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PROGRAMMA SCIENTIFICO
Giovedì 12 SETTEMBRE
10:00 Registrazione
10:50
Saluto di Benvenuto
Sessione AMBIENTE Moderatore: Cecilia BERGAMINI
11:00-11:30 V. Filippi, ARPAT, Livorno
La validazione di un metodo analitico come processo di sistema: validazione metodo per determinazione del tributilstagno in
acque superficiali e sotterranee UNI EN ISO 17353
11:30-11:35 A.R. Limongi, Università della
Basilicata
Effects of the different wavelengths and intensities light radiation on the growth and the metabolism in Chlorella spp
strain
11:35-11:50 M. Prete, ARPAV
Validazione del metodo per la determinazione di glifosate, AMPA e glufosinate nella acque mediante la tecnica ESI-LC-MS/MS
11:50-12:05 M. Di Giovanni, ARPAE Bologna
Determinazione delle microcistine in LC-MS/MS. Indagine conoscitiva 2017-2019 in Romagna
12:05-12:35 M. Mazzetti, ARPAT, Livorno
Analysis of Glyphosate and AMPA in surface waters. Case study: estimating accuracy, repeatability and reproducibility
13:00-14:30 Pranzo
Sessione FARMACEUTICA
Moderatore: Fabiana PISCITELLI
14:30-15:00 S. Petrosino, Epitech Group
Validazione di un metodo LC-MS per misurare la palmitoiletanolamide ultramicronizzata nel plasma e in tessuti di
ratto, in seguito a somministrazione orale
15:00-15:15
A. Passoni, Ist. Mario
Negri
Mass spectrometric quantitation of intranasal cholesterol delivery in a mouse model of Huntington’s disease
15:15-15:30 E. Urso, Ist. G. Ronzoni
Validation of the analytical procedure for the characterization of Glatiramer acetate
15:30-15:45 P. Annoni, Redox
Validation of LC-MS multiresidual method for industrial cleaning
15:45 Visita guidata
Venerdì 13 SETTEMBRE
Sessione CLINICA
Moderatore: Fulvio MAGNI
9:00-9:30 M. Caterino, Università di
Napoli “Federico II”
Targeted analysis to profile serum, cellular and tissue metabolites
9:30-9.45 F. Esposito, CNR-IPCB
MS Based approaches in the diagnosis of congenital disorders of glycosylation
9:45-10:00 R. Conte, Centro AMES
Applicazioni cliniche della cromatografia LC-MS/MS
10:00-10:45 coffee break
Sessione ALIMENTARE
Moderatore: Donatella CARUSO
10:45-11:15 R. Galarini, Istituto
Zooprofilattico Sperim. Umbria
e Marche
La validazione dei metodi analitici per il controllo ufficiale dei residui negli alimenti
11:15-11:30 M.A. Acquavia, Università della
Basilicata
LC-MS method development and optimization for the determination of soyasaponins in bean extracts
Sessione REGOLAMENTAZIONE
Moderatore: Adele CUTIGNANO
11:30-12:00 M. Radicchi, esperto e
consulente per l’accreditamento
Validazione dei metodi nella ricerca scientifica, è diversa dagli altri metodi? Norme e regole da osservare
per l'accreditamento
12:00-13:30 TAVOLA ROTONDA E CONCLUSIONI
13:45 PRANZO
ABSTRACTS
LA VALIDAZIONE DI UN METODO ANALITICO COME PROCESSO DI SISTEMA:
VALIDAZIONE METODO PER DETERMINAZIONE DEL TRIBUTILSTAGNO IN
ACQUE SUPERFICIALI E SOTTERRENEE UNI EN ISO 17353
Valeria Filippi,1 Federica Bellandi,
1 Michele Mazzetti,
1 Paolo Altemura
2
1 ARPAT – Laboratoruio AVL - Livorno, settore microinquinanti
2 ARPAT – Responsabile del laboratorio AVL - Livorno
Summary: La validazione di un metodo può essere vista come un qualsiasi processo che si sviluppa
all’interno di un’organizzazione. Come afforontare le differenze tra un metodo normato e le
esigenze analitiche di un laboratorio: validazione del metodo UNI EN ISO 17353 in base alle
esigenze della legislazione europea.
Keywords: Validazione metodo analitico, Tributilstagno, UNI EN ISO 17353
Introduzione
Il riconoscimento della competenza dei laboratori di prova in campo ambientale, è un requisito
spesso richiesto non tanto dalla normativa, quanto dal cliente del laboratorio stesso. Operare
conformemente alla norma UNI CEI EN ISO/IEC 17025:2018 per garantire la qualità e la
trasparenza dei processi e dei dati analitici si traduce nel processo di accreditamento delle prove.
Infatti, l’accreditamento risulta essere l’“attestazione di terza parte, relativa ad un organismo di
valutazione della conformità (nel caso specifico il laboratorio di prova), consistente in una
dimostrazione formale della competenza dello stesso a svolgere specifici compiti di valutazione
della conformità ed a produrre dati e risultati tecnicamente validi “(par. Introduzione 17025).
Scelta dei metodi di prova
La selezione dei metodi di prova è trattata, della norma UNI CEI EN ISO/IEC 17025, sia dal punto
di vista gestionale che tecnico.
Dal punto di vista GESTIONALE, il laboratorio deve dimostrare di avere politiche e procedure
adeguatamente definite, documentate e comprensibili.
Dal punto di vista TECNICO, il laboratorio deve essere in grado di selezionare metodi di prova che
possano soddisfare il cliente e che siano appropriati per le prove da eseguire.
Nel documento di ACCREDIA RT-08 rev.04 al Cap. 3 si trovano elencate le definizioni:
METODO DI PROVA
Metodo di prova ufficiale
Metodo di prova normalizzato
Metodo di prova NON normalizzato
Metodo di prova Interno
La validazione di un metodo può essere quindi vista come un processo (insieme di attività correlate
o interagenti tra di loro) caratterizzato da INPUT, RISORSE, VINCOLI, che concorrono ad avere
un OUTPUT (metodo, dati) affidabile.
Fig. 1. Schema del processo “Validazione di un metodo analitico”
L’accreditamento da parte di un laboratorio di prova di un metodo NORMALIZZATO implica la
verifica, della conformità alle prestazioni indicate dal metodo. Qualora non esista un metodo
normato che possa soddisfare le esigenze del cliente e della normativa di riferimento, il laboratorio
può adattare a queste un metodo di prova normalizzato, mantenendo la dicitura del metodo
solamente là dove gli scostamenti riguardino:
1. Campo di misura
2. Campo di applicazione
In ogni caso tali scostamenti dal metodo devonono essere sottoposti a validazione.
Metodo UNI EN ISO 17353
Previa stesura di un rapporto di validazione, il nostro laboratorio ha accreditato il metodo UNI EN
ISO 17353, apportandone delle modifiche che hanno permesso di poter essere conformi alle
richieste della normativa vigente per la determinazione del Tributilstagno (nella direttiva 2000/60 /
CE SQA indicato per il TBT catione è 0,0002 μg/L (per ogni tipo di acqua superficiale)).
Fig. 2. Tabella di confronto tra metodo UNI EN ISO 17353 e modifiche apportate da ARPAT
Conclusioni Le modifiche apportate al metodo, opportunamente validate e correlate da documentazione oggettiva, hanno permesso al laboratorio di ARPAT (Area Vasta Litoranea), di ottenere
l’accreditamento per l’analisi del Tributilstagno cloruro in acque superficiali,comprese quelle
marino-costiere, e sotterranee.
References
Manuale della qualità ARPAT
ACCREDIA – RT-08 rev.4, 2018
ISO/IEC 17025: 2017
Metodo UNI EN ISO 17353: 2006
EFFECTS OF DIFFERENT WAVELENGTHS AND INTENSITIES LIGHT RADIATION
ON THE GROWTH AND THE METABOLISM IN CHLORELLA SPP STRAIN
A.R. Limongi,1,2
R.P. Radice,1,2
G. Ferretti,1 D. Coviello,
1 G. Bianco,
1 G. Martelli
1
1 Università degli Studi della Basilicata, Viale dell'Ateneo Lucano, Potenza, Italia, 85100
2 Bioinnova srls, Via Ponte Nove Luci, Potenza, Italia, 85100
Summary: Change in light condition could lead to stress in algal cultures but also production of
valuable metabolites. Different light intensities were obtained with different filter and the effect on
the growth in a Chlorella spp. strain was evaluated. Preliminary mass spectra show different
patterns in metabolic composition.
Keywords: Microalgae, metabolites, mass spectrometry
Introduction
The attention towards microalgae world has increased significantly in recent years due to the variety
and versatility of algal metabolites [1]. One of the main factors influencing algae growth is
represented by light, which provides the energy input necessary for metabolism. High efficiency in
the use of light is essential for the development of every alga growing system [2]. Furthermore, a
change in the condition of illumination, with consequent stress on algal cultures, could lead to
valuable metabolites, or increase their production [3].
Experimental
Different light intensities were obtained with different filter and the effect on the growth in a
Chlorella spp strain was evaluated. Red, blue, yellow and green filters were used including in the
experimental design control samples with transparent or no-filters. Support for growth plates was
designed to isolate each one providing only a top opening where filters were fixed. Algal growth
was performed in Modified Bold 3N Medium at 25 °C, under constant shaken and irradiation of 120
μmol m-2
s-1 with a rhythm of 16 h light and 8 h dark. The growth was followed for two weeks by
measuring three different parameters: optical density, cell counting, biomass wet weight. To assess
preliminary differences in metabolite composition an LC/ESI-LTQ MS analysis was performed on
every colture, both on pellet and media, after centrifugation.
Results
Microalgae growth is affected by different light conditions as confirmed by absorbance
measurements (shown in Fig.1), cell counting and biomass wet weight (p<0.05, ANOVA test). In
particular, the controls (black line) show higher absorbance compatible with an optimal growth,
while the colture under the colored filters show evident growth slowdowns although light radiation
stress doesn't affect cell vitality.
Fig. 1. Absorbance under different light conditions during 14 days
The preliminary LC/ESI-LTQ MS analysis shows different patterns in metabolic composition, in
pellet and media, between controls (Fig. 2) and treatments.
Fig. 2. Mass spectra of cell media from control colture
Similarly, differences were observed also among different light filter treatments (Fig. 3 and Fig. 4).
Fig. 3. Mass spectra of cell media from red filter treatment colture
Fig. 4. Mass spectra of cell media from yellow filter treatment colture
Interestingly the differences are more pronounced in the cellular medium than in pellet (data not
shown): this may lead to easier metabolites isolation from the colture. Different light conditions
probably trigger stress situation involving a greater production of specific metabolites to avoid
irreversible effects on cell vitality.
Conclusions
Different light conditions may be responsible for various cellular composition that our preliminary
data suggest. Further analysis is, however, necessary to identify accurately the more interesting
molecular signals from every spectrum. Considering that a singular genotype subjected to different
treatments was used, it is also interesting to study in deep if epigenetic mechanisms are involved in
the great adaptive abilities of the microalgal organisms.
References
1. O. Pulz, W. Gross; Applied Microbiology and Biotechnology, 65 (2004), pp 635-648.
2. G. Gim, J. Ryu, M. Kim, P. Kim, S. Kim; Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology,
43 (2016), pp 605-616.
3. L. Zhu, Z. Li, E. Hiltunen; BioMed Research International, 2016 (2016), pp 1- 8.
VALIDAZIONE DEL METODO PER LA DETERMINAZIONE DI GLIFOSATE, AMPA E
GLUFOSINATE NELLA ACQUE MEDIANTE LA TECNICA ESI-LC-MS/MS
Marco Prete , Anna Conte , Francesca Zanon
Agenzia Regionale per la Prevenzione e Protezione Ambientale del Veneto (ARPAV), Treviso
Il glifosate è uno dei pesticidi più largamente commerciati nel mondo, viene generalmente utilizzato
come erbicida a largo spettro, non selettivo e post-emergenza. Una volta immesso nell’ambiente
degrada velocemente nel suo principale metabolita l’acido amminometilfosfonico (AMPA). Il
glufosinate è un erbicida che viene impiegato meno frequentemente ma data la similarità della
struttura chimica con il glifosate viene studiato e determinato nello stesso modo.
La determinazione di glifosate, AMPA e glufosinate non può essere eseguita con la classica analisi
multi residuale per la determinazione dei fitofarmaci nelle acque data la loro struttura polare. Si
tratta di composti anfoteri, privi di gruppi cromofori, insolubili in molti solventi organici e molto
solubili in acqua: tutte queste caratteristiche rendono difficile e complessa l’analisi di questi
composti.
Il metodo che è stato sviluppato e validato consente la determinazione di glifosate, AMPA e
glufosinate nelle acque potabili destinate al consumo umano, nelle acque sotterranee e superficiali.
Sono previste tre fasi: una fase di derivatizzazione con 9-fluorenilmetilcloroformiato (FMOC-Cl),
uno stadio di purificazione su colonna di estrazione in fase solida (SPE) e infine la rilevazione e
determinazione degli analiti utilizzando la tecnica di cromatografia liquida accoppiata alla
spettrometria di massa a triplo quadrupolo con sorgente elettrospray (ESI-LC-MS/MS). La
quantificazione analitica viene eseguita mediante taratura con standard interno. Ciascun standard
viene preparato in matrice (acqua di rete) e sottoposto al medesimo trattamento analitico dei
campioni.
La validazione del metodo è stata eseguita calcolando diversi parametri. La precisione del metodo è
stata valutata attraverso prove di ripetibilità a più livelli di concentrazione (0,02 µg/L e 0,10 µg/L):
si sono ottenuti valori di scarto tipo tra 7 e 11% per la ripetibilità stretta e tra il 13 e il 20% per la
ripetibilità intermedia. L’esattezza è stata valutata attraverso il recupero mediante l’aggiunta di
quantità note di analiti a campioni reali. In tutte le prove i valori di recupero sono nell’intervallo 75-
125%. Inoltre il laboratorio ha partecipato fin dal 2015 a circuiti interlaboratorio organizzati da enti
nazionali e internazionali ottenendo sempre z-score inferiori a 2. Il limite di rilevabilità è stato
determinato a 0,01 µg/L per tutti gli analiti. La linearità tra 0,01 µg/L e 1 µg/L ha dato una
regressione lineare con coefficiente R2 >0.997 e intercetta statisticamente nulla.
Da maggio 2018 la prova è accreditata secondo la norma UNI CEI EN ISO/IEC 17025. Inoltre il
laboratorio ARPAV di Treviso ha contribuito per la determinazione di glifosate, AMPA e
glufosinate al gruppo di lavoro nazionale per la stesura dei metodi analitici ISTISAN 19/7
recentemente pubblicati dall’Istituto Superiore di Sanità.
DETERMINAZIONE DELLE MICROCISTINE IN LC-MS/MS. INDAGINE
CONOSCITIVA 2017-19 IN ROMAGNA
Barbara Romagnoli, Manuela Di Giovanni, Maria Ferrari, Rino Calori, Maurizio Falchieri,
Cecilia Bergamini
Unità analitica Chimica Acque sanitarie e ambientali
Arpae - Agenzia Regionale per la Prevenzione, l'Ambiente e l'Energia dell'Emilia-Romagna
Laboratorio Multisito Sede secondaria di Bologna
La valutazione del rischio di tossicità delle acque destinate alla potabilizzazione in alcuni invasi
della Romagna, ha dato il via ad un’indagine sulla presenza di microcistine. L’ottimizzazione di un
metodo in LC- MS/MS previa concentrazione su colonnine SPE ha evidenziato la contaminazione
di MC-LR (0.1-0.9 μg/L) nel 17% dei campioni analizzati.
Parole chiave: microcistine, LC-MS/MS, SPE.
Introduzione
I bacini d’acqua dolce rappresentano una delle risorse idriche più importanti per la vita dell’uomo.
La loro crescente eutrofizzazione ha favorito la formazione di fioriture (o “blooms”) di alghe
tossiche procariote, dette cianobatteri, molte specie delle quali producono, come metaboliti
secondari, numerose tossine (cianotossine) che si diversificano per proprietà chimiche e attività
biologica. Le più diffuse sono le microcistine (Mcs), peptidi ciclici con più di 90 varianti strutturali
conosciute, che hanno mostrato effetti genotossici, epatotossici e nefrotossici nei mammiferi,
nonché attività come promotori tumorali. La più diffusa e studiata è la MC-LR [1] .
Il rischio per la salute umana è dovuto alla loro introduzione lungo la filiera di potabilizzazione,
esponendo l’uomo per diverse vie (ingestione di acqua potabilizzata e di pesce che si è nutrito delle
alghe, inalazione di aerosol contenente frammenti di cellule di alghe e/o tossine, attività di
balneazione). Per tale motivo l'Istituto Superiore di Sanità, ha istituito il “Gruppo nazionale per la
gestione del rischio cianobatteri in acque destinate a consumo umano” che ha condotto
all'elaborazione dello Schema del Decreto interministeriale per l'introduzione, nell'allegato I, parte
B, del DLgs 2 febbraio 2001, n. 31 [2], del parametro "Microcistina-LR" e relativo valore di
riferimento. Il suddetto valore, pari a 1,0 μg/L, è riferito al contenuto di tossina totale (intra ed
extracellulare) ed è stabilito per MC-LR, ma riferito alla somma delle concentrazioni dei diversi
congeneri di microcistine presenti nel campione, considerati come equivalenti di MC-LR, sulla base
di un approccio ampiamente conservativo nei confronti della protezione della salute. La ricerca di
cianotossine in acque destinate al consumo umano non deve essere oggetto di ordinaria
sorveglianza, ma deve effettuarsi solo nei casi definiti in seguito a valutazione del rischio, secondo i
criteri definiti dal “Gruppo nazionale” suddetto.
Nel 2016, si è registrato un’importante bloom algale in alcuni invasi della Romagna, dai quali si
effettua captazione di acqua destinata al consumo umano, nel periodo estivo. È stato valutato,
quindi, il rischio della presenza di cianotossine ed avviato un programma di sorveglianza, dal 2017
ad oggi, che prevede l’analisi di un’aliquota prelevata a gennaio (punto 0) e campionamenti, con
cadenza mensile, tra aprile e settembre di ogni anno.
Sono state campionate 17 aliquote nel 2017, 25 nel 2018 e 16 nel 2019 ad oggi, conferite al
laboratorio chimico di Bologna per l’analisi delle MCs e al laboratorio microbiologico di Ravenna,
per l'identificazione e la quantificazione delle alghe.
Metodo
Il metodo di analisi utilizzato è quello dell'Istituto Superiore di Sanità, Rapporto ISTISAN 07/31
(ISS.CBA.044.REV00) e prevede la quantificazione delle microcistine in LC-MS/MS previa
concentrazione su colonnine SPE [3].
La procedura estrattiva per la determinazione del contenuto totale di tossina (intra + extracellulare)
prevede un ciclo di congelamento e scongelamento (lisi cellulare), filtrazione e
purificazione/concentrazione con colonnine SPE. Le microcistine analizzate sono MC-LR, MC-RR,
MC-YR, MC-dLR e lo standard interno Nodularina.
Il campo di applicazione del metodo è 0,1-0,4 µg/L, i recuperi ottenuti sono superiori all’85% al
limite di quantificazione (LDQ) che è pari a 0,1 µg/L e la precisione (CV% al LDQ) varia tra 3% e
12%, così come indicato dal metodo ISTISAN 19/7 (ISS.CBA.053.REV00) [4].
Risultati
La Figura 1 riporta le positività di MC-LR risultate dalla campagna conoscitiva. Le microcistine
RR, YR, dLR non sono mai rilevate a concentrazioni superiori al LDQ.
Nel 2017, da luglio a settembre, nel Lago 1 si è riscontrata la presenza della tossina LR con valori
compresi tra 0,1 e 0,2 µg/L. Negli stessi campioni è stata identificata la presenza dell’alga
"Microcystis".
Nel 2018 la presenza della tossina si riconferma nel Lago 1, tra giugno e agosto, con un picco di 0,9
µg/L a giugno, e si estende al Lago 2 nei mesi di agosto e settembre con valori di 0,1 µg/L.
Nel 2019 tutti i campioni analizzati da aprile ad oggi sono risultati inferiori al limite di
quantificazione per tutti gli analiti.
Fig. 1. Campioni risultati positivi per MC-LR nel 2017 – 2019.
Conclusioni
Negli anni sotto indagine, i campioni positivi, inferiori al limite di legge, rappresentano il 17% del
totale analizzato (10/58), confermano l'importanza del mantenimento di un approccio integrato di
sorveglianza, analisi del rischio e monitoraggio, per la gestione delle emergenze correlate alla
proliferazione di cianobatteri nella filiera di potabilizzazione delle acque e per la protezione della
salute dell'uomo e dell'ambiente.
Bibliografia
1. L. Lucentini, M. Ottavini et al; ISTISAN 11/35, 1 (2011).
2. DLgs 2 febbraio 2001, n. 31e successive integrazioni.
3. ISTISAN 07/31 ISS.CBA.044.REV00, (2007), pp. 203-212.
4. ISTISAN 19/7 ISS.CBA.053.REV00, (2019), pp. 172-183.
ANALYSIS OF GLYPHOSATE AND AMPA IN SURFACE WATERS.
CASE STUDY: ESTIMATING ACCURACY, REPETEABILITY AND
REPRODUCIBILITY
Michele Mazzetti,1 Andrea Agostini,
1 Valeria Filippi,
1 Fabrizio Mannelli,
2 Paolo Altemura
3
1 ARPAT - Agenzia regionale per la protezione ambientale della Toscana. Laboratorio AVL
2 ARPAT - Agenzia regionale per la protezione ambientale della Toscana. Coordinamento dei
Laboratori 3
ARPAT - Agenzia regionale per la protezione ambientale della Toscana. Responsabile Laboratorio
AV
Summary: The ARPAT-AVL in force method for analysis of Glyphosate and AMPA in surface
waters is detailed with an evaluation of the statistical parameters reported in title.
KEYWORDS: GLYPHOSATE, HRMS, UNCERTAINTY
The ARPAT AVL Lab in force method, based on ISO 16308:2014(E) and USGS Techniques and
Methods 5–A10 (derivatization with FMOC, preconcetration with SPE and HPLC/MSMS) was
developed with some modifications.
The application of the previous mentioned changes and mainly the use of UHPLC-HRMS/HCD
(Ultra High Performance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry/Higher
Collisional Dissociation) in positive ionization mode, permit an identification in compliance with
Decision EU 657/2002 of the analytes and the reaching of a limit of determination (LOD) of
0.005μg/L in surface water.
The isotopic diluition with stable-isotope labeled AMPA and glyphosate allows a quantitation range
for the method from 0.02 to 0.5 μg/L.
The method was accreditated according to UNI-EN-ISO/IEC17025:2005 in april 2016 and re-
evaluated in 2019 for compliance to 2018 revision of 17025.
All statistical parameters needed to the validation process were determined by the use of three
different approaches (PT. Olistic and Within-Lab approach).
The obtained data are substantially equivalent and so they give a good evaluation of the method and
a powerful tool to control the whole process
VALIDATION OF A LC-MS METHOD TO MEASURE ULTRAMICRONIZED
PALMITOYLETHANOLAMIDE IN PLASMA AND RAT TISSUES FOLLOWING ORAL
ADMINISTRATION
Stefania Petrosino,1,2
Marika Cordaro,3 Roberta Verde,
1 Aniello Schiano Moriello,
1,2 Gabriele
Marcolongo,2 Carlo Schievano,
4 Rosalba Siracusa,
3 Fabiana Piscitelli,
1 Alessio F. Peritore,
1
Rosalia Crupi,3 Daniela Impellizzeri,
3 Emanuela Esposito,
3 Salvatore Cuzzocrea,
3
Vincenzo Di Marzo 1
1 Endocannabinoid Research Group, Institute of Biomolecular Chemistry, CNR, Napoli, Italy,
2Epitech Group SpA, Padova, Italy,
3Department of Chemical, Biological, Pharmaceutical and
Environmental Science University of Messina, Messina, Italy, 4Innovative Statistical Research SRL,
Padova, Italy
Palmitoylethanolamide (PEA) is a pleiotropic lipid mediator with established anti-inflammatory and
anti-hyperalgesic activity. Ultramicronized PEA (PEA-um) has superior oral efficacy compared to
naïve (non-micronized) PEA.
The aim of the present study was two-fold: (1) to evaluate whether oral PEA-um has greater
absorbability compared to naïve PEA, and its ability to reach peripheral and central tissues under
healthy and local inflammatory conditions (carrageenan paw edema); (2) to better characterize the
molecular pathways involved in PEA-um action, particularly at the spinal level.
Rats were dosed with 30 mg/kg of [13
C]4-PEA-um or naïve [13
C]4-PEA by oral gavage, and [13
C]4-
PEA levels quantified, as a function of time, by liquid chromatography/atmospheric pressure
chemical ionization/mass spectrometry. Overall plasma levels were higher in both healthy and
carrageenan-injected rats administered [13
C]4-PEA-um as compared to those receiving naïve [13
C]4-
PEA, indicating the greater absorbability of PEA-um.
Furthermore, carrageenan injection markedly favored an increase in levels of [13
C]4-PEA in plasma,
paw and spinal cord. Oral treatment of carrageenan-injected rats with PEA-um (10 mg/kg)
confirmed beneficial peripheral effects on paw inflammation, thermal hyperalgesia and tissue
damage. Notably, PEA-um down-regulated distinct spinal inflammatory and oxidative pathways.
These last findings instruct on spinal mechanisms involved in the anti-hyperalgesic effect of PEA-
um in inflammatory pain.
MASS SPECTROMETRIC QUANTITATION OF INTRANASAL CHOLESTEROL
DELIVERY IN A MOUSE MODEL OF HUNTINGTON’S DISEASE
Alice Passoni,1 Monica Favagrossa,
2 Laura Colombo,
2 Mario Salmona,
2 Renzo Bagnati
1
Mario Negri Institute for Pharmacological Research – IRCCS, Milan, Italy 1 Department of Environmental Health Sciences
2 Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology
Summary: The demonstrations of the efficacy of exogenous cholesterol treatment on Huntington
disease phenotype give us the basis for the presented study. We developed a reproducible and
reliable mass spectrometric method to evaluate the cholesterol delivery to brain after intranasal
treatment of a mouse model of the disease.
Keywords: LC-MS, Huntington’s disease, intranasal treatment
Since the current pharmacological treatment for Huntington disease is only palliative, there is a
need for therapies to restore function in patients. Recent results indicate that exogenous cholesterol
administration into the brains of mice model of Huntington disease rescues synaptic communication
and protects the animal from cognitive decline, suggesting that this can be translated into clinical
therapy. Intranasal administration of cholesterol may be an effective means to reach the brain, so we
developed a fully validated method based on liquid chromatography and mass spectrometry for the
quantitation of cholesterol-D6 levels in brain, bulbs and plasma.
Two experimental groups, well-timed and R6/2 mice, were treated with a single or two injections of
liposomes loaded with cholesterol-D6 (200 ug cholesterol-D6/mouse). The delivery of cholesterol-
D6 to the brain after intranasal treatment was verified following the determination of cholesterol-D6
concentrations in mouse brain, plasma and bulbs. The analytical method was developed using a
liquid chromatographic system coupled to a triple quadrupole mass spectrometer and using a
Selected Reaction Monitoring (SRM) method. The method was fully validated according to EMA
guidelines in both plasma and brain.
The separation of cholesterol was performed using a fast chromatographic method, which allowed
the analysis of cholesterol-D6 in only 6 minutes. The method was sensitive and reproducible
allowing the quantitation of the analyte starting from concentrations of 0.1 ng/mg in tissues and 7.5
ng/ml in plasma. The evaluation of time-course profiles after acute treatment confirmed delivery of
cholesterol to the brain of animals, reaching the highest concentration 48 hours after treatment. A
significant amount of cholesterol-D6 was still detected 72 hours after treatment, suggesting a
possible accumulation in the target tissue. The brain concentrations of cholesterol-D6 are consistent
with those found in plasma: time-course profile in plasma reached the maximum concentration 24
hours after treatment with a decrease of cholesterol-D6 levels 72 hours after treatment. Finally, the
levels of cholesterol-D6 in bulbs were stable at different time-points, confirming delivery of
cholesterol with a minimum accumulation at the site of administration.
A reproducible and reliable liquid chromatography-mass spectrometry method was successfully
validated for the quantitation of cholesterol-D6 in biological samples of treated mice. This method
meets the acceptance criteria of EMA guidelines, showing good linearity in a wide concentration
range with acceptable precision and accuracy. This validated analytical method enabled an accurate
quantitation of cholesterol-D6 in biological samples and the evaluation of its biological distribution
after intranasal treatment, confirming the delivery of cholesterol-D6 into the brain. The plasma,
brain and bulbs time-course profile will offer useful information for further investigation of its
behavioural effects.
VALIDATION OF THE ANALYTICAL PROCEDURE FOR THE CHARACTERIZATION
OF GLATIRAMER ACETATE
Elena Urso, Marika Siciliano, Lucio Mauri, Marco Guerrini
Istituto di Ricerche Chimiche e Biochimiche G. Ronzoni
Summary: Glatiramer acetate (GA), the active ingredient of Copaxone® marketed by Teva, is a
nonbiologic complex drug indicated for the treatment of patients with relapsing forms of multiple
sclerosis. Hereby, validation of the analytical procedure adopted for characterization and profiling
of commercial reference and generic drugs, was performed.
Keywords: high resolution mass spectrometry, method specificity, method validation
Introduction
Glatiramer acetate is a heterogeneous mixture of synthetic polypeptides randomly prepared by the
combination of four amino acids (glutamic acid, lysine, alanine and tyrosine) and then producing an
extremely high variability in length chain, molecular weight distribution and amino acid sequences.
Due to the complexity of the drug, the enzyme digestion strategy has emerged as an essential
requirement to reduce the mixture polydispersity followed by HILIC-High Resolution Mass
Spectrometry analysis [1]. Since this analytical method is intended as identification test for
comparing a biosimilar product and the innovator reference, according to the ICH guideline
Q2(R1), specificity represents the most important parameter to be validated. In addition, to assess
feasibility of semi- quantitative comparison of relative intensity of chromatographic peaks,
repeatability of the chromatographic process was evaluated.
Experimental
Three different lots of Teva GA drug were analysed. Copolimer-1 (provided by Sigma) was used as
negative sample. Sample depolymerization was performed by Lysyl endopeptidase (Lys-C) [1].
LC-MS analysis was performed using a LC system equipped with a Kinetex 2.6µm HILIC column
(2.1 x 100 mm, Phenomenex) coupled to ESI-Q-TOF mass spectrometer.
Results and Conclusions
Specificity of the analytical procedure arising from the combined result of the HPLC separation and
of mass spectrometry detection providing mass signals measurements at very high accuracy,
allowed to confirm the presence of all fragments (24 peptides) previously identified (Figure 1) and
detect additional 22 peptides (Figure 2). LC-MS profiles of consecutive runs compared among them
and to the ones repeated in a different day, shows very good analysis repeatability. The semi-
quantitative results reported in table 1, where the area of each peak is normalized by the main peak
n.16, show that CV% is often significantly less than 15%.
Fig. 1. HPLC/ESI-Q-TOF MS profile of Copaxone commercial sample (blue profile) and overlaid
EIC profiles of all m/z signals previously identified [1].
Fig. 2. HPLC/ESI-Q-TOF MS profile of Copaxone commercial sample (blue profile) and overlaid
EIC profiles of all m/z signals newly identified.
Table 1. Evaluation of the coefficient of variation of 18 chosen peaks
The method, currently employed in profiling of commercial reference and generic drugs, is
followed by multivariate statistical tools of recorded data to assess comparability or detect
significant differences among the analysed samples.
References
1. S. Rogstad, E. Pang, C. Sommers, M. Hu, X. Jiang, D. A. Keire, M. T. Boyne, Bioanal. Chem.,
407 (2015), pp8647-8659.
VALIDATION OF LC-MS MULTIRESIDUAL METHOD FOR
INDUSTRIAL CLEANING PROCESS
Paolo Annoni, Matteo Arosio
Redox s.r.l., viale Stucchi 62/26, Monza, Italy
Summary: Manufacturing plant cleaning of highly potent active ingredients is becoming an
important topic for pharmaceutical industrial process validation. Analytical methods with high
sensitivity and sensitivity are request; they still have to be simple and fast to follow production
necessities.
For this purpose Redox developed for its customer a multiresidual LC-MS method using Shimadzu
LC-MS-8045 triple quadruple system for detection of nine different steroids in swab and rinse
samples.
Keywords: LC-MS, cleaning, validation
Introduction
The present work describes LC-MS method developed and validated by Redox for its customer to
detect and quantify nine different steroid pharmaceutical active ingredients in swab and rinse
solution coming from manufacturing plant to confirm equipment cleaning.
Experimental
Analysis was carried out with HPLC instrument Shimadzu Nexera X2 coupled with mass
spectrometer triple quadrupole Shimadzu LC/MS-8040 equipped with APCI ion source working in
positive polarity. Separation was obtained with HPLC column Reprosil Gold C18 100×2.1 mm 1.9
µm with mobile phase water/acetonitrile starting with concentration 70/30 and rising to 100% of
acetonitrile in 25 min and flow 0.2 mL/min.
Reference solutions of nine analyte were prepared dissolving samples in methanol. Rinsing solution
were analysed as they are while swab recovery was evaluated on steel, glass and polyethylene plates
using swabs texwipe.
For each analyte specific MRM signal was optimized and acquired.
Results
The method shows satisfactory selectivity in order to accurately quantify the residual of each steroid
compound in rinse and swab samples.
The peak of the analyte is completely isolated and no interferences are present.
Linearity of response of each steroid compound were assessed in range of 10-1000 ng/mL (50 -
5000 ng/swab), on six concentration levels. The determination coefficient, for all the analytes
tested, respect the specification required of NLT 0.99.
Instrumental precision was calculated by three injections of standard solutions at each concentration
level of the regression curve. Average instrumental precision is about 8-12% for all compound
tested apart budesonide that result 17%.
The recovery of each steroid was calculated deposing an exact amount of standard on steel, glass
and polyethylene plates at three concentration levels (three preparations each), covering the whole
linearity range (concentrations on plates corresponds to 50,
500 and 5000.0 ng/swab). Plates were then swabbed and analysed by LC-MS to assess the amount
of analyte recovered in the solutions: for each kind of surface, 9 different results will be obtained.
Recovery was in range of 80-100% for glass palates, 60-90% for polyethylene and steel plates.
Repeatability and intermediate precisions were also evaluated and they results in range of about 8-
20% depending by analyte and surface type.
Stability of each steroid in solution was evaluated reinjecting standard solution 4 prepared for
linearity item after 1, 3, 7, 14 and 21 days at room temperature and at 4°C.
Steroids content on swab stick is stable after 1 day with a difference lower than 10%; after three
days the difference is lower than 20%.
In rinse solution Steroids are stable after at least 3 days.
Conclusions
Developed method is selective and sensitive, with good dynamic range. Instrumental precision,
repeatability and intermediate precisions are satisfactory. Recoveries, depending by analyte and
surface material, are in range of 60-100%.
Stability of analytes adsorbed on swabs and in rinse solution stored at 4°C is at least of 3 days.
TARGETED ANALYSIS TO PROFILE SERUM, CELLULAR AND TISSUE
METABOLITES
Marianna Caterino
Dipartimento di Medicina Molecolare e Biotecnologie Mediche, Università di Napoli “Federico II”
Targeted metabolomic procedure was performed to quantize aminoacids and acylcarnitines in
biological fluids, as plasma, cell lines and animal tissues. Aminoacids and acylcarnitines
quantization was carried out by LC/MSMS analysis. Tandem mass spectrometry allow us to analyze
different chemical family, caractherized by common fragment ions or neutral molecules. The
acylcarnitines are acyl ester of L-carnitine, including: i) saturated and unsaturated ii) hydroxyl and
iii) branched acyl ranging from the 2-carbon through the 20-carbon aliphatic groups. These
compounds are measurement by precurson ion scan monitoring the fragment m/z 85, common to all
acylcarnitines both underivatized and butyl ester derivatives. On the other hand, the butyl ester of
amminoacids are detected by using the neutral loss of butyl formate. The basic amino acids have
functional group, as ammonia or basic group, that fragments easily. Hence, a neutral loss of 119 Da
scan is used to detect ornithine and citrulline. Arginine does not lose ammonia, but rather an
arginino group and is detected using a NL of 161 scan. The serum quantitative analysis of
amminoacids and acylcarnitine allows to diagnose aminoacidopathies and urea cycle defects or fatty
acids β-oxidation defects and organic acidemias, respectively [1]. According to described procedure
amminoacids and acylcarnitine were dosed also using rat liver, Kidney and heart tissue. Intra-sex
and inter- organ metabolomic profiles reveals specific difference sex and tissue-dependent [2].
Finally, these metabolites were detected also using a myotubes cell line to evaluete the response to
insulin in presence of fatty acids with a varying degree of saturation [3].
1. Scolamiero et al. 2015, Molecular Biosystems
2. Ruoppolo et al. 2019, Scientific Report
3. Giacco et al. 2019, FASEB Journal
MS BASED APPROACHES IN THE DIAGNOSIS OF CONGENITAL
DISORDERS OF GLYCOSYLATION
Francesca Esposito1, Angelo Palmigiano
1, Angela Messina
1, Rita Barone
1-2, Luisa Sturiale
1,
Domenico Garozzo1
1 CNR-IPCB UOS Catania, Institute for Polymers, Composites and Biomaterials, Via Paolo
Gaifami, 18 – 95126, Catania, Italy 2 Department of Clinical and Experimental Medicine, Child Neuropsychiatry Unit, University of
Catania, Via S. Sofia, 78 – 95123 Catania, Italy
Summary: Adopting RapiFluor-MS (RFMS) as a labeling method to enhance MS sensitivity, we
performed the enzymatic release and the N-glycan labelling of total serum and single serum
glycoproteins from selected CDG patients (MAN1B1-CDG, ALG12-CDG, MOGS-CDG,
TMEM199- CDG). RFMS method coupled to HILIC-UPLC-ESI-MS, represents a sensitive high
throughput approach for serum N-glycome analysis.
Keywords: LC-MS, Congenital disorders of Glycosylation, HILIC
Introduction
N-glycans are often studied to discover disease-associated biomarkers, as well as to identify
changing in glycomic profiles supporting diagnosis of those disorders directly connected to
impaired glycan biosynthesis of glycoconjugates, such as congenital disorders of glycosylation
(CDG) [1]. Strategies based on liquid chromatography (LC) coupled preferentially to electrospray
ionization (ESI)-mass spectrometry (MS) have emerged as powerful analytical methods for N-
glycan identification and characterization.
To enhance detection sensitivity, glycans are commonly functionalized with a tag prior to LC-MS
analysis. Since the majority of the techniques used for glycan derivatization are notoriously time-
consuming, some commercial analytical kits were developed to perform a rapid deglycosylation and
labelling of N-glycans linked specifically to monoclonal antibodies (mAbs) [2].
Experimental
Adopting one of these commercial kits, RapiFluor-MS (RFMS), through a slightly modified
protocol, we performed the enzymatic release and the N-glycan labelling of total serum and single
serum glycoproteins from selected CDG patients (MAN1B1-CDG, ALG12-CDG, MOGS-CDG,
TMEM199- CDG).
Results
Hydrophilic Interaction Chromatography (HILIC)-UPLC-ESI-MS separation of derivatized N-
glycans allowed us to differentiate either structural isomers and isomers differing for the linkage
type, as hybrid glycan structures accumulating in N-glycan profile of MAN1B1-CDG and ALG12-
CDG.
According to patient immunological phenotype, serum IgG analysis of the Glucosidase 1-deficient
patient (MOGS-CDG) showed significant N-glycosylation differences compared to control as the
occurrence of the accumulating Glc3-Man7-GlcNAc2 glycoform (in accordance with the molecular
defect) and, moreover, a generalized increase of sialylation.
Serum N-glycan profiling of TMEM199-CDG showed, aside an increased amount of under-
sialylated biantennary structures, also an overall increase of the triantennary N-glycan component.
Conclusions
All these applications demonstrated that RFMS method coupled to HILIC-UPLC-ESI-MS,
represents a sensitive high throughput approach for serum N-glycome analysis and a valuable
option for glycan detection and separation particularly for isomeric species.
References
1. A. Banazadeh, L. Veillon, K. M. Wooding, M. Zabet, Y. Mechref: Electrophoresis, 38 (2017),
pp 162– 189.
2. S. Zhou, L. Veillon, X. Dong, Y. Huang, Y. Mechref; Analyst, 142 (2017), pp 4446–4455.
APPLICAZIONI CLINICHE DELLA CROMATOGRAFIA LC-MS/MS
Raffaele Conte
Centro AMES- Casalnuovo di Napoli (NA)
Il notevole sviluppo tecnologico subito dalla spettrometria di massa negli ultimi anni ha reso
possibile un suo impiego nell’ambito della diagnostica clinica. In particolare, l’introduzione di
tecniche di ionizzazione soft, l’accoppiamento con la cromatografia liquida e la disponibilità di
tecniche di spettrometria di massa tandem (MS/MS) hanno permesso di semplificare la
preparazione del campione e diminuire i tempi di analisi. Inoltre, le elevate sensibilità e specificità
tipiche dei metodi di analisi quantitativa basati sulla spettrometria di massa e l’ampia flessibilità,
con la conseguente possibilità di analizzare molecole molto diverse tra loro per dimensioni e classe
di appartenenza hanno contribuito, insieme allo sviluppo di strumenti più economici, con elevato
grado di automazione e con costi di analisi spesso inferiori a quelli delle tecniche tradizionali,
all’espansione della applicazione della cromatografia LC-MS/MS nei laboratori di chimica clinica.
Esempi di impieghi riguardano il dosaggio di farmaci, ormoni, vitamine e altri metaboliti, oltre alle
applicazioni tossicologiche quali analisi delle droghe d’abuso, tassi alcolimetrici e veleni. Si può
quindi affermare che la cromatografia LC-MS/MS ha apportato il vantaggio dell’utilizzo di metodi
di alta qualità analitica nella routine clinica.
LA VALIDAZIONE DEI METODI ANALITICI PER IL CONTROLLO UFFICIALE DEI
RESIDUI NEGLI ALIMENTI
Roberta Galarini
Centro Sviluppo e Validazione Metodi - Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell’Umbria e delle
Marche «Togo Rosati»
Negli ultimi venti anni nell’ambito della ricerca di xenobiotici negli alimenti, l’Unione europea ha
messo a punto un articolato sistema legislativo atto a garantire la qualità dei dati prodotti dai
laboratori ufficiali dei suoi stati membri. Vengono presi in rassegna i settori principali per i vari
gruppi di sostanze, ovvero i pesticidi, i PCB e le diossine, i farmaci veterinari, gli idrocarburi
policiclici aromatici, i metalli pesanti e le micotossine. Il sistema europeo si basa su tre pilastri: i) la
gerarchia dei laboratori all’interno dell’Unione; ii) l’accreditamento degli stessi secondo lo
Standard ISO 17025; iii) le norme e/o le linee-guida riguardanti i requisiti minimi che i metodi
devono possedere. Quest’ultimo aspetto si occupa delle principali caratteristiche delle procedure
analitiche per l’analisi in tracce quali selettività, linearità, precisione, esattezza, limiti di rilevazione
e quantificazione, caratteristiche che devono essere dimostrate attraverso uno studio di validazione.
La selettività è un parametro strettamente legato alla tecnica strumentale e, quindi, agli apparecchi
dotati di rivelatori in spettrometria di massa. Sono quindi discussi i criteri di selettività validi per i
tradizionali analizzatori triplo-quadrupolo fino ai più recenti detector quali il tempo di volo,
l’orbitrap e le configurazioni ibride quadrupolo-tempo di volo e quadrupolo-orbitrap.
LC-MS METHOD DEVELOPMENT AND OPTIMIZATION FOR THE
DETERMINATION OF SOYASAPONINS IN BEANS EXTRACTS
Raffaella Pascale1, Cecilia F. Carbone
1, Maria A. Acquavia
1, Tommaso R. I. Cataldi
2, Philippe
Schmitt- Kopplin3,4
, Daniela Russo1, Luigi Milella
1, Giuliana Bianco
1
1Dipartimento di Scienze, Università degli Studi della Basilicata, via dell’Ateneo Lucano, 10-
85100 Potenza, Italy 2
Dipartimento di Chimica, Università degli Studi di Bari Aldo Moro, Via E. Orabona, 4, 70126
Bari, Italy 3
Helmholtz Zentrum Munchen, Analytical BioGeoChemistry, 85764 Neuherberg, Germany 4
Technische Universität Muenchen, Chair of Analytical Food Chemistry, Freising-
Weihenstephan, Germany
Soyasaponins are naturally occurring triterpenoids, found in many food materials, that have
attracted attention for having a high number of biological activities in animal systems, including
chemoprotective, hypocholesterolemic and hypoglycemic activities [1-3]. To date up to 20
soyasaponins have been characterized and they have been distinguished in three different classes
(i.e. A, B and E) depending on the O-substitution of the C-22 and C-3 position of the aglycone
moiety [4].
The goal of our research was the development of a comprehensive and accurate method based on
high- performance reversed-phase liquid chromatography (RPLC) coupled to electrospray
ionization (ESI) and Fourier transform ion cyclotron resonance (FTICR) mass spectrometry (MS),
for the qualitative and quantitative determination of soyasaponins in Fagioli di Sarconi beans
extracts.
Liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) is, in effect, the most prevalent analytical
technique employed for the determination of soyasaponins in leguminous plants, since it ensures a
high selectivity and accuracy of the analysis [5-7].
In order to work out a suitable method for establishing the distribution and the content of
soyasaponins in Fagioli di Sarconi beans, an optimization study of the main instrumental
parameters, such as mobile phase additives, pH, and ESI polarity, was conducted. With a standard
solution of soyasaponins Ba, Bb, Bd, and Be, which are the only commercially available reference
standards, the best results were obtained in positive ion mode with a mobile phase consisting of
purified water, containing 0.1% formic acid, and acetonitrile.
The method chosen allowed the simultaneous determination of 8 soyasaponins, i.e. soyasaponins
Ba, Bb, Bd, Be, Bb', αg, βg and γg.
The developed analytical method was fully validated in terms of accuracy, limits of detection and
quantification (LOD/LOQ), inter and intra-day precision (repeatability) and relative standard
deviations (% RSDs). The accuracy of the method was determined by recovery tests, analyzing
sample extracts spiked with a standard mixture of 10 mg/L, and the percentage recovery values
were within the range, 86.0 ± 0.8 and 113.0
± 4.2%, demonstrating thus also the absence of the matrix effect [8]. The LoD ranged from 0.13 to
0.26 mg/L and the LoQ from 0.41 to 0.80 mg/L. Intra-day precision was assessed by injecting a
standard solution (10 mg/L) of soyasaponins ten times in the same day, while inter-day was
determined by analyzing five replicates of calibration standard (10 mg/L) on three non-consecutive
days over 3 weeks. The relative standard deviation (RSD) of intra- and inter-day precision were 14
and 10%, thus suggesting a satisfactory result in agreement with the acceptance criteria (15% RSD)
[9].
After quantitative and semiquantitative analysis, the total concentration levels of the identified
soyasaponins in beans extract were found ranging from 83.6 ± 9.3 to 767 ± 37 mg/kg.
References
1. Francis, G., Kerem, Z., Makkar, H. P., & Becker, K. (2002). The biological action of saponins in
animal systems: a review. British journal of Nutrition, 88(6), 587-605.
2. Lin, Y., Meijer, G. W., Vermeer, M. A., & Trautwein, E. A. (2004). Soy protein enhances the
cholesterol- lowering effect of plant sterol esters in cholesterol-fed hamsters. The Journal of
nutrition, 134(1), 143-148.
3. Bianco, G., Pascale, R., Carbone, C. F., Acquavia, M. A., Cataldi, T. R., Schmitt-Kopplin, P.,
Buchicchio, A., Russo, D., & Milella, L. (2018). Determination of soyasaponins in Fagioli di
Sarconi beans (Phaseolus vulgaris L.) by LC-ESI-FTICR-MS and evaluation of their
hypoglycemic activity. Analytical and bioanalytical chemistry, 410(5), 1561-1569.
4. Güçlü-Üstündağ, Ö., & Mazza, G. (2007). Saponins: properties, applications and processing.
Critical Reviews in Food science and nutrition, 47(3), 231-258.
5. Jin, M., Yang, Y., Su, B., & Ren, Q. (2006). Rapid quantification and characterization of
soyasaponins by high-performance liquid chromatography coupled with electrospray mass
spectrometry. Journal of Chromatography A, 1108(1), 31-37.
6. Hu, J., Lee, S. O., Hendrich, S., & Murphy, P. A. (2002). Quantification of the group B
soyasaponins by high-performance liquid chromatography. Journal of Agricultural and Food
Chemistry, 50(9), 2587-2594.
7. Bianco, G., Buchicchio, A., & Cataldi, T. R. (2015). Structural characterization of major
soyasaponins in traditional cultivars of Fagioli di Sarconi beans investigated by high-resolution
tandem mass spectrometry. Analytical and bioanalytical chemistry, 407(21), 6381-6389.
8. Hewavitharana, A. K., Tan, S. K., & Shaw, P. N. (2014). Strategies for the detection and
elimination of matrix effects in quantitative LC-MS analysis. LCGC North America, 32(1), 54-
64.
9. Pascale, R., Caivano, M., Buchicchio, A., Mancini, I. M., Bianco, G., & Caniani, D. (2017).
Validation of an analytical method for simultaneous high-precision measurements of greenhouse
gas emissions from wastewater treatment plants using a gas chromatography-barrier discharge
detector system. Journal of Chromatography A, 1480, 62-69.
LA VALIDAZIONE DEI METODI NELLA RICERCA SCIENTIFICA, È DIVERSA
DALLA VALIDAZIONE DEGLI ALTRI METODI ?
NORME E REGOLE DA OSSERVARE PER L’ACCREDITAMENTO”
Massimo Radicchi
professionista per l’accreditamento
Summary:
l’intervento affronta:
Le differenze fra verifica e validazione,
le necessità di validazione di metodi di prova nella ricerca scientifica considerando sia i
metodi sviluppati internamente che i metodi normati modificati,
le caratteristiche di un metodo sia quantitativo e qualitativo ed il loro significato,
le modalità della validazione,
la Documentazione a corredo della validazione di un metodo interno secondo la norma
ISO/IEC 17025:2018 e le prescrizioni ACCREDIA,
i passi principali nell’iter di accreditamento,
i Problemi ricorrenti nell’iter di accreditamento e nella validazione dei metodi.
Keywords: accreditamento, validazione, metodi interni, ISO/IEC 17025.
Le regole, le norme e le modalità di validazione richieste dalla norma ISO/IEC 17025:2018, dalle
prescrizioni ACCREDIA e riportate nelle guide di settore risultano applicabili al mondo della
ricerca scientifica. Le modalità citate non contrastano e non ostacolano l’opera del ricercatore ma
l’aiutano ad ottimizzare tempi ed altre risorse ottenendo la dimostrabilità oggettiva della bontà dei
propri lavori scientifici sia in riferimento alle tecniche LC-MS ed LC-MS-MS che alle altre tecniche
analitiche quantitative e qualitative.
