stanju u trenutku nailaska fotona. S obzirom

da u uzorku imamo vise molekula u osnovnom stanju videćemo više stoksovih linija.

Antistoksove mogu biti posebno zanimljive ako fluorescencija maskira stoksove.

Slika 1. Konstrukcija Ramanovog mikroskopa

Svetlost lasera se fokusira na uzorak a Ramanovi signali preko filtera i difrakcione resetke

dolaze do CCD detektora.

200

Uključi aparat pritiskom na prekidač na produžnom kablu.

Uključi kompjuter, pokreni LabSpec 6, ikonica na sred ekrana.

Proveri da li je napajanje lasera uključeno

Slika 2. Osnovne komande na LabSpec 6

Kontrolna tabla

Browser – lista otvorenih podataka u LabSpec-u

Acquisition - Podesi parametre snimanja uključujući i hardversku knfiguraciju

Info- detalji fajla

Processing – Izmeni snimljene podatke – korekcija bazne linije…

Analysis - Analiziraj rezultate

Display - Podesi način prikazivanja spectra, snimka ili mapiranja

Methods – Napravi program

Maintenance: Pristup funkcijama održavanja aparata, autokalibracija…

201

Autokalibracija

Ukoliko se na dnu ekrana pojavi crvena oznaka AC potrebno je uraditi autokalibraciju.

Postavi referentni silikonski preparat pod mikroskop sa označenim objektivom 100X

Izoštri

Pritiskom na AC aktiviraj process autokalibracije

Video prikaz

Filter točak postavi na poziciju broj 2

Aktiviraj kameru ,

Podesi objektiv koji koristiš

zaustavi , ako želiš sačuvaj snimak

202

Ramanovi spektar u realnom vremenu

Filter točak postavi na poziciju broj 1

Podesi centralnu poziciju spektra

Podesi ekspoziciju – vreme merenja za prikaz

rezultata u realnom vremenu

Podesi objektiv

Veci broj linija rešetke daje bolju rezoluciju ali uži spektar

Podesi intenzitet lasera.

Podesi talasnu dužinu lasera.

Manji prorez daje bolju rezoluciju, ali slabiji intenzitet.

Manja rupa daje bolju rezoluciju, ali slabiji intenzitet.

Aktiviraj snimanje u realnom vremenu . Zaustavi na

203

Snimanje spektra

Filter točak postavi na poziciju broj 1

Aktiviraj snimanje u zadatom opsegu

Podesi opseg spektra

Podesi vreme trajanja snimanja

Podesi broj snimanja

Snimi spektar , kad završi sačuvaj .

Prikaz spektara

Snimljeni spektri mogu biti prikazani na vise načina

Desni klik na spektralnom prozoru ili klik na otvoriće prozor sa opcijama prikaza

spektara

204

Da bi ste bolje videli neki deo spektra kliknite na lupu pa obelezite regon za uvećanje.

Da bi ste videli ceo spektar kliknite na

Slika 3. Grupno prikazani Ramanovi spektri