Upload
mary
View
33
Download
1
Embed Size (px)
DESCRIPTION
Problémy spojené s kultivací in vitro. rekalcitrance. Nežádoucí a většinou ireverzibilní stav nastávající u kultur in vitro, kdy buňky, pletiva nebo orgány ustrnou ve vývoji i růstu a ač jsou živé, nereagují ani na - PowerPoint PPT Presentation
Citation preview
Problémy spojené s kultivací in vitro
rekalcitrance
Nežádoucí a většinou ireverzibilní stav nastávající u kultur in vitro, kdy
buňky, pletiva nebo orgány ustrnou ve vývoji i růstu a ač jsou živé, nereagují ani na– změněné kultivační podmínky (recalcitro =
přístup odpírám, vyhazuji – o koni).
Rekalcitrantní genotypy
Příčiny– jsou spatřovány v ekologické konstituci
rostlinného materiálu (donora), manipulacích invitro a stresorech in vitro.Vážný problém v biotechnologii.
Hypotéza: neexistují(jen zatím nevíme jak na to)
Symptomy in vitro
1. Atypická anatomie, morfologie a fyziologie - miniaturizace
• změna stavby listů a jejich funkce (uzavřený prostor), pokožka s nízkým obsahem pektinu a celulózy, s nedostatečně vyvinutou kutikulouNefunkční průduchy
• opuchlé výhony• listy bledě zelené nebo šedomodré
• listy podlouhlé nebo páskovité• křehké• krabacené nebo zkroucené
listy průsvitného (skelného) vzhledu - vitrifikace
• Sklovitý až průhledný vzhled
• Hyperhydricita pletiv a orgánů
• křehkost
http://www.hort.purdue.edu/hort/courses/HORT201/Lec/03-05-08TCProblems.pdf
Grigoriadou1, 2007
• Etylén• Oxid uhličitý• Vodní páry
• Komponenty média (cytokininy, sacharóza, dusík)
• Vysoká teplota
Jak překonat?
1. Zvýšit koncentraci agaru, případně změnit na Gelrit (event. šikmý agar)
2. Změnit poměr amonia: nitrátu
3. Snížit hladinu cytokininů na minimum
4. ventilovat
Srovnání atmosféry
Skleník in vitro kultura
• O2 21 % jen 4 %
• CO2 0.04 % až 20 %
• H2O 60-85 % 100 %
Jak překonat?
1. Zvýšit koncentraci agaru, případně změnit na Gelrit (event. šikmý agar)
2. Změnit poměr amonia: nitrátu
3. Snížit hladinu cytokininů na minimum
4. Ventilovat
5. Zvýšit intenzitu světla (fotosyntézu)
6. Snížit teplotu a vlhkost
2. Redukce apikální dominance
• Zkrácená internodia výhonků
• Růžicovitý růst
• shluky výhonů při mikropropagaci
Somaklonální variabilita
Rhododendron
Příčiny zvyšující SV:Dlouhá expozice fytohormony (!2,4-D)Dlouhé intervaly mezi subkulturamiVětší riziko při tvorbě adventivních než při množení z axilárních pupenů (a meristémů)
3. Narušení tvorby kořenů
• nadměrná produkce adventivních kořenů• špatná tvorba adventivních kořenů
4. Nežádoucí nadprodukce a oxidace fenolických látek
• Hnědnutí média
• Odumírání explantátu
Proč vzniká?
• Obranná reakce proti možnému vniknutí infekce
• Fytotoxické substance
Jak se nežádoucí nadprodukci fenolických látek bránit?
• časté pasážování (tekuté medium)
• počáteční kultivace v chladu, v klidu
• příměsi do media (AU – aktivní uhlí,
PVP - polyvinylpyrolidon…)
Jak se bránit nežádoucí oxidaci fenolických látek?
• Preparace pod hladinou vody nebo antioxidační směsi AOX (10% k.citronová a 15% k. ascorbová)
• inkubace explantátů (5-30 min v AOX směsi)
• počáteční kultivace v chladu, v klidu
• příměsi do media (AA – kyselina ascorbová)
Pupenové kultury dřevin
Hormonální regulace mikropropagace z pupenů
CK CK CK (AUX) AUX
AUX (AUX) (AUX) (bez RR)
(GA)
Postup - založení pupenové kultury dřevin
• 1/ důkladné promytí tekoucí vodou
• 2/ propláchnutí 70% ETOH
• 3/ povrchová sterilizace 15 min 20% SAVO na třepačce
• 4/ propláchnutí sterilní dest. vodou (3x)
• 5/ odstranění krycích šupin (* antioxydační směs kys. ascorbové 10% a citronové 15%)
• 6/ odříznutí pupenu s 2 mm lodyhy (*)
• 7/ přenesení do zkumavky - popis